CA2397560A1

CA2397560A1 - Utilisation de derives de paullones pour la fabrication de medicaments

Info

Publication number: CA2397560A1
Application number: CA002397560A
Authority: CA
Inventors: Laurent Meijer; Conrad Kunick
Original assignee: Individual
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2000-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2001-08-23
Also published as: US20030181439A1; WO2001060374A1; FR2804959B1; JP2003522793A; AU2001235691A1; EP1255551A1; US7232814B2; FR2804959A1

Abstract

L'invention vise l'utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteur s de la GSK-3.beta. de dérivés de paullones. Application pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3.beta. et CDK5.

Description

WO 01/60374 CA 02397560 2002-07-12 pCT~R01/00455 û~ilisa~ion de déri-rés de paullc~es pou= la ~a:nrica~ion de médicaments.
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2 varie durant 1e cycle cellulaire. La liaison à des in:nibiteurs de CDKs entraîne une désactivation des CDKs.
Des dérivés de aaullone substitués sur dlfferenteS DCSl~~OilS, et en DartlC;iller en pOS~tlOn 9, Se J Sont réveléS, CCmme rapporté dans 1'artlCle Cl-deSSUS, forteme~:~. i nhibiteurs de CDK1 /-c_rcl ine 3. ainsi, 1 a 9 -vitro-7,12-dihydroindolo[3,2-d] [1]-benzazépin-6 (SH)-ove, appelée alster~aullone, présente une IC~~ de 0,035 ~M et une activité anti-tumorale ir_ vitro d'~,~n ordre de grandeur IO supéri eur à 1 (1og IGS~ moyenr_e du point du milieu du graphe - -ô,4M).
Ces propriétés inhibitrices de CDKs, qui entraînent ur_ arrêt du cycle ce11u1aire, confèrent à ces dérivés de Daullones un intérêt pour 1e traitement de p pathologies liées à la perte du contrôle de 1a prolifération comme les cancers, le psoriasis, les maladies cardio-vasculaires, les maladies infectieuses, 1a néphrologie, les maladies neurodégénératives et les infections virales.
?0 De manière- surprenante, les inventeurs ont à
présent mis en évidence que certains de ces dérivés de paullones exerçaient un effet inhibiteur sur une autre cible enzymatique, constituée par la glycogène synthase kinase-3(3 ou GSK-3~3 en abrégé, ainsi que 1e cas échéant sur 25 les CDKs, et notamment la CDKS/p25.
La GSK-3~i est un élément essentiel de la voie de signaux r~'T. Elle est imoliquëe dans de multiples processus physiologiques: régulation du cycle cellulaire par contrôle de taux de cvcline D1 et de (3-caténine, formation dorso-ventrale durant le dévelooDement, action de l'insuline sur

3 la synthèse de glycogène, excroissance a_~conale, neurotoxicité de ~-ïIV-1 à médiation pa= Tat, et autres.
De Dlus , or: sai ~ que 1 a GS K- 3 3 et la CDKS sor_ responsables oou~Y une 'tonne Dart de 1'~_-,,~er~hos~hor'ylation anormal e de 1a protéi ne tau 1 ia_:t les mi crotubul es comme observé dar_s les filaments appariés en hélice dans 1a maladie d'Alzheimer et au ges "taupathies"
neurodégénératives.
On mesure ëgalement l'intérêt de pouvoir disposer de dérivés inhibiteurs de l'activité de GSK-3~3 pour favoriser ïa division cellulaire.
Or, les seuls inhibiteurs de la GSK-3~3 divulgués à ce jour sont constitués par le lithium et certains dérivés de purine.
1S La sélectivité du lithium n'a pas été rapportée, mais étant donnê 1a nature atomique du produit, il est vraisemblable qu'elle doit être très faible. De plus, 1e lithium n'agit qu'à des doses considérables (ICso autour de 10 cnul ) .
Il en est de même avec les dérivés de r~..,~.r..ne décrits dans la demande WO 98/16528, qui sont peu sélectifs et dont les ICSO sont autour de 10 ~M.
L'invention apporte une solution à ces problèmes avec l'utilisation, pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3~ et le cas échéant de CDKs, de paullones de grande efficacitë, présentant, vis-à-vis de GSK-3~3, des ICSo inférieures à 10 ~CM, et même pour un bon i i W ri ~t v0~?'e à 1 ~.l,i~t.
nombre -d entre elles n_..._ _eures à S ~c .;
Certains de ces composés présentent même des ICS
inférieures à SO n:'~t et atteignant pour certains des valeurs in_érie;:res à ~ 0 r:~~?.

4 PCT/FRO1/00455 ,.
Con_or:aémer_t. à i iZVer~=ïon, pour la fabrication deSdltS meClCa.~.le_:tS a ~LLet '_r!1~.1~1L°u_ _W.~Tu'?lellt Ce on utili se des dérivés de oa~~lîone réocnda_~t à l a zor,nul e générale -, 5 ~'S
~'X
~, (1) dans laauellea - ~ représente un groupe C = O, C-S-C=~, C-S,-C-N'riOH;
- Z représente C ou N ;
- Y représente, avec le cycle ad~acer_t, u-~ résidu phényle ZO ou thiazolyle ;
le ou les cycles constituant ces dérivés étant 1e cas êchéant substitués par un ou plusieurs . atomes d'halogène, groupes hydro:cy, alkylènehydroxy, alCyn.eal kyl ènehydro:cy, alcynehydroxycyclohexyle, alkyle, alko:~y, alkylènealkoxy, 25 alkylènecyano, le groupe alkylène étar_t saturé ou insaturé, ces radicau.~c étant à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à
C18 , ladite chaîne êtan t le cas échéan t substit~~ée par un ou plusi eurs groupes hydro_ty ou amino ; ~~r_ cu p1 usieurs groupes trifluorométhyle , -COM ;
30 -COOM , ou -Ci:,COOM (avec M représentant ur_ atome d'hydrogèr:~, u n groupe al:~~~~;e en C1 à ~~ e, à chaîne droite ou ralmiriée, substituée le cas échêant Dar ;Ln ou plusieurs groupes ;~:icro:~y et/ou amiro) ; nitroso; vitro ; ou cyano , _ _ _ nr~ ~ ~ e d'.~_- ~-ogane ou un groupe - R re..~~se..te u:. a~.om y~_ al kyie en C_ à C5, j - R reDL't~.se:__°_ L:n a~.otT~e C' _'~rO~èn°, Ou u groupe ~.-CO~- (C~:,),, et les sels de ces dérivés Dhysioïogi~~e~~:e~:t acceptables.
,~A r lie réréré~ ~~ re ré A avec le bans L_.., a.T~1 D ~, _ D_ Se nt_, CYCle ad~aCe:lt, un rèSl.dl_ DhenVle, et 2 =C. Cette ia~'Cl~lle répond à la zormule générale (II) .
~s r~ _X
y (iI) u s~
~~,JJ ~;J
n n Clans laQL'e1 1 e p - X, R et R sont tels que dérinis ci-dessus, et - R- à R~, R' à R' , identicrues ou di ftérents, représentent un atome d'hydrogène, d'halogène (°, Cl, I) , un groupe hydroxy, alkylènehydroxy, 2j alcynealkylènehydroxy, alcynehydroxycyclohexyle, alkyle, alkoxy, alkylèneal koxy, al kyl ènecyano, ces radicaurt étant à
chaîne droi te ou ramiLiée, en C1 à C18, 1 e groupe alkylè_le étant saturé ou insaturé, ladite c:-~aîne étant le cas échéan t subs t i tuée Dar un ou plus i eur s g r pupes hydr o:<;~ ou 30 ami vo , un groupe tri ~lucrométhyle; un groupe -COM; -COOM;
Ou -C::,~Wi~'f, (a'"'eC ~'t iep~~Se:-taW. l~-: 3tC~':e d' ~-~"~rOg~n,~ L;,~

