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*nouveaux polypeptides et procédé pour les préparer" L'invention a pour objet de nouvelle substances théra-
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pentiquement utiles du type des polypeptides ainsi que leur procède de préparation.
Plus particulièrement, 1'invention a pour objet une classe de polypeptides doués d'une grande
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activité Yalodilatatrice et hypotensive, qui sont l'hendéca- peptide L-pyrogXttam.prolyl-L-séryl-L-ly.yl.L-MpartylLl* -alan11-L-pén11.11-L-1801euc11-gl1c11-L-leuc11-L-.éth1onin- aalde (!)# l'htndécapept1de L-gluttuainyl.-L-prolyl-L'-eeryl-I' .lyar,-IF-aa,ekrtyl.le.any.-L-phényle7 anyl-L.eolaucyl-glycyl -leucylw-abt.osx3aamt.da (II) et leurs dérives (III), le tétrapeptide L-glutIJl1n1-L-pl'Ol;rl-L-.é171-L-1181nt (IV) et
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ses dérivés (V), l'heptapeptide L-sspartyl-L-alanyl-L-phanyl- alanyl-L-:
Lsoleucyl-glyoyl-L-leucyl-L-méthioninam1de (VI) et ses dérivés (VII), l'hexapeptide L-alanyl-'L-phénylalanyl-L" .isoleucy3.-glycyl L-3.eucyl.- L-rnéthioninamide (VIII) et ses les dérivés (IX), les compositions pharmaceutiques qui/contiennent et leur procédé de préparation. Les hendécapeptides 1 et II et Ilhexapeptide VIII ont un grand pouvoir vasodilatateur périphé
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rique, bien décelable spécialement chez le chien et Ithomme, de sorte que leur usage peut être recommandé dans le traite- ment des attaques'chez les hypertendus
Les polypeptides III, IV, V, VI, VII, IX sent utiles comme intermédiaires et certains d'entre eux pour leur activité hypotensive et vasodilatatrice.
Les polypeptides de l'invention peuvent être appelées
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de façon générale R-L-alanyl-L-phênylalanyl-L-looleucyl-glycyl-L- -leucyl-méthioninamide8, R étant un atome d'hydrogène ou un groupement L-aspartyle, L-giutaminyl*'L-.prolyt#L'Béryl'-L-'lysyl' -L-aspartyle, ou L-pyroglatamyl..L pxo.yl-T.raéryl-Lr.3.ysyl -aspartyle. Leur procédé de préparation est basé sur les réactions générales suivantes On condense un dérivé (X) du nouveau tripeptide L- alanyl-L-phénylalanyl-L-isoleucine (XI) contenant un groupe pro- tecteur du groupe mine avec le nouveau tripeptide glycyl-L-
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3.eucy..T,..,méth.oninaznide (XII) pour obtenir llhexapept1de IX dont on élimine le groupe protecteur du groupe amine pour obte- nir l'hexapeptide L alanyl L-phényZa.lany. G3so.rucyilray ' -Z.-leucyl.L.m6thionïnamîde (VIII).
On fait alors réagir cet
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eapep,àr 11 sur un dérivé d'acide aspartique portant yn groupe protecteur du groupe amine et un groupe p-earboxyle pour obtenir l'heptapeptide que l'on transforme en hepta- peptide VI après avoir élimine les groupes protecteurs,
On condense le dérivé du nouveau tétrapeptide L-glute-
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m3,y iPxo.y,l.séry,.,L .ysine *) dont le groupe aminé est protège avec l'heptapeptide VU pour obtenir lhendcapeptide 11 que l'On convertit, par élimination du groupe protecteur, On.bend4capeptide lip à partir duquel on obtient Ithendéoppep- tide 1 par élimination d'ammoniac.
Pour obtenir le nouveau tétrapeptide L.-gutaenylffllo. al.ï.aécy,L.,ys.ne (IV), on fait réagir la Iglutaminyï- pxo.,na dont le groupe amine est protégé, sur la séry3..
-L-lysine dans laquelle le groupe aminé en epsilon et le groupe carboxyle de la lysine sont tous deux protégés, et on élimine les groupes protecteurs du tétrapeptide obtenu.
Pour protéger les groupes aminé (substituant R2),
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on peut utiliser les groupes toluenesulfonyle, carbobenaxyr caxbo taxobutoxyle, txi,u4xaoétyl,e triphénylm4thylop etc*, habituellement utilisés dans la chimie des polypeptides.
Pour protéger le groupe carboxylo (substituant R3),on peut utiliser les groupes méthyle, éthyle, butyle tertiaire,
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benzyle, p-nitrobenzylee etc., habituellement utilisés à cet effet.
Les dérivés d'acide propres à réagir sur les groupes aminé sont le chlorure, l'azide, l'ester de p-nitrophényle etc,, qui servent habituellement pour ce enre de réaction ; on peut aussi faire réagir l'acide en présence d'une dicyclo-
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he xyl-çarbodliznlde
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Pour éliminer les groupes protecteurs ainsi fiil tt Indiqué en détail aux exemple? suivants, on peut procéder suj-
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vent les procédés connus dans!la littérature, par exemple
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traiter le composé par un hydroxydo alcalin 04 par le .Qd1 dans l'ammoniac liquide, çu par Z'4cteq chorhydriue w r<cn<hydrj..que, ou bien opérer une tyirognation ,t8vtie,
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suivant les cas.
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Pour séparer et purifier le? ,oyptPtldè. suivant l'invention, en particulier les tutn<:t4Ifapeptldes, on peut aussi procéder suivant des techniques bien connues de çhro matographiep soit sur de l'alumine basique, soit sur des résines échangeuses d'ions ou par dotrtbution b contre-
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-courante En particulier, on exécute de préférence le procède de l'invention comme suit.
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On condense le chlorure de lu"es9onYl.pyr glutamyle avec la proline et en convertit le dipeptide obtenu en toluonesulf onyllglutamirylwV-pro/Wn pa* réaction sur . 1 ammoniac concentré.. On condense encore ou dipoptlde avec le chlorhydrate de L-.86ryl-('!to3rUneeulfonyl)-'îlyainate d'éthyle (que l'on obtient en condensant le c rbofc n ôxy*&N ##séryl-fazlde avec It "-N...tolune8\.1;
Lf9nY1..LM3,y.1nate d'éthyle et en éliminant ensuite le groupe carbobenzoxylo, pour < obtenir le N-tolunesulfonYllutamtnyl.prQ1Y .*e6ryl.( 6- -N-toluène8ulfonyl)...LooIy'inat. d'éthyle (formule V dans laquelle R2 m toluenesulfonyj-e, R4 Jill C+éthyle) dont on élimine alors le groupe éthyle pour obtenir le tétra-i peptide V (R2 m toluènesulfonylet R4 pH), En éliminant les groupes toluène sglfonyle on obtient le tetrapeptide 3W '
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On pout aussi obtenir le 1;
<tr<ptide IV <V60 de bons rendement* en condensant la N-4tUbobenzoxy-t,...glutamI.nYt,.. proline (obtenue par réaction do laproline sur le chloruré de N-aaxbobenzoxy-8r.pYroglutamyxe, puis par réaction du pro- duit sur l'ammoniac) avec le Lsryl.. t> #l-carbobenaûxy-t *
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-lysinate dé méthyle (que l'on obtient en faisant réagir la
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N-triphênylm6thyl-L..à 6rine sur 1' t f, -N-carbobenzoxy-L-ly*1ne,
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puis en hydrolysant par l'acide acétique aqueux) et en élimi- nant ensuite les groupes protecteurs.
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On condense le chlorhydrate de L-ph4nylalanyl-L-isG-
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leucinate de Méthyle (que l'on a obtenu en condensant la
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carbobenzoxy-t,ph4hylalanine avec le L-isoleucinate de
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méthyle, puis en éliminant le groupe carbobenzoxyle du dipeptide obtenu) avec la carbobonzoxy-L-alanine pour obtenir
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le carbobenzoxy-L-alanyl-L-ph6nylalanyl-L-isoloucinatë de
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méthyle dont on élimine le groupe méthyle pour le convertir
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en carbobonzoxy-L-alanyl-L-phénylalanyl-L-1s01euc1ne (X).
On condense ce tripeptide avec la 91ycyl-L-leucyl-éth1onifi amide (XII) (que l'on a obtenue en condensant la carbobonzoxy- -glycyl-L-leuclno avec le mdthioninate de méthyle,, puis en
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faisant réagit le tripeptide obtenu sur une solution saturée
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d'ammoniac dans le méthanol pour obtenir la carbobenzoxy- -qlycyl-L-leucYl-méth1oninamide dont on élimine le groupe aarbaban.axyxQ), afin d'obtenir la aarbobenzoxy-L.alahylLr. -ph'nylalanyl-L-1so1eucyl-glycyl-L-leucyl-L-méth1on1namide (IX)
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dont on élimine le groupe carbobenzoxyle pour obtenir
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l'hexapeptide VIII.
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Quand on fait réagir llhexapept1de VIII sur le carbobcnxoxy-'p-aspartate de benzyle, il donne llheptepept1dè correspondant dont on élimine le groupe carbobonzoxyle pour obtenir la ..benxyl L.aspartyJ. L-aZnyl-L-ph;nylalanyl. L- -isolucyl-glycyl-L-leucyl-L-méthioninamide ("tÏII). On
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obtient l'heptapcptide VI en éliminant le groupe benzyle.
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En condensant l'heptapeptida VII avec le tétrapep-' tide V, on obtient l'hondécapeptide III ; par exemple, en condensant la benzyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-ph6nylalanyl-L- -1so1eucyl-glycyl-L-leucyl-L-méth1on1nam1do avec la N-toluène- sulfonyl-L-glutam1nyl-L-prolyl-L-aé:y1-( #. -N-toluènesulf onyl)- -J>-lysine, on obtient Ilhendécapept1de N-toluénesulfonyl-L4- <-glutaminyl-L-prolyl-L-.seryl( e. N..tolunesuxfonyl)-L..lysya- .(benzyl)-L-aspartyl-L-alanyl-t-phénylalanYl-L-1so1eucYl- -glycyl-L-lcucyl-L-méth1on1na1de (III).
Une autre méthode consiste à condenser l'azlde de N-carbobonzoxy.L-qlutam1nyl-L- -prolyl-L-séry11 t -N-carbobehzOXy-lY81ne avec la L-aspartylL.r -alanyl-L-phénylaanyl-L-isoleucyl-Olycyl-L-leucyl-L-méthlon1n- amide pour obtenir la N-carbobenzoxy-t-glutamlnyl-L-prôlyl-L- #séryl- ± -N-carbobenzoxy-L-1Y$yl.B$Pàrtyl-L-alanyl-L- -phénylalanyl-L-isoleucyl-qlycyl-L-leucyl-L-méth1on1namido (It).
On obtient l'hendécapeptide II en éliminant les groupe$
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protecteurs de III.
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En soumettv.-it l'hendécapeptlde Il à un milieu qui favo-
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rise le déplacement d'ammoniac, par exemple par chromât graphie sur des résines échangeuse$ carboxylées ou par chauffai avec
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de l'eau, on obtient l'hendécapeptide 1.
