Verfahren zur Herstellung neuer Hexahydropyrrolobenzodiazepinone Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Hexahydro-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]benzodiazepin-5-one, welche antibiotische Eigenschaften und Wirkungen gegen über Phagen und Viren haben und zur Behandlung von Tu moren verwendet werden können.
Die Verbindungen weisen eine hohe Aktivität gegen ver schiedene Mikroorganismen, wie grampositive und gramne gative Bakterien, Mykobakterien, Pilze und Bakteriophagen
EMI0001.0000
in der R einen niederen Alkoxyrest bedeutet.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekenn zeichnet, dass man Streptomyces achromogenes var. tomay- myceticus A.T.C.C. 21 353 oder engverwandte Mutanten die ses Mikroorganismus in einem Nährmedium unter aeroben Submersbedingungen züchtet, und das gebildete, aus der Gärmaische isolierte oder nicht isolierte Antibiotikum mit einem Alkohol der Formel RH, in welcher R obige Bedeu tung besitzt, behandelt.
Der verwendete Mikroorganismus ist eine neuentdeckte Art von Streptomyces, die aus einer in Musashi-Koganei in Japan gesammelten Bodenprobe isoliert wurde. Eine Kultur des im folgenden mit Streptomyces achromogenes var. to- maymyceticus bezeichneten Organismus wurde bei der A.T.C.C., Rockville, Maryland (USA), unter der Nr. hinterlegt.
Das Verfahren ist nicht auf die Verwendung des genann ten, speziellen Organismus und auf die Verwendung der Or ganismen, die die hier zur Erläuterung beschriebenen Wachs tumseigenschaften und mikroskopischen Me-kmale aufwei sen, beschränkt. Ausdrücklich soll die Verwendung von Mu- auf. Eine stark viruzide Wirkung auf einige Viren wurde in vitro beobachtet. Eine weitere wichtige Eigenschaft der Ver bindungen ist ihre Fähigkeit, das Wachstum und die Entwick lung von bestimmten transplantierbaren und induzierten Tu moren zu hemmen. Wegen dieser antibiotischen Eigenschaf ten sind die Verbindungen von grossem Wert als Arznei stoffe bei der Behandlung verschiedener Krankheiten.
Die Verfahrensprodukte entsprechen der allgemeinen Formel: 21<B>353</B> tanten eingeschlossen sein, die durch verschiedene Verfah ren, wie Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit Stickstofflost und Einwirkung von Phagen, aus dem ge wünschten Organismus hergestellt werden können.
Ebenso sollen alle Mikroorganismen ungeachtet ihres Aussehens oder physiologischen Verhaltens eingeschlossen sein, die durch Transformation, Transduktion, genetische Re- kombination oder durch andere genetische Verfahren unter Verwendung von Nucleinsäuren aus den genannten Arten erhalten werden können, wobei der entstandene Mikroorga nismus die Fähigkeit hat, das hier beschriebene Produkt her zustellen oder die hier beschriebene biologische Umwand lung durchzuführen.
Zur Isolierung und Charakterisierung des Mikroorganis mus wird ein Teil der Bodenprobe in sterilem, destilliertem Wasser geschüttelt und auf Krainsky-Agarmedium aufgestri chen. Nach siebentägiger Inkubation bei 30 C werden Kolo nien von Streptomyces achromogenes var. tomaymyceticus A.T.C.C. 21 353 aus dem Medium isoliert und dann auf Ben- net-Agarmedium gezüchtet.
Die morphologischen Eigenschaften von Streptomyces achromogenes var. tomaymyceticus A.T.C.C. 21 353 nach 10- bis 14tägiger Züchtung bei 30 C auf Czapek-Agar sind nach stehend angegeben. Das Konidium ist sphärisch bis oval mit einer glatten Oberfläche. Es entsteht ein verzweigtes und ge rades oder leicht gekrümmtes, langes Luftmyzel mit spärli chem Wachstum.
Die Züchtgungseigenschaften und physiologischen Merkmale des neuen Stammes Streptomyces achromogenes var. tomaymyceticus in einer Anzahl von Nährmedien sind nachstehend angegeben. Die Beobachtungen wurden nach 10- bis 14tägiger Züchtigung bei 30 C gemacht. Wenn nicht anders angegeben, wurden die hier beschriebene Züchtungs dauer und Züchtungstemperatur verwendet.
Czapek-Agar: Weisses bis blassgelbliches, kolonienähnli ches Wachstum; spärliches Wachstum eines pulvrigen, weis sen Luftmyzels; kein lösliches Pigment.
Stärke-Ammoniumagar: Schwach gräuliches Wachstum mit pulvrigem, dunkelgrauem Luftmyzel; kein lösliches Pig ment. Schwach diastatische Wirkung.
