Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia drobnoustrojów wolnych od rozpuszczalników i wody na drodze hodowli w obecnosci weglowo¬ dorów i wodnego roztworu pozywki przy czym o- trzymane drobnoustroje zanieczyszczone weglowo¬ dorami i wolnym roztworem pozywki poddaje sie ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi.Metody hodowli mikroorganizmów i uzyskiwania gotowego produktu omówiono w brytyjskich opi¬ sach patentowych nr 914567 craz 914568.W wyniku ekstrakcji rozpuszczalnikiem lub in¬ nego postepowania a takze podczas hodowli mikro¬ organizmów mozna otrzymac mikroorganizm w po¬ wiazaniu z woda i materialem obcym dla samych mikroorganizmów. W pewnych przypadkach ten material bedzie mial taki punkt wrzenia, ze w od¬ powiednich warunkach mozna go odparowac za¬ sadniczo calkowicie pozostawiajac pewna ilosc wy¬ mienionej wody zwiazanej z mikroorganizmem.Material wykazujacy te wlasciwosc bedzie dalej nazwany ,,materialem odparowywalnym".Stwierdzono, ze w pewnych warunkach odparo¬ wanie cieczy zwiazanych z mikroorganizmem mo¬ ze prowadzic do produktu mikroorganizmów za¬ wierajacych pewna ilosc materialu odparowywal- nego zwiazanego z mikroorganizmem, przy czym polaczenie to jest polaczeniem tego rodzaju, ze material odparowywalny nie da sie usunac przez zastosowanie metod konwencjonalnych w rodzaju ogrzewania lub dalszej ekstrakcji rozpuszczalni¬ kiem. Ponadto stwierdzono, ze w obecnosci pew¬ nej ilosci wody mikroorganizm nie jest w stanie utworzyc tego polaczenia, przynajmniej w taki spo¬ sób, który przeszkadzalby usunieciu materialu od- parowywalnego a takze, ze usuniecia pewnej ilosci wody, a w pewnych przypadkach jej calosci, z materialu zawierajacego mikroorganizm, mozna dokonac bez tworzenia omówionego polaczenia.Wedlug wynalazku, sposób otrzymywania drob- io noustrojów, wolnych od rozpuszczalników i wody na drodze hodowli w obecnosci weglowodorów i! wodnego roztworu pozywki przy czym otrzymane drobnoustroje zanieczyszczone weglowodorami i wodnym roztworem pozywki poddaje sie ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi polega na tym, ze drobnoustroje zawierajace rozpuszczalnik organicz¬ ny i wode w ilosci wiekszej niz jej zawartosc w drobnoustrojach w stanie suchym poddaje sie dzialaniu ciepla i/lub zmniejszonego cisnienia przy czym w trakcie usuwania rozpuszczalnika organi¬ cznego drobnoustrój musi zawierac co najmniej 2C°/o wody powyzej zawartosci wody w drobnou¬ stroju w stanie suchym oraz ewentualnie, po usu¬ nieciu rozpuszczalnika, drobnoustrój poddaje sie dalszemu dzialaniu ciepla w celu wyparowania czesci lub calosci wody.Sposobem wedlug wynalazku usuwa sie pozo¬ stalosci rozpuszczalnika z mikroorganizmów uprze¬ dnio mytych tym rozpuszczalnikiem w celu usu- niecia weglowodorów i lipidów. Cecha charakte- 84 42784 427 rystyczna sposobu wedlug wynalazku jest usuwa¬ nie rozpuszczalnika przy pozostawieniu wody przy¬ laczonej do mikroorganizmu w ilosci co najmniej % wagowych, gdyz okazalo sie, ze niemozliwe jest calkowite usuniecie rozpuszczalnika jezeli ilosc 5 wody w calym procesie bedzie inna niz 20l0/o wa¬ gowych.Dowodem na to, ze 20%-owa zawartosc wody jelst wielkoscia krytyczna sa wyniki dwu doswiad¬ czen przez porównanie z przykladami wykonania i0 sposobu wedlug wynalazku, przy zawartosci 14,8% i, 13,2%. Próby te wykazuja, ze nawet po uplywie 65 minut pozostaje odpowiednio 0,3% i 0,4% hek¬ sanu i 1,2% i 1,9% izopropanu.Stosujac sposób wedlug .wynalazku zarówno za- 15 wartosc heksanu jak i izopropanolu wynosi zero w dwu przypadkach i 0,2% izopropanolu w jed¬ nym przypadku co stanowi V5 zawartosci w dos¬ wiadczeniu porównawczym.Zawartosc pozostalego rozpuszczalnika jest bar- 2o dzo wazna cecha, poniewaz otrzymany sposobem wedlug wynalazku mikroorganizm wykorzystuje sie jako pozywienie.Doswiadczenie porównowcze. 