Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung eines Mikroorganismen enthaltenden Materials von verdampfbaren Substanzen.
Verfahren zur Extraktion mit einem Lösungsmittel von Mikroorganismen enthaltenden Fraktionen zum Entfernen von Lipoiden und/oder Schmutzstoffen wurden bereits beschrieben.
Durch die Extraktion mit einem Lösungsmittel oder eine andere Behandlung oder Methoden zur Züchtung von Mikroorganismen kann ein Mikroorganismenprodukt erzielt werden, mit dem Wasser und ein dem Mikroorganismus fremder Stoff verbunden sind. Dieser Stoff hat in gewissen Fällen einen solchen Siedepunkt, dass er unter geeigneten Bedingungen im wesentlichen vollständig verdampft werden kann, wobei ein Teil des erwähnten Wassers in Verbindung mit dem Mikroorganismus zurückbleibt; ein Stoff, der diesen Charakter aufweist, wird nachstehend als verdampfbarer Stoff bezeichnet.
Wir haben festgestellt, dass unter gewissen Bedingungen die Verdampfung der mit dem Mikroorganismus verbundenen Flüssigkeiten zu einem Mikroorganismenprodukt führen kann, bei dem ein Teil des verdampfbaren Stoffes sich nicht durch herkömmliche Methoden, wie z. B. Erhitzen oder eine weitere Extraktion mit einem Lösungsmittel, entfernen lässt.
Wir haben ferner festgestellt, dass in Gegenwart einer gewissen Menge von Wasser der Mikroorganismus diese Verbindung nicht bildet (jedenfalls nicht in einer Weise, die das Entfernen des verdampfbaren Stoffes verhindert).
Wir haben ferner festgestellt, dass das Entfernen eines Teils des Wassers und in gewissen Fällen der ganzen Wassermasse aus dem den Mikoorganismus enthaltenden Material ohne die Bildung der erwähnten Verbindung erzielt werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Reinigung eines Mikroorganismen enthaltenden Materials von verdampfbaren Substanzen ist nun dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismen, Wasser und eine weitere verdampfbare Substanz enthaltendes Material, in welchem das Wasser in einer Menge von über 20sec, auf das Trockengewicht der Mikroorganismen bezogen, vorliegt, derart behandelt wird, dass mindestens ein Teil oder die Gesamtheit des von Wasser verschiedenen verdampfbaren Stoffes entfernt wird, während mindestens 20% Wasser, auf das Trockengewicht der Mikroorganismen bezogen, in Verbindung mit den Mikroorganismen beibehalten wird.
Eine besondere Ausführungsart des Verfahrens besteht darin, dass man das Mikroorganismen enthaltende Material so behandelt, dass ein Teil oder die Gesamtheit des Wassers entfernt und ein Mikroorganismen enthaltendes Konzentrat erhalten wird, das noch mindestens 20% Wasser, auf das Trockengewicht der Mikroorganismen bezogen, enthält, worauf der verdampfbare Stoff oder dessen Rückstand aus dem Konzentrat entfernt wird.
Es ist klar, dass besondere Sorgfalt notwendig ist, um zu gewährleisten, dass der verdampfbare Stoff aus der Verbindung mit dem Mikroorganismus entfernt wird, während mindestens 20 Gew.-c Wasser in Verbindung mit dem Mikroorganismus beibehalten wird.
Der verdampfbare Stoff kann durch Verwendung von Hitze und/oder vermindertem Druck unter solchen Bedingungen, dass (a) das Entfernen desselben vor dem Entfernen von Wasser stattfindet oder (b) unter solchen Bedingungen, dass der verdampfbare Stoff und das Wasser miteinander entfernt werden, wobei mindestens ein Teil der auf diese Weise entfernten Flüssigkeit durch Beigabe von Wasser zum Mikroorganismus ersetzt wird, entfernt werden.
Die obige Methode (a) kann durch eine mehrstufige und vorzugsweise zweistufige Verdampfung oder durch Verwendung eines Abscheidungsmittels zum vorzugsweisen Entfernen des verdampfbaren Stoffes durchgeführt werden.
Ferner kann man so verfahren, dass ein Mikroorganismen enthaltendes Material. das einen Mikroorganismus in Verbindung mit (a) überschüssigem Wasser in bezug auf das im lebendigen Mikroorganismus im trockenen Zustand vorhandene Wasser und (b) einen oben genannten verdampfbaren Stoff enthält, wobei das erwähnte Material unter solchen Bedingungen gehalten wird. dass der verdampfbare Stoff durch Verdampfen entfernt wird, während ein Teil des Wassers in Verbindung mit dem Mikroorganismus zurückbleibt.
Gegebenenfalls kann das Verfahren mit einem oben beschriebenen Material verwendet werden, bei dem der verdampfbare Stoff einen Siedepunkt in der Nähe von oder über demjenigen von Wasser aufweist. In diesem Fall kann das Mikroorganirmen enthaltende Material behandelt werden, indem es bei geeigneter Temperatur undioder vermindertem Druck unter Beigabe von Wasser gehalten wird, um Wasser in Verbindung mit dem Mikroorganismus zu behalten. Gegebenenfalls kann ein Abscheidungsmittel verwendet werden.
Das Verfahren eignet sich besonders zur Behandlung eines Mikroorganismen enthaltenden Materials. in welchem der oben genannte verdampfbare Stoff einen Siedepunkt unter demjenigen von Wasser aufweist: ein solcher Stoff wird aus Gründen der Zweckmässigkeit nachstehend als flüchtiger Stoff bezeichnet.
Das Verfahren kann man ferner auch so durchführen, dass man bei einer Temperatur. bei der der flüchtige Stoff unter den herrschenden Bedingungen entfernbar ist, aber unter derjenigen, bei der das Wasser mit einer wesentlichen Geschwindigkeit durch Verdampfung entfernt wird, arbeitet.
während der flüchtige Stoff durch Verdampfung entfernt wird.
Anfänglich kann ein Teil des Wassers rasch entfernt werden, z. B. unter Verwendung einer Zerstäuberspritzvorrichtung, so dass ein mindestens 20 Gew.-6 c Wasser enthaltendes Material erzielt wird.
Vorzugsweise wird der verdampfbare Stoff entfernt, indem der Mikroorganismus nahe bei einer geheizten Oberfläche gehalten und vorzugsweise in Bewegung in bezug auf die Oberfläche gehalten wird.
Es eignet sich dazu eine Förderschnecke, der Hitze zugeführt wird. Gegebenenfalls kann die Förderschnecke mit einem Heizmantel versehen werden.
Durch eine geeignete Verteilung der Hitze auf die Förderschnecke und 'oder die Ummantelung. wenn eine solche verwendet wird, kann die Förderschnecke eine doppelte Funktion erfüllen: sie entfernt den verdampfbaren Stoff, während eine gewünschte Menge Wasser im Mikroorganismus zurückgehalten wird, und entfernt danach die Gesamtheit oder einen Teil des verbleibenden Wassers.
Das Mikroorganismus enthaltende Material wird zweckmässig in Bewegung in bezug auf die Oberfläche der Förderschnecke gehalten, und zwar durch Prallbleche im Fördersystem, die mit einem Propeller zusammenwirken. mittels der das erwähnte Material durch ein Rohr befördert wird. Zweckmässig weist der Propeller eine hohle Achse auf und wird mit Dampf beheizt. Die Förderschnecke wird normalerweise kontinuierlich betrieben, wobei frisches Material durch einen Trichter zugeführt wird. Vorzugsweise wird das System verschlossen und mittels eines inerten Gases unter Druck gehalten, damit Luftsauerstoff zum mindesten weitgehend ausgeschlossen ist.
