Procédé pour la préparation de glutathion
L'objet du présent brevet est un procédé de préparation du L-glutathion ou dy-L-glutamyl-L-cystéinyl- glycine, tripeptide-naturel de formule :
EMI1.1
dont l'importance physiologique a óté mise en évidence dans le < < Symposium of glutathione - Proceedings of the Symposium held at Ridgefield, Connecticut, Novembre 1953, New York Acad. Press. 1954 .
Ce composé était difficilement accessible jusqu'ici, les méthodes employées utilisant généralement comme agent de blocage de la fonction mercaptan, le chlorure de benzoyle. On aboutissait généralement a, u peptide correspondant au glutathion dont la fonction amine était bloquée par un groupement carbobenzoxy, le soufre étant benzylé.
Comme l'hydro- génolyse ne peut pas s'appliquer aux compos, és
S-benzylés, on était astreint, en dernier lieu, à 1ibérer la fonction mercaptan du glutathion soit par action du sodium dans l'ammoniaque liquide, soit par action de l'indure de phosphonium, deux méthodes difficilement applicables dans l'industrie.
Dans le brevet suisse N 338197 la titulaire a décrit la préparation des N-trityl-aminoacides et leur utilisation pour la préparation de N-peptides par la méthode aux anhydrides mixtes, Il a été montré ultérieurement dans le brevet suisse No 343407, que les N-trityl-aminoacides permettaient un accès aisé aux N-trityl-peptides en les faisant réagir sur 1'ester d'un aminoacide en présence de dicyclohexylcarbo- diimide, agent de condensation préconisé en synthèse peptidique par Sheehan et Hess (J. Am.
Chem. Soc., 1955, 77, 1066) pour d'autres dérivés d'aminoacides, 1'ester du peptide N-trityle ainsi obtenu étant ensuite saponifié puis détritylté par l'acide acétique aqueux chaud.
Finalement, il a éé préconisé dans le brevet suisse No 348161 l'emploi de l'ester a-benzylique de l'acide N-trityl-glutamique pour accéder aux Y-glut- amyl-peptides par oondensation en présence de dicychlohexylcarbodiimide avec un ester bezylique d'un aminoacide. On libòre ensuite les fonctions acides du Lrglutamyl-peptide-N-trityle par hydrogénolyse et détrityle par l'acide acétique aqueux chaud.
Le L-glutathion est préparé par synthèse selon le procédé de la pr6sente invention au départ de la L-cystéine de formule I, la première étape consiste à trityler la L-cystéine, par exemple par réaction du chlorure de trityle sur la L-cystéine dans un mélange d'eau et d'un solvant approprié comme l'alcool ou 1'6ther an pr6sence d'une base organique telle que la diéthylamine qui a été utilisée par Zervas (IVe Congres International de Chimie pure et appli queue)
pour la tritylation d'a-aminoacides non sou- frets. On eviteaini la préparation préalable de l'ester de la L-cystéine avant tritylation et sa saponifica tion ultérieure. On peut séparer la N, S-ditrityl cyseine de formule 11 sous forme de son sel de diéthylamine grâce à l'imolubilité de ce sel dans l'éther et l'alcool. Au cours de la réaction, il se forme simultanément un peu de S-trityl-L-cysteine de formule III, qu'il est facile de séparer en mettant à profit son insolubilité dans l'éther.
La N, S-ditrityl-L-cysteine obtenue à partir de son sel de diéthylami, ne est condensée avec un ester de cette glycine, par exemple le glycinate d'éthyle ou de méthyle, en présence d'un carbodiimide disubstitué tel que le dicyclohexylcarbodiimide, le diisopropylcarbodiimide ou le méthyl-terbutylcarbo- diimide. L'ester de la N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycine de formule IV ainsi obtenu est détritylé sur l'atome d'azote, par exemple au moyen d'acide chlorhydrique en solution hydroacétonique à température ambiante.
On fait ensuite réagir lacide N-trityl-L-glutamique de formule VI, avec 1'ester de S-trityl-L-cysteinyl- glycine en présence d'un carbodiimide disubstitué pour obtenir 1'ester du N, S-ditrityl-L-glutathion de formule VII.
On saponifie ensuite 1'ester du tripeptide avec formation du N, S-ditrityl glutathion, puis on détrityle celui-ci, en général d'abord sur l'atome d'azote, par exemple au moyen d'acide acétique aqueux chaud, on aboutit au S-trityl-L-glutathion de formule VIII, lequel est à son tour détritylé sur l'atome de soufre, par exemple par traitement avec une solution chloroformique d'acide chlorhydrique gazeux. On obtint ainsi le chlorhydrate de L-glutathion d'où on libère le L-glutathion de formule IX.