groupe alkyle ~n C1 à Ci8, à chaîne àroite ou ramifiée, sui~stituée le cas échéa~-~t par un ou plusieurs groupes hydroay et/ou a:~;ino) ; un groupe ni~rosc; ~~n groupe n~ tro ;
Ou un QrOUDe C'IanO ;
i e. leS Sel S 'JL1yS101 Ogî.Ç"~:e:,~en~ aCCept3bl eS Ce CeS
àérivês.
Dan s une autre fa.;ii 11e arriérée, Y représente, aVeC ~ e CTIC l e ad~3Ce:'lt, un reSldu tnlaZOly! e et z - C.
Cette famille répor_d à l a °o~ri"ule général e (I I I) p R;
N ~,, S
(IIT_) l5 , W
,..
~rr ' ..
dans laauelle les substituants Drésentent les .0 significations donr_ées ci-àessuS en raDDOrt avec la formule (II) .
Dans encore ur_e autre famille, Y forme avec le cycle adjacent un groupe phényle et Z - N. Cette famille répond à la formule (IV) .
R' v '~r (IJ) i ,5 R G ~=~ ~
'\
3 0 \ ~, \ 9 n V

dans laquelle les substituants présentent les significations données en rapport avec la formule (II).
Un groupe de dérivés de paullones préférés dans ces différentes familles correspond au cas où X représente C = 0.
Dans un autre groupe X représente C-S-CH3 ou C-S.
Dans encore un autre groupe X représente -C-NHOH.
De maniêre générale, les dérivés de l'invention présentent avantageusement une ICSO vis-à-vis de GSK-3(3 infêrieure à 10 ~.M et pour bon nombre d' entre eux à 1 uM, des ICSO inférieures à 100 nM et même à 10 nM pouvant être obtenues.
Des paullones particulièrement préférées de ces groupes appartiennent aux familles de formule (II) ou de formule (III) avec R9 choisi parmi -NO~, -CN, -Cl, -Br, -CF3, alkyle en Ç1 â C5, en particulier mêthyle, ou un atome.
d' hydrogène, RZ_ et/ou R3 choisis parmi alkoxy (en C1 à C3 pour le radical alkyle) et notamment méthoxy, alkylènecyano, vinylalkoxy, ou propylène, les autres substituants étant de l'hydrogène.
L'invention vise en particulier l'utili;-~ütion pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3(3, de CDKl et de CDKS, de dérivés de paullone de formule (II) dans laquelle X - CO, R9 est choisi parmi -N02, -CN, -Br, -Cl, -CF3, H, et R2 et/ou R' représentent H, alkoxy en C1-C5, notamment méthoxv, alkylènecyano, notamment mêthylènecyano, les autres substituants étant de l'hydrogène.
L'invention vise tout spécialement l'utilisation de paullones de formule (II) dans laquelle X =CO, R~ représente -NOZ, -CN, -Br, -C1 ou -CF~, les autres substituants rerrésentant de l'hydrogène.
L'invention vise er_core tout spécialement 1'utilisatior_ de oaullores de formule (II) dans laauelle X=CO, R9 représente les significations ci-dessus et R- et R
représentent tous deu~t ur_ groupe alkoxy en C._ à C5, notamment méthoxy, ou R" représente un groupe alkylènecyar_o, notamment éthylènecyano.
L'invention vise égaiement en particulier l'utilisation pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3~i, de paullones de formule générale (II) dar_s laquelle X - SCH3 et R9 est tel que défini ci-dessus et représente en particulier un atome d'halogène, nota.Tnment de brome.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on utilise pour 1a fabrication de mêdicaments inhibiteurs de GSK-3~3, CDK1 et CDKS, avec une sélectivité
plus grande vis-â-vis de GSK-3~ et de CDK1, des dérivës de paullones 'de formule (III) dans laquelle R9 est tel crue ZO dêfini ci-dessus dans ses significations prêférées, les autres substituants représentant un atome d'hydrogène.
On notera que la 9-cyano-2,3-diméthoxypaullone est un produit nouveau et à ce titre entre dans le champ de l'invention.
_5 L'invention permet donc de disposer de médicaments ayant la sélectivité requise pour une application donnée.
30 Les médicaments fabriqués conformémer_t à
l'invention en utilisant ces ~~ér;vés de paullones sont tout spécialement appropriés pour le traitemer:t des pathologies dans lesouelles la GSK-3Q est imnli~:ée.
1 en ; n e ~- e _ en ; ~ ; o, ,-est aires_ otamm n~. àocr__.o_ogi_ pa exempt e, dans l es diabètes, où les _n~ibiteurs de GS_:-3l3 sont utilisabl es comme insu.~iro-,~,imëticues . On rappell e ~~e 1' insul ine agit par ur_e cascade d' è-rènements biochi:nicr~aes conduisais t à une inhibition de ';a GSK-3~ et crue cette inhibition est responsable de la r?ponse des cellules à
l'insuline.
De même, ces médicaments présentent un grand intérêt pour le traitement de maladies neurodégénératives, comme la maladie d'Alzheimer. L'hyperphosphorylation de la protéine tau provoquée par CDKS et GSK-3(3 peut être en effet inhibée par les dérivés de paullones. En administrant les médicaments fabriqués selon l'ïnvention, il est alors possible, grâce à leur effet inhibiteur à la fois de CDK5 et de GSK-3(3, d'empêcher 1'hyperphosphorylation de la protéine tau chez les malades d'Alzheimer et de lutter contre la neurodégénérescence et l'ischémie.
20 Ces médicaments trouvent également une application de grand intérêt pour le traitement de maladies maniaco-dépressives.
On citera en outre leur utilisation pour le traitement de cancers où leur effet inhibiteur à la fois de 25 GSK-3~3 et de CDK1/2/5, qui se traduit par 1'apoptose de 1a cellule tumorale, est avantageusement mis à protêt.
Ces mêdicaments s'avèrent également efficaces pour 1e traitement de maladies pro~rcqaées Dar des parasites unicellulaires comme la malaria, les tr~rpanosomes, les 30 leishmar_ias, 1 es to:<oolasmes, 1 es one~.~.-nocystis et autres, ou par des parasires Dlurice~~ula~res, comme les champignons et les vers. Les génomes de ces parasites contiennent en effet des gènes GSK3 homologues, mais différentes de GSK-3 humain.
Ils sont également utilisables dans la sphère