Glucose-Asparagin-Agar: Weisses bis hell elfenbeinfarbe nes, kolonienähnliches Wachstum; kein Wachstum oder spär liches Wachstum eines pulvrigen, weissen Luftmyzels; kein lösliches Pigment.
Calciummalat-Agar; Cremefarbenes Wachstum mit pulv rigem, weissem bis dunkelgrauem Luftmyzel; kein lösliches Pigment, Calciummalat wird löslich gemacht.
Tyrosin-Agar: farbloses oder hellbräunliches, vegetatives Wachstum ohne Bildung von Luftmyzel und löslichem Pig ment.
Bouillon-Agar: Cremefarbenes, kolonienähnliches Wachs tum ohne Luftmyzelbildung; Herstellung von bräunlichem, löslichem Pigment. Keine Herstellung von Schwefelwasser stoff nach 7tägiger Inkubation.
Bennett-Agar: Hellcremefarbenes, kolonienähnliches Wachstum; keine Bildung von Luftmyzel und löslichem Pig ment. Nach Inkubation bei 37 C entsteht ein bräunliches, ko lonienähnliches Wachstum mit pulvrigem, dunkelgrauem Luftmyzel und ein braunes, lösliches Pigment.
Glucose-Bouillon: Cremefarbenes, kolonienähnliches Wachstum mit braunem, löslichem Pigment; kein Wachstum von Luftmyzel.
Glucose-Czapek-Lösung: Oberflächenwachstum spärlich, farblos, kolonienähnlich mit spärlichem Wachstum eines pulvrigen, weissen Luftmyzels und keine Bildung von lösli chem Pigment. Nitrat wird nicht oder nur schwach zu Nitrit reduziert.
Gelatine-Schrägkultur: Cremefarbenes Wachstum ohne Bildung von Luftmyzel und löslichem Pigment nach 21tägige Inkubation bei 15 bis 20 C. Es wird eine schwache Verflüssi gung von Gelatine beobachtet.
Lackmusmilch: Die Kultur wächst als cremefarbener Ring auf der Oberfläche. Es wird ein matt gräulichbraunes, lösliches Pigment gebildet. Leichte Peptonisierung, aber keine Koagulation.
Kartoffelscheiben: Gräulichcremefarbenes, vegetatives Wachstum mit runzliger Oberfläche; spärliches Wachstum eines pulvrigen, weissen Luftmyzels; Bildung von dunkel braunem, löslichem Pigment.
Cellulose-Agar: Es wird kein Wachstum mit Ammonium- oder Nitrationen als Stickstoffquellen beobachtet.
Die Verwertung von Kohlenstoffquellen wurde nach 7tä- giger Inkubation bei 30 C nach dem Verfahren von Pridham und Gottlieb untersucht.
a) Zu den gutverwerteten Substraten gehören: Glucose, Xylose, Mannose, Fructose und Mannit.
b) Zu den mässig verwerteten Substraten gehören: Atabi- nose, Rhamnose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Raffi nose und Inosit. c) Zu den wenig verwerteten Substraten gehört: Salicin. Das neue Antibiotikum wird hergestellt, wenn Strepto- myces achromogenes var. tomaymyceticus in einem Nähr medium unter kontrollierten aeroben Submersbedingungen gezüchtet wird. Bei der Züchtung können eine Reihe von Nährmedien verwendet werden. Es wurde festgestellt, dass die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn ein wässriges Nährmedium verwendet wird, das eine assimilierbare Koh lenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle oder ein proteinhaltiges Material enthält.
Als assimilierbare Koh lenstoffquellen können verwendet werden: mehrwertige Al kohole und Mono-, Di- und Polysaccharide, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Zucker, brauner Zucker, Stärke, Mais stärke, Galactose, Dextrin, Glycerin oder Melassen. Als Pro teinmaterialien können unveränderte Proteine und Protein abbauprodukte verwendet werden, insbesondere Produkte, die bei der Proteinhydrolyse entstehen.
Als assimilierbare Stickstoffquellen und Proteinquellen können verwendet wer den: Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Baumwoll- samenmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, pankreatisch gespal tenes Kasein, die bei der Branntweindestillation anfallenden löslichen Rückstände, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch extrakt, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt und Knochen mehl und Knochenstücke und anorganische Materialien, wie Nitrate und Ammoniumsalze. Diese vorzugsweise in Kombi nation verwendeten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen müs sen nicht in reiner Form eingesetzt werden, da sich weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen von Mineralnährstoffen enthalten, sehr gut eignen.
Gegebenenfalls können sie zusammen mit Mineralsalzen, wie Natriumchlorid und Kaliumchlorid und Puffersubstanzen, wie Calciumcarbonat und Calciumphos phat, verwendet werden. Nötigenfalls wird ein Mittel zur Verhinderung von Schaumbildung, wie flüssiges Paraffin, ein höherer Alkohol oder Silicon, dem Nährmedium zugesetzt.