Les réactions susmentionnées peuvent etre illustrées par les équations suivantes :
EMI2.1
<tb> <SEP> HS-CH2-CH-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> 2
<tb> <SEP> I
<tb> C6H5 <SEP> CoH5
<tb> C6Hs/C-S-CH2-ICH-COOH <SEP> + <SEP> CoH7C-S-CH2-ICH-COOH
<tb> CsHs/I <SEP> CeHs <SEP> CsHs/NH
<tb> <SEP> C6H5
<tb> <SEP> C6Hs
<tb> <SEP> (III)
<tb> <SEP> (II)
<tb> <SEP> H2N-CH2-COOR
<tb> <SEP> en <SEP> présence <SEP> de <SEP> dicyclohexylcarbodiimide
<tb> C6Hs\,
<tb> CeHs-C-S-CH2-CH-CONH-CH2-COOR
<tb> C6H5 <SEP> C6H, <SEP> 5
<tb> <SEP> NH-CC6Hs
<tb> <SEP> Cr, <SEP> H5
<tb> <SEP> (IV)
<tb> CsHs\
<tb> C6Hs <SEP> jC-S-CH2-CH-CO-NH-CH2-COOR
<tb> C6H5 <SEP> NH2
<tb> <SEP> HOOC-CH2-CH2-CH-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> /CcHs
<tb> <SEP> /NH <SEP> C/C <SEP> H
<tb> <SEP> C6H.
<SEP> 5
<tb> <SEP> /C6H5
<tb> CsHs
<tb> C6Hs\C-S-CH2-CH-CONH-CH2-COOR
<tb> <SEP> I
<tb> CEHs/NH
<tb> <SEP> CL
<tb> <SEP> UR2
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> C6H5 <SEP> CH2
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> C6HsC <SEP> ¯NH¯ <SEP> CH
<tb> /I <SEP> (VII)
<tb> <SEP> CcHs/, <SEP> ICOOH
<tb>
EMI3.1
Le nouveau procédé excelle donc par une grande simplicité car il n'utilise qu'un minimum de stades et un seul et unique réactif de blocage du soufre et de l'azote. Ses particularités marquantes sont la détritylation séective à l'azote par l'action de l'acide acétique aqueux à chaud ou de l'acide chlorhydrique en solution hydroacétonique à froid,
et la détrityla- tion du S-trityl-L-glutathion au soufre par l'acide chlorhydrique gazeux en chloroforme, réactions faciles à réaliser à l'échelle industrielle et ne provoquant auoune racémisation. En outre, il utilise la conden saut, ion de l'acide N-trityl-L-glutamique avec les esters de la S-trityl-L-cysteinyl-glycine.
Dans les exemples suivants, les points de fusion sont des points de fusion inskantanée déterminés sur bloc de Maquenne. Les formules des composés figurent sur le schéma annexé à la fin de la description.
Le mode opératoire décrit peut être évidemment employé au départ des aminoacides racémiques ou des énantiomorphes. De même, il est possible de détrityler le N, S-ditrityl-L-glutathion simultanement à l'azote et au soufre. On peut notamment changer de solvant, utiliser un autre ester de la S-trityl-Lr cystéinyl-glycine que celui mentionné, ou employer, comme agent de condensation, un autre carbodiimide disubstitué que ceux mentionnés.
Exemple
Préparation de la N, S-ditrityl-L-cysteine
de formule 11
Dans une solution, refroidie à 0 C, de 25 g de chlorhydrate de cystéine, de formule I [α]D20 = +5,5 (c = 1 /o, acide chlorhydrique N) dans 480 cm3 d'eau, on introduit, sous courant d'azote et agitation m6canique, 480 cm3 d'6ther et 80 cm3 de diethyl- amine et refroidit à - 5 C. Sans interrompre l'agita- tion, on introduit rapidement 120 g de chlorure de trityle et poursuit l'agitation pendant trois heures.
Le mélange réactionnel devient une masse pâteuse assez difficile à agiter. On ajoute alors 150 à 200 cm3 de chloroforme, décante la phase aqueuse qui ne renferme que du chlorhydrate de diéthylamine et le chlorhydrate de cystéine qui n'a pas réagi. La
S-trityl-cystéine estérifiée par le chlorure de trityle ainsi que la N, S-ditrityl-L-cystéine sous forme de sel de diéthylamine et d'ester tritylique, passent dans la couche organique qu'on lave à nouveau avec 300 cm3 d'eau, sèche la solution chloroformique éthérée sur sulfate de soude et concentre, après filtration, à petit volume.
On ajoute alors 100 cm3 d'alcool contenant 1 cm3 de diéthylamine et distille le solvant jusqu'à ce qu'il ait entraîné tout le chloroforme. Le sel de diéthylamine de la N,-S-ditrityl-cysteine de formule
II cristallise. On complète la cristallisation plar addi- tion progressive de 100 cm3 d'éther, glace, essore et sèche.
On obtint ainsi 55 g de sel pur se présentant sous forme d'aiguilles [a] D20 = + 71 # 1 (c = 2 /o, chloroforme), solubles en chloroforme, très peu solu bles en alcool, insolubles dans 1'eau et l'éther. Les réactions à la ninhydrine et au nitroprussiate de sodium sont négatives.
