CN1733717A - N,n’－二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及N，N’－二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体、制备方法和医药用途，并涉及以优选的构型异构体为活性成分的药物组合物。从N，N’－二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体中优选出分子中胱氨酸为L型或内消旋型，同时分子中精氨酸的构型是至少含有一个L型精氨酸的构型异构体，用于制备抗肿瘤、治疗免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病的药物、治疗感染性疾病或治疗肝病肝损伤、肝功能衰竭的药物。

Description

N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体及其用途

技术领域

本发明涉及具有免疫调节活性的N，N’-二乙酰胱氨酸的精氨酸盐，含有N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体的药物组合物、其制备方法和医药用途。

技术背景

N-乙酰半胱氨酸是一种公知的含巯基的氨基酸衍生物，具有多种生物活性，例如作为粘液溶解剂，用于呼吸系统疾病；在还原型谷胱甘肽降低和氧化应激方面也被研究和应用；尚可用于药物中毒引起的急性肝功能衰竭。近年来的临床研究证明，对各型肝炎病毒引起的肝衰竭也有良好疗效。N-乙酰半胱氨酸的药理作用机制是多样的，包括强抗氧化作用、刺激谷胱甘肽合成，对一氧化氮的产生和其合成酶活性的影响等等。

N，N’-二乙酰胱氨酸是N-乙酰半胱氨酸以二硫键结合的二聚体，也是一种公知化合物。瑞典专利申请SE9002067-8发现了N，N’-二乙酰胱氨酸具有强效的免疫刺激作用，能刺激I型速发型变态反应，抑制IV型迟发型变态反应。此外还能证明N，N’-二乙酰胱氨酸能明显改善已被损害的内皮细胞舒血功能，但不影响正常内皮细胞舒血功能。

中国专利“N，N’-二乙酰胱氨酸的有机盐”(申请号93104963.6)公开了N，N’-二乙酰胱氨酸与一些有机碱形成的盐能够避免游离N，N’-二乙酰胱氨酸的吸湿性，有利于制备符合药物质量控制要求的制剂。

中国专利申请“新的化合物N，N’-二乙酰胱氨酸精氨酸盐及其制备方法和用途”(申请号02136216.5)公开了N，N’-二乙酰胱氨酸精氨酸盐及其制备方法和医药用途。

N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的结构式如下：

其中R⁺为精氨酸的阳离子。

N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐为白色结晶性粉末，与油状的游离N，N’-二乙酰胱氨酸相比，具有吸湿性小、稳定性好的优点。与中国专利“N，N’-二乙酰胱氨酸的有机盐”(申请号93104963.6)中制备的N，N’-二乙酰胱氨酸赖氨酸盐相比，精氨酸与N，N’-二乙酰胱氨酸成盐后不仅具有良好的适于制剂的物理、化学性质，更具有突出的协同作用，提高治疗肝病、暴发性肝功能衰竭的疗效。但在该篇文献中没有对该化合物构型异构体进行选择。

胱氨酸和精氨酸分别具有L和D两种构型异构体，不同构型的氨基酸具有的生物学特性往往有很大的差别。尽管普遍认为天然存在于生物体的氨基酸构型才具有生理活性，也有观点认为这些含氨基酸的物质，其生物活性部分来源于在体内降解得到的氨基酸产物。但研究表明，N-乙酰半胱氨酸的药理作用非常多样，不能完全用其代谢产物的L-胱氨酸来替代，例如，N-乙酰半胱氨酸分子具有直接的抗自由基作用，还具有增强谷胱甘肽S转移酶活性的作用(Moldeus P & Cotgreave IA.Meth.Enzymol.234：482-492，1994)；研究表明N-乙酰半胱氨酸具有金属离子螯合作用，完全是由分子本身起作用而与代谢产物无关(Banner W Jr.et alToxicol.Appl.Pharmacol.83：142-147，1986)。N，N’-二乙酰胱氨酸具有强免疫调节作用，其免疫作用的强度是N-乙酰半胱氨酸的1000倍(Samstrand B；Jansson AH；Matuseviciene G，et al.JPharmacol Exp Ther.1999 Mar；288(3)：1174-84)。说明N，N’-二乙酰胱氨酸具有自身独特的药理作用机制，而不仅仅是作为N-乙酰半胱氨酸的前体药物发挥作用。另外，N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐分子中，不同精氨酸构型既影响N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐分子的物理化学性质，又影响其生物活性，包括药理作用机制和体内代谢动力学参数。因此，N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的不同构型异构体具有影响其作为药物应用的不同特性。

