Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung eines Mikroorganismen enthaltenden Materials von verdampfbaren Substanzen.
Verfahren zur Extraktion mit einem Lösungsmittel von Mikroorganismen enthaltenden Fraktionen zum Entfernen von Lipoiden und/oder Schmutzstoffen wurden bereits beschrieben.
Durch die Extraktion mit einem Lösungsmittel oder eine andere Behandlung oder Methoden zur Züchtung von Mikroorganismen kann ein Mikroorganismenprodukt erzielt werden, mit dem Wasser und ein dem Mikroorganismus fremder Stoff verbunden sind. Dieser Stoff hat in gewissen Fällen einen solchen Siedepunkt, dass er unter geeigneten Bedingungen im wesentlichen vollständig verdampft werden kann, wobei ein Teil des erwähnten Wassers in Verbindung mit dem Mikroorganismus zurückbleibt; ein Stoff, der diesen Charakter aufweist, wird nachstehend als verdampfbarer Stoff bezeichnet.
Wir haben festgestellt, dass unter gewissen Bedingungen die Verdampfung der mit dem Mikroorganismus verbundenen Flüssigkeiten zu einem Mikroorganismenprodukt führen kann, bei dem ein Teil des verdampfbaren Stoffes sich nicht durch herkömmliche Methoden, wie z. B. Erhitzen oder eine weitere Extraktion mit einem Lösungsmittel, entfernen lässt.
Wir haben ferner festgestellt, dass in Gegenwart einer gewissen Menge von Wasser der Mikroorganismus diese Verbindung nicht bildet (jedenfalls nicht in einer Weise, die das Entfernen des verdampfbaren Stoffes verhindert).
Wir haben ferner festgestellt, dass das Entfernen eines Teils des Wassers und in gewissen Fällen der ganzen Wassermasse aus dem den Mikoorganismus enthaltenden Material ohne die Bildung der erwähnten Verbindung erzielt werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung eines Mikroorganismen enthaltenden Materials von verdampfbaren Substanzen ist nun dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismen, Wasser und eine weitere verdampfbare Substanz enthaltendes Material, in welchem das Wasser in einer Menge von über 20sec, auf das Trockengewicht der Mikroorganismen bezogen, vorliegt, derart behandelt wird, dass mindestens ein Teil oder die Gesamtheit des von Wasser verschiedenen verdampfbaren Stoffes entfernt wird, während mindestens 20% Wasser, auf das Trockengewicht der Mikroorganismen bezogen, in Verbindung mit den Mikroorganismen beibehalten wird.
Eine besondere Ausführungsart des Verfahrens besteht darin, dass man das Mikroorganismen enthaltende Material so behandelt, dass ein Teil oder die Gesamtheit des Wassers entfernt und ein Mikroorganismen enthaltendes Konzentrat erhalten wird, das noch mindestens 20% Wasser, auf das Trockengewicht der Mikroorganismen bezogen, enthält, worauf der verdampfbare Stoff oder dessen Rückstand aus dem Konzentrat entfernt wird.
Es ist klar, dass besondere Sorgfalt notwendig ist, um zu gewährleisten, dass der verdampfbare Stoff aus der Verbindung mit dem Mikroorganismus entfernt wird, während mindestens 20 Gew.-c Wasser in Verbindung mit dem Mikroorganismus beibehalten wird.
Der verdampfbare Stoff kann durch Verwendung von Hitze und/oder vermindertem Druck unter solchen Bedingungen, dass (a) das Entfernen desselben vor dem Entfernen von Wasser stattfindet oder (b) unter solchen Bedingungen, dass der verdampfbare Stoff und das Wasser miteinander entfernt werden, wobei mindestens ein Teil der auf diese Weise entfernten Flüssigkeit durch Beigabe von Wasser zum Mikroorganismus ersetzt wird, entfernt werden.
Die obige Methode (a) kann durch eine mehrstufige und vorzugsweise zweistufige Verdampfung oder durch Verwendung eines Abscheidungsmittels zum vorzugsweisen Entfernen des verdampfbaren Stoffes durchgeführt werden.
Ferner kann man so verfahren, dass ein Mikroorganismen enthaltendes Material. das einen Mikroorganismus in Verbindung mit (a) überschüssigem Wasser in bezug auf das im lebendigen Mikroorganismus im trockenen Zustand vorhandene Wasser und (b) einen oben genannten verdampfbaren Stoff enthält, wobei das erwähnte Material unter solchen Bedingungen gehalten wird. dass der verdampfbare Stoff durch Verdampfen entfernt wird, während ein Teil des Wassers in Verbindung mit dem Mikroorganismus zurückbleibt.
