CH412201A - Procédé de stabilisation d'un produit à base de virus antigène labile - Google Patents

Description

  



  Procédé de stabilisation d'un produit à base de virus antigène labile
 La présente invention a pour objet un procédé de stabilisation d'un produit à base de virus antigène
 labile.



   Les produits commerciaux à base de virus tendent en général à perdre leur activité antigène lorsqu'ils sont conservés, et c'est pourquoi on a déjà proposé de leur incorporer une substance stabilisante, destinée à maintenir ou à stabiliser leur activité pendant de longues durées. Diverses substances   stabili-    santes ont été proposées. Dans le cas de la fabrication des vaccins, le problème est rendu plus complique par le fait que cette fabrication peut comprendre une opération de lyophilisation du vaccin, en vue de l'obtention d'un produit non aqueux, ou une simple congélation destinée à le mettre dans un état de stabilité maximum, le vaccin étant ensuite dégelé au moment de sa mise en ampoules.

   Lorsque la réserve de vaccin dépasse la quantité requise pour le remplissage immédiat, comme c'est le cas habituellement dans la fabrication industrielle, l'excès de vaccin doit être congelé à nouveau et conservé jusqu'au moment où une nouvelle quantité de vaccin est nécessaire pour un nouveau remplissage. Il en résulte inévitablement une série de cycles congélation-dégel qui, ayant un effet nuisible en l'absence d'une substance stabilisante appropriée, entraînent une perte prématurée d'activité antigène. Dans cet ordre d'idées, on sait que les sels en forte concentration ont un effet nuisible sur l'activité antigène, et c'est pourquoi on a déconseillé l'emploi des sels comme stabilisants.

   La concentration des sels a une influence particulière au cours du séchage, car elle augmente progressivement au fur et à mesure du départ de   l'eau    du produit aqueux, exposant ainsi de plus en plus les facteurs antigènes à une altération possible. En outre, l'addition de sels a pour effet d'abaisser la température à laquelle un produit fluide peut être solidifié. Les matières hygroscopiques sont également contre-indiquées car, en concentration élevée, elles forment des sirops qui sont difficiles à manier, en particulier au cours du séchage.



   L'invention a donc pour but de procurer des produits à base de virus dont la stabilité   antigénique    est améliorée, spécialement au cours de la lyophilisation ou lorsqu'ils sont stockés ou conservés en cours de fabrication pendant de longues durées.



   L'invention a également pour but de procurer des produits fluides à base de virus qui peuvent être soumis à des traitements de congélation et de dégel successifs sans perte notable d'activité antigène.



   Un autre but de l'invention est de procurer des vaccins stabilisés.



   L'invention a encore pour but de procurer des produits fluides à base de virus qui peuvent être réduits en forme solide non hygroscopique sans formation de sirops et qui, lorsqu'ils sont reconstitués avec de   l'eau    ou autrement traités, peuvent être utilisés comme vaccins pour des buts d'immunisation ou prophylactiques.



   L'invention a encore pour but de procurer un moyen de stabilisation des produits à base de virus.



   Ces buts sont atteints conformément à l'invention par l'adjonction aux antigènes de virus d'une faible proportion du sel appelé lactobionate de calcium.



  Les antigènes de virus contenant du lactobionate de calcium sont antigéniquement stables et conservent l'activité désirée pendant de longues durées. Comme l'addition de sels aux vaccins et aux produits   antigéni-    ques est ordinairement indésirable, il est surprenant que les produits de l'invention qui contiennent le sel ajouté, c'est-à-dire du lactobionate de calcium, sont très supérieurs aux produits analogues ne contenant pas de lactobionate de calcium, en ce qui concerne la stabilité   antigénique.    En outre, les antigènes fluides de l'invention peuvent être réduits en une poudre sèche et floconneuse sans formation de sirops difficiles à manier ou d'autres formes hygroscopiques.