在一分子N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐分子中含有两分子胱氨酸和两分子精氨酸，因此N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐是具有多种构型异构体(N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐、N，N’ -二乙酰-L-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，P-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐，i-胱氨酸表示内消旋胱氨酸)。通常不同的构型异构体及其内消旋体和外消旋体在某些场合具有不同程度的物理化学性质和药物作用方面的差异，特别是手性药物是通过与体内的某种大分子中固有的结合位点产生诱导契合，从而抑制(或激动)该大分子的生理活性，达到治病的目的。生化反应的立体专一性，要求药物具有较高的光学纯度，在开发手性分子药物的过程中，优选构型和应用最佳构型成药是非常重要的环节。因此我们对N，N’-二乙酰胱氨酸精氨酸盐的各种构型所具有的物理、化学性质和药理作用进行了充分的研究，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于从不同构型的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐中优选出适于药物应用的构型，这些特定构型的化合物具有免疫调节活性，可以治疗免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病，具有抗感染、抗肿瘤作用，可以用于制备与这一药理作用相关联的抗感染、抗肿瘤药物，特别是这些特定构型的化合物具有治疗肝病肝损伤、肝功能衰竭的作用。

本发明的另一个目的是提供药物组合物，该组合物含有优选的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的特定构型化合物为药物活性成分，该药物组合物具有免疫调节活性，可以治疗免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病，具有抗感染、抗肿瘤作用，可以用于制备与这一药理作用相关联的抗感染、抗肿瘤药物的药物，特别具有治疗肝病肝损伤、肝功能衰竭的作用，含有该组合物的药物中不仅具有显著的药理药效和药物动力学的优势，还有利于降低生产成本。

本发明进一步提供上述含有优选构型作为药物活性成分的药物组合物及不同给药途径的各种制剂，这些制剂加有或不加药用载体。

本发明的另一个目的还在于提供这些优选构型的化合物的制备工艺。

本发明较优选的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体是N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型7)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型9)。这些立体构型化合物的结构如下：

构型1、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐

构型3、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐

构型7、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-精氨酸盐

构型9、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-精氨酸盐

本发明进一步优选的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体是N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)。

本发明最优选的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体是N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)。

本发明提供一种含有N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体的药物组合物，该组合物含有单一或混合的N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型7)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型9)为药物活性成分。

本发明进一步提供一种含有N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体的药物组合物，该组合物含有单一或混合的N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)为药物活性成分。

本发明还提供一种含有N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体的药物组合物，该组合物有含有N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)为药物活性成分。

上述含有优选构型作为药物活性成分的药物组合物可通过口服、直肠或肠胃外给药方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制剂如糖浆、口服液等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊、注射液和注射粉针。这些制剂加有或不加药用载体，可以按药学领域常规的生产方法制备，这些方法包括将活性成分与一种或多种的载体或赋形剂混合，一般制备的方法是，将活性成分均匀和紧密地与液体载体或磨细的固体载体混合，根据需要可以将产物干燥成型。

本发明的制剂包括合乎要求的赋形剂，这些赋形剂包括黏合剂、稀释剂、崩解剂、防腐剂、分散剂、助流剂和润滑剂。根据需要含有适量黏合剂、约5-10％崩解剂、约2-5％助流剂、约1％润滑剂。

片剂可以通过活性化合物和一种或多种的载体或赋形剂一起压缩或模压而成，片剂一般每片含有约100-500mg的活性成分。根据需要可以对片剂进行包衣，并可以配制成可以使活性成分缓释或控释的剂型。合乎需要的赋形剂例如乳糖、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、乙基纤维素、滑石粉和硬脂酸镁。

注射液可以含有抗氧化剂、缓冲液、等渗剂等。水性或非水性的悬浮液可以含有悬浮剂和增稠剂。

上述的制剂可以含有本领域常用的其他的药剂，例如，口服制剂可以含有调味剂。

本发明的药用组合物含有活性成分的摩尔数占整个组合物摩尔数的0.1％-99.5％。

N，N’-二乙酰胱氨酸制备有几种方法：方法一是以N-乙酰半胱氨酸为起始原料，在碱性条件下通过过氧化氢，再经离子树脂纯化，生成N，N’-二乙酰胱氨酸；方法二是以胱氨酸为起始原料，在碱性条件下用醋酸酐乙酰化，得N，N’-二乙酰胱氨酸。

N，N’-二乙酰胱氨酸与精氨酸成盐的办法，包括将纯化的N，N’-二乙酰胱氨酸、适量精氨酸，分别分散或溶解在溶剂或溶剂混合物中，再将两者混合。所用溶剂可以选自水、醇类、二元醇类、酮类、酰胺类、亚砜类或其他极性溶剂或溶剂混合物。所生成的盐经过减压浓缩、结晶、再用溶剂洗涤，最后干燥成品。在此，为了去除N，N’-二乙酰胱氨酸杂质，可以将N，N’-二乙酰胱氨酸溶液通过阳离子交换树脂，再用水洗脱；N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐结晶时宜采用的溶剂为醇类或醇酮混合溶剂，也可以在溶剂中加入适量水。

还可以采用方法三由N-乙酰半胱氨酸和精氨酸为起始原料，通过过氧化氢氧化直接合成N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐。

通过选择L-胱氨酸、D-胱氨酸或内消旋的胱氨酸为起始原料，利用方法二合成N，N’-二乙酰胱氨酸，能够获得不同构型的N，N’-二乙酰胱氨酸。再以单一或按比例混合的L-精氨酸、D-精氨酸为成盐剂，最终合成N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的不同构型异构体。也可以选择L-半胱氨酸或D-半胱氨酸，与L-精氨酸或D-精氨酸为起始原料，利用方法一或二合成N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的不同构型异构体。

