Procédé pour la préparation de glutathion
L'objet du présent brevet est un procédé de préparation du L-glutathion ou dy-L-glutamyl-L-cystéinyl- glycine, tripeptide-naturel de formule :
EMI1.1
dont l'importance physiologique a óté mise en évidence dans le < < Symposium of glutathione - Proceedings of the Symposium held at Ridgefield, Connecticut, Novembre 1953, New York Acad. Press. 1954 .
Ce composé était difficilement accessible jusqu'ici, les méthodes employées utilisant généralement comme agent de blocage de la fonction mercaptan, le chlorure de benzoyle. On aboutissait généralement a, u peptide correspondant au glutathion dont la fonction amine était bloquée par un groupement carbobenzoxy, le soufre étant benzylé.
Comme l'hydro- génolyse ne peut pas s'appliquer aux compos, és
S-benzylés, on était astreint, en dernier lieu, à 1ibérer la fonction mercaptan du glutathion soit par action du sodium dans l'ammoniaque liquide, soit par action de l'indure de phosphonium, deux méthodes difficilement applicables dans l'industrie.
Dans le brevet suisse N 338197 la titulaire a décrit la préparation des N-trityl-aminoacides et leur utilisation pour la préparation de N-peptides par la méthode aux anhydrides mixtes, Il a été montré ultérieurement dans le brevet suisse No 343407, que les N-trityl-aminoacides permettaient un accès aisé aux N-trityl-peptides en les faisant réagir sur 1'ester d'un aminoacide en présence de dicyclohexylcarbo- diimide, agent de condensation préconisé en synthèse peptidique par Sheehan et Hess (J. Am.
Chem. Soc., 1955, 77, 1066) pour d'autres dérivés d'aminoacides, 1'ester du peptide N-trityle ainsi obtenu étant ensuite saponifié puis détritylté par l'acide acétique aqueux chaud.
Finalement, il a éé préconisé dans le brevet suisse No 348161 l'emploi de l'ester a-benzylique de l'acide N-trityl-glutamique pour accéder aux Y-glut- amyl-peptides par oondensation en présence de dicychlohexylcarbodiimide avec un ester bezylique d'un aminoacide. On libòre ensuite les fonctions acides du Lrglutamyl-peptide-N-trityle par hydrogénolyse et détrityle par l'acide acétique aqueux chaud.
Le L-glutathion est préparé par synthèse selon le procédé de la pr6sente invention au départ de la L-cystéine de formule I, la première étape consiste à trityler la L-cystéine, par exemple par réaction du chlorure de trityle sur la L-cystéine dans un mélange d'eau et d'un solvant approprié comme l'alcool ou 1'6ther an pr6sence d'une base organique telle que la diéthylamine qui a été utilisée par Zervas (IVe Congres International de Chimie pure et appli queue)
pour la tritylation d'a-aminoacides non sou- frets. On eviteaini la préparation préalable de l'ester de la L-cystéine avant tritylation et sa saponifica tion ultérieure. On peut séparer la N, S-ditrityl cyseine de formule 11 sous forme de son sel de diéthylamine grâce à l'imolubilité de ce sel dans l'éther et l'alcool. Au cours de la réaction, il se forme simultanément un peu de S-trityl-L-cysteine de formule III, qu'il est facile de séparer en mettant à profit son insolubilité dans l'éther.
La N, S-ditrityl-L-cysteine obtenue à partir de son sel de diéthylami, ne est condensée avec un ester de cette glycine, par exemple le glycinate d'éthyle ou de méthyle, en présence d'un carbodiimide disubstitué tel que le dicyclohexylcarbodiimide, le diisopropylcarbodiimide ou le méthyl-terbutylcarbo- diimide. L'ester de la N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycine de formule IV ainsi obtenu est détritylé sur l'atome d'azote, par exemple au moyen d'acide chlorhydrique en solution hydroacétonique à température ambiante.
On fait ensuite réagir lacide N-trityl-L-glutamique de formule VI, avec 1'ester de S-trityl-L-cysteinyl- glycine en présence d'un carbodiimide disubstitué pour obtenir 1'ester du N, S-ditrityl-L-glutathion de formule VII.