1. Porównawcze doswiadczenie wykazujace za¬ wartosc pozostalosci rozpuszczalnika przy susze¬ niu produktu drozdzowego zawierajacego 13,2% wagowych wody.Produkt drozdzowy wykazujacy nastepujace a- nalityczne cechy po ekstrakcji rozpuszczalnikiem byl poddany procesowa usuwania rozpuszczalnika wedlug sposobu opisanego na str. 17 opisu brytyj- skiego.Ciecz : 13,2% wagowych suchych drozdzy Azot : 11,1% Dipidy : 0,4% Pozostalosc heksanu : 7,4% Pozostalosc I.P.A. : 22 % Usuwanie pozostalych rozpuszczalników i wody pokazane jest w ponizszej tablicy Pozywka Warunki doswiadczen Czas 0 13 45 80 65 Temperatura 60 84 94 106 117 120 Cisnienie atm.,, ,, ,, „ » Analityczne dane pasty drozdzowej Ciecz 13,2 ,1 9,0 ,0 2,2 1,8 Heiksan % wagowe 7,4 1,9 1,5 1,3 1,2 0,9 IPA 22,0 8,2 ,5 2,4 1,8 1,2 2. Podobne doswiadczenie porównawcze zostalo przeprowadzone na produkcie o zawartosci cieczy 14,8%.Po 65 minutach prób zgodnych z warunkami do¬ swiadczen podanymi w Tablicy nastepujacy pro¬ dukt finalny zostal otrzymany: Zawartosc cieczy w % wagowych 1,6 Zawartosc IPA " " 0,9 Zawartosc hexanu " " 0,4 Zgodnie z wynalazkiem sposób ten obejmuje ob¬ rabianie produktu zawierajacego mikroorganizmy, zawierajacych material odparowywalny i wode, przy czym woda wystepuje w ilosci wiekszej niz % w stosunku do suchej masy mikroorganiz¬ mu. Z produktu mikroorganizmów usuwa sie czesc lub calosc materialu odparowywalnego utrzymujac przynajmniej 20% wody w stosunku do suchej masy mikroiorganizmów w powiazaniu z mikroor¬ ganizmami.Zgodnie ze sposobem wedlug'wynalazku obrabia sie takze produkt z mikroorganizmami zawieraja¬ cy material odparowywalny i wode, przy czym woda wystepuje w ilosci wiekszej nliz 20% w sto¬ sunku do masy mikroorganizmów w stanie su¬ chym. Produkt ten poddaje sie przeróbce w celu usuniecia czesci wody i otrzymania produktu za¬ wierajacego mikroorganizmy, zwanego odtad „kon¬ centratem", o zawartosci co najmniej 20% wody w stosunku do suchej masy mikroorganizmów, z 40 50 55 60 65 którego w tej fazie usuwa sie calosc, lub pozo¬ stalosc .materialu odparowywalnego, utrzymujac stale zawartosc wody co najmniej powyzej 20%.Oczywiste jest, ze dla zapewnienia usuniecia materialu odparowywalnego przy zachowaniu w produkcie co najmniej 20% wody, konieczna jest szczególna dbalosc w postepowaniu.Usuniecia materialu odparowywalnego mozna dokonac przez zastosowanie ciepla i/lub obnizonego cisnienia w takich warunkach, ze usuniecie ma¬ terialu odparowywalnego zachodzi przed usunie¬ ciem wody lub w takich warunkach, ze material odparowywalny i woda sa usuwane lacznie, z za¬ stapieniem przynajmniej czesci usuwanej w ten sposób cieczy przez dodanie do mikroorganizmu wody.W pierwszym wymienionym przypadku mate¬ rial odparowywalny mozna usunac droga wielo¬ stopniowego, najleipiej dwustopniowego odparowy¬ wania lub przez zastosowanie srodka odpedowego ulatwiajacego proces odparowania.Zgodnie z takim aspektem wynalazku produkt zawierajacy mikroorganizmy oraz wode w nad¬ miarze w stosunku do wody obecnej w zywym mikroorganizmie i material odparowywalny, przy czym material jest otrzymywany w takich warun¬ kach, ze material odparowywalny jest usuwany przez odparowanie podczas gdy w produkcie po¬ zostaje pewna ilosc wody.84 427 W razie potrzeby mozna zastosowac sposób we¬ dlug wynalazku dla przypadku, w którym mate¬ rial odparowywany ma temperature wrzenia bliska lub wyzsza od temperatury wrzenia wody. W tym przypadku produkt zawierajacy mikroorganizm moze byc przerabiany przez utrzymywanie go w odpowiedniej temperaturze i/lub pod obnizonym cisnieniem z dodatkiem wody w celu zachowania Wody zwiazanej z mikroorganizmem. W razie po¬ trzeby mozna zastosowac srodek odpedowy.Proces odpowiadajacy któremukolwiek z aspek¬ tów opisywanego tu wynalazku nadaje sie do pro¬ duktu zawierajacego mikroorganizmy, w którym material odparowywalny ma temperature wrzenia nizsza od wrzenia wody. Material taki bedzie da¬ lej nazywany „materialem lotnym".Zgodnie z kolejnym aspektem wynalazku obra¬ bia sie produkt zawierajacy wode 'w nadmiarze w stosunku do wody obecnej w zywym mikroorga¬ nizmie i material lotny, w temperaturze wyzszej od temperatury wrzenia materialu odparowywal- nego i. zawartej wody, przez odparowanie ze zna¬ czna szybkoscia.Na poczatku mozna usuwac z . mikroorganizmu czesc wody w warunkach szybkiego usuwania po¬ sluguj c ri* na przyklad suszarka rozpryskowa w celu ctrzymania produktu zawierajacego w pola¬ czeniu z mikroorganizmem przynajmniej 20% wa¬ gowo wody.Korzystnie jest usuwac material odparowywal¬ ny przez utrzymywanie produktu z mikroorganiz¬ mami w poblizu ogrzewanej powierzchni, utrzy¬ mujac produkt w ruchu wzglednym powierzchni.W tym celu zastosowano przenosnik srubowy, korzystnie z ogrzewaniem parowym.Taki sposób suszenia umozliwiajacy doprowadze¬ nie ciepla do przenosnika srubowego i/lub do pla¬ szcza, moze spelniac podwójna funkcje — usuwa¬ nie materialu odparowywalnego z