Analyse : C45H46O2N2S = 678,91
Calculé : C 76,61 % H 6,83 % N 4,13 % S 4,72 % Trouvé : C79, 4 /o H6, 9 O/o N 4, 0'O/o S 4, 7 /o
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
A partir des eaux mères de cristallisation on obtient un deuxième jet de produit portant le rendement global à 70 g environ. En reprenant ce sel par l'eau acidulée, on le décompose avec mise en liberté de la N, S-ditrityl-L-cystéine de formule II, qui peut être facilement extraite par l'éther dans lequel elle est assez soluble. L'évaporation de l'éther fournit le produit brut à l'état amorphe.
Le résidu provenant de la concentration de la solution mère éthéro- alcoolique du sel de diéthylamine de la N, S-ditrityl L-cystéine et renfermant les esters trityliques de la S-trityl-L-cystéine et de la N, S-ditrityl-L-cysteine est traité dix minutes au reflux par l'acide acétique aqueux à 50 % en solution éthérée. Il fournit un mélange de N, S-ditri, tyl-L-cystéine et de S-trityl-Lcystéine qu'on peut séparaer grâce à l'insolubilité de cette defnière dans l'éther. La S-trityl-L-cystéine est purifiée par recristallisation en alcool.
Elle se pré- sente alors en aiguilles, F = 202-205 C, [α]D20 ¯-I-19 1 (c = 2%, soude N/10), solubles dans les alcalis dilués aqueux, peu solubles dans l'alcool et les acides dilués aqueux, insolubles dans l'éther et l'eau. Elle donne une réaction positive à la ninhydrine et une réaction négative au nitroplussiate de sodium.
Analyse C22H21O2NS = 363,47
Calculé : C 72,69 % H 5,825 N 3,85% S 8,82%
Trouvé : C 72, 8 % H 6,0 % N 3,6 % S 8, 4 0/o
Condensation de la N,S-ditrityl-L-cystéine, II,
avec le glycinate d'éthyle
On dissout 13, 6 g (0, 02mol.) de sel de diéthyl- amine de la N, S-ditrityl-L-cystéine dans 50 cm3 de chloroforme et agite avec 20 cm3 d'acide chlorhydri que normal pour libérer l'acide qui passe dans le chloroforme.
Après décantation, on sèche la couche chloroformique sur sulfate de soude, filtre, distille à sec sous vide et reprend par 20 cm3 de chlorure de méthylène. On verse dans cette solution, en agitant, 2, 5 g de glycinate d'éthyle dissous dans 10 cm3 de chlorure de méthylène et 5 g de dicyclohexylcarbodiimide, abandonne une nuit, ajoute 1 cm3 d'acide acétique pour détruire le d'icyclohexylcarbodiimide en excès, filtre le précipité de dicyclohexylurée formé et lave ce précipité au chlorure de méthylène.
Après avoir réuni le filtrat et le liquide de lavage dans, une ampoule à décanter, on lave à l'acide chlorhydrique normal pour éliminer le glycinate d'éthyle qui n'a pas réagi, puis a 1'eau, a 1'ammaniaqwe et à l'eau. Le chlorure de méthylène est séché sur sulfate de sodium, filtré et évaporé à sec. On obtient ainsi environ 16 g de N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycinate d'éthyle de formule IV (R = CHS) sous forme de produit brut pulvérulent, suffisamment pur pour la suite des opérations.
Détrtylation à l'azote
du N, S-ditrityl-L-cystéinyl-glycinate d'éthyle
de f ormule I V
16 g du derive de formule IV est repris par 40 cm3 d'acétone. On ajoute 10 cm3 d'acide chlorhydrique 5 N et agite à la température ambiante. La solution se clarifie d'abord avec un léger échauffe- ment puis se trouble par suite de la cristallisation du triphénylcarbinol.
Après avoir abandonné un quart d'heure, on ajoute au filtrat 10 cm3 d'eau et distille une partie de l'acétone, on dilue par 50 cm3 d'eau et extrait le chlorhydrate da S-trityl-L-cysteinyl-gly- cinate d'éthyle au chloroforme à deux reprises. Les extraits chloroformiques réunis sont séchés sur sulfate de soude et évapor6s à sec après filtration. Le résidu est repris par 100 cm3 d'éther et 50 cm3 d'éther de pétrole, le composé de formule V (r = C2H5) précipite à l'état pulvérulent.
Après essorage et lavage à l'éther, il est seche. Il est suffisamment pur pour la condensation avec l'acide
N-trityl-glutamique. Le rendement est de 8, 4 g de chlorhydrate de S-trityl-cysteinyl-glycinate d'ethyle de formule V brut (soit 86, 0/o par rapport à la N, S ditrityl-Lrcysteine de départ).
Par saponification de ce produit par deux minutes de chauffage au bain-marie dans 10 volumes de potasse hydroalcoolique normale suivie d'une acidification, filtration et recristallisation en alcool aqueux, on obtient l'hydrate de S-trityl-L-cysteinyl- glycine sous forme de feuillets incolores, F = 1200 C environ (avec déshydratation), [α]D20 = + 17,5 # 1 (c = 2 /o, soude N/10 en mathanol a 90 /o) (pro- duit anhydre).