5 cardio-vasculaire pour traiter ou prévenir notamment, l'athérosclérose, la resténose ou l'angicgénèse, en modifiant l'équilibre entre la prolifération et l'apoptose, et en contrôlant les taux de (3-caténine.
On les utilisera également avec avantage pour le 10 traitement des maladies infectieuses, comme par exemple le SIDA.
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules l~ pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi.
Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments $ont préparés sous forme de gélules, comprimés,.
dragées, capsules, pilules, gouttes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.
Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables. Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à SO mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 10!J yM en dérivé de paullone dans le sang du patient traité.
A titre d'indicatif, la posologie utilisable chez l'homme correspond aux doses suivantes . ainsi on administre par exemple au patient en une ou plusieurs prises à 50 mg/jour pour le traitement de tumeurs ou de parasitoses.
Afin d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée, on rapporte dans les exemples qui suivent 5 d'autres caractéristiques et avantages.
Dans ces exemples, il serait fait référence aux figures 1 à 6, qui représentent respectivement, - les figures 1A et 1B, l'activité inhibitrice vis à-vis de CDKs, CDKl/CDK2, et de GSK-3 de 1'alsterpaullone 10 (fig. 1A) et de 1a kenpaullone (fig. 1Bj en fonction de la concentration de ces paullones, - la figure 2, les formules de paullones selon l'invention, - les figures 3A à 3C, les IC-, , de paullones selon l~ l'invention vis-à-vis de l'une des protéines kinases GSK3, CDKl/cycline B, CDKS/p25 en fonction de leurs IC~~; vis-à-vis des 2 autres protéines kinases, - la figure 4, les courbes montrant l'inhibition de GSK-3(3 par l'alsterpaullone pour compétition avec l'ATP, - 1a figure 5, l'effet inhibiteur de l'alsterpaullone de la phophorylation de tau par GSK-3~3 ir vitro et in vivo, et - la figure 6, 1 ' inhibition de la phosphory'..a'~.ion de DARPP-32 par CDK5 sur Thr75 in vivo par l'alsterpaullone.
~ Caractérisation des paullones Les analyses élémentaires ont été effectuées à
l'aide d'un appareil d'analy.se élémentaire de CHN Perkin Elmer 2400. Les spectres de RNN-H ont été enregistrés à 400 MHz, de RI~INwC à 100 MHz sur un appareil Bruker P~~IX 400, avec comme référence interne du tétraméthylsilane.
Les synthèses des composés du tableau 2 or.t été
réalisées selon les méthodes décrites dans J. of Medicinal Chemistry indiqué plus haut. La synthèse des 2-iodopaullone, 2-bromo-9-:_itropaullone, 2,3 diméthox_y-9-nitropaullone, 9-cyano-2,3, diméthoxy paullone, 7-bromo-5-(4-nitrophénylhydrazc no) -4, 5-dihydro-1-H-[1]benzazépin-2 (3H) -one, 7,8-diméthoxy-5--(4-uitrophénylhydrazono)-4,5-dihydro-1H-[1]benzazépin-2(3H)-one, est décrite dans les exemples 1 à 6.
TamDOns Les tamDOns utilisés ont les comDOSitions suivantes:
Tampon d'homogénéisation: - 60 m~~t de ~-glycérophosphate, 15 mlyl de p-n;trCphényl phOSph3te, 25 :;lit Ce MORS (pH 7, 2) , 15 mI~!
d'EGTA, 15 mM de MgCl,, ï ruM de DTT, 1 mM vanadate de sodium, 1 :nM àe NaF, 1 :nM de DhénirlDhosphate, 10 ~g de leupeptine/ml, 10 ~Cg d'aprotinine/ml, 10 ~:g d'inhibiteur de trypsine de soja/ml et 100 ~M de ber~zamiàine.
Tampon A . 10 cru~I de MgCI , , 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 2 S mM
IO de Tris-Hcl pH 7,5, 50 ~Cg d'héparine/ml .
Tampon C . tamDOn d'homogénéisation, mais renfermant 5 mM
d'EGTA, et dëpourvu de NaF et d'inhibiteurs de protéase.
Tris-tdmlJOn salin de Tween-20 (T3ST) . 50 mM de Tris pH
7, 4, 150 r~~i de NaCl, 0, 1°s de Tween-20~.
I5 TamDOn de lyse hYpotonic~ue (HLB) . 50 mM de Tris-HC1 ph 7,4, 120 m.~'~I de NaCl, 10-°s de glycérol, 1~ de Nonidet-P40, 5 mM de DTT, 1 mM d'EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM d'orthovanadate, uM de microcystine, 100 ~Cg/m1 de chacun des produits suivants . leuDeptine, aprotinine, pepstatine.
20 . Préparations de kinases et déterminations des Les activités des kinases ont été déterminées dans le tampon A ou C (à moins d'indications contraires), à 30°C, à
une concentrati on finale en ATP de 15 :cM. Les valeurs des 25 essais à blanc ont été soustraites et les activités calculées en Dmoles de ohosDhate ir_cor~oré pour une ~nCllDatlO~ Ce â i :;l'_.~.. LeS '~'~ 1 eu=S .~.eS aCt'_'~ ~CeS SCP

