Procédé de préparation de la dibenzyloxyphosphorylcréatinine
La présente invention concerne un procédé de préparation de la dibenzyloxyphosphorylcréatinine.
La phosphocréatine a été isolée du muscle par
C. H. Fiske et Subarrow (Journal of Biological Chemistry, 81, 1929, p. 620). Ces auteurs ont établi aussi sa constitution qui répond à la formule:
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Le rôle, que joue cette substance dans la contraction musculaire, est bien connu en tant que donneur de Fion phosphate, d'où dérive l'appellation Phosphagène .
Jusqu'à 1938, la phosphocréatine était isolée du muscle sous forme de sels alcalino-terreux. C'est à cette date que K. Zeile et G. Fawaz (Hoppe Seyler's
Zeitschrift für Physiologisehe Chemie, 256, 1938, p. 194) réussirent à obtenir de petites quantités de phosphocréatinate de calcium, en phosphorylant la créatine, en milieu très fortement basique, par de l'oxychlorure de phosphore.
A.H. Ennor et L. A. Stocken (Biochemical Journal, 43, 1948, p. 190) ont fait appel à la technique de phosphorylation de Zeile, puis à une variante du procédé d'isolement de Fiske et ont obtenu également de petites quantités de phosphocréatinate de sodium tébra ou hexahydraté. C'est, à peu de chose près, le procédé d'Ennor et Stocken qui est décrit dans Bio chemisai Preparations V, 1957, p. 9. Ce procédé est long et les séparations sont laborieuses. Tous les autres essais de synthèse de la phosphocréatine ont été infructueux.
Par le présent procédé, on peut obtenir de la phosphocréatine sous sa forme cyclisée par une voie de synthèse, qui permet sa fabrication à l'échelle industrielle.
Fol est connu que les dérivés O-substitués des isourées, les dérivés S-substitués des isothiourées ou les cyanamides substituées sont susceptibles de réagir avec des amines pour former des guanidines ; par exemple, F. Cramer et A. Vollman dans les Chemische Berichte, vol. 91, 1958, p. 920, ont con densé des diesters des phosphorylisotaiouréides avec des dérivés aminés et entrevu la possibilité de condenser avec des a-aminoacides ou des esters d'α
- aminoacides. I1 a été effectivement constaté, par la demanderesse, qu'une telle condensation permettait d'obtenir des triesters de guanidines phosphorylées et substituées par une chaîne contenant un groupe COOH. Par ce procédé, on peut aboutir à des triesters de phosphooréatine.
Des triesters particulièrement intéressants sont ceux de formule générale:
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dans laquelle Alk représente un groupe alcoyl inférieur.
Ils peuvent en effet être soumis à une hydrolyse, dans des conditions ménagées de telle manière que seul le groupe ester carboxylique soit hydrolysé. En soumettant ensuite le produit isolé à une hydrogénolyse on provoque le clivage des groupes esters phosphoriques sans scission de la liaison
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Pour obtenir de bons résultats, il faut ohoisir les diesters des phosphorylisothiouréides de départ, de manière telle que ce clivage sans scission de la
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soit possible ; de tels diesters sont les diesters de l'alcool benzylique.
C'est ainsi qu'a été tout d'abord préparé, entre autres esters, le dérivé Ndibenzyi-oxy-phosphorylé de la S-méthyl isothiourée:
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par action du phosphite dibeuzylique en solution dans le tétrachlorure de carbone (A. R. Todd et Col.
Journal of Chemical Society, 1945, p. 662) sur le sulfate de iméthyl isothiouronium en présence de soude.
Cette N-dibenzyl-oxy-phosphoryl-S-méthyl isothiourée a été soumise à l'action de l'oxyde de mercure (HgO), dans le but de préparer la cyanamide correspondante, compte tenu des travaux de H. J.
Backer et H. P. Moed (Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 66, 1947, p. 335) et de H. J.