Le produit se déshydrate à 80 C. Il est soluble dans le chloroforme et les alcalis dilués aqueux, peu soluble dans les acides dilués aqueux et l'alcool, insoluble dans l'éther. Il ne donne pas de réaction avec le nitroprussiate de soude.
Analyse : C24H24N2O3S = 420,52
Calculé : C 68,54 % H 5,75 % N 6,66 % S 7,62 %
Trouvé : C 68,3 % H 5, 8 O/o N 6, 4 % S 7, 2 %
Ce composé est nouveau.
Préparation de l'acide N-trityl-L-glutamique
Cet acide est obtenu par hydrogénolyse sélective du N-trityl-glutamate de dibenzyle. 57 g de N-tritylglutamate de dibP < nzyle, decrit dans le brevet suisse No 344714, sont dissous dans 500 cm3 d'acétate d'éthyle.
On introduit du noir palladié (préparé par hydrogénation d'un mélange de 15 g de noir végétal et 5 cm3 de chlorure palladeux à 20 /o dans 200 cm3 d'eau) et ajoute 27 cm3 de triéthylamine pour salifier l'acide N-trityl-glutamique au fur et à mesure de sa libération par hydrogénolyse et éviter ainsi la détritylation. On hydrogène jusqu'à fixation de la quantité théorique d'hydrogène, ce qui demande environ quarante-cinq minutes, essore le catalyseur, le lave à l'acétate d'éthyle,
réunit le liquide de lavage au filtrat précédent et concentre à 100 cinq environ.
Après refroidissement, il y a prise en masse. On ajoute 100 cm3 d'ether, essore, lave à l'éther et sèche à 800 C. Il y a départ partiel de triéthylamine et lon obtient finalement 32 g de sel acide de triéthyl- amine de l'acide N-trityl-glutamique. Une récupéra- tien à partir des eaux mères porte le rendement global a 81' /o (40 g). Le sel acide se recristallise dans l'acétae d'éthyle.
Il sc pr6sente sous forme d'aiguilles, F = 100 C (pâteux), [α]D20 = -32 # 2 (c = 2 /0, chloroforme), solubles dans l'eau, le chloroforme et l'alcool, insolubles dans l'éther.
Analyse : C30H38O4N2 = 490, 63
Calculé : C 73, 44 O/o H 7, 81 /o N 5, 71 /o
Trouvé ; C 73,2 % H 7, 9 % N 5, 5 /o
Ce composé est nouveau.
Par reprise au chloroforme et décomposition par la quan, tité calculée d'acide chlorhydrique, il donne l'acide N-trityl-glutamique de formule VI & l'état amorphe [a] D =-f-27, 5 2 (c = 2 O/o, m6thanol).
Le même acide peut être obtenu par tritylation directe de l'acide L-glutamique en présence de diethylamine dans. des conditions similaires à celles décrites pour la tritylation de la cystéine ou encore, par saponification du N-trityl-glutamate de-mono- méthyle ou éthyle. Ce produit donne des sels bien oristallisés avec la diéthylamine et le L (+)-thréo-l- p-nitrophényl-2-aminopropanc-1, 3-diol.
Condensation de l'acide N-trityl-glutamique
avec le S-trityl-L-cystéinyl-glycinate d'éthyle
et saponification
18 g de chlorhydrate de S-trityl-L-cysteinyl-gly- cinate d'éthyle sont dissous dans 50 cm3 de chlorure de méthylène. On lave la solution avec de l'ammoniaque mormal en léger excès pour déplacer la base, puis à l'eau, sèche sur sulfate de sodium, filtre et ajoute 9, 5 g de dicyclohexylcarbodiimide puis 19, 6 g de sel acide de triéthylamine de l'acide N-trityl-glutamique décrit ci-dessus.
Après une nuit, on ajoute 2 cm2 d'acide acétique pour détruire le dicyclohexyl carbodiimide en excès et filtre la dicyclohexylurée formée après un quart d'heure d'abandon. Après essorage et lavage au chlorure de méthylène de la dicyclohexylurée, on réunit les chlorures de méthy- lène, on les lave à l'acide chlorhydrique N/2, puis à l'eau, sèche sur sulfate de soude, filtre et évapore à sec.
On obtient ainsi l'ester éthylique du N, S-ditri- tyl-L-glutathion brut de formule VII, que l'on reprend par l'alcool dont on distille une partie pour chasser le chlorure de méthylène. On chauffe au bain-marie et ajoute petit à petit 80 cm3 de soude normale. La saponification est terminée en dix minou- tes. On dilue par 200 cm3 d'eau, refroidit à la tem- pérature ambiante et acidifie par 81 cm3 d'acide chlorhydrique N et extrait au chloroforme.
L'extrait chloroformique est lavé à l'eau, séché sur sulfate de soude et évaporé à sec sous vide après filtration. On obtient ainsi un résidu amorphe constitué par le
N, S-ditrityl-L-glutathion.
Détritylation à l'azote du N, S-ditrityl-L-glutathion
Le résidu obtenu est repris par 60 cm3 d'acide acétique aqueux à 50 /o et chauffé cinq minutes au bain-marie. Le triphénylcarbinol précipite. On dilue par 500 cm3 d'eau environ et extrait au chloroforme.