   Un autre avantage inattendu est que, tandis qu'il est   gé-    néralement nécessaire de congeler de nombreux types de vaccins et de les maintenir à des   températu-    res extrêmement basses afin de les rendre aussi stables que possible au cours du stockage, les produits de l'invention peuvent être conservés à l'état congelé à des températures sensiblement plus élevées pendant de longues durées sans perte appréciable d'activité. Par exemple, le vaccin ordinaire contre la rougeole, qui contient normalement un faible pourcentage de chlorure de calcium, doit être conservé à une température inférieure à   environ-600    C, car aux températures plus élevées la perte   d'antigénicité    est rapide et pratiquement complète.

   Par contre, le vaccin contre la rougeole stabilisé conformément à l'invention peut être conservé commodément à des températures pouvant atteindre-200 C, et une stabilité maximum est obtenue à ces plus hautes températures. En outre, les produits stabilisés conformément à l'invention peuvent être soumis à des cycles congélation-dégel successifs sans perte marquée d'ac  tivité    antigène.



   Le procédé selon l'invention peut, d'une manière générale, être appliqué aux produits à base de virus antigène, et spécialement aux produits à base de virus, sous forme sèche ou aqueuse, qui sont des vaccins ou qui peuvent être utilisés pour la production de vaccins ou   d'anti-sérums.   



   Le procédé selon l'invention est donc applicable aux vaccins à base de virus atténués ou tués. Parmi les nombreux vaccins auxquels le procédé selon   l'in-    vention peut être appliqué, on peut citer les vaccins contre la poliomyélite, la rougeole, l'hépatite infectieuse, la fièvre jaune, la parotidite épidémique, la rage et la variole. Ces vaccins, qui peuvent être non stabilisés ou préalablement stabilisés, sont obtenables par les méthodes classiques connues. Le procédé selon l'invention est également applicable à la stabilisation des matières premières pour la préparation des vaccins de virus, par exemple filtrats et centrifugats, de cultures de virus, des vaccins de virus non finis, des vaccins en masse et d'autres produits antigènes.

   Dans la suite de cet exposé, la stabilisation de vaccins terminés est prise à titre d'exemple, mais il est entendu que l'invention englobe la stabilisation des produits à base de virus d'une manière générale et n'est pas limitée aux vaccins finis.



   Le lactobionate de calcium est une matière relativement bon marché et se trouve dans le commerce à un haut degré de pureté. Les qualités techniques sont satisfaisantes, mais les qualités purifiées se rapprochant de l'analyse typique ci-dessous, ou la   dé-    passant, sont préférées :
 Calcium 4,   94 ouzo   
 Humidité 5,   140/o   
 Substances réductrices totales,
 en lactose. HO 0,   270/o   
 Métaux lourds   10 p. p. m.   
 pH (solution à   10"/.)    6, 5-7, 5
 La proportion de lactobionate de calcium à incorporer aux produits à base de virus pour les stabiliser dépend de la nature du vaccin, de la labilité relative de l'antigène présent et d'autres facteurs analogues.

   Il convient d'incorporer le lactobionate de calcium, sous forme de poudre sèche ou de solution aqueuse ou diluée, au produit fluide à base de virus en mélangeant soigneusement à basse température jusqu'à obtention d'une suspension ou solution homogène. Dans le procédé selon l'invention, on adopte une concentration d'au moins environ 0,   1 ouzo    (poids/ vol). Pour une stabilisation maximum, une concentration de   1 ouzo    (poids/vol) est préférée. Les concentrations allant jusqu'à environ   5 ouzo    (poids/vol) donnent également satisfaction. L'invention s'étend à l'utilisation de concentrations encore plus élevées, bien que 1'effet stabilisant désiré devienne de moins en moins significatif lorsque la concentration augmente.

   Des produits stabilisés secs peuvent être préparés à partir des produits fluides mentionnés par des traitements de séchage classiques et connus, par exemple par séchage sous congélation ou lyophilisation. Ces produits non aqueux contiennent une proportion relativement importante de lactobionate de calcium en poids par rapport aux solides totaux.



  Outre les produits à base de virus et les vaccins fluides et aqueux, le procédé selon l'invention vise les produits secs, non aqueux, tels que ceux pouvant être préparés par séchage des produits fluides mentionnés.