对所合成的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐多种构型异构体，分析测定易结晶性、稳定性、吸湿性，并进行药物代谢、药效学等方面的研究。这些方面对选择合适的药用构型具有特别重要的作用。

优选的构型化合物具有的共同特征是分子中具有至少一个L构型精氨酸。L-精氨酸是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物。补充L-精氨酸能促进尿循环，降低血液中氨的含量，治疗血氨中毒，抢救垂危的病人。当人体肝功能不正常时，尿循环受阻，血液中氨含量增高，就会引起肝昏迷，肝昏迷是重症肝炎常见的并发症。L-精氨酸对急性病毒性肝炎，慢性持续性肝炎以及肝硬化也有较好的治疗效果，并可防止和治疗脂肪肝病变，起到有效护肝的作用。机体普遍存在精氨酸一氧化氮通路，在多种生理系统中表现出重要的生物介导特性和功能，在肝脏生理功能和疾病中，能调节肝细胞蛋白质合成，具有介导各型肝中毒及影响肝硬化血液动力学变化的重要机理。精氨酸在体内细胞代谢途径与肝细胞再生关系密切，动物试验表明，N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐分子中至少一个L构型精氨酸的构型化合物大多具有显著的疗效，与未成盐的L-精氨酸、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸，以及N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L-赖氨酸盐相比，减轻肝损伤和改善血清学指标的疗效更明显，肝衰竭动物的存活率显著提高，说明L-精氨酸与N，N-二乙酰胱氨酸成盐对治疗肝衰竭具有明显增效减毒的协同作用。因此，L-精氨酸与N，N’-二乙酰胱氨酸成盐，不仅解决了母体化合物难以结晶、易于吸湿的物理特性，而且提高了其生物活性。

在半乳糖胺合并脂多糖致敏小鼠引起免疫性肝衰竭的动物试验中令人惊奇地发现，在N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体中，N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-精氨酸盐、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-精氨酸盐等构型中虽然含有内消旋的胱氨酸和D型精氨酸，与N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐一样，能够明显降低动物死亡率，改善血清学指标，具有理想的药效。这一发现突破了通常认为的D型氨基酸不是人体天然存在的氨基酸，不具有生理活性的的常规认识。

因此，本发明较优选的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体为：N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)、N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型7)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型9)，具有较优的易结晶性、稳定性，不易吸湿，药效较好。

在进一步的药动学研究中发现，在N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体中，N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)主要分布在脾脏(免疫器官)，显示这两个构型的化合物具有显著的免疫器官靶向性，有利于发挥免疫调节作用。

因此本发明进一步优选N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)，他们除了具有优良的易结晶性、稳定性，不易吸湿，还具有强的免疫器官靶向性，有利于药效更好地发挥。

本发明优选的这些N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体不仅具有最优的物理化学性质和药效和药物代谢特性，毒理试验证明具有相当的安全性，为目前缺乏良药的肝衰竭提供新的有效治疗途径，也适合用于制备具有免疫调节活性的药物，用于与这一药理作用相关联的抗感染、抗肿瘤药物，可以治疗免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1  N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐的合成

先取氢氧化钾672g投入5L反应瓶内，加水2400ml溶解成浓碱液，降温至室温(20～30℃)时开始分次加入L-胱氨酸360g搅拌溶解，冷却至0℃以下。外用冰水浴冷却下缓慢滴加乙酸酐，控制内温不超过5℃。加毕，继续保温搅拌30分钟，放置3小时。滴加浓盐酸调节pH至2～3。得乙酰胱氨酸的水溶液。

乙酰胱氨酸的水溶液减压蒸馏(外温80℃)，浓缩至粘稠状，用丙酮-水(90∶10)分3次提取过滤去除大部分无机盐。提取液减压蒸馏除去丙酮，浓缩至粘稠，残留物加水溶解(约加水1500mL)。加入732阳离子树脂(约200mg)搅拌2～3小时。

过滤除去树脂，滤液搅拌下分批加入L-精氨酸523g，调节pH至7。继续搅拌30分钟，反应液减压浓缩至粘稠状，加入2L乙醇加热回流，溶解，放置冷却析晶。析出晶体后，过滤，用少量乙醇洗涤滤饼，滤干，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时。得N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐粗品909g，收率90％。

取上述粗品500g，加入90％乙醇4000ml(1∶8)，加热溶解，加活性炭25g回流脱色30分钟趁热过滤。滤液放至室温，冷藏析晶24小时(5℃以下。过滤，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，即得N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐精品450g，收率为90％。本品为白色结晶性粉末，本品在水、甲醇中易溶，在乙醇中微溶，熔点为203～208℃(分解)；比旋度为[α]_D ²⁰-61.0～-64.0。

精制品的元素分析结果见下表：

表1.N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氧酸盐精制品的元素分析结果

测试元素		C	H	N
					计算值(％)		39.28	6.59	20.82
实测值(％)	第一次	39.12	6.69	20.63
					第二次	39.18	6.72	20.69

