CH629372A5

CH629372A5 - Process for the production of biomasses by new monocellular microorganisms of the genus Prototheca

Info

Publication number: CH629372A5
Application number: CH880376A
Authority: CH
Inventors: Ludwig Degen; Pasquale Zaffaroni; Lamberto Formiconi; Antonio Senni
Original assignee: Anic Spa
Priority date: 1975-07-10
Filing date: 1976-07-08
Publication date: 1982-04-30
Also published as: GB1522756A; IT1039758B; AU1556476A; BE843992A; JPS5212991A; FR2317355B1; FR2317355A1; DE2631047C3; SE7607909L; NL7607713A; DE2631047B2; DK141760B; AU507816B2; SU708997A3; ATA508976A; LU75347A1; DK311676A; AT354966B; DE2631047A1; ZA763893B

Description

La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per la produzione di biomasse utilizzando nuovi microorganismi monocellulari del genere Prototheca.

Nella letteratura tecnica ed in brevetti sono descritti numerosi procedimenti di fermentazione per la produzione di microorganismi che forniscono sostanze proteiche. Sono per esempio descritti processi per la coltivazione, di lieviti su carboidrati, contenuti in melassi, liscive sulfitiche di cartiere nonché su frazioni di n-alcani del gasolio. Simili processi sono anche descritti per la produzione di biomasse con batteri.

Durante la fermentazione per la produzione di lieviti o di batteri si sviluppa una notevole quantità di calore a causa dell'ossidazione del substrato, che è tanto più grande quanto più basso è il grado di ossidazione del medesimo.

L'uso di substrati parzialmente ossidati limita il consumo di ossigeno e la produzione di calore.

Inoltre l'uso di microorganismi che crescono a temperature elevate limita notevolmente i costi di raffreddamento.

In molti processi per la produzione di biomasse può rendersi necessaria una estrazione con solventi organici per eliminare residui del substrato non desiderati o nocivi come idrocarburi ad alto peso molecolare o idrocarburi policiclici ecc.

Substrati molto idonei per la produzione di bioproteine sono alcoli. Essi sono solubili in acqua, sono già parzialmente ossidati e vengono prodotti industrialmente ad un alto grado di purezza. Fra gli alcoli alifatici vengono usati come substrati in prima linea metanolo ed etanolo.

Considerazioni economiche richiedono che i substrati per la produzione di bioproteine siano di basso costo.

In confronto con prodotti di scarto, il costo dell'etanolo è relativamente alto. È perciò essenziale che il substrato venga completamente utilizzato.

Il procedimento secondo l'invenzione per la produzione di biomassa utilizzando il microorganismo del genere Prototheca è caratterizzato nella rivendicazione 1 precedente.

Con la scelta dell'etanolo vengono evitati numerosi inconvenienti di altri substrati. Infatti, l'etanolo è facilmente reperibile e viene usato come alimento. Non esistono problemi tossicologici perché viene prodotto ad un alto grado di purezza; inoltre l'etanolo è volatile ed eventuali residui vengono facilmente eliminati durante l'essiccamento delle cellule. Non esistono inoltre problemi di distribuzione del substrato nel terreno nutritivo come con polisaccaridi e idrocarburi.

I ceppi usati secondo la presente invenzione possiedono inoltre il grande vantaggio di crescere a temperature fino a 40°C, preferibilmente a 33-37°C, ed in un vasto campo di pH (pH 1,0-8,0), preferibilmente a pH 3,0-5,0 il che dimi-

15

20

TABELLA 1 Caratteristiche colturali e fisiologiche

Caratteristiche colturali terreno solido (24 h): (peptone-glucosio)

terreno liquido (24 h): (peptone-glucosio)

diametro delle colonie 2-3 mm friabili, ruvide, opache senza pigmenti; sedimento, pellicola sottile.

B. Caratteristiche del ciclo vegetativo:

25 Formazione di 2-8 aplanospore (endospore).

Dopo rottura della cellula madre le aplanospore ripetono il ciclo, alcuni formano hypnospore (resting cells).

C. Caratteristiche delle cellule vegetative:

30 Sferoidali o ellipsoidali aventi le dimensioni 15-25 X 20-30 [J,. Formazione di aggregati. Nucleo e granuli di riserva ben visibili.