Wenn erwünscht, kann der verdampfbare Stoff und nachher wenigstens ein Teil des verbleibenden Wassers mittels einer Schalentrockenvorrichtung mit geheizter Oberfläche und einem Schaber zur Weiterbeförderung des Materials, aus dem Mikroorganismus entfernt werden, wobei die Schalentrockenvorrichtung gewöhnlich chargenweise betrieben wird.
Wenn erwünscht. kann das so erhaltene Produkt weiterverar beitet werden, um die Gesamtheit oder einen Teil des verblei benden Wassers des Materials zu entfernen. Zweckmässig kann dies erfolgen, indem das Produkt mittels eines Zerstäubers getrocknet oder mittels einer beheizten Förderschnecke in Berührung gebracht wird.
Vorzugsweise wird dazu ein Material verwendet, bei dem die Gesamtmenge des verdampfbaren Stoffes 50 Gew.-% des mit den Mikroorganismen in Verbindung stehenden Wassers nicht übersteigt, das Wasser in den Mikroorganismen in trokkenem Zustand nicht eingerechnet.
Verdampfbare Stoffe im vorliegenden Sinne sind z. B.
Lösungsmittel, die zur Extraktion von verunreinigten Mikroorganismen verwendet werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren zum Entfernen von Normalhexan oder Isopropanol aus dem Material.
Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Reinigung von Materialien, die man durch Züchten von Mikroorganismen in Gegenwart von durch diese Mikroorganismen zum Wachstum verbrauchbaren Kohlenwasserstoffen erhält, und die mit Kohlenwasserstoffen verunreinigten Mikroorganismen von der Zuchtmasse abtrennt und hierauf das abgetrennte Material mit oder ohne Reinigung in Gegenwart von Wasser einer Lösungsmittelextraktion unterwirft, und dann nach einem oben beschriebenen Verfahren handelt.
Gewöhnlich liegen die gradkettigen Kohlenwasserstoffe in Nährböden auf der Zuchtstufe als Paraffine vor; sie können jedoch auch als Olefine vorliegen. Es kann auch ein Gemisch davon verwendet werden.
Geeignete Kohlenwasserstoff-Nährböden sind Kerosin, Gasöle und Schmieröle; diese Nährböden können unraffiniert oder einer Verfeinerungsbehandlung unterzogen worden sein, doch ist es von Vorteil, wenn sie einen Anteil an gradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten. Zweckmässig enthält die Erd ölfraktion 345 Gew.-O/c gradkettige Kohlenwasserstoffe.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist von besonderem Wert für die Behandlung von Erdöl-Gasöl-Fraktionen, die gradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten, weil dabei ein Gasöl mit einem verbesserten Stockpunkt erzielt wird, und somit ein wertvolleres Produkt erhalten wird.
Durch Anwendung des Verfahrens unter Bedingungen, die den Abbau von gradkettigen Kohlenwasserstoffen begrenzen, ist es möglich, so vorzugehen, dass nur eine gewünschte Menge dieser Kohlenwasserstoffe entfernt wird.
Mikroorganismen, die wie hierin beschrieben gezüchtet werden, können Hefen, Schimmel oder Bakterien sein oder Gemische davon. Vorzugsweise können sie auf gewissen Normalparaffinen wachsen.
Die hier angegebenen Hefen werden gemäss den in The Yeasts, a Taxonomic Study von J. Lodder und W.J.W. Kreger-Van Rij, North Holland Publishing Co. (Amsterdam) (1952), umrissenen Klassifizierungssystem klassifiziert.
Die hier erwähnten Bakterien werden gemäss dem in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology von R.S. Breed, E.G.D. Murray und N.R. Smith, Bailliere, Tindall and Cox (London), 7. Ausgabe (1957), umrissenen Klassifizierungssystem eingeordnet.
Im Verfahren geeignete Hefen gehören vorzugsweise zur Familie der Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie der Cryptococcoideae; gegebenenfalls können jedoch auch z. B. ascosporogene Hefen der Unterfamilie der Saccharomycoideae verwendet werden. Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie der Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida.
Bevorzugte Hefearten sind die folgenden. (Insbesondere wird es vorgezogen, die spezifischen Nährböden mit der angegebenen Baarn-Kennzahl zu verwenden; diese Kennzahlen beziehen sich auf CBS-Nährböden des Cen traal Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland, und auf
INRA-Nährböden des Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Frankreich.)
Candida lipolytica
Candida pulcherrima CBS 610
Candida utilis
Candida utilis, Variati CBS 841 major
Candida tropicalis CBS 2317
Torulopsis colliculosa CBS 133
Hansenula anomala CBS 110
Oidium lactis
Neurospora sitophila
Mycoderma cancoillote INRA: STV 11
Candida lipolytica und C. tropicalis werden besonders bevorzugt.
Wenn erwünscht, kann der Mikroorganismus ein Bakterium sein.
Zweckmässig werden folgende Klassen von Bakterien verwendet: Pseudomonadales, Eubacteriales und Actinomycetales.
Vorzugsweise gehören die verwendeten Bakterien zu den Familien der Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actincycmycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae und Pseudomonadaceae. Bevorzugte Arten sind der Bacillus megaterium, der Bacillus subtilis und die Pseudomonas aeruginosa.
Andere Arten, dieverwendet werden können, sind:
Bacillus amylobacter
Pseudomonas natriegens
Arthrobacter sp.
Micrococcus sp.
Corynebacterium sp.
Pseudomonas syringae
Xanthomonas begoniae
Flavobacterium devorans
Acetobacter sp.
Actinomyces sp.
Nocardia opaca
Diese Bakterien wachsen in Gegenwart des folgenden wässrigen Nährmediums: NH4CI 0,5 g NaCl 4g MgSO4 7H20 0,5 g NaHPO4 12H20 0,5 g KH2PO4 0,5 g Wasser q.s. ad 1000 ml
Der pH dieses Mediums wird vorzugsweise bei 7 gehalten.
Ein weiteres wässriges Nährmedium ist: K2HPO4 1 g KH2PO4 0,5 g MgSO47H2O 0,5 g CaC12 0,1 g NaCl 0,1 g Wasser q.s. ad 1000 ml
Ein geeignetes Nährmedium für Hefen und Schimmel weist folgende Zusammensetzung auf: (NH4)2HPO4 2 g KCI 1,15 g MgSO4 7H20 0,65 g ZnS04 0,17 g MnSO4 4H20 zu 3z0 0,045 g FeSOJ7H20 0,068 g Hahnenwasser 200 ml Hefeextrakt 0,025 g Destilliertes Wasser (q.s.ad 1000 ml)
Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird durch die Beigabe zum Kulturmedium einer sehr geringen Menge Hefeextrakts (eines industriellen Produktes das reich an wesentlichen Nutriliten, d. h. Wachstumsfaktoren, die durch die Hydrolyse einer Hefe erzielt werden, ist) oder allgemeiner der wesentlichen Nutrilite begünstigt.
Zu den wesentlichen Nutriliten gehören Biotin, Pantothensäure, Nikotinsäure, Thiamin, Inositol und Pyridoxin. Die beigefügte Menge Hefeextrakt liegt vorzugsweise in der Grössenordnung von 25 Teilen pro Million. Die erforderliche Menge Nutrilit schwankt zwischen etwa 0,1 Teil pro Million im Fall von Biotin und etwa
10 Teilen pro Million im Fall von Inositol.
Vorzugsweise wird das wässrige Nährmedium durch die portionenweise oder kontinuierliche Beigabe eines wässrigen Mediums mit einem hohen pH-Wert beim gewünschten pH gehalten. Gewöhnlich wird bei Verwendung von Schimmeln oder Hefen und insbesondere bei Verwendung von Candida lipolytica der pH des Nährmediums im Bereich von 3-6, vor zugsweise von 4-5 gehalten. (Bakterien erfordern einen höheren pH, gewöhnlich 6,5-8.) Geeignete alkalische Substanzen als Zusatz zum Nährmedium sind z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak, entweder als solche oder in wässriger Lösung.
