CH640511A5

CH640511A5 - Synthesis of tris(hydroxymethyl)methane-substituted peptides

Info

Publication number: CH640511A5
Application number: CH386979A
Authority: CH
Inventors: Rolf Dr Schaefer; Doris Dr Schaefer; Werner Schaefer
Original assignee: Schaefer Chemisches Inst Ag
Priority date: 1979-04-25
Filing date: 1979-04-25
Publication date: 1984-01-13

Description

**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.

PATENTANSPRÜCHE
1. Synthese von Tris-hydroxymethyl-methan substituierten niederen Peptiden der Formel
EMI1.1
dadurch gekennzeichnet, dass man Tris-hydroxymethyl-amino-methan
EMI1.2

In-vitro-Kulturen tierischer und menschlicher primärer oder kontinuierlicher (transformierter) Zellinien repräsentieren biologisch höchst empfindliche Systeme. Die Zellen müssen für ihre optimale Proliferation neben Temperaturkonstanz, Serumzusatz und aufwendigen Nährlösungen vor allem um den physiologischen pH-Wert (pH 7,2-7,4) mit nichttoxischen Substanzen gut abgepuffert werden.

Während für einige wenige kontinuierliche Zellinien synthetische Puffersubstanzen wie Piperazinsulfonsäure-Derivate sich in allerdings nur niedrigen Konzentrationen (20-50 mM) als nichttoxisch erwiesen haben, ist man hingegen für die Kultivierung der meisten Zellinien auf das CO2/ NaHCO3-Puffersystem angewiesen. Dies hat den Nachteil, dass man in offenen Gefässen respektive Systemen arbeiten muss, um den Gasaustausch zu gewährleisten. Kontaminationen durch Bakterien, Mycoplasmen, Hefe und Pilze lassen sich nur durch den Einsatz bestimmter Verbindungen (Antibiotikas, Fungizide) auf ein Minimum reduzieren, wobei diese Verbindungen das Wachstum tierischer oder menschlicher Zellen beeinträchtigen. Antikontaminationsmittel sind vor allem dann nicht erwünscht, wenn auf menschlichen primären Zellinien Humanvaccine hergestellt werden müssen.

Diese Sterilitätsprobleme respektive der Einsatz von Antibiotikas lassen sich vollständig eliminieren, wenn es möglich ist, primäre Humanzellen in geschlossenen Systemen zu kultivieren, was dann den Einsatz nichttoxischer Puffer bedingt..

Es hat sich gezeigt, dass als nichttoxische Puffer hierfür niedere Peptide oder Tris-hydroxymethyl-methan substituierte niedere Peptide sehr geeignet sind. Niedere Peptide besitzen eine gute Pufferkapazität in einem weiten pH-Bereich (in Abhängigkeit der Aminosäuren-Zusammensetzung), kommen jedoch als Puffersubstanzen praktisch nicht in Frage, da ihre Löslichkeiten in protischen Lösungsmitteln zu gering sind und oft durch biologische Systeme metabolisiert, das heisst aufgebraucht werden.

Beide Nachteile lassen sich durch geeignete Substituenten an den Peptiden eliminieren. AIs Substituent besitzt hierfür der Tris-hydroxymethyl-methan-Rest die erforderlichen molekularen Eigenschaften, niedere Peptide in eine gut wasserlösliche Form zu überführen. Dies erfolgt durch die Umsetzung von Tris-hydroxymethyl-aminomethan mit N-2halogenacetylierten Aminosäuren respektive N-2-halogenacetylierten Di-, Tri- und Tetrapeptiden in wässriger Lösung.

Bei dieser Kondensationsreaktion wird die Aminosäure respektive das niedere Peptid am N-Terminus um einen Glycinrest verlängert, welcher seinerseits Tris-hydroxymethylmethan substituiert ist. Hierdurch lassen sich Tris-hydroxy- methyl-methan substituierte Peptide ganz allgemein, wie folgt, synthetisieren:
EMI1.3
mit N-(2-halogenacetylierten) Aminosäuren respektive N-(2halogenacetylierten) Di-, Tri- und Tetrapeptide der Formel
EMI1.4
umsetzt, wobei X = C1, Br oder J und Y eine Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid bedeuten.

2. Synthese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure eine a-l- oder a-d-Aminosäure darstellt.

3. Synthese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Di-, Tri- oder Tetrapeptid aus ss-, y- oder 6-Amino- säuren oder deren Gemische besteht.