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Les polypqptdes de l'invention, en particule:!? les polypeptides I, II et VIII, ont une forte action vesodiletatrice périphérique qui est bien décelable principalement chez le chien et l'homme. Les doses actives pour le chien sont de 0,001 à 0,005 @g/kg de polype ptide administré par voie intraveineuse par infection dans l'artère fémorale, on observe dans le membre du chien des vasodilatations jusque des doses de 0,001 g. Sur des muscles lisses intestinal isoles de lapin, de chien et de cobaye, l'hexapeptide est actif jusqu'à des doses de 0,001 à 0,002 g.
Les polypeptides de l'invention ou leurs sels non toxiques sont utilisa pratiquement et avantageusement en clinique pour les attaques des hypertendus, ou en tout cas dans la thérapeutique d'urgence de l'hypertension très grave; dans les syndromes spastiques vasculaires, spécialement ceux des régions musculc-cutanées (particulièrement dans les eas de syndrome de Burger, de syndrome de Raynaud, d'ulcères latents), des vaisseaux rétiniens (amaurose provenant d'un spasme de l'action centrale de la rétine), des vaisseaux ménin- gés (céphalée et migraine provenant de spasme vesculeige) et des vaisseaux coronaires (angine de poitrine).
On peut administrer ces polypeptides par voie parentéra- le : sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse (une seule injection ou par perfusion lente) ou intraartérielle.
Les solvants les plus appropriés sont l'eau ou les solutés physiologiques non alcalins.
Par voie sous-cutanée ou intramusculaire, on peu$ leur ajouter des substances retardatrices d'absorption.
Les pourcentages d'ingrédient actif peuvent varier suivant les formes pharmaceutiques particulières et suivant l'effet d'hypotension désiré, mais généralement ils sont très faibles, L'administration journalière d'ingrédient sctif peut varier de 0,005 à 5 mg chez l'homme. L'usage des polypep tides de l'invention ne cause pas de manifestations de toxicité aiguë, n chronique,
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Les exemples suivants servent à illustrer l'invention, sans la limiter* Exemple 1.
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ToLuènesulPonyx-.pyx'ogxaamy.-L-pxo.ia.' .
On dissout 5,04 g de L-proline dans 40 cm3 d'eau, on ajoute 4 g d'oxyde de magnésium et on refroidit le mélange au moyen d'un mélange de glace et de sel. On ajoute en l'espace de 20 minutes, en agitant vigoureusement, 12 g de chlorure de
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toluènosulfonyl-pyroglutamyle {Cp.., 0 Chem. Comm..12, 1954, 365). On agite à nouveau le mélange rationnel à la température ambiante pendant 1,5 heure, puis on l'acidifie au moyen d'acide Chlorhydrique concentré.
On laisse décanter le précipite pendant 30 minutes, puis on le filtre. Rendement 10,5 g ; point de fusion
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250-252oc (après recristallisation par lf6thanol) ; r ,fD 0 M -800 (à 0,5 % dans l'ethanol).
Exemple 2.
TOluènasulfonyl-L-glutam1nyl-L-proline.
On dissout 8 g de tolubnçèsulfpnyl-L-pyroglutamyl-L- '"proline dans 40 cm3 d'ammoniac concentré et on laisse reposer la solution 60 minutes. On chasse sous vide la majeure partie de l'ammoniac et on acidifie la solution restante au moyen d'acide chlorhydrique. On recristallise le produit-par un mélange d'éthanol et d'eau.
Rendement 7,6 g ; point de fusion 216 - 218 C ;
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cdë5 la ¯'8 Cà 1 % dans l'éthanol).
,Exemple 3.
Carbobenzoxy-L-séry( #N-toluenesulf onyl)-L- -lysinate d'éthyle.
On ajoute une solution de aatboberxaxy-L-séxy.laz3de dans l'acétate d'ethyle, préparée à partir de 5,06 g de carbobenzoxy- -8érylhydraz:Lde (J. biol. Chem. 146. 1942, page.463) à une solution d' 6< .l,.taLuènesuiany,i.1',rlysinats d'éthyle dans
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l'acétate d'dthyle (J* Hrn. Cham. Socs Les 1956, page '5866) que l'on a préparée à partir do 8,6 g de chlorhydrate* Au bout de 24 heures à la température ambiante, on extrait le
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mélange réactionnel par l'acide chlorhydrique 1N, le b3.dsxw bonate de sodium 1M, puis par l'eau, et on sèche sur du sulfate de sodium anhydre.
On évapore lo solvant sous vide et on obtient 8 g d'un résidu huileux.
Exemple 4,
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Chlorhydrate de L-séryl-( S. -N-toluènesulfonyl)- lY8inata d'éthyle.
On dissout 8 g de carbobenzoxy-L-séryl-( & .tolune- sulfonyl)-L-lysinate d'éthyle dans 100 em3 d'éthanol et on ajoute à la solution 2,5 g de palladium à 10 % sur charbon de bois, puis on hydrogène le mélange pendant 4 heures à la pression atmosphérique.
Après filtration du catalyseur, on concentre la solu- tion jusqu'à un faible volume, puis on ajoute 200 cm 3 d'éther anhydre et on acidifie la solution par l'acide chlorhydrique gazeux$ On décante le solvant, on triture le résidu à plusieurs reprises avec de l'éther anhydre et finalement on le sèche sous vide.
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Rendement 6,6 c ; point de fusion 6â6?'pC (avec d'com- position ) ; 5. '-7,5" (a 3 % dans l'éthanol). pxernRlo 5.
N-toluènesulfonyl-glutam1nyl-L-prolyl-L-séryl- ..( t..t3..toluènesuxfonyl) L. .ysinate d'éthyle (formule V ; R2 m toluênesulfonylep R4 a C6-éthylo).
On dissout 6,4 g de chlorhydrate de L*séryl *( 6 1w Mtolunesulfonyl).L-1Y$1nate d'éthyle dans 80 cm3 d'aeetonltrlle et on ajoute 201 cm 3 de triéthylamine. Puis on ajoute bzz g de
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a,unasu.cnyJ.. .rtarn.ny.xo,3ri dissoute dans 40 cm3 de d1mâthylformamide et z g de dicyciohexylcarbodiiMide et on agite le mélange pondant 24 heures à la température ambiante.
On filtre la d3.cycxahacyJ.uxct on évapore le solvant sous vidé, on triture le résidu à plusieurs reprises avec de l'éther de
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pétrole, on lo dissout dans toto oma d'acétate d'éthyle et on extrait la solution par l'acide chlorhydrique 1N, par le bicarbonate de sodium 1M et par l'eau. Après avoir séché 'la solution sur du sulfate de sodium, on chasse le solvant sous vide pour obtenir 5,6 g de solution visqueuse.
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xQn la 6..
N.t.o.unesuieny. Lwg,utaminy. t.pxoJ.y. Lâxy1 . ,.N.tasunesu.fcnyi) L l.ys3,ne (formule V t R2 m toluànesiilfohyiôi R4 m OH).
On dissout 4,7 g de N-tolune8ultonyl-L-glutaminyl-t. o,y3.-..sdxyl.( .aNtolunssu,Foriylj.L.lyinate d'éthyle dans 15 cm3 de méthanol et on ajoute 9 cm3 de soude 2N. On laisse reposer la solution 30 minutes à la température ambiante? on évapore le méthanol sous vide à la température ambiante, on dilue le résidu par l'eau et on 1* acidifie .On dissout le précipite dans de l'alcool éthylique et de l'acétate d'éthyle et on sèche la solution sur du sulfate de sodium anhydre.
Après élimination du solvant. on obtient 4 g de la substance
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tous forme de mousse. r6....4 z 5 % dons l'éthanol).
En éliminant les groupes protecteurs toluènosulfonyle, on obtient le tétrapeptide IV.
Exemple 7.
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Carbobenzoxy.phénylalnnyl-L-1so1eucinàte de méthyle* On dissout 29,2 g de carbobonïoxy-L¯ph<5nylaianine (beur. il, 1958, page 462) et 16 q de t-i8cleucinte de méthyle (Helv. Chim. Acta , 1 5, page 1500) dans 250 cm de tétera- hydrofurane anhydre. Puis on ajoute, en agitant et en refroi-
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èi$ant,24.7 e. diÇyqlXY1"carbodi1mide.
On egite 9 m4aQEt pendant î6 heures 'o"'pf,,. ambiante. Aprbe OVOE flt;6 a àicyc.ahcxy,ux le solvant sous vide, dissout le résidu dans 3 d'cétate '6thy"o' on . par l'acide ChOry;ie 1. par le b3axbR'1 do $d1um 1 M et enfin par bzz la solution sur du 8ijfte de sodium anhydre, ' on dvap9ve 19 a4,van. r6sidg par mél4ngQ 414144* On t",'t.I' 10 ésidu par un #### 4.,4"'
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dtlthyle et d'6tOf o pétrole. o Rendt","t 6 (1 po1nt QG fusion 106-1070(; , /!Vo ..10,1i(h . 1." dans l'MMl). 9mletTa. Ç9hyd;ate de hénylalaYlt-So.on't de htYlalany^""xer,n'' m4thyle.
On A''1: 't3 9 ...rb..en..P. so,aua,nlwo 0 i,Yy dsns 0 cm de méthn9 .t ÇA ajoute le solution B '1 . p.J.l3um à 10 % sur chayb boise on da3n 10 '0 pendant 5 heure. pression .. uo. Apa fs,ltr:att" oetalyseurt on 6vapoge le 'ONfl\, disa0u $.du dan ox anhydxo, 4n aer,d, a'' ' obtenue au my'0 .d! a3de ch.oxlydx3ta gazeux et 0 l'va jusqu'à oiçctd point fusion Rendement 115 9 point de fusion 74-76 , cg> Io ,r( % dans 11 éthanol).
'' #b0b0roxY "alanyx-Phny..anl""""a0t c1n4t, de méthyle (fotmul X , R2 . ab0bl'Cs xylc t R4 . C.m6thyle)- t7ri s' 11 Pl 9 ee carbobenZOy¯alnn1e ie Sl01. h0m. 19r Pa'0 4) ,5 . tphdnya,0ny.s0ru Chom. W, 19$8, page 702) et 1,5 g libre) d.n. .1ell. ' c3,nae dd 1 h ,r ($OU$ libre) dane , t>O 1JIt3 r,I, . J tdtrahydtoeUr4ng et on ajoute 12e3 g de d.cyaa.hxyaaac.
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mide en refroidissant et en agitant ; on laisse reposer le mélange 16 heures à la température ambiant, puis on le filtre, on évapore le solvant et on dissout le résidu dane 400 cm3 d'acétate d'éthyle. On agite la solution avec de l'acide chlorhydrique 1N, du bicarbonate de sodium 1m et de l'eau.
On sèche la solution sur du sulfate de sodium, on évapore le solvant et on recristallise le résidu par un mélange d'acétate d'éthyle et d'éthor de pétrole.
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Rendement 21 g ; point rfe fusion 154-156OC .
/"<7µ8 -44,6" (à 2,5 % dans l'éthanol), temple, 10.