zachowaniem wymagalnego poziomu wody w .mikroorganizmie i nastepnie usuwanie calosci lub czesci pozostalej wody.Produkt zawierajacy mikroorganizm utrzymuje sie odpowiednio w ruchu wzgledem powierzchni przenosnika przez zastosowanie w systemie prze¬ nosnika umocowanych przegród wspóldzialajacych ze sruba slimakowa, która tloczy wymieniony ma¬ terial przez rure oslaniajaca. Przenosnik dziala w sposób ciagly, przy czym material wprowadza sie przez lej. Korzystnie jest jezeli uklad jest obudo¬ wany i utrzymywany w nadcisnieniu gazu obojet¬ nego w celu odciecia, przynajmniej w znacznym stopniu, od tlenu atmosferycznego.W razie potrzeby material odparowywalny a na¬ stepnie przynajmniej czesc pozostajacej wody moz¬ na usuwac z mikroorganizmów za poimoca suszar¬ ki pólkowej z ruchowymi zgarniakami- Waznym warunkiem jest nie dopuszczac do ob¬ nizenia sie zawartosci wody zwiazanej w produkcie ponizej 20% wagowo w stosunku do masy mikro¬ organizmów w stanie isuchym wówczas gdy mikro¬ organizmy sa zwiazane z materialem odparowal¬ nym.Terminem „mikroorganizmy w stanie suchym" jak równiez „suicha mase mikroorganizmu'" ozna¬ czono mikroorganizmy w stanie osiagnietym przez suszenie w 1.20°C.W razie potrzeby otrzymywany w ten sposób pro¬ dukt mozna przerabiac dalej w celu usuniecia calosci lub czesci pozostajacej wody zwiazanej z mikroorganizmem. Mozna to przeprowadzic odpo¬ wiednio przez suszenie rozpryskowe lub przez dal¬ sze kontakty w suszarce z ogrzewanym przenosni¬ kiem. io Korzystnie jest gdy w produkcie calkowita ilosc materialu odlparowywalnego jest nie wieksza niz 5C% ilosci wody zwiazanej z mikroorganizmami w stosunku do wody obecnej w mikroorganizmach w stanie suchym.Pod nazwa „material odparowywalny" nalezy dalej rozumiec zgodnie ze sposobem wedlug wyna¬ lazku, jako rozpuszczalniki stosowane w ekstrakcji rozpuszczalnikiem zanieczyszczonego mikroorganiz¬ mu w szczególnosci proces nadaje sie do usuwania z polaczenia z mikroorganizmem normalnego hek¬ sanu lub izopropanolu lub ich mieszanin.Sposobem wedlug wynalazku prowadzi sie ho¬ dowle w warunkach tlenowych mikroorganizmów odzywiajacych sie weglowodorem w obecnosci sub- stratu zawierajacego ten weglowodór, uzyskiwanie frakcji produktu zawierajacego mikroorganizmy zanieczyszczone weglowodorem, a nastepnie z wprowadzeniem lub bez posredniego stadium od¬ zyskiwania lub oczyszczania produktu zawieraja- cego mikroorganizmy przez poddanie ekstrakcji rozpuszczalnikiem w obecnosci wody i dalsza prze¬ róbke polegajaca na usunieciu rozpuszczalnika i wody, sposobem wyzej opisanym.Zwykle jako pozywka do hodowli mikroorga- nizmów w wyjsciowym stadium stosowane sa we¬ glowodory o lancuchu prostym jako parafiny, jed¬ nakze moga wystepowac takze olefiny lub ich mieszanine.Materialy wyjsciowe stanowiace pozywke odpo- 40 wiednia dla sposobu hodowli wedlug wynalazku stanowia nafta, oleje gazowe i oleje smarowe. Mo¬ ga one byc w stanie nieoczyszczonym lub po rafi¬ nacji, lecz dla spelnienia zalozen wynalazku mu¬ sza zawierac weglowodory o lancuchu prostym. 45 Odpowiednia frakcja ropy naftowej powinna za¬ wierac 3—45% wagowo weglowodorów o lancu¬ chu prostym.Proces bedacy przedmiotem wynalazku jest szczególnie wartosciowy w postepowaniu z frak- 50 cjami oleju gazowego ropy naftowej, które zawie¬ raja weglowodory o lancuchu prostym w postaci wosków, poniewaz frakcje te stanowia olej gazo¬ wy o ulepszonym punkcie plynnosci, podczas gdy woski ulegaja przemianie na wartosciowy produkt. 55 Przez zastosowanie tego procesu w warunkach ograniczaj aych zuzycie metaliczne weglowodo¬ rów o lancuchu prostym umozliwione jest poste¬ powanie z usuwaniem jedynie odpowiedniej czes¬ ci tych weglowodorów. 60 Mikroorganizmami hodowanymi w opisywany sposób moga byc drozdze, plesnie i bakterie.Drozdze klasyfikuje sie w tym wyszczególnieniu wedlug systemu klasyfikacji, przedstawionego w pracy J. Doddera i W. J. W. Kreger-Van Raj „The 65 Yeasts, a Taxenonic Study" opublikowanej przez84 42* 7, T^orth Holland Pmblishing Co. (Amsterdam 1952).Bakterie klasyfikuje sie wedlug systemu klasy¬ fikacji przedstawionego w pracy R S. Breed'a, E. G. C, Murray'a a r^.'R. Smitha „Bergey'a Manuel of D^tejiminatiye Eacteniology" opublikowanej przez BaiJjjL^a, Tindalla, i Gexa (Londyn, wydanie Vff~ia57)t Do hodowli drozdzy najlepiej nadaja sie z ro¬ dziny Cryptococcaces, a szczególnie z podrodziiny