Zur Erreichung eines maximalen Wachstums und Ent wicklung von Streptomyces achromogenes var. tomaymyce- ticus soll das Nährmedium vor dem Animpfen mit dem Or ganismus auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise von 6,0 bis 7,0 gebracht werden. Es wurde festgestellt, dass das Nährmedium während der Wachstumsperiode des Orga nismus und der Herstellung des Antibiotikums vorteilhafter weise im pH-Bereich zwischen 6,0 und 6,5 gehalten wird. Die besten Ausbeuten an Antibiotikum erhält man bei einer Züchtungstemperatur von 25 bis 37 C und einer Züchtungs dauer von 40 bis 80 Stunden. Nach Ablauf dieser Dauer ist eine beträchtliche Menge an Antibiotikum entstanden.
Für die Herstellung von kleineren Mengen des Antibioti kums kann das Submersverfahren in kleinen Flaschen, die auf geeignete Weise geschüttelt oder gerührt werden, durch geführt werden. Zur Züchtung von grossen Volumina des angeimpften Nährmediums können grosse Tanks oder Fäs ser, wie sie üblicherweise in der Fermentationsindustrie ver wendet werden, eingesetzt werden. Zur Herstellung von grossen Mengen wird die Verwendung der vegetativen Form des Organismus zum Animpfen der Tanks oder Fässer bevorzugt, um eine Wachstumsverzögerung bei der Herstel lung des Antibiotikums zu vermeiden.
Demgemäss ist es wünschenswert, zuerst ein vegetatives Inoculum des Orga nismus durch Animpfen einer relativ kleinen Menge des Nährmediums mit der Sporenform des Organismus herzustel len und dann das vegetative Inoculum aseptisch auf grosse Tanks oder Fässer zu übertragen. Das vegetative Inoculum kann in dem gleichen oder in einem verschiedenen Nährme dium, wie es zur Herstellung des Antibiotikums verwendet wird, hergestellt werden.
Bewegen und Belüften des Züchtungsgemisches kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Die Bewegung kann durch einen Propellerrührer oder ähnliche mechanische Be wegungsvorrichtungen, durch einen Dreh- oder Schüttelfer- menter, durch verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch Hindurchleiten eines sterilen Luftstromes durch das Medium erreicht werden. Die Belüftung kann durch Einblasen eines sterilen Luftstroms in das Züchtungsgemisch oder durch Sprühen, Spritzen oder Giessen der Gärmaische in oder durch eine entsprechende Atmosphäre erreicht werden.
Nach dem Filtrieren oder Zentrifugieren der Gärmai- sche kann das Antibiotikum aus dem Züchtungsmedium nach üblichen, bei der Gewinnung von anderen Antibiotika verwendeten Extraktions- oder Adsorptionsverfahren ge wonnen werden. Die Extraktion kann vorzugsweise mit pola ren organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden, z. B. mit Alkoholen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropa- nol und Butanol, Alkylestern von Fettsäuren, wie Äthylace- tat; Ketonen, wie Aceton; chlorierten Kohlenwasserstoffen, wie Chloroform; und Pyridin. Ebenso können andere Lö sungsmittel von ähnlichem Charakter verwendet werden.
Vorteilhafterweise wird ein Gemisch dieser Lösungsmittel verwendet. Eine andere Möglichkeit zur Gewinnung des An tibiotikums aus der Gärmaische besteht in der Verwendung eines Adsorptionsmittels, wie Kieselgur, aktiviertes Alumi niumoxid, Kieselgel, Aktivkohle und Kieselsäure. Das Anti biotikum kann durch Verwendung eines polaren, organi schen Lösungsmittels, in dem es sich löst, leicht eluiert wer den. Ein geeignetes Verfahren zur Gewinnung des Antibioti kums aus dem Extrakt oder dem Eluat umfasst das Eindamp fen des Lösungsmittels bis zu einem verhältnismässig gerin gen Volumen und das Ausfällen des Antibiotikums durch Zu gabe eines Lösungsmittels, in dem das Antibiotikum unlös lich ist. Das Antibiotikum wird anschliessend durch Umkri stallisieren oder Chromatographieren gereinigt.
Geeignete Lösungsmittel zum Umkristallisieren sind wasserhaltiges Aceton, wasserhaltiges Methanol und andere Lösungsmittel, in denen das Antibiotikum eine gewisse Löslichkeit besitzt. Zur Gewinnung des Antibiotikums geeignete Adsorptions mittel können auch mit Erfolg zur chromatographischen Reinigung verwendet werden. Ebenso können dazu zur Ge winnung des Antibiotikums geeignete Elutionsmittel verwen det werden. Das nach den im wesentlichen oben beschriebenen Ver fahren isolierte Antibiotikum liegt in Form eines Pulvers vor.