Carbobenzoxy-t.alany.L-Ph6ylalanyl-L-i801eucine (formule V t R2 8* çarbpbenzoxylo R4 a OR).
On dissout 4,9 g de carbobenzoxyL-alanyl-t-phénYlalany1 .L.1so1euc1nate de méthyle dans 90 em3 d'éthanol et on ajoute 20 cm3 de soude 1N. Au bout de 90 minutes à 20 C, on évapore l'éthanol sous vide à la température ambiante, on reprend le résidu par l'eau, on acidifie la solution par l'acide chlor- hydrique et on extrait le précipita par l'acétate d'éthyle.
Après séchage sur du sulfate de sodium, on évapore le sol- vante,
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Rendement 4,4 g ; point dp fusion 183-186 (après recristallisation par l'acétate d'éthyle).
Exemple 11.
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CarbobenzoxY"91yeyl-leucyl-thion1nate de méthyle* On dissout 10 g de aaxbabanQsy glycy3-..,eucine (J. Amer. Chem. Soc. 78p 1956, page 2130) et 5 g de m<5thioninate de méthyle (Helv. Chem. Acta 24p 195tj page 2091) dans 90 cam 3 de tétrahydrofurane. Puis on ajoute 72 g de d1cyolohexyl- ¯<5arbodiinilde et on agite le mélange pendant 16 heures à la température ambiante. On filtre la dicyolohexylureo, on évapore e solvant sous vide et on dissout le résidu dans 250 cm3
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d'acétate d'ethyle. On extrait là solution par l'ecide chl0thy* . drique 1N, par le bicarbonate de sodium 1M et par l'eau.
Apres séchage sur du sulfate de Sodium. on évapore la solution sous'Vide* On triture le résidu huileux avec de l'éther dû parole pour obtenir un produit cristallin que l'on purifie par un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole*
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Rendement 12 g ; point de fusion 11a.119 ; /*7 " -43.1 (h 3 % dans l'éthanol).
Exemple 12 <3arbobenzoxyglycyl-'L-leueyl'*L-*Mëthionihamidet On dissout 10 g de cârboben2oxy-glycyl -L leU6yl*± - -méthioniftste dé thethylo dans 200 cm3 de méthanol anhydre saturé d"ar)Mt)onia6 0"C. Au bout de 4 Jourar a la température . ambiante, on évapore la solution jusqu'à siccité, on triture
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le résidu à plusieurs reprises avec de l'acétate d"@thyl6'e on le sèche Rendement 6 g ; point de fusion 177-11900 (6>Jtô recristallisation pat l'acétate d'éthyle) j /* <l7d ** 7<' (à 5 % dans la méthanol).
Exemple ,13
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dyiSyi-Ïleucyl'-L-'methioninanddo (Xïï)* On dissout ,5 g de carbobenzoxY-91ycylL-leéY1 -méth1oninnm1dt dans 250 cm3 de méthanol, on ajouta le tout à 3 g de palladium a ;0 % sur charbon de bois et on hydrogène la pression atmosphérique. Au bout de 3 heures, on ajoute à nouveau 3 g de catalyseur et on fait réagir à nouveau le mélange pondant 4 heures. Après filtration du catalyseur, on évapol@ la solution jusqu'à siccité, on triture le résidu avec de l'eau et on évapore le filtrat sous vide.
Rendement de produit brut : 2 g ; point de fusion 120 C.
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Éitemftle,,,,!.
Ca*bobôh*oxy*t* àî.6ftyi*Uph4nyaalanyi *L-lôoleiioyl'- -glycyl.1.uoylêthlon1namldé (formule IX t R2 catbbbèfi.Óy1e).
On dissout 2,1 0 dë 6ajPb6bônz6}tY'.L-alanyl'-t'phnyl Alanyl-L-isoloucine et le$ 9 de 6iyûyl*Uleucyl¯I>md*hlôrtinàifriide dans 50 ema de dîméthylfoïlffiàffiidoi puis on ajoute 1,4 g de dicyelohexyl'-carbodilmido et on 4ito le mélange pendant 20 heures à la tempéràtuafe émb1a\é. Apet fiitration (1.' 9 de dicyclohexylurde)o on Vap6 là béÏUtion sous vide jusqu'à siccité et on triture Î4 résidu av*c de l'éther anhydre oh dissout à nouveau le pioÉipHe dirtl 14 quantité minimale do oimdthylformamide et on piédipito'à nouveau par 1'6thor.
Rendement 3 9 t poLrtt dà fuôiôn 235 238<SC (après recristallisatlon par lt4thnb1).
EMI14.2
temple.15.
EMI14.3
Brotnhydfëto do ainylL*'phenylalanyl't'isoleu*' eyl'lyeyi*'Mueyi*'ïmothioninamide (vm)< A 1,4 cm3 de solution atui?4Q dtacide bromhydrique 9aeux dans l'acide acétique, ôrt ajoute 1,1 cm 3 de phosplid de diéthyle et 0#5 CM3 did<t.a6eti<et Dans ce mdlahlo# on . dissout 0,4 g de earbobeftiîô tai#rtyl-t*phéttylalanv'i-t-'i8ô* leucyl"'"91ycyl..L-l0ucyl.t..tnthiÓf\thatn1de. Au bout de 7 4ftUtot h 20 C, on ajoute à la aolution 50 tffl3.d.êthe anhydres On lava à plusieurs reprisée la précipite obtenu avec de l'ether et on le sèche sous vide sur de la potatob et de l'anhydride phospho**
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tique,
EMI14.5
Rendoment 0,36 <
<Desc/Clms Page number 15>
Exemple 16.
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N-carbobenzoxy-.(p-benzyl)-L-aspartyX-L-aXanyl-3-¯ p hénylalany3,-L-.s ol.eucyl-glycyl.L,.-leucyl.-L -nêthion3.nam.ide, On dissout 0,36 g de bromhydrate de L-alanyl-I-phënyï- 3 alanyl--3.soJ.eucy, g.ycyl-L-leucyiL.-méthi.oninamide dans 7 cm de diméthylformamide et on fait réagir la solution sur 0,071 cinq de triéthylamine. Puis on ajoute 0 178 g de carbobenzoxy-p- -aspartato de benzyle (J. Chem. Soc. 1959, page 3870) et 0,123 g de dicyclohexyl-carbodiimide. Au bout de 2 jours à la température ambiante, on filtre la solution, on la concentre jusqu'à un petit volume et on précipite l'heptapeptide au moyen d'éther.
Rendement 0,5 g. exemple 1*7.
EMI15.2
Bromhydrate de P-benzyl-L-aspartyl-L-alanyl-L- wphnyla.anyl.-L..is oleucyl-glycyl-.L-xeucyl.-L..
..méthioninamide (formule VII R3 = benzyle).
On dissout 0,5 g de carbobenzoxy--benzyl Laspartyl-L..
-alanyl-L-phényl-alanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-méthi0- ninamide dans un mélange de 2,8 cm3 d'acide acétique et 1,2 cm3 de phosphite de diéthyle saturé d'acide bromhydrique gazeux.
Au bout de 15 minutes, on ajoute 100 cm3 d'éther anhydre, on lave le précipité à plusieurs reprises avec de l'éther et finalement on le' sèche sous vide sur de la potasse et de l'anhydride phosphorique.
Rendement 0,42 g.
En éliminant le groupe benzyle protecteur, on obtient l'heptapeptide VI.
<Desc/Clms Page number 16>
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Exemple, J18 , N-toluen9sulfonylL-glutamyl-I.rprolyl"!Neryl'- -( #. -d3-to.uènesulfanyl)rlrlysyl.benxy.,-L- aspartyl-I,..a.anyhT.-ph6ny,axany3,.L..soW tCY.
-glycyl-leucyl-L-méth1oninam1d& (formule III s R2 toluène suif ony le, R3 : benzyle).
On dissout 0,42 g de bromhydrate de P"rJ?en2yl" îr*a8P?rtyl- -L-alanyl-L-phénylalanyl-L-:Lsoleucyl-L-leucyl-méthlon1namide dans 4 ern3 de diméthylformamide et on traite par 0,063 cm 3 de tri6thylamine. A cette solution, on ajoute 0,35 g de N-toluène# sulfonyl'-L-g.Lutatnlnyl-L-proJ.yl-!.ceryl'*( #. .touènesulfonyl)- .J,-lysine et opel g de dicyclohexyl-carbod:Lim1de. On laisse le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 2 jours* Après filtration de la dicyclohexyluréop on contentre la solu- tion jusqu'à un petit volume et on précipite le peptide protégé par addition d'éther.
Rendement 0,66 g.
EMI16.2
E4,ZM21.2. -U. lutam1nyl-L-prolylL-séryl-L-1YBY1-a8partyl- -L-alanyl-L.vhénYlalanyl-L-1so1eucyl-glycylt- leucyl-L-mdthloninamide (formule II).
On dissout 0,68 g de l'hendécapeptide protégé dans 20
EMI16.3
com d'ammoniac liquide, puis on ajoute en agitant 0, t'3 g de sodium métallique. Au mélange réactionnel, on ajoute 0,45 cm3 d'acide acétique. Après évaporât ion de l'ammoniac, on sèche, le résidu sous vide sur de l'anhydride phosphorique.
Rendement 0,6 g.
On peut aussi obtenir le polypeptide II à partir du polypeptide III dans lequel R2 peut être un groupe carboben- zyle, carbobutoxyle tertiaire, etc., et R3 peut être un'groupe
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p-nitrobenzyle, butyle tertiaire, etc...
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Exemple 20. x.-pyroglutamyl-t,..p::olyl...L-t':yl..t-lysy1-r...-a,pa:r:- tyl-L-alanyl-L-phénylalanyl1so1eueyl.glycyl- -leucyl-L-méth10n1namide (formule 1).
On dissout Ilhenddeapaptide II dans de lteau et on le fait passer à travers une colonne de résine échangeuse d'anions (par exemple de marque commerciale "Amberlite IRC 50") puis on élue par l'eau. Après avoir purifié de façon connue l'hendécs- peptide obtenu, on obtient lthendécapeptide I sous forme pure.
Exemple 21.
EMI17.2
N-carbobenzoxy-L-pyroglutamyl L..proline.
On dissout 2,5 g de L-proline dans 40 cm3 d'eau ; à cette solution glacée on ajoute 2 g d'oxyde de magnésium et
EMI17.3
5,6 g de chlorure de N-carbobQnzoxy-L-pyroglutamyle (Annalen 640, 1961, page 151) finement pulvérisé. On agite le mélange pendant 1 heure à 0 C et pendant une heure de plus à 20 C.
Après avoir acidifié par l'acide chlorhydrique, on filtre le
EMI17.4
précipité, on le lave à l'eau et on her recristallise par un mélange d'eaj et d'alcool.
EMI17.5
Rendement 5 g ; point de fusion 177 - 1?8 C ; /"OL'' $49 (4 2 % dans l'éthanol) ; r4 III -1060 (à 2 % dans l'acide acétique à 95 %).
Exemple 22.
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N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-proline On dissout 4$8 g de N-carbobenzoxy* L-glutanjlnyl-L¯pro- line dans 30 cm3 d'ammoniac aqueux concentré et on laisse reposer la solution une nuit.