平均值

39.15

6.71

20.66

测定结果表明，所得双酰胱氨酸精氨酸盐精制品的C、H和N含量实测值与理论值之差均小于0.3％。元素分析结果表明，1分子N，N’-二乙酰胱氨酸与2分子精氨酸成盐。

按氧瓶燃烧法(中国药典2000年版二部附录VIIC)，采用BaCl₂滴定法测定精制品的S含量。S含量测定值为9.33％，与理论值(9.53％)之差小于0.3％。S含量测定结果也表明，1分子二乙酰胱氨酸与2分子精氨酸成盐。

高分辨MS(ESI(+))测定的准分子离子峰[M+H]⁺峰的质量为175.1191(以内标物m/z206.1405校正，在10.0ppm允许误差范围内)，分子式(M)为C₆H₁₄N₄O₂，该成分为精氨酸；高分辨MS(ESI(-))测定的准分子离子峰[M-H]^-峰的高分辨测定质量为323.0365(以内标物m/z 250.1080校正，在10.0ppm允许误差范围内)，分子式(M)为C₁₀H₁₆N₂O₆S₂，为N，N’-二乙酰胱氨酸。

实施例2  N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐的合成

先取氢氧化钾670g投入5L反应瓶内，加水2400ml溶解成浓碱液，降温至室温至(20～30℃)时开始分次加入D-胱氨酸360g搅拌溶解，冷却至0℃以下。外用冰水浴冷却下缓慢滴加乙酸酐，控制内温不超过5℃。加毕，继续保温搅拌30分钟，放置3小时。滴加浓盐酸调节pH至2～3。得乙酰胱氨酸的水溶液。

乙酰胱氨酸的水溶液减压蒸馏(外温80℃)，浓缩至粘稠状，用丙酮-水(90∶10)分3次提取过滤去除大部分无机盐。提取液减压蒸馏除去丙酮，浓缩至粘稠，残留物加水溶解(约加水1500mL)。加入732阳离子树脂(约200mg)搅拌2～3小时。

过滤除去树脂，滤液搅拌下分批加入L-精氨酸523g，调节pH至7。继续搅拌30分钟，反应液减压浓缩至粘稠状，加入2L乙醇加热回流，溶解，放置冷却析晶。析出晶体后，过滤，用少量乙醇洗涤滤饼，滤干，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，。得N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐粗品856g，收率85％。

取上述粗品500g，加入85％乙醇4000ml(1∶8)，加热溶解，加活性炭30g，回流脱色30分钟，趁热过滤。滤液放至室温，冷藏析晶24小时(5℃以下。过滤，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，即得N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐精品400g，收率为80％。本品结晶易吸湿，在水、甲醇中易溶，在乙醇中微溶，熔点为201～206(分解)℃；比旋度为[α]_D ²⁰+115.4～+120.0°。元素分析计算值：C₂₂H₄₄N₁₀S₂O₁₀，C：39.28 H：6.59 N：20.82；实测值：C：39.17 H：6.70 N：20.68。S含量测定值为9.34％，理论值(9.53％)。

实施例3  N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐的合成

先取氢氧化钾675g投入5L反应瓶内，加水2400ml溶解成浓碱液，降温至室温至(20～30℃)时开始分次加入L-胱氨酸360g搅拌溶解，冷却至0℃以下。外用冰水浴冷却下缓慢滴加乙酸酐，控制内温不超过5℃。加毕，继续保温搅拌30分钟，放置3小时。滴加浓盐酸调节pH至2～3。得乙酰胱氨酸的水溶液。

乙酰胱氨酸的水溶液减压蒸馏(外温80℃)，浓缩至粘稠状，用丙酮-水(90∶10)分3次提取过滤去除大部分无机盐。提取液减压蒸馏除去丙酮，浓缩至粘稠，残留物加水溶解(约加水1500mL)。加入732阳离子树脂(约200mg)搅拌2～3小时。

过滤除去树脂，滤液搅拌下分批加入D-精氨酸523g，调节pH至7。继续搅拌30分钟，反应液减压浓缩至粘稠状，加入2L乙醇加热回流，溶解，放置冷却析晶。析出晶体后，过滤，用少量乙醇洗涤滤饼，滤干，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时。得N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐粗品900g，收率90％。

取上述粗品500g，加入90％乙醇4000ml(1∶8)，加热溶解，加活性炭25g回流脱色30分钟，趁热过滤。滤液放至室温，冷藏析晶24小时(5℃以下。过滤，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，即得N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐精品435g，收率为87％。本品为结晶缓慢，较易吸湿，在水、甲醇中易溶，在乙醇中微溶，熔点为201～205℃(分解)；比旋度为[α]_D ²⁰-83.7～87.2°。元素分析计算值：C₂₂H₄₄N₁₀S₂O₁₀，C：39.28 H：6.59 N：20.82；实测值：C：39.20 H：6.67 N：20.70。S含量测定值为9.36％，理论值(9.53％)。