Cryiptococcoideae, jeclnakze mozna takze zastoso¬ wac drozdze rozmnazajace sie przez askospory a podrpdlzjny Sapcharenyicoideae. Najlepszymi rodza¬ jami podrpdziny Cryptococcoideae sa Torulepsis, znane równiez jako Torula i Candida.Najlepszymi gatunkami drozdzy sa nastepujace ponizej. W szczególnosci najkorzystniejsze jest za¬ stosowanie sipecyfiicznego zasobu o wskazanych nu¬ merach wykazu Baarn. Oznaczenia i numery wy¬ kazu dotycza katalogu Central Bureau vor Schim- nelculture, Baarn, Holandia i Institut National de la Recherche Agronomiaue, Paryz, Francja. Naj¬ korzystniejsze gatunki podano ponizej. Candida Lipolytica Candida pulcherriima CBS 610, Candida utilis Candida utilis, Varisti major CBS 841, Can¬ dida tropicalis Torulepsis coliculeae CBS 133, Nan- senula anomala CBS 110, Oidium lactis, Neuro- spera sitophila, Mycoderma cancaillote INRA: STV 11.Z powyzszych pozycja szczególnie korzystne sa Candida lipolytica i C. tropicalis.Równiez, zgodnie z wynalazkiem mikroorganiz¬ mami moga byc plesnie. Odpowiednimi plesniami sa Penilciillium, a najlepiej uzyc Penicillium expan- sum. Innym odpowiednim rodzajem jest Aspergil¬ lus.W razie potrzeby mikroorganizmem moga byc bakterie. Odipowiednie bakterie naleza do jednego sposród rzedów: Pseudomonadales, Eubacteriales, Actinoimycetales.Najlepiej, jezeli zastosowane bakterie naleza do którejs z rodzin sposród Corynebacteriadeae, Mic- rococcaceae, Achromabacteriaceae, Actinomyceta- ceae, Rhizobjaceae, Bacillaceae i Pseudomonadaceae.Najlepszymi gatunkami sa Bacillus aegaterium, Bacillus subtilis i Pseudomonas aeruginosa. Inne gatunki, które mozna zastosowac, obejmuja: Ba¬ cillus amylobacter, Pseudomonas natriegens, Art- hrobacter sp., Micrococcus sp., Corynebacterium sp., Pseudomonas syringae, Xanthomonas begoniae, Flavobacterium devorans, Acetobacter sp., Actino-. myces sp., Nocardis opaca.Te bakterie rosna w obecnosci nastepujacej wod¬ nej pozywki: NH4C1 0,5 g NaCl 4 g MgS04-7H20 0,5 g NaHP04-12H20 0,5 g KH2p04 0,5 g Woda dla dopelnienia do 1000 ml.Korzystne pH dla tej pozywki stanowi wykladnik 7. Inna pozywka wodna jest: 8 K£HP04 \ g KH2P04 0,5 g MgS04-7Hv0' 0;5-g.CaGl2 0,1 g NaCl 0-1 g Woda dla dopelnienia do 1000 ml.Odpowiednia pozywka dla drozdzy i plesni ma sklad: (NH/4)2HP04 2 g KC1 1,15 g M,gSO4-7H20 0,65 g ZnS04 0,17 g MnS04-4H20 0,045 g FeS04-7H20 0,068 g Woda z kranu 200 ml Wyciag z drozdzy 0,025 g Woda destylowana — uzupelnienie do 1000 ml.Do wzrostu zastosowanych mikroorganizmów przyczynia sie dodanie pozywki o bardzo malej . zawartosci wyciagu z drozdzy, bedacego produk¬ tem przemyslowym, bogatym w podstawowe czyn¬ niki odzywcze, to znaczy czynniki wzrostu otrzy¬ mane droga hydrolizy drozdzy, lub dodatek ogól¬ nie zwanych podstawowych czynników odzywczych.Czynniki odzywcze obejmuja biotyne, kwas panto¬ tenowy, kwas nikotynowy, tianine, inozyt i piry- doksyne. Korzystna iloscia dodanego wyciagu z drozdzy jest rzedu 25 czesci na milion. Ilosc kaz¬ dego wymaganego czynnika odzywczego waha sie pomiedzy 0,1 czesci na milion dla biotyny do oko¬ lo 10 'czesci na milion dla inozytolu.Korzystne .jest utrzymywanie pH pozywki przez dodawanie sposobem ciaglym lub porcjami pozyw¬ ki o wysokiej wartosci pH. Zwykle, stosujac ples- nie lub drozdze, a w szczególnosci stosujac Can¬ dida lipolytica, utrzymuje sie pH pozywki w gra¬ nicach 3—6, a najlepiej w granicach 4—5. Bakterie wymagaja wyzszego pH, zwykle 6,5—8. Materialy alkaliczne odpowiednie dla dodania do mieszaniny 40 wzrostowej obejimuja wodorotlenek sodu, wodoro¬ tlenek potasu, kwasny fosforan dwusodowy i amo¬ niak, wolny lub w roztworze wodnym.Optymalna temperatura mieszaniny wzrostowej zmienia sie zaleznie od typu zastosowanego mikro- 45 organizmu i zawiera sie zwykle w granicach 25— —35°C. Przy zastosowaniu Candida lipolytica ko¬ rzystny zakres temperatury wynosi 28—32°C.Bardzo istotnym warunkiem dla wzrostu mikro¬ organizmów jest dostep tlenu. Tlen wyprowadza sie 50 zwykle w postaci powietrza. W celu utrzymania szybkiego tempa wzrostu, powietrze powinno wy¬ stepowac w postaci rozproszonej, praktycznie drob¬ nych pecherzyków, z jednoczesnym mieszaniem.Mozna wprowadzac je poprzez powierzchnie spie- 55. karne. Mozna jednaikze zastosowac system napowie¬ trzania znany jako „napowietrzanie wirowe".Proces zwiazany ze wzrostem przeprowadza sie zwykle w sposób ciagly, jednakze w razie potrze¬ by mozna zastosowac dzialanie okresowe. Po za- 60 konczeniu okresu rozmnazania zwykle oddziela sie mikroorganizmy zanieczyszczone pewna iloscia nie przetworzonego metabolicznie materialu wyjsciowe¬ go i wodnej pozywki od masy frakcji nie prze¬ tworzonego metabolicznie materialu wyjsciowego. 