Backer et S. K. Wodman (Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 68, 1948, p. 595); ces auteurs ont observé, en effet, la faible stabilité de la p.nitro phényl-sulfonylcyanamide. Ils ont, par contre, signalé la possibilité de travailler avec son sel de sodium; c'est pourquoi il est utile d'ajouter, au milieu désulfurant, du carbonate de sodium de façon à former, au fur et à mesure de sa naissance, le dérivé sodé de la dibenzyl-oxy-phosphoryl-cyanamide ;
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Ce sel réagit en milieu alcoolique avec le chior- hydrate de sarcosinate d'éthyle;
il y a formation du dibenzyl-oxy-phosphoryl créatinate d'éthyle, suivant le schéma:
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Le contact de ce triester en milieu hydroalcoolique avec de la soude diluée et à froid hydrolyse la fonction ester du groupe carboxylique, mais toute autre condition d'hydrolyse aboutissant au même résultat peut être utilisée. Le sel de sodium de la dibenzyl-oxy-phosphoryl-créatine ainsi obtenu se transforme sous l'action des acides, mêmes faibles, en dibenzyl-oxy-phosphoryl-créatinine suivant la réaction:
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Le procédé selon l'invention pour la préparation de la dibenzyl-oxy-phosphoryl-créatinine est donc caractérisé en ce que l'on hydrolyse en milieu alcalin un ester de formule (II) et soumet le diester obtenu à l'action d'un acide.
La constitution du dérivé de formule (VI) a été prouvée par l'analyse centésimale et aussi par comparaison avec les résultats obtenus à partir du di phénoxy-phosphoryl-créatinate d'éthyle. Ce triester, traité de façon analogue, donne naissance à la di phénoxy-phosphoryl-créatinine:
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Cette substance a été décrite par H. R. Ing (Journal of the Chemical Society, 1932, p. 2054) et par
K. Zeile et H. Meyer (Hoppe Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 252, 1938, p. 101) qui l'ont obtenue par des procédés tout à fait différents du présent procédé.
Cette cyclisation est remarquable et inattendue.
K. Zeile et H. Meyer (Hoppe Seyler's Z. Physiol.
Chem., 256, 1938, p. 131) ont montré en effet que, s'il est facile de passer de la phosphocréatinine à la phosphocréatine par ouverture du cycle, il est impos sible de transformer par cyclisation la phosphocréatine en phosphocréatinine. I1 a maintenant été montré que cette cyclisation est possible quand les fonctions acides du groupe phosphorique de la phosphocréatine sont estérifiées.
L'hydrogénolyse de la dibenzyl-oxy-phosphorylcréatinine conduit ensuite, avec aisance, en présence de soude par exemple au sel disodique de la phosphocréatinine :
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Grâce au procédé selon l'invention on peut préparer industriellement ce composé, que Zeile et ses collaborateurs ont obtenu par une méthode compliquée et en très petites quantités.
La phosphocréatinine peut ainsi être obtenue très pure, par exemple, à l'état de sel de sodium cristallisé avec 5 molécules d'eau. L'ouverture de la phosphocréatinine en phosphocréatine peut être pratiquée suivant le procédé de Zeile ou en milieu plus concentré. La phosphocréatine préparée suivant oe procédé est identique à la phosphocréatine naturelle extraite du muscle; ce fait a été confirmé par la comparaison des courbes de neutralisation de la demanderesse avec celles décrites par H. Fiske et
Subarrow (Biochemical Chemistry 81, 1929, p. 629),
O. Meyerhof et K. Loran (Biochemlische Zeitschrift 196, 1928, p. 66) et K. Zeile et H. Meyer (Hoppe Seyler's Z. 256, 1938, p. 135).
Le schéma des synthèses de la dibenzyl-oxy phospho-créatinine et de la phosphocréatinine est en résumé le suivant:
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Uans les exemptes ci-dessous donnes à Autre non limitatif les parties indiquées sont en poids, sauf indications contraires.
Exemple
Préparation de la N-dibenzyloxy-phosphoryl
S-méthyl isothiourée (formule III)
Dans un appareil muni d'un agitateur mécanique, d'un thermomètre et d'un jaugeur, on dissout, dans 294 parties d'eau, 99 parties de sulfate de S-méthyl isothiourée préparées comme décrit dans Organic
Syntheses, vol. XII, p. 52. On ajoute 186 parties de phosphite dibenzylique (préparation selon Todd
Journal of Chemical Soeiety, 1945, p. 384 et 1946, p. 662), dissoutes dans 750 parties en volume de tétrachlorure de carbone. Sous une bonne agitation et par l'intermédiaire du jaugeur, on ajoute 56,8 parties de soude dissoutes dans 170 parties d'eau, en maintenant la température entre 5 et 100 C par l'intermédiaire d'un bain réfrigérant. L'introduction de la soude dure environ une heure.