   Pour renforcer l'effet antigène, les produits peuvent contenir de faibles proportions d'une protéine ou d'un polypeptide ajouté, immunologiquement compatible, par exemple une albumine humaine, une protamine ou une peptone. Ainsi, on peut utiliser environ   1-5 ouzo    (poids/vol) de protéine ou de polypeptide.



   Dans le cas du séchage des produits fluides, on peut incorporer aux produits fluides avant le séchage, en plus du lactobionate de calcium, un faible pourcentage (par exemple environ   2-10 ouzo    (poids/ vol) et de préférence environ   5  /0)    de lactose, ce qui facilite encore le maniement et renforce 1'effet stabilisant. L'opération de séchage est facilitée par le fait que le lactose fournit une masse compatible et travaillable. En outre, les produits secs contenant du lactose sont en général plus stables   antigénique-    ment que les produits secs qui n'en contiennent pas.



   Conformément à la pratique classique, le procédé selon l'invention est avantageusement mis en oeuvre en conditions aseptiques, en utilisant des composants qui ont été rendus préalablement stériles   bactériolo-    giquement. La stérilité peut être maintenue au cours du stockage par incorporation d'une substance germicide et compatible avec l'antigène, telle que le thimérosal ou le chlorure de   benzéthonium.    Cependant, dans le cas des produits qui sont amenés à l'état sec, l'emploi d'un germicide ou agent   stérili-    sant est ordinairement superflu. Sauf indication contraire, les substances antigènes sont de préférence maintenues froides   (à    environ   40    C) autant que possible pendant la fabrication.



   Dans les exemples qui suivent, la concentration des ingrédients est exprimée en pour-cent en poids rapporté au volume, sauf indication contraire.



   Exemple 1 a)   Preparation    de cellules de culture de tissu.



   On cultive des cellules de culture de tissu, préparées à partir d'oeufs de poulet embryonnés de 11 à 12 jours par les techniques normales de trypsinisation, dans des bouteilles fixes (870 g, réglementaires) pendant 3 à 5 jours. Le milieu de culture des cellules est le milieu synthétique   No    199. On lave les monocouches cellulaires deux fois avec des portions de 100 ml du milieu   No    199 au pH 7, 4-7, 6 et contenant 1 microgramme de streptomycine.   b) Inocialation des cellules.   



   Après lavage, on ajoute dans chaque bouteille de culture de tissus   50 ce    d'une solution contenant 1000 à 10 000 doses infectieuses à 50    /0    pour culture de tissu   (DICTUo)    de la souche atténuée Edmonston du virus de la rougeole, suspendues dans du milieu   Nô 199.    Cette souche de virus peut être obtenue auprès du Département des Recherches sur les maladies infectieuses, The Children's Medical Center,
Boston, Massachusetts (USA). Cf. American Journal of Public Health, 47 : 275-282 (1957) ; Connecticut
Medicine, 23 : 561-567 (1959). c) Incubation.



   Les cultures inoculées sont incubées immobiles à   320    C jusqu'à ce qu'environ 2/3 à 3/4 de la monocouche subisse un effet cytopathique, en général entre 7 et 14 jours après l'inoculation, auquel moment le rendement en virus est optimum. d) Récolte.



   Les feuilles de cellules provenant des cultures incubées sont suspendues dans les fluides et recueillies en une masse commune, dans un récipient réfrigéré.



  La suspension résultante est centrifugée à   40 C    pendant 10 mn à 1500 t/mn. La couche liquide est   sépa-    rée du culot de débris cellulaires et, toujours froide, est passée à travers un filtre en verre fritte moyen pour en éliminer les petits débris éventuellement présents. Le filtrat est utilisable comme vaccin contre la rougeole, mais il est relativement instable quant à l'activité antigène lorsqu'il est stocké pendant de longues durées ou soumis à des cycles congélation-dégel successifs, à un séchage sous congélation, etc.



   On décrit ci-après la production de vaccins antirougeole stabilisés à partir de matières antigéniques de départ préparées de la manière décrite ci-dessus.