Die optimale Temperatur des Nährmediums schwankt je nach dem Typus des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25-35oC. Bei Verwendung von Candida lipolytica liegt der bevorzugte Temperaturbereich bei 28-320C.
Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum des Mikroorganismus wesentlich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Um eine grosse Wachstumsgeschwindigkeit zu gewährleisten, sollte die zur Beschaffung von Sauerstoff verwendete Luft in Form feiner Blasen. z. B. durch Rühren, eine gesinterte Oberfläche oder durch Wirbellüftung eingeführt werden.
Die Züchtung wird gewöhnlich kontinuierlich durchgeführt; Gewünschtenfalls kann auch ansatzweise vorgegangen werden.
Nach dem Wachstum ist es gewöhnlich möglich, den mit etwas nichtassimilierter Nahrung und wässrigem Nährmedium verunreinigten Mikroorganismus von der Masse der nicht aufgenommenen Nahrungsfraktion zu trennen. Vorzugsweise wird diese Trennung dadurch Abgiessen vorgenommen; zudem oder alternativ kann ausgeschleudert werden. Die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion wird dann vorzugsweise mit einem ein oberflächenaktives Mittel enthaltenden wässrigen Medium behandelt.
Vorzugsweise wird die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion energisch mit dem wässrigen oberflächenaktiven Mittel vermischt und ohne weitere Wachstumsperiode einer weiteren Trennung, vorzugsweise durch Ausschleudern unterzogen, wobei eine den Mikroorganismus enthaltende Fraktion und eine wässrige Phase, die die abgetrennten Kohlenwasserstoffverunreinigungen enthält, gewonnen wird. Wenn nötig, können die Wasch- und Trennstufen mehrmals wiederholt werden, wobei in der Waschstufe jedesmal ein wässriges oberflächenaktives Mittel verwendet wird. Nach dem Waschen ist es nötig, in einem wässrigen Milieu zu waschen, das frei von oberflächenaktivem Mittel ist; vorzugsweise mit Wasser. Wiederum kann gegebenenfalls eine Reihe von Wasch- und Trennstufen folgen.
Vorzugsweise werden die Waschstufen so lange durchgeführt, bis der Kohlenwasserstoffgehalt der Mikroorganismen unter 7% fällt. bezogen auf das Gewicht der trockenen Mikroorganismen. Vorzugsweise liegt der erwähnte Kohlenwasserstoffgehalt unter 5 sec.
Als zum Waschen verwendete oberflächenaktive Mittel können kationische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Stearyltrimethylammoniumchlorid, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. die Kondensate von Ölsäure und Äthylenoxyd, oder anionische oberflächenaktive Mittel. wie z. B.
Natriumalkylsulfate, verwendet werden.
Die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion wird dann gewöhnlich mit einem Lösungsmittel extrahiert. Vorzugsweise wird in einer ersten Extraktionsphase. die aus einer oder mehreren Extraktionsstufen besteht, das verunreinigte feste Material mit einem Gemisch eines Alkohols und eines Kohlenwasserstoffs, mit dem es ein Azeotrop bildet, extrahiert, wobei der erwähnte Alkohol und der Azeotrop bildende Kohlenwasserstoff in einem Volumen-Verhältnis im Bereich von 30:70 bis 70:30 verwendet werden.
Zweckmässig wird ein Mehrphasensystem verwendet; in einer zweite Extraktionsphase, die aus einer oder mehreren Extraktionsstufen besteht, kann das behandelte feste Material aus der ersten Phase mit einem azeotropischen Gemisch des Alkohols und des ein Azeotrop bildenden Kohlenwasserstoffs extrahiert werden, worauf das behandelte feste Material gewonnen wird.
Einzeln oder nach der Vermischung können die Extraktfraktionen aus der ersten und zweiten Extraktions phase einer Destillationsphase, die aus einer oder mehreren Destillationsstufen besteht, zur gesonderten Rückgewinnung (a) eines azeotropen Gemisches des Alkohols und des ein Azoetrop bildenden Kohlenwasserstoffs, (b) eines azeotropen Gemisches des Alkohols mit Wasser und (c) einer Rückstandsfraktion zugeführt werden, worauf das im wesentlichen ganze azeotrope Gemisch des Alkohols mit Wasser mit einem Teil des azeotropen Gemisches des Alkohols und des ein Azeotrop bildenden Kohlenwasserstoffs vermischt werden, wobei der Teil gewählt wird, um ein Gemisch des Alkohols und des ein Azeotrop bildenden Kohlenwasserstoffs zu erzielen, das diese Materialien in einem volumenmässigen Verhältnis im Bereich von 30:70 bis 70:
:30 enthält, und das erzielte Gemisch zur ersten Extraktionsphase zurückgeführt wird.
Zweckmässig liegt die Temperatur der Extraktionsstufen im Bereich von 30600C.
Zweckmässig ist der ein Azeotrop bildende Kohlenwasserstoff Normalhexan. Zweckmässig ist der Alkohol Äthanol, Propanol, Isopropanol oder ein Butanol.
Zweckmässig wird das erfindungsgemässe Verfahren mit einem rohen oder teilweise raffinierten Produkt des Wachstums von Mikroorganismen in Kohlenwasserstoffnährboden in Gegenwart eines wässrigen Nährmilieus ausgeführt.
Vorzugsweise enthält der Mikroorganismus, wenn er einer Extraktion mit einem Lösungsmittel unterzogen wird, insbesondere 100-200 Gew.-to Wasser (auf das Trockengewicht der reinen Hefe bezogen).
Wenn nötig, kann die Hefe vor der Extraktion mit Wasser vermischt werden.
Vorzugsweise liegt das Verhältnis vom Wasser zur Gesamtheit des Alkohols und des ein Aezotrop bildenden Kohlenwasserstoffs in der Stufe oder in den Stufen der Extraktionsphase oder der ersten Extraktionsphase, gewichtsmässig im Bereich von 1:4 bis 1:10.
Wenn erwünscht, kann die oben beschriebene Extraktion wiederholt werden, und zwar vorzugsweise nach Beigabe von Wasser zur Hefe, um einen Wassergehalt wie in der ersten Phase zu erzielen.
Die in der Extraktionsphase durch Extraktion mit einem Lösungsmittel zurückgewonnenen Kohlenwasserstoffe können zur Zuchtphase der Mikroorganismen zurückgeführt werden, wenn sie noch aufnahmefähig sind.
Das die Mikroorganismen enthaltende Material, das nach der Extraktion mit einem Lösungsmittel gewonnen wird, das Wasser und einen verdampfbaren Stoff enthält, wird wie oben beschrieben zum Entfernen eines Teils oder der Gesamtheit des verdampfbaren Stoffes weiterbehandelt.
Hefe, die nach einem der oben beschriebenen Verfahren von der Gesamtheit oder einem Teil ihrer Lipoide und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen befreit wurde, ist als industrielles Produkt neu.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, dass ein Mikroorganismus in einer oben beschriebenen Weise in Gegenwart einer zum Teil aus gradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Erdölfraktion mit einem mittleren Molekulargewicht, das mindestens 10 Kohlenstoffatomen pro Molekül entspricht, eines wässrigen Nährmilieus und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet wird und vom Gemisch einerseits der Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion, die eine verminderte Proportion gradkettiger Kohlenwasserstoffe aufweist oder von denen erwähnten grad kettigen Kohlenwasserstoffen frei ist, getrennt wird, worauf dei Mikroorganismus wie oben beschrieben behandelt wird.
Das Verfahren kann ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Bevorzugte Methoden, die zum Züchten des Mikroorganismus und zur Gewinnung des Produkts verwendet werden können, sind in den britischen Patenten Nr. 914 567, 914 568 1107 584, 1 049 065 und 1 017 585 beschrieben.
