CN100341858C

CN100341858C - 甘氨双唑钠的合成工艺

Info

Publication number: CN100341858C
Application number: CNB031512917A
Authority: CN
Inventors: 宣坚钢; 吴蓉蓉; 莫道明; 代朝阳
Original assignee: Shandong Luye Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Luye Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-09-29
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2023-09-29
Also published as: CN1603312A

Abstract

本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了一种甘氨双唑钠合成新工艺。本发明的工艺以氨三乙酸为原料，在N，N-二甲基酰胺中与乙酸酐反应，产品精制后再与碳酸氢钠成盐制得。本发明的工艺反应收率高、成本低，减轻劳动强度，有利于环保，宜于规模化生产。

Description

甘氨双唑钠的合成工艺

技术领域：

本发明属于药物化学技术领域。具体涉及一种甘氨双唑钠的合成工艺。

背景技术：

癌是世界上发病和死亡率较高的疾病，严重威胁人类的生命。肿瘤治疗目前仍以手术及放、化疗为主。近年来肿瘤放疗的患者与日俱增，然而肿瘤放疗效果不够理想，即使用最大可能的照射剂量或改变照射方法，有时仍达不到根治目的。

放射增敏剂自50年代后期开始研究以来，目前已研究了多种类型的化合物。其中研究较多的是亲电子化合物。英国Adams从亲电子理论和构效关系分析，合成了一系列硝基咪唑类化合物，从中筛选出的咪嗦硝唑(MISO)，是当今国际上公认较好的放射增敏剂，已经进行临床研究。但因其神经毒性大，临床使用受到限制。甲硝唑是一种抗阿米巴、滴虫病及抗厌氧菌药物，也属硝基咪唑类化合物，七十年代被开发为放射增敏剂。该化合物与咪嗦硝唑一样对乏氧细胞有特异的放射增敏作用，但因服用需要剂量大才能产生增敏效果，增敏效价较低，不如咪嗦硝唑，同时也易引起严重神经毒副反应，已放弃不用。近年来正在试验将甲硝唑改为肿瘤局部注药合并放疗。

本发明人发现硝基咪唑环是产生乏氧细胞放射增敏作用的必要结构，而其毒性主要取决于其在体内的分布，尤以脑内含量高易引起神经毒性等特点。

经摸索筛选后，于1984年成功地将甲硝唑与氨三乙酸合成甲硝唑氨酸，现名甘氨双唑。为改善其溶解度，又将甘氨双唑制成钠盐甘氨双唑钠。

甘氨双唑钠经过物理化学水平(ESR、E′7及E1/2)、分子水平(DNA断链重接)、离体细胞集落形成、荷瘤(四种肿瘤)整体水平的实验研究及药理、毒理试验结果，均证明它是一种低毒有效的乏氧细胞放射增敏剂。

甘氨双唑钠的现有制备方法为以氨三乙酸为原料，在吡啶中与乙酸酐反应，所得产物不予分离，直接与甲硝唑反应，制得甘氨双唑(酸)，然后再在乙醇中与碳酸氢钠成盐即得。该方法已申请中国专利，ZL89102182.5：

该工艺有以下不足之处：

(1)吡啶毒性较大，易挥发，气味难闻，且反应后的母液处理、回收困难；

(2)使用吡啶单耗较高。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计一种新的合成工艺，降低成本，减轻劳动强度。

本发明提供了一种甘氨双唑钠的合成工艺，该工艺包括下列步骤：

(1)甘氨双唑的制备-酯化反应

A、于100升反应釜中加入氨三乙酸6.0～8.0公斤(I，31.4～41.8mol)、DMF 30公斤和乙酸酐12～20公斤(118～196mol)，于50～80℃保温搅拌反应2～6小时；

B、加入甲硝唑14.0～22.0公斤(81.8～128mol)于反应釜中，于40～80℃继续保温搅拌反应3～7小时；

C、反应结束后，夹层通冷水冷却反应料液；

D、反应液冷至30℃，加纯化水，搅拌至有沉淀析出，冷置(＜5℃)析晶；

E、沉淀甩干脱水，水洗至中性；

F、离心分离后得甘氨双唑粗品，湿重9.18～13.4公斤，收率47.0～51.4％。

(2)甘氨双唑精制

A、将甘氨双唑粗品湿料置200升反应釜内，加35～65公斤DMF、50～80公斤纯化水及少量浓氨水加热回流溶解，加0.4公斤活性炭脱色，趁热过滤。滤液置200升结晶罐内，夹层通冷却水，料液降温至0～30℃。搅拌加入15％稀盐酸调pH2～5，冷置(＜5℃)析晶；

B、沉淀甩干脱水，用约200公斤纯化水洗至中性；

C、60～70℃烘干，得白色粉末状结晶甘氨双唑(精制品)6.09～8.04公斤(12.2～16.2mol)，熔点116～118℃，收率75.0～83.0％。

(3)甘氨双唑钠的制备-成盐反应

A、于100升反应釜中加入25～45公斤纯化水、10～30公斤95％乙醇，升温至40～80℃后，加8.7公斤(21.5mol)甘氨双唑，搅拌均匀后，逐渐加入碳酸氢钠粉末1～4公斤，于40～80℃搅拌溶解。溶解完毕加入活性炭0.5公斤，反应0.5小时。

B、趁热过滤，母液置200升结晶罐内，降温至5～30℃，搅拌加入无水乙醇25～75公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。