  On donne également une comparaison entre les comportements antigéniques de vaccins antirougeole stabilisés et non stabilisés lorsqu'ils sont soumis à des conditions ambiantes différentes, rencontrées au cours de la congélation, du séchage et du stockage. Les vaccins non stabilisés utilisés sont les filtrats obtenus par le procédé   1d    ci-dessus et sont dénommés ciaprès        témoins   s-et    les mêmes fluides auxquels de l'albumine humaine   (1  /o)    a été ajoutée sont dénommés ci-après   témoins avec albumine   p.   



  Vaccins stabilisés :
 Des prises aliquotes séparées de filtrat de fluide de virus de la rougeole obtenu par le   procédé    ld ont été mélangées respectivement avec   1 O/o    de lactobionate de calcium (qualité purifiée, Sheffield Chemical Div., Sheffield Farms Co., Inc.,   Norwich,    Connecticut, USA) avec   1 ouzo    et   5 ouzo    de lactobionate de calcium et   1"/o d'albumine    humaine et avec   I O/o    de lactobionate de calcium,   1 ouzo    d'albumine humaine et   5  /o    de lactose. Dans chaque cas, les ingrédients ont été mélangés intimement à froid, jusqu'à obtention d'un liquide homogène.

   La composition des produits résultants est la suivante, rapportée au volume total de vaccin :
Vaccin A :
   1  /o    de lactobionate de calcium.



  Vaccin B :
   1  /o de    lactobionate de sodium ;
   1  /o    d'albumine humaine.



  Vaccin C :
   5  /o    de lactobionate de calcium ;
   1  /o    d'albumine humaine.



  Vaccin D :
   1  /o    de lactobionate de calcium ;
   1  /o    d'albumine humaine ;
   5  /o    de lactose.



   On a déterminé la résistance contre la perte d'ac  tivité    pendant le séchage sous congélation en soumettant les vaccins C et D, ainsi qu'un vaccin témoin, à un traitement classique de séchage sous congélation   (Oo    C ; appareil de séchage Virtis, modèle No P-24
PR, Virtis   Company,    Inc. ; Gardiner, N.-Y., USA).



  L'activité avant et après le séchage, exprimée en titre   d'infectiosité,    a été déterminée pour chaque vaccin.



  Pour cette détermination, on inocule des cultures monocouches de cellules d'embryon de poulet avec une prise aliquote des vaccins respectifs et on observe le développement d'une formation en plaque, conformément au procédé décrit par Dulbecco et al., J.



  Exper. Med., 99 : 167, 1954. Le titre   d'infectiosité,    qui est directement lié à   l'antigénicité    de l'inoculum, est exprimé en unités de formation de plaque (UFP) par millilitre de vaccin. Les résultats suivants ont été obtenus : l'activité des vaccins avant le premier cycle de con  gélation-dëgel    et après les cycles 1, 2, 4 et 8, avec les résultats suivants :

  
 Tableau I
 Vaccin Titre   d'infectiosité       (UFP/ml)   
   Pré-séché    Séché
Témoin avec albumine 33110 5888
Vaccin C 10000 8511
Vaccin D 19950 18200
 Ces résultats montrent que, tandis que les vaccins antirougeole C et D n'ont subi qu'une perte modérée d'activité pendant le séchage, le vaccin   té-    moin sans stabilisant a perdu plus de   80 O/o    de son activité.



   On a également déterminé l'effet stabilisant lors du séchage (sublimation sous vide) et lors du stockage pendant 7 jours. Pour cette détermination, plusieurs lots de vaccin B et un témoin avec albumine ont été soumis à des températures de séchage différentes   (Qo C,-40"C,    et un intervalle de   0      à-40"C)    et à différentes températures de stockage   (+ 15    et   -800C). L'activité    (titre   d'infectiosité)    a été déterminée au début et à la fin de chaque essai.