Dann löst man das pulverförmige Antibiotikum in einem Alkohol der allgemeinen Formel R-H, in der R ein niederer Alkoxyrest ist, und lässt die Lösung zur Bildung von kristalli nem Material abkühlen. Beispiele verwendbarer Alkohole sind Methanol, Äthanol, Propanol und Isopropanol. Zur Erreichung einer maximalen Ausbeute wird die Re aktion vorteilhafterweise in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt. Beispiele für solche Lösungsmittel sind Methy- lenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Essigsäu- reäthylester. Die Reaktionstemperatur ist nicht besonders kritisch. Vorzugsweise wird die Reaktion bei 25 bis 35 C durchgeführt.
Der Rest der genannten Alkohole wird in 11 -Stellung des Ringsystems eingeführt. , Die erhaltenen Verbindungen können durch Umsetzung mit einem eine niedere Alkanoyl- oder eine Aroylgruppe ab gebenden Acylierungsmittel oder mit einem eine niedere Al kylgruppe abgebenden Alkylierungsmittel in entsprechende 8-Alkanoyloxy- oder 8-Aroyloxy- bzw. 8-Alkoxyverbindungen übergeführt werden. Das Ringsystem wird folgendermassen numeriert:
EMI0003.0012
Die Acylierungsreaktion kann durch Umsetzung der Ver bindung der allgemeinen Formel I mit einem Acylierungsmit- tel in einem Lösungsmittel, wie Pyridin, durchgeführt wer den. Alle Acylierungsmittel, die einen Acylrest liefern kön nen, der mit einer Hydroxylgruppe in der 8-Stellung reagiert, können verwendet werden.
Dazu gehören die freien Carbon- säuren, die Säurehalogenide, Säureanhydride und Ester. Spe zielle Beispiele für verwendbare Acylierungsmittel sind Es sigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, p-Brombenzoesäure, ihre Chloride und Bromide, ihre Anhydride und ihre Methyl- und Äthylester. Die Umsetzung mit diesen Acylierungsmit- teln geschieht vorzugsweise bei Raumtemperatur oder unter Kühlen der Lösung. Verfahren, bei denen das Reaktionsge misch gekühlt wird oder das Acylierungsmittel in ein eiswas sergekühltes Gemisch gegossen wird, führen zur Bildung der acylierten Verbindungen.
Diese acylierten Verbindungen können zur Kristallisation gebracht werden, indem man das Reaktionsgemisch z. B. in Wasser eingiesst, das ausgefällte Rohprodukt abfiltriert, gegebenenfalls chromatographisch reinigt und aus einem Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Methanol, umkristallisiert.
Zur Alkylierung wird die Verbindung in einem Lösungs mittel wie Methanol mit einem Alkylierungsmittel versetzt. Übliche verwendbare Alkylierungsmittel, die mit der Hydro xylgruppe in der 8-Stellung der Verbindung reagieren, sind z. B. Diazoalkane und Dialkylsulfate. Spezielle Beispiele für verwendbare Alkylierungsmittel sind Diazomethan, Diazo- äthan und Dimethylsulfat. Während der Alkylierungsreaktion wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise gekühlt. Das Reak tionsgemisch wird z. B. in einen Kühlschrank gestellt, nach beendeter Umsetzung zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Methanol gelöst. Die Methanollösung wird mit Äther versetzt, die Ätherlösung auf 0 C abgekühlt. Hierbei kristallisiert die alkylierte Verbindung aus.
Die Verbindungen und ihre durch die angegebenen Reak tionen daraus hergestellten Derivate weisen eine hohe Akti vität gegen eine Anzahl von Mikroorganismen auf. Die Un tersuchungen wurden mit der 11-Methoxy-Verbindung, d. h. dem 1,2,3,10,11,11a-Hexahydro-2-äthyliden-7,11-dimethoxy-8- hydroxy-SH-pyrrolo[2,1-cI1,4]-benzodiazepin-5-on, durchge führt. Die Aktivität der Verbindung wird durch die Mindest hemmkonzentration (MIK) ausgedrückt, welche nach der üb lichen Reihenverdünnungsmethode bestimmt wurde. Die Un tersuchungen wurden für Bakterien mit einem Glucose-Bouil lon-Nährboden und für Pilze und Hefe mit einem Sabouraud- Nährboden durchgeführt.
Das Untersuchungsmedium wurde 24 bis 72 Stunden bei inkubiert und die MIK-Werte werden durch die Konzentration der Verbindung in g/ml ausgedrückt, die das Wachstum des Organismus verhinderte.