Beispiel 1
Ein Gärungsgefäss aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 60 Liter wurde mit 40 Liter eines wässrigen Mineralnährmediums folgender Zusammensetzung beschickt: g
Diammoniumhydrogenphosphat 2
Kaliumchlorid 1,15
Magnesiumsulfat 7H20 0,65
Zinksulfat 0,17
Mangansulfat 4H20 0,068
Eisen-II-sulfat 0,124
Hefeextrakt 0,030
Hahnenwasser 200 destilliertes Wasser q.s.ad 1000 ml
20 Liter eines 24 Stunden-Impfstoffs von Candida lipolytica auf gemischten Normalkohlenwasserstoffen mit 10-20 Kohlenstoffatomen wurden dann beigefügt, so dass die Zellendichte etwa 1 g Trockensubstanz pro Liter betrug.
1,030 Liter schweres Gasöl, d. h. 15 glLiter, wurden dann zugesetzt; diese Menge genügt, um die Zellendichte auf 2 g/ Liter zu bringen.
Die Temperatur der Kultur wurde durch Wasser, das in einem Ring, der aus dem Raum zwischen zwei konzentrischen Zylindern, von denen der kleinere das Gärungsgefäss selbst war, bestand, geleitet wurde, bei 30+10C gehalten. Es wurde so gelüftet und geschüttelt, dass das Ausmass der Lüftung 3 Millimol O2 pro Liter Medium in der Minute betrug.
Der pH wurde durch die Beigabe einer Ammoniaklösung, die durch ein automatisches pH-Kontrollsystem eingeleitet wurde, bei 4 gehalten. Wenn der Ammoniakzufluss 20 ml erreicht, wurde mit der Beigabe von Gasöl begonnen. Das Gas hatte folgende Eigenschaften: spezifisches Gewicht 0,870
Stockpunkt + 15"C
Siedebereich 300-3900C
Die Geschwindigkeit der Beigabe wurde durch den theoretischen Bedarf der Kultur bestimmt, wobei eine Ausbeute aufgrund von Gasöl (erzeugte trockene Hefe) (Gasölnährboden) von 10 Gew.-% und eine Zellteilungsdauer von 3 Stunden angenommen wurde. Diese Beigabe erfolgte jede Stunde, bis die Gesamtmenge des Gasöls 200 g/l, d. h. 13,81 erreichte.
Begann man mit einer Zellendichte von 2 g/l, so betrug sie nach 25 Stunden (am Schluss der exponentiellen Wachstumsphase) 15 g/l.
Das Gärungsgefäss wurde bei einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,2 Vol/Vol/Stunde kontinuierlich betrieben, wobei die Zellendichte während des ganzen Versuchs bei 15 gll konstant blieb.
Dem Gärungsgefäss wurde Bouillon kontinuierlich entnommen und abgegossen, wobei 65% des verbrauchten Mediums entnommen und in der zurückgewonnenen Bouillon durch 65cr, Leitungswasser ersetzt wurden.
Der obigen Phase wurde 0,5 g/l unter der Handelsbezeichnung NI 29 bekanntes nichtionisches Reinigungsmittel beigefügt; nach dem Ausschleudern wurden einzeln zurückgewonnen: verbrauchtes Mineralmedium 840 g/l nicht aufgenommenes Gasöl 110 g/l Mikroorganismenpaste 50 gil
Die Mikroorganismenpaste wurde dann bei Raumtemperatur mit Wasser gespült und ausgeschleudert; die erzielte Hefe enthielt 65 bis 70% Wasser.
Wasser wurde dann daraus zum Teil entfernt, um eine aus 50 Gew.-Sc trockener Hefe und 50% Wasser bestehende Hefepaste zu erzielen.
Diese nasse Hefe wurde dann in eine Abziehvorrichtung gepumpt, bestehend aus einer um eine horizontale Achse rotierende Filtertrommel. Ein aus 50% Hexan und 50% Isopropanol bestehendes Lösungsmittelgemisch wurde der nassen Hefe in einem Verhältnis von 8 Teilen Gemisch pro Teil trokkene Hefe beigefügt. Das ganze Gemisch, nämlich Hefe + Wasser + Lösungsmittel. wurde 30 Minuten bei 60C gehalten. Dann wurde das den Hauptteil der Hefeverunreinigungen enthaltende Lösungsmittel abgezogen.
Hierauf wurde dieses Reinigungsverfahren wiederholt.
Die nachstehende Tabelle 1 gibt die Zusammensetzung des extrahierten Produktes an.
Tabellen
Feuchtigkeit 68,4 Gew.-6T
Stickstoff 10,5 Gew.-Sc trockene Hefe
Lipoide 0,3 Gew.-6Rc trockene Hefe
Verbleibendes Hexan 6,8 Gew.-Sc trockene Hefe
Verbleibendes Isopropanol 31.0 Gew.-Wc trockene Hefe
Die zurückgewonnenen Lösungsmittel wurden vermischt und dann einer Destillation zur Rückgewinnung sowohl eines azeotropen Gemisches des Isopropanols und des Normalhexans als auch eines azeotropen Gemisches von Alkohol und von Wasser und eines alle Lipoide und Verunreinigungen enthaltenden Rückstandes unterzogen. Diese azeotropen Gemische wurden dann zum Widergebrauch vermischt.
Die mit einem Lösungsmittel extrahierte Hefepaste wurde dann einem Schalentrockner zugeführt, der eine von vier Schabern aus rostfreiem reingehaltene erhitzte Oberfläche aufwies und bei atmosphärischem Druck kontinuierlich betrieben wurde. Das Entfernen von Lösungsmittelresten und Wasser erfolgte gemäss Angaben der nachstehenden Tabelle 2.
Tabelle 2
Betriebsbedingungen Zusammensetzung der Hefepaste
Dauer Temp. Druck Feuchtigkeit Hexan IPA in OC Gew.-C?c Gew.-ec Gew.-ec min.
Produkt- 0 60 atmosph. 68,4 6,8 31,0 nährboden
15 84 atmosph. 55,9 < 0,05 15,2
30 94 atmosph. 34,4 < 0,05 0,2
45 106 atmosph. 6,2 < 0.05 < 0,7
60 117 atmosph. 1,9 < 0,05 < 0,2
65 120 atmosph. 1,6 < 0,05 < 0,2
Wie man sieht, war das Hefeprodukt nach einer Stunde beinahe vollständig von Lösungsmittel befreit und fast vollständig trocken. Zuerst wurde Hexan entfernt und dann IPA (Isopropylalkohol) und schliesslich Wasser..
Beispiel 2
Die Hefe C. lipolytica wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, gewonnen und extrahiert. Wie beschrieben, wurde eine Lösungsmittel enthaltende nasse Hefepaste erzielt.
Dieses nasse Produkt wurde dann mehrmals durch einen Förderschneckentrockner geleitet, der einen mit einem Mantel und einem Deckel versehenen Trog sowie folgende Merkmale aufwies:
Gesamtvolumen 30 dm3
Druck im Trog 1 Atmosphäre
Druck in der Doppelwand des 10 Atmosphären
Trogs
Austauschoberfläche 0,4 m2
Abgangstemperatur des Dampfs 142 "C an der Doppelwand
Die Schrauben weisen einen doppelten Mantel auf, worin
Dampf bei einem Druck von 2,5 Atmosphären zirkulierte
Durchmesser 130 mm
Länge 900 mm
Druck 10 Atmosphären
Umdrehungen pro Minute 1
Austauschoberfläche 0,45 m2
Die ganze vordere Oberfläche der Schraubenspiralen waren mit als Schaber wirkenden Teflonstreifen versehen.
Alle in Berührung mit dem behandelten Produkt stehenden Flächen waren aus rostfreiem Stahl.