D. Caratteristiche sessuali:

35 Non è stato osservato alcun ciclo sessuale. .

E. Caratteristiche fisiologiche:

1) Utilizzazione di varie fonti di carbonio a) utilizzazione fermentativa

40 glucosio acido senza gas, lento galattosio negativo saccarosio negativo maltosio negativo lattosio negativo

45 raffinosio negativo melibiosio negativo inulina negativo amido negativo a-metil-D-glucoside negativo

50

b) utilizzazione assimilativa di fonti di carbonio D-glucosio positivo D-galattosio negativo saccarosio negativo

55 fruttasio positivo maltosio negativo lattosio negativo raffinosio negativo melibiosio negativo

60 inulina negativo amido solubile negativo a-metil-D-glucoside negativo

L-sorbosio negativo salicina negativo

65 arbutina negativo cellobiosio negativo trealosio negativo melizitosio negativo

3

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D-xilosio

D-arabinosio

L-arabinosio

D-ribosio

L-ramnosio metanolo etanolo n-propanolo iso-propanolo n-butanolo terz-butanolo cicloesanolo glicerolo eritritolo ribitolo dulcitolo

D-mannitolo sorbitolo inositolo

DL-acido lattico acido succinico acido citrico n-paraffine negativo negativo negativo negativo negativo negativo positivo positivo negativo positivo negativo negativo positivo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo positivo

2) utilizzazione di varie fonti di azoto: ammonio, nitrato e urea

3) fattori di crescita richiede tiamina

4) crescita a diverse temperature

4°C 15-42°C 45°C

negativo positivo negativo

Recentemente Arnold e Ahearn (Mycologia 64, 265, 1972) hanno proposto una chiave per la classificazione della specie del genere Prototheca, secondo cui i ceppi, che fanno parte della presente invenzione, appartengono alla specie P. zopfii.

I ceppi contrassegnati con i numeri 855 A, B e C si distinguono però dalla descrizione standard di P. zopfii e da un ceppo di collezione (ottenuto dal Prof. Liferri - Pavia) (Vedi tabella 2).

TABELLA 2

rali e fattori crescita. La tiamina può essere fornita come tale oppure come liquido di macerazione del granoturco (corn steep liquor) o melassa o estratto di lievito. L'etanolo come fonte di carbonio può essere aggiunto al terreno di col-s tura tutto in una volta prima della fermentazione oppure in piccole dosi durante il corso della fermentazione. È però preferibile aggiungere l'etanolo in continuo durante la fermentazione per consentire una più completa utilizzazione.

La fermentazione viene eseguita a temperature comprese io fra 15 e 40°C, preferibilmente a 30-38°C, e ad un pH compreso tra 1 e 8, preferibilmente 3,0-5,0.

Secondo il procedimento qui descritto, che fa parte dell'invenzione, si ottiene resa del 60-70% (g biomassa secca/g EtOH) con una concentrazione di cellula nella coltura di 15 20-60 g/1.

Un importante vantaggio di questo procedimento sta nell'utilizzazione di alghe eterotrofe del genere Prototheca. Esse, per la loro grandezza, sono infatti facilmente recuperabili.

Nel caso della fermentazione in discontinuo le cellule 20 vengono recuperate per sedimentazione o filtrazione alla fine della fermentazione. Analogamente si procede per recuperare la biomassa durante il processo in continuo.

La biomassa così ottenuta ed essiccata contiene all'in-circa 50-60% di proteina grezza assieme a polisaccaridi, lipi-25 di e acidi nucleici.

Secondo l'invenzione è possibile produrre biomasse ad alto contenuto proteico, coltivando alghe eterotrofe del genere Prototheca in un semplice terreno colturale contenente etanolo come unica fonte di carbonio.

30 Quanto precedentemente detto ed ulteriori caratteristiche operative saranno più chiaramente comprensibili dall'esame degli esempi qui di seguito riportati al solo intento di meglio illustrare l'invenzione, senza tuttavia limitarne gli scopi.

35

Esempio 1

Veniva preparato un terreno di coltura avente la seguente composizione:

45

855 A

P. zopfii

P. zopfii (dati di letteratura)

50

D-galattosio negativo positivo positivo iso-pentanolo negativo negativo positivo crescita a 42°C positivo negativo —

(NH4)2S04

5

g/1

NaH2P04. H20

10

g/1

kh2po4

10

g/1

MgSOé. 7HzO

0,2

g/1

FeS04. 7H20

2

mg/1

ZnSO„. 7H20

2

mg/1

CaCl2

2

mg/1

Estratto di lievito

500

mg/1

sol. di oligoelementi

1

mi

La composizione della soluzione di oligoelementi era:

CuS04. 5H20

5

mg/1

H3BO3

500

mg/1

MnSO,. H20

500

mg/1

kj

10

mg/1

CaCl. 6H20

10

mg/1

Mo03

10

mg/1

Il ceppo 855 A (wild type) può essere perciò considerato una variante stabile e definita della specie P. zopfii. Proponiamo il nome: Prototheca zopfii var. harcourt con la descrizione standard come in tabella 1. Esso è stato depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures Baarn con il numero CB5 26S.75.