Man erhielt die folgenden Ergebnisse.
EMI0003.0027
Testorganismus <SEP> MIK, <SEP> g/ml
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 6,2
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> A.T.C.C. <SEP> 6633 <SEP> 12,5
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 25,0
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 25,0
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100,0
EMI0004.0000
Testorganismus <SEP> MIK, <SEP> g/ml
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100,0
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 50,0
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Q-176 <SEP> 25,0
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 50,0
<tb> Torula <SEP> utilis <SEP> 50,0
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 50,0 Die Wirkungen der 11-Methoxyverbindung auf Bakterio phagen bei in-vitro-Untersuchungen sind nachstehend ange geben.
Bei den Untersuchungen wurde 1 ml einer 2 x 104 Partikel des Testphagen pro ml enthaltenden Suspension in 0,01m TriS-HCl-Puffer (pH-Wert 7,2) zu jeder Verdünnung (1 ml) der Proben der zu untersuchenden Verbindung im ge nannten Puffer zugesetzt. 0,1 ml des Gemisches wurde 1 Stunde bei 37 C inkubiert und in eine Petrischale mit 1,5 % Nähragar gegossen. Die Phagenzählung wurde nach der Tropfenmethode mit dem entsprechenden Wirtstamm durchgeführt, wobei die Menge, die gerade 50 % der Phagen inaktivierte, in g/ml ausgedrückt ist.
EMI0004.0001
Testphagen <SEP> Konzentration <SEP> zur
<tb> Inaktivierung
<tb> von <SEP> 50 <SEP> <B>%</B> <SEP> der
<tb> Phagenaktivität,
<tb> ug/ml
EMI0004.0002
Einige der Verbindungen der Erfindung besitzen auch Antiviren- und Antitumor-Aktivität.
In vitro war die 11-Methoxyverbindung gegen den DNA- Virus Herpes simplex hominis aktiv. Bei diesen Experimen ten wurden Dosen von 0,1 und 0,05 mg/ml in 10 % Dimethyl- sulfoxid enthaltendem destilliertem Wasser in Reagenzglä sern mit gleichen Teilen einer Virussuspension in Hankscher Lösung bei einer Verdünnung von 10-35 vermischt. Nach verschiedenen Kontaktzeiten bei 22 C wurden Dosen von jeweils 0,2 ml, eine Menge, die vorher in Hankscher Lösung einer LD95 entsprach, intraperitoneal einer willkürlich ge wählten Gruppe von 10 männlichen Mäusen des Stammes NMRJ von 15 bis 19 g Gewicht verabreicht.
Einer Kontroll- gruppe von 10 Mäusen wurden 0,2 ml des Gemisches aus der Virussuspension und einer Lösung von 10 % DMSO in destilliertem Wasser ohne die 11-Methoxy-Verbindung verab reicht.
Die 100%ige Sterblichkeit der Kontrollgruppe vermin derte sich bei 1- bis 4stündiger Kontaktzeit auf 20 % und auf 0 nach 6stündiger Kontaktzeit. Dies bedeutet, dass die Viru lenz dieses DNA-Virus teilweise oder vollkommen durch die 11-Methoxy-Verbindung zerstört wird.
Die 11-Methoxy-Verbindung zeigt ferner eine vollstän dige Hemmung von verschiedenen transplantierbaren Asci- tes-Tumoren, wie Ehrlich-Karzinom und Cr. Sarkom 180 bei Mäusen, Stamm NMRJ, und Yoshida-Sarkom, Stämme AH 66 R und AH 130, bei Wistar-Ratten. Bei intratumoraler Ver abreichung ist sie auch gegen das feste Walker-Carcino-Sar- kom wirksam. Die Leukämiestämme L-1210-5 und L-1210-8 (6-mercaptopurin-resistent) werden teilweise gehemmt.
Die Verlängerung der Oberlebenszeit mit der gut verträglichen Dosis von 0,125 mg/kg bei 4 intraperitonealen Verabreichun- gen an 4 aufeinanderfolgenden Tagen beträgt bei L-1210-S 26 bis 50 % und bei L-1210-8 51 bis 75 %.
Bei all diesen Untersuchungen mit transplantierbaren As- cites-Tumorstämmen wurde den Mäusen oder Ratten eine bestimmte Menge an Zellen oder an Zellenmaterial in Hank- scher Lösung transplantiert. Diese Dosen verursachten 100%igen Tumorbefall. Willkürlich gewählte Gruppen von 8 Tieren pro Dosis bei Ratten oder 10 Tieren pro Dosis bei Mäusen wurden zum ersten Mal 4 Stunden nach der Trans plantation mit einer Dosis der 11-Methoxy-Verbindung und an den folgenden 3 Tagen jeweils mit der gleichen Dosis be handelt. Dabei wurden Lösungen in Triäthylenglykol mit 90 % destilliertem Wasser verwendet.