généralement exprimées en ~ de 1'acti-~ité maximale, c'est-à-dire, en l'absence d'inhibiteurs.
é ;-, ~ é-~ réalisés à l'aide de Des essais t~mo_._s o..t '...
dilutions appropriées de Me,SO. Dans c~~elques cas, comme indiqué ci-après, la p~:osphorylation des substrats est déterminée par autoradiographie après SDS-?AGE.
La GSK-3~3 utilisée est soit l ' e nzyme purifiée à
partir du muscle de lapin ou exprimée et purifiée à pari=
de cellules d'insecte Sf9 (Hughes et a1, 1992, Eur. J.
Biochem. , 203 . 305, 311) . Les àéte_-ninations ont été
effectuées avec une dilution à 1/100 cia:-~s 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, avec 5 ~Cl de GS-1 40 ~CM comme substrat, dans le tdITlpOn A, en présence de 15 ~.M y!'~P~ ATP (3000 Ci/moles , 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 ~C1. Après 30 minutes d' incubati on à 30°C, des aliquotes de 25 u1 de surnageant ont été appliqués sur des bardes de papier d.A
phosphocellulose Whatman P81, de 2,S x 3 cm, et 20 secondes plus tard, les filtres ont été lavés 5 fois (pendant a»
moins 5 mir_. à chaque fois) , dar:s une solution de 10 m1 ZO d'acide phosphorique/i d'eau. Les filtres humides ont fait l'objet de comptage en présence de 1 ml de fluide de scintillation ACS (Amersham).
La CDK1/cycline B utilisée a été extraite à
l'aide d'un tampon d'homogénéisation à partir d'ovocytes d'étoiles de mer (~~farthaste~ias glaciales) et purifiée par cesèsv chromatog~aphie d'affinité sur ciel billes de p9 -Sépharose à partir desquelles le produit a été élué par du c~csr_S
p9 libre, comme décrit par Meijer et al., 1997, (Methods in Enzymoloay, vol 283 . 113-128), et Borgne e~
;0 al., X999, J. Biol. Chem. 274 . 11977-11985.

L'activité '.kinase a été déterminée dar_s le tampon C, aVeC ~ mg d' hlStOne rl/ml , en Drésence de 1S ~M de (,~ P]
ATP ((3000 Ci/mmol ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 ~c 1 .
Après 10 minutes d'ir_cubatio~? à 30°C, des aliquotes de 25 ~C1 de surnageant ont été déposés sur des paplerS de p~lOSDflOCellulOse Pôl et tralteS COmme deCr'_t C1-dessus.
La CDKS/p35 a été reconstituée en mélangeant des 0 quantités égales de CDKS et de p35 de ma_~unifère recombinantes, exprimées dans E.coli sous forme de protéine de fusion GST (Glutathione-S-transfërase) et purifiées par chromatographie. d'affinité sur glutathione-agarose.
L'activité enzymatique du complexe a été déterminée dans le 15 tampon C comme décrit pour CDK1/cycline H.
PhosDhorylation de tau 'r_ vitro et in vivo La DhosDhorvlation de tau in vitro a été
effectuée en utilisant de la GSK-3(3 purifiée et 1a protéine tau-32 humaine recombinar_te en tant que substrat. Après 30 20 minutes d'incubation en présence de différentes concentrations d'alsterpaullone, dans les conditions d'étude de la GSK-3~ décrite ci-dessus, 1a réaction de la kinase a été arrêtêe par addition de ta.~npon Laemmli. La protéine tau a été résolue en SDS-PAGE à 10~ et son taux de 25 phosp horylation visualisé par autoradiographie.
Cellules et virus . on a cultivé les cellules Sf9 (InVitrogen, San Diego, C_~) à 27°C dans un milieu de Grace de culture en monocouche (Gibco BRL, Gaithersburg, ~), suDDlêmenté avec 10~ de sérum bovin foetal et 50 ~g de 'il m ~ i ma ~ 1 v '7 ~ ~,lg d' amDhOter iC'_ne/ITlI . ~aCUI OGOId a ,: genta..,v c___~.i m_ t -. , _ été obtenu auprès de Phar:~tingen (San Di ego, C~) , et pVL1 392 de Invitrogen.
La transfecticn de tau . cn = excisë, à partir - ., d'un vecteur d'expression bactéri e: oNG2 (Biernat et a1 5 1993,Neuron 11 . 153-163! et le gène codant pour htau23, l'isoforme tau humain le plus court, avec Kbal et BamHI. Le gène a été inséré dans le vecteur de transfert de baculovirus DVL1392 découpé avec les mêmes er_donucléases.
Le système BaculoGold a été utilisé pour la construction du t0 vecteur contenant le baculovirus tau. L'ADN de BaculoGold est un type modifié de baculovirus contenant une délétion léthale.
La co-transfection de l'ADN de BaculoGold avec un vecteur de transfert de baculovirus complément permet de t5 récur~érer la délétion léthale de cet ADN viral et de reconstituer des particules de virus -.niables portant 1a séquence codant pour htau23.
L' ADN plasmidic~~:e utilisé pour les transfections a été purifié en util i saut des cartouches de QTnI~fE'1 (Hilden, Allemagne).
Les cellules Sf9 cultivées en monocouches (2x105 cellules dans un récipient de culture ce11u1 aire de 60 mm) ont été co-transfectées avec de l'ADN de baculovirus (0,5 ~.g d' ADN de BaculoGold) et avec les dér ivés de pVLl3 92 ( 2 ~5 ~.g) en utilisant la méthode de co-précipitation au phosphate de calcium. La présence de protëine recombinante a été examinée dans les cellules infectées 5 jours après l'infection par SDS-PAGE et western bloc.