On laisse sous agitation encore une heure, puis au repos jusqu'au lendemain. On ajoute alors 300 parties en volume de chloroforme pour dissoudre le solide et laisse décanter; la phase organique est séchée sur du sulfate de sodium; on filtre et évapore à sec sous pression réduite. Le produit se prend en masse; on filtre en s'aidant d'éther de pétrole. On obtint ainsi 225 parties de N-dibenzyloxy-phosphoryl S-méthyl isothiourée, soit un rendement de 90 /o. Le produit fond au capillaire à 850 C. On peut le faire recristalliser dans des mélanges d'éthanol-eau ou de benzène- éther de pétrole; le point de fusion est alors de 860 C.
Analyse pour C16H19N2O3P S
Calculé %: N 7,99 P 8,84 S 9,14
Trouvé O/o: N 7,65 P 8,75 S 9,27
Préparation de la dibenzyloxyphosphoryl-
créatinine
Dans un appareil muni d'un agitateur et d'un réfrigérant on introduit 175 parties de dibenzyloxyphosphoryl S-méthyl isothiourée, 3000 parties d'al- cool à 80 %, 26,5 parties de carbonate de sodium et 54 parties d'oxyde rouge de mercure. On chauffe à l'ébullition sous agitation pendant deux heures.
Après refroidissement on filtre le mercaptide de mercure et élimine le solvant sous pression réduite. Le résidu est repris par 1000 parties d'alcool absolu, on ajoute à cette solution 76,75 parties de chior- hydrate de l'ester éthylique de la sarcosine de point de fusion: 121-122 C dissoutes dans 200 parties d'alcool. On laisse reposer la nuit, puis le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant deux heures.
Après refroidissement et filtration du chlorure de sodium on élimine l'alcool présent dans le filtrat. Le résidu est dissous dans 250 parties d'alcool et l'on ajoute 60 parties en volume de soude 10 N. On laisse en contact pendant une heure; on ajoute 250 parties d'eau ; on filtre et la solution est acidifiée par 36 parties d'acide acétique. On abandonne pendant une nuit à la cristallisation ; on filtre et lave le précipité à l'alcool à S00/o, puis à l'eau et finalement à l'alcool à 50 % et l'on sèche à l'étuve à la température de 500 C. On obtient ainsi 132 parties de dibenzyioxyphosphorylcréatinine de point de fusion 91-92 C, soit un rendement de 71 %.
Cette dibenzyloxyphosphorylcréatinine se prête très bien sans une autre purification à la préparation de la phosphocréatinine.
Pour l'analyse on la fait recristalliser dans du méthanol à 70 /o. Le rendement de la recristallisa- tion est de 90 %. Le point de fusion s'élève alors à 930 C.
Analyse pour C18H20N3O4P
Calculé % : C 57,90 H 5,40 N 11,25
P 8,30
Trouvé o/o: C 57,68 H 5,96 N 10,89
P 8,54
Sel dirodique de la phosphocréatinine
160 parties de dibenzyloxyphosphorylcréatinine sont dissoutes dans un mélange de 500 parties en volume de soude 2 N et 150 parties en volume d'alcool. A cette solution on ajoute du noir palladié (préparé par hydrogénation d'un mélange de 93 parties de noir de carbone, de 1000 parties d'eau et de 9,3 parties de chlorure de palladium) et l'on hydrogène à température et pression ordinaires. 17 550 parties en volume d'hydrogène sont absorbées en deux heures. Le catalyseur est séparé par filtration et lavé 3 fois avec chaque fois 125 parties d'eau.
Au filtrat on ajoute 3620 parties d'alcool.
Le sel disodique de la phosphocréatinine commence à cristalliser très rapidement, puis se prend en masse. On abandonne une journée, filtre, lave à l'alcool à 80 /o, puis à l'alcool et finalement à l'éther. On sèche sur P2O5 et sous vide à la température ordinaire. On obtient ainsi 117 parties de sel disodique de la phosphocréatinine pentahydraté, soit un rendement de 83 %.
Analyse pour C4H6N3O4PNa2 5H2O P.M. 327
Calculé /o : C 14,68 H 4,89 N 12,84
P 9,48 Na 14,07
Trouvé o/o: C 14,90 H 5,39 N 12,58
P 9,48 Na 14,04
P 9,43 Na 14,00
La courbe de titration est identique à celle décrite par K. Zeile (Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physio logische Chemie, 236, 1936, p. 263) puis par Zeile et Meyer (Ibid. 252, 1938, page 101) qui ont obtenu des petites quantités de cette phosphocréatinine.