C、甩干收集沉淀，用无水乙醇(约需25公斤)洗涤。

D、真空干燥得甘氨双唑钠粗品5.22～7.36公斤(9.10～12.8moL)，收率74.5～79.5％。

(4)甘氨双唑钠的精制

将7.6公斤甘氨双唑钠粗品投入50升反应釜，加入20～35公斤纯化水、10～35公斤无水乙醇，搅拌下加热至40～80℃，搅拌使完全溶解，搅拌加入活性碳0.3公斤，保温30分钟后趁热过滤。滤液置100升结晶罐内，降温至5～30℃，搅拌加入无水乙醇25～60公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。离心过滤并收集沉淀置真空干燥箱内，于60～70℃/20mmHg干燥，得类白至微黄色结晶粉末状甘氨双唑钠4.19～6.28公斤，收率80.3～85.3％。

本发明的合成工艺与现有技术比较如下：

表1 甘氨双唑粗品合成新、老工艺数据比较

老工艺			新工艺
老工艺			新工艺			020801	020802	020803	010705	010711	010718
投料量(kg)得量(kg)收率(％)外观纯度(％)	20.025.048.0淡棕色结晶95.95	20.026.851.4淡棕色结晶96.43	20.025.949.7淡棕色结晶96.06	8.010.751.4淡棕色结晶98.06	8.09.847.0淡棕色结晶98.06	020801	020802	020803	010705	010711	010718	8.010.449.9淡棕色结晶98.12

注：收率以氨三乙酸投料量计算

表2 甘氨双唑粗品精制新、老工艺数据比较

老工艺			新工艺
老工艺			新工艺			020801	020802	020803	010705	010711	010718
投料量(kg)得量(kg)收率(％)外观纯度(％)	25.020.883.2白色结晶97.64	26.822.583.9白色结晶96.99	25.921.884.2白色结晶97.65	10.78.781.3白色结晶98.96	9.88.183.0白色结晶99.14	020801	020802	020803	010705	010711	010718	10.48.379.8白色结晶99.13

质量控制方法：HPLC法，纯度＞95％。

表3 甘氨双唑成盐反应新、老工艺数据比较

老工艺			新工艺
老工艺			新工艺			020801	020802	020803	010705	010711	010718
投料量(kg)得量(kg)收率(％)外观有关物质(％)含量(％)	20.819.581.3微黄色结晶1.099.2	22.521.382.2微黄色结晶0.80101.1	21.820.581.6微黄色结晶0.90100.6	8.77.574.8微黄色结晶0.40101.7	8.17.277.1微黄色结晶0.35100.2	020801	020802	020803	010705	010711	010718	8.37.679.5微黄色结晶0.38100.6

因此，本发明的工艺具有以下优点：

1、用DMF取代吡啶作为酯化反应的溶剂，甘氨双唑的合成收率提高，各项质量指标符合要求，其中成品的有关物质得到了有效的控制。

2、新工艺甘氨双唑钠的总收率为30.1～31.6％，较老工艺的26.3～28.6％提高了3.0～3.8％，而每公斤单耗由828～864元降为650～686元。

3、新工艺大大降低了生产操作的劳动强度，减轻了吡啶废液处理的负担，有利于三废处理。

4、新工艺中试数据表明，新工艺的收率稳定，成品质量均能符合甘氨双唑钠国家标准WS-166(X-143)-2002的各项规定。

本发明的关键中间体甘氨双唑(酸)质量标准

甘氨双唑

Gan’anshuangzuo

Glycididazole

C₁₈H₂₂N₈O₁₀ 573.45

本品为N，N-双[(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)-乙氧羰甲基]甘氨酸。按无水物计算，含C₁₈H₂₂N₈O₁₀不得少于95.0％。

外观本品为类白色至微黄色的结晶或结晶性粉末；无臭，味苦；遇光色渐变深。

溶解度本品在热乙醇中略溶，在水或丙酮中几乎不溶。

色谱纯度照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD)测定。

避光操作。取本品约12.5mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺1～2ml，振摇使溶解，再加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(临用新制)；取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成份峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积，按峰面积归一法计算，主成分峰面积应大于95％。

本发明产品药理、毒理、临床结果如下：

一、药理、毒理部分

1、主要药效学

I化疗增敏药效学作用研究如下：

a、体外试验

用常规体外细胞克隆活存的方法研究了甘氨双唑钠对卡铂、环磷酰胺、和长春新碱的化疗增敏作用。

(1)首先用0-1000μg/ml的甘氨双唑钠作用于胃癌SGC-7901细胞株，观察甘氨双唑钠对细胞活存的影响。结果表明，当甘氨双唑钠的浓度＜50μg/ml时，对为癌细胞的活存无明显影响。确定甘氨双唑钠的增敏试验浓度不应超过50μg/ml。

然后分别用卡铂(0.5-60μg/ml)、环磷酰胺(1-100μg/ml)和长春新碱(1-100μg/ml)分别作用于胃癌细胞，观察化疗药物对细胞的影响。结果表明：0.5μg/ml的卡铂、10μg/ml的环磷酰胺、1μg/ml的长春新碱即能使胃癌细胞的活存有显著降低。