Eine einzelne Dosis für Mäuse bestand aus 0,5 ml pro 20 g und bei Ratten aus 1 ml pro 100 g, wobei diese Dosen schliesslich auf kg umge rechnet wurden.
Die Aktivität der 11-Methoxy-Verbindung war dosisab hängig, aber eine 99%ige Hemmung wurde noch beobachtet bei einer Dosis von 0,0625 mg/kg i. p. bei Ascites-Tumoren, Ehrlich-Karzinom und Cr. Sarkom 180 (Maus) und von 0,1 mg/kg i. p. und von 0,05 mg/kg i. p. bei Yoshida-Sarkom AH 66 R bzw. Yoshida-Sarkom AH 130 (Ratte).
Alle verabreichten Dosen wurden von den Versuchstie ren gut vertragen.
Die Verbindungen der Erfindung können als Arzneistoffe in Form von Arzneipräparaten verwendet werden, die das Antibiotikum oder seine Derivate im Gemisch mit einem pharmakologisch verträglichen, organischen oder anorgani schen, festen oder flüssigen Träger, der sich für orale oder parenterale Verabreichung eignet, verwendet werden. Die Arzneipräparate können feste Formen haben, wie Kapseln, Tabletten oder Dragees, oder flüssige Form, wie Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Gegebenenfalls können den Präparaten Hilfsstoffe zugesetzt werden, z. B. Konservie rungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netz- oder Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks und Puffer.
Die Dosierung der Verbindungen variiert von Verbindung zu Verbindung und hängt auch vom Alter und dem Zustand eines Patienten ab, doch ist eine Tagesdosis von ungefähr 20 mcg/kg der Verbindung im allgemeinen wirkungsvoll.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Auf schräggestelltem Agar gezüchtetes vegetatives Wachstum und Sporen von Streptomyces achromogenes var. tomaymyceticus A.T.C.C. 21353 wurden in eine 500-ml-Flasche, die 100 ml des folgenden Nährmediums ent hielt, verbracht.
EMI0004.0026
<U>Bestandteile <SEP> Gew:</U>
<tb> Lactose <SEP> 3
<tb> Fleischextrakt <SEP> 1
<tb> Hefeextrakt <SEP> 1
<tb> Polypepton <SEP> 1
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,25 Dieses Medium wurde sterilisiert und mit dem oben ge nannten Agar angeimpft. Es wurde 3 Tage bei 30 C geschüt telt.
In einen 2-Tonnen-Tank aus nichtrostendem Stahl wur den 1000 Liter eines Nährmediums der folgenden Zusam mensetzung eingefüllt.
EMI0005.0000
Bestandteile <SEP> Gew: <SEP> %
<tb> Lactose
<tb> Fleischextrakt <SEP> 1
<tb> Hefeextrakt <SEP> 1
<tb> Polypepton <SEP> 1
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,25
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0,25
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 1,5
<tb> Natriumhydrogenphosphat <SEP> (12 <SEP> H20) <SEP> 0,43 Der pH-Wert des Mediums wurde auf 6,1 eingestellt. Das Nährmedium wurde durch 30minutiges Erhitzen auf unge fähr 120 C unter Druck sterilisiert. Das Medium wurde ab gekühlt und ungefähr 1 ml des oben beschriebenen Animpf mediums wurde aseptisch zugesetzt. Der Organismus wurde 50 bis 60 Stunden bei einer Temperatur von 30 C im Me dium gezüchtet.
Während der Wachstumsperiode wurde die Gärmaische mit einem Propellerrührer bei 350 Upm gerührt und mit ste riler Luft in einer Menge von 1000 Liter/Minute belüftet.
Nach Beendigung der Züchtung wurde das Myzel abzen trifugiert. Der Überstand wurde 30 Minuten mit 5 kg Aktiv kohle gerührt. Anschliessend wurde das Gemisch filtriert und die Aktivkohle zwei Mal mit 100 Liter eines Gemisches aus Pyridin, Ammoniak, Äthanol und Wasser in einem Ver hältnis von 10 : 3 : 80 : 10 unter Erwärmen auf 45 C 30 Minu ten eluiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck bei 50 C eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhielt 1,6 kg pulverförmiges Produkt. Das Pulver wurde in ungefähr 10 Liter n-Hexan gewaschen und in Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 2 bis 3 eingestellt. Die ange säuerte Lösung wurde 4 Mal mit je 5 Liter Chloroform ex trahiert.