L'extrait chloroformique est lave a 1'Eau, seche sur sulfate de soude, filtré, passé au noir puis concentre à faible volume. On précipite le S-trityl-L-glutathion brut de formule VIII par addition d'alcool absolu, essore et lave à l'alcool puis à l'éther. Après séchage, on obtient 16 g (soit un rendement de 70 ouzo par rapport aux deux constituants de départ) de S-trityl
L-glutathion brut VIII sous forme de produit pulvé- rulent blanc.
Détritylaton du S-trityl-L-glcctathion
5 g de dérivé de formule VIII sont dissous dans 50 cm3 de chloroforme anhydre. On fait passer de l'acide chlorhydrique gazeux anhydre pendant quelques minutes. La solution se trouble et le chlorhydrate brut du L-glutathion de formule IX, précipite.
On ajoute 50 cm3 d'6ther anhydre, agite, essore le chlorhydrate hygroscopique, lave à l'éther sur filtre, le dissout dans 10 cm3 d'eau distillée et ajoute à cette solution, petit à petit, de l' Amberlite IR4B de façon à ajuster le PEI à 2. On filtre la resine echan- geuse d'ions, lave à l'eau et concentre le filtrat réuni aux eaux de lavage sous vide et sous azote, presque à sec, la température du bain-marie étant de 40 C.
Le résidu est repris par l'alcool à 75 n/o. Apres abandon en exsiccateur, le L-glutathion cristallise. On 1'essore, lave à l'alcool et sèche. Le produit est identique sous tous les rapports au L-glutathion naturel.
Process for the preparation of glutathione
The subject of this patent is a process for preparing L-glutathione or dy-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine, a natural tripeptide of formula:
EMI1.1
whose physiological importance has been demonstrated in the <<Symposium of glutathione - Proceedings of the Symposium held at Ridgefield, Connecticut, November 1953, New York Acad. Press. 1954.
This compound was not easily accessible until now, the methods employed generally using as blocking agent for the mercaptan function, benzoyl chloride. This generally resulted in a, u peptide corresponding to glutathione, the amine function of which was blocked by a carbobenzoxy group, the sulfur being benzylated.
As hydro- genolysis cannot be applied to compounds, és
S-benzylated, we were forced, lastly, to release the mercaptan function of glutathione either by the action of sodium in liquid ammonia, or by the action of phosphonium indide, two methods which are difficult to apply in industry.
In Swiss patent N 338197 the holder described the preparation of N-trityl-amino acids and their use for the preparation of N-peptides by the mixed anhydride method, It was subsequently shown in Swiss patent No 343407 that the N -trityl-amino acids allowed easy access to N-trityl-peptides by reacting them with the ester of an amino acid in the presence of dicyclohexylcarbodiimide, a condensation agent recommended in peptide synthesis by Sheehan and Hess (J. Am.
Chem. Soc., 1955, 77, 1066) for other amino acid derivatives, the ester of the N-trityl peptide thus obtained being then saponified and then detritylted with hot aqueous acetic acid.
Finally, in Swiss Patent No. 348161, it was recommended to use the α-benzyl ester of N-trityl-glutamic acid to access Y-glut-amyl-peptides by oondensation in the presence of dicychlohexylcarbodiimide with an ester bezyl of an amino acid. The acid functions of Lrglutamyl-peptide-N-trityl are then liberated by hydrogenolysis and detritylated with hot aqueous acetic acid.
L-glutathione is prepared by synthesis according to the method of the present invention starting from L-cysteine of formula I, the first step consists in tritylating L-cysteine, for example by reaction of trityl chloride with L-cysteine in a mixture of water and a suitable solvent such as alcohol or ether in the presence of an organic base such as diethylamine which was used by Zervas (IVth International Congress of Pure Chemistry and application)
for the tritylation of unsulfurized α-amino acids. The prior preparation of the L-cysteine ester before tritylation and its subsequent saponification is avoided. The N, S-ditrityl cyseine of formula 11 can be separated in the form of its diethylamine salt by virtue of the imolubility of this salt in ether and alcohol. During the reaction, a little S-trityl-L-cysteine of formula III is simultaneously formed, which can easily be separated by taking advantage of its insolubility in ether.
The N, S-ditrityl-L-cysteine obtained from its diethylamine salt is not condensed with an ester of this glycine, for example ethyl or methyl glycinate, in the presence of a disubstituted carbodiimide such as dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide or methyl-terbutylcarbodiimide. The N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycine ester of formula IV thus obtained is detritylated on the nitrogen atom, for example by means of hydrochloric acid in hydroacetonic solution at room temperature.
The N-trityl-L-glutamic acid of formula VI is then reacted with the ester of S-trityl-L-cysteinylglycine in the presence of a disubstituted carbodiimide to obtain the ester of N, S-ditrityl-L. -glutathione of formula VII.