65 Najlepiej dokonuje sie rozdzialu zapomoca dekan-9 tacji i/lub odwirowania. Wydzielona frakcje, za¬ wierajaca mikroorganizmy korzystnie jest poddac dzialaniu wodnego srodowiska zawierajacego sro¬ dek powierzchniowo czynny.W tym celu miesza sie energicznie frakcje mi- 5 kroorganizmów z roztworem wodnym srodka po¬ wierzchniowo czynnego, nastepnie oddziela, najle¬ piej przez odwirowanie, w celu uzyskania frakcji mikroorganizmów oddzielonych od zuzytej fazy wodnej, zawierajacej zanieczyszczenia weglowodo- 10 rowe wylugowane z mikroorganizmów. W zalez¬ nosci od potrzeb, etapy przemywania i oddziela¬ nia mozna powtórzyc kilkakrotnie, z zastosowa¬ niem w stadium przemywania roztworu wodnego srodka czynnego powierzchniowo, konczac czysta 15 woda.Najlepiej jest prowadzic przemywanie do osiag¬ niecia zawartosci weglowodoru w mikroorganiz¬ mach ponizej 7'% w stosunku do suchej masy mi¬ kroorganizmu, korzystnie ponizej 5°/o. 20 Ze srodków czynnych powierzchniowo do prze¬ mywania mozna uzyc kationowy srodek- powierz¬ chniowo czynny np. chlorek stearylotrójmetylo- amoniowy, niejonowe srodki powierzchniowo czyn¬ ne, np. produkty kondensacji kwasu oleinowego z 25 tlenkiem etylenu lub anionowe srodki powierzch¬ niowo czynne, np siarczany sodowo-alkilowe.Frakcje zawierajaca mikroorganizmy zwykle poddaje sie po wydzieleniu ekstrakcji rozpuszczal¬ nikiem. Korzystnie jest w pierwszym stadium ek¬ strakcji jedno lub kilkakrotnej staly zanieczysz¬ czony material usuwac mieszanina alkoholu i we¬ glowodoru, tworzacym razem azeotrop, zwanego dalej ,,weglowodorem azeotropujacym". Alkohol i weglowodór tworzacy azeotrop stosuje sie odpo¬ wiednio w proporcji objetosciowej w granicach od : 70 do 70 : 30.W stadium ekstrakcji' kilkustopniowej stosuje sie w drugim stadium jedno- lub kilkakrotna ek¬ strakcje mieszanina azeotropowa alkoholu i we¬ glowodoru, z której odzyskuje sie wyekstrahowa¬ ny produkt staly. Frakcje ektraktu z pierwszego i drugiego stadium ekstrakcji mozna wprowadzac oddzielnie lub w polaczeniu do stadium destylacji, w celu oddzielenia i uzyskania azeotropowej mie¬ szaniny alkoholu i weglowodoru azeoitropowej mie¬ szaniny alkohol i wody oraz pozostalosci. Poszcze¬ gólne destylaty laczy sie ze soba w celu uzyskania mieszaniny alkoholu i weglowodoru w stosunku objetosciowym, mieszczacym sie w granicach : 70 do 70 : 30 i ponownie wprowadza sie do pierwszego stadium ekstrakcji.Temperature w poszczególnych stadiach ekstrak¬ cji utrzymuje sie w granicach 30—60°C.Odpowiednim weglowodorem azeotropujacym jest normalny heksan. Odpowiednim alkoholem jest etanol, propanol, izopropanol lub butanol.Sposób oczyszczania, bedacy przedmiotem czes¬ ci wynalazku odnosi sie do surowego lub czescio- 60 wo oczyszczonego produktu hodowli mikroorganiz¬ mów na substracie weglowodorowym w obecnosci wodnej pozywki.Korzystnie jest, aby poddany ekstrakcji produkt mikroorganizmów zawieral co najmniej 20%, a w 65 szczególnosci 100—200% wagowo wody w stosun¬ ku do suchej masy czystych drozdzy.W razie potrzeby mozna zmieszac drozdze z wo¬ da przed ekstrakcja.Korzystnie jest, aby stosunek wody do calkowi¬ tej ilosci mieszaniny alkoholu z weglowodorem azeotropujacym w poszczególnych stadiach ekstrak¬ cji stanowil 1:4 do 1:10.W razie potrzeby ekstrakcje opisana jak powy¬ zej mozna powtórzyc, najlepiej po dodaniu do drozdzy wody w celu uzyskania zawartosci wody jak w pierwszym stadium.O ile weglowodory uzyskano w fazie ekstraktu w wyniku ekstrakcji rozpuszczalnikiem sa mozli¬ we do metabolicznego przetworzenia, mozna je wprowadzic ponownie w stadium hodowli mikro¬ organizmu.Produkt zawierajacy mikroorganizmy uzyskany w wyniku ekstrakcji rozpuszczalnikiem i zawiera¬ jacy wode i material odparowywalny skladajacy sie z rozpuszczalnika lub zawierajacy go, poddaje sie dalszej przeróbce w opisany powyzej sposób celem usuniecia czesci lub calosci materialu odpa- rowywalnego.Drozdze pozbawione przy pomocy jednej z opi¬ sanych powyzej metod od calosci lub czesci lipi¬ dów i zanieczyszczajacych weglowodorów stano¬ wia nowy produkt przemyslowy.Zgodnie z korzystna cecha niniejszego wyna¬ lazku podaje sie proces obejmujacy hodowle mi¬ kroorganizmu w sposób opisany powyzej w obec¬ nosci frakcji ropy naftowej zlozonej czesciowo z weglowodorów o lancuchu prostym i sredniej ma¬ sie czasteczkowej o co najmniej 10 atomach wegla oraz w obecnosci wodnej pozywki i gazu zawie¬ rajacego wolny tlen oraz oddzielenie z mieszaniny z jednej strony mikroorganizmów, a z drugiej stro¬ ny frakcji ropy naftowej o zmniejszonej zawartos¬ ci weglowodorów o lancuchu prostym lub wolnej od nich, a nastepnie poddanie mikroorganizmów dalszej przeróbce w celu ich oczyszczenia.Procesy hodowli oraz oczyszczania mozna prze¬ prowadzac okresowo lub w sposób ciagly.Przyklad I. 40 litrów pozywki mineralnej w roztworze wodnym o ponizej podanym skladzie wprowadzono do kadzi fermentacyjnej ze stali nie¬ rdzewnej o pojemnosci efektywnej 60 litrów.Wodna pozywka miala sklad nastepujacy: gramów kwasny fosforan dwuamonowy 2 chlorek potasu 1,15 siarczan magnezu 7 H20 0,65 siarczancynku 0,17 siarczan manganu 4 H20 0,068 siarczan zelazawy 0,124 wyciag z drozdzy 0,030 wodazwykla 200 woda destylowana do 1000 ml.Dodano nastepnie 20 litrów 24-godzinnego szcze¬ pu Candida lipoltica na mieszanych weglowodo¬ rach normalnych C10 — C20 tak, ze gestosc komór¬ kowa wynosila okolo 1/1 suchej masy.Dodano nastepnie 1 : 030 1 ciezkiego oleju gazo¬ wego, co stanowilo 15 g/l. Ilosc ta byla wystar-84 427 11 czajaca do podniesienia gestosci komórkowej do 2 g/l.Temperature kultury utrzymywano na poziomie ±1^C za pomoca plaszcza wodnego.Napowietrzanie i mieszanie byly tak dobrane, ze ilosc doprowadzonego powietrza wynosila 3 mili- nole tlenu na litr pozywki na minute.Utrzymywano pH 4 za pomoca roztworu amo¬ niaku, przez isaimoczynna regulacje o dzialaniu pul¬ sacyjnym. Kiedy doplyw amoniaku osiagal 20 ml, zaczynalo sie podawanie oleju gazowego. Olej ga¬ zowy mial nastepujace wlasnosci: ciezar gatunkowy 0,870 temperatura plynnosci + 15°C zakres wrzenia 300—390°C Porcje podawania okreslono teoretycznie potrze¬ bami kultury, przy zalozeniu wydajnosci oleju ga¬ zowego wyrazonej stosunkiem wytworzonych su¬ chych drozdzy do oleju gazowego jako pozywki, równej 10°/o wagowych i podzialu komórkowego w czasie 3 godzin. To podawanie przeprowadzano co godzine, az do uzyskania calkowitej zawartosci o- leju gazowego 200 g/l, to znaczy 13,8 1.Wychodzac od gestosci komórlkowej 2 g/l po 25 godzinach tj. po zakonczeniu zalozonej fazy roz¬ mnazania gestosc komórkowa wynosila 15 g/l.Kadz fermentacyjna pracowala nastepnie w spo¬ sób ciagly przy szybkosci rozcienczania 0,2 obj(obj) godz. i stalej gestosci komórkowej wynoszacej 15 g/l przez caly okres pracy.Bulion odbierano z kadzi fermentacyjnej w spo¬ sób ciagly i poddawano dekantacji, przy czym od¬ bierano 65% zuzytej pozywki i uzupelniano dodat¬ kiem 65% wody zwyklej.Do górnej fazy dodano 0,5 g/l detergentu niejo¬ nowego o nazwie handlowej „NI 29" i po odwiro¬ waniu otrzymano oddzielnie zuzytej pozywki mineralnej 840 gramów/litr nie przetworzonego metabolicznie oleju gazowego 110 " " pasty mikroorganizmu 50 " " Paste mikroorganizmu przemyto nastepnie woda w temperaturze otoczenia i odwirowano. Otrzyma¬ ne drozdze zawieraly 65 do 70% wody.Wode czesciowo usunieto w celu wytworzenia jpasty drozdzowej zlozonej w % wagowych z 50% suchych drozdzy i 50% wody. Otrzymane wilgotne 12 drozdze wtloczono nastepnie do ekstraktera, w po¬ staci bebna [filtracyjnego obracanego w osi pozio¬ mej. Do Wilgotnych drozdzy dodano mieszanine rozpuszczalników zlozona z 50% heksanu i 50% .5 izopropsnolu w proporcji 8 czesci wagowych mie¬ szaniny na 1 czesc suchych drozdzy. Calosc mie¬ szaniny drozdze — woda — rozpuszczalnik utrzy¬ mywano w temperaturze 60QC w ciagu 30 iminut.Nastepnie odciagnieto rozpuszczalnik, zawierajacy Wieksza czesc zanieczyszczen drozdzowych.Do pozostalych drozdzy dodano wody w celu wy¬ tworzenia pasty drozdzowej zawierajacej 50% su¬ chych drozdzy wagowo. Do wilgotnych drozdzy do¬ dano ponownie swiezej mieszaniny rozpuszczalni- ków zlozonej z '50% normalnego heksanu i 50% izopropanolu równiez w proporcji 8 czesci miesza¬ niny na czesc suchych drozdzy.Mieszanine drozdzy, wody i rozupszczainika u- trzymywano w temperaturze 60°C przez 30 minut.Nastepnie odciagnieto rozpuszczalnik zawierajacy nieco pozostalosci zanieczyszczen drozdzowych.Dane dotyczace skladu drozdzy po ekstrakcji rozpuszczalnikiem podano w tabeli 1.Tabela