Die nachstehende Tabelle 3 gibt die Versuchs- und Analysenwerte an:
Tabelle3
Zusammensetzung der Hefe
Gewicht Feuchtigkeit IPA Hexan kg Gew.-% Gew.-% Gew.-%
Nährboden zum Trockner 269 74,9 35,7 7,7
Nach dem: 188 61,1 20,7 Spuren
1. Durchgang
2. Durchgang 135 47,9 3,4 0
3. Durchgang 115 38,3 0,7 0
4. Durchgang 102 30,0 0,4 0
5. Durchgang 93 24,9 0,2 0
Nach fünf Durchgängen war das Produkt gänzlich frei von Lösungsmittel, doch blieb etwas Wasser zurück. Um dieses zu eliminieren, waren drei weitere Durchgänge erforderlich.
Beispiel 3
Die Hefe C. lipolytica wurde wie in Beispiel 1 gezüchtet, gewonnen und extrahiert.
Das etwas Lösungsmittel enthaltende nasse Produkt wurde einer Holoflite-Förderschnecke kontinuierlich zugeführt.
Die Temperatur der geheizten Oberflächen der Förderschnecke betrug 1600C und die Geschwindigkeit der Schraube 1 Umdrehung pro Minute. Ferner bestand der Trockner aus einem mit einem Mantel und einem Deckel versehenen Trog, der zwei 900 mm lange Schrauben von einem Durchmesser von 130 mm enthielt. Die Schrauben enthielten 2-5 kg Dampf. Der Mantel des Trogs und der Deckel konnten mit einem Druck von 1 kg/cm2 belastet werden.
Wärme-Austauschoberfläche der Schrauben 0,9 m2 Fassungsvermögen des Trockners 111
Die Durchflussmenge betrug 25-30 kg/h.
Alle mit der Hefepaste in Berührung stehenden Oberflächen des Apparats waren aus rostfreiem Stahl.
Das Produkt (nasse extrahierte Hefe) wurde mehrmals durch die Förderschnecke geleitet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 wiedergegeben.
Tabelle 4
Betriebsbedingun- Zusammensetzung der Hefe gen
Feuchtigkeit Hexan IPA Gew.-% Gew.-% Gew.-%
Produktnährboden 63,4 3,7 26,9
1. Durchgang T = 160 C 55 (0,1 11,6
1 U/min
2. Durchgang T"=160"C - - 0,9
1 U/min
3. Durchgang T"= 1600C 26 - .0,2
1 U/min
4. Durchgang T"=160"C 15 - c0,1
1 U/min
5. Durchgang T"=160"C 6 -
1 U/min
Hexan und IPA wurden ganz entfernt, während Wasser langsam entfernt wurde.
Das erzielte Endprodukt war ein Proteinkonzentrat, das frei von Lösungsmittel war und einen geringen Wassergehalt aufwies.
Das oberflächenaktive Mittel NI 29 ist von nichtionischer Art, das man durch Kondensation von Äthylenoxyd mit Laurylalkohol erhält, wobei eine Äthylenoxydkette mit durchschnittlich 8,5 Einheiten pro Molekül entsteht.
Andere oberflächenaktive Mittel, die im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können, sind z. B. (a) ein anionisches oberflächenaktives Mittel, das durch Sulfatierung des erwähnten nichtionischen oberflächenaktiven Mittels erzielt wird (d. h. ein oxyäthylenisiertes Laurinalkoholsulfat) und (b) ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, das durch Kondensieren von Äthylenoxyd mit einem Gemisch von Laurylalkohol und Myristinalkohol erzielt wird.
Beispiel 4 (Reinigung eines Bakteriums)
40 Liter eines wässrigen Nährmediums folgender Zusammensetzung: K2HPO4 1 g KH2PO4 0,5 g MgS047H20 0,5 g NaCl 0,1 g Fe SO4 ' 7H2n 0,02 g Hefeextrakt 0,03 g Wasser bis zu 1000 ml wurden in einen 60 Liter fassenden Gärbottich aus rostfreiem Stahl gegeben. Hierauf wurden 20 Liter einer 24 Stunden alten Impfung von Bacterium Microccoccus certificaus auf einem Gemisch von normalen C7 bis C20-Kohlenwasserstoffen zugesetzt, und zwar in einer solchen Menge, dass die Zellendichte etwa 1 g Trockensubstanz pro Liter ausmachte.
Die Kultur wurde zur Züchtung mittels von in einem zweiten, das Gärgefäss zylindrisch umgebenden Bottich, zirkulierendem Wasser auf einer Temperatur 26 1 lt gehalten.
Das pH der Gärbrühe wurde mittels automatischer Einstellung durch Zusatz von wässrigem Ammoniak neutral (7) gehalten.
Ferner wurde in Gasöl folgender Eigenschaften in einer Menge von 180 g pro Liter Gärbrühe zugesetzt: spez. Gewicht 0,865
Stockpunkt 1 5OC
Siedebereich 265-3800C
Als die Menge an Trockensubstanz pro Liter 15 g erreichte, erfolgte die Gärung bei einer Konzentrationsabnahme von 0,2 Volumen pro Gärvolumen pro Stunde, während die Menge an Trockensubstanz dauernd auf 15 g/l gehalten wurde.
Aus dem Gärbottich wurde kontinuierlich Gärbrühe abgezogen und einer Dekantierung unterworfen, wobei daraus 65 % an verbrauchtem Nährmedium entnommen und durch ebensoviel Leitungswasser ersetzt wurden.
Hierauf wurden 1 g/l eines Reinigungsmittels ( Laural 746 ) zugesetzt, die Mischung kräftig gerührt und dann zentrifugiert, wobei eine Trennung in 830 g/l verbrauchtes Nährmedium 100 g/l nicht umgesetztes Gasöl und
70 g/l Paste aus Mikroorganismen erreicht wurde.
( Laural 746 ist ein oxyäthyleniertes Laurylsulfat.) Die abgetrennte Paste aus Mikroorganismus wurde hierauf mit frischem Wasser bei Raumtemperatur gewaschen und dann zentrifugiert. Man erhielt so eine Paste mit einem Wassergehalt von 65%, welche weiter entwässert wurde, bis der Wassergehalt noch 50% betrugt. Dieses nasse Produkt wurde nun so behandelt wie es für Candida lipolytica im Beispiel 2 beschrieben wurde, wobei die gleichen Ergebnisse erhalten wurden.
N. B. Der Schutzbereich des Patentes ist durch Art. 2, Ziff.
2, Pat. G. beschränkt.
The present invention relates to a method for purifying a material containing microorganisms from vaporizable substances.
Processes for extraction with a solvent from fractions containing microorganisms to remove lipoids and / or contaminants have already been described.
By extraction with a solvent or other treatment or methods of culturing microorganisms, a microorganism product can be obtained with which water and a substance foreign to the microorganism are associated. In certain cases, this substance has a boiling point such that it can be substantially completely evaporated under suitable conditions, some of the water mentioned remaining in connection with the microorganism; a substance that exhibits this character is hereinafter referred to as a vaporisable substance.
We have found that, under certain conditions, evaporation of the fluids associated with the microorganism can result in a microorganism product in which some of the vaporizable material cannot be removed by conventional methods such as drying B. heating or a further extraction with a solvent, can be removed.
We have also found that in the presence of a certain amount of water the microorganism does not form this compound (at least not in a way that prevents the removal of the vaporizable substance).
We have also found that the removal of part of the water and in certain cases all of the water mass from the material containing the microorganism can be achieved without the formation of the mentioned compound.
The method according to the invention for cleaning a material containing microorganisms from vaporizable substances is characterized in that a material containing microorganisms, water and another vaporizable substance, in which the water is present in an amount of over 20 seconds, based on the dry weight of the microorganisms, is treated such that at least some or all of the vaporizable material other than water is removed while at least 20% water, based on the dry weight of the microorganisms, is retained in association with the microorganisms.