实施例4  N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐的合成

先取氢氧化钾670g投入5L反应瓶内，加水2400ml溶解成浓碱液，降温至室温至(20～30℃)时开始分次加入i-胱氨酸360g搅拌溶解，冷却至0℃以下。外用冰水浴冷却下缓慢滴加乙酸酐，控制内温不超过5℃。加毕，继续保温搅拌30分钟，放置3小时。滴加浓盐酸调节pH至2～3。得乙酰胱氨酸的水溶液。

乙酰胱氨酸的水溶液减压蒸馏(外温80℃)，浓缩至粘稠状，用丙酮-水(90∶10)分3次提取过滤去除大部分无机盐。提取液减压蒸馏除去丙酮，浓缩至粘稠，残留物加水溶解(约加水1500mL)。加入732阳离子树脂(约200mg)搅拌2～3小时。

过滤除去树脂，滤液搅拌下分批加入L-精氨酸520g，调节pH至7。继续搅拌30分钟，反应液减压浓缩至粘稠状，加入2L乙醇加热回流，溶解，放置冷却析晶。析出晶体后，过滤，用少量乙醇洗涤滤饼，滤干，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，得N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐粗品911g，收率90％。

取上述粗品500g，加入90％乙醇4000ml(1∶8)，加热溶解，加活性炭25g回流脱色30分钟，趁热过滤。滤液放至室温，冷藏析晶24小时(5℃以下。过滤，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，即得N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐精品452g，收率为90％。本品为白色结晶性粉末，不易吸湿，在水、甲醇中易溶，在乙醇中微溶；熔点为160～162℃；比旋度为[α]_D ²⁰+26.9～+27.9°。元素分析计算值：C₂₂H₄₄N₁₀S₂O₁₀，C：39.28 H：6.59 N：20.82；实测值：C：39.22 H：6.69 N：20.70。S含量测定值为9.35％，理论值(9.53％)。

实施例5  N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐的合成

将300克N-乙酰-L-半胱氨酸与150克L-精氨酸和150克D-精氨酸溶于1000ml去离子水中，边搅拌边缓慢加入过氧化氢80ml，保持温度低于25℃以下，连续搅拌5小时。向将溶液中加入1000ml 95％乙醇，继续搅拌至结晶完全。用乙醇50ml洗涤，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，得N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐500克，收率82％。本品为白色结晶性粉末，不易吸湿，在水、甲醇中易溶，在乙醇中微溶；熔点为196～199℃(分解)；比旋度为[α]_D ²⁰-58.0～-61.2°。元素分析计算值：C₂₂H₄₄N₁₀S₂O₁₀，C：39.28 H：6.59 N：20.82；实测值：C：39.22 H：6.69 N：20.70。S含量测定值为9.35％，理论值(9.53％)。

实施例6  N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐的合成

将200克N-乙酰-L-半胱氨酸、200克N乙酰-D-半胱氨酸与200克L-精氨酸、200克D-精氨酸溶于1000ml去离子水中，边搅拌边缓慢加入过氧化氢80ml，保持温度低于25℃以下，连续搅拌5小时。向将溶液中加入1000ml 95％乙醇，继续搅拌至结晶完全。用乙醇50ml洗涤，减压干燥(40℃，-0.09MPa)24小时，得N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐650克，收率80％。本品为白色结晶性粉末，不易吸湿，在水、甲醇中易溶，在乙醇中微溶；熔点为156～158℃(分解)；比旋度为[α]_D ²⁰+16.5～+19.1°。元素分析计算值：C₂₂H₄₄N₁₀S₂O₁₀，C：39.28 H：6.59 N：20.82；实测值：C：39.22 H：6.65 N：20.74。S含量测定值为9.36％，理论值(9.53％)。

实施例7  N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体物理化学性质

构型异构体		熔点(℃)	比旋度[α]D 20(°)
				1	N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐	203～208(分解)	-61.0～-64.0
2	N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐	201～206(分解)	+115.4～+120.0
				3	N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氮酸盐	160～162(分解)	+26.9～+27.9
4	N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐	201～205(分解)	-83.7～87.2
				5	N，N’-二乙酰-D胱氨酸-D，D-二精氨酸盐	204～208(分解)	+145.2～+150.2
6	N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-D，D-二精氨酸盐	154～159(分解)	-40.2～-42.8
				7	N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐	196～199(分解)	-58.0～-61.2
8	N，N’-二乙酰-D-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐	178～181(分解)	+124.1～+127.0
				9	N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-二精氨酸盐	156～158(分解)	+16.5～+19.1

实施例8  N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体治疗小鼠免疫性肝衰竭的疗效方法摘要：给小鼠腹腔注射(ip)半乳糖胺(GalN)1000mg/kg，同时ip脂多糖(LPS)10μg/kg，给药组于注入GalN/LPS前、后1h分别ip.N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体200mg/kg，6h后测定血清转氨酶水平，取抗凝全血测定CD4+、CD8+、TH1、TH2，取肝组织作病理学观察，并观察24h死亡情况。