Der Chloroformextrakt wurde mit 5%iger wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und unter vermindertem Druck bei 50 C einge dampft. Es entstand ein öliger Rückstand, der in Petroläther aufgenommen wurde, wodurch sich ein Pulver ausschied. Durch Filtrieren der Petrolätherlösung erhielt man ungefähr 20 g eines Pulvers, das in 100 ml Essigsäureäthylester gelöst wurde, in einer Säule an Kieselsäure adsorbiert und mit un gefähr 8 Liter Essigsäureäthylester eluiert wurde. Das Eluat wurde fast zur Trockne eingedampft und anschliessend mit ungefähr 30 ml Methanol versetzt. Nach 2tägigem Stehenlas sen bei -20 C scheiden sich Kristalle aus, die abfiltriert wurden. Man erhielt 1,8 g Rohprodukt, das anschliessend in ungefähr 30 ml warmem Methanol gelöst wurde. Man liess die Methanollösung bei 2 Tage bei -20 C stehen.
Es ent- standen 1,2 g von reinem, kristallinem 1,2,3,10,11,11a-Hexahy dro-2-äthyliden-7,11-dimethoxy-8-hydroxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]- benzdiazepin-5-on vom F. 145 bis 146,5 C (Zersetzung).
EMI0005.0005
C <SEP> H <SEP> O <SEP> N
<tb> C16H20N2O4 <SEP> ber.: <SEP> 63,16 <SEP> 6,58 <SEP> 21,05 <SEP> 9,21
<tb> gef.: <SEP> 62,95 <SEP> 6,66 <SEP> 21,25 <SEP> 9,05. Das UV-Absorptionsspektrum dieser Verbindung in Met hanol zeigt Maxima bei 224 mg (s = 36 000) und bei 320 mg (s = 3600) und Schultern bei 237 mg (s = 30 000) und 260 mg (s = 9000), wie aus Fig. 1 hervorgeht.
Das IR-Absorptionsspektrum in Nujol zeigt Banden bei 3340, 1640, 1570, 1510, 1425, 1290, 1265, 1210, 1190, 1180, 1070, 830, 800 und 765 cm=', wie aus Fig. 2 hervorgeht.
Nach einer anderen Ausführungsform der Aufarbeitung wurden 100 Liter des Überstands mit Salzsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt und 3 Mal mit je 30 Liter Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden vereinigt und auf ungefähr 10 Liter eingedampft. Anschliessend wurden 10 Liter Methanol zugesetzt. Die Lösung wurde weiter auf un gefähr 300 ml eingedampft, wobei langsam Methanol zuge setzt wurde. Die Methanollösung wurde in einen Kühl schrank gestellt. Der gebildete Niederschlag wurde filtriert und mit Essigsäureäthylester gewaschen. Das entstandene Pulver wurde in warmem Methanol gelöst und in der Kälte stehengelassen. Der entstandene kristalline Niederschlag wurde aus Methanol umkristallisiert.
Man erhielt ungefähr 2 g 1,2,3,10,11,11a-Hexahydro-2-äthyliden-7,11-dimethoxy-8-hy- droxy-5H-pyrrolo[2,1-c] [1,4]benzdiazepin-5-on.
Beispiel 2 100 Liter der in Beispiel 1 hergestellten Gärmaische wur den mit Salzsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt und 3 Mal mit je 30 Liter Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingedampft und in einer kleinen Menge Chloroform gelöst. Die Lösung wurde über eine mit Kiesel gel gefüllte Säule gegeben. Die Kieselgelsäule wurde mit einem 3 : 1-Äthylacetat/Chloroform-Gemisch eluiert. Das Eluat wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit n-Hexan versetzt. Die gebildete Fällung wurde abfil triert, in Chloroform gelöst und, wie oben angegeben, chro- matographiert. Das Eluat wurde eingedampft und das dabei erhaltene Pulver in Äthanol gelöst und in der Kälte stehen gelassen.
Das erhaltene kristalline Material wurde aus Ätha- nol umkristallisiert. Man erhielt blassgelbe Nadeln von 1,2,3,10,11,11 a-Hexahydro-2-äthyliden-7-methoxy-8-hydroxy-11 -äthoxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]benzdiazepin-5-on vom F. 134 bis 136 C (Zersetzung).
EMI0005.0016
C <SEP> H <SEP> O <SEP> N
<tb> C17H22N2O4 <SEP> ber.: <SEP> 64,13 <SEP> 6,97 <SEP> 20,10 <SEP> 8,80
<tb> gef.: <SEP> 63,85 <SEP> 7,02 <SEP> 20,77 <SEP> 8,44. Die Verbindung weist UV-Absorptionsmaxima in Ätha- nol bei 225 mg (s = 38 000) und 325 mg (s = 6700) und Schultern bei 235 mg (s = 35 000) und 262 mg (e =<B>11000)</B> auf, wie aus Fig. 3 hervorgeht.