On chassd la majeure partie de l'ammoniac sous vide et on acidifie la solution restante au moyen d'acide chlorhy- drique* On extrait l'huile séparée par l'acétate d'éthyle ; après séchage sur du sulfate de sodium, on évapore le solvant sous vide. On triture le résidu avec de l'éther de pétrole et on le sèche sur de l'anhydride phosphorique.
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Rendement : 4,5 g de produit amorphe
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JT*Jq0 * bzz" ( 4 % dans Itéthanol).
Exemple ;|23> N-tlphénylmÓthyl-8ÓrlnatG de méthyle.
On dissout 15,5 g de chlorhydrate de t.-,..ér1$t. de méthyle (Helv. Chim. Acta 4J., 195$p page 1858) dans 150 cm3 de chloroforme anhydre et à cette solution glacée, on ajoute, en agitant, 28 cm3 de triethylamine et 2T, 8 g de chlorure de triphénylméthyle. Au bout de 6 heures 4 la température ambiante, on lave la solution à trois reprises avec de l'eau et on la sèche sur du sulfate do sodium ;on évapore le solvant sous vide et on recristallise le résidu par un mélange de benzène et d'éther de pétrole.
Rendement 29 g ;point de fusion 145 C.
Exemple 24.
EMI18.2
N.tr3phényimâthy...l;.z,ne.
,On dissout 25 g de N...tr1phénylméthyJ.-t,..eérinate de méthyle dans un mélange chaud de 40 cm d'éthanol et 80 om 3 de potasse alcoolique 1N. Au bout d'une heure à la température ambiante, on dilue la solution avec 250 cm3 d'eau.. on refroidit à la glace et on acidifie par l'acide acétique ;on filtre le précipité, on le lave et on le recristallise par un mélange de méthyl-éthylcétone et d'éther de pétrole.
EMI18.3
Rendement 15 g ; point de fusion 154-1 57 C ? -4. +240 (à e % dans l'éthanol). temple 25.
N triphny3,méthy,L-sél N.arbobenzoxy-1" lysinate de méthyle.
On dissout 13pl g de chlorhydrate d' 6 vnogarbobenzoxy- -L-lysinate de méthyle (Helv. schim. Acta 4J., 1958, page 1878) dans 100 cm3 de diméthylformamide et 100 cam 3 d'acétonitrlle puis on ajoute 5,6 cm3 de triéthylamine, 13,2 g de N-triphényl- méthyl-L-sérine et, en refroidissant, 8,4 g de dicyelbhekyi- ' # ' ' carbodiimide. @ .,
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Au bout de 20 heures à la température ambiante on fil-
EMI19.1
tre la dicyclohexylurée et on évapore le solvant sous vide.
On dissout le résidu dans 350 cm3 d'acétate d'éthyle et on lave la solution avec do l'acide chlorhydrique 1N (à 0 C), avec du bicarbonate de sodium 1M et avec de l'eau. Après séchage sur du sulfate de sodium, on chasse -acétate d'éthyle par distil- lation et on recristallise le résidu à deux reprises par un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole.
Rendement 15 g ; point de fusion 128 C ;
EMI19.2
3 . -380 (a 5 % dans .éthanoJ.7.
Exemple,, 26.
L-sêryl- -N-carboben%oxy.-L-ly.1nate de méthyle.
On dissout 8>4 g de N-tr1phénylmêthyl-L-"ryl- & i #carbobenzoxy-L-lyslnate de méthyle dans 50 om d'acide acétique, puis on ajoute 50 cm3 d'eau et on chauffe le mélange au bain- -.tarie pendant 30 minutes. On ajoute à nouveau 50 cm3 d'eau et on refroidit le tout à 0 C. Après filtration.. on évapore la solution limpide sous vide jusqu'à siccité. On reprend le résidu par 80 cm3 d'ammoniac aqueux à 2 % et on extrait le mélange par le chloroforme. On sèche les extraits sur du sulfate de sodium et on distille sous vide pour obtenir un résidu sirupeux.
Rendement 4,2 g.
Le produit apparaît homogène à la chromatographie sur papier.
Exemple 27.
EMI19.3
N-carbobanzoxy-L-gltitantinyl-L-prolyl-L-Séxyl- L - -N-carbobenzoxy-L-lysinate de méthyle (formule Vs R2 carbobenzoxyle, R4 - Méthyle).
On dissout 4,1 g de N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-proline
EMI19.4
et 4,2 g de i.séxyl.. #. -N-carbobenzoxy-L-lysinate de méthyle dans 70 cm3 de chlorure de méthylène et à la solution, refroidie à 0 C, on ajoute 2,5 g de dicyclohexyl-carbodiimide. Au bout de 16 heures à 20 C, on filtre le mélange et on lave le filtrat
<Desc/Clms Page number 20>
avec de lucide chlorhydrique 1N, du bicarbonate de sodium 1M et de l'eau. On sèche la solution sur du sulfate do sodium, on chasse le solvant par distillation sous vide et on recristallise le résidu par un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pé- trole.
EMI20.1
Rendement 5 g ; point de fusion 58-6Q G ; J 5 . -.5t?a (à 2 % dans l'éthanol).
Exemple, 28.
EMI20.2
Hydrazide de N-earbobenzaxy. L cl.utam3,ny.-L-praly, -.L-sëryl-' & -N-carboben%oxy-L-lys1na (formule Vt R2 a carbobenzoxyle, R4 - -NI3 - NH).
On dissout 3 g de N-carbobenzoxy-L-glutam1nyl-L-prolyl-L- eéxy.t -N-carbobonzoxy-L-lysinate de méthyle dans 30 cm3 de méthanol, puis on ajoute 7 cm3 d'hydrate d'hydrazine* On main-
EMI20.3
tient la solution une nuit à 20 C, puis on 1'évapore sou. vide jusqu'à siccité et on triture le résidu à plusieurs reprises avec de l'éther éthylique anhydre. On recristallise le produit par l'éthanol.
EMI20.4
Rendement 2 point de fusion 1ô316 C 5 . .30 {à 2 % dans la dimdthylformamide).
Exemple 29.
N-tr1phnylméthyl-glycylleuc1nate de méthyle.
On dissout 31,7 g de N-triphénylméthyl-glycine (J.A.C.S.
78, 1956, page 1359 et 15,9 g de L-leucinate de méthyle (Helv.
Chim. Acta 29, 1946, page 784) dans 300 cm3 de tétrahydrofurane,
EMI20.5
puis on ajoute 22,6 g de d3cycl.ohaxyl-aarbod,imide. On agite le mélange une nuit à la température ambiante, puis on filtre la dicyclohexylurée et on chasse le solvant par distillation sous vide. On dissout le résidu dans 300 cm3 d'acétate d'éthyle et on lave la solution avec de l'acide chlorhydrique 1N (à 0 C), de l'ammoniaque 1N et de l'eau. Après avoir séché sur du sulfate de sodium, on chasse le solvant sous vide.
Rendement : 35 g de produit sirupeux.
<Desc/Clms Page number 21>
EMI21.1
Bxemole 30r Ntiphnylméthyl.gl.jrcyl-lrrZeuaine.
On dissout par chauffage 35 ruz de N-triphenylmethyl-gly-. cyl-L-leucinate de méthyle dans 90 cm3 de potassium alcoolique 1N
EMI21.2
et 50 cm3 d'éthanol. On maintient la solution à la température ambiante pendant 1,5 heure, puis on la dilue avec 300 cm3 d'eau et on la filtre. On refroidit le filtrat limpide, on l'acidifie avec de l'acide acétique, on filtre le précipité et on le lave à l'eau.
Rendement 20 g ; point de fusion 75-85 C.
Exemple 31
EMI21.3
...mcthion,nam3de.
On dissout 38,5 g de x.-méth.an,nate de méthyle (Helv.
Chim. Acta 3., 1951, page 2091 ) dans 250 em3 de méthanol anhydre et on sature la solution d'ammoniac gazeux à 5 C.
Au bout.de 4 jours à 45 C, on évapore la solution sous vide jusqu'à siccité et on triture à plusieurs reprises le résidu avec de l'éther éthylique anhydre.
.Rendement 33 g ; point de fusion 50-51 C ;
EMI21.4
/" L7]37 * "2' (b 5 % dans l'éthanol).
.Exemple ,32,.
N-triphénylméthyl-91Yèyl-L-leucyl-Óthion!n- amide.
On dissout 11 te g de N..tr1phény1méthyl-g1ycyl-L-leuc1n4 ..t,, 0 g de L,.tméthlon1Mmidt dans 180 ami de chlorure de méthy- lène, puis on ajoute *- en refroidissant" 8,6 g de dicyclohéxyl- carbodllraide. Au bout d'une nuit à la température ambiante, on filtre le mélange ractionnel et on lave le filtrat avec de
EMI21.5
.1tacide chlorhydrique 1N (à 0 C), du bicarbonate de sodium 1M et de l'eau. Après séchage sur du sulfate de sodium, on chasse le solvant par distillation sous vide et on recristallise le résidu par l'acétate d'éthyle.
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
Rendement 15 g ; point de fusion 214-21 6 C ? /"<C7 " -'20" (à 1*6 % dans l'éthanol).
Exemple- 33t GlycyJ.-L-.eucy.-Tr...mdthiori3,nam,de (XII ) .
On dissout 9,5 g de N-triph6nylmdthyl-glycyl-L-leucyl- -méthloninamide dans 50 cm d'acide acétique, puis on ajoute 50 cm3 d'eau et on chauffe le mélange 30 minutes au bain-marié.
Après avoir ajouté à nouveau 50 cm3 d'eau, on refroidit le mélan-
EMI22.2
ge à OOC et on filtre la triphdnylcarbinol, On concentre sous vide jusqu'à siccité la solution limpide ainsi obtenue. On recristallise par l'éthanol le résidu d'acétate de glycyl-L- -leucyl-L-méthioninamide ; point de fusion 134-136 C.
On fait passer la solution aqueuse d'acétate de tri- peptide sur une colonne de résine de marque commerciale "Dowex 2" sous la forme basique et on concentre le produit d'élution sous vide jusqu'à siccité.
EMI22.3
Rendement i 4,6 g ; point de fusion 956i58 ; /"OL7D*= -500 (à 2. dans l'eau).
Exemple 34.
N..caxbobenzoxy-L-ciutaminyl.-L-pxaJ.yi-Irsxyl.
-I-carbabenxoxyLLysyl-L aspartyl-ir-alryl-.
-phênylalanyl-L-isoloucyl-glycyl-L-leucyl-L- -méthioninamide (formule III t R7 catboben. zoxyle, R 3 m H)t On dissout 0,60 g d'hydrazide de N'-oarbobenzoxy!' lutaminyl-'L-proiyl-s oryl- dans .,.
12 com de diméthylformamide, puis on ajoute 0,81 cl diacide chlorhydrique 4N et on refroidit le mélange a -50C.