I 40 45 Zawartosc wilgoci Azot Lipidy Pozostalosc'heksanu, , Pozostalosc izopro- 1 panu % wagowych 68.4 1 .5 w suchych droz¬ dzach 0,3 6,8 31,0 „ „ 1 Odzyskane rozpuszczalniki po zmieszaniu pod¬ dano destylacji celem otrzymania oddzielnie mie¬ szaniny azeotropowej izopropanolu i n-heksanu, azeotropowej mieszaniny alkoholu i wody oraz po¬ zostalosci skladajacej sie w calosci z lipidów i za¬ nieczyszczen. Wymieszane mieszaniny azeotropowe uzyto do nastepnej ekstrakcji.Paste drozdzowa otrzymana po ekstrakcji roz¬ puszczalnikiem wysuszono w suszarce pólkowej ze stali nierdzewnej pod normalnym cisnieniem. U- suwanie pozostalosci rozpuszczalników i wody prze¬ biegalo, jak przedstawiono w tabeli II.T a b e 1 a II Pasta drozdzowa Warunki dzialania ' Czas w min 0 45 60 65 1 Tempe¬ ratura 0°C 60 84 94 106 117 120 | Cisnie¬ nie atmosfe¬ ryczny "- 1 Dane dotyczace pasty drozdzowej Wilgoc 1 % wag. 68,4 55,9 34,4 6,2 1,9 1,6 1 Heksan 1 % wag. 6,8 0,05 „ " " ,, i Alk. izo- propylo- ' wy % wag. 31,0 ,2 0,2 0,2 „ ,, i84 427 13 Jak imozna zauwazyc, po 1 godzinie produkt drozdzowy byl calkowicie uwolniony od rozpusz¬ czalnika i prawie zupelnie suchy. Usunieto naj¬ pierw heksan, nastepnie alkohol izopropylowy i w koncu wode.Przyklad II. Przeprowadzono hodowle, wy¬ dzielenie i ekstrakcje drozdzy Candida lipolytica w sposób jak w przekladzie I. Otrzymano wilgot¬ na paste drozdzowa zawierajaca rozpuszczalnik.Wilgotny produkt przepuszczono w serii przejsc przez suszarke z przenosnikiem srubowym, zaopa¬ trzona w rynne z plaszczem obudowana oslona i posiadajaca nastejpujace charakterystyki: Pojemnosc calkowita Cisnienie w rynnie Cisnienie wewnatrz pod¬ wójnej sciany rynny Powierzchnia grzejna Temperatura pary na wylocie z podwójnej sciany dm3 1 atmosfera atmosfer 0,4 m2 142°C 14 Sruba miala podwójne scianki, wewnatrz których przeplywala para wodna o cisnieniu 2/5 atmosfery.Charakterystyka i warunki dzialania przenosnika srubowego byly nastepujace: Srednica Dlugosc Cisnienie wewnetrzne Ilosc obrotów na minute powierzchnia wy¬ miany cieplnej 130 mm 900 mm atmosfer 1 0,45 m2 Powierzchnie czolowe sruby byly wyposazone w zgarniaki z teflonu.Wszystkie powierzchnie stykajace sie z produk¬ tem byly wykonane ze stali nierdzewnej.Przebieg i dane analityczne podano w tabeli III.Tabela III Produkt wyjs¬ ciowy dla su¬ szarki Po: przejsciu 1 przejsciu 2 przejsciu 3 przejsciu 4 przejsciu 5 Dane dotyczace skladu drozdzy 1 Ilosc produktu kg 269 188 135 115 102 93 Zawartosc wilgoci % wag. 74,9 61,1 47,9 38,3 ,0 24,9 Ilosc alkoholu izopropylo¬ wego °/o wag. ,7 ,7 3,4 0,7 0,4 0,2 Ilosc heksanu °/o wag. 7,7 slady 0 0 0 o 1 Po 5 przejsciach produkt byl calkowicie wolny od rozpuszczalnika, lecz pozostala pewna ilosc wo¬ dy. W celu jej usuniecia konieczne bylo dokonanie trzech dalszych przejsc.Przyklad III. Przeprowadzono hodowle, wy¬ dzielenie i ekstrakcje drozdzy Candida lipolytica, w sposób jak w przykladzie I.Wilgotny produkt zawierajacy nieco rozpuszczal¬ nika wprowadzano w sposób ciagly do przenosnika srubowego Heloflite.Ogrzewana powierzchnia przenosnika srubowe¬ go miala temperature 160°C, a szybkosc obrotowa wynosila 1 obr/min. Inne cechy suszarki byly na¬ stepujace: Zbudowana z oslonietej plaszczem rynny z po¬ krywa posiadala dwie sruby o srednicy 130 mm i dlugosci 900 mm, z ogrzewaniem parowym. Plaszcz rynny i oslone mozna bylo poddac cisnieniu 1 kg/ cm2 pary grzejnej.Powierzchnia wymiany cieplnej srub 0,9 m2 Pojemnosc suszarki 11 litrów^ Przepustowosc rzedu 25 do 30 kg/godzine.Wszystkie powierzchnie aparatu stykajace sie z pasta drozdzowa byly wykonane ze stali nierdzew¬ nej. 45 50 65 Produkt, tj. wilgotne wyekstrahowane drozdze,, przepuszczano kilkakrotnie przez przenosnik sru¬ bowy. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli IV.Heksan i alkohol izopropylowy usunieto calko¬ wicie, natomiast wode usuwano powoli.Otrzymany ostatecznie produkt byl koncentra¬ tem bialkowym calkowicie wolnym od rozpuszczal¬ ników i o niskiej zawartosci wody.Srodek powierzchniowo czynny NI 29 jest nie¬ jonowym srodkiem powierzchniowo czynnym otrzy¬ manym przez kondensacje tlenku etylenu z alko¬ holem laurynowym celem wytworzenia lancucha tlenku etylenu o przecietnej 8,5 jednostek w cza¬ steczce.Inne srodki powierzchniowo czynne, które mozna zastosowac w procesie bedacym przedmiotem wy¬ nalazku stanowia niejonowy srodek powierzchnio¬ wo czynny