On saponifie ensuite 1'ester du tripeptide avec formation du N, S-ditrityl glutathion, puis on détrityle celui-ci, en général d'abord sur l'atome d'azote, par exemple au moyen d'acide acétique aqueux chaud, on aboutit au S-trityl-L-glutathion de formule VIII, lequel est à son tour détritylé sur l'atome de soufre, par exemple par traitement avec une solution chloroformique d'acide chlorhydrique gazeux. On obtint ainsi le chlorhydrate de L-glutathion d'où on libère le L-glutathion de formule IX.
Les réactions susmentionnées peuvent etre illustrées par les équations suivantes :
EMI2.1
<tb> <SEP> HS-CH2-CH-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> 2
<tb> <SEP> I
<tb> C6H5 <SEP> CoH5
<tb> C6Hs/C-S-CH2-ICH-COOH <SEP> + <SEP> CoH7C-S-CH2-ICH-COOH
<tb> CsHs/I <SEP> CeHs <SEP> CsHs/NH
<tb> <SEP> C6H5
<tb> <SEP> C6Hs
<tb> <SEP> (III)
<tb> <SEP> (II)
<tb> <SEP> H2N-CH2-COOR
<tb> <SEP> en <SEP> présence <SEP> de <SEP> dicyclohexylcarbodiimide
<tb> C6Hs\,
<tb> CeHs-C-S-CH2-CH-CONH-CH2-COOR
<tb> C6H5 <SEP> C6H, <SEP> 5
<tb> <SEP> NH-CC6Hs
<tb> <SEP> Cr, <SEP> H5
<tb> <SEP> (IV)
<tb> CsHs\
<tb> C6Hs <SEP> jC-S-CH2-CH-CO-NH-CH2-COOR
<tb> C6H5 <SEP> NH2
<tb> <SEP> HOOC-CH2-CH2-CH-COOH
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> /CcHs
<tb> <SEP> /NH <SEP> C/C <SEP> H
<tb> <SEP> C6H.
<SEP> 5
<tb> <SEP> /C6H5
<tb> CsHs
<tb> C6Hs\C-S-CH2-CH-CONH-CH2-COOR
<tb> <SEP> I
<tb> CEHs/NH
<tb> <SEP> CL
<tb> <SEP> UR2
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> C6H5 <SEP> CH2
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> C6HsC <SEP> ¯NH¯ <SEP> CH
<tb> /I <SEP> (VII)
<tb> <SEP> CcHs/, <SEP> ICOOH
<tb>
EMI3.1
Le nouveau procédé excelle donc par une grande simplicité car il n'utilise qu'un minimum de stades et un seul et unique réactif de blocage du soufre et de l'azote. Ses particularités marquantes sont la détritylation séective à l'azote par l'action de l'acide acétique aqueux à chaud ou de l'acide chlorhydrique en solution hydroacétonique à froid,
et la détrityla- tion du S-trityl-L-glutathion au soufre par l'acide chlorhydrique gazeux en chloroforme, réactions faciles à réaliser à l'échelle industrielle et ne provoquant auoune racémisation. En outre, il utilise la conden saut, ion de l'acide N-trityl-L-glutamique avec les esters de la S-trityl-L-cysteinyl-glycine.
Dans les exemples suivants, les points de fusion sont des points de fusion inskantanée déterminés sur bloc de Maquenne. Les formules des composés figurent sur le schéma annexé à la fin de la description.
Le mode opératoire décrit peut être évidemment employé au départ des aminoacides racémiques ou des énantiomorphes. De même, il est possible de détrityler le N, S-ditrityl-L-glutathion simultanement à l'azote et au soufre. On peut notamment changer de solvant, utiliser un autre ester de la S-trityl-Lr cystéinyl-glycine que celui mentionné, ou employer, comme agent de condensation, un autre carbodiimide disubstitué que ceux mentionnés.
Exemple
Préparation de la N, S-ditrityl-L-cysteine
de formule 11
Dans une solution, refroidie à 0 C, de 25 g de chlorhydrate de cystéine, de formule I [α]D20 = +5,5 (c = 1 /o, acide chlorhydrique N) dans 480 cm3 d'eau, on introduit, sous courant d'azote et agitation m6canique, 480 cm3 d'6ther et 80 cm3 de diethyl- amine et refroidit à - 5 C. Sans interrompre l'agita- tion, on introduit rapidement 120 g de chlorure de trityle et poursuit l'agitation pendant trois heures.