Traitement de cellules S~9 avec des ir_hibiteurs de kinases Pour déterminer ïes e~=ets des inhibiteurs de â-rTtlP_ODt:rVala_'!01 et l' a~ Sue=Oallil On e sur 1 3 phospho~fl ation de tau, les cellu l es S=9 infectées par 1e baculovirus exprimant htau23 ont été traitées 36 heures après 1' _infection, (lorscrue les cellules or_t dêjà e.~primé
des nivea',~~c de tau suffisants ocu= 1e développement des processus cellulaires) avec 20 ~C~f d'inhibiteurs pendant 3 l0 heures avant d'.étre recueillies.
Western blot de tau Les cellules Sf9 ont été infectées avec ur_ m rus recombinant à une MOI de 1 à 5.
Les lysats cellulaires ont été préparés dans le t~ tampon de lyse hypotonicTUe (HLB) .
Après 1S minutes dé cent; i rugation à 16000 g, 1e surnageant a ëté récupéré et sa concentration en NaC1 augmentée juscru'à S00 mM. Le surnageant a été ensuite soumis à ébullition pendant 10 min. et recentrifugé à 16000 0 g pendant 15 min. Les protéines (3 ug) ont été résolues par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de PVDF et étudiées avec un rAestern blot avec les anticorps suivants . AT-8 (1:
2000), AT-180 (1:1000), AT-100 (1:500), PHF-1 (1:ô00) et l'anticorps polyclonal anti-tau K9JA. L'immunocoloration a 25 ëté visualisée en utilisant un système de chimioluminescence ECL (Amersham, Braunschweig, Allemagne).

. ïnhibition in situ de CD~S dans le strlatum OW Drepdre des COL:peS St_r'_atal 1 eS de Ce?~VeaL de souri s adulte selon ia mét podologie starcard. En sui vaut à e ' ~ar'~o nata àe :~rebs o:c~rgéné
J 1 eC.T11111Dr° CanS un tampon b:_.u_..
avec une aération continue (95°sO~/S~CO,), on traite ies coupes avec di~iérentes concentrations d'alste_-paullor_e, ou avec îO~Cm de roscovitine Dec_dar_t SO min . , ou on ïes laisse dans le ta_mDOn de bi carbor_ate de ~rebs pendant 1a même durée. Les coupes homogér_éisées par sonication dans 1~ de SDS à ébul linon et 50.~u~t de Na~ . Cn déternine les concentrations en protéines par la méthode BG~ en utilisant une courbe standard de BSA. Des cruantités égales de protéines (80 ~.g) sont soumises à une SDS-PAGE en utilisant un gel à 1S~ d'acrylamide, tra~!s~ëré par electrophorèse sur une membrar_e de nitrocellulose et sou:-nis à un immunoblot avec LLP_ a=!tlCOrDS ~de Di'10SD}''_Oryl at'_O_~_ SDeCIîIG,u° Qu?
deteCte sélectivement DA_RPP-32 phosphorylé sur Thr7S.
$xemple 1 2-Iodo-7,12-dihydro-indolo [3,2-d] [1]
benzazépine-6 (Sri) -one- (2-iodopaullone) H O
N
/ ~i H
2~ W /
Une bouilli e de phénylhvdrazi ne (152 L~:g, 1, 5 mmol) et de 7-iodo-1H- [1 ] benzazépine-2, S (3~, 4~:) -àione (30I mg 1 mmol) eSt SOUIVISe dans de l'acide acétifie glacial agitation pendant 1 h a 70°C. Or! aboute de l'acide Sul turîQLe COnCentre (~, ~ a'-=~1 °~ O~ COili..ln'_:e 1 'agltatl0i 1 h à 70°C. Après refroidissement à 1a température ambiante, l e mélange est versé dan s ur_e solution acnseuse d'acétate de sodiu_m à e~. Le précipité est éliminé Dar fil tratio::, lavé avec de ~ eau et cri szali~.sé à partir j d'than0l. O_~_ obt-ent 5?~ e cris'au~c beige, P~ 303~

(dec. ) ; i ~ (ter) 1-'_0 (C=O); -:i-R:~fi'i . 3270 (~i~) , (DMSO-400 ~Iz) . ~ (ppm) - 3, 52 (s, , ) , 7, 04-7, 10 d5 ; 2~ C~, (3, tri) , , 19 ( 7, 6 Hz, 1ri) , 43 8, ~', 1 ~) , 7, ~~t~~ 7, (, 2 66-7,59 (m, 2ri), 8,07 (, 1,5 riz, 1ri), 10,1 (s, 7_ri, lac'ame , 11, 66 (s, tri, indol e N'N) C_;:__IN~O (374, 18) ; Calc.
NH ;
) C 51,4, ri 3,0, N 7,5 ; trouv C 51,0, ri 3,3, N
7,2.

$xemple 2 . 2-Bromo-7,12-dihydro-9-vitro-indolo [3,2-d] [1]
benzazépine-6(SH)-ove (2-bromo-9-nitropaullone) 1~
c a,-z0 La 7-Bromo-S- (4-nitrophénylhydrazono) -4, S-dihydro-1~- [I]
benzazépine-2 (3H) -ove (389 mg, 1 mmol ) est mise à reflux dans du diphényl-éther (20 mL) pendant 2 h sous azote.
25 Après refroidissement à température amiante, on ajoute de 1'hexane (50 mL). Le précipité est filtré, lavé avec de 1'hexane et cristallisé à partir d'ét:nanol/toluène. Or.
~35~) ~~' °C ; ir obtient des cristau:c jaune fond , , _r > 330 (KBr) . 3310 (Vri) , 1670 (C=O) ; -..-~'''t~'1 (Dr~t50-d~, 400 ~''--'~') .
30 d (ppm) - 3, 69 (s, tri, CHI) , 7, 23 (d, 1H, 8, 6 Hz) , 7, 59-7, 6-_'_ (m, tri) , 7 , 95 (d, ï.-:, ?, 0 ~:z) , 8, 0(dd, 1::, 9, 1%2, 0 ?) , 8, 77 (d, î H, 1, S Hz) , 14, 32 (s, 1 H, lacta:T~e N'ri) , 12, 46 (s, 1H, insole N'H) ; C,ôH.~BrN;O~ (372, ï9) ; Cal c. C S1, 6, H 2, 7, N 11,2 , Br 21,5 ; trouvé C 51,5, __ 3,0, N 10,8, Hr 21,3.
Bxemnle 3 . 2,3-Diméthoxy-7,12-dihvdro-9-vitro-indolo[3,2-d] [1] benzazé~ine-6 (5E) -ove (2, 3-diméthoxv-9-nitronaullone) H~CO
H~CO
NO.
1~
La 7, 8-Dimétho:cy-S- ( 4-r.itrop~-!enylhdyrazor;o) -4, S-dilhydro-ï
N_- [1] benzazépinè-2 (3H) -or_e (370 mg, 1 .mol ) est mi se à
2 h sous refl u:c daïls du diphényl-éther (20 mL ) pendant azote. Après refroidissement à température a:-abiante, on ajoute de 1 'hexane (50 mL) . Le précipité est fil tré, lavê
avec de l'hexar_e et crsitallisê à partir d'éthar_ol/toluëne.
On obtient des cristaux jaune foncé (63~), PF > 330°C , ir (Kbr) . 3340 (iv~-i) , 1660 (C=O) ; iH-RMN (DMSO-d5, 400 MF-iz) .
8 (ppm) - 3, 58 (s, 2H, CHZ) , 3, 81 (s, 3H, OCH~) , 3, 88 (s, ZS 3H, OCH3) , 6, 90 (s, 1H) , 7, 31 (s, 1H) , 7, 31 (s, 1H) , 7, S9 (d, 1H, 9,2 Hz), 8,CS (dd,lH, 8,9/2,3 Hz), 8,69 (d, 1H, 2,0 Hz) , 9, 94 (s, 1::, lacta_me i~'ri) , 1 2, 32 (s, î H, insole 1'r~) ;
Cl~H~sN30! (353, 35) ; C31C. C ô1, 2, H 4, 3, N 11, 9 ; t.rou-:é C
60, 9, H4, 4, N 11 , 8.
N O