Pour la faire recristalliser on dissout à froid dans 2 parties d'eau et après filtration on ajoute 8 parties d'alcool et l'on opère comme précédemment.
Le rendement de la cristallisation est de 83 /o.
Analyse pour C4H6N3O4PNa2 5 H2O P. M. 327
Calculé % : C 14,68 H 4,89 N 12,84
P 9,48 Na 14,07
Trouvé 0/o: C 14,96 H 5,39 N 12,58
P 9,47 Na 14,04
Calculé % : H3O 27,52
Trouvé /o : 1120 27,64
Le produit a été séché sous un vide de 3 L à la température de 600 C jusqu'à poids constant pour doser l'eau. Il a été réhydraté à l'air et à la température ambiante. Le sel disodique de la phospho créatine absorbe alors 2,5 mol d'eau.
Process for preparing dibenzyloxyphosphorylcreatinine
The present invention relates to a process for the preparation of dibenzyloxyphosphorylcreatinine.
Phosphocreatine has been isolated from muscle by
C. H. Fiske and Subarrow (Journal of Biological Chemistry, 81, 1929, p. 620). These authors also established its constitution which responds to the formula:
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The role played by this substance in muscle contraction is well known as a donor of Fion phosphate, from which the name Phospagena derives.
Until 1938, phosphocreatine was isolated from muscle in the form of alkaline earth salts. It was on this date that K. Zeile and G. Fawaz (Hoppe Seyler's
Zeitschrift für Physiologisehe Chemie, 256, 1938, p. 194) succeeded in obtaining small quantities of calcium phosphocreatinate, by phosphorylating creatine, in a very strongly basic medium, with phosphorus oxychloride.
AH Ennor and LA Stocken (Biochemical Journal, 43, 1948, p. 190) used the Zeile phosphorylation technique, then a variant of the Fiske isolation method and also obtained small amounts of sodium phosphocreatinate tebra or hexahydrate. This is more or less the process of Ennor and Stocken which is described in Bio chemisai Preparations V, 1957, p. 9. This process is long and the separations are laborious. All other attempts to synthesize phosphocreatine have been unsuccessful.
By the present process, it is possible to obtain phosphocreatine in its cyclized form by a synthetic route, which allows its manufacture on an industrial scale.
It is known that O-substituted derivatives of isoureas, S-substituted derivatives of isothioureas or substituted cyanamides are capable of reacting with amines to form guanidines; for example, F. Cramer and A. Vollman in Chemische Berichte, vol. 91, 1958, p. 920, condensed phosphorylisotaioureid diesters with amino derivatives and saw the possibility of condensing with α-amino acids or esters of α
- amino acids. It has actually been observed, by the Applicant, that such a condensation makes it possible to obtain phosphorylated guanidine triesters substituted with a chain containing a COOH group. By this process, one can end up with phosphooreatin triesters.
Particularly interesting triesters are those of general formula:
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wherein Alk represents a lower alkyl group.
They can in fact be subjected to hydrolysis under conditions such that only the carboxylic ester group is hydrolyzed. Subsequently subjecting the isolated product to hydrogenolysis cleaves the phosphoric ester groups without splitting the bond.
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To obtain good results, it is necessary to choose the diesters of the starting phosphorylisothiourides, in such a way that this cleavage without splitting of the
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is possible; such diesters are benzyl alcohol diesters.
Thus, among other esters, the Ndibenzyi-oxy-phosphoryl derivative of S-methyl isothiourea was first prepared:
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by the action of dibeuzyl phosphite in solution in carbon tetrachloride (A. R. Todd and Col.
Journal of Chemical Society, 1945, p. 662) on imethyl isothiouronium sulfate in the presence of sodium hydroxide.
This N-dibenzyl-oxy-phosphoryl-S-methyl isothiourea was subjected to the action of mercury oxide (HgO), in order to prepare the corresponding cyanamide, taking into account the work of H. J.
Backer and H. P. Moed (Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 66, 1947, p. 335) and H. J.