A particular embodiment of the process consists in treating the material containing microorganisms in such a way that part or all of the water is removed and a concentrate containing microorganisms is obtained which still contains at least 20% water, based on the dry weight of the microorganisms, whereupon the vaporizable substance or its residue is removed from the concentrate.
It is clear that special care is required to ensure that the vaporizable material is removed from association with the microorganism while maintaining at least 20% by weight of water in association with the microorganism.
The vaporizable material can be produced by using heat and / or reduced pressure under conditions such that (a) the removal thereof takes place before the removal of water or (b) under such conditions that the vaporizable material and the water are removed together, whereby at least part of the liquid removed in this way is replaced by adding water to the microorganism, can be removed.
The above method (a) can be carried out by a multistage and preferably two-stage evaporation or by using a separating agent for the preferential removal of the evaporable substance.
It is also possible to proceed in such a way that a material containing microorganisms. which contains a microorganism in association with (a) excess water with respect to the water present in the living microorganism in the dry state and (b) an above-mentioned vaporizable substance, said material being kept under such conditions. that the vaporizable substance is removed by evaporation, while some of the water remains in connection with the microorganism.
Optionally, the method can be used with a material described above in which the vaporizable material has a boiling point near or above that of water. In this case, the microorganism-containing material can be treated by keeping it at a suitable temperature and / or reduced pressure with the addition of water in order to keep water associated with the microorganism. A deposition agent can be used if necessary.
The method is particularly suitable for treating a material containing microorganisms. in which the above-mentioned vaporizable substance has a boiling point below that of water: such a substance is hereinafter referred to as a volatile substance for reasons of convenience.
The process can also be carried out in such a way that one is at one temperature. where the volatile is removable under the prevailing conditions but operates under that where the water is removed at a substantial rate by evaporation.
while the volatile is removed by evaporation.
Initially, some of the water can be removed quickly, e.g. B. using an atomizer spray device, so that a material containing at least 20% by weight of water is obtained.
Preferably, the vaporizable material is removed by holding the microorganism close to a heated surface and preferably by keeping it in motion with respect to the surface.
A screw conveyor, which is supplied with heat, is suitable for this. If necessary, the screw conveyor can be provided with a heating jacket.
By appropriately distributing the heat to the screw conveyor and 'or the casing. if such is used, the screw conveyor can perform a dual function: it removes the vaporizable material while retaining a desired amount of water in the microorganism and then removes all or part of the remaining water.
The material containing the microorganism is expediently kept in motion with respect to the surface of the screw conveyor by means of baffle plates in the conveyor system which interact with a propeller. by means of which the mentioned material is conveyed through a pipe. The propeller expediently has a hollow shaft and is heated with steam. The auger is normally operated continuously, with fresh material being fed through a hopper. The system is preferably closed and kept under pressure by means of an inert gas so that atmospheric oxygen is at least largely excluded.
If desired, the vaporizable material and subsequently at least a portion of the remaining water can be removed from the microorganism by means of a tray dryer with a heated surface and a scraper for further conveyance of the material, the tray dryer usually being operated in batches.
If wanted. the product thus obtained can be processed further to remove all or part of the remaining water of the material. This can expediently be done by drying the product by means of an atomizer or by bringing it into contact by means of a heated screw conveyor.
For this purpose, a material is preferably used in which the total amount of the vaporizable substance does not exceed 50% by weight of the water associated with the microorganisms, not counting the water in the microorganisms in the dry state.
Vaporizable substances in the present sense are z. B.
Solvents used to extract contaminated microorganisms. The method is particularly suitable for removing normal hexane or isopropanol from the material.
The method is particularly suitable for the purification of materials obtained by cultivating microorganisms in the presence of hydrocarbons which can be consumed by these microorganisms for growth, and separating the microorganisms contaminated with hydrocarbons from the breeding mass and then the separated material with or without cleaning in the presence of Subjecting water to solvent extraction and then acting by a method described above.
The straight-chain hydrocarbons are usually present in culture media at the breeding stage as paraffins; however, they can also be present as olefins. A mixture thereof can also be used.
Suitable hydrocarbon media are kerosene, gas oils and lubricating oils; these culture media may have been unrefined or have undergone a refinement treatment, but it is advantageous if they contain a proportion of straight-chain hydrocarbons. The petroleum fraction usefully contains 345% by weight of straight-chain hydrocarbons.
The process according to the invention is of particular value for the treatment of petroleum-gas oil fractions which contain straight-chain hydrocarbons in the form of waxes, because a gas oil with an improved pour point is achieved and a more valuable product is thus obtained.
By using the process under conditions that limit the degradation of straight chain hydrocarbons, it is possible to proceed so that only a desired amount of these hydrocarbons is removed.
Microorganisms grown as described herein can be yeast, mold, bacteria, or mixtures thereof. They can preferably grow on certain normal paraffins.
The yeasts given here are obtained according to the methods described in The Yeasts, a Taxonomic Study by J. Lodder and W.J.W. Kreger-Van Rij, North Holland Publishing Co. (Amsterdam) (1952), outlined classification system classified.
The bacteria mentioned here are according to the in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology by R.S. Breed, E.G.D. Murray and N.R. Smith, Bailliere, Tindall and Cox (London), 7th Edition (1957), outlined classification system.
Yeasts suitable in the process preferably belong to the family of the Cryptococcaceae, in particular to the subfamily of the Cryptococcoideae; however, if necessary, z. B. ascosporogenic yeasts of the subfamily Saccharomycoideae can be used. Preferred genera of the subfamily of the Cryptococcoideae are Torulopsis (also known as Torula) and Candida.
Preferred types of yeast are as follows. (In particular, it is preferred to use the specific culture media with the specified Baarn code number; these code numbers refer to the CBS culture media of the Central Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland, and on
INRA culture media from the Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, France.)
Candida lipolytica
Candida pulcherrima CBS 610
Candida utilis
Candida utilis, Variati CBS 841 major
Candida tropicalis CBS 2317
Torulopsis colliculosa CBS 133
Hansenula anomala CBS 110
Oidium lactis
Neurospora sitophila
Mycoderma cancoillote INRA: STV 11
Candida lipolytica and C. tropicalis are particularly preferred.
If desired, the microorganism can be a bacterium.
The following classes of bacteria are expediently used: Pseudomonadales, Eubacteriales and Actinomycetales.
The bacteria used preferably belong to the families of the Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actincycmycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae and Pseudomonadaceae. Preferred species are the Bacillus megaterium, the Bacillus subtilis and the Pseudomonas aeruginosa.
Other types that can be used are:
Bacillus amylobacter
Pseudomonas natriegens
Arthrobacter sp.
Micrococcus sp.
Corynebacterium sp.
Pseudomonas syringae
Xanthomonas begoniae
Flavobacterium devorans
Acetobacter sp.
Actinomyces sp.
Nocardia opaca
These bacteria grow in the presence of the following aqueous nutrient medium: NH4Cl 0.5 g NaCl 4g MgSO4 7H20 0.5 g NaHPO4 12H20 0.5 g KH2PO4 0.5 g water q.s. ad 1000 ml
The pH of this medium is preferably kept at 7.
Another aqueous nutrient medium is: K2HPO4 1 g KH2PO4 0.5 g MgSO47H2O 0.5 g CaC12 0.1 g NaCl 0.1 g water q.s. ad 1000 ml
A suitable nutrient medium for yeasts and molds has the following composition: (NH4) 2HPO4 2 g KCI 1.15 g MgSO4 7H20 0.65 g ZnS04 0.17 g MnSO4 4H20 to 3z0 0.045 g FeSOJ7H20 0.068 g tap water 200 ml yeast extract 0.025 g distilled Water (qsad 1000 ml)
The growth of the microorganisms used is favored by adding to the culture medium a very small amount of yeast extract (an industrial product rich in essential nutrilites, i.e. growth factors obtained by the hydrolysis of a yeast) or, more generally, the essential nutrilites.