The ester of the tripeptide is then saponified with formation of N, S-ditrityl glutathione, and then the latter is detritylated, generally first on the nitrogen atom, for example by means of hot aqueous acetic acid. results in S-trityl-L-glutathione of formula VIII, which in turn is detritylated to the sulfur atom, for example by treatment with a chloroform solution of gaseous hydrochloric acid. L-glutathione hydrochloride was thus obtained, from which the L-glutathione of formula IX was released.
The above reactions can be illustrated by the following equations:
EMI2.1
<tb> <SEP> HS-CH2-CH-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> 2
<tb> <SEP> I
<tb> C6H5 <SEP> CoH5
<tb> C6Hs / C-S-CH2-ICH-COOH <SEP> + <SEP> CoH7C-S-CH2-ICH-COOH
<tb> CsHs / I <SEP> CeHs <SEP> CsHs / NH
<tb> <SEP> C6H5
<tb> <SEP> C6Hs
<tb> <SEP> (III)
<tb> <SEP> (II)
<tb> <SEP> H2N-CH2-COOR
<tb> <SEP> in <SEP> presence <SEP> of <SEP> dicyclohexylcarbodiimide
<tb> C6Hs \,
<tb> CeHs-C-S-CH2-CH-CONH-CH2-COOR
<tb> C6H5 <SEP> C6H, <SEP> 5
<tb> <SEP> NH-CC6Hs
<tb> <SEP> Cr, <SEP> H5
<tb> <SEP> (IV)
<tb> CsHs \
<tb> C6Hs <SEP> jC-S-CH2-CH-CO-NH-CH2-COOR
<tb> C6H5 <SEP> NH2
<tb> <SEP> HOOC-CH2-CH2-CH-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> / CcHs
<tb> <SEP> / NH <SEP> C / C <SEP> H
<tb> <SEP> C6H.
<SEP> 5
<tb> <SEP> / C6H5
<tb> CsHs
<tb> C6Hs \ C-S-CH2-CH-CONH-CH2-COOR
<tb> <SEP> I
<tb> CEHs / NH
<tb> <SEP> CL
<tb> <SEP> UR2
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> C6H5 <SEP> CH2
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> C6HsC <SEP> ¯NH¯ <SEP> CH
<tb> / I <SEP> (VII)
<tb> <SEP> CcHs /, <SEP> ICOOH
<tb>
EMI3.1
The new process therefore excels in its great simplicity because it uses only a minimum of stages and a single reagent for blocking sulfur and nitrogen. Its outstanding features are the selective detritylation with nitrogen by the action of hot aqueous acetic acid or hydrochloric acid in cold hydroacetonic solution,
and the detritylation of S-trityl-L-glutathione to sulfur by gaseous hydrochloric acid to chloroform, reactions which are easy to carry out on an industrial scale and which do not cause racemization. In addition, it uses the jump conden, ion of N-trityl-L-glutamic acid with esters of S-trityl-L-cysteinyl-glycine.
In the following examples, the melting points are instantaneous melting points determined on a Maquenne block. The formulas of the compounds appear in the diagram appended at the end of the description.
The procedure described can obviously be employed starting from the racemic amino acids or from the enantiomorphs. Likewise, it is possible to detritylate N, S-ditrityl-L-glutathione simultaneously with nitrogen and sulfur. It is in particular possible to change the solvent, to use another ester of S-trityl-Lr cysteinyl-glycine than that mentioned, or to use, as condensing agent, another disubstituted carbodiimide than those mentioned.
Example
Preparation of N, S-ditrityl-L-cysteine
formula 11
In a solution, cooled to 0 C, of 25 g of cysteine hydrochloride, of formula I [α] D20 = +5.5 (c = 1 / o, N hydrochloric acid) in 480 cm3 of water, is introduced , under a stream of nitrogen and mechanical stirring, 480 cm3 of ether and 80 cm3 of diethylamine and cooled to -5 ° C. Without interrupting the stirring, 120 g of trityl chloride are introduced rapidly and the operation continued. stirring for three hours.
The reaction mixture becomes a pasty mass which is quite difficult to stir. 150 to 200 cm3 of chloroform are then added, decanting the aqueous phase which contains only diethylamine hydrochloride and unreacted cysteine hydrochloride. The
S-trityl-cysteine esterified with trityl chloride as well as N, S-ditrityl-L-cysteine in the form of diethylamine salt and trityl ester, pass into the organic layer which is washed again with 300 cm3 of water, dry the ethereal chloroform solution over sodium sulfate and concentrate, after filtration, to a small volume.
Then 100 cm3 of alcohol containing 1 cm3 of diethylamine are added and the solvent is distilled off until it has entrained all the chloroform. The diethylamine salt of N, -S-ditrityl-cysteine of the formula
It crystallizes. Crystallization is completed by gradual addition of 100 cm 3 of ether, ice, filtered off and dried.
55 g of pure salt was thus obtained in the form of needles [a] D20 = + 71 # 1 (c = 2 / o, chloroform), soluble in chloroform, very slightly soluble in alcohol, insoluble in water. and ether. Reactions with ninhydrin and sodium nitroprusside are negative.