Backer and S. K. Wodman (Collection of Chemical Works of the Netherlands, 68, 1948, p. 595); these authors observed, in fact, the low stability of p.nitro phenyl-sulfonylcyanamide. They have, on the other hand, pointed out the possibility of working with its sodium salt; this is why it is useful to add sodium carbonate to the desulfurizing medium so as to form, as it is formed, the sodium derivative of dibenzyl-oxy-phosphoryl-cyanamide;
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This salt reacts in an alcoholic medium with ethyl sarcosinate hydrochloride;
ethyl dibenzyl-oxy-phosphoryl creatinate is formed, according to the scheme:
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Contact of this triester in a hydroalcoholic medium with dilute sodium hydroxide and cold hydrolyses the ester function of the carboxylic group, but any other hydrolysis condition leading to the same result can be used. The sodium salt of dibenzyl-oxy-phosphoryl-creatine thus obtained is transformed under the action of acids, even weak ones, into dibenzyl-oxy-phosphoryl-creatinine following the reaction:
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The process according to the invention for the preparation of dibenzyl-oxy-phosphoryl-creatinine is therefore characterized in that an ester of formula (II) is hydrolyzed in an alkaline medium and the diester obtained is subjected to the action of a acid.
The constitution of the derivative of formula (VI) has been proved by centesimal analysis and also by comparison with the results obtained from ethyl diphenoxy-phosphoryl-creatinate. This triester, treated in a similar way, gives rise to diphenoxy-phosphoryl-creatinine:
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This substance has been described by H. R. Ing (Journal of the Chemical Society, 1932, p. 2054) and by
K. Zeile and H. Meyer (Hoppe Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 252, 1938, p. 101) who obtained it by methods quite different from the present method.
This cyclization is remarkable and unexpected.
K. Zeile and H. Meyer (Hoppe Seyler's Z. Physiol.
Chem., 256, 1938, p. 131) have in fact shown that, although it is easy to switch from phosphocreatine to phosphocreatine by opening the ring, it is impossible to transform phosphocreatine into phosphocreatine by cyclization. It has now been shown that this cyclization is possible when the acid functions of the phosphoric group of phosphocreatine are esterified.
The hydrogenolysis of dibenzyl-oxy-phosphorylcreatinine then leads, with ease, in the presence of sodium hydroxide, for example to the disodium salt of phosphocreatinine:
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Thanks to the process according to the invention, this compound can be prepared industrially, which Zeile and his collaborators have obtained by a complicated method and in very small quantities.
Phosphocreatinine can thus be obtained very pure, for example, in the form of a sodium salt crystallized with 5 molecules of water. The opening of phosphocreatine into phosphocreatine can be carried out according to the method of Zeile or in a more concentrated medium. The phosphocreatine prepared by this process is identical to the natural phosphocreatine extracted from muscle; this fact was confirmed by the comparison of the neutralization curves of the Applicant with those described by H. Fiske and
Subarrow (Biochemical Chemistry 81, 1929, p. 629),
O. Meyerhof and K. Loran (Biochemlische Zeitschrift 196, 1928, p. 66) and K. Zeile and H. Meyer (Hoppe Seyler's Z. 256, 1938, p. 135).
The diagram of the syntheses of dibenzyl-oxy phospho-creatinine and phosphocreatinine is summarized as follows:
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In the exceptions given below, other than non-limiting, the parts indicated are by weight, unless otherwise indicated.
Example
Preparation of N-dibenzyloxy-phosphoryl
S-methyl isothiourea (formula III)
In an apparatus equipped with a mechanical stirrer, a thermometer and a dipstick, 99 parts of S-methyl isothiourea sulfate prepared as described in Organic are dissolved in 294 parts of water.
Syntheses, vol. XII, p. 52. Add 186 parts of dibenzyl phosphite (preparation according to Todd
Journal of Chemical Soeiety, 1945, p. 384 and 1946, p. 662), dissolved in 750 parts by volume of carbon tetrachloride. With good stirring and through the gauge, 56.8 parts of sodium hydroxide dissolved in 170 parts of water are added, while maintaining the temperature between 5 and 100 ° C. by means of a cooling bath. The introduction of soda lasts about an hour.
The mixture is left under stirring for another hour, then left to stand overnight. Then added 300 parts by volume of chloroform to dissolve the solid and allowed to settle; the organic phase is dried over sodium sulfate; filtered and evaporated to dryness under reduced pressure. The product sets in mass; it is filtered with the help of petroleum ether. 225 parts of N-dibenzyloxy-phosphoryl S-methyl isothiourea were thus obtained, ie a yield of 90%. The product melts in the capillary at 850 ° C. It can be recrystallized from ethanol-water or benzene-petroleum ether mixtures; the melting point is then 860 C.