Gegebenenfalls kann das Verfahren mit einem oben beschriebenen Material verwendet werden, bei dem der verdampfbare Stoff einen Siedepunkt in der Nähe von oder über demjenigen von Wasser aufweist. In diesem Fall kann das Mikroorganirmen enthaltende Material behandelt werden, indem es bei geeigneter Temperatur undioder vermindertem Druck unter Beigabe von Wasser gehalten wird, um Wasser in Verbindung mit dem Mikroorganismus zu behalten. Gegebenenfalls kann ein Abscheidungsmittel verwendet werden.
Das Verfahren eignet sich besonders zur Behandlung eines Mikroorganismen enthaltenden Materials. in welchem der oben genannte verdampfbare Stoff einen Siedepunkt unter demjenigen von Wasser aufweist: ein solcher Stoff wird aus Gründen der Zweckmässigkeit nachstehend als flüchtiger Stoff bezeichnet.
Das Verfahren kann man ferner auch so durchführen, dass man bei einer Temperatur. bei der der flüchtige Stoff unter den herrschenden Bedingungen entfernbar ist, aber unter derjenigen, bei der das Wasser mit einer wesentlichen Geschwindigkeit durch Verdampfung entfernt wird, arbeitet.
während der flüchtige Stoff durch Verdampfung entfernt wird.
Anfänglich kann ein Teil des Wassers rasch entfernt werden, z. B. unter Verwendung einer Zerstäuberspritzvorrichtung, so dass ein mindestens 20 Gew.-6 c Wasser enthaltendes Material erzielt wird.
Vorzugsweise wird der verdampfbare Stoff entfernt, indem der Mikroorganismus nahe bei einer geheizten Oberfläche gehalten und vorzugsweise in Bewegung in bezug auf die Oberfläche gehalten wird.
Es eignet sich dazu eine Förderschnecke, der Hitze zugeführt wird. Gegebenenfalls kann die Förderschnecke mit einem Heizmantel versehen werden.
Durch eine geeignete Verteilung der Hitze auf die Förderschnecke und 'oder die Ummantelung. wenn eine solche verwendet wird, kann die Förderschnecke eine doppelte Funktion erfüllen: sie entfernt den verdampfbaren Stoff, während eine gewünschte Menge Wasser im Mikroorganismus zurückgehalten wird, und entfernt danach die Gesamtheit oder einen Teil des verbleibenden Wassers.
Das Mikroorganismus enthaltende Material wird zweckmässig in Bewegung in bezug auf die Oberfläche der Förderschnecke gehalten, und zwar durch Prallbleche im Fördersystem, die mit einem Propeller zusammenwirken. mittels der das erwähnte Material durch ein Rohr befördert wird. Zweckmässig weist der Propeller eine hohle Achse auf und wird mit Dampf beheizt. Die Förderschnecke wird normalerweise kontinuierlich betrieben, wobei frisches Material durch einen Trichter zugeführt wird. Vorzugsweise wird das System verschlossen und mittels eines inerten Gases unter Druck gehalten, damit Luftsauerstoff zum mindesten weitgehend ausgeschlossen ist.
Wenn erwünscht, kann der verdampfbare Stoff und nachher wenigstens ein Teil des verbleibenden Wassers mittels einer Schalentrockenvorrichtung mit geheizter Oberfläche und einem Schaber zur Weiterbeförderung des Materials, aus dem Mikroorganismus entfernt werden, wobei die Schalentrockenvorrichtung gewöhnlich chargenweise betrieben wird.
Wenn erwünscht. kann das so erhaltene Produkt weiterverar beitet werden, um die Gesamtheit oder einen Teil des verblei benden Wassers des Materials zu entfernen. Zweckmässig kann dies erfolgen, indem das Produkt mittels eines Zerstäubers getrocknet oder mittels einer beheizten Förderschnecke in Berührung gebracht wird.
Vorzugsweise wird dazu ein Material verwendet, bei dem die Gesamtmenge des verdampfbaren Stoffes 50 Gew.-% des mit den Mikroorganismen in Verbindung stehenden Wassers nicht übersteigt, das Wasser in den Mikroorganismen in trokkenem Zustand nicht eingerechnet.
Verdampfbare Stoffe im vorliegenden Sinne sind z. B.
Lösungsmittel, die zur Extraktion von verunreinigten Mikroorganismen verwendet werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren zum Entfernen von Normalhexan oder Isopropanol aus dem Material.
Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Reinigung von Materialien, die man durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von durch diese Mikroorganismen zum Wachstum verbrauchbaren Kohlenwasserstoffen erhält, und die mit Kohlenwasserstoffen verunreinigten Mikroorganismen von der Zuchtmasse abtrennt und hierauf das abgetrennte Material mit oder ohne Reinigung in Gegenwart von Wasser einer Lösungsmittelextraktion unterwirft, und dann nach einem oben beschriebenen Verfahren handelt.