(2)选择10、30和50μg/ml的甘氨双唑钠，分别与2μg/ml的卡铂、5μg/ml的环磷酰胺和2μg/ml的长春新碱共同作用于细胞，观察甘氨双唑钠对三种化疗药物的化疗增敏作用。结果表明：甘氨双唑钠对卡铂和环磷酰胺有明显的增敏作用。与空白对照相比，单独用卡铂(2μg/ml)处理，细胞的活存减低为83％；加入甘氨双唑钠(10、30和50μg/ml)后，细胞活存分别降低到：44％、26％和1.9％。单独用环磷酰胺(5μg/ml)处理，细胞的活存降低为77％；加入甘氨双唑钠(10、30和50μg/ml)后，细胞活存分别降低到：50％、16％和1.4％。表现出对烷化剂类抗肿瘤药物的明显的化疗增敏作用。但加入长春新碱后，未观察到甘氨双唑钠的增敏作用。因此可以证实：甘氨双唑钠对烷化剂类的抗肿瘤药物有明显的化疗增敏作用。

b、整体动物实验

考虑到肿瘤临床化学药物治疗中的复杂性，包括各种各样的化疗药物、不同病理类型的肿瘤、不同的化疗方案等，给动物药效试验带来了复杂性。因此在设计实验时选择了两条思路。一是甘氨双唑钠对典型的烷化剂抗肿瘤药物治疗不同肿瘤的增敏作用；二是甘氨双唑钠对典型的肿瘤用不同化疗药物治疗的增敏作用。这样基本可以反映甘氨双唑钠对不同化疗药物治疗不同肿瘤的化疗增敏作用。观察的终点指标为：各组肿瘤体积的变化、各组肿瘤相对增长速度、各组的肿瘤抑制率和近期治疗效果。为了考察加用注射用甘氨双唑钠后，是否会同时增加抗肿瘤药物的毒副反应，而抗肿瘤药物的主要毒副反应是骨髓造血抑制，因此另外设计试验，重点考察了各组动物在用药期间的外周血象的变化，并进行统计处理。同时根据指导原则，甘氨双唑钠选择了高、中、低三个给药的剂量水平，主要选择了临床静脉注射的给药途径进行其增敏作用的观察。

甘氨双唑钠选择了1000、500、250mg/kg高、中、低三个剂量水静脉给药途径，结果表明：

(1)与空白对照组相比，单独使用卡铂，对B₁₆黑色素瘤、EMT₆乳腺癌、Lewis肺癌和S₁₈₀肉瘤4种试验肿瘤有明显的治疗作用，表现为肿瘤生长速度减慢，肿瘤生长延迟天数增加，肿瘤抑制率增加。

加用不同剂量的注射用甘氨双唑钠(1000、500、250mg/kg)后，与卡铂治疗组相比，肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤生长延迟天数和肿瘤抑制率明显增加，有非常显著的统计学意义。对4种试验肿瘤，单独卡铂治疗的肿瘤抑制率(给药后第10天)分别为：25.6％、43.9％、18.0％和47.0％。加用注射用甘氨双唑钠(500mg/kg)后分别增加到：72.9％、76.5％、31.0％和78.0％。注射用甘氨双唑钠表现出明显的化疗增敏作用。

(2)与空白对照组相比，4种抗肿瘤化疗药物(丝裂霉素、足叶乙甙、环磷酰胺和卡铂)治疗Lewis肺癌，均表现出明显的治疗作用。表现为肿瘤生长速度减慢，肿瘤生长延迟天数增加，肿瘤抑制率增加。

加用不同剂量的注射用甘氨双唑钠(1000、500、250mg/kg)后，除足叶乙甙组外，与单独丝裂霉素、环磷酰胺和卡铂治疗组相比，肿瘤生长速度进一步减慢，肿瘤生长延迟天数和肿瘤抑制率明显增加，有非常显著的统计学意义。

对Lewis肺癌，单独丝裂霉素治疗的肿瘤抑制率(给药后第12天)为31.4％，加注射用甘氨双唑钠后提高为97.2％；

单独环磷酰胺治疗的肿瘤抑制率(给药后第12天)为71％，加注射用甘氨双唑钠后提高为94％；单独卡铂治疗的肿瘤抑制率(给药后第12天)为57％，加用注射用甘氨双唑钠(500mg/kg)后增加到：82％。注射用甘氨双唑钠表现出明显的化疗增敏作用。

II放射增敏作用

用离体培养的中国仓鼠V₇₉细胞体外试验集合S₁₈₀、Lewis肺癌、B₁₆黑色素瘤和EMT₆乳腺癌四种肿瘤小鼠整体试验的方法，证明了甘氨双唑钠的放射增敏作用。实验同时设空白对照组和单独照射两种对照组进行实验。分别设米索硝唑、SR-2508等几个文献中公认的放射增敏作用比较肯定的化合物作为阳性药物对照组进行实验。实验结果均经统计学处理。整体动物实验使用了腹腔注射和静脉注射两种给药途径，甘氨双唑钠药物剂量至少设高、中、低三个剂量进行实验。

(1)体外实验

a.甘氨双唑钠对有氧和乏氧细胞的IC₅₀值分别为：35.70mmol/L和23.50mmol/L，证实甘氨双唑钠对乏氧细胞的毒性明显大于有氧细胞。

b.药物浓度为0.1～1.38mmol/L时的增敏比(SER值)为1.26～2.32。

c.C_1.6值(放射增敏比SER值为1.6时，增敏剂的药物浓度)为0.48mmol/L。

d.对受照的有氧细胞未表现出放射增敏作用。

e.在相同实验条件下比较了等克分子药物浓度(0.3mmol/L)，甘氨双唑钠、米索硝唑、甲硝唑的放射增敏作用。结果表明，甘氨双唑钠的增敏比(SER值)为1.76，高于米索硝唑(1.52)和甲硝唑(1.07)。