gxemple 4 . 2,3-Dimérïhoxy-6-oxo-5,6,7,12-tetrahydro-indolo [3,2-d] [1]benzazÉ~pine-9-carbonitrile (9-cyano-2,3-diméthoxypaullone) ;;_C0 !_C0 J \j La 9-Bromo-2, 3-dimétho:w-7, 12-dihydro-i ndolo [3, 2-d] [1 ]
benzazéaine-6(5H)-one (387 mg, 1 mmol) et du cyanure de cuivre (I) (179 mg, 2 mmol) sont mis à rerlux pendant 2 h dans de la N-méthyl-2-pyrrolidone (10 mL). Après 1~ refroidissement à température ambiante, on ajoute de l'eau (10 m:~) et 1,e mélange réactionnel est soumis à agitation pendant 1 5 mir_. Le précipité est é1 imir_é par ~iltratior. et soumis à agitation pendant encore 15 min. dans un mélange d' eau ( 10 mL) et d' éthyl èn°_ diamin e (2 , 5 r~L) . Le Drécipité
est éliminé par Liltration, _lave avec une solution acrueuse à 10~ de cyanure et cristallisé à partir d'éthanol/toluène.
On obtient des cristaux incolores (405), PF > 330°C ; in (Kbr) . 3300/3200 (NH) , 2220 (CN) , 1660 (C=O) ; 1H-R.~''~
(DMSO-d6, 400 MHz) . b (ppm) - 3 , 53 (s, 2H, CHZ) , 3, 80 (s, 3H, OCH3) , 3, 87 (s, 3H, OCH~) , 6, 89 (s, 1H) , 7, 29 (s, 1H) , 7,49 (S, 1H), 7,49 (dd, 1H, 8,6/1,5 Hz), 7,58 (d, 1H, 8,2 Hz, ) , 8, 27 (s, 1H) , 9, 89 (s, 1H, lactame N:~) , 12, 10 (s, 1H, indole N:-I) ; C1~H_SN303 (333, 36) ; Calc. C 68, 5, H 4, S, N
12,, ô , trouvé C 68, 0, H 4, 6, N 12, 0.
C

Exemple 5 7-bromo-5-(4-nitrophénylhydrazono)-4,5-dihydro-1-H-[1]benzazepin-2(3H)-one On soumet à agitation, dans de l'acide acétique glacial (10 ml), pendant 1h à 70°C, de la 7-bromo-1H
[1]benzazépine-2, 5 (3H, 4H) dione (254 mg, Immole) , (Kunic~_ C.
(1991), Arch. Pharm. (Weinheim) 324, 579-581, du chlorhydrate de 4-nitrophénylhydrazine (284 mg, l,5mmole), et de l'acétate de sodium (123 mg, l, 5 mmole) .
Après refroidissement à température ambiante, le mélange est versé dans une solution aa_ueuse d'acétate de sodium 5' (20 ml). Le précipité est récupéré par filtration, lavé avec de l'eau, et cristallisé à partir d'éthanol. On obtient des cristaux jaunes, avec un rendement de 52~; PF
300°C (déca); IR (KBr)/3220 (NH), 1670 (C=0); RMN-rH
1~ (diméthylsulfoxyde-d,,, 400 MHz) - 8 (p.p.m.) - 2.56-2.59 and 3.02-3.06 (m, AA'XX', 4H, CH--CH=), 6.99 (d, 1H, 8.1 Hz), 7.33 (d, 2H, 9.2 Hz), 7.56 (dd, 1H, 8.7/2.5 Hz), 7.75 (d, 1H, 2.0 Hz), 8.16 (d, 2H, 9. 6 Hz) , 7.56 (dd,1H, 8.7/2.6 Hz) , 7.75 (d, 1H, 2.0 Hz) , r3.16 (d, 2H, 9.6 Hz), 9.87 (s, 1H, NH), 10.19 (s, 1H, NH) ;

C1"H-~ ;BrN~O~; ( 389.; Calcd. 49 . 4, H 3 . 4, N 14 . 4, Br 22 ) C 2 0 . 5 ;