Gewöhnlich liegen die gradkettigen Kohlenwasserstoffe in Nährböden auf der Zuchtstufe als Paraffine vor; sie können jedoch auch als Olefine vorliegen. Es kann auch ein Gemisch davon verwendet werden.
Geeignete Kohlenwasserstoff-Nährböden sind Kerosin, Gasöle und Schmieröle; diese Nährböden können unraffiniert oder einer Verfeinerungsbehandlung unterzogen worden sein, doch ist es von Vorteil, wenn sie einen Anteil an gradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten. Zweckmässig enthält die Erd ölfraktion 345 Gew.-O/c gradkettige Kohlenwasserstoffe.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist von besonderem Wert für die Behandlung von Erdöl-Gasöl-Fraktionen, die gradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten, weil dabei ein Gasöl mit einem verbesserten Stockpunkt erzielt wird, und somit ein wertvolleres Produkt erhalten wird.
Durch Anwendung des Verfahrens unter Bedingungen, die den Abbau von gradkettigen Kohlenwasserstoffen begrenzen, ist es möglich, so vorzugehen, dass nur eine gewünschte Menge dieser Kohlenwasserstoffe entfernt wird.
Mikroorganismen, die wie hierin beschrieben gezüchtet werden, können Hefen, Schimmel oder Bakterien sein oder Gemische davon. Vorzugsweise können sie auf gewissen Normalparaffinen wachsen.
Die hier angegebenen Hefen werden gemäss den in The Yeasts, a Taxonomic Study von J. Lodder und W.J.W. Kreger-Van Rij, North Holland Publishing Co. (Amsterdam) (1952), umrissenen Klassifizierungssystem klassifiziert.
Die hier erwähnten Bakterien werden gemäss dem in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology von R.S. Breed, E.G.D. Murray und N.R. Smith, Bailliere, Tindall and Cox (London), 7. Ausgabe (1957), umrissenen Klassifizierungssystem eingeordnet.
Im Verfahren geeignete Hefen gehören vorzugsweise zur Familie der Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie der Cryptococcoideae; gegebenenfalls können jedoch auch z. B. ascosporogene Hefen der Unterfamilie der Saccharomycoideae verwendet werden. Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie der Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida.
Bevorzugte Hefearten sind die folgenden. (Insbesondere wird es vorgezogen, die spezifischen Nährböden mit der angegebenen Baarn-Kennzahl zu verwenden; diese Kennzahlen beziehen sich auf CBS-Nährböden des Cen traal Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland, und auf
INRA-Nährböden des Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Frankreich.)
Candida lipolytica
Candida pulcherrima CBS 610
Candida utilis
Candida utilis, Variati CBS 841 major
Candida tropicalis CBS 2317
Torulopsis colliculosa CBS 133
Hansenula anomala CBS 110
Oidium lactis
Neurospora sitophila
Mycoderma cancoillote INRA: STV 11
Candida lipolytica und C. tropicalis werden besonders bevorzugt.
Wenn erwünscht, kann der Mikroorganismus ein Bakterium sein.
Zweckmässig werden folgende Klassen von Bakterien verwendet: Pseudomonadales, Eubacteriales und Actinomycetales.
Vorzugsweise gehören die verwendeten Bakterien zu den Familien der Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actincycmycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae und Pseudomonadaceae. Bevorzugte Arten sind der Bacillus megaterium, der Bacillus subtilis und die Pseudomonas aeruginosa.
Andere Arten, dieverwendet werden können, sind:
Bacillus amylobacter
Pseudomonas natriegens
Arthrobacter sp.
Micrococcus sp.
Corynebacterium sp.
Pseudomonas syringae
Xanthomonas begoniae
Flavobacterium devorans
Acetobacter sp.
Actinomyces sp.
Nocardia opaca
Diese Bakterien wachsen in Gegenwart des folgenden wässrigen Nährmediums: NH4CI 0,5 g NaCl 4g MgSO4 7H20 0,5 g NaHPO4 12H20 0,5 g KH2PO4 0,5 g Wasser q.s. ad 1000 ml
Der pH dieses Mediums wird vorzugsweise bei 7 gehalten.
Ein weiteres wässriges Nährmedium ist: K2HPO4 1 g KH2PO4 0,5 g MgSO47H2O 0,5 g CaC12 0,1 g NaCl 0,1 g Wasser q.s. ad 1000 ml
Ein geeignetes Nährmedium für Hefen und Schimmel weist folgende Zusammensetzung auf: (NH4)2HPO4 2 g KCI 1,15 g MgSO4 7H20 0,65 g ZnS04 0,17 g MnSO4 4H20 zu 3z0 0,045 g FeSOJ7H20 0,068 g Hahnenwasser 200 ml Hefeextrakt 0,025 g Destilliertes Wasser (q.s.ad 1000 ml)
Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird durch die Beigabe zum Kulturmedium einer sehr geringen Menge Hefeextrakts (eines industriellen Produktes das reich an wesentlichen Nutriliten, d. h. Wachstumsfaktoren, die durch die Hydrolyse einer Hefe erzielt werden, ist) oder allgemeiner der wesentlichen Nutrilite begünstigt.
