CN100339373C

CN100339373C - 紫杉醇类似物的制备和作为抗肿瘤剂的应用

Info

Publication number: CN100339373C
Application number: CNB961930209A
Authority: CN
Inventors: R·C·潘迪; L·K·扬科夫; R·奈尔; A·保罗艾
Original assignee: Xechem Inc
Current assignee: Xechem Inc
Priority date: 1995-12-13
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2007-09-26
Anticipated expiration: 2016-12-13
Also published as: WO1997029098A1; BR9607101A; CA2210924C; AU1461797A; CN1190964A; CA2210924A1; AU724929B2

Abstract

本发明提供了新的紫杉醇类似物，特别是2″，3″侧链卤化的三尖杉宁碱，它们对于许多种肿瘤在体外和体内都显示出类似紫杉醇的强效力。

Description

紫杉醇类似物的制备和作为抗肿瘤剂的应用

紫杉醇(Paclitaxel)是著名的抗肿瘤剂，并且已被美国食品医药管理局批准用于治疗乳腺癌和卵巢癌。这种药物目前还正进行用于治疗其它类型癌症的临床试验。但是，世界范围内紫杉醇的供应只限于为数不多的紫杉树和紫杉醇含量相对较少的其它紫杉物种，对于用于人和动物的抗肿瘤治疗和为研制具有类紫杉醇抗肿瘤作用的抗肿瘤药而进行的常规生物活性试验来讲，紫杉醇严重短缺。因此，极其需要紫杉醇的替代来源以及具有类紫杉醇抗肿瘤作用的替代化合物。

紫杉醇常常与其结构类似的著名的紫杉烷——三尖杉宁碱(Cephalomannine)一起存在。三尖杉宁碱和紫杉醇的结构示于下面式(I)中。

紫杉醇

三尖杉宁碱

紫杉醇和三尖杉宁碱是在短叶紫杉树和其它紫杉物种(包括欧洲紫杉、东北紫杉、云南紫杉、紫杉、Taxus capitata，Taxus brownii和Taxus dark green spreader)的树皮中发现的天然产物。在粗榧物种例如西双版纳粗榧以及培养的植物细胞和真菌中也发现有这些化合物。

据报道三尖杉宁碱在缓解白血病肿瘤方面有效。见美国专利4,206,221。

根据本发明，现在出乎意料地发现某些新的紫杉醇类似物，尤其是2″，3″侧链卤化的三尖杉宁碱，在许多肿瘤中显示出很强的体外和体内类紫杉醇功效，从而为紫杉醇和紫杉醇衍生物(如Taxotere)提供了一种适用的替代物。

三尖杉宁碱和紫杉醇的化学结构中都含有11个不对称碳原子，其中9个是在紫杉烷环上，2个是在碳13位的侧链上。三尖杉宁碱和紫杉醇的立体结构示于下面式(II)中：

紫杉烷的立体结构图

1.紫杉醇

2.三尖杉宁碱；

三尖杉宁碱中的环外2″，3″侧链双键以及此化合物结构中存在的立体中心数目，提供了这种紫杉烷存在许多立体异构体的可能性。例如，三尖杉宁碱可以分布在两种异构形式中，其中碳13位的羟基被苯基异丝氨酸酰化，而苯基异丝氨酸在氨基处被(Z)-或(E)-2-甲基-2-丁烯酸酰化分别导致(Z)-和(E)-三尖杉宁碱的形成。此外，已知三尖杉宁碱和紫杉醇由于在层析过程中受热或是由于在酸性或碱性溶液中，可以在碳7位发生差向异构，形成示于下面式(III)中的7-表-三尖杉宁碱。Miller等，有机化学杂志(J.Org.Chem)， 40：1469(1981)；Chaudhary等，有机化学杂志(J.Org.Chem)， 58：3978(1993)；和Wender等，CRC出版社，Boca Raton，Fla.，(1995)。因此，在卤化时2″，3″侧链位可以形成非对映异构产物的混合物。

因此，除了上面所述的以外，本发明提供了2″，3″-二卤三尖杉宁碱和2″，3″-二卤-7-表-三尖杉宁碱的分离和纯化的非对映异构体，它们显示出强的抗肿瘤效力。

7-表-三尖杉宁碱

发明详述及优选实施方案

本发明提供了紫杉醇的新类似物，特别是分离并纯化的2″，3″-二卤三尖杉宁碱和2″，3″-二卤-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体，它们在许多肿瘤细胞系中显示出强的体外和体内类紫杉醇抗肿瘤活性。本发明还提供了制备这些化合物的方法及其在肿瘤治疗中的应用。

根据本发明，二卤三尖杉宁碱类似物的非对映异构体混合物是以良好的产率由相对较纯的三尖杉宁碱来源制得或是由含有三尖杉宁碱、紫杉醇及其它紫杉烷化合物的未纯化的复杂混合物制得。这种类似物的制备方法是将三尖杉宁碱分子的不饱和侧链选择性卤化，同时留下分子的其它部分或混合物中其它重要的紫杉烷化合物(如紫杉醇)不受触动。

由混合物中分离和纯化单体的2″，3″-二卤三尖杉宁碱/二卤-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体是用常规方法完成的，这些化合物也显示出强的抗肿瘤效力。

进行选择性卤化的方法是，使三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱在一定的条件下反应，这包括能有效地使这些化合物的2″，3″侧链部分选择性卤化温度和时间，然后将所形成的极性较小的二卤三尖杉宁碱/二卤-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体混合物与紫杉醇和其它紫杉烷化合物分离。单体的非对映异构体可以用标准的层析方法和/或重结晶法从混合物中分离出来。

本发明的合成方法很有利地与紫杉烷化合物的各种复杂的或较纯的混合物中存在的三尖杉宁碱及7-表-三尖杉宁碱的浓度无关，因此可使用含三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱的任何来源作为起始物。这些来源的典型例子包括各种紫杉物种的树皮，例如短叶紫杉、欧洲紫杉、云南紫杉、紫杉和喜马拉雅紫杉；粗榧物种，例如西双版纳粗榧；植物材料；各种紫杉和粗榧物种的叶、针叶和桠枝；含有紫杉烷类化合物的复杂混合物的生物体提取物；以及由诸如紫杉和粗榧物种的细胞培养物和产生三尖杉宁碱的真菌等来源生产三尖杉宁碱及7-表-三尖杉宁碱的下游纯化液中。

在本发明的一项实施例中，将除紫杉醇外还含有三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱的紫杉烷混合物用溶在惰性溶剂(优选卤化的溶剂，如四氯化碳、氯仿、二氯甲烷或二氯乙烯)中的化学计量数量的卤素(如溴或氯)处理。例如，在一种典型的处理方法中，用卤素在四氯化碳中处理含大约30％重量三尖杉宁碱的混合物，结果以定量产率形成了2″，3″-二卤三尖杉宁碱非对映异构体和相应的2″，3″-二卤-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体的混合物。通用的反应方案(IV)如下：

其中，

I.(2″R，3″S)-二卤三尖杉宁碱

R₁＝OH R₂＝H

II.(2″S，3″R)二卤三尖杉宁碱

R₁＝OH R₂＝H

III.(2″R，3″S)-二卤-7-表-三尖杉宁碱

R₁＝H R₂＝OH

IV.(2″S，3″R)-二卤-7-表-三尖杉宁碱

R₁＝H R₂＝OH

X＝卤素

所形成的纯的二卤非对映异构体I-IV可以分离，其化学结构用常规的分析和物理化学方法阐明。

另外，根据本发明，对于含三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱以及约0.01-99.05％重量紫杉醇的混合物的卤化，所用的方法与上述相似。先将混合物溶在惰性溶剂中，优选四氯化碳、氯仿、1，2-二氯乙烷或二氯甲烷，随后与卤素反应，例如与溴或氯在惰性的氯化溶剂中的溶液反应，搅拌反应混合物直到三尖杉宁碱反应完全。反应优选在-20℃至20℃的温度下进行，更优选的反应温度是-5至5℃，最好是在暗处进行。优选的卤素溶液是溴或氯在四氯化碳中的0.01-0.1M溶液。为保证反应条件有利于形成所要的2″，3″-二卤三尖杉宁碱和/或2″，3″-二卤-7-表-三尖杉宁碱非对映异构反应产物，可以方便地用常规的分析技术(如HPLC)监测反应的进程并保持合适的反应条件。

含有紫杉烷杂质的反应混合物随后可以用常规方法，例如层析和重结晶，进行分离和纯化，分离和纯化过的单体非对映异构体可用于抗肿瘤治疗。

传统的知识会使人们预料，在有几个官能基的紫杉烷化合物存在下使用卤素将产生不良的副反应，从而消耗三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱和卤素的浓度，而不形成所要的二卤三尖杉宁碱，或是使其相当高的产率降低。还预料其它有价值的紫杉烷，例如紫杉醇，会由于这种卤化作用而降级。但是，本发明发现，三尖杉宁碱和7-表-三尖杉宁碱中2″，3″-侧链双键卤化的选择性在所控制的条件下很高，紫杉醇既不明显降级也不发生卤化。如上所述，通过用例如HPLC对反应进行监测，卤化期间任何不良的降级或反应产物均可避免，并且能适当地调节有效条件而无需过多的实验工作。

本发明中使用的卤素的摩尔当量取决于三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱含量和其它不饱和化合物是否存在。一般来说，纯度较差的混合物，即，相对于三尖杉宁碱和7-表-三尖杉宁碱不饱和紫杉烷类的含量较多的混合物，将需要较高摩尔当量的卤素使混合物中存在的所有的或基本上所有的三尖杉宁碱和/或7-表-三尖杉宁碱卤化。通常在植物提取物中与三尖杉宁碱、7-表-三尖杉宁碱和紫杉醇一起存在的各种其它不饱和紫杉烷的结构在列下面式(V)中：

提供以下实施例用以说明本发明的优选实施方案，具体说明含有不同数量三尖杉宁碱、7-表-三尖杉宁碱、紫杉醇及其它紫杉烷类的样品的选择性溴化和氯化，而没有明显的不良反应和/或降级(例如紫杉醇)。还提供了显示本发明的二卤三尖杉宁碱/二卤-7-表-三尖杉宁碱化合物抗肿瘤效力的实施例。