Die IR-Absorptionsbanden in Nujol liegen bei 3350, 1640, 1600, 1570, 1513, 1425,<B>1</B>290, 1265, 1210, 1190, 1160, 1130, 1070, 890, 835, 800, 765 und 710 cm-', wie aus Fig. 4 hervor geht.
Beispiel 3 Eine Lösung von 100 mg 1,2,3,10,11,11a-Hexahydro-2-äthy liden-8-hydroxy-7,11-dimethoxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]-benzdia- zepin-5-on in 5 ml Pyridin wurde tropfenweise unter Kühlung mit 0,2 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Das Reaktionsge misch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehenge lassen und in Eiswasser gegossen. Der entstandene Nieder schlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in 1 ml Me thanol gelöst und in der Kälte stehengelassen. Der entstan dene Niederschlag wurde aus Methanol umkristallisiert.
Man erhielt blassgelbe Nadeln von 1,2,3,10,11,11a-Hexa hydro-2-äthyliden-7,11-dimethoxy-8-acetyloxy-5H-pyrrolo- [2,1-cI1,4]benzdiazepin-5-on vom F. 132 bis 133 C. (Ausbeute 85 % der Theorie).
EMI0005.0026
C <SEP> H <SEP> O <SEP> N
<tb> C18H22N205 <SEP> ber.: <SEP> 62,41 <SEP> 6,40 <SEP> 23,10 <SEP> 8,09
<tb> gef.: <SEP> 62,30 <SEP> 6,53 <SEP> 23,24 <SEP> 7,95. Beispiel 4 Eine Lösung von 300 mg 1,2,3,10,11,11a-Hexahydro-2-äthy liden-7,11-dimethoxy-8-hydroxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]benzdia- zepin-5-on in 5 ml Pyridin wurde mit 400 mg p-Brombenzoe- säureanhydrid versetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden stehengelassen und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit Chloroform, einer 5%igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung und mit 2 n Salzsäure gewaschen und zu einem kleineren Volumen eingedampft. Der Rück stand wurde an einer Kieselgel-Säule adsorbiert und mit einem 8 :1-Chloroform/Essigsäureäthylester-Gemisch eluiert. Das Eluat wurde eingedampft. Man erhielt rohes 1,2,3,10,11,11 a-Hexahydro-2-äthyliden-7,11-dimethoxy-8-p-brom- benzoyloxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]benzdiazepin-5-on, das mit Acetonitril behandelt wurde.
Es entstanden weisse Nadeln von 1,2,3,11a-Tetrahydro-2-äthy- liden-7- methoxy-8-p-brombenzoyloxy-5H-pyrrolo[2,1-c) [1,4]benzdiazepin-5-on vom F. 204 bis 205 C. (Ausbeute 10 % der Theorie). C H O N Br C22H19N2O4Br ber.: 58,02 4,17 14,07 6,15 17,58 gef: 58,12 4,25 14,00 6,50 17,58
EMI0006.0005
in der R einen niederen Alkoxyrest bedeutet, dadurch ge kennzeichnet, dass man Streptomyces achromogenes var. tomaymyceticus A.T.C.C. oder engverwandte Mutan ten dieses Mikroorganismus in einem Nährmedium unter aeroben Submersbedingungen züchtet, und das gebildete aus der Gärmaische isolierte oder nicht isolierte Antibiotikum mit einem Alkohol der Formel R-H, in welcher R obige Be deutung besitzt, behandelt.
UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeich net, dass als Nährmedium ein wässriges Medium verwendet wird, welches eine Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und eine Quelle assimilierbaren Stickstoffs sowie gegebenenfalls Mineralsalze enthält.
2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium vor dem Animpfen mit dem Mikroorganismus auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise von 6,0 bis 7,0, eingestellt und wäh rend der Züchtung auf einen pH-Wert von 6,0 bis 6,5 gehal ten wird.
3. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung bei einer Anmerkung des Eidg. Amtes für geistiges Eigentum: Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentan spruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Ein klang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der Patentanspruch für den sachlichen Gel tungsbereich des Patentes massgebend ist. Beispiel 5 Eine Lösung von 100 mg 1,2,3,1O,11,11a-Hexahydro-2-äthy liden-7,11-dimethoxy-8-hydroxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]benzdia- zepin wurde tropfenweise mit einer ätherischen Diazome- thanlösung versetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden in der Kälte stehengelassen und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Methanol gelöst und anschliessend bei 0 C mit 10 ml Äther versetzt. Man erhielt blassgelbe Nadeln von 1,2,3,10,11,i1a-Hexahydro- 7,8,11-trimethoxy-5H-pyrrolo[2,1-cI1,4]benzdiazepin-5-on vom F. 88 C. (Ausbeute 90 % der Theorie).
EMI0006.0013