Zu den wesentlichen Nutriliten gehören Biotin, Pantothensäure, Nikotinsäure, Thiamin, Inositol und Pyridoxin. Die beigefügte Menge Hefeextrakt liegt vorzugsweise in der Grössenordnung von 25 Teilen pro Million. Die erforderliche Menge Nutrilit schwankt zwischen etwa 0,1 Teil pro Million im Fall von Biotin und etwa
10 Teilen pro Million im Fall von Inositol.
Vorzugsweise wird das wässrige Nährmedium durch die portionenweise oder kontinuierliche Beigabe eines wässrigen Mediums mit einem hohen pH-Wert beim gewünschten pH gehalten. Gewöhnlich wird bei Verwendung von Schimmeln oder Hefen und insbesondere bei Verwendung von Candida lipolytica der pH des Nährmediums im Bereich von 3-6, vor zugsweise von 4-5 gehalten. (Bakterien erfordern einen höheren pH, gewöhnlich 6,5-8.) Geeignete alkalische Substanzen als Zusatz zum Nährmedium sind z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak, entweder als solche oder in wässriger Lösung.
Die optimale Temperatur des Nährmediums schwankt je nach dem Typus des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25-35oC. Bei Verwendung von Candida lipolytica liegt der bevorzugte Temperaturbereich bei 28-320C.
Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum des Mikroorganismus wesentlich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Um eine grosse Wachstumsgeschwindigkeit zu gewährleisten, sollte die zur Beschaffung von Sauerstoff verwendete Luft in Form feiner Blasen. z. B. durch Rühren, eine gesinterte Oberfläche oder durch Wirbellüftung eingeführt werden.
Die Züchtung wird gewöhnlich kontinuierlich durchgeführt; Gewünschtenfalls kann auch ansatzweise vorgegangen werden.
Nach dem Wachstum ist es gewöhnlich möglich, den mit etwas nichtassimilierter Nahrung und wässrigem Nährmedium verunreinigten Mikroorganismus von der Masse der nicht aufgenommenen Nahrungsfraktion zu trennen. Vorzugsweise wird diese Trennung dadurch Abgiessen vorgenommen; zudem oder alternativ kann ausgeschleudert werden. Die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion wird dann vorzugsweise mit einem ein oberflächenaktives Mittel enthaltenden wässrigen Medium behandelt.
Vorzugsweise wird die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion energisch mit dem wässrigen oberflächenaktiven Mittel vermischt und ohne weitere Wachstumsperiode einer weiteren Trennung, vorzugsweise durch Ausschleudern unterzogen, wobei eine den Mikroorganismus enthaltende Fraktion und eine wässrige Phase, die die abgetrennten Kohlenwasserstoffverunreinigungen enthält, gewonnen wird. Wenn nötig, können die Wasch- und Trennstufen mehrmals wiederholt werden, wobei in der Waschstufe jedesmal ein wässriges oberflächenaktives Mittel verwendet wird. Nach dem Waschen ist es nötig, in einem wässrigen Milieu zu waschen, das frei von oberflächenaktivem Mittel ist; vorzugsweise mit Wasser. Wiederum kann gegebenenfalls eine Reihe von Wasch- und Trennstufen folgen.
Vorzugsweise werden die Waschstufen so lange durchgeführt, bis der Kohlenwasserstoffgehalt der Mikroorganismen unter 7% fällt. bezogen auf das Gewicht der trockenen Mikroorganismen. Vorzugsweise liegt der erwähnte Kohlenwasserstoffgehalt unter 5 sec.
Als zum Waschen verwendete oberflächenaktive Mittel können kationische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Stearyltrimethylammoniumchlorid, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. die Kondensate von Ölsäure und Äthylenoxyd, oder anionische oberflächenaktive Mittel. wie z. B.
Natriumalkylsulfate, verwendet werden.
Die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion wird dann gewöhnlich mit einem Lösungsmittel extrahiert. Vorzugsweise wird in einer ersten Extraktionsphase. die aus einer oder mehreren Extraktionsstufen besteht, das verunreinigte feste Material mit einem Gemisch eines Alkohols und eines Kohlenwasserstoffs, mit dem es ein Azeotrop bildet, extrahiert, wobei der erwähnte Alkohol und der Azeotrop bildende Kohlenwasserstoff in einem Volumen-Verhältnis im Bereich von 30:70 bis 70:30 verwendet werden.