Analysis: C45H46O2N2S = 678.91
Calculated: C 76.61% H 6.83% N 4.13% S 4.72% Found: C79.4 / o H6.9 O / o N 4.0'O / o S 4.7 / o
This compound is not described in the literature.
A second spray of product is obtained from the mother liquors of crystallization, bringing the overall yield to approximately 70 g. By taking up this salt in acidulated water, it is decomposed with release of the N, S-ditrityl-L-cysteine of formula II, which can be easily extracted with ether in which it is quite soluble. Evaporation of the ether provides the crude product in an amorphous state.
The residue resulting from the concentration of the etheroalcoholic stock solution of the diethylamine salt of N, S-ditrityl L-cysteine and containing the trityl esters of S-trityl-L-cysteine and of N, S-ditrityl- L-cysteine is treated for ten minutes at reflux with 50% aqueous acetic acid in ethereal solution. It provides a mixture of N, S-ditri, tyl-L-cysteine and S-trityl-Lcysteine which can be separated thanks to the insolubility of this defnière in ether. S-trityl-L-cysteine is purified by recrystallization from alcohol.
It is then presented in needles, F = 202-205 C, [α] D20 ¯-I-19 1 (c = 2%, soda N / 10), soluble in dilute aqueous alkalis, sparingly soluble in water. alcohol and dilute aqueous acids, insoluble in ether and water. It gives a positive reaction to ninhydrin and a negative reaction to sodium nitroplusside.
Analysis C22H21O2NS = 363.47
Calculated: C 72.69% H 5.825 N 3.85% S 8.82%
Found: C 72.8% H 6.0% N 3.6% S 8.40 / o
Condensation of N, S-ditrityl-L-cysteine, II,
with ethyl glycinate
13.6 g (0.02 mol) of diethylamine salt of N, S-ditrityl-L-cysteine are dissolved in 50 cm3 of chloroform and stirred with 20 cm3 of normal hydrochloric acid to release the acid. which passes into chloroform.
After decantation, the chloroform layer is dried over sodium sulfate, filtered, vacuum distilled to dryness and taken up in 20 cm3 of methylene chloride. Was poured into this solution, with stirring, 2.5 g of ethyl glycinate dissolved in 10 cm3 of methylene chloride and 5 g of dicyclohexylcarbodiimide, left overnight, added 1 cm3 of acetic acid to destroy the cyclohexylcarbodiimide in excess, filters the precipitate of dicyclohexylurea formed and washing this precipitate with methylene chloride.
After combining the filtrate and washing liquid in a separatory funnel, washing with normal hydrochloric acid to remove unreacted ethyl glycinate, then with water, ammonia and water. at the water. The methylene chloride is dried over sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness. In this way approximately 16 g of ethyl N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycinate of formula IV (R = CHS) are obtained in the form of a pulverulent crude product, sufficiently pure for the rest of the operations.
Nitrogen detrtylation
ethyl N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycinate
from formula I V
16 g of the derivative of formula IV is taken up in 40 cm3 of acetone. 10 cm3 of 5N hydrochloric acid are added and stirred at room temperature. The solution first clarifies with slight heating and then becomes cloudy due to the crystallization of triphenylcarbinol.
After leaving a quarter of an hour, 10 cm3 of water are added to the filtrate and part of the acetone is distilled, diluted with 50 cm3 of water and the hydrochloride is extracted from S-trityl-L-cysteinyl-gly- ethyl cinate with chloroform twice. The combined chloroform extracts are dried over sodium sulfate and evaporated to dryness after filtration. The residue is taken up in 100 cm3 of ether and 50 cm3 of petroleum ether, the compound of formula V (r = C2H5) precipitates in the pulverulent state.
After filtering and washing with ether, it is dried. It is sufficiently pure for condensation with acid
N-trityl-glutamic. The yield is 8.4 g of crude S-trityl-cysteinyl-glycinate hydrochloride of formula V (ie 86.0 / 0 relative to the starting N, S ditrityl-Lrcysteine).
By saponification of this product by two minutes of heating in a water bath in 10 volumes of normal hydroalcoholic potassium hydroxide followed by acidification, filtration and recrystallization in aqueous alcohol, the hydrate of S-trityl-L-cysteinyl-glycine is obtained under colorless sheet form, F = 1200 C approximately (with dehydration), [α] D20 = + 17.5 # 1 (c = 2 / o, N / 10 soda in 90 / o mathanol) (anhydrous product ).
The product dehydrates at 80 C. It is soluble in chloroform and dilute aqueous alkalis, sparingly soluble in dilute aqueous acids and alcohol, insoluble in ether. It does not react with sodium nitroprusside.
Analysis: C24H24N2O3S = 420.52
Calculated: C 68.54% H 5.75% N 6.66% S 7.62%
Found: C 68.3% H 5.8 O / o N 6.4% S 7.2%
This compound is new.
Preparation of N-trityl-L-glutamic acid
This acid is obtained by selective hydrogenolysis of dibenzyl N-trityl-glutamate. 57 g of dibP <nzyl N-tritylglutamate, described in Swiss patent No. 344714, are dissolved in 500 cm3 of ethyl acetate.