这些实施例只是用来说明本发明的某些实施方案，而不是对于由权利要求限定的本发明范围的限制。

实施例1

含三尖杉宁碱的部分纯化混合物的溴化

将还含有约6-7％紫杉醇的91.5％三尖杉宁碱0.63g(0.0007mol)在150ml四氯化碳中的溶液加到一只装有250ml分液漏斗的500ml三口圆底烧瓶中。然后将烧瓶浸在冰盐浴中。当温度降到-5℃时，以反应温度不超过5℃的速度在搅拌下慢慢加入溴(0.1221g)在四氯化碳中的溶液(76.31ml，0.01M)。三尖杉宁碱与溴的摩尔比为1∶1.1。这一加入步骤约需3小时，所形成的溶液为浅褐色并且混浊。

每小时进行HPLC分析以监测溴化反应。当所有的三尖杉宁碱都转化成2″，3″-二溴衍生物时反应完全，根据HPLC分析这需要8小时。由于溴的消耗，与深色的起始溶液不同，反应混合物为浅黄色至无色。

然后将反应混合物转移到一升的分液漏斗中，先用0.5％亚硫酸钠水溶液(300ml)和0.5％碳酸氢钠水溶液(300ml)洗，然后用去离子水洗2次(每次200ml)，至最终pH为6.5。合并的水层用CH₂Cl₂萃取一次，CH₂Cl₂层与先前的有机萃取液混合。有机层随后用Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发至干。产量为0.76g浅奶油色固体，按起始物计产率约100％。

将奶油色的固体物质在硅胶柱(50g，ICN Silitech，32-63D，60)上层析，用丙酮∶CH₂Cl₂溶剂混合物(10∶90)作洗脱剂。收集50ml级分并用TLC检验(硅胶60 F₂₅₄，Merck#5554，用丙酮/CH₂Cl₂：20/80展开，用香草醛-硫酸/甲醇喷雾试剂)。此级R_f＝0.64处有一单斑的级分(级分#26-#38)混合，浓缩至干，得到0.485g浅奶油色粉末，将其重结晶成白色晶状固体，熔点158℃，用物理化学方法(TLC，HPLC，UV，IR，NMR，MS)鉴定为2″，3″-二溴三尖杉宁碱。按起始物三尖杉宁碱计算，产率估计为70％。

实施例2

含有三尖杉宁碱、紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的粗制混合物的溴化

采用与实施例1中使用的类似装置，将2.0g粗制的紫杉醇样品溶在150ml四氯化碳和150ml CH₂Cl₂中形成透明的浅黄色溶液，该样品根据HPLC分析含有51.2％紫杉醇、28.8％三尖杉宁碱和约20％其它紫杉烷类或非紫杉烷类杂质的混合物。将烧瓶浸在冰盐浴中搅拌。当温度降到-5℃时，以反应温度不超过5℃的速度向溶液中加入0.1332g100％溴在83.13ml(0.01M)四氯化碳中的溶液(1摩尔三尖杉宁碱∶1.2摩尔溴)。加料约需3小时，形成混浊的浅黄褐色溶液。加完溴之后，使反应在相同条件下再继续8小时，每小时进行紫杉醇和三尖杉宁碱的HPLC分析。当溶液变成无色或浅黄色并且所有的三尖杉宁碱都已转化成二溴衍生物时，反应完成。如果在上述8小时后溶液仍含有多于1-2％的三尖杉宁碱，则保持原来的条件，逐滴加入10ml 0.01M溴/四氯化碳，反应1小时，然后再用HPLC分析。

反应混合物中多余的溴用0.5％Na₂SO₃水溶液(300ml)、0.5％NaHCO₃水溶液(200ml)和去离子水(2×200ml)依次洗涤除掉。反应混合物用无水硫酸钠干燥，在高真空下浓缩至干，得到2.35g干燥的浅奶油色至白色的粉末。干物质随后在实施例1列出的条件下在硅胶柱上纯化。要分离的混合物与硅胶之比为1∶60，因此使用120g硅胶。每个级分均用TLC检验，每第三个级分用HPLC检验。将在TLC中具有相同R_f并在HPLC中具有相同保留时间的级分混合，得到两个合并的级分。级分(#25-#39)显示一个R_f 0.64的TLC单斑，代表二溴三尖杉宁碱；级分(#41-#81)显示R_f 0.49的TLC单斑，代表紫杉醇。

级分#25-#39在约40℃于高真空下浓缩至干以后，形成白色到浅黄色固体0.460g(理论产率的66.6％)，熔点158-160℃，用TLC测定色谱纯度为96.19％。

所用的TLC材料如下：在硅胶60 F₂₅₄板(Merck，#5554)上R_f＝0.64(单斑)

溶剂体系：丙酮∶CH₂Cl₂(20∶80)

喷雾试剂：香草醛/硫酸在甲醇中

所得二溴三尖杉宁碱的质谱[FAB]⁺：

[M+H]⁺＝990，992，994

[M+Na]⁺＝1014

[M+K]⁺＝1030

第二合并级分(#41-#81)浓缩后得到1.16g(＞100％理论产率)紫杉醇，将它用50∶50丙酮/己烷重结晶、过滤，用同样比例的冷却溶剂洗，在40℃于高真空下干燥24小时。产量为0.902g(按起始物计为45.11％，按起始物中紫杉醇的HPLC分析计为88.08％)白色晶体物质，熔点214-216℃。

TLC分析物质：在可信样品存在下在硅胶60 F₂₅₄板〔Merck#5554〕上R_f＝0.49。

溶剂体系：丙酮/CH₂Cl₂(20∶80)。

喷雾试剂：香草醛/硫酸在甲醇中

所形成物质的紫外与红外光谱均与纯的紫杉醇相当，从而证实此溴化反应对于三尖杉宁碱的2″，3″不饱和侧链位置的高度选择性，而留下它的密切类似物紫杉醇不受触动。

实施例3

说明含三尖杉宁碱的粗制混合物溴化反应的放大实施例

将10.00g粗制的紫杉醇(根据HPLC分析，含量为28.8％三尖杉宁碱、51.2％紫杉醇和约20％其它紫杉烷类或非紫杉烷类杂质)溶在一只2升三口烧瓶内的1.5升四氯化碳中，烧瓶装有一个500ml的分液漏斗、回流冷凝器、温度计和磁搅拌器，并浸没在冰盐浴中。搅拌反应混合物直到温度降到-5℃，然后逐滴加入41.2ml 0.1M的溴(0.665g溴)/四氯化碳溶液，历时约3小时。三尖杉宁碱与溴之摩尔比为1∶1.2。温度不超过5℃。加完溴溶液后，继续搅拌并维持温度为-1至5℃。每小时用HPLC监测反应，直到所有的三尖杉宁碱都转化成二溴衍生物(约8小时)。此1500-1600ml溶液的最终颜色是浅黄或奶油色，这取决于起始混合物的颜色和可能存在的少量多余溴。

为除掉任何微量的溴，将反应混合物依次用0.5％Na₂SO₃水溶液(500ml)、0.5％NaHCO₃水溶液(500ml)和去离子水(2×500ml)洗。反应混合物随后用无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩至干，得到13.20g浅奶油色至白色的固体物质。

此物质在以上实施例1和2中列出的条件下于硅胶柱上层析分离。用淤浆法制备一只装有600g硅胶(比例1∶50)的100×5cm的玻璃柱。将柱子用丙酮/CH₂Cl₂(10∶90)洗脱。使用1升丙酮/CH₂Cl₂(25∶75)作为最终的柱洗液。每个级分均用TLC分析，每第3个级分用HPLC分析。级分#11-#22具有R_f＝0.64的单斑，将它们合并，浓缩至干燥(40℃，高真空)，得到3.25g(95％)2″，3″-二溴三尖杉宁碱，为白色至浅黄色固体。

此化合物的分析如下：

熔点：158-160℃

R_f＝0.64(单斑)，在硅胶60 F₂₅₄板(Merck，#5554)上。

溶剂体系：丙酮/CH₂Cl₂(20∶80)

喷雾试剂：香草醛/硫酸在甲醇中

元素成分和分子量(根据HR FAB⁺)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁷⁹Br₂[M+H]⁺：

计算值：990.191000

实验值：990.191103(Δm＝0.1ppm)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁷⁹Br⁸¹Br[M+H]⁺：

计算值：992.181000

实验值：992.189057(Δm＝8.1ppm)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁸¹Br₂[M+H]⁺：

计算值：994.175000

实验值：994.187011(Δm＝12.1ppm)

C₄₅H₅₃NO₁₄Na⁷⁹Br⁸¹Br[M+Na]⁺：

计算值：1014.161000

实验值：1014.171002(Δm＝9.9ppm)

C₄₅H₅₃NO₁₄K⁷⁹Br⁸¹Br[M+K]⁺：

计算值：1030.097000

实验值：1030.144940(Δm＝46.5ppm)

[α]_D ²⁵＝-40.207°(c0.29，MéOH)

甲醇中的紫外光谱[λ_max nm，(ε)]：274.2(1550.8)；227.1(18610.4)；

221.8(18325.1)

KBr中的红外光谱(cm^-1)3500，1105，1070(叔和仲OH)

3420，1670，1580(-CONH-)

3110，3060，1605，1505，770，710

(单取代的芳族化合物.)

3060，2960，2915，2870，1465，1370

(-CH₃，-CH₂-，＝CH-)

3020，1670，1310，980(双键)

1730，1270(芳族酯)

1715，1240(＞C＝O)

1730，1180(乙酸酯)

855(环氧化物环)

520(溴化合物)

¹H NMR，在CDCl₃中(300MHz)：1.94(d，3H，-COC(Br)CH₃-5″)

(ppm；仅侧链质子) 1.98(d，3H，-HC(Br)CH₃-4″)

4.63(qt，1H，＞CH(Br)-3″)

¹³C NMR(300MHz) 170.21和170.25(C-1′)

(ppm，仅侧链C)

72.76 and 72.90(C-2′)

172.26 and 172.32(C-1″)

54.34 and 54.52(C-3′)

69.71 and 69.88(C-2″)

55.13 and 55.35(C-3″)

30.39 and 30.77(C-4″)

27.21 and 27.62(C-5″)

EI-MS 568，551，509，491，449，431，405，391，386，329，

(m/z)

(主碎片)

326，308，278，264，245，217，200，188，159，149，

122，105，91，83，77，55，43.

DCI-MS(m/z)

(主碎片)

569，552，510，492，474，450，432，

424，392，387，370，329，327，309，279，265

264，246，218，200，188，167，149，125，124，

106，101，100，91，83，69.