Le mélange réactionnel devient une masse pâteuse assez difficile à agiter. On ajoute alors 150 à 200 cm3 de chloroforme, décante la phase aqueuse qui ne renferme que du chlorhydrate de diéthylamine et le chlorhydrate de cystéine qui n'a pas réagi. La
S-trityl-cystéine estérifiée par le chlorure de trityle ainsi que la N, S-ditrityl-L-cystéine sous forme de sel de diéthylamine et d'ester tritylique, passent dans la couche organique qu'on lave à nouveau avec 300 cm3 d'eau, sèche la solution chloroformique éthérée sur sulfate de soude et concentre, après filtration, à petit volume.
On ajoute alors 100 cm3 d'alcool contenant 1 cm3 de diéthylamine et distille le solvant jusqu'à ce qu'il ait entraîné tout le chloroforme. Le sel de diéthylamine de la N,-S-ditrityl-cysteine de formule
II cristallise. On complète la cristallisation plar addi- tion progressive de 100 cm3 d'éther, glace, essore et sèche.
On obtint ainsi 55 g de sel pur se présentant sous forme d'aiguilles [a] D20 = + 71 # 1 (c = 2 /o, chloroforme), solubles en chloroforme, très peu solu bles en alcool, insolubles dans 1'eau et l'éther. Les réactions à la ninhydrine et au nitroprussiate de sodium sont négatives.
Analyse : C45H46O2N2S = 678,91
Calculé : C 76,61 % H 6,83 % N 4,13 % S 4,72 % Trouvé : C79, 4 /o H6, 9 O/o N 4, 0'O/o S 4, 7 /o
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
A partir des eaux mères de cristallisation on obtient un deuxième jet de produit portant le rendement global à 70 g environ. En reprenant ce sel par l'eau acidulée, on le décompose avec mise en liberté de la N, S-ditrityl-L-cystéine de formule II, qui peut être facilement extraite par l'éther dans lequel elle est assez soluble. L'évaporation de l'éther fournit le produit brut à l'état amorphe.
Le résidu provenant de la concentration de la solution mère éthéro- alcoolique du sel de diéthylamine de la N, S-ditrityl L-cystéine et renfermant les esters trityliques de la S-trityl-L-cystéine et de la N, S-ditrityl-L-cysteine est traité dix minutes au reflux par l'acide acétique aqueux à 50 % en solution éthérée. Il fournit un mélange de N, S-ditri, tyl-L-cystéine et de S-trityl-Lcystéine qu'on peut séparaer grâce à l'insolubilité de cette defnière dans l'éther. La S-trityl-L-cystéine est purifiée par recristallisation en alcool.
Elle se pré- sente alors en aiguilles, F = 202-205 C, [α]D20 ¯-I-19 1 (c = 2%, soude N/10), solubles dans les alcalis dilués aqueux, peu solubles dans l'alcool et les acides dilués aqueux, insolubles dans l'éther et l'eau. Elle donne une réaction positive à la ninhydrine et une réaction négative au nitroplussiate de sodium.
Analyse C22H21O2NS = 363,47
Calculé : C 72,69 % H 5,825 N 3,85% S 8,82%
Trouvé : C 72, 8 % H 6,0 % N 3,6 % S 8, 4 0/o
Condensation de la N,S-ditrityl-L-cystéine, II,
avec le glycinate d'éthyle
On dissout 13, 6 g (0, 02mol.) de sel de diéthyl- amine de la N, S-ditrityl-L-cystéine dans 50 cm3 de chloroforme et agite avec 20 cm3 d'acide chlorhydri que normal pour libérer l'acide qui passe dans le chloroforme.
Après décantation, on sèche la couche chloroformique sur sulfate de soude, filtre, distille à sec sous vide et reprend par 20 cm3 de chlorure de méthylène. On verse dans cette solution, en agitant, 2, 5 g de glycinate d'éthyle dissous dans 10 cm3 de chlorure de méthylène et 5 g de dicyclohexylcarbodiimide, abandonne une nuit, ajoute 1 cm3 d'acide acétique pour détruire le d'icyclohexylcarbodiimide en excès, filtre le précipité de dicyclohexylurée formé et lave ce précipité au chlorure de méthylène.
Après avoir réuni le filtrat et le liquide de lavage dans, une ampoule à décanter, on lave à l'acide chlorhydrique normal pour éliminer le glycinate d'éthyle qui n'a pas réagi, puis a 1'eau, a 1'ammaniaqwe et à l'eau. Le chlorure de méthylène est séché sur sulfate de sodium, filtré et évaporé à sec. On obtient ainsi environ 16 g de N, S-ditrityl-L-cysteinyl-glycinate d'éthyle de formule IV (R = CHS) sous forme de produit brut pulvérulent, suffisamment pur pour la suite des opérations.