Zweckmässig wird ein Mehrphasensystem verwendet; in einer zweite Extraktionsphase, die aus einer oder mehreren Extraktionsstufen besteht, kann das behandelte feste Material aus der ersten Phase mit einem azeotropischen Gemisch des Alkohols und des ein Azeotrop bildenden Kohlenwasserstoffs extrahiert werden, worauf das behandelte feste Material gewonnen wird.
Einzeln oder nach der Vermischung können die Extraktfraktionen aus der ersten und zweiten Extraktions phase einer Destillationsphase, die aus einer oder mehreren Destillationsstufen besteht, zur gesonderten Rückgewinnung (a) eines azeotropen Gemisches des Alkohols und des ein Azoetrop bildenden Kohlenwasserstoffs, (b) eines azeotropen Gemisches des Alkohols mit Wasser und (c) einer Rückstandsfraktion zugeführt werden, worauf das im wesentlichen ganze azeotrope Gemisch des Alkohols mit Wasser mit einem Teil des azeotropen Gemisches des Alkohols und des ein Azeotrop bildenden Kohlenwasserstoffs vermischt werden, wobei der Teil gewählt wird, um ein Gemisch des Alkohols und des ein Azeotrop bildenden Kohlenwasserstoffs zu erzielen, das diese Materialien in einem volumenmässigen Verhältnis im Bereich von 30:70 bis 70:
:30 enthält, und das erzielte Gemisch zur ersten Extraktionsphase zurückgeführt wird.
Zweckmässig liegt die Temperatur der Extraktionsstufen im Bereich von 30600C.
Zweckmässig ist der ein Azeotrop bildende Kohlenwasserstoff Normalhexan. Zweckmässig ist der Alkohol Äthanol, Propanol, Isopropanol oder ein Butanol.
Zweckmässig wird das erfindungsgemässe Verfahren mit einem rohen oder teilweise raffinierten Produkt des Wachstums von Mikroorganismen in Kohlenwasserstoffnährboden in Gegenwart eines wässrigen Nährmilieus ausgeführt.
Vorzugsweise enthält der Mikroorganismus, wenn er einer Extraktion mit einem Lösungsmittel unterzogen wird, insbesondere 100-200 Gew.-to Wasser (auf das Trockengewicht der reinen Hefe bezogen).
Wenn nötig, kann die Hefe vor der Extraktion mit Wasser vermischt werden.
Vorzugsweise liegt das Verhältnis vom Wasser zur Gesamtheit des Alkohols und des ein Aezotrop bildenden Kohlenwasserstoffs in der Stufe oder in den Stufen der Extraktionsphase oder der ersten Extraktionsphase, gewichtsmässig im Bereich von 1:4 bis 1:10.
Wenn erwünscht, kann die oben beschriebene Extraktion wiederholt werden, und zwar vorzugsweise nach Beigabe von Wasser zur Hefe, um einen Wassergehalt wie in der ersten Phase zu erzielen.
Die in der Extraktionsphase durch Extraktion mit einem Lösungsmittel zurückgewonnenen Kohlenwasserstoffe können zur Zuchtphase der Mikroorganismen zurückgeführt werden, wenn sie noch aufnahmefähig sind.
Das die Mikroorganismen enthaltende Material, das nach der Extraktion mit einem Lösungsmittel gewonnen wird, das Wasser und einen verdampfbaren Stoff enthält, wird wie oben beschrieben zum Entfernen eines Teils oder der Gesamtheit des verdampfbaren Stoffes weiterbehandelt.
Hefe, die nach einem der oben beschriebenen Verfahren von der Gesamtheit oder einem Teil ihrer Lipoide und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen befreit wurde, ist als industrielles Produkt neu.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, dass ein Mikroorganismus in einer oben beschriebenen Weise in Gegenwart einer zum Teil aus gradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Erdölfraktion mit einem mittleren Molekulargewicht, das mindestens 10 Kohlenstoffatomen pro Molekül entspricht, eines wässrigen Nährmilieus und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet wird und vom Gemisch einerseits der Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion, die eine verminderte Proportion gradkettiger Kohlenwasserstoffe aufweist oder von denen erwähnten grad kettigen Kohlenwasserstoffen frei ist, getrennt wird, worauf dei Mikroorganismus wie oben beschrieben behandelt wird.
Das Verfahren kann ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Bevorzugte Methoden, die zum Züchten des Mikroorganismus und zur Gewinnung des Produkts verwendet werden können, sind in den britischen Patenten Nr. 914 567, 914 568 1107 584, 1 049 065 und 1 017 585 beschrieben.