Après avoir ajouté 0,22 cm3 de nitrite de sodium 4N, on agite la solution à -5 C pendant 5 minutes avec 0,34 cm3 de triéthylamine et on sèche à de nombreuses reprises sur du sulfate de sodium. @
<Desc/Clms Page number 23>
On filtre ± mélange et on lave le sulfate de sodium
EMI23.1
avec 5 com de dimthylformamide ; on ajoute au filtrat 0,70 g de L-aspartyl-l,-alanyl-f,-phénylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-le- -leucyl-t..-méthion:Lnamide et 0,34 cm3 de triéthylamine.
Au bout de;3 jours à 5 C, on évapore le solvant sous vide et on triture le résidu avec de l'eau, puis avec de l'éther éthylique anhydre.
EMI23.2
On dissout le produit dans de la dimdthyltormamide et on le précipite à nouveau en ajoutant de l'éther éthylique anhydre ; on le lave à l'éther à deux reprises et on le sèche sous vide.
Rendement : 1,1 g. @ Exemple 35.
L-glutaminyl-L-prolyl-L-séryl-L-lysyl-L-aspartyl-
EMI23.3
.L-alanyl..Lphënylalany.L-i.s oleucr,I-glycy7.-L- -leucyl-L-méthioninamide (II).
On dissout ,1 g de N-carbobenzoxy-L-glutamlnyl-L-prolyl- -L-séryl- ± Loarbobenzoxy-L-3.ysyl-L-aspaxtyl-L.-a.anyl-1G.
-phénylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-méthion1namide dans 11 cm3 d'acide trifluoracétique, puis on ajoute 4,7 cm3 de sulfure de méthyl-éthyle. On sature la solution d'acide bromhy- drique gazeux et on maintient à la température ambiante pendant 6 heures. On évapore le solvant sous vide, on triture le résidu avec de l'éther anhydre et on le sèche sous vide sur de la potasse et de l'anhydride phosphorique.
On purifie le produit brut par distribution à contre-
EMI23.4
-courant t 200 transferts dans le système butanol-n/acide acétique aqueux 0,5 N. Les fractions contenues dans les tubes 55 à 70 présentent la plus grande activité biologique. Le produit isolé donne, par hydrolyse acide (16 heures à 11 C dans l'acide chlorhydrique 6N), les aminoacides suivants acide glutamique, proline, serine, lysine, acide aspartique, alanine, phénylalanine, isoleucine, leucine, glycine et méthionine.
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
on purifie encore 30 z- d 'het)dÓoapept1de par ctomatra: phie sur papier Whatman 3 M/M en utilisant le mélange de
EMI24.2
butanol-n, diacide acétique et dteau 4ti tâj. produit ainsi obtenu (10 mg) est homogène tant à la chromatogaRhe qu â Ilélectrophorbse ;
aprls1hYdOlYSe en milieu acide, il donne les onze aminoacides cités plus haut.
EMI24.3
<Desc/Clms Page number 25>
EMI25.1
<Desc/Clms Page number 26>
(IX) t R2 = groupe protecteur de groupe aminé.
EMI26.1
(X) t R2 = groupe protecteur de groupe amine ;
R4 = -OH ou groupe protecteur de groupe carboxyle.
EMI26.2
<Desc / Clms Page number 1>
* new polypeptides and process for preparing them "The invention relates to novel therapeutic substances
EMI1.1
pentically useful polypeptides as well as their preparation process.
More particularly, the invention relates to a class of polypeptides endowed with a great
EMI1.2
alodilator and hypotensive activity, which are the endecapeptide L-pyrogXttam.prolyl-L-seryl-L-ly.yl.L-MpartylLl * -alan11-L-pen11.11-L-1801euc11-gl1c11-L-leuc11 -L-.eth1onin- alde (!) # Htndecapept1de L-gluttuainyl.-L-prolyl-L'-eeryl-I '.lyar, -IF-aa, ekrtyl.le.any.-L-phenyle7 anyl- L.eolaucyl-glycyl -leucylw-abt.osx3aamt.da (II) and their derivatives (III), the tetrapeptide L-glutIJl1n1-L-pl'Ol; rl-L-.é171-L-1181nt (IV) and
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
its derivatives (V), the heptapeptide L-sspartyl-L-alanyl-L-phanyl- alanyl-L-:
Lsoleucyl-glyoyl-L-leucyl-L-méthioninam1de (VI) and its derivatives (VII), the hexapeptide L-alanyl-'L-phenylalanyl-L ".isoleucy3.-glycyl L-3.eucyl.- L-rnethioninamide (VIII) and its derivatives (IX), pharmaceutical compositions which / contain and process for their preparation. Hendecapeptides 1 and II and Ilhexapeptide VIII have a great peripheral vasodilator power.
EMI2.2
risk, well detectable especially in dogs and humans, so that their use may be recommended in the treatment of attacks in hypertensive patients.
Polypeptides III, IV, V, VI, VII, IX are useful as intermediates and some of them for their hypotensive and vasodilatory activity.
The polypeptides of the invention can be called
EMI2.3
generally RL-alanyl-L-phenylalanyl-L-looleucyl-glycyl-L- -leucyl-methioninamide8, R being a hydrogen atom or an L-aspartyl group, L-giutaminyl * 'L-.prolyt # L' Beryl'-L-'lysyl '-L-aspartyl, or L-pyroglatamyl..L pxo.yl-T.raeryl-Lr.3.ysyl -aspartyl. Their preparation process is based on the following general reactions. A derivative (X) of the new tripeptide L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucine (XI) containing a protective group of the mine group is condensed with the new tripeptide glycyl- L-
EMI2.4
3.eucy..T, .., meth.oninaznide (XII) to obtain the hexapept1de IX from which the protecting group of the amine group is removed to obtain the hexapeptide L alanyl L-phenyZa.lany. G3so.rucyilray '-Z.-leucyl.L.m6thioninamide (VIII).
We then react this
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
eapep, at r 11 on an aspartic acid derivative bearing a protective group for the amine group and a p-earboxyl group to obtain the heptapeptide which is converted into heptapeptide VI after having removed the protective groups,
The derivative of the new tetrapeptide L-glute-
EMI3.2
m3, y iPxo.y, l.séry,., L .ysine *) whose amino group is protected with heptapeptide VU to obtain endcapeptide 11 which is converted, by elimination of the protective group, On.bend4capeptide lip to from which Ithendeopeptide 1 is obtained by elimination of ammonia.
To obtain the new tetrapeptide L.-gutaenylffllo. al.ï.aécy, L., ys.ne (IV), Iglutaminyï- pxo., na, the amine group of which is protected, is reacted with sery3 ..
-L-lysine in which the amino group in epsilon and the carboxyl group of lysine are both protected, and the protective groups of the resulting tetrapeptide are removed.
To protect the amino groups (R2 substituent),
EMI3.3
it is possible to use the toluenesulfonyl, carbobenaxyr caxbo taxobutoxyl, txi, u4xaoétyl, e triphenylm4thylop etc * groups, usually used in polypeptide chemistry.
To protect the carboxyl group (substituent R3), one can use the methyl, ethyl, tertiary butyl groups,
EMI3.4
benzyl, p-nitrobenzylee etc., usually used for this purpose.
Acid derivatives suitable for reacting with amino groups are chloride, azide, p-nitrophenyl ester, etc., which are usually used for this reaction enre; the acid can also be reacted in the presence of a dicyclo
EMI3.5
he xyl-çarbodliznlde
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
To remove the protecting groups thus fil tt Indicated in detail in the examples? following, we can proceed
EMI4.2
methods known in the literature, for example
EMI4.3
treat the compound with an alkaline hydroxydo 04 with .Qd1 in liquid ammonia, obtained by Z'4cteq chorhydriue w r <cn <hydrj..que, or else operate a tyirognation, t8vtie,
EMI4.4
depending on the case.
EMI4.5
To separate and purify the? , oyptPtldè. according to the invention, in particular the tutn <: t4Ifapeptldes, it is also possible to proceed according to well-known techniques of chromatographyp either on basic alumina, or on ion exchange resins or by dotrtbution b against
EMI4.6
In particular, the method of the invention is preferably carried out as follows.
EMI4.7
Glutamyl chloride is condensed with proline and the resulting dipeptide is converted into toluonesulfonyllglutamirylwV-pro / Wn by reaction on concentrated ammonia. Condensed further or dipopted with L-86ryl hydrochloride. - ('! to3rUneeulfonyl) -' ethylainate (which is obtained by condensing the c rbofc n ôxy * & N ## seryl-fazlde with It "-N ... tolune8 \ .1;
Lf9nY1..LM3, ethyl y.1nate and then eliminating the carbobenzoxylo group, to obtain the N-tolunesulfonYllutamtnyl.prQ1Y. * E6ryl. (6- -N-toluene8ulfonyl) ... LooIy'inat. ethyl (formula V in which R2 m toluenesulfonyj-e, R4 Jill C + ethyl) from which the ethyl group is then removed to obtain the tetra-i peptide V (R2 m toluenesulfonylet R4 pH), By removing the toluene sglfonyl groups one obtains the tetrapeptide 3W '
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
We can also get the 1;
<tr <ptide IV <V60 of good yield * by condensing the N-4tUbobenzoxy-t, ... glutamI.nYt, .. proline (obtained by reaction of laproline on the chloride of N-aaxbobenzoxy-8r.pYroglutamyxe, then by reaction of the product on ammonia) with Lsryl .. t> # l-carbobenaûxy-t *
EMI5.2
-methyllysinate (obtained by reacting
EMI5.3
N-triphenylm6thyl-L..à 6rin on 1 't f, -N-carbobenzoxy-L-ly * 1ne,
EMI5.4
then hydrolyzing with aqueous acetic acid) and then removing the protecting groups.
EMI5.5
L-ph4nylalanyl-L-isG- hydrochloride is condensed
EMI5.6
Methyl leucinate (obtained by condensing the
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carbobenzoxy-t, ph4hylalanine with L-isoleucinate
EMI5.8
methyl, then removing the carbobenzoxyl group from the resulting dipeptide) with carbobonzoxy-L-alanine to obtain
EMI5.9
carbobenzoxy-L-alanyl-L-ph6nylalanyl-L-isoloucinate from
EMI5.10
methyl from which the methyl group is removed to convert it
EMI5.11
to carbobonzoxy-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-1s01euc1ne (X).
This tripeptide is condensed with 91ycyl-L-leucyl-ethonifi amide (XII) (which was obtained by condensing carbobonzoxy- -glycyl-L-leuclno with methyl mthioninate, then by
EMI5.12
causing the tripeptide obtained to react with a saturated solution
EMI5.13
ammonia in methanol to obtain carbobenzoxy- -qlycyl-L-leucYl-meth1oninamide from which the aarbaban.axyxQ group is removed), in order to obtain aarbobenzoxy-L.alahylLr. -ph'nylalanyl-L-1so1eucyl-glycyl-L-leucyl-L-meth1on1amide (IX)
EMI5.14
from which the carbobenzoxyl group is removed to obtain
EMI5.15
hexapeptide VIII.
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
When the hexapept1de VIII is reacted with benzyl carboboxoxy-p-aspartate, it gives the corresponding heptepept1de from which the carbobonzoxyl group is removed to give the ... benxyl L.aspartyJ. L-aZnyl-L-ph; nylalanyl. L- -isolucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamide ("tII).
EMI6.2
obtains heptapcptide VI by removing the benzyl group.