Found C 49.1, H 3.4, N 14.1, Br 20.2.
Exemple 6-- . 7,8-diméthoxy-5-(4-nitrophénylhydrazono)-4,5-dihydro-1H-[1]benzazépin-2(3H)-one On soumet à agitation, dans de l'acide acétique glacial (i0 ml), pendant 1h à 70°C, de la 7,8 -diméthoxy-1H-[1]benzazépine-2,5(3h,4H)dione (235 mg, 1 mmole), (Schultz C.
et al, (1999) J.Med.Chem., 42, 2909-2919), du chlorhydrate de 4-nitrophénylhydrazine (569 mg, 3 mmoles), et de l'acétate de sodium (246mg, 3 mmoles) .
Après refroidissement à température ambiante, le mélange est versé dans une solution aqueuse d'acétate de sodium 5_ (20 ml). Le précipité est récupéré par filtration, lavé avec de l'eau, et cristallisé à partir d'éthanol. On obtient des cristaux jaunes, avec un rendement de 60~; P
286°C (àéc.); IR (KBr)/3260 /3180(NH), 1680 (C=0); RMN-'H
diméthylsulfoxyde-d;_, 400 MHz):
- 8 (p.p.m.) - 2.53-2.56 and 2.99-3.03 (m, AA'XX', 4H, CH_-CH_), 3.77 (s, 3H, OCH;), 3.81 (s, 3H, OCHs), 6.65 (s, 1H), 7.'20 (s, 1H), 7.32 (d, 2H, 9.2 Hz), 8.13 (d, 2H, 1~ 9.2 Hz) , 9.53 (s, 1H, NH) , 10.06 (s, 1H, NH) ; C,_~H,~,N;O--;
(370.38) ; calculated. C 58.4, H 4.9, N 15.1 ; found C 57.8, H 4.9, N 14.8.
Exemple 7 Etude de l'inhibition de GSK-3j3, de CDKS/p35 et de CDKl/cycline B par les paullones.
Alsterpaullone L'activité de l'alsterpaullone a été étudiée sur plusieurs kinases hautement purifiées.
Les activités kinases ont été déterminées ave un substrat approprié (GSK-3(3: GS1 peptide; CDKs . histone Hl) en présence de 15 ~I d'ATP et à des concentrations croissantes en alsterpaullone et kenpaullone.
L'activité est exprimée en pourcentage de l'activité maximale.

Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 1 et dans le tableau 1. Les valeurs de ICI,; ont été calculées à
partir des courbes dose/réponse et sont exprimées en ~.iM.

m~l-,l cn"
(<O.OI~M(~),0.01-O.I~M( ~),0.1-l~M( ),l-lOuM( ~)>10~M( Enzyme Alsterpaullone ICso (~.M) CDK1/cyclin B

CDK2lcyclin A

CDK2/cyclin E "~,~~r ., :...,.
.,. ., -.~, ,~
.
,~v ~ab... M ..
_ CDK4/cyclin D 1 > 10.000 CDKS/p35 GSK-3 a GSK-3 ~3 erk 1 22.000 erk2 4.500 c-raf -. - > 10.000 MAPKK > 100.000 c-jun N-terminal kinase> 10.000 protein kinase C a > 100.000 protein kinase C /31 > 100.000 protein kinase C (32 > 100.000 protein kinase C y > 100.000 p~otein kinase C b > 100.000 protein kinase C e > 100.000 protein kinase C r1 > 100.000 protein kinase C ~ > 100.000 cAMP-dependent protein7.000 kinase cGMP-dependent protein> 100.000 kinase casein kinase 1 > 100.000 casein kinase 2 > 100.000 insulin receptor tyrosine> 100.000 kinase On constate que la plupart des kinases testées sont faiblement ou pas du tout inhibées (ICso >10 ~.M) .
On notera qu'en plus de l'effet sur la CDK1/cycline B, l'alsterpaullone inhibe la CDK2/cycline A, la CDK2/cycline E, la CDKS/p25 et la GSK-3a/GSK-3(3 (ICSo respectivement de 15, 200, 40 et 4nM).

. Au ges paullones selon la Lormule I
Da s les cablea~r.,c 2A e~ 2J dor=_és ci-agrès e~ sui l a L figue 2 , o~ a rapDOrté l ' e L L e ' __.__ib i ceu~ de Paul l one s utll i SéeS SelO': 1 ~ l:!'Ian~i ~:~ sri S_~_<~_S Q°_ ~SK-3~, C~C~7/~2 5 et CDK1/cvcli~e B.

Yumro Composs GSK3 CDK1 CDfU

98 aLrternauilnne (9-Nicropaullone) 0.0(':1J 0.035 0.(''-tOn N'_15 98 9-cyanopaullonc O.OLO 0.024 0.() )V

98 '.3-dimerhoxy-9-nitropaullonc 0.013 0.021 0.021 N

98 9_cyano-2.3-dimcrhoxypaullonc 0.() I8 0.0~-t O.W

?
I
7r 96 ~eapauffnne (9-Bromopaullonc) 0.023 0.-t(~' 0.3j0' N
til9 97 9-chloropaullone 0.024 0.500' 0.800' N
3a3 97 9-critluoromethylpaullone 0.030 0..100 O.b(~
N

98 3-(6-oxo-9-tritluoromethyl-5.6.?.l?-tetrahydro-0.033 0.()4i 0.033' V
3j7 indu)o(2-3-dJ[l]bcnzazepin-?-yl)-prop~cnorile tBl 98 ?.3-:limcthoxy-9-tritluormathylpaullonc~3.0'j 0.?30' 0.30' N

98 9-bromo-l2-methyloxycarbonylmethylpaullone0.075 1.100'' 350.000' N
Oa8 97 9-tluotopaullonc 0.080 1.6(X) 1.300 :V

9 N 9-bromo-2.3-dimcrhoxypaullonc 0.100 0.200 1x00 97 9-bromo-?.3-dihydroxypaullone 0.1'0' 3.0(X) x.000'' N

g7 9-methylpaullonc O.I30' '.000 6.3(X) N

97 l(l-bromopaullone 0.1-=0 1.300 ? '1X7 N

97 2-bromopaullone 0.'00' 3.300 5.0(X) N

97 l l chloropaullone 0.200' 1.100 '.900 N
34.4 98 2-(3-hydroxy-I-propinyl)-9-tritluoromcthylpaullonc0.'00' 0.300' 2.0(X)'' N C) 98 2_bromo-9-nicropaullone 0.200' 0.053 0.1'0' V
3j4 98 ?-iodopaullone 0.?50' 3.700 7..100 N
?59 93 9-bromo-l2-(2-6ydroxycthyl)-paullone0.300' 3.000 110.000' N

98 9-txomo- l2-mechylpaullone 0.400' 6.200 400_000' N
?
t l 98 (E-3-(6-oxo-9-triHuoromethyl-5.6.7.12-tetrahydto-0.100' 0.270' 900'' N

indu)o(2-3-d][ljlxozazepin-?-yl~acrylonicrile (E) 97 9-bromo-5-(meehyloxycarbonylmethyl)paullonc0.500' 6.-11X) 5.30(Y' N