4. Synthese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Di-, Tri- und Tetrapeptide nach Anspruch 3 saure und basische Aminosäuren, zum Beispiel Aminodicarbonsäuren und Di-aminocarbonsäuren im Molekül enthalten.

5. Synthese nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Alkalisalze der Aminosäuren respektive Di-, Tri- und Tetrapeptide verwendet.

6. Verwendung der nach Anspruch 1 und 2 erhaltenen Peptide als untoxische Puffer für sämtliche biologischen Systeme, wobei für die Aminosäure alle natürlichen l-Amino- säuren stehen.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Tris-Gly-Ala als untoxische Puffersubstanz für kontinuierliche und primäre Zellinien einsetzt.

8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, dass man Tris-Gly-Met als untoxische Puffersubstanz für kontinuierliche und primäre Zellinien einsetzt.

hydroxymethyl-aminomethan und erwärmt das Gemisch

zum Siedepunkt unter Rückfluss für vier Stunden. Nach Zusatz von Äthanol bis zum Trübungspunkt in der Hitze lässt man das Produkt (Tris-Gly-met) unter Abkühlen auskristallisieren.

Beispiel 2
Zu einer gesättigten, wässrigen Lösung von 1 Mol N-2-Jacetyl-l-tyrosin (Li-Salz) gibt man 1,05 Mol Tris-hydroxymethyl-aminomethan und erwärmt das Gemisch zum Siedepunkt unter Rückfluss und Lichtausschluss für 15 Minuten.

Nach Zusatz von Äthanol bis zum Trübungspunkt in der Hitze lässt man das Produkt (Tris-Gly-Tyr) unter Abkühlen auskristallisieren .

Beispiel 3
Zu einer gesättigten, wässrigen Lösung von 0,1 Mol N-2 Br-acetyl-l-gly-l-arg-d-asp-l-threo (K-Salz) gibt man 0,1 Mol Tris-hydroxymethyl-aminomethan und erwärmt das Gemisch zum Siedepunkt unter Rückfluss und Lichtausschluss für 45 Minuten. Nach Zusatz von Isopropanol bis zum Trübungspunkt in der Hitze lässt man das Produkt (Tris-Gly-Gly-arg-ser-threo) unter Abkühlen auskristallisieren.

Beispiel 4
Zu einer gesättigten, wässrigen Lösung von 0,05 Mol N2-chloracetyl-y-aminobuttersäure (K-Salz) gibt man 0,05 Mol Tris-hydroxymethyl-aminomethan und erwärmt das Gemisch zum Siedepunkt unter Rückfluss für fünf Stunden.

Nach Zusatz von Propanol bis zum Trübungspunkt in der Hitze lässt man das Produkt (Tris-Gly-y-butyr) unter Abkühlen auskristallisieren.
EMI2.1

wobei X = Cl, Br, J und Y eine a-6- oder a-l-Aminosäure, Di-, Tri- oder Tetrapeptid, bestehend aus p y- oder 8-Ami- nosäuren und deren Gemische, darstellen.

Die bei der Reaktion freiwerdende Salzsäure wird dadurch abgefangen, indem man für die Reaktion die Alkalisalze der Aminosäuren oder Peptide verwendet. Nach der Reaktion entstehen somit die inneren Salze der Tris-substituierten Aminosäuren und die entsprechenden Salze der Alkali- und Halogengruppe. Die Reaktionen werden potentiometrisch verfolgt. Nach pH-Konstanz ist die Umsetzung vollständig.

Nimmt man zur Synthese N-2-halogenacetylierte a-l Aminosäuren, so werden Puffersubstanzen erhalten, welche für primäre und kontinuierliche Zellinien in Konzentrationen bis zu 0,1 M absolut untoxisch sind.

Beispiel 1
Zu einer gesättigten, wässrigen Lösung von 1 Mol N-2chloracetyl-l-methionin (Na-Salz) gibt man 1,05 Mol Tris

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Synthese von Tris-hydroxymethyl-methan substituierten niederen Peptiden der Formel EMI1.1 dadurch gekennzeichnet, dass man Tris-hydroxymethyl-amino-methan EMI1.2 In-vitro-Kulturen tierischer und menschlicher primärer oder kontinuierlicher (transformierter) Zellinien repräsentieren biologisch höchst empfindliche Systeme. Die Zellen müssen für ihre optimale Proliferation neben Temperaturkonstanz, Serumzusatz und aufwendigen Nährlösungen vor allem um den physiologischen pH-Wert (pH 7,2-7,4) mit nichttoxischen Substanzen gut abgepuffert werden.