(2)整体实验

a.选用Lewis肺癌、B₁₆黑色素瘤、EMT₆乳腺癌和S₁₈₀等四种肿瘤模型，观察了0.1～1.8mmol/kg(57.3～1032.2mg/kg)甘氨双唑钠对0～32Gyγ线单次照射的放射增敏作用。结果表明与单独照射相比，加用甘氨双唑钠后肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤抑制率增加，肿瘤生长延迟天数增加，四种肿瘤模型均得到相同结果。SER值大部分在1.3以上。

b.甘氨双唑钠对四种肿瘤模型放射增敏作用的敏感性有差异，其中对Lewis肺癌和B₁₆黑色素瘤效果更好一些。

c.用荷Lewis肺癌和EMT₆乳腺癌小鼠证明了0.1、1.0mmol/kg(57.3～573mg/kg)的甘氨双唑钠对分次剂量r线照射也有放射增敏作用。

d.等克分子量(0.1mmol/kg)甘氨双唑钠的放射增敏作用比甲硝唑及SR-2508的增敏效果好。

e.小数连续用药2州(每次200mg/kg，每周二次)，然后照射0～6Gyγ线，与单独照射相比，加用甘氨双唑钠后对小鼠骨髓CFU-GM和CFU-S无明显的影响，对体重和脾指数也无明显影响。上述结果证实甘氨双唑钠对受照的辐射较敏感的正常造血组织无放射增敏作用。

2、一般药理试验

分别用小鼠和大鼠研究了150～900mg/kg的甘氨双唑钠静脉注射后对神经系统的影响。结果表明，甘氨双唑钠150～900mg/kg(450～2700mg/m²)对小鼠的一般行为活动和协调运动无明显影响。当剂量为300～900mg/kg(1800～5400mg/m²)静脉注射时，可影响大鼠的探究活动，主要表现为爬格试验的方格间穿行次数减少和竖起、修饰次数减少，呈量-效关系。

用猫观察了50～300mg/kg的甘氨双唑钠静脉注射对心血管和呼吸系统的影响。当药物剂量小于100mg/kg时，对麻醉猫的血压和心率无明显影响。对心电图无明显影响。当药物剂量为300mg/kg时，具有明显的降压作用。同时可观察到心电图的T波增高。50～300mg/kg的剂量对麻醉猫呼吸频率和幅度无明显影响。

3、急性毒性试验

以腹腔注射(ip)和静脉注射(iv)两种给药途径，分别观察了甘氨双唑钠对大鼠、小鼠的急性毒性反应。

大剂量(3200mg/kg)给小鼠静脉注射甘氨双唑钠后，动物在一分钟内出现步态不稳、动作失调、蹦跳乱窜、全身肌肉抽搐，药后1～15分钟，出现动物死亡。不死亡者24～48小时后恢复正常。雌、雄小鼠的LD₅₀无显著差异。经用加权概率单位回归法统计，LD₅₀值为2675.89mg/kg小鼠腹腔注射的LD₅₀值为3959.52mg/kg。

大剂量(5000mg/kg)给大鼠静脉注射甘氨双唑钠后，经数分钟出现步态不稳、动作失调、扭体，然后动物伏卧、闭眼、四肢震颤，药后1小时起开始死亡，24小时后不死亡动物恢复正常。性别间LD₅₀无明显差异，LD₅₀值为2691.63mg/kg(2576.89～2811.49mg/kg)。大鼠腹腔注射甘氨双唑钠后，毒性反应与静脉注射相似，LD₅₀值为2911.44mg/kg(2652.13～3196.09mg/kg)。

上述结果表明，静脉给药，大鼠和小鼠的LD₅₀值均大于2g/kg，腹腔给药对大鼠的LD₅₀值大于2g/kg，对小鼠的LD₅₀值在4g/kg左右，可以认为该药的毒副作用不太大。

4、全身用药毒性试验

注射用甘氨双唑钠对家兔耳缘静脉血管刺激试验结果表明，在注射部位仅见进针的机械损伤，未见明显的与药物相关的刺激反应，给药组及阴性对照组无明显的不同。

家兔红血球溶血试验和对豚鼠过敏试验结果呈阴性反应。

5、长期毒性

实验动物长期毒性试验选用SD大鼠和Beagle犬两种动物。

(1)大鼠腹腔注射甘氨双唑钠3个月毒性试验大鼠长期毒性试验，剂量设置以等渗药液腹腔注射最大容许量作为高剂量，以10∶3∶1剂距，设置中、低剂量组。连续腹腔注射3个月后，高剂量组600mg/kg/天(相当于3600mg/m²/天)雄性大鼠体重增长受到轻度抑制。其余中、低剂量组(180、60mg/kg/天，相当于1080、360mg/m²/天)未见其他与药物有关的明显毒性症状。血清生化和尿常规检查，均未发现与药物有关的异常结果，测量值均在正常值范围内。给药及恢复期终止时病理检查全身各脏器均未见明显病变，镜检也未发现有与药物有关的毒性反应。确定的无毒性反应剂量为60mg/kg/天(360mg/m²/天)。