EMI6.3
By condensing heptapeptida VII with tetrapep- tide V, we obtain hondecapeptide III; for example, by condensing benzyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-ph6nylalanyl-L- -1so1eucyl-glycyl-L-leucyl-L-méth1on1nam1do with N-toluene-sulfonyl-L-glutam1nyl-L-prolyl- L-aé: y1- (#. -N-toluenesulf onyl) - -J> -lysine, we obtain Ilhendécapept1de N-toluénesulfonyl-L4- <-glutaminyl-L-prolyl-L-.seryl (e. N..tolunesuxfonyl ) -L..lysya-. (Benzyl) -L-aspartyl-L-alanyl-t-phenylalanYl-L-1so1eucYl- -glycyl-L-lcucyl-L-méth1on1na (III).
Another method is to condense the azlde of N-carbobonzoxy.L-qlutam1nyl-L- -prolyl-L-seray11 t -N-carbobehzOXy-lY81ne with L-aspartylL.r -alanyl-L-phenylaanyl-L-isoleucyl -Olycyl-L-leucyl-L-méthlon1n- amide to obtain N-carbobenzoxy-t-glutamlnyl-L-prôlyl-L- # seryl- ± -N-carbobenzoxy-L-1Y $ yl.B $ Pàrtyl-L- alanyl-L- -phenylalanyl-L-isoleucyl-qlycyl-L-leucyl-L-méth1on1namido (It).
Endecapeptide II is obtained by eliminating the groups $
EMI6.4
protectors of III.
EMI6.5
By subjecting the hendecapeptlde He to an environment which favors
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make the displacement of ammonia, for example by chromate graphics on $ carboxylated exchange resins or by heating with
EMI6.7
water, we obtain the endecapeptide 1.
<Desc / Clms Page number 7>
The polyps of the invention, in particular:!? polypeptides I, II and VIII, have a strong peripheral vesodiletatrice action which is well detectable mainly in dogs and humans. The active doses for the dog are 0.001 to 0.005 @ g / kg of polyp ptide administered intravenously by infection in the femoral artery, vasodilations up to doses of 0.001 g are observed in the limb of the dog. In isolated intestinal smooth muscles of rabbits, dogs and guinea pigs, the hexapeptide is active up to doses of 0.001 to 0.002 g.
The polypeptides of the invention or their non-toxic salts are used practically and advantageously in the clinic for attacks of hypertension, or in any case in emergency therapy for very severe hypertension; in the vascular spastic syndromes, especially those of the musculc-cutaneous regions (particularly in the cases of Burger syndrome, Raynaud's syndrome, latent ulcers), of the retinal vessels (amaurosis resulting from a spasm of the central action of retina), menineal vessels (headache and migraine from vesculeige spasm) and coronary vessels (angina pectoris).
These polypeptides can be administered parenterally: subcutaneously, intramuscularly, intravenously (a single injection or by slow infusion) or intraarterial.
The most suitable solvents are water or non-alkaline physiological solutes.
Subcutaneously or intramuscularly, they may be added to substances which delay absorption.
The percentages of active ingredient may vary depending on the particular dosage forms and depending on the desired hypotensive effect, but generally they are very low. The daily administration of active ingredient may vary from 0.005 to 5 mg in humans. The use of the polypep tides of the invention does not cause manifestations of acute or chronic toxicity.
<Desc / Clms Page number 8>
The following examples serve to illustrate the invention without limiting it * Example 1.
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ToLuènesulPonyx-.pyx'ogxaamy.-L-pxo.ia. ' .
5.04 g of L-proline is dissolved in 40 cm3 of water, 4 g of magnesium oxide is added and the mixture is cooled with a mixture of ice and salt. Was added over 20 minutes, with vigorous stirring, 12 g of chloride.
EMI8.2
toluenosulfonyl-pyroglutamyl {Cp .., 0 Chem. Comm. 12, 1954, 365). The rational mixture was again stirred at room temperature for 1.5 hours, then acidified with concentrated hydrochloric acid.
The precipitate is allowed to settle for 30 minutes, then it is filtered. Yield 10.5 g; Fusion point
EMI8.3
250-252oc (after recrystallization from ethanol); r, fD 0 M -800 (0.5% in ethanol).
Example 2.
TOluenasulfonyl-L-glutamyl-L-proline.
8 g of tolubcesulfpnyl-L-pyroglutamyl-L- "proline are dissolved in 40 cm3 of concentrated ammonia and the solution is left to stand for 60 minutes. Most of the ammonia is removed in vacuo and the remaining solution is acidified with water. The product is recrystallized by means of hydrochloric acid with a mixture of ethanol and water.
Yield 7.6 g; melting point 216-218 C;
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cdë5 la ¯'8 C at 1% in ethanol).
, Example 3.
Ethyl carbobenzoxy-L-sery (# N-toluenesulfonyl) -L- -lysinate.
A solution of aatboberxaxy-L-sexy.laz3de in ethyl acetate, prepared from 5.06 g of carbobenzoxy-8erylhydraz: Lde (J. biol. Chem. 146, 1942, page 463) is added. to a solution of 6 <.l, .taLuènesuiany, i.1 ', ethyl rlysinates in
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
ethyl acetate (J * Hrn. Cham. Socs Les 1956, page '5866) which was prepared from 8.6 g of hydrochloride * After 24 hours at room temperature, the mixture is extracted.
EMI9.2
reaction mixture with 1N hydrochloric acid, 1M sodium b3.dsxw bonate, then with water, and dried over anhydrous sodium sulfate.
The solvent is evaporated off in vacuo and 8 g of an oily residue are obtained.
Example 4,
EMI9.3
Ethyl L-seryl- (S-N-toluenesulfonyl) lY8inata hydrochloride.
8 g of ethyl carbobenzoxy-L-seryl- (& .tolune-sulfonyl) -L-lysinate are dissolved in 100 em3 of ethanol and 2.5 g of 10% palladium on charcoal are added to the solution. , then the mixture is hydrogenated for 4 hours at atmospheric pressure.
After filtration of the catalyst, the solution is concentrated to a small volume, then 200 cm 3 of anhydrous ether are added and the solution is acidified with gaseous hydrochloric acid. The solvent is decanted, the residue is triturated with several times with anhydrous ether and finally dried in vacuo.
EMI9.4
Yield 6.6c; melting point 6â6? 'pC (with composition); 5. '-7.5 "(at 3% in ethanol). PxernRlo 5.
N-toluenesulfonyl-glutam1nyl-L-prolyl-L-seryl- .. (t..t3..toluenesuxfonyl) L. ethyl isinate (formula V; R2 m toluenesulfonylep R4 to C6-ethylo).
6.4 g of L * seryl * hydrochloride (6 1w Mtolunesulfonyl). L-1Y $ 1nate of ethyl is dissolved in 80 cm3 of aeetonltrlle and 201 cm 3 of triethylamine is added. Then we add bzz g of
<Desc / Clms Page number 10>
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a, unasu.cnyJ .. .rtarn.ny.xo, 3ri dissolved in 40 cm3 of d1mâthylformamide and z g of dicyciohexylcarbodiiMide and the mixture is stirred for 24 hours at room temperature.
The d3.cycxahacyJ.uxct is filtered off, the solvent is evaporated off under vacuum, the residue is triturated several times with sodium ether.
EMI10.2
petroleum, it is dissolved in toto oma of ethyl acetate and the solution is extracted with 1N hydrochloric acid, with 1M sodium bicarbonate and with water. After the solution was dried over sodium sulfate, the solvent was removed in vacuo to obtain 5.6 g of viscous solution.
EMI10.3
xQn the 6 ..
N.t.o.unesuieny. Lwg, utaminy. t.pxoJ.y. Lâxy1. , .N.tasunesu.fcnyi) L l.ys3, ne (formula V t R2 m toluansiilfohyiôi R4 m OH).
4.7 g of N-tolune8ultonyl-L-glutaminyl-t are dissolved. ethyl o, y3 .- .. sdxyl. (.aNtolunssu, Foriylj.L.lyinate in 15 cm3 of methanol and 9 cm3 of 2N sodium hydroxide are added. The solution is left to stand for 30 minutes at room temperature? the mixture is evaporated off. methanol in vacuo at room temperature, the residue is diluted with water and acidified. The precipitate is dissolved in ethyl alcohol and ethyl acetate and the solution is dried over sodium sulfate. anhydrous.
After removal of the solvent. we get 4 g of the substance
EMI10.4
all form of foam. r6 .... 4 z 5% in ethanol).
By removing the toluenosulfonyl protecting groups, tetrapeptide IV is obtained.
Example 7.
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Methyl carbobenzoxy.phénylalnnyl-L-1so1eucinàte * 29.2 g of carbobonïoxy-L¯ph <5nylaianine (beur. Il, 1958, page 462) and 16 q of methyl t-i8cleucinte (Helv. Chim. Acta, 1 5, page 1500) in 250 cc of anhydrous teterahydrofuran. Then add, with stirring and cooling
<Desc / Clms Page number 11>
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èi $ ant, 24.7 e. diCyqlXY1 "carbodi1mide.
The mixture is stirred for 9 m4aQEt for 16 hours at room temperature. After drying, the solvent under vacuum dissolves the residue in 3 ′ 6 ″ of acetate. with ChOry acid; ie 1. by b3axbR'1 do $ d1um 1 M and finally by bzz the solution on 8ijfte of anhydrous sodium, evap9ve 19 a4, van. r6sidg by mél4ngQ 414144 * On t ", 't.I' 10 ésidu by a #### 4., 4" '
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ethyl etOf o petroleum. o Rendt "," t 6 (1 po1nt QG fusion 106-1070 (;, /! Vo ..10,1i (h. 1. "in MMl). 9mletTa. Ç9hyd; ate de hénylalaYlt-So.on ' t of htYlalany ^ "" xer, n '' methyl.
On A''1: 't3 9 ... rb..en..P. so, aua, nlwo 0 i, Yy dsns 0 cm of methn9 .t THIS adds solution B '1. p.J.l3um at 10% on chayb boise on da3n 10 '0 for 5 hours. pressure .. uo. Apa fs, ltr: att "oetalyseurt on 6vapoge le 'ONfl \, disa0u $ .du dan ox anhydxo, 4n aer, d, a' '' obtained at my'0 .d! A3de ch.oxlydx3ta gas and 0 l'va up to oiçctd melting point Yield 115 9 melting point 74-76, cg> Io, r (% in 11 ethanol).
'' # b0b0roxY "alanyx-Phny..anl" "" "a0t c1n4t, methyl (fotmul X, R2. ab0bl'Cs xylc t R4. C.m6thyle) - t7ri s' 11 Pl 9 ee carbobenZOy¯alnn1e ie Sl01 . h0m. 19r Pa'0 4), 5. tphdnya, 0ny.s0ru Chom. W, 19 $ 8, page 702) and 1.5 g free) dn .1ell. 'c3, nae dd 1 h, r ($ OR $ free) dane, t> O 1JIt3 r, I,. J tdtrahydtoeUr4ng and 12e3 g of d.cyaa.hxyaaac are added.