Beispiel 1
Ein Gärungsgefäss aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 60 Liter wurde mit 40 Liter eines wässrigen Mineralnährmediums folgender Zusammensetzung beschickt: g
Diammoniumhydrogenphosphat 2
Kaliumchlorid 1,15
Magnesiumsulfat 7H20 0,65
Zinksulfat 0,17
Mangansulfat 4H20 0,068
Eisen-II-sulfat 0,124
Hefeextrakt 0,030
Hahnenwasser 200 destilliertes Wasser q.s.ad 1000 ml
20 Liter eines 24 Stunden-Impfstoffs von Candida lipolytica auf gemischten Normalkohlenwasserstoffen mit 10-20 Kohlenstoffatomen wurden dann beigefügt, so dass die Zellendichte etwa 1 g Trockensubstanz pro Liter betrug.
1,030 Liter schweres Gasöl, d. h. 15 glLiter, wurden dann zugesetzt; diese Menge genügt, um die Zellendichte auf 2 g/ Liter zu bringen.
Die Temperatur der Kultur wurde durch Wasser, das in einem Ring, der aus dem Raum zwischen zwei konzentrischen Zylindern, von denen der kleinere das Gärungsgefäss selbst war, bestand, geleitet wurde, bei 30+10C gehalten. Es wurde so gelüftet und geschüttelt, dass das Ausmass der Lüftung 3 Millimol O2 pro Liter Medium in der Minute betrug.
Der pH wurde durch die Beigabe einer Ammoniaklösung, die durch ein automatisches pH-Kontrollsystem eingeleitet wurde, bei 4 gehalten. Wenn der Ammoniakzufluss 20 ml erreicht, wurde mit der Beigabe von Gasöl begonnen. Das Gas hatte folgende Eigenschaften: spezifisches Gewicht 0,870
Stockpunkt + 15"C
Siedebereich 300-3900C
Die Geschwindigkeit der Beigabe wurde durch den theoretischen Bedarf der Kultur bestimmt, wobei eine Ausbeute aufgrund von Gasöl (erzeugte trockene Hefe) (Gasölnährboden) von 10 Gew.-% und eine Zellteilungsdauer von 3 Stunden angenommen wurde. Diese Beigabe erfolgte jede Stunde, bis die Gesamtmenge des Gasöls 200 g/l, d. h. 13,81 erreichte.
Begann man mit einer Zellendichte von 2 g/l, so betrug sie nach 25 Stunden (am Schluss der exponentiellen Wachstumsphase) 15 g/l.
Das Gärungsgefäss wurde bei einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,2 Vol/Vol/Stunde kontinuierlich betrieben, wobei die Zellendichte während des ganzen Versuchs bei 15 gll konstant blieb.
Dem Gärungsgefäss wurde Bouillon kontinuierlich entnommen und abgegossen, wobei 65% des verbrauchten Mediums entnommen und in der zurückgewonnenen Bouillon durch 65cr, Leitungswasser ersetzt wurden.
Der obigen Phase wurde 0,5 g/l unter der Handelsbezeichnung NI 29 bekanntes nichtionisches Reinigungsmittel beigefügt; nach dem Ausschleudern wurden einzeln zurückgewonnen: verbrauchtes Mineralmedium 840 g/l nicht aufgenommenes Gasöl 110 g/l Mikroorganismenpaste 50 gil
Die Mikroorganismenpaste wurde dann bei Raumtemperatur mit Wasser gespült und ausgeschleudert; die erzielte Hefe enthielt 65 bis 70% Wasser.
Wasser wurde dann daraus zum Teil entfernt, um eine aus 50 Gew.-Sc trockener Hefe und 50% Wasser bestehende Hefepaste zu erzielen.
Diese nasse Hefe wurde dann in eine Abziehvorrichtung gepumpt, bestehend aus einer um eine horizontale Achse rotierende Filtertrommel. Ein aus 50% Hexan und 50% Isopropanol bestehendes Lösungsmittelgemisch wurde der nassen Hefe in einem Verhältnis von 8 Teilen Gemisch pro Teil trokkene Hefe beigefügt. Das ganze Gemisch, nämlich Hefe + Wasser + Lösungsmittel. wurde 30 Minuten bei 60C gehalten. Dann wurde das den Hauptteil der Hefeverunreinigungen enthaltende Lösungsmittel abgezogen.
Hierauf wurde dieses Reinigungsverfahren wiederholt.
Die nachstehende Tabelle 1 gibt die Zusammensetzung des extrahierten Produktes an.