Détrtylation à l'azote
du N, S-ditrityl-L-cystéinyl-glycinate d'éthyle
de f ormule I V
16 g du derive de formule IV est repris par 40 cm3 d'acétone. On ajoute 10 cm3 d'acide chlorhydrique 5 N et agite à la température ambiante. La solution se clarifie d'abord avec un léger échauffe- ment puis se trouble par suite de la cristallisation du triphénylcarbinol.
Après avoir abandonné un quart d'heure, on ajoute au filtrat 10 cm3 d'eau et distille une partie de l'acétone, on dilue par 50 cm3 d'eau et extrait le chlorhydrate da S-trityl-L-cysteinyl-gly- cinate d'éthyle au chloroforme à deux reprises. Les extraits chloroformiques réunis sont séchés sur sulfate de soude et évapor6s à sec après filtration. Le résidu est repris par 100 cm3 d'éther et 50 cm3 d'éther de pétrole, le composé de formule V (r = C2H5) précipite à l'état pulvérulent.
Après essorage et lavage à l'éther, il est seche. Il est suffisamment pur pour la condensation avec l'acide
N-trityl-glutamique. Le rendement est de 8, 4 g de chlorhydrate de S-trityl-cysteinyl-glycinate d'ethyle de formule V brut (soit 86, 0/o par rapport à la N, S ditrityl-Lrcysteine de départ).
Par saponification de ce produit par deux minutes de chauffage au bain-marie dans 10 volumes de potasse hydroalcoolique normale suivie d'une acidification, filtration et recristallisation en alcool aqueux, on obtient l'hydrate de S-trityl-L-cysteinyl- glycine sous forme de feuillets incolores, F = 1200 C environ (avec déshydratation), [α]D20 = + 17,5 # 1 (c = 2 /o, soude N/10 en mathanol a 90 /o) (pro- duit anhydre).
Le produit se déshydrate à 80 C. Il est soluble dans le chloroforme et les alcalis dilués aqueux, peu soluble dans les acides dilués aqueux et l'alcool, insoluble dans l'éther. Il ne donne pas de réaction avec le nitroprussiate de soude.
Analyse : C24H24N2O3S = 420,52
Calculé : C 68,54 % H 5,75 % N 6,66 % S 7,62 %
Trouvé : C 68,3 % H 5, 8 O/o N 6, 4 % S 7, 2 %
Ce composé est nouveau.
Préparation de l'acide N-trityl-L-glutamique
Cet acide est obtenu par hydrogénolyse sélective du N-trityl-glutamate de dibenzyle. 57 g de N-tritylglutamate de dibP < nzyle, decrit dans le brevet suisse No 344714, sont dissous dans 500 cm3 d'acétate d'éthyle.
On introduit du noir palladié (préparé par hydrogénation d'un mélange de 15 g de noir végétal et 5 cm3 de chlorure palladeux à 20 /o dans 200 cm3 d'eau) et ajoute 27 cm3 de triéthylamine pour salifier l'acide N-trityl-glutamique au fur et à mesure de sa libération par hydrogénolyse et éviter ainsi la détritylation. On hydrogène jusqu'à fixation de la quantité théorique d'hydrogène, ce qui demande environ quarante-cinq minutes, essore le catalyseur, le lave à l'acétate d'éthyle,
réunit le liquide de lavage au filtrat précédent et concentre à 100 cinq environ.
Après refroidissement, il y a prise en masse. On ajoute 100 cm3 d'ether, essore, lave à l'éther et sèche à 800 C. Il y a départ partiel de triéthylamine et lon obtient finalement 32 g de sel acide de triéthyl- amine de l'acide N-trityl-glutamique. Une récupéra- tien à partir des eaux mères porte le rendement global a 81' /o (40 g). Le sel acide se recristallise dans l'acétae d'éthyle.
Il sc pr6sente sous forme d'aiguilles, F = 100 C (pâteux), [α]D20 = -32 # 2 (c = 2 /0, chloroforme), solubles dans l'eau, le chloroforme et l'alcool, insolubles dans l'éther.
Analyse : C30H38O4N2 = 490, 63
Calculé : C 73, 44 O/o H 7, 81 /o N 5, 71 /o
Trouvé ; C 73,2 % H 7, 9 % N 5, 5 /o
Ce composé est nouveau.