FAB⁺-MS： 1030[M+K]⁺；1014[M+Na]⁺；992

(正离子模式) [M+H]⁺(见元素分析)；974[M-H₂O]⁺；

(m/z) 932[M-AcOH]⁺；914[M-AcOH-H₂O]⁺；912

[M-HBr]⁺；870[M-BzOH]⁺；854[870-

H₂O-2H]；832[M2-HBr]⁺；705[M-243-

Ac]⁺；569[T]⁺；551[T-H₂O]；509[T-

AcOH]⁺；491[T-AcOH-H₂O]⁺；448[T-

BzOH]⁺；429；424[SH₂]⁺；413；405[S-

H₂O]⁺；391[S-0-H₂O]⁺；

387[T-AcOH-BzOH]⁺；376；347[S-0-

CO-HCHO]⁺；338：327[387-T-AcOH]⁺；

315；284[327-Ac]⁺，279；264[832-T]⁺or

[424-2HBr]⁺；246[264-H₂O]⁺；231；218

[264-HCOOH]⁺；188；167[S-C₅H₈ONBr₂]⁺；

149[167-H₂O]⁺；133；122[BzOH]⁺；

113：105[Bz]⁺；91[C₇H₇]⁺；83；77[C₆H₆]⁺；

76；57；55；

(T＝化合物中的紫杉烷环；S-

化合物中的酸(侧)链)

HPLC：

条件1：柱 CN 10μ(250×4.6mmn)

溶剂体系 CH₃CN∶H₂O(40∶60)

流速 1mL/分

检测器 Waters 490uv在227nm

注射体积 20μL

RT_{2″，3″-二溴三尖杉宁碱} 26.06分。

条件2：柱 Curosil G 6μ(250×3.2mm)

溶剂体系 CH₃CN∶H₂O(45∶55)

流速 0.75mL/分

检测器 Waters 490uv在227nm

注射体积 20μL

RT_{2″，3″二溴三尖杉宁碱} 2种非对映异构形式

RT_I＝23.53

RT_II＝24.50

热重分析(TGA)： 28℃(100.0％)，100℃(99.64％)

(温度及分解％) 150℃(98.88％)，175℃(95.35％)，

180℃(86.74％)，200℃(60.38％)，

250℃(45.03％)。

示差扫描量热法(DSC)：173.76℃，187.73℃。

如以下分析所证实的，粗制紫杉醇混合物的溴化反应显示出对于三尖杉宁碱不饱和侧链2″，3″位的令人吃惊的高度选择性，同时留下紫杉醇不受触动。

将在TLC中具有单斑(R_f 0.49，与可信的紫杉醇样品相同)并在HPLC中有单峰的级分#26-#68合并，浓缩并干燥(40℃，高真空1-2mm)，得到6.10g白色固体。将此物质自60ml丙酮/己烷(50∶50)混合物中结晶，过滤，用同一比例的冷溶剂洗，在高真空下于40℃干燥24小时，得到4.84g(92％)白色晶状固体，与可信样品比较后确定为紫杉醇。

分析结果如下：

熔点：214-216℃

R_f：0.49(在可信样品存在下)

硅胶60 F₂₅₄板(Merck#5554)

溶剂体系：丙酮/CH₂Cl₂(20∶80)

喷雾试剂：香草醛/硫酸在甲醇中

元素分析

C₄₇H₅₁O₁₄N：％C ％H ％N

计算值 66.11 6.02 1.64

实验值 65.97 5.89 1.63

[α]_D ²⁵＝-51.104°(c 0.33，MeOH)

甲醇中的紫外光谱：

(λ_max，nm，(ε) 227.2 (29824.1)

208.0 26256.3)

IR 光谱 (KBr)(cm^-1) 3500，1105，1070(tert.&sec.OH)

3430，1650，1580(-CONH-)

1610，1520，780，710(单取

代的芳香环)2950，2910，

1480，1450，1370

(-CH₃，-CH₂-，＞CH-基团)3020，1315，

980(双键)1725，1270

(芳香酯)1710，1240(＞C＝O)

850(环氧化物环)

¹H NMR谱： 1.88(S，1OH，C-1)； 5.66(d，1H，C-2)；

(300MHz；CDCl₃) 3.82(dd，1H，C-3)；2.38(S，3H，CH₃COO

(ppm) at C-4)；4.94(dd，1H，C-5)；1.88

(ddd，1H，C-6)； 2.48(ddd，1H，C-6)；

2.53(d，1OH，C-7)；4.38(dd，1H，C-7)；

6.27(S，1H，C-10)；2.23(S，3H，CH₃COO

at C-10)；6.20(qt，1H，C-13)；2.27

(ddd，1H，C-14)；2.33(dd，1H，C-14)；

1.13(S，3H，C-19)；1.23(S，3H，

C-18)；1.78(S，3H，C-18)；1.68(S，3H，

C-19)；4.20(dd，1H，C-20)；4.30(S，1H，

C-20)；3.77(S，1H，C-2′)；4.78(ddd，1H，

C-2′)，5.20(ddd，1H，C-3′)，7.10(d，1H，N-1)；

7.30-7.53(m，10H，芳香环上对位和间位H

A₁，B₁，&C₁)；

7.64(t，1H，A₁-p)；7.72(dd，2H，

C₁-o)；8.11(dd，2H，A₁-o).

¹³C NMR谱 79.1(C-1)；75.1(C-2)；45.8(C-3)；81.2

(300MHz，CDCl₃) (C-4)；84.4(C-5)；35.6(C-6)；72.1

(ppm) (C-7)；56.7(C-8)；203.6(C-9)；75.6(C-

10)；

133.3(C-11)；141.9(C-12)；72.3

(C-13)；35.7(C-14)；43.2(C-15)；

21.8(C-16)；26.9(C-17)；14.7(C-18)；

9.5(C-19)；76.5(C-20)；73.3

(C-2′)；55.1(C-3′)；20.7(CH₃CO)在

C-10；22.6(CH₃CO在C-4)；170.3(CH₃CO

在C-10)；171.1(CH₃CO在C-4)；167.0

(ArCO-A₁)；167.0(ArCO-C₁)；

172.7(PhISCO-)；129.3(aC-A₁)；133.8

(aC-B₁)；138.1(aC-C₁)；130.3

(o-C，A₁)；127.0(o-C，B₁)；127.0

(o-C，C₁)；128.7(m-C，A₁)；128.6

(m-C，B₁)；129.0(m-C，C₁)；133.6(p-C，A₁)；

131.9(p-C，B₁)；128.3(p-C，C₁).

EIMS：[M}⁺＝853 568[T]⁺；550[T-H₂O]⁺；508[T-AcOH]⁺；490

(m/z，主碎片) [T-AcOH-H₂O]⁺；448[T-2AcOH]⁺or

[T-BzOH]⁺；386[T-AcOH-BzOH]⁺；

326[T-BzOH-2AcOH]⁺；308[326-H₂O]⁺；286[M-T]⁺

or[S]⁺；280；268[S-O]⁺；240[S-O-CO]⁺；

210[S-O-CO-HCOH]⁺；122[BzOH]⁺；

105[Bz]⁺；91[C₇H₇]⁺；

77[C₆H₅]⁺；51；43[Ac]⁺.

DC/MS：[M+H]⁺＝854 569；551；509；492；449；387；327；

(m/z；主碎片) 311；287；269；240；224；222；210；165；

149；123；105；92；71.

FAB MS：(正离子模式)：

(m/z；主碎片) 892[M+K]⁺；876[M+Na}⁺；854[M+H]⁺；569；551；523；

509；495；369；327；286；240；210；177；155；149；

119；105；85；69.

FAB MS：(负离子模式)：

852-[M-H]⁺

HPLC：

柱： μBondapak苯基

溶剂体系： CH₃CN∶CH₃OH∶H₂O-132∶20∶48

流速： 1mL/分

检测器： Waters 490uv在227nm

注入体积： 20μL

热解重量分析：50℃(100.0％)，205℃(99.86％)，215℃(99.10％)，220℃(92.19％)，250℃(56.66％)，275℃(45.92％).

示差扫描量热法：210℃。

水含量(％H₂O)：0.90％(Karl Fischer)

实施例4

2″，3″-二溴三尖杉宁碱非对映异构体的分离与纯化

4.1原材料

批量的云南紫杉粗制植物提取物中含约15-40％三尖杉宁碱，50-70％紫杉醇和约20-35％其它的紫杉烷/非紫杉烷组分，该提取物或是得自西雅图，俄勒冈州的短叶紫杉(T.brevifolia)，或是得自中华人民共和国(云南紫杉或喜马拉雅紫杉)。溴试剂得自Fisher Scientific公司。所用的硅胶是ICN Silitech，32-63μm，60，IGN Biomedicals公司，Aurora，OH。使用的所有溶剂均为HPLC级或ACS级，由Specturm化学品制造公司得到。所用的纯化水为自用的去离子水。

4.2粗制植物提取物的溴化

将粗制的植物提取物(10.0g，26.4％三尖杉宁碱)溶在氯仿中以便得到总计250ml溶液。将此溶液在冰浴中冷却并在磁搅拌器连续搅拌下加入四氯化碳4750ml。向冷却的溶液(4℃)中逐滴加入0.1M的溴/四氯化碳溶液40ml。此混合物的HPLC分析表明紫杉醇与三尖杉宁碱的峰面积比为2.6∶1。将反应混合物在暗处搅拌，温度逐渐升至15℃。反应7小时后，再加入7ml 0.1M的溴/四氯化碳溶液，在15℃下继续反应。又反应8小时后，加入最后一份7ml 0.1M的溴/四氯化碳溶液，在15℃下继续反应过夜(14小时)。混合物随后的HPLC分析表明紫杉醇与三尖杉宁碱的峰面积比为11∶1。再反应7小时后此比例增加到12.3∶1。然后用5000ml 0.2％亚硫酸钠水溶液洗此混合物。水层的pH为8.0。接着用水洗两次(2×5升)。

第一次和第二次水洗液的pH分别是6.5-7.0和6.0-6.5。将合并的水层用5升氯仿再萃取。将有机层合并，用无水硫酸钠(500g)干燥，用旋转蒸发仪在40℃下蒸发至干。固体残余物(13.64g)用层析法纯化。