Secondo l'invenzione le cellule di Prototheca zonfii, var. harcourt 855 A, usate per la produzione di bioproteine, vengono coltivate in terreni di coltura contenenti fino a 4% di etanolo, come fonte di carbonio, fonti di azoto, sali mine-

Dopo la correzione del pH a 5,0, il terreno veniva distri-60 buito in porzioni di 100 mi in beute da 500 e dopo la sterilizzazione (30 min a 116°C) venivano aggiunti 1% di etanolo (v/v). Le beute venivano inoculate con una coltura di 3 giorni a 30°C del ceppo 855 A su slant, contenente lo stesso terreno più 2% di agar e successivamente incubate (agita-65 zione orbitale, 220 r.p,m.) a 30°C. Alla 24a ora di incubazione veniva aggiunto ancora il 2% di etanolo.

La resa in cellule secche dopo 33 ore di incubazione era di 18,7 g/1.

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4

Esempio 2

Veniva eseguita una fermentazione a 40°C lasciando inalterate tutte le altre condizioni dell'esempio 1.

La resa in cellule secche dopo 48 h di incubazione era di 18,7 g/1.

Esempio 2

La resa in cellule secche dopo 48 h di incubazione era di 13,5 g/1.

Esempio 3

Veniva preparato un terreno colturale come in esempio 1, contenente al posto dell'estratto di lievito 1,5 g/1 Corn Steep liquor (C.S.L.).

La resa in peso secco dopo 34 h di fermentazione nelle condizioni dell'esempio 1 a 35°C era di 17,5 g/1.

Esempio 4

In piccoli fermentatori di laboratorio con una turbina a 4 frangiflutti della capacità di 161, venivano preparati 101 del terreno come in esempio 1, con l'unica differenza che la concentrazione dei fosfati era di 2 g/1, anziché 10 g/1. Dopo la sterilizzazione per 30 min a 116°C, i fermentatori venivano inoculati nella misura del 10% con una coltura di 21 h a 35°C del ceppo 855 A in beuta con lo stesso terreno dell'esempio 1. La coltivazione veniva eseguita a 35°C, 1000 giri/min ed una areazione di 0,5 v/v/min. Il pH veniva controllato a pH 4,0 con soda per tutta la fermentazione. L'etanolo veniva aggiunto al principio (1 % v/v) ed alla 24a ora di fermentazione (2% v/v).

Dopo 43 ore di fermentazione, le cellule venivano raccolte per filtrazione su carta e dopo lavaggio con acqua venivano essiccate a 90°C sotto vuoto.

La resa di cellule secche era di 50,5 g/1 contenenti 52,56% di proteine grezze (N X 6,25) e 4,73% di lipidi.

incubazione la concentrazione di biomassa passava da 10,3 g/1 a 33,1 g/1.

Esempio 6

s In un fermentatore da 16 litri, con 1 turbina e 4 frangiflutti, contenente 7 litri di terreno, veniva preparata una coltura del ceppo 855 A come in esempio 4.

Per la fermentazione in continuo veniva preparato un terreno nutritivo (= feed) avente la seguente composizione:

io

Na^PO,. HjO 2,0 g/1

KH2P04 2,0 g/1

(NH4)2S04 5,0 g/1

MgS04 . 7HzO 0,2 g/1

15 FeS04. 7H20 22 mg/1

20 mg/1

ZnS04. 7H20 CaCl,

sol. di oligoelementi estratto di lievito 20 etanolo (Sc)

20 mg/1 2 ml/1 0,5 g/1 37,6 g/1

Il terreno (senza etanolo) veniva portato a pH 4,0 e sterilizzato a 116aC per 30 min.

A velocità di diluizione (D = jx) di 0,190 hr1, 2000 giri/ 25 min ed una areazione di 1,5 v/v/min si ottenevano i seguenti risultati:

S = concentrazione di etanolo nella coltura 0,067 g/1

30 X = concentrazione di biomassa nella coltura 25,12 g/1

YSUb = resa (g biomassa/g substrato) 0,66

P = produttività 4,8 g/l.h

35

La biomassa veniva raccolta per centrifugazione e dopo un lavaggio con acqua, essiccata in stufa sotto vuoto. La composizione della biomassa è riportata in tabella 3.