   Les résultats suivants ont été obtenus :
 Tableau III
 Titre   d'infectiosité ((UFP/ml)    X   10')   
 Cycles Témoin Vaccin B
 congélation-dégel avec albumine
 0 16. 220 19. 050
   1 15.    490 18. 620
 2 11. 220 18.   620   
 4 9. 333 15. 140
 8 5. 129 11. 480
 Ces résultats montrent qu'un vaccin stabilisé par le procédé selon l'invention présente une bonne stabilité au cours d'un traitement cyclique de congélation et de dégel. Bien que ce vaccin et un vaccin témoin aient progressivement perdu leur activité avec le nombre croissant de cycles, le premier a conservé deux fois plus d'activité par cycle moyen que le   té-    moin.



   On a encore déterminé la résistance à la perte d'activité de produits sèches, au cours d'un stockage prolongé à   4O    C. Après séchage sous congélation, les produits (vaccin témoin antirougeole et vaccins A et
B) ont été conservés et leur activité a été dosée de temps en temps avec les résultats suivants :
 Tableau II
 Titre d'infectiosité    ( (UFP/ml) X 10')   
 Température Température Témoin Vaccin B
 de sublimation de stockage avec albumine (Initial :
 (Initial :

   8. 913)
  C    C    8. 913)
   0    15 5, 248 2. 138
 0-80 31, 620 2. 951
 -40 15 5, 248 1. 288
 -40-80  <    5,    012 2. 239
 0 à-40 15  <  5, 012 1. 698
 0 à-40-80  <  5, 012 2. 512
 Ces résultats montrent que le vaccin témoin a perdu plus de   99 O/o    de son activité initiale dans tous les cas. Les résultats montrent également que, con  irairement    au vaccin témoin, un vaccin stabilisé conformément à l'invention conserve une activité ap  préciable    au cours du séchage et du stockage.



   On a également déterminé la résistance à la perte d'activité au cours de cycles congélation-dégel. Pour cette détermination, on a successivement congelé à   ¯ 760    C et dégelé   à + 37, 5"    C huit fois du vaccin B et un vaccin témoin avec albumine.

   On a déterminé
 Tableau IV
 Titre d'infectiosité (UFP/ml)
 Temps Témoin Vaccin A Vaccin B
 de stockage   pré-séché      pré-sèche      pré-séché   
 (semaines) 10, 000 12, 590 3162
 1 692-
 8--3467
 9 50-
 17  <  10-3800
 19-870
 28-646
 40--3310
 Ces résultats montrent qu'un vaccin témoin sans stabilisant perd pratiquement tout pouvoir antigène après quatre mois de stockage, tandis que les vaccins stabilisés conformément à l'invention conservent un pouvoir antigène significatif pendant de beaucoup plus longues durées.



   On a également démontré la résistance à la perte d'activité d'un vaccin congelé conservé, en comparaison avec un vaccin témoin. Deux températures ont été employées pour la congélation, avec les résultats suivants : 
 Tableau V
 Titre   d'infectiosité    à intervalles   ( (UFP/ml)    X   103)   
 Température Température Vaccin témoin Vaccin B de congélation de stockage
    C  C    0 1 semaine 1 mois 0 1 semaine   1 mois   
 -20-40 10. 230 3. 162 2. 630 14. 790 5. 012 10. 000
 -65-40 12. 590 794, 3 631 14. 450 17. 380 15.

   850
 Ces résultats montrent que le vaccin témoin non stabilisé et conservé à basse température subit une perte importante d'activité, alors que dans les mêmes conditions, le vaccin stabilisé conformément à l'invention conserve son activité originale sans perte, dans les limites de précision expérimentales.



   Les vaccins stabilisés antirougeole, préparés de la manière décrite, peuvent être utilisés directement pour développer l'immunité. Un produit préféré est un fluide exempt de cellules provenant d'une culture de virus de la rougeole sur tissu, auquel a été ajouté 1  /o de lactobionate de calcium et   1 ouzo    d'albumine humaine et qui a été séché sous congélation et emballé en ampoules à dose unitaire, en conditions aseptiques, de manière que l'activité unitaire minimum soit de   1000UFP.    Un tel produit, doué d'une bonne stabilité et pouvant être administré après avoir été reconstitué avec de l'eau, s'est montré cliniquement efficace.