<Desc / Clms Page number 12>
mide while cooling and stirring; the mixture is left to stand for 16 hours at ambient temperature, then it is filtered, the solvent is evaporated off and the residue is dissolved in 400 cm 3 of ethyl acetate. The solution is stirred with 1N hydrochloric acid, 1m sodium bicarbonate and water.
The solution is dried over sodium sulfate, the solvent is evaporated off and the residue is recrystallized with a mixture of ethyl acetate and petroleum ethor.
EMI12.1
Yield 21 g; rfe melting point 154-156OC.
/ "<7µ8 -44.6" (2.5% in ethanol), temple, 10.
Carbobenzoxy-t.alany.L-Ph6ylalanyl-L-i801eucine (formula V t R2 8 * çarbpbenzoxylo R4 a OR).
4.9 g of carbobenzoxyL-alanyl-t-phenYlalany1 .L.1so1euc1nate methyl is dissolved in 90 em3 of ethanol and 20 cm3 of 1N sodium hydroxide are added. After 90 minutes at 20 ° C., the ethanol is evaporated off under vacuum at room temperature, the residue is taken up in water, the solution is acidified with hydrochloric acid and the precipitate is extracted with acetate. ethyl.
After drying over sodium sulphate, the solvent is evaporated off,
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Yield 4.4 g; melting point 183-186 (after recrystallization from ethyl acetate).
Example 11.
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Methyl carbobenzoxY "91yeyl-leucyl-thioninate * 10 g of aaxbabanQsy glycy3 - .., eucine (J. Amer. Chem. Soc. 78p 1956, page 2130) and 5 g of methyl 5thioninate (Helv. Chem. Acta 24p 195tj page 2091) in 90 cam 3 of tetrahydrofuran 72 g of d1cyolohexyl- ¯ <5arbodiinilde are then added and the mixture is stirred for 16 hours at room temperature The dicyolohexylureo is filtered off, the solvent is evaporated in vacuo and the residue is dissolved in 250 cm3
<Desc / Clms Page number 13>
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ethyl acetate. The solution is extracted by ecide chl0thy *. 1N drric, by 1M sodium bicarbonate and by water.
After drying over sodium sulfate. the solution is evaporated off under a vacuum * The oily residue is triturated with speech ether to obtain a crystalline product which is purified with a mixture of ethyl acetate and petroleum ether *
EMI13.2
Yield 12 g; melting point 11a.119; / * 7 "-43.1 (3% h in ethanol).
Example 12 <3arbobenzoxyglycyl-'L-leueyl '* L- * Mëthionihamidet 10 g of carboben2oxy-glycyl -L leU6yl * ± - -méthioniftste de thethylo are dissolved in 200 cm3 of anhydrous methanol saturated with "ar) Mt) onia6 0" C . After 4 Jourar at temperature. room, evaporate the solution to dryness, triturate
EMI13.3
the residue several times with ethyl acetate and dried Yield 6 g; mp 177-11900 (6> recrystallization from ethyl acetate) j / * <17d ** 7 <'(at 5% in methanol).
Example, 13
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dyiSyi-Ïleucyl'-L-'methioninanddo (Xïï) * 5 g of carbobenzoxY-91ycylL-leéY1 -méth1oninnm1dt are dissolved in 250 cm3 of methanol, the whole is added to 3 g of 0% palladium on charcoal and atmospheric pressure is hydrogenated. After 3 hours, another 3 g of catalyst is added and the mixture is reacted again, making up 4 hours. After filtration of the catalyst, the solution is evaporated to dryness, the residue is triturated with water and the filtrate is evaporated in vacuo.
Yield of crude product: 2 g; melting point 120 C.
<Desc / Clms Page number 14>
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Item ,,,,!.
Ca * bobôh * oxy * t * àî.6ftyi * Uph4nyaalanyi * L-lôoleiioyl'- -glycyl.1.uoylêthlon1namldé (formula IX t R2 catbbbèfi.Óy1e).
2.1 0 dë 6ajPb6bônz6} tY'.L-alanyl'-t'phnyl Alanyl-L-isoloucine and the $ 9 of 6iyûyl * Uleucyl¯I> md * hlôrtinàifriide are dissolved in 50 ema of dîmethylfoïlffiàffiidoi and then 1.4 g of dicyelohexyl'-carbodilmido and the mixture is stirred for 20 hours at hot temperature. Apet fiitration (1. '9 of dicyclohexylurde) where we Vap6 there beating under vacuum until dryness and we triturate the residue with anhydrous ether oh dissolve the pioEipHe dirtl 14 again minimum quantity of oimdthylformamide and pedipito' again by 1'6thor.
Yield 39% fuôiôn 235 238 <SC (after recrystallization by lt4thnb1).
EMI14.2
temple.15.
EMI14.3
Brotnhydfëto do ainylL * 'phenylalanyl't'isoleu *' eyl'lyeyi * 'Mueyi *' ïmothioninamide (vm) <To 1.4 cm3 of solution atui? 4Q of 9aeux hydrobromic acid in acetic acid, then add 1.1 cm 3 of diethyl phosplid and 0 # 5 CM3 did <t.a6eti <and In this mdlahlo # on. dissolves 0.4 g of earbobeftiô tai # rtyl-t * phéttylalanv'i-t-'i8ô * leucyl "'" 91ycyl..L-l0ucyl.t..tnthiÓf \ thatn1de. At the end of 74ftUtot h 20 ° C., 50 tffl3.d. anhydrous ethe are added to the solution. The precipitate obtained is washed several times with ether and dried under vacuum over potatob and phospho anhydride. **
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tick,
EMI14.5
Yield 0.36 <
<Desc / Clms Page number 15>
Example 16.
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N-carbobenzoxy -. (P-benzyl) -L-aspartyX-L-aXanyl-3-¯ p henylalany3, -L-.s ol.eucyl-glycyl.L, .- leucyl.-L -nêthion3.nam.ide 0.36 g of L-alanyl-I-phënyï-3 alanyl - 3.soJ.eucy, g.ycyl-L-leucyiL.-methi.oninamide hydrobromide is dissolved in 7 cm of dimethylformamide and the mixture is reacted. solution on 0.071 five of triethylamine. Then 0 178 g of benzyl carbobenzoxy-p- -aspartato (J. Chem. Soc. 1959, page 3870) and 0.123 g of dicyclohexyl-carbodiimide were added. After 2 days at room temperature, the solution is filtered, concentrated to a small volume and the heptapeptide is precipitated with ether.
Yield 0.5 g. example 1 * 7.
EMI15.2
P-Benzyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-wphnyla.anyl.-L..is oleucyl-glycyl-.L-xeucyl.-L .. hydrobromide
..methioninamide (formula VII R3 = benzyl).
0.5 g of carbobenzoxy - benzyl Laspartyl-L .. is dissolved.
-alanyl-L-phenyl-alanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methi0-ninamide in a mixture of 2.8 cm3 of acetic acid and 1.2 cm3 of diethyl phosphite saturated with hydrobromic acid gaseous.
After 15 minutes, 100 cm3 of anhydrous ether are added, the precipitate is washed several times with ether and finally dried under vacuum over potassium hydroxide and phosphorus pentoxide.
Yield 0.42 g.
By removing the protective benzyl group, heptapeptide VI is obtained.
<Desc / Clms Page number 16>
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Example, J18, N-toluen9sulfonylL-glutamyl-I.rprolyl "! Neryl'- - (#. -D3-to.uenesulfanyl) rlrlysyl.benxy., - L-aspartyl-I, .. a.anyhT.-ph6ny, axany3, .L..soW tCY.
-glycyl-leucyl-L-méth1oninam1d & (formula III s R2 toluene tallow ony le, R3: benzyl).
0.42 g of P "rJ? En2yl" îr * a8P? Rtyl- -L-alanyl-L-phenylalanyl-L-: Lsoleucyl-L-leucyl-methlon1namide hydrobromide is dissolved in 4 ern3 of dimethylformamide and treated with 0.063 cm 3 of triethylamine. To this solution is added 0.35 g of N-toluene # sulfonyl'-Lg.Lutatnlnyl-L-proJ.yl - !. ceryl '* (#. .Touenesulfonyl) - .J, -lysine and opel g of dicyclohexyl -carbod: Lim1de. The reaction mixture is left at room temperature for 2 days. After filtration of the dicyclohexylureop the solution is contained to a small volume and the protected peptide is precipitated by adding ether.
Yield 0.66 g.
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E4, ZM21.2. -U. lutam1nyl-L-prolylL-seryl-L-1YBY1-a8partyl- -L-alanyl-L.vhénYlalanyl-L-1so1eucyl-glycylt-leucyl-L-mdthloninamide (formula II).
0.68 g of the protected hendecapeptide is dissolved in 20
EMI16.3
com of liquid ammonia, then 0.3 g of metallic sodium is added with stirring. To the reaction mixture, 0.45 cm3 of acetic acid is added. After evaporating off the ammonia, the residue is dried under vacuum over phosphorus pentoxide.
Yield 0.6 g.
Polypeptide II can also be obtained from polypeptide III where R2 can be carbobenzyl, tertiary carbobutoxyl, etc., and R3 can be a group.
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p-nitrobenzyl, tertiary butyl, etc ...
<Desc / Clms Page number 17>
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Example 20. x.-pyroglutamyl-t, .. p :: olyl ... L-t ': yl..t-lysy1-r ...- a, pa: r: - tyl-L-alanyl-L -phenylalanyl1so1eueyl.glycyl- -leucyl-L-méth10n1namide (formula 1).
Ilhenddeapaptide II is dissolved in water and passed through a column of anion exchange resin (eg, trade mark "Amberlite IRC 50") and then eluted with water. After having purified the obtained endecapeptide in a known manner, the endecapeptide I is obtained in pure form.
Example 21.
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N-carbobenzoxy-L-pyroglutamyl L..proline.
2.5 g of L-proline are dissolved in 40 cm3 of water; to this ice-cold solution is added 2 g of magnesium oxide and
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5.6 g of finely powdered N-carboboxoxy-L-pyroglutamyl chloride (Annalen 640, 1961, page 151). The mixture is stirred for 1 hour at 0 C and for an additional hour at 20 C.
After having acidified with hydrochloric acid, the
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precipitated, washed with water and recrystallized her with a mixture of water and alcohol.
EMI17.5
Yield 5 g; melting point 177-1-8 C; / "OL" $ 49 (42% in ethanol); r4 III -1060 (2% in 95% acetic acid).
Example 22.
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N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-proline 4. 8 g of N-carbobenzoxy * L-glutanyl-L-proline is dissolved in 30 cc of concentrated aqueous ammonia and the solution is allowed to stand overnight.
Most of the ammonia is removed in vacuo and the remaining solution acidified with hydrochloric acid. The separated oil is extracted with ethyl acetate; after drying over sodium sulfate, the solvent is evaporated off in vacuo. The residue is triturated with petroleum ether and dried over phosphorus pentoxide.
<Desc / Clms Page number 18>
Yield: 4.5 g of amorphous product
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JT * Jq0 * bzz "(4% in Itethanol).
Example; | 23> Methyl N-tlphenylmÓthyl-8ÓrlnatG.