Analysis for C16H19N2O3P S
Calculated%: N 7.99 P 8.84 S 9.14
Found O / O: N 7.65 P 8.75 S 9.27
Preparation of dibenzyloxyphosphoryl-
creatinine
175 parts of dibenzyloxyphosphoryl S-methyl isothiourea, 3000 parts of 80% alcohol, 26.5 parts of sodium carbonate and 54 parts of red oxide are introduced into an apparatus fitted with a stirrer and a condenser. of mercury. It is heated to boiling with stirring for two hours.
After cooling, the mercury mercaptide is filtered off and the solvent is removed under reduced pressure. The residue is taken up in 1000 parts of absolute alcohol, to this solution is added 76.75 parts of sarcosine ethyl ester hydrochloride, melting point: 121-122 C dissolved in 200 parts of alcohol. Allowed to stand overnight, then the reaction mixture is heated at reflux for two hours.
After cooling and filtration of the sodium chloride, the alcohol present in the filtrate is removed. The residue is dissolved in 250 parts of alcohol and 60 parts by volume of 10N sodium hydroxide are added. The residue is left in contact for one hour; 250 parts of water are added; it is filtered and the solution is acidified with 36 parts of acetic acid. It is left to crystallize overnight; the precipitate is filtered off and washed with S00 / o alcohol, then with water and finally with 50% alcohol and dried in an oven at a temperature of 500 C. In this way 132 parts are obtained of dibenzyioxyphosphorylcreatinine of melting point 91-92 C, ie a yield of 71%.
This dibenzyloxyphosphorylcreatinine lends itself very well without further purification to the preparation of phosphocreatinine.
For analysis, it is recrystallized from 70% methanol. The recrystallization yield is 90%. The melting point is then 930 C.
Analysis for C18H20N3O4P
Calculated%: C 57.90 H 5.40 N 11.25
P 8.30
Found o / o: C 57.68 H 5.96 N 10.89
P 8.54
Dirodic salt of phosphocreatinine
160 parts of dibenzyloxyphosphorylcréatinine are dissolved in a mixture of 500 parts by volume of 2N sodium hydroxide and 150 parts by volume of alcohol. To this solution is added palladium black (prepared by hydrogenation of a mixture of 93 parts of carbon black, 1000 parts of water and 9.3 parts of palladium chloride) and hydrogenation is carried out at temperature and pressure. ordinary. 17,550 parts by volume of hydrogen are absorbed in two hours. The catalyst is separated by filtration and washed 3 times with 125 parts of water each time.
3620 parts of alcohol are added to the filtrate.
The disodium salt of phosphocreatinine begins to crystallize very quickly, and then solidifies. We give up a day, filter, wash with 80% alcohol, then with alcohol and finally with ether. It is dried over P2O5 and under vacuum at room temperature. 117 parts of disodium salt of phosphocreatinine pentahydrate are thus obtained, ie a yield of 83%.
Analysis for C4H6N3O4PNa2 5H2O M.P. 327
Calculated / o: C 14.68 H 4.89 N 12.84
P 9.48 Na 14.07
Found o / o: C 14.90 H 5.39 N 12.58
P 9.48 Na 14.04
P 9.43 Na 14.00
The titration curve is identical to that described by K. Zeile (Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physio logische Chemie, 236, 1936, p. 263) then by Zeile and Meyer (Ibid. 252, 1938, page 101) who obtained small amounts of this phosphocreatinine.
In order to recrystallize it, it is dissolved cold in 2 parts of water and after filtration 8 parts of alcohol are added and the operation is carried out as above.
The yield of crystallization is 83%.
Analysis for C4H6N3O4PNa2 5 H2O P. M. 327
Calculated%: C 14.68 H 4.89 N 12.84
P 9.48 Na 14.07
Found 0 / o: C 14.96 H 5.39 N 12.58
P 9.47 Na 14.04
Calculated%: H3O 27.52
Found / o: 1120 27.64
The product was dried under a vacuum of 3 L at the temperature of 600 C to constant weight to determine the water. It was rehydrated in air and at room temperature. The disodium salt of phospho creatine then absorbs 2.5 mol of water.