otrzymany przez siarczanowanie wymie¬ nionego niejonowego srodka powierzchniowo czyn¬ nego, tj. siarczanu oksytylenowanego alkoholu lau- rylowego i niejonowy srodek powierzchniowo czyn¬ ny otrzymany przez kondensacje tlenku z miesza¬ nina alkoholu laurylowego z alkoholem mirysty- lowym.15 84 427 Tabela IV 16 Pasta drozdzowa Liczba iprzejsc 1 2 3 4 Warunki dzialania Dane dot. pasty drozdzowej Wilgoc % wag. heksan % wag.T° = 160°C obr/min = 1 63,4 55 26 6 3,7 0,1 alkohol izopro^ pylowy % wag. 26,9 11,6 0,9 0,2 0.1 Przyklad IV. Przeprowadzono hodowle i wy¬ dzielanie drozdzy Candida li!pblytica, wedlug spo¬ sobu jaJk w przykladzie I.Po wyodrebnieniu, drozdze wysuszono na su¬ szarce rozpryskowej, otrzymujac drozdze o zawar¬ tosci wilgoci okolo 5%, a nastepnie przeslano do 3 stadiowego zestawu ekstrakcyjnego, o pracy w przeciwpradzie. Jaiko rozpuszczalnik stosowano mieszanine azeotropowa izopropanol — woda w stosunku, odpowiednio 88 i 12 w procentach wago¬ wych. Swiezy rozpuszczalnik wprowadzano w kon¬ cowym stadium ekstrakcji, w ilosci 8 czesci wa¬ gowych rozpuszczalnika na 1 czesc wysuszonych drozdzy, uzytych w pierwszym stadium ekstrakcji.W, .kazdym stadium ekstrakcji zawiesine drozdzy mieszano z rozpuszczalnikiem, w temperaturze 80°C. Odzyskane w ekstrakcji drozdze, w postaci pasty o skladzie: drozdzy 37°/o, izopropanolu 53%, wody 10% wymieszano z woda do uzyskania brei o zawartosci drozdzy 25% wagowych i wysuszono w suszarni pólkowej, skladajacej sie z 11 pólek, ogrzewanych goraca woda z wewnetrznym obie¬ giem. Suszenie prowadzono w ten spos6b, ze paste drozdzowa rozcienczana ' woda doprowadzano na górna pólke, przy czym tworzacy sie podczas su¬ szenia konglomerat byl kruszony przez uklad wal¬ ków sprzezony z pólkami.Temperature suszenia otrzymywano w zakresie- temperatur 100°C na dnie suszarni, 75°C w czesci ' srodkowej i 60°C na pierwszej górnej pólce, a cis¬ nienie — atmosferyczne. Produkt drozdzowy od¬ bierany z dna suszarni mial sklad nastepujacy: woda 3% oraz, w przeliczeniu na sucha substancje, azot 11%, lipidy 1% i izopropanol 0,2%.Przyklad V. Dotyczy bakterii. 40 1 wodnej pozywki mineralnej o skladzie: K2HP04 1 g KH2P04 0,5 g, MgS04-7H20 0,5 g NaCl 0,1 g, FeS04-7H20 0,02 ig, ekstrakt drozdzowy 0,03 g, woda w uzupel¬ nieniu do 1000 ml, w[prowadzono do naczynia fer¬ mentacyjnego ze stali nierdzewnej, o pojemnosci 60 1 i dodano 20 1 bakterii Micrococcus cerificans inokulowanych 24 godziny na mieszaninie weglo¬ wodorów 'normalnych C7 — C20, uzyskujac gestosc odpowiadajaca 1 ig suchej pozostalosci w 1 litrze.Hodowle prowadzono w temperaturze 36°C ±1°C, stosujac jako nosnik ciepla wode obiegowa w plaszczu naczynia fermentacyjnego oraz utrzymy- wano wartosc pH srodowiska 7, regulujac automa¬ tycznie odczyn wodnym roztworem amoniaku.Jako mieszanine weglowodorów stosowano olej gazowy o nastepujacej charakterystyce: ciezar ga¬ tunkowy 0,865, temperatura plynnosci + 15°C, za¬ kres temperatur wrzenia 265°—380°C. Po osiagnie¬ ciu gestosci komórek 15 g/l rozpoczeto rozciencza¬ nie zawartosci naczynia fermentacyjnego z predko¬ scia 0,2 obj!(obj)igodzine, utrzymujac gestosc komó¬ rek 15 g/l przy jednoczesnym odprowadzaniu bulio¬ nu ze strefy hodowli do dekantacji, przy czym usunieto 65% zuzytego srodowiska, zastepujac go w tej samej ilosci zwykla woda.Po dodaniu amonowego detergentu, stanowiace¬ go siarczan produktu kondensacji alkoholu laury- nowego z tlenkiem etylenu, w ilosci 1,5 g/l i do¬ kladnym wymieszaniu, zawiesine odwirowano, u- zyskujac: zuzytego srodowiska mineralnego 830 g/l, nieprzetworzonego oleju gazowego 100/1 i pasty mikroorganizmów 70 g/l. Paste mikroorganizmów przeplukano swieza woda o temperaturze pokojo¬ wej i odwirowano, otrzymujac nowa paste o za¬ wartosci 65% wody, z której usunieto czesc wody do poziomu zawartosci w pascie 50%. Talk przygo¬ towana paste poddano wysuszeniu w sposób jak podano w przykladzie II, z takim samym konco¬ wym wynikiem.Przyklad VI. Dotyczy plesniaków. Przeprowa¬ dzono hodowle wydzielenie i ekstrakcje sposobem jak podano w przykladzie I, dla Candida lilpoltica.Otrzymany mokry produkt, zawierajacy pewna ilosc rozpuszczalnika, poddiano obróbce ciaglej w przenosniku srubowym Holoflite w sposób jak po¬ dano w przykladzie III i w tych samych warun¬ kach. Heksan i izopropanol usunieto calkowicie, natomiast woda byla usunieta w tej operacji w malej ilosci. PL