(2)犬静脉滴注甘氨双唑钠3个月毒性试验Beagle犬的长期毒性试验设置60、180、600mg/kg/天(1200、3600、12000mg/m²/天)3个剂量组，每次静脉滴注给药连续三个月。结果表明，对动物体重、摄食量、血液常规、血清生化、尿常规、心电图和眼底检查等均未见与药物有关的异常变化。甘氨双唑钠给予动物后所发生的与药物-剂量有关的毒性反应主要为恶心、呕吐、轻度流涎、轻微肌肉震颤等中枢神经系统症状。引起动物死亡的主要原因为血液循环系统及中枢神经系统障碍，具有剂量依赖性。

6、致突变试验

(1)微生物回复突变(Ames)试验应用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102为指示微生物，测试50～5000μg/皿甘氨双唑钠的制突变性。结果表明，四菌株在加和不加代谢活化系统条件下，在1000、500μg/皿剂量以下为阴性结果。

(2)哺乳动物培养细胞基因突变试验结果表明，20～1280μg/ml各剂量组的细胞突变率在加和不加S9代谢活化条件下，均小于自发突变率的3倍。而在同等条件下，阳性对照物甲基磺酸乙酯(EMS)和苯并芘分别远大于自发突变率的3倍。因此证实甘氨双唑钠的哺乳动物培养细胞基因突变试验结果为阴性。

(3)染色体畸变试验采用中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)体外实验方法，检测了甘)氨双唑钠对哺乳动物培养细胞染色体畸变率的影响。结果表明，在250～1000μg/ml剂量下，各浓度试验组的染色体畸变率与空白对照组无显著性差异。未见甘氨双唑钠诱发CHL细胞染色体畸变。

(4)微核试验采用性成熟的NIH小鼠，对甘氨双唑钠进行了哺乳动物体内微核试验。结果表明，139.9～1399mg/kg剂量的各试验组微核率与阴性对照组的微核率无显著差异，未显示本药物诱发小数骨髓多染红细胞微核增加的效应。

7、生殖毒性

(1)一般生殖毒性试验结果表明，高剂量组(300mg/kg)对雄性小鼠的体重增长有一定影响。中剂量组(100mg/kg)和高剂量组动物睾丸重量相对增加，精子活动度有不同程度下降。对雄鼠生育力、雌鼠受孕率及仔鼠的生长发育、哺育等情况均无明显影响。

(2)致畸试验对受孕母鼠致畸敏感期的毒性试验结果表明，高剂量组(1399mg/kg)吸收胎增加，活胎率和平均窝活胎数下降，可造成一定程度(总畸胎率7.42％)的胎鼠畸形，有一定的母鼠毒性。中剂量(279.8mg/kg)时表现出轻度母体毒性，但无胚胎毒性和致畸作用。

(3)围产期毒性试验甘氨双唑钠在围产期和哺乳期给药(300mg/kg)，对出生活胎率、哺育成活率、仔鼠的学习记忆能力、生殖能力无明显的影响，但对某些生理发育(门齿萌出、睾丸下降、张耳)和反射发育的成熟有延缓作用。在有轻微母体毒性剂量时，还可导致仔鼠生长发育迟缓。

8、药代动力学试验

采用HPLC方法测定小鼠及大鼠静脉注射甘氨双唑钠后生物样品中甘氨双唑钠及其代谢产物甲硝唑的含量。经测定效应与浓度的相关性、回收率、精密度考察，试验所用方法和HPLC条件符合药代动力学研究要求。小鼠体外转化试验表明，甘氨双唑钠在水、全血、肝匀浆中都不稳定，尤以血中降解最迅速。90min的转化率分别为：27.3％、91.8％和41.1％。甲硝唑在水、全血、肝匀浆中90min的生成率分别为：8.2％、67.3％和27.3％。小鼠静脉注射甘氨双唑钠57.3、171.9、515.7mg/kg三个剂量的药代动力学研究表明，甘氨双唑钠在小鼠体内转化或消除很快，呈一房室模型，三个剂量的消除半衰期分别为：0.5、0.8和1.0min。C₀分别为：209.6、567.3和3102.8μg/ml。浓度-时间曲线下的面积AUC分别为：282.4、1127.5和6700.8μg·min/ml。C₀和AUC均与剂量呈正相关(r为0.992、0.993)。甘氨双唑钠的代谢产物甲硝唑达峰很快，消除较慢，呈二房室模型，三个剂量的达峰时间分别为：0.5、1.0和1.2min，消除半衰期为：63.2、68.2和64.3min，C_max为：25.7、59.7和145.5μg/ml，AUC分别为1014.7、3914.9和11178.7μg·min/ml。C_max和AUC均与剂量呈正相关(r均为0.999)。表现出一级动力学特征。

组织分布试验发现大鼠静脉注射甘氨双唑钠171.9mg/kg后，甘氨双唑钠迅速分布到各组织中，主要发现在血流充足的心、肺、肾及消化道中，药后2min及5min，甘氨双唑钠组织含量最高，20min大幅度降低。其代谢物甲硝唑在各组织的含量在2min和5min较高，高于相应时间的甘氨双唑钠含量，20min后，各组织含量下降。

大鼠静脉注射甘氨双唑钠171.9mg/kg后，甘氨双唑钠的排泄以尿为主，从尿中排泄的原药占给药总量的8.4％，甲硝唑及另一未知代谢物的排泄分别占33.4％和39.2％，即从尿中共排除给药总量的81％。胆汁排泄较少，甘氨双唑钠和甲硝唑分别占11.5％和10.1％。粪排泄极少，甘氨双唑钠和甲硝唑分别占给药量的0.14％和0.06％。甘氨双唑钠平均蛋白结合率仅为14.2±2.2％。