Palladium black (prepared by hydrogenation of a mixture of 15 g of vegetable black and 5 cm3 of 20 / o palladium chloride in 200 cm3 of water) is introduced and 27 cm3 of triethylamine is added to salify the N-trityl acid. -glutamic as it is released by hydrogenolysis and thus avoid detritylation. Hydrogenation is carried out until the theoretical quantity of hydrogen is fixed, which takes approximately forty-five minutes, the catalyst is filtered off and washed with ethyl acetate,
combines the washing liquid with the previous filtrate and concentrates to about 100 five.
After cooling, there is solidification. 100 cm3 of ether are added, filtered off, washed with ether and dried at 800 C. There is partial departure of triethylamine and finally 32 g of the acid salt of triethylamine of N-trityl-glutamic acid are obtained. . Recovering from the mother liquors brought the overall yield to 81% (40 g). The acid salt recrystallizes from ethyl acetate.
It is presented in the form of needles, F = 100 C (pasty), [α] D20 = -32 # 2 (c = 2/0, chloroform), soluble in water, chloroform and alcohol, insoluble in ether.
Analysis: C30H38O4N2 = 490.63
Calculated: C 73, 44 O / o H 7, 81 / o N 5, 71 / o
Find ; C 73.2% H 7.9% N 5.5 / o
This compound is new.
On taking up in chloroform and decomposition by the calculated quantity of hydrochloric acid, it gives N-trityl-glutamic acid of formula VI & the amorphous state [a] D = -f-27.5 2 (c = 2 O / o, methanol).
The same acid can be obtained by direct tritylation of L-glutamic acid in the presence of diethylamine in. conditions similar to those described for the tritylation of cysteine or alternatively, by saponification of monomethyl or ethyl N-trityl-glutamate. This product gives well-oristallized salts with diethylamine and L (+) - threo-1-p-nitrophenyl-2-aminopropanc-1, 3-diol.
Condensation of N-trityl-glutamic acid
with ethyl S-trityl-L-cysteinyl-glycinate
and saponification
18 g of ethyl S-trityl-L-cysteinyl-glycinate hydrochloride are dissolved in 50 cm3 of methylene chloride. The solution was washed with normal ammonia in slight excess to displace the base, then with water, dried over sodium sulfate, filtered and added 9.5 g of dicyclohexylcarbodiimide followed by 19.6 g of the acid salt of triethylamine. N-trityl-glutamic acid described above.
After one night, 2 cm 2 of acetic acid are added to destroy the excess dicyclohexyl carbodiimide and filter the dicyclohexylurea formed after a quarter of an hour of abandonment. After draining and washing the dicyclohexylurea with methylene chloride, the methylene chlorides are combined, washed with N / 2 hydrochloric acid, then with water, dried over sodium sulphate, filtered and evaporated to dryness. .
In this way the ethyl ester of crude N, S-ditrityl-L-glutathione of formula VII is obtained, which is taken up in the alcohol, a part of which is distilled to remove the methylene chloride. Heat in a water bath and gradually add 80 cm3 of normal soda. The saponification is completed in ten minutes. Diluted with 200 cm3 of water, cooled to room temperature and acidified with 81 cm3 of N hydrochloric acid and extracted with chloroform.
The chloroform extract is washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness under vacuum after filtration. An amorphous residue is thus obtained consisting of
N, S-ditrityl-L-glutathione.
Nitrogen detritylation of N, S-ditrityl-L-glutathione
The residue obtained is taken up in 60 cm 3 of 50% aqueous acetic acid and heated for five minutes in a water bath. Triphenylcarbinol precipitates. Diluted with approximately 500 cm3 of water and extracted with chloroform.
The chloroform extract is washed with water, dried over sodium sulfate, filtered, darkened and then concentrated to low volume. The crude S-trityl-L-glutathione of formula VIII is precipitated by adding absolute alcohol, filtered off and washed with alcohol and then with ether. After drying, 16 g (i.e. a yield of 70 ouzo relative to the two starting constituents) of S-trityl are obtained
Crude L-glutathione VIII as a white powdery product.
S-trityl-L-glcctathione detritylaton
5 g of derivative of formula VIII are dissolved in 50 cm3 of anhydrous chloroform. Anhydrous gaseous hydrochloric acid is passed through for a few minutes. The solution becomes cloudy and the crude L-glutathione hydrochloride of formula IX precipitates.
50 cm3 of anhydrous ether are added, stirred, the hygroscopic hydrochloride is filtered off, washed with ether on a filter, dissolved in 10 cm3 of distilled water and added to this solution, little by little, Amberlite IR4B so adjusting the PEI to 2. The ion exchange resin is filtered, washed with water and the combined filtrate is concentrated in the washing water under vacuum and under nitrogen, almost to dryness, the temperature of the water bath being 40 C.
The residue is taken up in alcohol at 75 n / o. After abandonment in the desiccator, L-glutathione crystallizes. It is filtered off, washed with alcohol and dried. The product is identical in all respects to natural L-glutathione.