Tabellen
Feuchtigkeit 68,4 Gew.-6T
Stickstoff 10,5 Gew.-Sc trockene Hefe
Lipoide 0,3 Gew.-6Rc trockene Hefe
Verbleibendes Hexan 6,8 Gew.-Sc trockene Hefe
Verbleibendes Isopropanol 31.0 Gew.-Wc trockene Hefe
Die zurückgewonnenen Lösungsmittel wurden vermischt und dann einer Destillation zur Rückgewinnung sowohl eines azeotropen Gemisches des Isopropanols und des Normalhexans als auch eines azeotropen Gemisches von Alkohol und von Wasser und eines alle Lipoide und Verunreinigungen enthaltenden Rückstandes unterzogen. Diese azeotropen Gemische wurden dann zum Widergebrauch vermischt.
Die mit einem Lösungsmittel extrahierte Hefepaste wurde dann einem Schalentrockner zugeführt, der eine von vier Schabern aus rostfreiem reingehaltene erhitzte Oberfläche aufwies und bei atmosphärischem Druck kontinuierlich betrieben wurde. Das Entfernen von Lösungsmittelresten und Wasser erfolgte gemäss Angaben der nachstehenden Tabelle 2.
Tabelle 2
Betriebsbedingungen Zusammensetzung der Hefepaste
Dauer Temp. Druck Feuchtigkeit Hexan IPA in OC Gew.-C?c Gew.-ec Gew.-ec min.
Produkt- 0 60 atmosph. 68,4 6,8 31,0 nährboden
15 84 atmosph. 55,9 < 0,05 15,2
30 94 atmosph. 34,4 < 0,05 0,2
45 106 atmosph. 6,2 < 0.05 < 0,7
60 117 atmosph. 1,9 < 0,05 < 0,2
65 120 atmosph. 1,6 < 0,05 < 0,2
Wie man sieht, war das Hefeprodukt nach einer Stunde beinahe vollständig von Lösungsmittel befreit und fast vollständig trocken. Zuerst wurde Hexan entfernt und dann IPA (Isopropylalkohol) und schliesslich Wasser..
Beispiel 2
Die Hefe C. lipolytica wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, gewonnen und extrahiert. Wie beschrieben, wurde eine Lösungsmittel enthaltende nasse Hefepaste erzielt.
Dieses nasse Produkt wurde dann mehrmals durch einen Förderschneckentrockner geleitet, der einen mit einem Mantel und einem Deckel versehenen Trog sowie folgende Merkmale aufwies:
Gesamtvolumen 30 dm3
Druck im Trog 1 Atmosphäre
Druck in der Doppelwand des 10 Atmosphären
Trogs
Austauschoberfläche 0,4 m2
Abgangstemperatur des Dampfs 142 "C an der Doppelwand
Die Schrauben weisen einen doppelten Mantel auf, worin
Dampf bei einem Druck von 2,5 Atmosphären zirkulierte
Durchmesser 130 mm
Länge 900 mm
Druck 10 Atmosphären
Umdrehungen pro Minute 1
Austauschoberfläche 0,45 m2
Die ganze vordere Oberfläche der Schraubenspiralen waren mit als Schaber wirkenden Teflonstreifen versehen.
Alle in Berührung mit dem behandelten Produkt stehenden Flächen waren aus rostfreiem Stahl.
Die nachstehende Tabelle 3 gibt die Versuchs- und Analysenwerte an:
Tabelle3
Zusammensetzung der Hefe
Gewicht Feuchtigkeit IPA Hexan kg Gew.-% Gew.-% Gew.-%
Nährboden zum Trockner 269 74,9 35,7 7,7
Nach dem: 188 61,1 20,7 Spuren
1. Durchgang
2. Durchgang 135 47,9 3,4 0
3. Durchgang 115 38,3 0,7 0
4. Durchgang 102 30,0 0,4 0
5. Durchgang 93 24,9 0,2 0
Nach fünf Durchgängen war das Produkt gänzlich frei von Lösungsmittel, doch blieb etwas Wasser zurück. Um dieses zu eliminieren, waren drei weitere Durchgänge erforderlich.
Beispiel 3
Die Hefe C. lipolytica wurde wie in Beispiel 1 gezüchtet, gewonnen und extrahiert.
Das etwas Lösungsmittel enthaltende nasse Produkt wurde einer Holoflite-Förderschnecke kontinuierlich zugeführt.
Die Temperatur der geheizten Oberflächen der Förderschnecke betrug 1600C und die Geschwindigkeit der Schraube 1 Umdrehung pro Minute. Ferner bestand der Trockner aus einem mit einem Mantel und einem Deckel versehenen Trog, der zwei 900 mm lange Schrauben von einem Durchmesser von 130 mm enthielt. Die Schrauben enthielten 2-5 kg Dampf. Der Mantel des Trogs und der Deckel konnten mit einem Druck von 1 kg/cm2 belastet werden.
Wärme-Austauschoberfläche der Schrauben 0,9 m2 Fassungsvermögen des Trockners 111
Die Durchflussmenge betrug 25-30 kg/h.