二、临床部分(放射增敏作用)

1、I期临床试验

(1)静脉途径给予注射用甘氨双唑钠剂量达900mg/m²，对外周血象，呼吸、脉搏、血压、体温等基础生命体征，肾功能等无明显影响。

(2)剂量达900mg/m²，部分病人可出现窦性心动过速、ST段改变等心电图的变化，可作为临床使用的监测药物毒性的一个指标。

(3)剂量达900mg/m²，部分病人可出现ALT升高的肝功能损伤，长时间使用本药时应注意监测病人的肝功能。

(4)剂量达900mg/m²，对病人的神经系统无明显的影响。

(5)与用药有关的不良反应主要有消化道的恶心呕吐和便秘及心功能的改变。

(6)初步放射治疗的结果提示，本药对肿瘤组织内的乏氧细胞有较好的放射增敏作用。

(7)综合考虑药代动力学和临床前的研究结果，II期临床研究的推荐剂量为800mg/m²。

2、II期临床第一阶段试验

本阶段试验采用随机、双盲、平行对照的设计，共入组218例确诊的头颈部、食管和肺部肿瘤进行放射治疗的病人。由于各种原因脱落和剔除13例，有效的统计病例205名。试验组在常规放射治疗的同时使用注射用甘氨双唑钠(800mg/m²)，对照组使用安慰剂。结果表明：

(1)注射用甘氨双唑钠对头颈部肿瘤、食管癌和肺癌的放射治疗有肯定的放射增敏疗效，表现为增加肿瘤抑制率、减少CR和PR的照射剂量，提高CR或CR+PR病人的百分率。目前的资料提示可增加CR、PR的缓解时间。

(2)使用注射用甘氨双唑钠可非常显著提高头颈部肿瘤、食管癌和肺癌的肿瘤全消率(CR率)。

(3)头颈部肿瘤疗效达到CR和PR的SER值分别为：1.27和1.31；食管癌和肺癌的Dt4000cGy时肿瘤局部控制率由单独放射治疗组的39.18％提高到62.75％(P＝0.001)；两组的全消率由单独放射治疗组的30.9％提高到55.9％(P＝0.001)，表现出明显的放射增敏作用。

(4)一个放射治疗疗程使用注射用甘氨双唑钠，使用的剂量达800mg/m²/次，连续使用21次，病人的耐受性良好。

(5)推荐临床使用的剂量(800mg/m²/次，每周3次，连续6～7周)出现的不良反应发生率与单独照射相比，未观察到注射用甘氨双唑钠的不良反应发生率增加。

(6)个别肝功能异常的病例，使用本药后出现肝功能明显损害的结果。对肝功能异常病人是否应严加限制使用本药，有待继续扩大病例数后得出结论。

(7)I期临床研究观察到，当使用注射用甘氨双唑钠的剂量较大时，个别病人可观察到心电图的改变，表现为心动过速、T波改变等。II期临床试验观察到这种情况两组间无统计学差别，但应在以后大范围的试验中，注意观察病人的心电图和心功能，以便得出明确结论。

3、II期临床第二阶段试验

本阶段试验采用随机、平行对照的设计，共入组411例确诊的头颈部、食管和肺部肿瘤进行放射治疗的病人。由于各种原因脱落和剔除9例，有效的统计病例402名。试验组在常规放射治疗的同时使用注射用甘氨双唑钠(800mg/m²)，随机按2∶1(试验组：对照组)的比例设单独放射治疗的对照组。在较大范围观察了注射用甘氨双唑钠的有效性和安全性。结果表明：

(1)注射用甘氨双唑钠对头颈部肿瘤、食管癌和肺癌的放射治疗有肯定的放射增敏作用，表现为增加肿瘤抑制率、减少CR和PR的照射剂量，提高CR或CR+PR病人的百分率。

(2)使用注射用甘氨双唑钠可非常显著提高头颈部肿瘤、食管癌和肺癌的肿瘤全消(CR)率(P＝0.003)。

(3)头颈部肿瘤转移灶疗效达到CR和PR的SER值分别为：1.39和1.26；食管癌和肺癌的Dt4000cGy时肿瘤局部控制率由单独放射治疗组的41.22％提高到54.76％(P＝0.012)；两组的全消率由单独放射治疗组的28.2％提高到44.0％(P＝0.003)，表现出明显的放射增敏作用。

(6)使用注射用甘氨双唑钠后，对食管癌、头颈部肿瘤放射治疗的皮肤、粘膜不良反应有减少的趋势。

(7)使用注射用甘氨双唑钠后，尽管总体上肝功能的化验指标均在正常值范围内，但有部分试验者用药前后的不良反应表现在肝功能的改变方面。结合第一阶段的试验结果，长期使用本品时应该重视对肝脏功能的监测。肝功能异常的患者应慎用本药。

(8)I期临床研究观察到，当使用注射用甘氨双唑钠的剂量较大时，少数病人可观察到心电图或心功能的改变，表现为心动过速、心电图T波改变等。经随机双盲和随机对照的II期临床第一、第二阶段试验证明，治疗前心电图正常、治疗后与心肌缺血和心律异常有关的心电图改变的例数，两组间无统计学差异。证实本药对心电图无明显影响。