4.3溴化物质的层析纯化

将这样得到的溴化物质(13.64g)用中压层析法纯化，使用用淤浆堆积法填充硅胶(ICN Silitech，32-63μm，60)的柱子(6.9cm i.d，70cm长)，使用1.5％的甲醇/1，2-二氯乙烷。加入溶在同一溶剂中的样品，以50ml/分的速度洗脱。共收集55个级分(每份500ml)。各级分用TLC法分析，TLC板用10％甲醇/1，2-二氯乙烷展开，用1％的香草醛在50/50的硫酸-甲醇中的溶液检测。二溴-7-表-三尖杉宁碱洗脱在级分10-14中，蒸发掉溶剂后得到1.42g固体。同样，二溴三尖杉宁碱洗脱在级分24-28中，蒸发掉溶剂后得到1.64g固体。二溴三尖杉宁碱及相应的7-表-三尖杉宁碱的单个非对映异构体随后用下面

4.4中讨论的半制备型HPLC拆分和分离。

中压层析级分34-54的蒸发形成4.79g纯的紫杉醇，熔点214°-216℃，用紫外、红外、高效液相色谱、质谱、核磁等测得的分析数据与美国专利申请08/571,427中列出的相同。

4.4 2″，3″-二溴三尖杉宁碱和2″，3″-二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体的分离

二溴三尖杉宁碱和二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体去除其它杂质的最终纯化是用半制备型HPLC(Waters Deltaprep 3000)完成的，使用一根Waters Deltapak C18柱，100，19mm×30cm，以50％乙腈/水作为流动相，流速15ml/分。洗脱峰用一台设定在227nm的Waters Lambda Max 481型紫外检测仪监测。将溶在2ml甲醇中的每份200mg物质注入柱中。二溴三尖杉宁碱非对映体I的洗脱液在54分时出峰，非对映体II在56分出峰。类似地，二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映体III在约104分时出峰，相应的非对映体IV在112分时出峰。将从重复的注入液收集到的级分合并，在40℃下减压蒸发除掉有机溶剂。滤出结晶的固体，用水洗，在40℃下于真空烘箱中干燥，得到纯的二溴三尖杉宁碱和二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体。所得到的以下非对映异构体的二溴化合物的制备、分离和结构列在VI中：

(I)(2″R，3″S)-二溴三尖杉宁碱， (DiBr-I)

(II)(2″S，3″R)-二溴三尖杉宁碱， (DiBr-II)

(III)(2″R，3″S)-二溴-7-表-三尖杉宁碱，(DiBr-III)和

(IV)(2″S，3″R)-二溴-7-表-三尖杉宁碱， (DiBr-IV)

类似物1：(2″R，3″S)-二溴三尖杉宁碱类似物2：(2″S，3″R)

-二溴三尖杉宁碱

紫杉醇

类似物3：(2″R，3″S)-二类似物4：(2″S，3″R)-二溴-7-表-三尖杉宁碱

溴-7-表-三尖杉宁碱

紫杉醇类似物(溴化的)

非对映异构体的分析鉴定如下：

图1是2″，3″-二溴三尖杉宁碱和2″，3″-二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体(DiBr-I-IV)的TLC分离图，总结在下面的表1中。

表1

分道线	化合物
分道线	化合物	(1)(2)(6)(7)(T)	DiBr-IDiBr-IIDiBr-IIIDiBr-IV紫杉醇

板：硅胶60 F₂₅₄(Merck#5554)

溶剂体系：a)10％ CH₃OH/1，2-二氯乙烷

b)己烷/氯仿/乙酸乙酯/CH₃OH 20/60/15/5

试剂：a)紫外光

b)香草醛/H₂SO₄在甲醇中

图2是非对映异构体(I)DiBr-I；(II)DiBr-II；(III)DiBr-III；和(IV)DiBr-IV的混合物的HPLC层析谱。在得到此层析谱时使用的设备和条件如下：

柱：ES Industries FSP(五氟苯基)，4,6mm内径×250mm，粒度5μm，孔径60

溶剂体系：水/乙腈/甲醇，41∶39∶20

流速：0.50ml/分，无梯度洗脱

检测器：Waters 990光电二极管列阵检测器，在227nm处监测。

注射体积：20μl。

图3是非对映异构体DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV在甲醇中的叠合的紫外光谱图。谱图结果总结在下面表2中。

表2

异构体	λ_max(nm)	(ε)
异构体	λ_max(nm)	(ε)	DiBr-IDiBr-IIDiBr-IIIDiBr-IV	226.0226.0219.4218.4	14732124153790020013

图4是非对映异构体DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV在KBr中的叠合的红外光谱图。其结果总结在下面表3中。

表3

谱线，cm^-1	官能基
谱线，cm^-1	官能基	3500，1105，10703420，1670，15803110，3060，16051505，770，7102960，2915，28701465，13703020，1670，1310980730，12701715，12401730，1180855	叔和仲.OH-CONH-单取代的芳香环-CH₃-；-CH₂-；-CH-在脂族或碳环化合物中双键芳族酯＞C＝O乙酸酯氧杂环丁烷环

图5是非对映异构体DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV的EI-MS(电子轰击质谱)谱图，其结果总结如下：

图5EI-MS；[M]⁺＝992(m/z；主碎片)

568[T]⁺；550[T-H₂O]⁺；508[T-AcOH]⁺；

490[T-AcOH-H₂O]⁺；448[T-2AcOH]⁺；

or[T-BzOH]⁺；390[S-0-H₂O]⁺；

386[T-AcOH-BzOH]⁺；348[S-0-CO-HCHO]⁺；

326[T-BzOH-2AcOH]⁺；308[T-326-H₂O]⁺；

284[327-Ac]⁺；264[832-T]⁺；or

[424-2HBr]⁺；246[264-H₂O]⁺；

218[264-HCOOH]⁺；188，167[S-C₅H₈ONBr₂]⁺；

148[167-H₂O]⁺；122[BzOH]⁺；105[Bz]⁺；

91[C₇H₇]⁺；83[C₄H₇C≡O]⁺；77[C₆H₅]⁺；57，55.

(T＝化合物中的紫杉烷环

S＝化合物中的酸(侧)链.)

图6是非对映异构体DiBr-I、DiBr-II、DiBr-III和DiBr-IV的FAB⁺-MS(快原子轰击质谱)谱图，总结如下：

图6 FAB⁺-MS： (正离子模式)(m/z)

1030[M+K]⁺；1014[M+Na]⁺；992[M+H]⁺

(See Elem.Anal.)；974[M-H₂O]⁺；932[M-

AcOH]⁺；

914[M-AcOH-H₂O]⁺；912[M-HBr]⁺；870

[M-BzOH]⁺；854[870-H₂O-2H]；832[M-2HBr]⁺；

705[M-243-Ac]⁺；569[T]⁺；551[T-H₂O]；

509[T-AcOH]⁺；491[T-AcOH-H₂O]⁺；448[T-

BzOH]⁺；

429；424[SH₂]⁺；413；405[S-H₂O]⁺；391

[S-0-H₂O]⁺；387[T-AcOH-BzOH]⁺；376；347

[S-0-CO-HCHO]⁺；338：327[387-T-AcOH]⁺；

315；284[327-Ac]⁺；279；264[832-T]⁺or

[424-2HBr]⁺；246[264-H₂O]⁺；231；218[264-

HCOOH]⁺；

188；167[S-C₅H₈ONBr₂]⁺；149[167-H₂O]⁺；

133；122[BzOH]⁺；113：105[Bz]⁺；91[C₇H₇]⁺；

83；77[C₆H₅]⁺；76；57；55；

(T＝化合物中的紫杉烷环

S＝化合物中的酸(侧)链.)

图7-10是这些非对映异构体的¹H-NMR图谱，图11是¹³C-NMR图谱，结果总结如下：

DIBr-I ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的质子)

DIBr-I ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	170.373.054.6172.470.155.422.727.6203.5	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″；C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

DIBr-II ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的质子)

DIBr-II ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	170.372.954.6172.470.155.222.727.9203.5	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″)C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

DIBr-III ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的质子)

DIBr-III ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	169.372.954.0172.557.754.522.629.4207.1	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″)C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

DIBr-IV ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的质子)

DIBr-IV ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和一些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	169.272.154.1172.557.854.322.629.4207.1	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″；C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

本发明的二溴三尖杉宁碱/7-表-三尖杉宁碱的物理化学性质总结在下面表4中。

表4

紫杉醇的溴代类似物的物理化学性质

性质	DiBr-I	Di-Br-II	DiBr-III	DiBr-IV
性质	DiBr-I	Di-Br-II	DiBr-III	DiBr-IV	外观	灰白至浅黄色晶体	灰白至浅黄色晶体	灰白至浅黄色晶体	灰白至浅黄色晶体
熔点	185-187℃	171-173℃	166-168℃	163-165℃	外观	灰白至浅黄色晶体	灰白至浅黄色晶体	灰白至浅黄色晶体	灰白至浅黄色晶体
熔点	185-187℃	171-173℃	166-168℃	163-165℃	分子式	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂
分子量	991.7	991.7	991.7	991.7	分子式	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂	C₄₅H₅₃O₁₄NBr₂
分子量	991.7	991.7	991.7	991.7	[α]_D	-41.3°	-44.4°
IR^*(cm^-1)	3500，1105，1070；3420，1670，1580；3110，3060，1605，1505，770，710；2960，2915，2870，1465，1370；3020，1670，1310，980；1730，1270；1715，1240；1730，1180；855；				[α]_D	-41.3°	-44.4°
IR^*(cm^-1)					UVλ_max；(∈)	226.0nm；14732	226.0nm；12415	219.4nm；37900	218.4nm；20013
TLC^**(R_f)溶剂体系：AB	0.340.28	0.370.30	0.630.54	0.650.57	UVλ_max；(∈)	226.0nm；14732	226.0nm；12415	219.4nm；37900	218.4nm；20013
TLC^**(R_f)溶剂体系：AB	0.340.28	0.370.30	0.630.54	0.650.57	HPLC^***(RT)条件1：条件2：	43.81分46.65分	45.01分48.39分	69.68分69.66分	71.92分72.60分

^*DiBr-I至IV的IR谱彼此重叠

^**溶剂体系A：甲醇/1，2-二氯乙烷(1∶9或1∶10)

溶剂体系B：己烷/氯仿/乙酸乙酯/甲醇(2∶6∶15∶0.5)