Alle mit der Hefepaste in Berührung stehenden Oberflächen des Apparats waren aus rostfreiem Stahl.
Das Produkt (nasse extrahierte Hefe) wurde mehrmals durch die Förderschnecke geleitet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4
Betriebsbedingun- Zusammensetzung der Hefe gen
Feuchtigkeit Hexan IPA Gew.-% Gew.-% Gew.-%
Produktnährboden 63,4 3,7 26,9
1. Durchgang T = 160 C 55 (0,1 11,6
1 U/min
2. Durchgang T"=160"C - - 0,9
1 U/min
3. Durchgang T"= 1600C 26 - .0,2
1 U/min
4. Durchgang T"=160"C 15 - c0,1
1 U/min
5. Durchgang T"=160"C 6 -
1 U/min
Hexan und IPA wurden ganz entfernt, während Wasser langsam entfernt wurde.
Das erzielte Endprodukt war ein Proteinkonzentrat, das frei von Lösungsmittel war und einen geringen Wassergehalt aufwies.
Das oberflächenaktive Mittel NI 29 ist von nichtionischer Art, das man durch Kondensation von Äthylenoxyd mit Laurylalkohol erhält, wobei eine Äthylenoxydkette mit durchschnittlich 8,5 Einheiten pro Molekül entsteht.
Andere oberflächenaktive Mittel, die im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können, sind z. B. (a) ein anionisches oberflächenaktives Mittel, das durch Sulfatierung des erwähnten nichtionischen oberflächenaktiven Mittels erzielt wird (d. h. ein oxyäthylenisiertes Laurinalkoholsulfat) und (b) ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, das durch Kondensieren von Äthylenoxyd mit einem Gemisch von Laurylalkohol und Myristinalkohol erzielt wird.
Beispiel 4 (Reinigung eines Bakteriums)
40 Liter eines wässrigen Nährmediums folgender Zusammensetzung: K2HPO4 1 g KH2PO4 0,5 g MgS047H20 0,5 g NaCl 0,1 g Fe SO4 ' 7H2n 0,02 g Hefeextrakt 0,03 g Wasser bis zu 1000 ml wurden in einen 60 Liter fassenden Gärbottich aus rostfreiem Stahl gegeben. Hierauf wurden 20 Liter einer 24 Stunden alten Impfung von Bacterium Microccoccus certificaus auf einem Gemisch von normalen C7 bis C20-Kohlenwasserstoffen zugesetzt, und zwar in einer solchen Menge, dass die Zellendichte etwa 1 g Trockensubstanz pro Liter ausmachte.
Die Kultur wurde zur Züchtung mittels von in einem zweiten, das Gärgefäss zylindrisch umgebenden Bottich, zirkulierendem Wasser auf einer Temperatur 26 1 lt gehalten.
Das pH der Gärbrühe wurde mittels automatischer Einstellung durch Zusatz von wässrigem Ammoniak neutral (7) gehalten.
Ferner wurde in Gasöl folgender Eigenschaften in einer Menge von 180 g pro Liter Gärbrühe zugesetzt: spez. Gewicht 0,865
Stockpunkt 1 5OC
Siedebereich 265-3800C
Als die Menge an Trockensubstanz pro Liter 15 g erreichte, erfolgte die Gärung bei einer Konzentrationsabnahme von 0,2 Volumen pro Gärvolumen pro Stunde, während die Menge an Trockensubstanz dauernd auf 15 g/l gehalten wurde.
Aus dem Gärbottich wurde kontinuierlich Gärbrühe abgezogen und einer Dekantierung unterworfen, wobei daraus 65 % an verbrauchtem Nährmedium entnommen und durch ebensoviel Leitungswasser ersetzt wurden.
Hierauf wurden 1 g/l eines Reinigungsmittels ( Laural 746 ) zugesetzt, die Mischung kräftig gerührt und dann zentrifugiert, wobei eine Trennung in 830 g/l verbrauchtes Nährmedium 100 g/l nicht umgesetztes Gasöl und
70 g/l Paste aus Mikroorganismen erreicht wurde.
( Laural 746 ist ein oxyäthyleniertes Laurylsulfat.) Die abgetrennte Paste aus Mikroorganismus wurde hierauf mit frischem Wasser bei Raumtemperatur gewaschen und dann zentrifugiert. Man erhielt so eine Paste mit einem Wassergehalt von 65%, welche weiter entwässert wurde, bis der Wassergehalt noch 50% betrugt. Dieses nasse Produkt wurde nun so behandelt wie es für Candida lipolytica im Beispiel 2 beschrieben wurde, wobei die gleichen Ergebnisse erhalten wurden.
N. B. Der Schutzbereich des Patentes ist durch Art. 2, Ziff.
2, Pat. G. beschränkt.