(9)使用本品后未观察到明显的消化道的不良反应，对肾功能和心电图无明显影响。

(10)使用本品后未观察到明显的神经系统的毒副反应。

具体实施方式：

实施例1、甘氨双唑的制备-酯化反应

A、于100升反应釜中加入氨三乙酸6.0公斤(I，31.4mol)、DMF30公斤和乙酸酐12公斤(118mol)，于50℃保温搅拌反应6小时；

B、加入甲硝唑14.0公斤(81.8mol)于反应釜中，于40℃继续保温搅拌反应7小时；

C、反应结束后，夹层通冷水冷却反应料液；

D、反应液冷至30℃，加纯化水，搅拌至有沉淀析出，冷置(＜5℃)析出结晶；

E、沉淀甩干脱水，水洗至中性；

F、离心分离后得甘氨双唑粗品，湿重9.18公斤，收率47.0％。

实施例2、甘氨双唑的制备-酯化反应

A、于100升反应釜中加入氨三乙酸7.0公斤(I，36.6mol)、DMF30公斤和乙酸酐16公斤(157mol)，于65℃保温搅拌反应4小时；

B、加入甲硝唑18.0公斤(105mol)于反应釜中，于60℃继续保温搅拌反应5小时；

C、反应结束后，夹层通冷水冷却反应料液；

E、沉淀甩干脱水，水洗至中性；

F、离心分离后得甘氨双唑粗品，湿重11.3公斤，收率49.6％。

实施例3、甘氨双唑的制备-酯化反应

A、于100升反应釜中加入氨三乙酸8.0公斤(I，41.8mol)、DMF30公斤和乙酸酐20公斤(196mol)，于80℃保温搅拌反应2小时；

B、加入甲硝唑22.0公斤(128mol)于反应釜中，于80℃继续保温搅拌反应3小时；

C、反应结束后，夹层通冷水冷却反应料液；

E、沉淀甩干脱水，水洗至中性；

F、离心分离后得甘氨双唑粗品，湿重13.4公斤，收率51.4％。

实施例4、甘氨双唑精制

A、将甘氨双唑粗品湿料9.18公斤置200升反应釜内，加35公斤DMF、80公斤纯化水及少量浓氨水加热回流溶解，加0.4公斤活性炭脱色，趁热过滤。滤液置200升结晶罐内，夹层通冷却水，料液降温至0℃。搅拌加入15％稀盐酸调pH2～5，冷置(＜5℃)析出结晶；

B、沉淀甩干脱水，用约200公斤纯化水洗至中性；

C、60～70℃烘干，得白色粉末状结晶甘氨双唑(精制品)6.09公斤(12.9mol)，熔点116～118℃，收率83.0％。

实施例5、甘氨双唑精制

A、将甘氨双唑粗品湿料11.3公斤置200升反应釜内，加50公斤DMF、65公斤纯化水及少量浓氨水回流溶解，加0.4公斤活性炭脱色，趁热过滤。滤液置200升结晶罐内，夹层通冷却水，料液降温至15℃。搅拌加入15％稀盐酸调pH2～5，冷置(＜5℃)析出结晶；

B、沉淀甩干脱水，用约200公斤纯化水洗至中性；

C、60～70℃烘干，得白色粉末状结晶甘氨双唑(精制品)7.14公斤(14.3mol)，熔点116～118℃，收率79.0％。

实施例6、甘氨双唑精制

A、将甘氨双唑粗品湿料13.4公斤置200升反应釜内，加65公斤DMF、50公斤纯化水及少量浓氨水回流溶解，加0.4公斤活性炭脱色，趁热过滤。滤液置200升结晶罐内，夹层通冷却水，料液降温至30℃。搅拌加入15％稀盐酸调pH2～5，冷置(＜5℃)析出结晶；

B、沉淀甩干脱水，用约200公斤纯化水洗至中性；

C、60～70℃烘干，得白色粉末状结晶甘氨双唑(精制品)8.04公斤(16.2mol)，熔点116～118℃，收率75.0％。

实施例7、甘氨双唑钠的制备-成盐反应

A、于100升反应釜中加入25公斤纯化水、30公斤95％乙醇，升温至80℃后，加6.09公斤(12.9mol)甘氨双唑，搅拌均匀后，逐渐加入碳酸氢钠粉末1.0公斤，于80℃搅拌溶解。溶解完毕加入活性炭0.5公斤，反应0.5小时。

B、趁热过滤，母液置200升结晶罐内，降温至30℃左右，搅拌加入无水乙醇25公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。

C、甩干收集沉淀，用无水乙醇(约需25公斤)洗涤。

D、真空干燥得甘氨双唑钠粗品5.22公斤(9.11moL)，收率74.5％。

实施例8、甘氨双唑钠的制备-成盐反应

A、于100升反应釜中加入35公斤纯化水、20公斤95％乙醇，升温至60℃后，加7.14公斤(14.3mol)甘氨双唑，搅拌均匀后，逐渐加入碳酸氢钠粉末2.5公斤，于60℃搅拌溶解。溶解完毕加入活性炭0.5公斤，反应0.5小时。

B、趁热过滤，母液置200升结晶罐内，降温至17℃左右，搅拌加入无水乙醇50公斤，冷置(＜5℃)析出结晶。

C、甩干收集沉淀，用无水乙醇(约需25公斤)洗涤。

D、真空干燥得甘氨双唑钠粗品6.33公斤(10.6moL)，收率77.0％。

实施例9、甘氨双唑钠的制备-成盐反应

A、于100升反应釜中加入45公斤纯化水、10公斤95％乙醇，升温至40℃后，加8.04公斤(16.2mol)甘氨双唑，搅拌均匀后，逐渐加入碳酸氢钠粉末4.0公斤，于40℃搅拌溶解。溶解完毕加入活性炭0.5公斤，反应0.5小时。