15.5 g of t .-, .. er1 $ t hydrochloride are dissolved. of methyl (Helv. Chim. Acta 4J., 195 $ p page 1858) in 150 cm3 of anhydrous chloroform and to this ice-cold solution are added, with stirring, 28 cm3 of triethylamine and 2T, 8 g of triphenylmethyl chloride. After 6 hours at room temperature, the solution was washed three times with water and dried over sodium sulfate; the solvent was evaporated in vacuo and the residue recrystallized from a mixture of benzene and d. petroleum ether.
Yield 29 g; melting point 145 C.
Example 24.
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N.tr3phényimâthy ... l; .z, ne.
25 g of methyl N ... triphenylmethyl erinate are dissolved in a hot mixture of 40 cm 3 of ethanol and 80 µm 3 of 1N alcoholic potassium hydroxide. After one hour at room temperature, the solution is diluted with 250 cm3 of water .. cooled with ice and acidified with acetic acid; the precipitate is filtered, washed and recrystallized with a mixture of methyl ethyl ketone and petroleum ether.
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Yield 15 g; melting point 154-1 57 C? -4. +240 (at e% in ethanol). temple 25.
N triphny3, methyl, L-sel N. arbobenzoxy-1 "methyl lysinate.
13 μl g of 6 vnogarbobenzoxy- -L-lysinate methyl hydrochloride (Helv. Schim. Acta 4J., 1958, page 1878) is dissolved in 100 cm3 of dimethylformamide and 100 cm3 of acetonitrile and then 5.6 cm3 are added. of triethylamine, 13.2 g of N-triphenyl-methyl-L-serine and, with cooling, 8.4 g of dicyelbhekyi- '#' 'carbodiimide. @.,
<Desc / Clms Page number 19>
After 20 hours at room temperature, the
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be dicyclohexylurea and the solvent is evaporated off in vacuo.
The residue is dissolved in 350 cm3 of ethyl acetate and the solution washed with 1N hydrochloric acid (at 0 ° C.), with 1M sodium bicarbonate and with water. After drying over sodium sulfate, ethyl acetate is distilled off and the residue recrystallized twice with a mixture of ethyl acetate and petroleum ether.
Yield 15 g; melting point 128 C;
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3. -380 (at 5% in .ethanolJ.7.
Example ,, 26.
Methyl L-seryl- -N-carboben% oxy.-L-ly.1nate.
8> 4 g of N-tr1phenylmethyl-L- "ryl- & i # carbobenzoxy-L-lyslnate are dissolved in 50 µm of acetic acid, then 50 cm3 of water are added and the mixture is heated in a bath. -. dryness for 30 minutes 50 cm 3 of water are added again and the whole is cooled to 0 ° C. After filtration, the clear solution is evaporated in vacuo to dryness The residue is taken up in 80 cm 3 of water. 2% aqueous ammonia and the mixture was extracted with chloroform, the extracts were dried over sodium sulfate and distilled in vacuo to obtain a syrupy residue.
Yield 4.2 g.
The product appears homogeneous on chromatography on paper.
Example 27.
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Methyl N-carbobanzoxy-L-gltitantinyl-L-prolyl-L-Séxyl- L - -N-carbobenzoxy-L-lysinate (formula Vs R2 carbobenzoxyl, R4 - Methyl).
4.1 g of N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-proline are dissolved
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and 4.2 g of i.séxyl .. #. Methyl N-carbobenzoxy-L-lysinate in 70 cm3 of methylene chloride and to the solution, cooled to 0 C, 2.5 g of dicyclohexyl-carbodiimide are added. After 16 hours at 20 C, the mixture is filtered and the filtrate washed.
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with 1N hydrochloric lucid, 1M sodium bicarbonate and water. The solution is dried over sodium sulfate, the solvent is removed by distillation in vacuo and the residue is recrystallized from a mixture of ethyl acetate and petroleum ether.
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Yield 5 g; melting point 58-6Q G; J 5. -.5t? A (at 2% in ethanol).
Example, 28.
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N-earbobenzaxy hydrazide. L cl.utam3, ny.-L-praly, -.L-seryl- '& -N-carboben% oxy-L-lys1na (formula Vt R2 has carbobenzoxyl, R4 - -NI3 - NH).
3 g of methyl N-carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolyl-L-eéxy.t -N-carbobonzoxy-L-lysinate are dissolved in 30 cm3 of methanol, then 7 cm3 of hydrazine hydrate * are added. We keep
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holds the solution overnight at 20 ° C., then it is evaporated off. vacuum to dryness and the residue is triturated several times with anhydrous ethyl ether. The product is recrystallized with ethanol.
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Yield 2 melting point 1316 C 5. .30 (at 2% in dimdthylformamide).
Example 29.
Methyl N-triphnylmethyl-glycylleuc1nate.
31.7 g of N-triphenylmethyl-glycine (J.A.C.S.
78, 1956, page 1359 and 15.9 g of methyl L-leucinate (Helv.
Chim. Acta 29, 1946, page 784) in 300 cm3 of tetrahydrofuran,
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then 22.6 g of d3cycl.ohaxyl-aarbod, imide are added. The mixture is stirred overnight at room temperature, then the dicyclohexylurea is filtered off and the solvent is removed by distillation in vacuo. The residue is dissolved in 300 cm3 of ethyl acetate and the solution is washed with 1N hydrochloric acid (at 0 C), 1N ammonia and water. After drying over sodium sulfate, the solvent is removed in vacuo.
Yield: 35 g of syrupy product.
<Desc / Clms Page number 21>
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Bxemole 30r Ntiphnylmethyl.gl.jrcyl-lrrZeuaine.
35 µg of N-triphenylmethyl-gly- are dissolved by heating. Methyl cyl-L-leucinate in 90 cm3 of 1N alcoholic potassium
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and 50 cm3 of ethanol. The solution is kept at room temperature for 1.5 hours, then diluted with 300 cm3 of water and filtered. The clear filtrate is cooled, acidified with acetic acid, the precipitate is filtered off and washed with water.
Yield 20 g; melting point 75-85 C.
Example 31
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... mcthion, nam3de.
38.5 g of x.-meth.an, methyl nate (Helv.
Chim. Acta 3., 1951, page 2091) in 250 em3 of anhydrous methanol and the solution is saturated with gaseous ammonia at 5 C.
After 4 days at 45 ° C., the solution is evaporated in vacuo to dryness and the residue is triturated several times with anhydrous ethyl ether.
Yield 33 g; melting point 50-51 C;
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/ "L7] 37 *" 2 '(b 5% in ethanol).
.Example, 32 ,.
N-triphenylmethyl-91Yeyl-L-leucyl-Ethion! N-amide.
11 g of N..tr1phenylmethyl-glycyl-L-leuc1n4 ..t ,, 0 g of L, .tmethlon1Mmidt are dissolved in 180 amm of methylene chloride, then added * - while cooling "8.6 g dicyclohexylcarbodllraide After overnight at room temperature, the reaction mixture is filtered and the filtrate washed with
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.1N hydrochloric acid (at 0 C), 1M sodium bicarbonate and water. After drying over sodium sulphate, the solvent is removed by distillation in vacuo and the residue is recrystallized with ethyl acetate.
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Yield 15 g; melting point 214-21 6 C? / "<C7" -'20 "(at 1 * 6% in ethanol).
Example- 33t GlycyJ.-L-.eucy.-Tr ... mdthiori3, nam, de (XII).
9.5 g of N-triph6nylmdthyl-glycyl-L-leucyl- -méthloninamide are dissolved in 50 cm3 of acetic acid, then 50 cm3 of water are added and the mixture is heated for 30 minutes in a water bath.
After adding another 50 cm3 of water, the mixture is cooled.
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ge to OOC and the triphdnylcarbinol is filtered. The clear solution thus obtained is concentrated under vacuum to dryness. The residue of glycyl-L- -leucyl-L-methioninamide acetate is recrystallized with ethanol; mp 134-136 C.
The aqueous tri-peptide acetate solution is passed through a column of "Dowex 2" trademark resin in the basic form and the elution is concentrated in vacuo to dryness.
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Yield i 4.6 g; melting point 956158; / "OL7D * = -500 (at 2. in water).
Example 34.
N..caxbobenzoxy-L-ciutaminyl.-L-pxaJ.yi-Irsxyl.
-I-carbabenxoxyLLysyl-L aspartyl-ir-alryl-.
-phenylalanyl-L-isoloucyl-glycyl-L-leucyl-L- -methioninamide (formula III t R7 catboben. zoxyl, R 3 m H) t 0.60 g of N'-oarbobenzoxy hydrazide is dissolved! ' lutaminyl-'L-proiyl-s oryl- in.,.
12 com of dimethylformamide, then 0.81 cl 4N hydrochloric diacid is added and the mixture is cooled to -50C.
After adding 0.22 cm3 of 4N sodium nitrite, the solution was stirred at -5 C for 5 minutes with 0.34 cm3 of triethylamine and dried several times over sodium sulfate. @
<Desc / Clms Page number 23>
Filter ± mixture and wash the sodium sulfate
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with 5 com of dimthylformamide; 0.70 g of L-aspartyl-l, -alanyl-f, -phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-le- -leucyl-t ..- methion: Lnamide and 0.34 cm3 of triethylamine are added to the filtrate.
After 3 days at 5 ° C., the solvent is evaporated off in vacuo and the residue is triturated with water, then with anhydrous ethyl ether.
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The product is dissolved in dimethyltormamide and precipitated again by adding anhydrous ethyl ether; it is washed twice with ether and dried in vacuo.
Yield: 1.1 g. @ Example 35.
L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-aspartyl-
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.L-alanyl..Lphenylalany.L-i.s oleucr, I-glycy7.-L- -leucyl-L-methioninamide (II).
1 g of N-carbobenzoxy-L-glutamlnyl-L-prolyl- -L-seryl- ± Loarbobenzoxy-L-3.ysyl-L-aspaxtyl-L.-a.anyl-1G is dissolved.
-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-méthion1namide in 11 cm3 of trifluoroacetic acid, then 4.7 cm3 of methyl-ethyl sulfide are added. The gaseous hydrobromic acid solution is saturated and kept at room temperature for 6 hours. The solvent is evaporated in vacuo, the residue is triturated with anhydrous ether and dried in vacuo over potassium hydroxide and phosphorus pentoxide.
The crude product is purified by distribution against
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current t 200 transfers into the n-butanol / 0.5 N aqueous acetic acid system. The fractions contained in tubes 55 to 70 exhibit the greatest biological activity. The isolated product gives, by acid hydrolysis (16 hours at 11 C in 6N hydrochloric acid), the following amino acids glutamic acid, proline, serine, lysine, aspartic acid, alanine, phenylalanine, isoleucine, leucine, glycine and methionine.
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30 µg of het) oapept1de were further purified by cytomatra: phy on 3 M / M Whatman paper using the mixture of
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butanol-n, acetic diacid and 4ti taj water. product thus obtained (10 mg) is homogeneous both to chromatograRhe and to electrophoresis;
aprls1hYdOlYSe in an acidic medium, it gives the eleven amino acids mentioned above.
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(IX) t R2 = amino group protecting group.
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(X) t R2 = amine group protecting group;
R4 = -OH or carboxyl group protecting group.
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