The essential nutrilites include biotin, pantothenic acid, nicotinic acid, thiamine, inositol and pyridoxine. The amount of yeast extract added is preferably on the order of 25 parts per million. The amount of Nutrilit required varies between about 0.1 parts per million in the case of biotin and about
10 parts per million in the case of inositol.
The aqueous nutrient medium is preferably kept at the desired pH by adding an aqueous medium with a high pH value in portions or continuously. Usually when using molds or yeasts and especially when using Candida lipolytica, the pH of the nutrient medium is kept in the range of 3-6, preferably 4-5. (Bacteria require a higher pH, usually 6.5-8.) Suitable alkaline substances as additives to the nutrient medium are e.g. B. sodium hydroxide, potassium hydroxide, disodium hydrogen phosphate and ammonia, either as such or in aqueous solution.
The optimum temperature of the culture medium will vary depending on the type of microorganism used and is usually in the range of 25-35oC. When using Candida lipolytica, the preferred temperature range is 28-320C.
The uptake of oxygen is essential for the growth of the microorganism. The oxygen is usually supplied as air. In order to ensure a rapid growth rate, the air used to obtain oxygen should be in the form of fine bubbles. z. Be introduced by stirring, a sintered surface or by vortex aeration.
The cultivation is usually carried out continuously; If desired, a rudimentary approach can also be used.
After growth it is usually possible to separate the microorganism contaminated with some unassimilated food and aqueous nutrient medium from the bulk of the uningested food fraction. This separation is preferably carried out by pouring; in addition or alternatively it can be ejected. The fraction containing the microorganism is then preferably treated with an aqueous medium containing a surfactant.
Preferably, the fraction containing the microorganism is vigorously mixed with the aqueous surfactant and subjected to further separation, preferably by centrifugation, without any further growth period, a fraction containing the microorganism and an aqueous phase containing the separated hydrocarbon impurities being obtained. If necessary, the washing and separation steps can be repeated several times, each time using an aqueous surfactant in the washing step. After washing, it is necessary to wash in an aqueous medium free of surfactant; preferably with water. Again, a series of washing and separation stages can optionally follow.
The washing steps are preferably carried out until the hydrocarbon content of the microorganisms falls below 7%. based on the weight of the dry microorganisms. The hydrocarbon content mentioned is preferably less than 5 seconds.
As the surface active agents used for washing, cationic surface active agents such as. B. stearyltrimethylammonium chloride, nonionic surfactants such. B. the condensates of oleic acid and ethylene oxide, or anionic surfactants. such as B.
Sodium alkyl sulfates, can be used.
The fraction containing the microorganism is then usually extracted with a solvent. Preferably in a first extraction phase. which consists of one or more extraction stages, the contaminated solid material with a mixture of an alcohol and a hydrocarbon, with which it forms an azeotrope, extracted, said alcohol and the azeotrope-forming hydrocarbon in a volume ratio in the range of 30:70 until 70:30.
A multi-phase system is expediently used; In a second extraction phase, which consists of one or more extraction stages, the treated solid material can be extracted from the first phase with an azeotropic mixture of the alcohol and the azeotrope-forming hydrocarbon, whereupon the treated solid material is recovered.
Individually or after mixing, the extract fractions from the first and second extraction phase of a distillation phase, which consists of one or more distillation stages, can be used for the separate recovery of (a) an azeotropic mixture of the alcohol and the hydrocarbon forming an azoetrope, (b) an azeotropic mixture of the alcohol with water and (c) a residue fraction are fed, after which the substantially entire azeotropic mixture of the alcohol with water are mixed with a portion of the azeotropic mixture of the alcohol and the azeotrope-forming hydrocarbon, the portion being selected to be a mixture of the alcohol and the hydrocarbon forming an azeotrope to achieve these materials in a volume ratio in the range of 30:70 to 70:
: 30 contains, and the mixture obtained is returned to the first extraction phase.
The temperature of the extraction stages is expediently in the range of 30600C.
The hydrocarbon normal hexane, which forms an azeotrope, is expedient. Appropriate alcohol is ethanol, propanol, isopropanol or a butanol.
The process according to the invention is expediently carried out with a crude or partially refined product of the growth of microorganisms in a hydrocarbon medium in the presence of an aqueous nutrient medium.
If the microorganism is subjected to an extraction with a solvent, it preferably contains, in particular, 100-200% by weight of water (based on the dry weight of the pure yeast).
If necessary, the yeast can be mixed with water before extraction.
The ratio of water to all of the alcohol and the hydrocarbon forming an aezotrope in the stage or stages of the extraction phase or the first extraction phase is preferably in the range from 1: 4 to 1:10 by weight.
If desired, the extraction described above can be repeated, preferably after adding water to the yeast, in order to achieve a water content as in the first phase.
The hydrocarbons recovered in the extraction phase by extraction with a solvent can be returned to the culture phase of the microorganisms if they are still able to absorb them.
The material containing the microorganisms which is obtained after extraction with a solvent which contains water and a vaporizable substance is further treated as described above to remove part or all of the vaporizable substance.
Yeast which has been freed from all or part of its lipoids and contaminating hydrocarbons by one of the methods described above is new as an industrial product.
A preferred embodiment of the method consists in that a microorganism is cultured in a manner described above in the presence of a petroleum fraction consisting partly of straight-chain hydrocarbons with an average molecular weight corresponding to at least 10 carbon atoms per molecule, an aqueous nutrient medium and a gas containing free oxygen and from the mixture, on the one hand, the microorganism and, on the other hand, a petroleum fraction which has a reduced proportion of straight-chain hydrocarbons or from which the mentioned straight-chain hydrocarbons are free, is separated, whereupon the microorganism is treated as described above.
The process can be carried out batchwise or continuously.
Preferred methods that can be used to grow the microorganism and obtain the product are described in British Patent Nos. 914 567, 914 568 1107 584, 1,049,065 and 1,017,585.
example 1
A fermentation vessel made of stainless steel with a capacity of 60 liters was charged with 40 liters of an aqueous mineral nutrient medium of the following composition: g
Diammonium hydrogen phosphate 2
Potassium chloride 1.15
Magnesium sulfate 7H20 0.65
Zinc sulfate 0.17
Manganese sulfate 4H20 0.068
Ferrous sulfate 0.124
Yeast extract 0.030
Tap water 200 distilled water q.s.ad 1000 ml
20 liters of a 24 hour vaccine of Candida lipolytica on mixed normal hydrocarbons with 10-20 carbon atoms were then added so that the cell density was about 1 g dry matter per liter.
1.030 liters of heavy gas oil, i.e. H. 15 glLiters was then added; this amount is sufficient to bring the cell density to 2 g / liter.
The temperature of the culture was kept at 30 + 10C by water circulating in a ring consisting of the space between two concentric cylinders, the smaller of which was the fermentation vessel itself. It was ventilated and shaken in such a way that the amount of ventilation was 3 millimoles O2 per liter of medium per minute.
The pH was maintained at 4 by the addition of an ammonia solution introduced through an automatic pH control system. When the ammonia inflow reached 20 ml, the addition of gas oil was started. The gas had the following properties: specific gravity 0.870
Setting point + 15 "C
Boiling range 300-3900C
The rate of addition was determined by the theoretical needs of the culture, assuming a yield due to gas oil (dry yeast produced) (gas oil culture medium) of 10% by weight and a cell division time of 3 hours. This addition was made every hour until the total amount of gas oil was 200 g / l, i.e. H. Reached 13.81.
If you started with a cell density of 2 g / l, it was 15 g / l after 25 hours (at the end of the exponential growth phase).