结果摘要：1、3、7、9型构型异构体能抑制GalN/LPS攻击6h后引起的小鼠血清ALT、AST活力增高，明显增加CD8+、TH1、TH2淋巴细胞，使肝组织损害减轻，提高小鼠存活率。说明1、3、7、9型构型异构体对Gal/LPS致小鼠免疫性肝衰竭有明显预防和治疗作用。尤以1型构型异构体疗效最好。

[试药配制]取N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体，用0.9％氯化钠溶液分别配制成每1ml含20mg的溶液，pH为6.5~8.0，用4#垂熔漏斗过滤，灌装于10ml安瓿中，熔封，105℃灭菌45分钟，临用前用生理盐水稀释或直接应用。

[试验动物]BalB/C♂小鼠每组10只。性别、体重：♂小鼠16～18g。试验期间所有动物除中毒后禁食20h(自由饮水)外，其余时间均自由进食和饮水。

[试验主要步骤]取BALB/C♂小鼠150只，随机分15组，每组10只。除阴性对照组外，所有动物同时ip 12％GalN溶液(含脂多糖10μg/kg)1000mg/kg，治疗组于中毒前1h和中毒后1h分别ip N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体200mg/kg，阳性对照1组ip促肝细胞生长素(pHGF)60mg/kg(文献剂量)，阳性对照2组ipN，N’-二乙酰-L-胱氨酸100mg/kg，阳性对照3组ipL-精氨酸100mg/kg，阳性对照4组ipN，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L-赖氨酸盐200mg/kg。模型和正常对照组ip同容积生理盐水，各组观察24h的存活情况，并于注入LPS/Gal 6h后，处死部分动物测定血清ALT和AST，取肝素抗凝全血用流式细胞仪测定CD4+、CD8+、TH1、TH2；取肝左叶制病理切片作组织学检查。

[试验对照]

正常对照组  ip同容积空白溶剂以排除溶剂影响。

模型对照组  ip同容积空白溶剂以求等同的注射次数。

阳性对照组  阳性对照1组采用目前临床用于治疗重型肝炎的促肝细胞生长素(pHGF)，广东阳江药厂生产(94)卫药准字x-67号，批号：021013，20mg/瓶，，并根据文献剂量。按照pHGF药效学研究表明，能促进肝衰竭大鼠DNA合成，抑制TNF，改善血液循环及降低死亡率，因此受试药物与阳性对照药物的用途基本一致。阳性对照2组采用江苏正大天晴药业股份有限公司研究所合成的N，N’-二乙酰-L-胱氨酸100mg/kg，阳性对照3组ip采用L-精氨酸(Sigma公司)100mg/kg，阳性对照4组采用江苏正大天晴药业股份有限公司研究所合成的N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L-赖氨酸盐200mg/kg。

[统计学方法]试验结果求均数( x)与标准差(s)，除死亡率显著性检验用x²检验，其它显著性检验用非配对t检验，病理组织学采用等级序值法检验。P≤0.05或P≤0.01认为具有统计学意义。

[实验结果]

1、对GalN/LPS致肝衰竭小鼠死亡率的影响小鼠ip GalN/LPS 6h后，饮食、活动明显减少，多数小鼠出现萎靡、嗜睡、竖毛，8h后症状加剧，昏迷、出血并开始死亡，构型1、3、7、9治疗组(200mg/kg)的症状明显比模型对照组轻，降低死亡率的疗效比阳性对照药好，存活动物恢复很快，24h后饮食、活动明显增加。结果见表一。试验结果表明构型1、3、7、9具有显著的疗效。

      表一、对LPS/Gal致肝衰竭小鼠死亡率的影响( x±s)

试验组	动物数	剂量(mg/kg)	死亡率(％)
				模型对照组	10		80
正常对照组	10		0
				阳性对照1组	10	60	50**
阳性对照2组	10	100	70*
				阳性对照3组	10	100	80*
阳性对照4组	10	200	70**
				构型1治疗组	10	200	30**
构型2治疗组	10	200	60**
				构型3治疗组	10	200	40**
构型4治疗组	10	200	60**
				构型5治疗组	10	200	60**
构型6治疗组	10	200	60**
				构型7治疗组	10	200	30**
构型8治疗组	10	200	70**
				构型9治疗组	10	200	40*

^*p＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较。

2、对GalN/LPS引起肝衰竭小鼠血清ALT和AST活力的影响

小鼠ip GalN/LPS5h后血清转氨酶水平稍增高，构型1、3、7、9治疗组能明显抑制转氨酶的活力，改善血清学指标，见下表

               表二、对LPS/Gal引起肝衰竭小鼠血清ALT和AST活力的影响( x±s)

试验组	动物数	剂量(mg/kg)	ALT(IU/L)	AST(IU/L)
					模型对照组	10		98.5±25.3	203.2±56.8
正常对照组	10		42.5±10.6**	83.6±1 5.6**
					阳性对照1组	10	60	63.1±24.7**	139.1±33.2**
阳性对照2组	10	100	81.9±25.6**	176.2±30.3**
					阳性对照3组	10	100	93.2±23.4**	179.3±34.5**
阳性对照4组	10	200	80.2±23.7**	173.3±31.6**
					构型1治疗组	10	200	63.4±12.3**	142.0±34.2**
构型2治疗组	10	200	84.6±15.4**	172.0±44.1**
					构型3治疗组	10	200	67.7±17.1**	157.2±36.8**
构型4治疗组	10	200	73.9±11.3**	158.0±30.8**