Während für einige wenige kontinuierliche Zellinien synthetische Puffersubstanzen wie Piperazinsulfonsäure-Derivate sich in allerdings nur niedrigen Konzentrationen (20-50 mM) als nichttoxisch erwiesen haben, ist man hingegen für die Kultivierung der meisten Zellinien auf das CO2/ NaHCO3-Puffersystem angewiesen. Dies hat den Nachteil, dass man in offenen Gefässen respektive Systemen arbeiten muss, um den Gasaustausch zu gewährleisten. Kontaminationen durch Bakterien, Mycoplasmen, Hefe und Pilze lassen sich nur durch den Einsatz bestimmter Verbindungen (Antibiotikas, Fungizide) auf ein Minimum reduzieren, wobei diese Verbindungen das Wachstum tierischer oder menschlicher Zellen beeinträchtigen. Antikontaminationsmittel sind vor allem dann nicht erwünscht, wenn auf menschlichen primären Zellinien Humanvaccine hergestellt werden müssen.

Diese Sterilitätsprobleme respektive der Einsatz von Antibiotikas lassen sich vollständig eliminieren, wenn es möglich ist, primäre Humanzellen in geschlossenen Systemen zu kultivieren, was dann den Einsatz nichttoxischer Puffer bedingt..

Es hat sich gezeigt, dass als nichttoxische Puffer hierfür niedere Peptide oder Tris-hydroxymethyl-methan substituierte niedere Peptide sehr geeignet sind. Niedere Peptide besitzen eine gute Pufferkapazität in einem weiten pH-Bereich (in Abhängigkeit der Aminosäuren-Zusammensetzung), kommen jedoch als Puffersubstanzen praktisch nicht in Frage, da ihre Löslichkeiten in protischen Lösungsmitteln zu gering sind und oft durch biologische Systeme metabolisiert, das heisst aufgebraucht werden.

Beide Nachteile lassen sich durch geeignete Substituenten an den Peptiden eliminieren. AIs Substituent besitzt hierfür der Tris-hydroxymethyl-methan-Rest die erforderlichen molekularen Eigenschaften, niedere Peptide in eine gut wasserlösliche Form zu überführen. Dies erfolgt durch die Umsetzung von Tris-hydroxymethyl-aminomethan mit N-2halogenacetylierten Aminosäuren respektive N-2-halogenacetylierten Di-, Tri- und Tetrapeptiden in wässriger Lösung.

Bei dieser Kondensationsreaktion wird die Aminosäure respektive das niedere Peptid am N-Terminus um einen Glycinrest verlängert, welcher seinerseits Tris-hydroxymethylmethan substituiert ist. Hierdurch lassen sich Tris-hydroxy- methyl-methan substituierte Peptide ganz allgemein, wie folgt, synthetisieren: EMI1.3 mit N-(2-halogenacetylierten) Aminosäuren respektive N-(2halogenacetylierten) Di-, Tri- und Tetrapeptide der Formel EMI1.4 umsetzt, wobei X = C1, Br oder J und Y eine Aminosäure oder ein Di-, Tri- oder Tetrapeptid bedeuten.
2. Synthese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure eine a-l- oder a-d-Aminosäure darstellt.
3. Synthese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Di-, Tri- oder Tetrapeptid aus ss-, y- oder 6-Amino- säuren oder deren Gemische besteht.
4. Synthese nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Di-, Tri- und Tetrapeptide nach Anspruch 3 saure und basische Aminosäuren, zum Beispiel Aminodicarbonsäuren und Di-aminocarbonsäuren im Molekül enthalten.
5. Synthese nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Alkalisalze der Aminosäuren respektive Di-, Tri- und Tetrapeptide verwendet.
6. Verwendung der nach Anspruch 1 und 2 erhaltenen Peptide als untoxische Puffer für sämtliche biologischen Systeme, wobei für die Aminosäure alle natürlichen l-Amino- säuren stehen.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Tris-Gly-Ala als untoxische Puffersubstanz für kontinuierliche und primäre Zellinien einsetzt.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, dass man Tris-Gly-Met als untoxische Puffersubstanz für kontinuierliche und primäre Zellinien einsetzt. **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.