^***条件1：柱 ES Industries FSP(五氟苯基)4.6mm内径×250mm，粒度5μm，孔径60；流动相：水/乙腈/甲醇(41∶39∶20)；流速：0.50ml/分；分离模式：无梯度洗脱；检测器：Waters 990光电二极管列阵检测器，在227nm处监测洗脱液；注入体积：20μl。

条件2：柱 Phenomenex 4.6mm内径×250mm，粒度5μm，孔径80；流动相：水/乙腈/甲醇(45∶40∶15)；流速：0.50ml/分；分离模式：无梯度洗脱；检测器：Waters 490可编程多波长检测器，在227nm处监测洗脱液；注入体积：整个混合物80μl。

实施例5

显示二溴三尖杉宁碱/二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体混合物的抗肿瘤效力及其与已知的紫杉醇抗肿瘤效力相关的体外和体内研究

已知紫杉醇及其衍生物Taxotere^(Rhne-Poulenc Rhor公司)对于一些肿瘤具有极其理想的抗肿瘤效力。这些抗肿瘤药以一种独特的方式起作用，它们阻止了构成有丝分裂纺锤体微管的微管蛋白的解聚，而这种解聚对于细胞分化是必不可少的，这样就造成了细胞分化与肿瘤细胞增生一道停止。紫杉醇的作用机理，它的药理性质等在例如Rowinsky等的以下文章中有说明：“紫杉醇：一种新研究的抗微管药物”，国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.) 82：1247(1990)。

根据本发明，发现一种新的二溴三尖杉宁碱/二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体的混合物具有很强的类紫杉醇的体外和体内抗肿瘤效力。

5.1体外研究(NCI)

以下体外研究是按照国立癌症研究所(NCI)的试验性疗法计划进行的，它证实了本发明的二溴三尖杉宁碱非对映异构体的很强的抗肿瘤效力，而这一效力与紫杉醇的密切相关。

试验性疗法计划作为公众服务提供了一种体外抗癌药物的发现筛选工作，它使用一组60种不同的人类肿瘤细胞系，用一定浓度范围的候选药物对其进行试验。见Boyd等，药物开发研究(Drug DevelopmentResearch) 34：91-109(1995)，该文在本发明中全文引用作为参考。正如Boyd等所讨论的，筛选工作按这样的方式设计和操作，即，构成筛选的每种细胞系的相对和绝对敏感性都要可重复到能够产生各个细胞系对候选药物响应的特征图形(“指纹”)的程度。近来关于NCI体外筛选的体内对应研究已经表明，体外筛选是选择有体内抗癌效力的化合物的有效方法。参见Grever等，美国癌症研究协会年报(Proc.Am.Assoc.Cancer.Res.) 35：369(1994)。筛选工作的操作和解释在Boyd等及本发明引用的其它几篇文章中有详细的讨论，这里无需重复，只是列出了用化合物“XCLY-401759类似物”表示的新的2″，3″-二溴三尖杉宁碱/二溴-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体与已知的抗肿瘤化合物紫杉醇的筛选对比结果。XCLY-401759的体外抗肿瘤效力按试验结果和均值图分别示于图12和13。

按相应的方式，用剂量响应的均值图表示的紫杉醇体外抗肿瘤效力示于图14中。

5.1.1结果的讨论(NCI)

在NCI体外抗癌药物筛选中，一种抗肿瘤候选药物，即本发明的XCLY-401759，对细胞系生长百分数(PG)的影响和计算出的响应参数在以下文献中有详细的讨论：Boyd等，“NCI用的以疾病为目标的体外抗肿瘤药物筛选数据显示及分析方法”，细胞毒性抗癌药物：药物发现与开发的模型和概念(Cytotoxic Anticancer Drugs：Modelsand Concepts for Drug Discovery and Development)，Kluwer学术出版社，Amsterdam，11-34页(1992)，和Monks等“在培养物中使用互异的一组人类肿瘤细胞系实现高通量抗癌药物筛选的可行性”，国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.) 83：757-766(1991)，上述文献的全部内容在本发明中引用作为参考。一般来说，在筛选数据报告(图12)和均值图(图13和14)中，“GI₅₀”代表50％生长抑制因子，“TGI”代表完全生长抑制或细胞静止的作用水平，“LC₅₀”代表致死浓度，或净的细胞杀死或细胞毒性参数。附有符号“＜”的数值表示剂量水平或实际值比最低试验浓度还小，而附有符号“＞”的数值表示有效剂量或实际值比最高试验浓度还高。

均值图是由NCI体外筛选试验中所试验的化合物对各细胞系得到的GI₅₀、TGI和LC₅₀浓度构成的。Boyd等(1995)提供了关于均值图构成的详细讨论。在解释该均值图时，通常突出到右方的条块表示特定细胞系对一种抗癌候选药物的敏感性超过所试验的所有细胞系的平均敏感性，而延伸到左方的条块表示细胞系平均来说对抗癌候选药物不太敏感。条块的标度是对数标度，于是，在例如GI₅₀均值图中延伸到垂直参考线右方例如2或3单位的条块，表示该抗癌候选药物对于某个特定的细胞系的响应参数在相当于对所有细胞系所需的平均浓度的百分之一至千分之一的浓度下就可以达到，从而指示该特定的肿瘤细胞系对于所试验的候选药物非常敏感。

现在回到图13，XCLY-401759对于以下细胞系在TGI方面显示出相对较大的效果：白血病细胞系HL-60(TB)；非小细胞肺癌细胞系NCI-H522；结肠癌细胞系COLO 205和HT 29；CNS癌细胞系SF-539和SNB-75；卵巢癌细胞系OVCAR-3；直肠癌细胞系RXF-393；和乳腺癌细胞系MCF 7、MDA-MB-231/ATCC、HS 578T、MDA-MB-435和MDA-N。

与图14的紫杉醇的分析相比较，XCLY-401759对于非小细胞肺癌细胞系NCI-H522显示出象紫杉醇一样的非常高的响应(对于XCLY-401759和紫杉醇分别为＜-8和＜-10)。还比较了XCLY-401759和紫杉醇部具有高量级响应的以下细胞系：结肠癌细胞系COLO 205(＜-8和＜-7.97)，CNS癌细胞系SNB-75(-7.30和-9.18)，以及例如乳腺癌细胞系HS 5787(-7.61和-9.91)。

XCLY-401759对于很多细胞系的高量级作用在GI₅₀方面或许更显著，此时XCLY-401759对于很多同一细胞系，例如对于所试验的各种结肠癌细胞系、黑素瘤细胞系、卵巢癌细胞系和直肠癌细胞系，显示出与紫杉醇一样的高响应水平，从而其型式属于类紫杉醇抗肿瘤活性，并因此可重复地显示出这种新的XCLY-401759混合物的高的抗肿瘤效力。

XCLY-401759的强的类似紫杉醇的抗肿瘤效力进一步表示在总结于下面表5中的由NCI得到的相关数据中：

表5

NCI

对比-相关-GI₅₀ XCLY-401759/LCONC-4.00M(BV)

*	NSC	LCONC(MAX X)	CORR.COEFF.	(N)	化学名称
*	NSC	LCONC(MAX X)	CORR.COEFF.	(N)	化学名称	1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)	1259739999914984230533284263377663305001655635851426746983265	-4.60 210.00 1-5.60 127-6.60 71-5.60 19-3.60 10-3.30 12-3.70 14-4.00 8-3.70 13-3.90 15	0.8250.8110.7550.7130.6990.6860.6630.6180.6040.5900.586	6010606060605960606060	紫杉醇MDR RHOD30长春花碱硫酸盐放线菌素D叶下珠糖苷蒽双咪腙盐酸盐MACBECIN II鸦胆丁色霉素A3脱氧阿霉素S-三苯甲基-L-半胱氨酸

NCI

对比-相关-TGI

XCLY-401759/LCONC-4.00M(BV)

	NSC	LCONC(MAX X)	CORR.COEFF.	(N)	化学名称
	NSC	LCONC(MAX X)	CORR.COEFF.	(N)	化学名称	1)2)3)4)5)6)7)8)9)10)11)	12597349842332598153858675743305003284268326532501479037349156	-4.60 20-5.60 128-9.00 9-4.00 15-3.00 62-3.30 12-5.60 19-3.90 15-3.65 11-3.30 58-3.65 11	0.8300.7270.6050.5980.5270.5010.4930.4840.4510.4300.422	5959595959595959595959	紫杉醇长春花碱硫酸盐RHIZOXIN美登素长春新碱硫酸盐MACBECIN II叶下珠糖苷S-三苯甲基-L-半胱氨酸波林菌素氯乙环己亚硝脲PANCRATIASTATIN

^*NSC-试验编号

LCONC-最高试验浓度的对数

MAXX-试验总数

COEFF.-Pearson相关系数

CORR.-

(N)-细胞系总数

见Paull等.，国立癌症研究所杂志(1989)81：1088-1092。

5.2体外研究(南方研究所)

一个独立的研究组——南方研究所(Birmingham，Alabama)进行了关于XCLY-401759对于MX-1(乳腺癌)、RXF-393(直肠细胞癌)、NCI-H522(肺腺癌)和OVCAR-3(卵巢癌)等四种人类肿瘤系的生物抗细胞活性的另外的体外研究。。在这些研究中，XCLY-401759类似物显示出一系列与紫杉醇相近的活性。

此项试验用上述的人类肿瘤细胞系进行，采用标准的组织培养技术和半自动染料转化分析方法。用于试验的人类细胞系的选择至少部分地是基于以下准则：(1)临床重要的组织发生，(2)适当的生长特性，和(3)研究所对于具体细胞系的经验。该研究的材料、方法和结果如下。

5.2.1材料和方法

5.2.1.1细胞培养

在南方研究所的研究中，人类细胞系在无菌条件下于含有10％胎牛血清(Sigma化学公司)、2mM L-谷氨酰胺及碳酸氢钠的RPMI1640(Hyclone公司，完全培养基)中繁殖，并在37℃下于装有高效微粒空气过滤器的Sterilcult CO₂组织培养恒温箱(Forma公司)中在5％CO₂和湿度95％的条件下培养。每一到两周将细胞系传代培养并用于实验。所有的细胞系都用GeneProbe^TM(Fischer公司)鉴别支原体的污染，阳性培养物则用BM-Cyclin^TM抗微生物系统(BoehringerMannheim公司)在三个通道上不断处理以消除污染物。只有确认不含支原体的细胞系才用来试验化合物的抗细胞活性。