构型5治疗组	10	200	94.6±25.2**	192.0±44.7**
					构型6治疗组	10	200	75.8±18.4**	155.2±31.6**
构型7治疗组	10	200	64.7±13.2**	142.0±28.3**
					构型8治疗组	10	200	91.6±26.3**	188.0±42.5**
构型9治疗组	10	200	70.6±17.6**	140.2±30.5**

^*p＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较。

3、对免疫性肝衰竭小鼠T细胞增殖分化的影响

GalN/LPS注射后6h，小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞明显降低，TH1、TH2淋巴细胞略有增加。与模型对照组比较1、3、7、9型构型治疗组明显增加CD8+淋巴细胞，并上调TH1、TH2细胞活性，使免疫性肝衰竭小鼠病情减轻，死亡率下降。试验结果见下表：

                                      表三、对免疫性肝衰竭小鼠T细胞增殖分化的影响( x±s)

试验组	动物数	剂量(mg/kg)	CD4+(％)	CD8+(％)	TH1(％)	TH2(％)
							正常对照组	10		57.0±14.7**	5.0±3.3**	0.30±0.19**	0.28±0.10**
模型对照组	10		36.6±13.2	2.0±1.0	0.39±0.28	0.34±0.27
							阳性对照1组	10	60	36.4±15.6**	3.3±1.5**	0.20±0.13*	0.28±0.08*
阳性对照2组	10	100	42.2±16.3**	3.3±0.8**	1.00±0.53**	1.28±0.08**
							阳性对照3组	10	100	36.4±15.1**	2.9±0.4**	0.40±0.24**	0.88±0.38**
阳性对照4组	10	200	41.4±16.2**	3.0±0.7**	1.10±0.62**	1.18±0.89**
							构型1治疗组	10	200	54.8±15.1**	12.6±4.1**	3.51±1.47**	4.37±1.21**
构型2治疗组	10	200	38.1±10.0*	8.7±3.2*	0.91±0.32*	1.40±1.08*
							构型3治疗组	10	200	50.5±12.2**	11.9±3.1**	3.01±1.40**	4.40±2.02**
构型4治疗组	10	200	31.4±12.3**	9.7±3.0**	2.91±0.82**	2.00±1.18**
							构型5治疗组	10	200	32.8±10.1**	7.7±2.7**	1.12±0.40**	2.00±0.09**
构型6治疗组	10	200	40.0±11.0**	8.6±2.5**	2.01±1.02**	3.30±0.69**
							构型7治疗组	10	200	53.4±11.7**	12.1±3.0**	3.44±0.89**	4.42±1.08**
构型8治疗组	10	200	35.6±9.4**	2.90±0.2**	0.96±0.10**	0.89±0.17**
							构型9治疗组	10	200	45.2±10.3**	11.6±3.3**	2.74±0.42**	3.30±0.69**

^*p＜0.05，**P＜0.01与模型对照组比较。

4、对GalN/LPS引起肝衰竭小鼠肝组织学的影响

                    表四、GalN/LPS引起肝衰竭小鼠各级肝组织损伤的动物数

试验组	动物数	剂量(mg/g)	3级	2级	1级	0级	平均级数
								正常对照组	10		0	0	0	10	0
模型对照组	10		6	3	1	0	2.5
								阳性对照1组	10	60	1	7	2	0	1.9
阳性对照2组	10	100	3	6	1	0	2.2
								阳性对照3组	10	100	3	7	0	0	2.3

阳性对照4组	10	200	3	6	1	0	2.2
								构型1治疗组	10	200	1	1	8	0	1.3
构型2治疗组	10	200	2	2	6	0	1.6
								构型3治疗组	10	200	1	2	7	0	1.4
构型4治疗组	10	200	3	4	3	0	2.1
								构型5治疗组	10	200	3	3	4	0	1.9
构型6治疗组	10	200	2	3	5	0	1.7
								构型7治疗组	10	200	1	3	6	0	1.5
构型8治疗组	10	200	2	5	3	0	1.9
								构型9治疗组	10	200	1	4	5	0	1.6

平均级数＝损伤级别*相应级别的动物数/每组动物数

实施例9  N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体在小鼠体内的组织分布

取昆明种小白鼠12只，随机分成3组，每组4只，分别尾静脉注射给予80mg/kg的N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)，N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型7)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，D-精氨酸盐(构型9)，并在给药后5、30、及60分钟处死动物取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、肠、胃、睾丸、子宫等组织并称重，分别加生理盐水2.0mL制成匀浆，然后离心沉淀，取上清液10μL在选定的色谱条件下进行分析，以内标法计算所含样品浓度。