The fermentation vessel was operated continuously at a dilution rate of 0.2 vol / vol / hour, the cell density remaining constant at 15 ml throughout the experiment.
Bouillon was continuously removed from the fermentation vessel and poured off, 65% of the used medium being removed and replaced in the recovered bouillon with 65% tap water.
0.5 g / l of the nonionic cleaning agent known under the trade name NI 29 was added to the above phase; After centrifuging, the following were individually recovered: used mineral medium 840 g / l gas oil not absorbed 110 g / l microorganism paste 50 gil
The microorganism paste was then rinsed with water at room temperature and centrifuged; the yeast obtained contained 65 to 70% water.
Water was then partially removed therefrom to make a yeast paste composed of 50% by weight of dry yeast and 50% water.
This wet yeast was then pumped into a puller consisting of a filter drum rotating about a horizontal axis. A mixed solvent consisting of 50% hexane and 50% isopropanol was added to the wet yeast in a ratio of 8 parts of mixture per part of dry yeast. The whole mixture, namely yeast + water + solvent. was kept at 60C for 30 minutes. Then the solvent containing the majority of the yeast contaminants was removed.
This cleaning procedure was then repeated.
Table 1 below gives the composition of the extracted product.
Tables
Moisture 68.4 wt. 6T
Nitrogen 10.5 wt. Sc dry yeast
Lipoids 0.3 wt. 6Rc dry yeast
Remaining hexane 6.8 wt. Sc dry yeast
Remaining isopropanol 31.0 wt. Wc dry yeast
The recovered solvents were mixed and then subjected to distillation to recover both an azeotropic mixture of isopropanol and normal hexane and an azeotropic mixture of alcohol and water and a residue containing all lipids and impurities. These azeotropic mixtures were then mixed for reuse.
The yeast paste extracted with a solvent was then fed to a tray dryer which had a heated surface kept clean by four scrapers made of stainless steel and operated continuously at atmospheric pressure. The removal of solvent residues and water was carried out according to the information in Table 2 below.
Table 2
Operating conditions Composition of the yeast paste
Duration Temp. Pressure Humidity Hexane IPA in OC wt-C? C wt-ec wt-ec min.
Product 0 60 atm. 68.4 6.8 31.0 medium
15 84 atm. 55.9 <0.05 15.2
30 94 atm. 34.4 <0.05 0.2
45 106 atm. 6.2 <0.05 <0.7
60 117 atm. 1.9 <0.05 <0.2
65 120 atm. 1.6 <0.05 <0.2
As can be seen, the yeast product was almost completely solvent removed and almost completely dry after one hour. First hexane was removed and then IPA (isopropyl alcohol) and finally water ..
Example 2
The yeast C. lipolytica was grown, recovered and extracted as described in Example 1. As described, a wet yeast paste containing solvent was obtained.
This wet product was then passed several times through a screw conveyor dryer which had a trough provided with a jacket and a lid and the following features:
Total volume 30 dm3
Pressure in the trough 1 atmosphere
Pressure in the double wall of 10 atmospheres
Troughs
Exchange surface 0.4 m2
Exit temperature of the steam 142 "C on the double wall
The screws have a double jacket in which
Steam was circulated at a pressure of 2.5 atmospheres
Diameter 130 mm
Length 900 mm
Pressure 10 atmospheres
Revolutions per minute 1
Exchange surface 0.45 m2
The entire front surface of the helix was provided with scraper-acting Teflon strips.
All surfaces in contact with the treated product were made of stainless steel.
Table 3 below gives the test and analysis values:
Table 3
Composition of yeast
Weight moisture IPA hexane kg wt .-% wt .-% wt .-%
Medium to the dryer 269 74.9 35.7 7.7
After: 188 61.1 20.7 tracks
1st round
2nd round 135 47.9 3.4 0
3rd round 115 38.3 0.7 0
4th round 102 30.0 0.4 0
5th round 93 24.9 0.2 0
After five passes, the product was entirely solvent-free, but some water remained. To eliminate this, three more passes were required.
Example 3
C. lipolytica yeast was grown, recovered and extracted as in Example 1.
The wet product containing some solvent was fed continuously to a Holoflite auger.
The temperature of the heated surfaces of the screw conveyor was 1600C and the speed of the screw 1 revolutions per minute. The dryer also consisted of a trough provided with a jacket and a lid, which contained two 900 mm long screws with a diameter of 130 mm. The screws contained 2-5 kg of steam. The shell of the trough and the lid could be loaded with a pressure of 1 kg / cm2.
Heat exchange surface of the screws 0.9 m2 capacity of the dryer 111
The flow rate was 25-30 kg / h.
All surfaces of the apparatus in contact with the yeast paste were made of stainless steel.
The product (wet extracted yeast) was passed through the screw conveyor several times. The results are shown in Table 4 below.
Table 4
Operating conditions Composition of the yeast
Moisture Hexane IPA wt% wt% wt%
Product medium 63.4 3.7 26.9
1st run T = 160 C 55 (0.1 11.6
1 rpm
2nd pass T "= 160" C - - 0.9
1 rpm
3rd pass T "= 1600C 26 - .0.2
1 rpm
4th run T "= 160" C 15 - c0.1
1 rpm
5th round T "= 160" C 6 -
1 rpm
Hexane and IPA were removed entirely while water was slowly removed.
The final product obtained was a protein concentrate that was solvent free and had a low water content.
The surface-active agent NI 29 is of a nonionic type, which is obtained by condensation of ethylene oxide with lauryl alcohol, an ethylene oxide chain with an average of 8.5 units per molecule being formed.
Other surface-active agents which can be used in the process according to the invention are e.g. B. (a) an anionic surfactant obtained by sulfating said nonionic surfactant (i.e. an oxyethylene lauric alcohol sulfate) and (b) a nonionic surfactant obtained by condensing ethylene oxide with a mixture of lauryl alcohol and myristic alcohol.
Example 4 (purification of a bacterium)
40 liters of an aqueous nutrient medium of the following composition: K2HPO4 1 g KH2PO4 0.5 g MgS047H20 0.5 g NaCl 0.1 g Fe SO4 '7H2n 0.02 g yeast extract 0.03 g water up to 1000 ml were in a 60 liter capacity Giving stainless steel fermentation vat. Then 20 liters of a 24-hour-old inoculation of Bacterium Microccoccus certificaus on a mixture of normal C7 to C20 hydrocarbons were added in such an amount that the cell density was about 1 g dry matter per liter.
For cultivation, the culture was kept at a temperature of 26 1 l by means of water circulating in a second vat, which was cylindrical around the fermentation vessel.
The pH of the fermentation broth was kept neutral (7) by means of automatic adjustment by adding aqueous ammonia.
In addition, the following properties were added to gas oil in an amount of 180 g per liter of fermentation broth: spec. Weight 0.865
Pour point 1 5OC
Boiling range 265-3800C
When the amount of dry matter per liter reached 15 g, fermentation took place with a decrease in concentration of 0.2 volume per fermentation volume per hour, while the amount of dry matter was kept constantly at 15 g / l.
Fermentation broth was continuously drawn off from the fermentation vat and subjected to decanting, 65% of the nutrient medium used being removed from it and replaced by the same amount of tap water.
Then 1 g / l of a cleaning agent (Laural 746) was added, the mixture was stirred vigorously and then centrifuged, separating into 830 g / l of used nutrient medium 100 g / l of unreacted gas oil and
70 g / l paste from microorganisms was achieved.
(Laural 746 is an oxyethylene lauryl sulfate.) The separated microorganism paste was then washed with fresh water at room temperature and then centrifuged. This gave a paste with a water content of 65%, which was further dehydrated until the water content was still 50%. This wet product was then treated as described for Candida lipolytica in Example 2, the same results being obtained.
N. B. The scope of protection of the patent is provided by Art. 2, No.
2, Pat. G. limited.