5.2.1.2抗细胞活性实验设计

对于所有的试验收取细胞并使其成粒状沉淀以除去培养基，然后悬浮在新鲜的完全培养基中。取样测定细胞密度。细胞计数用库尔特Z₁型细胞计数器进行，生存力通过用碘化丙锭染色后在库尔特EPICS Elite流动型细胞计数上分析来测定。将细胞样品用完全培养基调节至密度为5×10³细胞/ml。在组织培养群集板(96孔，Costar公司产品编号3595)上接种100μl细胞(5×10³)，按所述进行培养。

在处理的当天将类似物XCLY-401759溶在100％乙醇中，然后逐次地用培养基稀释。0剂量对照样用培养基模拟处理。适当的孔(8行)用5种浓度等级(10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8M)处理。原始载液(培养基中的乙醇)的最高剂量为≤0.2％乙醇。在0.2％浓度下配制一个载液对照样以确定载液对细胞系的影响。将紫杉醇(得自XECHEM公司，New Brunswick，New Jersey)溶在DMSO中，逐次用培养基稀释，然后加到孔中使剂量为1×10^-8和1×10^-9M。每个群集板含有一细胞对照样(8个孔，用完全培养基模拟处理)，一个培养基对照样(7个孔，装有培养基，用来减掉由培养基条件产生的信号)，和一个空气空白样(1个孔，用来校正板读数器)。一旦完成加药，将板堆放并包裹在塑料薄膜中以减少蒸发，按所述进行培养。平行测定的各组群集板与药物接触1或72小时。为保证适当的药物接触时间，将板在无菌巾上无菌地吸干，用培养基温和地洗三次。然后向样品中加入新鲜培养基，将板包在塑料包皮中。两组接触药物的板都培养到第7天，然后用磺化罗丹明B(SRB)法分析抗细胞活性。

5.2.1.3结果

在一小时接触中，在所有试验的细胞系中都显示出与XCLY-401759浓度有关的活性。OVCAR-3卵巢和NCI-H522肺细胞系对于XCLY-401759最敏感。紫杉醇的活性在所试验的两个浓度对于MX-1、RXF 393和OVCAR-3肿瘤细胞系最小，而NCI-H522对紫杉醇敏感。当接触时间增加到72小时时，所有的细胞系对于XCLY-401759和紫杉醇的敏感性都提高。与其它细胞系相比，MX-1对于紫杉醇和XCLY-401759相对地敏感性差。

总之，根据南方研究所的研究，XCLY-401759在所试验的不同肿瘤病原的四种人类肿瘤细胞系中产生一系列与紫杉醇相近的抗细胞活性。

结果总结在下面的表6和7中。

表6

南方研究所

处理第1天接触药物1小时后洗涤沉淀的板；第7天对板读数

药物	处理浓度(M)	细胞系RXF 393	抑制％(每孔沉积5.0×10³细胞)
			抑制％(每孔沉积5.0×10³细胞)			MX-1	OVCAR-3	NCI-H522
			XCLY-401759载液对照样紫杉醇	1.0E-081.0E-071.0E-061.0E-051.0E-041.0E-091.0E-08	2.516.023.842.938.10.03.713.8	MX-1	OVCAR-3	NCI-H522	3.23.70.01.742.70.81.64.0	23.181.297.298.198.37.01.27.1	7.924.895.299.499.54.58.335.1

表7

南方研究所

处理第1天接触药物72小时后洗涤沉积的板；第7天对板读数

药物	处理浓度(M)	细胞系RXF 393	抑制％(每孔沉积5.0×10³细胞)
			抑制％(每孔沉积5.0×10³细胞)			MX-1	OVCAR-3	NCI-H522
			XCLY-401759载液对照样紫杉醇	1.0E-081.0E-071.0E-061.0E-051.0E-041.0E-091.0E-08	64.880.785.181.6100.04.441.573.3	MX-1	OVCAR-3	NCI-H522	29.445.476.575.498.32.310.641.1	98.799.199.298.8100.00.098.199.3	97.298.698.498.3100.00.096.198.7

5.3体内研究

按照NCI试验性疗法计划，对于本发明的XCLY-401759类似物对几种新生肿瘤细胞系的抗肿瘤效力进行了体内中空纤维试验。

此试验按照试验性疗法计划的生物试验部分进行。在这些试验中，将所需要的人类肿瘤细胞在聚偏二氟乙烯(PVDF)中空纤维中培养，将每种细胞系的样品均植入到小鼠两个生理区室(腹膜内和皮下)的每一室中。每只试验鼠均接受总计六根纤维(3根腹膜内，3根皮下)，代表3种不同的癌细胞系。

三只小鼠用潜在的抗肿瘤化合物处理，每种化合物2种试验剂量，以腹膜内途径采用每天4次处理的时间表。载液对照样由6只小鼠组成，它们只接受化合物稀释剂。在治疗最后一天的次日收集纤维培养物。

为确定抗肿瘤效力，用甲染料(MTT)转化试验测定每种细胞系的活细胞质量。由此，用化合物处理过的样品的平均光密度除以载液对照样的平均光密度，计算出T/C％。对各样品测定细胞质量的净增加。

用XCLY-401759非对映异构混合物/化合物对于最低限度的12种人类癌细胞系进行试验，总计4次实验，每次实验包括3个细胞系。对于每个细胞系均以T/C％的形式报道两个化合物剂量各自的实验数据，腹膜内和皮下样品的数值分别计算。

这一体内试验的结果总结在下面的表8-11中。

表8

XCLY-401759的毛细管中空纤维试验

NCI

实验编号：HF597-0HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA
实验编号：HF597-0HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA	％T/C(净生长)处理 MDA-MB-435 OVCAR-5 SF-295
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	％T/C(净生长)处理 MDA-MB-435 OVCAR-5 SF-295
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	3 150.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，4天 3 2 93 ＞100 82 ＞100 91 ＞1004 100.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，4天 3 3 55 84 60 ＞100 24 94
载液
载液	组 3-＞1(剂量-150.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重组 4-＞1(剂量-100.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重
关于HF597-0-HF的意见

此实验是在可接受的质量控制参数内，被认为有效。

表9

XCLY-401759的毛细管中空纤维试验

NCI

实验编号：HF596-0-HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA
实验编号：HF596-0-HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA	％T/C(净生长)处理 LOX IMVI COLO 205 OVCAR-3
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	％T/C(净生长)处理 LOX IMVI COLO 205 OVCAR-3
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	3 150.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，4天 3 2 363 3 -53 ＞100 74 93 994 100.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，4天 3 3 -56 -193 97 95 62 84
载液
载液	组 3-＞1(剂量-150.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重组 4-＞1(剂量-100.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重
关于HF596-0-HF的意见

此实验是在可接受的质量控制参数内，被认为有效。

表10

XCLY-401759的毛细管中空纤维试验

NCI

实验编号：HF594-0-HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA
实验编号：HF594-0-HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA	％T/C(净生长)处理 NCI-H23 MDA-MB-231 SW-620
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	％T/C(净生长)处理 NCI-H23 MDA-MB-231 SW-620
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	3 150.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，3天 3 3 72 85 90 99 88 834 100.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，3天 3 3 61 ＞100 21 ＞100 92 ＞100
载液
载液	组 3-＞1(剂量-150.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重组 4-＞1(剂量-100.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重
关于HF594-0-HF的意见

此实验是在可接受的质量控制参数内，被认为有效。

表11

XCLY-401759的毛细管中空纤维试验

NCI

实验编号：HF595-0-HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA
实验编号：HF595-0-HF 宿主…：无胸腺裸鼠性别……：雌性来源/系……：1 来源：APA	％T/C(净生长)处理 NCI-H522 UACC-62 U251
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	％T/C(净生长)处理 NCI-H522 UACC-62 U251
组号剂量/单位途径时间表小鼠数目纤维数目 IP SC IP SC IP SC	3 150.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，3天 3 3 75 ＞100 62 60 58 944 100.00mg/kg/剂量腹膜内每天4次，3天 3 3 59 98 64 ＞100 4 87
载液
载液	组 3-＞1(剂量-150.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重组 4-＞1(剂量-100.00)：在盐水中：Tween 80(0.05％)(未知)注射体积.：0.1ml/10mg体重
关于HF595-0-HF的意见

此实验是在可接受的质量控制参数内，被认为有效。

实施例6

2″，3″-二氯三尖杉宁碱非对映异构体的制备及生物活性研究

6.1原材料

云南紫杉或喜马拉雅紫杉的粗制植物提取物得自中华人民共和国，其中含有约15-40％的三尖杉宁碱、约50-70％的紫杉醇和约20-35％的其它紫杉烷/非紫杉烷组分。氯气得自Matheson公司。所用的硅胶是ICN Silitech，32-63μm，60，ICN Biomedicals公司，Aurora，OH。使用的溶剂全是HPLC级或ACS级，得自Spectrum化学品制造公司。所用的纯化水为自备去离子水。

6.2粗制植物提取物在氧化氯仿中的氯化

6.2.1氧化氯仿的制备

将氯(3.12g)逐滴加到4l氯仿中以便中和在市售溶剂中存在的稳定剂戊烯。将溶液激烈混合，在室温下放置过夜，然后用1.5％亚硫酸钠溶液(1.0l)洗一次，用水(2×1.0l)洗两次。接着加过氧化氢溶液(3％，10ml)，激烈混合，放置3-5天。溶剂中的氯含量用容量分析法测定。随后向5ml溶剂样品中加1.0N HCl(10ml)和水(50ml)。向此混合物中加KI(2g)，充分混合至溶解，所形成的深褐色溶液用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定。当溶液的颜色变成浅褐色时，加入3-4滴淀粉指示剂溶液(0.5％，USP)。将这一深蓝-紫色溶液进一步滴定至溶液变成无色。记下达到终点时所用的硫代硫酸钠溶液的体积，算出氯含量。理想的氯含量为0.01-0.1％。将溶剂用无水硫酸钠(100g)干燥，用于下面的氯化反应。