适宜的色谱条件：LichrospherC18柱(4.6mm 15cm，dp5μm)，流动相为甲醇∶0.025mol/L磷酸二氢钾(PH3.0)＝10∶90(v/v)。检测波长205nm。

试验结果表明，N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型1)、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-精氨酸盐(构型3)在脾脏的组织含量远远高于在其他组织，提示这两种构型化合物具有脾靶向性，其他构型化合物不具有这种靶向性。试验结果见下表：

         表五  N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体在小鼠提体内的组织分布(n＝4)

平均组织分布(60min，μg/g)	构型1	构型3	构型7	构型9
					心	0	0	0	0
肝	0	0	20.9±2.8	41.2±3.6
					脾	110.6±20.2	102.8±18.1	30.5±5.6	22.8±3.4
肺	0	0	0	0
					肠	15.0±3.5	25.4±3.2	62.3±10.6	68.4±8.0
肾	3.6±1.1	3.2±1.0	11.6±1.8	15.3±2.0
					胃	0	0	0	0

脑	0	0	0	0
					肌肉	0	0	0	0
子宫	0	0	0	0
					睾丸	0	0	0	0

实施例10  注射液

处方：

N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐    10g

氯化钠                                    9g

注射用水                                  加至1000ml

将氯化钠加至约800ml注射用水中搅拌使溶解，加入N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐，调节pH至7.0，加水至全量，加热至55℃左右，加入针用活性炭，保温吸附30分钟，脱炭，过滤球、滤膜，灌封，灭菌、包装，即得。可分装于250ml、500ml的输液瓶中。

实施例11  注射用无菌粉末

将N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸溶于注射用水后，加入活性炭滤过，经喷雾干燥，无菌分装，密封，得注射用无菌分装产品。规格可制成25mg、50mg、100mg、500mg、1g。

实施例12胶囊剂

处方：

N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐   150g

N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐   150g

预胶化淀粉                               150g

硬脂酸镁                                 1.5g

制成                             1000粒胶囊

将N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐、N，N’-二乙酰-i-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐分别粉碎过筛，加入预胶化淀粉、硬脂酸镁，混匀，装入胶囊壳，即得。

实施例13  片剂

处方：

N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐     500g

乳糖                                       150g

羧甲基淀粉钠                               100g

微晶纤维素                                 80g

微粉硅胶                                   10g

硬脂酸镁                                   5g

85％乙醇                                   适量

制成                                       1000片

将N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐、乳糖、微晶纤维素及半量的羧甲基淀粉钠混匀，用85％乙醇制粒，烘干、整粒后，加入剩余羧甲基淀粉钠、微粉硅胶、硬脂酸镁混匀，压片，即得。

实施例14  片剂

处方：

N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐           10g

乳糖                                             10g

羧甲基淀粉钠                                     10g

微晶纤维素                                       8g

微粉硅胶                                         12g

硬脂酸镁                         0.6g

85％乙醇                         适量

制成                             1000片

将N，N’-二乙酰-L-胱氨酸-L，L-二精氨酸盐、乳糖、微晶纤维素及半量的羧甲基淀粉钠混匀，用85％乙醇制粒，烘干、整粒后，加入剩余羧甲基淀粉钠、微粉硅胶、硬脂酸镁混匀，压片，即得。

Claims (11)

1、N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐构型异构体，其特征在于分子中胱氨酸为L型或内消旋型，同时分子中精氨酸的构型是至少含有一个L型精氨酸，结构如下：

或

或

或

2、如权利要求1所述的的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体，结构如下：

或

3、如权利要求1所述的的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体，结构如下：

4、一种组合物，其特征在于含有一种或几种权利要求1所述的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体为其活性成分。

5、权利要求4的组合物，其特征在于含有一种或几种权利要求2所述的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体为其活性成分。

6、权利要求5的组合物，其特征在于含有权利要求3所述的N，N’-二乙酰胱氨酸二精氨酸盐的构型异构体为其活性成分。

7、权利要求4所述的组合物，其特征在于含有合适的药用载体。

8、权利要求7的组合物为口服、注射制剂。

9、权利要求1-3任一化合物的制备方法，该方法包括以L-胱氨酸、D-胱氨酸或内消旋的胱氨酸为起始原料，在碱性条件下用醋酸酐乙酰化，得到双乙酰胱氨酸，再加入光学纯的L-精氨酸或D-精氨酸，分散溶解，减压浓缩、结晶、洗涤，最后干燥成品。

10、权利要求1-3任一化合物的制备方法，该方法包括以N-乙酰的L-半胱氨酸、D-半胱氨酸或内消旋的半胱氨酸为起始原料，在碱性条件下通过通过过氧化氢，纯化得到双乙酰胱氨酸，再加入光学纯的L-精氨酸或D-精氨酸，分散溶解，减压浓缩、结晶、洗涤，最后干燥成品。

11、权利要求1-3任一化合物在用于制备具有免疫调节活性的药物，抗肿瘤药物、治疗免疫缺陷性疾病、自身免疫性疾病的药物、治疗感染性疾病或治疗肝病肝损伤、肝功能衰竭的药物中的应用。