Esempio 5

Un fermentatore da laboratorio della capacità di 20 litri e contenente 12 litri del terreno colturale usato nell'esempio 4, venne inoculato come ivi descritto ed incubato per 24 ore a 35°C, sotto agitazione (800 giri/minuto) e con l'immissione di 0,5 v/v/min di aria.

Con 1,5 litri ciascuno di questa precoltura vennero inoculati due fermentatori da laboratorio del tipo descritto nell'esempio 4 e contenenti 101 dello stesso terreno colturale, con 1' 1 % di etanolo. I fermentatori venivano agitati a 1000 giri/minuto con una aereazione di 0,5 v/v/minuto: la temperatura di incubazione di uno dei fermentatori veniva mantenuta a 30°C, mentre quella dell'altro era di 35°C. Per mantenere il pH al valore desiderato (circa pH 4) veniva utilizzata una miscela costituita da ammoniaca acquosa al 32% ed etanolo 95 % nel rapporto 20: 80. In tal modo non solo il pH veniva mantenuto attorno al valore ottimale per la crescita, ma veniva fornita automaticamente anche la fonte di C.

Dopo 20 ore di incubazione le concentrazioni della biomassa erano rispettivamente 20,6 g/1 (30°C) e 21,3 g/1 (35°C). La velocità di agitazione veniva allora innalzata a 1500 giri/min e l'areazione a 0,75 v/v/minuto. Dopo altre 25 ore di incubazione le concentrazioni della biomassa erano rispettivamente di 53,2 g/1 (30°C) e di 58,1 g/1 (35°C).

Con due litri della coltura a 35°C venne inoculato un terzo fermentatore dello stesso tipo contenente 10 litri dello stesso terreno colturale che venne anch'esso incubato a 35C, 1500 giri/min e 0,75 v/v/min di aria. In otto ore di

40

TABELLA 3

Dati analitici della biomassa di Prototheca zopfii var. harcourt 855 A

45 umidità 0,60%

ceneri 7,04%

N (Kjeldahl) 8,45%

proteine grezze (N X 6,25) 52,62%

proteine (biureto) 45,70%

50 lipidi grezzi 4,82%

acidi grassi 3,08%

carboidrati solubili 11,96%

fibra grezza 2,50%

RNA 15,17%

55 DNA 0,42%

60

65

Analisi elementare C H N

46,10% 6,71% 8,32%

Composizione percentuale degli acidi grassi:

n-C14

1,38%

n-C16

29,12%

n-C16 :

: 1

0,90%

n-Ci8

4,44%

n~C18 :

1

28,46%

n-C18 :

2

35,70%

5

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Composizione percentuale degli amminoacidi: (g/100 g di biomassa secca)

lisina

1,88

istidina

0,779

arginina

5,11

acido aspartico

3,03

treonina

1,73

serina

1,56

acido glutammico

4,85

prolina 3,13

glicina 1,98

alanina 2,26

valina 2,11

5 metionina 0,83

isoleucina 1,12

leucina 2,95

tirosina 1,32

fenilalanina 1,55

io triptofano 0,23

v

Claims

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1. Procedimento per la produzione di bioproteine consistente nel coltivare il microorganismo monocellulare del genere Prototheca, depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures Baarn con il numero CB5 265.75 in un terreno di coltura contenente etanolo come fonte di carbonio, ottenendo così una biomassa contenente bioproteine.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'etanolo è aggiunto al terreno di coltura fino al 4% in peso.

2

RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fermentazione viene eseguita a temperature comprese fra 15 e 40°C, preferibilmente fra 30 e 38°C.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che la fermentazione viene eseguita ad un pH comprese fra 1 e 8, preferibilmente fra 3 e 5.

nuisce il pericolo di infezione batterica durante la fermentazione.

Molti microorganismi non crescono in substrati conte- • nenti alcoli, altri crescono solo se le concentrazioni sono bas-5 se. I nostri ceppi invece crescono bene anche ad alte concentrazioni e solamente concentrazioni superiori a 4% sono inibenti.

I ceppi di Prototheca, oggetto della presente invenzione, sono stati isolati e selezionati da campioni di terra prelevalo ti ad Harcourt in Nigeria e sono contrassegnati con i numeri 855 A, 855 B e 855 C. Le caratteristiche colturali e fisiologiche sono riassunte in tabella 1.