6.2.2氯化

将粗制的植物提取物(5.0g，28.8％三尖杉宁碱，62.2％紫杉醇)溶在3升烧瓶内用冰浴冷却到4℃的氧化氯仿(1升)中。1小时后混合物的HPLC分析表明紫杉醇与三尖杉宁碱之比为8∶1。随后将反应混合物于15℃下搅拌9小时。此时反应混合物的HPLC分析表明紫杉醇与三尖杉宁碱之比为19∶1。用5ml去离子水洗过的5ml反应混合物样品的pH约为2.0。然后用500ml 1.0％亚硫酸钠水溶液洗，水层的pH为7.5。接着用水洗两次(2×500ml)。第一次和第二次水洗液的pH分别为7.0和6.5。合并的水层再用150ml氯仿萃取。将有机层合并，用无水硫酸钠(85g)干燥，蒸发至干。固体残余物(5.85g)用层析法纯化。氯化物质的液相色谱质谱联用分析表明，形成了作为反应产物的二氯三尖杉宁碱的非对映体以及在起始物中存在的紫杉醇混合物。

6.3氯化物质的层析纯化

将氯化物质(5.85g)在一个用淤浆法堆积的硅胶(300g)柱(4.1cm内径，62cm长)上用10％丙酮/1，2-二氯乙烷层析纯化。将样品溶在10％丙酮/1，2-二氯乙烷中。在头两个700和350ml的级分之后，所有的后继级分均限于50ml。各级分用TLC法分析(TLC板用20％丙酮/1，2-二氯乙烷展开，用1％的香草醛/50∶50硫酸∶甲醇检测)。二氯三尖杉宁碱洗脱在级分8-13中，溶剂蒸发后得到1.6g固体(～90％)。此物质最后用半制备型HPLC纯化。

6.4粗制的植物提取物在1，2-二氯乙烷中氯化

6.4.1氯在1，2-二氯乙烷中的溶液的制备

为制备氯在1，2-二氯甲烷中的溶液，将氯气缓慢地鼓入用冰预冷到0-4℃的1升1，2-二氯乙烷中。继续鼓气几分钟(约10分钟)，直到1，2-二氯乙烷中的氯达到所要求的浓度。定期抽取溶剂样品并分析溶解的氯含量如下：向一只250ml的锥形瓶中的5ml溶剂样品内加入1.0N HCl(10ml)和水(50ml)。向此混合物中加入KI(2g)，充分混合至溶解，生成的深褐色溶液用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定。当溶液的颜色变成浅褐色时，加3-4滴淀粉指示剂溶液(0.5％，USP)。将此深蓝-紫色溶液进一步滴定，直到溶液变成无色。记下达到终点时所用的硫代硫酸钠溶液的体积，计算氯含量。理想的氯含量为0.01-0.1％。

6.4.2氯化

将溶在1，2-二氯乙烷(200ml)中的粗制植物提取物(5.0g)冷却到-4℃，在搅拌下逐滴加到用冰浴冷却到4℃的0.06％氯/1，2-二氯乙烷(1250ml)溶液中。加完后将混合物在4℃下搅拌1小时，样品用HPLC分析。HPLC分析表明三尖杉宁碱的峰几乎完全消失。将混合物用1.0％亚硫酸钠溶液(1升)和水(2×1升)洗。水层的pH值如下：亚硫酸钠洗，7.5-8.0；第一次水洗，6.0-6.5；第二次洗，5.5。将水层用1，2-二氯乙烷(200ml)萃取。将有机层合并，用无水硫酸钠(50g)干燥，用旋转蒸发仪在40℃下蒸发。残余的固体在真空烘箱中于40℃下干燥2小时，得到5.3g氯化物质。此物质的HPLC分析表明，作为反应产物的二氯三尖杉宁碱与起始的粗制植物提取物中存在的紫杉醇一起存在。

6.5氯化物质与紫杉醇用结晶法分离

将6.4.2中的氯化的产物混合物(5.30g)溶在250ml锥形瓶内的50ml丙酮中。向此溶液中加入己烷(65ml)，充分混合，在室温下放置直到开始结晶。然后将锥形瓶在4℃下存放60小时。将晶体过滤，用冷的20％丙酮/己烷洗，在真空烘箱中于40℃干燥3.5小时，得到3.10g紫杉醇(～95％，晶体I)。将合并的滤液和洗液蒸发，残余的固体在真空烘箱中于40℃下干燥2小时，得到1.96g母液物质(母液I)。将晶体I(3.10g)溶在32ml丙酮中，向此溶液中加入40ml己烷，混合物在室温下放置5小时，4℃下放置过夜。将晶体过滤，用20％丙酮/己烷洗，在40℃下于真空烘箱中干燥3小时，得到2.49g紫杉醇(98.5％，晶体II)。将滤液和洗液合并后蒸发。残余的固体在真空烘箱中于40℃下干燥2小时，得到0.65g母液物质(母液II)。将晶体II再次溶于温热的丙酮(25ml)中。向此溶液中加入25ml己烷，混合物在室温下存放5小时，4℃下放置过夜。将晶体过滤，用20％丙酮/己烷洗，在真空烘箱中于40℃下干燥，得到2.10g紫杉醇(99.5％，晶体III)。将滤液和洗液合并，蒸发。残余的固体在真空烘箱中于40℃下干燥2小时，得到0.47g母液物质(母液III)。母液I、II和III含有二氯三尖杉宁碱，将其合并，用半制备型HPLC进一步分离。

6.6 2″，3″-二氯三尖杉宁碱和2″，3″-二氯-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体的最终纯化

二氯三尖杉宁碱和7-表-二氯三尖杉宁碱非对映异构体去除其它杂质的最终纯化用半制备型HPLC(Waters Deltaprep 3000)完成，使用Waters Deltapak C18柱(100，19mm×30cm)，以45％乙腈/水作为流动相，流速为15ml/分。用设定在227nm的紫外检测器监测洗脱峰。注入溶在2ml甲醇中的每份200mg物质。二氯三尖杉宁碱非对映体I在约86分时出现洗脱峰，而非对映体II在98分。类似地，二氯-7-表-三尖杉宁碱非对映体III在约118分时出峰，而相应的非对映体IV在124分时出峰。由重复注入的样品中收集相应级分，合并后于40℃减压蒸发以除去有机溶剂。滤出结晶的固体，用水洗，在真空烘箱中于40℃下干燥，得到纯的二氯三尖杉宁碱和二氯-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体。用这种方式分离出的二氯三尖杉宁碱非对映体I带有污染物，通过在所述的HPLC步骤在峰值洗脱时收集较小的级分作进一步的纯化。

所得到的以下非对映异构的二氯化合物的制备、分离和结构示于VII中：

(I)(2″R，3″S)-二氯三尖杉宁碱(DiCl-I)；

(II)(2″S，3″R)-二氯三尖杉宁碱(DiCl-II)；

(III)(2″R，3″S)-二氯-7-表-三尖杉宁碱(DiCl-III)；和

(IV)(2″S，3″R)-二氯-7-表-三尖杉宁碱(DiCl-IV)。

类似物1：(2″R，3″S)一二氯三尖杉宁碱类似物2：(2″S，3″R)-

二氯三尖杉宁碱

类似物3：(2″R，3″S)-二氯类似物：(2″S，3″R)-二氯

-7-表-三尖杉宁碱 -7-表-三尖杉宁碱

紫杉醇类似物(氯化物)

这些非对映异构体的分析鉴定如下。

图15是2″，3″-二氯三尖杉宁碱和2″，3″-二氯-7-表-三尖杉宁碱立体异构体(DiCl-I至DiCl-IV)的TCL分离图。图16的图标列在下面的表12中。

表12

分道线编号	立体异构体
分道线编号	立体异构体	12T34	DiCl-IDiCl-II紫杉醇DiCl-IIIDiCl-IV

板：硅胶60F₂₅₄(Merck#5554)

溶剂体系：a)10％CH₃OH/1，2-二氯乙烷

b)己烷/氯仿/乙酸乙酯/CH₃OH 20∶60∶15∶5

试剂： a)紫外光

b)香草醛/H₂SO₄-甲醇

图16是本发明的二氯三尖杉宁碱和二氯-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体混合物的HPLC层析图，各个峰鉴别在下面表13中。

表13

峰编号	立体异构体
峰编号	立体异构体	IIIIIIIV	DiCl-IDiCl-IIDiCl-IIIDiCl-IV

在产生此层析谱中使用的设备和条件如下：

柱：ES Industries，FSP(五氟苯基)；4.6mm内径×250mm；5μm；60

溶剂体系：水/乙腈/甲醇，41∶39∶20

流速：0.50ml/分，无梯度

检测器：Waters 900光电二极管列阵检测器，在227nm处监测

注入体积：20μl。

在图17中以叠合的形式列出了本发明的立体异构体在甲醇中的紫外光谱。谱图结果总结在下面的表14中。

表14

峰编号	立体异构体	λmax，nm	(ε)
峰编号	立体异构体	λmax，nm	(ε)	IIIIIIIV	DiCl-IDiCl-IIDiCl-IIIDiCl-IV	226.6227.2228.2229.4	14,81314,99017,25214,694

图15画出了本发明立体异构体的叠合的红外光谱图，其内容总结在下面的表15中。

表15

谱线，cm^-1	官能基
谱线，cm^-1	官能基	3500，1105，10703420，1670，15803110，3060，16051505，770，7102960，2915，28701465，13703020，1670，13109801730，12701715，12401730，1180855	叔和仲羟基-CONH-单取代的芳香环-CH₃-；-CH₂-；-CH-基团(在脂族或碳环化合物中)双键芳香酯＞＝O基团乙酸酯氧杂环丁烷环

图19-22分别是DiCl-I、DiCl-II、DiCl-III和DiCl-IV非对映异构体在CDCl₃中的¹H-NMR谱图(300MHz)，图23是这些非对映异构体的¹³C-NMR(300MHz)谱图，其结果全总结如下：

DICL-I ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的质子)

DICL-I ¹³C-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	170.273.155.0172.070.858.721.827.5203.6	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1′)C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

DICL-II ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的质子)

DICL-II ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	170.272.655.0172.670.658.721.827.7203.5	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″)C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

DICL-III ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的质子)

DICL-III ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	170.273.054.8172.262.755.321.629.3203.5	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″)C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

DICL-IV ¹H-NMR在CDCL₃中(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的质子)

DICL-IV ¹³C-NMR(300MHz，ppm；仅侧链和某些重要的碳原子)