Par reprise au chloroforme et décomposition par la quan, tité calculée d'acide chlorhydrique, il donne l'acide N-trityl-glutamique de formule VI & l'état amorphe [a] D =-f-27, 5 2 (c = 2 O/o, m6thanol).
Le même acide peut être obtenu par tritylation directe de l'acide L-glutamique en présence de diethylamine dans. des conditions similaires à celles décrites pour la tritylation de la cystéine ou encore, par saponification du N-trityl-glutamate de-mono- méthyle ou éthyle. Ce produit donne des sels bien oristallisés avec la diéthylamine et le L (+)-thréo-l- p-nitrophényl-2-aminopropanc-1, 3-diol.
Condensation de l'acide N-trityl-glutamique
avec le S-trityl-L-cystéinyl-glycinate d'éthyle
et saponification
18 g de chlorhydrate de S-trityl-L-cysteinyl-gly- cinate d'éthyle sont dissous dans 50 cm3 de chlorure de méthylène. On lave la solution avec de l'ammoniaque mormal en léger excès pour déplacer la base, puis à l'eau, sèche sur sulfate de sodium, filtre et ajoute 9, 5 g de dicyclohexylcarbodiimide puis 19, 6 g de sel acide de triéthylamine de l'acide N-trityl-glutamique décrit ci-dessus.
Après une nuit, on ajoute 2 cm2 d'acide acétique pour détruire le dicyclohexyl carbodiimide en excès et filtre la dicyclohexylurée formée après un quart d'heure d'abandon. Après essorage et lavage au chlorure de méthylène de la dicyclohexylurée, on réunit les chlorures de méthy- lène, on les lave à l'acide chlorhydrique N/2, puis à l'eau, sèche sur sulfate de soude, filtre et évapore à sec.
On obtient ainsi l'ester éthylique du N, S-ditri- tyl-L-glutathion brut de formule VII, que l'on reprend par l'alcool dont on distille une partie pour chasser le chlorure de méthylène. On chauffe au bain-marie et ajoute petit à petit 80 cm3 de soude normale. La saponification est terminée en dix minou- tes. On dilue par 200 cm3 d'eau, refroidit à la tem- pérature ambiante et acidifie par 81 cm3 d'acide chlorhydrique N et extrait au chloroforme.
L'extrait chloroformique est lavé à l'eau, séché sur sulfate de soude et évaporé à sec sous vide après filtration. On obtient ainsi un résidu amorphe constitué par le
N, S-ditrityl-L-glutathion.
Détritylation à l'azote du N, S-ditrityl-L-glutathion
Le résidu obtenu est repris par 60 cm3 d'acide acétique aqueux à 50 /o et chauffé cinq minutes au bain-marie. Le triphénylcarbinol précipite. On dilue par 500 cm3 d'eau environ et extrait au chloroforme.
L'extrait chloroformique est lave a 1'Eau, seche sur sulfate de soude, filtré, passé au noir puis concentre à faible volume. On précipite le S-trityl-L-glutathion brut de formule VIII par addition d'alcool absolu, essore et lave à l'alcool puis à l'éther. Après séchage, on obtient 16 g (soit un rendement de 70 ouzo par rapport aux deux constituants de départ) de S-trityl
L-glutathion brut VIII sous forme de produit pulvé- rulent blanc.
Détritylaton du S-trityl-L-glcctathion
5 g de dérivé de formule VIII sont dissous dans 50 cm3 de chloroforme anhydre. On fait passer de l'acide chlorhydrique gazeux anhydre pendant quelques minutes. La solution se trouble et le chlorhydrate brut du L-glutathion de formule IX, précipite.
On ajoute 50 cm3 d'6ther anhydre, agite, essore le chlorhydrate hygroscopique, lave à l'éther sur filtre, le dissout dans 10 cm3 d'eau distillée et ajoute à cette solution, petit à petit, de l' Amberlite IR4B de façon à ajuster le PEI à 2. On filtre la resine echan- geuse d'ions, lave à l'eau et concentre le filtrat réuni aux eaux de lavage sous vide et sous azote, presque à sec, la température du bain-marie étant de 40 C.
Le résidu est repris par l'alcool à 75 n/o. Apres abandon en exsiccateur, le L-glutathion cristallise. On 1'essore, lave à l'alcool et sèche. Le produit est identique sous tous les rapports au L-glutathion naturel.