B、趁热过滤，母液置200升结晶罐内，降温至5℃左右，搅拌加入无水乙醇75公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。

C、甩干收集沉淀，用无水乙醇(约需25公斤)洗涤。

D、真空干燥得甘氨双唑钠粗品7.36公斤(12.3moL)，收率79.5％。

实施例10、甘氨双唑钠的精制

将5.22公斤甘氨双唑钠粗品投入50升反应釜，加入20公斤纯化水、30公斤无水乙醇，搅拌下加热至80℃，搅拌使完全溶解，搅拌加入活性碳0.3公斤，保温30分钟后趁热过滤。滤液置100升结晶罐内，降温至30℃，搅拌加入无水乙醇25公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。离心过滤并收集沉淀置真空干燥箱内，于60～70℃/20mmHg干燥，得类白至微黄色结晶粉末状甘氨双唑钠4.19公斤，收率80.3％。

实施例11、甘氨双唑钠的精制

将6.33公斤甘氨双唑钠粗品投入50升反应釜，加入27公斤纯化水、20公斤无水乙醇，搅拌下加热至60℃，搅拌使完全溶解，搅拌加入活性碳0.3公斤，保温30分钟后趁热过滤。滤液置100升结晶罐内，降温至17℃，搅拌加入无水乙醇45公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。离心过滤并收集沉淀置真空干燥箱内，于60～70℃/20mmHg干燥，得类白至微黄色结晶粉末状甘氨双唑钠5.25公斤，收率83.0％。

实施例12、甘氨双唑钠的精制

将7.36公斤甘氨双唑钠粗品投入50升反应釜，加入35公斤纯化水、10公斤无水乙醇，搅拌下加热至40℃，搅拌使完全溶解，搅拌加入活性碳0.3公斤，保温30分钟后趁热过滤。滤液置100升结晶罐内，降温至5℃，搅拌加入无水乙醇65公斤，冷置(0～5℃)析出结晶。离心过滤并收集沉淀置真空干燥箱内，于60～70℃/20mmHg干燥，得类白至微黄色结晶粉末状甘氨双唑钠6.28公斤，收率85.3％。

Claims

1、一种甘氨双唑钠合成工艺，其特征在于该工艺包括下列步骤：

(1)甘氨双唑的制备—酯化反应

A、于100升反应釜中加入相当于31.4～41.8mol氨三乙酸6.0～8.0公斤)、DMF 30公斤和乙酸酐12～20公斤，于50～80℃保温搅拌反应2～6小时；

B、加入相当于81.8～128mol甲硝唑14.0～22.0公斤于反应釜中，于40～80℃继续保温搅拌反应3～7小时；

C、反应结束后，夹层通冷水冷却反应料液；

D、反应液冷至30℃，加纯化水，搅拌至有沉淀析出，冷置＜5℃，12小时；

E、沉淀甩干脱水，水洗至中性；

F、离心分离后得甘氨双唑粗品，湿重9.18～13.4公斤，收率47.0～51.4％；

(2)甘氨双唑精制

A、将甘氨双唑粗品湿料置200升反应釜内，加35～65公斤DMF、50～80公斤纯化水及少量浓氨水加热回流溶解，加0.4公斤活性炭脱色，趁热过滤。滤液置200升结晶罐内，夹层通冷却水，料液降温至0～30℃。搅拌加入15％稀盐酸调pH2～5，冷置＜5℃析晶；

B、沉淀甩干脱水，用约200公斤纯化水洗至中性；

C、60～70℃烘干，得相当于12.2～16.2mol白色粉末状结晶甘氨双唑精制品6.09～8.04公斤，熔点116～118℃，收率75.0～83.0％；

(3)甘氨双唑钠的制备—成盐反应

A、于100升反应釜中加入25～45公斤纯化水、10～30公斤95％乙醇，升温至40～80℃后，加相当于21.5mol的甘氨双唑8.7公斤，搅拌均匀后，逐渐加入碳酸氢钠粉末1～4公斤，于40～80℃搅拌溶解，溶解完毕加入活性炭0.5公斤，反应0.5小时；

B、趁热过滤，母液置200升结晶罐内，降温至5～30℃，搅拌加入无水乙醇25～75公斤，冷置0～5℃析出结晶；

C、甩干收集沉淀，用无水乙醇洗涤；

D、真空干燥得相当于9.10～12.8moL甘氨双唑钠粗品5.22～7.36公斤，收率74.5～79.5％；

(4)甘氨双唑钠的精制

将7.6公斤甘氨双唑钠粗品投入50升反应釜，加入20～35公斤纯化水、10～35公斤无水乙醇，搅拌下加热至40～80℃，搅拌使完全溶解，搅拌加入活性碳0.3公斤，保温30分钟后趁热过滤，滤液置100升结晶罐内，降温至5～30℃，搅拌加入无水乙醇25～60公斤，冷置0～5℃析出结晶，离心过滤并收集沉淀置真空干燥箱内，于60～70℃/20mmHg干燥，得类白至微黄色结晶粉末状甘氨双唑钠4.19～6.28公斤，收率80.3～85.3％。