化学位移(ppm)	指认
化学位移(ppm)	指认	170.272.953.9172.262.555.021.729.3203.5	-(C-1′；C＝O)-(C-2′)-(C-3′)-(C-1″)C＝O)-(C-2″)-(C-3″)-(C-4″)-(C-5″)-(C-9；C＝O)

图24是DiCl-IV非对映体的EI-MS图谱，它同样是DiCl-I、DiCl-II、DiCl-III的碎裂图谱，图25是这些非对映异构体的MS-FAB⁺(快原子轰击质谱)图，其结果总结如下。

DiCl-I，DiCl-II，DiCl-III和DiCl-IV

E1-MS；[M⁺]＝902 568[T]⁺；550[T-H₂O]⁺；

508[T-AcOH]+；490[T-AcOH-H₂O]⁺；

(m/z，主碎片) 480；448[T-2AcOH]+或[T-B₂OH]⁺；386

[T-AcOH-B₂OH]⁺326[T-B₂OH-

2AcOH]⁺；308[T-326-H₂O]⁺；264[832-T]+；

246[264-H₂O]⁺；188；148；122[B₂OH]⁺；105

[B_z]⁺；91[C₇H₇]⁺；83[C₄H₇C＝O]；77[C₆H₅]⁺；

57；55；43

DiCl-I、DiCl-II、DiCl-III和DiCl-IV(m/z，主碎片)

940([M+K]⁺)；924([M+Na]⁺)；902([M+¹H]⁺)；

842([M-60⁺])；832([cephal])；824([M-60-18]⁺)；

569([T]⁺)；551([T-18]⁺)；527([T-43]⁺)；

509([T-60]⁺)；491([T-60-18]⁺)；449/448([T-122]⁺)；405

([S-18])；

387([T-60-122]⁺)；327([387-60]⁺)；

309([327-18]⁺)；264([832-T]⁺)；

246([264-18]⁺)；218([264-46]⁺)；

105([C₆H₅CO]⁺)；91([C₇H₇]⁺)；77([C₆H₅]⁺)；

本发明的二氯三尖杉宁碱/二氯-7-表-三尖杉宁碱非对映异构体的物理化学性质总结在下面的表16中。

表16

紫杉醇的氯化类似物的物理化学性质

性质	DiCl-I	Di-Cl-II	DiCl-III	DiCl-IV
性质	DiCl-I	Di-Cl-II	DiCl-III	DiCl-IV	外观	白至灰白色晶体	白至灰白色晶体	白至灰白色晶体	白至灰白色晶体
熔点	190-192℃	186-188℃	178-182℃	160-162℃	外观	白至灰白色晶体	白至灰白色晶体	白至灰白色晶体	白至灰白色晶体
熔点	190-192℃	186-188℃	178-182℃	160-162℃	分子式	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂
分子量	902.8	902.8	902.8	9028	分子式	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂	C₄₅H₅₃O₁₄NCl₂
分子量	902.8	902.8	902.8	9028	[α]_D	-56.9°	-45.9°	-38.8°
IR^*(cm^-1)	3500，1105，1070；3420，1670，1580；3110，3060，1605，1505，770，710；2960，2915，2870，1465，1370；3020，1670，1310，980；1730，1270；1715，1240；1730，1180；855；760				[α]_D	-56.9°	-45.9°	-38.8°
IR^*(cm^-1)					UVλ_max；(ε)	226.6nm；14813	227.2nm；14990	228.2nm；17252	229.4nm；14694
TLC^**(R_f)溶剂：A：B：	0.410.33	0.430.36	0.460.39	0.490.44	UVλ_max；(ε)	226.6nm；14813	227.2nm；14990	228.2nm；17252	229.4nm；14694
TLC^**(R_f)溶剂：A：B：	0.410.33	0.430.36	0.460.39	0.490.44	HPLC^***(RT)条件1：条件2：	38.50分37.75分	41.75分41.83分	48.29分45.98	49.74分48.01分

^*DiCl-I至IV的IR图谱是可重合的。

^**溶剂体系A：甲醇/1，2-二氯乙烷(1∶10)

溶剂体系B：己烷/氯仿/乙酸乙酯/甲醇(2∶6∶1.5∶0.5)

^***条件1：柱 ES Industries FSP(五氟苯基)4.6mm内径×250mm，5μm粒径，孔径60；

流动相：水/乙腈/甲醇(41∶39∶20)；

流速：0.50ml/分；

分离模式：无梯度；

检测器：Waters 990光电二极管列阵检测器，在227nm处监测洗脱液；

注入体积：20μl。

条件2：柱 Phenomenex 4.6mm内径×250mm，5μm粒径，孔径80；

流动相：水/乙腈/甲醇(45∶40∶15)；

流速：0.50ml/分；

分离模式：无梯度；

检测器：Waters 490可编程多波长检测器，在227nm处监测洗脱液；

注入体积：80μl总混合物。

实施例7

显示(2″R，3″S)和(2″S，3″R)-二氯三尖杉宁碱非对映异构体抗肿瘤效力的体外NCI研究

在此项NCI研究中，分离和纯化过的二氯三尖杉宁碱的(2″R，3″S)和(2″S，3″R)非对映异构体在NCI的60种人类肿瘤细胞系筛选研究中显示出很强的类似紫杉醇的体外抗肿瘤效力。

7.1结果的讨论

NCI体外研究的结果总结在图26、27、28和29中。分别代表非对映异构体(2″R，3″S)和(2″S，3″R)的图27和29两个均值图显示出这两种化合物的强抗肿瘤效力。

Claims

1.化学式如下的一种化合物：

其中R选自：

R₁＝OH R₂＝H；

R₁＝OH R₂＝H；

R₁＝H R₂＝OH；和

R₁＝H R₂＝OH；

X是卤素。

2.一种药物制剂，其中包括作为活性组分的权利要求1的化合物，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

3.权利要求1的化合物在制备用于治疗动物或人类肿瘤的药物方面的用途。

4.一种制造二卤三尖杉宁碱或二卤-7-表-三尖杉宁碱的方法，该方法包括在能够将三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱的2″，3″不饱和侧链部分选择性卤化的条件下，将三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱卤化，生成2″，3″-二卤三尖杉宁碱或二卤-7-表-三尖杉宁碱。

5.权利要求4的方法，其中三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱以任何数量存在于含有紫杉醇及其它含紫杉烷环化合物的混合物中，随后自混合物中分离出这样生成的2″，3″-二卤三尖杉宁碱。

6.权利要求5的方法，其中卤化反应在暗处于约-20℃至20℃的温度下进行。

7.权利要求6的方法，其中的反应温度为约-5℃至5℃。

8.权利要求7的方法，其中卤化反应用相对于三尖杉宁碱浓度为化学计量数量的卤素进行。

9.以下化学式的一种化合物：

其中R选自：

R₁＝OH R₂＝H

R₁＝OH R₂＝H

R₁＝H R₂＝OH；和

R₁＝H R₂＝OH。

10.一种药物制剂，其中含有作为活性组分的权利要求9的化合物，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

11.权利要求9的化合物在制备用于治疗动物或人类肿瘤的药物方面的用途。

12.权利要求11的用途，其中所述化合物是

R₁＝OH；R₂＝H。

13.权利要求11的用途，其中所述化合物是

R₁＝OH；R₂＝H。

14.权利要求11的用途，其中所述化合物是

R₁＝H；R₂＝OH。

15.权利要求11的用途，其中所述化合物是

R₁＝H；R₂＝OH。

16.一种制备以下化学式的化合物的方法，

其中R选自：

R₁＝OH R₂＝H

R₁＝OH R₂＝H；

R₁＝H R₂＝OH；和

R₁＝H R₂＝OH；

所述方法包括，在能够将三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱的2″，3″-不饱和侧链部分选择性溴化的条件下将三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱溴化。

17.权利要求16的方法，其中生成了非对映异构体化合物I、II、III和IV的混合物，该方法还包括从混合物中将各化合物I、II、III和IV分开。

18.权利要求16的方法，其中三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱以任何数量存在于含有紫杉醇和其它紫杉烷环化合物的混合物中。

19.权利要求16的方法，其中溴化反应在暗处于约-20℃至20℃的温度下进行。

20.权利要求19的方法，其中反应温度为约-5℃至5℃。

21.权利要求18的方法，其中溴化反应用相对于三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱浓度为化学计量数量的溴进行。

22.权利要求18的方法，其中溴化反应用溴在氯化溶剂中的溶液进行，该氯化溶剂选自CCl₄、CHCl₃、ClCH₂CH₂Cl和CH₂Cl₂。

23.化学式如下的一种化合物，

其中R选自：

R₁＝OH R₂＝H

R₁＝OH R₂＝H；

R₁＝H R₂＝OH；

和

R₁＝H R₂＝OH。

24.一种药物制剂，其中含有作为活性组分的一种或多种权利要求23的化合物，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

25.权利要求23的化合物在制备用于治疗动物或人类肿瘤的药物方面的用途。

26.权利要求25的用途，其中所述化合物是

R₁＝OH R₂＝H。

27.权利要求25的用途，其中所述化合物是

R₁＝OH；R₂＝H。

28.权利要求25的用途，其中所述化合物是

R₁＝H R₂＝OH。

29.权利要求25的用途，其中所述化合物是

R₁＝H R₂＝OH。

30.一种制备以下化学式的化合物的方法，

其中R选自：

R₁＝OH R₂＝H

R₁＝OH R₂＝H

R₁＝H R₂＝OH

和

R₁＝H；R₂＝OH

该方法包括在能将三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱的不饱和2″，3″侧链部分选择性氯化的条件下将三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱氯化。

31.权利要求30的方法，其中生成了非对映异构体I、II、III和IV的混合物，该方法还包括从混合物中将各化合物I、II、III和IV分开。

32.权利要求30的方法，其中三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱以任何数量存在于含有紫杉醇和其它紫杉烷环化合物的混合物中。

33.权利要求32的方法，其中氯化反应在约-20℃至20℃的温度下进行。

34.权利要求32的方法，其中氯化反应在约-5℃至20℃的温度下进行。

35.权利要求32的方法，其中氯化反应在暗处进行。

36.权利要求32的方法，其中氯化反应用相对于三尖杉宁碱或7-表-三尖杉宁碱浓度的化学计量数量的氯进行。

37.权利要求32的方法，其中氯化反应用氯在一种氯化溶剂中的溶液进行，该氯化溶剂选自CCl₄、CHCl₃、ClCH₂CH₂Cl和CH₂Cl₂。