   Le procédé ci-dessus peut être utilisé pour la stabilisation d'autres vaccins, provenant de matières premières à base de virus différents. Par exemple, au lieu d'un vaccin antirougeole, on peut stabiliser un vaccin à base de virus de parotidite épidémique inactivé (100 unités d'agglutination de cellules de poulets (ACP) par   ml)    contenant   i/oooo    de   thiméro-    sal. On ajoute à ce vaccin   1 ouzo    de lactobionate de calcium et   I O/o    d'albumine humaine et on agite le mélange à froid jusqu'à obtention d'une solution homogène. On conserve cette solution à 40 C et, à la demande, on en remplit des ampoules pour la distribution.



   Exemple 2
 On prépare un fluide centrifugé, exempt de cellules, à partir   d'une    culture de virus de la vaccine sur tissu, en procédant de la manière suivante : en utilisant les techniques classiques de trypsinisation, on prépare des cultures monocouches de 7 jours de peau embryonnaire de bovidé. On ajoute du milieu synthétique   No    199 aux cultures et on inocule chaque culture avec 50ml d'une suspension contenant du virus de la vaccine   (1000 DICI, o)    On fait incuber les cultures inoculées pendant 4 à 7 jours, on récolte les fluides, on les réunit et on les centrifuge.



   Pour déterminer 1'effet stabilisant du lactobionate de calcium sur le vaccin de virus de la vaccine, on a conservé une prise aliquote du fluide ci-dessus comme témoin et on a stabilisé une autre prise aliquote par mélange avec 1    /o    de lactobionate de calcium. Le vaccin stabilisé résultant et le vaccin témoin ont été tous deux congelés et sèches dans un appareil de séchage Virtis.

   L'activité antigène, exprimée par le titre   d'infectiosité,    a été déterminée avant et après séchage par congélation, avec les résultats suivants :
 Titre   d'infectiosité   
 l   ( (UFP/ml)    X   103)   
 Avant séchage Après séchage
 sous sous
 congélation congélation
Vaccin témoin. 3. 981 1. 585
Vaccin stabilisé avec
   1  /o    de lactobionate
 de calcium 4. 169 5.   000 +   
 Ces résultats montrent que le vaccin témoin non stabilisé a perdu plus de la moitié de son activité pendant le séchage sous congélation. Dans les mêmes conditions, le vaccin stabilisé par le lactobionate de calcium a conservé son activité à un haut degré, sans perte apparente.



   Le procédé ci-dessus peut être utilisé pour la stabilisation d'autres produits antigènes. Par exemple, à la place   d'un    fluide à base de virus de la vaccine, on peut utiliser un milieu aqueux contenant un antigène de virus de la poliomyélite, par exemple un filtrat de culture sur tissu de rein de singe, contenant un ou plusieurs des types 1, 2 et 3 du virus de la poliomyélite, tués partiellement par traitement par le formaldéhyde et partiellement par exposition à la lumière ultraviolette (voir Brevet britannique   No    802048). On peut également utiliser un centrifugat de fluide de culture amniotique d'embryon de poulet contenant du virus de parotidite épidémique, titre   d'infectiosité    (hémagglutination) de   10-4.   

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de stabilisation de produits à base de virus antigène, labiles, caractérisé en ce que l'on in corpore à un produit fluide antigène à base de virus au moins 0, 1 O/o en poids de lactobionate de calcium.

   SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caractérise en ce que le produit fluide antigène à base de virus est un vaccin.

   2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce qu'on congèle le mélange résultant.

   3. Procédé selon la sous-revendication 2, caractérisé en ce que le produit fluide antigène à base de virus est un vaccin.

   4. Procédé selon la sous-revendication 2, carac térisé en ce que le produit à base de virus est un fluide exempt de cellules provenant d'une culture du virus de la rougeole.

   5. Procédé selon la sous-revendication 2, carac térisé en ce que le produit à base de virus est un fluide exempt de cellules provenant d'une culture de virus de la vaccine.

   6. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on sèche sous congélation le mélange résul- tant.

   7. Procédé selon la sous-revendication 6, caracté- risé en ce que le produit à base de virus est un fluide exempt de cellules provenant d'une culture du virus de la rougeole.