98 ll-mechylpaullone 0.500' 3.000' 9.000 N

97 paulfnne (A) 0.620' 7.000 10.100' N ' 93 II-ethylpaullone 0.700' 3.300 '-3.OOO
N ' 98 9-bromo-7,12-dihydro-6-(hydroxyamino)-indolo(2-3-.ij[f0.75Cf 1.000 '--1(Xl N ]bcnzaznpine ;F1 2l6 97 '.9-dibromupaullone 0.300' 0.300' 10.000' N

97 11-bromopaullone 0.900' 1.300 1.100 N

97 3.3-dimethoxypaullone 0-900' 1.300 ''=00 N ' -IW

98 (E7-3-(6-oxo-9-trifluoromcthyl-5.6.7.12-tetrahydto-0.900'' -1.300 130.000 N

indu)o[?-3-d](1]benzazepin-2-ylracrylic acid mechyl cirer (D) 97 9-bromo-7,12-dihydro-6-mcthylthio-indolo[.-3-d][l]bcnzazcpinc1.200 43.000' 450.0011 N )G) 6l0 g8 (~-2-(3-oxo-l-butenyl)-g-tritluoromethylpaullone1.400 0.320' 34.000' N tI-D
3j8 98 9-bromo-l2-ethylpaullone 1.500 23-(X~~ '60W
N
2l3 97 9-bromo-7.12-dihydro-indolo[2-3-d][1]benzazcpinc_6151~-thione2.000'' 2.300'' 8.000 N ()i 98 2-bromo-9-trifluoromethylpaullone 2.~ 0 ~'~ 3-~
N .
(117 98 2-[2-(1-hydroxycyclohexyl)~thinyl]-9-triEluotomethylpaullone2.000 3?00 8-300 N (P
3:19 97 9-bromo-5-mcthylpaullooe '--1~ 20W I30'~
N
6l3 97 9-rnethoxypaullonc 2.200' 0.900' '.100 N

98 2-iodo-9-tritluoromethylpaullonc '-200 0.700 7'000 N ' ?36 93 9-bromo- l2-(tert.-butyloxycarbonyl)-paullone? 300 70.000' 80().0()0 N
0.16 98 9-bromo-l2-(2-propenyli-Paullone -x.000 60.(XXJ' 240.000' N ' 97 9-bromo--t-hydroxypaullone 4.300 x.000' 850.000 N

98 8.10-dichlotopaullone 5.000 2.500 350.000' N ' ~'-9 93 5-benzyl-9-bromopaullone I0.0(Xl' 35.000' 370.(7(,0' N

97 9-bromo=i-methoxypaullone L6-000' ?50.000' 400-000' N

98 9-bromo-5-ethylpaullone 24-00(l' -170.000 300'(X.()' N ' 98 9-bromo-5,7-bi,-(tert.-butyloxycarbonyt)-paullone130.000' 80-(X)(1'f , > 1(%X
f ?09 97 ~methoxypaullone I:10.000'-130.000'10(H).000' N

98 9-bromo-5.6.7.12-tecrahydro-benzo(6-7]cyclohcpt(1,2_b]indolc180.000' 51.000' 360.0(X)' N (K) ' 98 2-phenyl-J-(2_thicnyll-5l~-PYrido(2_3_d][ljbenzazeoinc-6(71-thionc350.000' 33.000' 700.00(1 N !L) ' 98 9-bromo-5,7,12-tri-(rert.-butyloxycarbonyl)-paullonc500.000' 150.000' 1000.0()0 N

97 9-bromo-5.l2-bis-(ter(.-butylo.eycarbonyl)-paullone610.000' 1000.000'>
1000' N

I

98 1-(4-chlorophcnyl)-2-(2-naphthyl)-N

5ff-pyrido[?-3-Q][l]bcnzazcpine-6i7f~-thionc> 100()' > 1000' ~I) 98N3185.6.7.12-tctrahydro-benzo(6-7]cyclohcpt[1.2-~]indole;V)> 1000' 130.000' > f00(1 c o.c)I ,cet: ° n.ol-o.l w~t: ' o.)-1 w~t: ° 1-lo wa: ' 1o wH.

Dans -1e tableau 2B, on i nài crue égal eurent les IC50 pour GSK3 , CDK1 et CDKS pour d' autres dé=ivés de painlunes utilisés selon l'invention. Les signi_ications présentées j par leS substicuantS SOnt ~nàlQLeS, pOUr ChaQLe composé
lorsqu'iï ne s'agit pas d'un atome à'hydrogène.
Tableau 2B
Composs GSK3 I CDK1 CDKS

X = -SCH3 ; R9 - -Br 0,034 43,000 160,000 Y = rsidu thiazolyle; R9 - -Br 0,120 0,600 4,000 R2 - -CH = CH-CO-CH3 , R~ - -CF3 0, 350 I ~., 15, 000 I

R9 - R'' - -F 0, 400 3, 400 10, 000 ~ i Y = thiazolyle ; R3 - -C1 0,400 O,S00 5,000 Y = thiazolyle ; R9 - -CH3 1,300 ~ 4,000 40,000 I
RZ - R3 - -OH 2,200 32,000 42,000 RZ - -I ; R9 - -Br 4, 200 0, 320 30, 000 _ Z = pyridyle S,S00 i 2,200 3,300 i Pour comparer les effets des comDOSés actifs sur GSK-3~3 et les CDKs, on rwoporte sur les figures 3A à 3C les val eur s de ! CS,~ V1S-à-vi s de chaq;:e enzyme (CDK1/cycl i ne B, CDKS/p25 et GSK-3~) en fcnction des val eurs de ICS~ vis-à
vis des 2 autres kinases.
Cette analyse montre çue les efficacités des paullones vis-à-vis de CDK1 et CDKS sont très liées, et le sont beaucoup moins vis-à-vis de GSK-3~3 et des CDKs.
t0 gxemple 8 : $tude de l'inhibition par les paullones de GSK-3(3 par compétition avec l'ATP.
On rapporte sur 1a figure 4 les données cinétiques dei dêtermination de l'activité de GSK-3~i à
différentes concentrations en alste~aullor_e. Les activités t5 enzymatiques sont dé dites comme déterminê ci-dessus.
Figure 4A . courbe primaire 1/V versés 1/ATP. Les concentrations en ATP dar_s ce mélange réactionnel varient de 0,5 à ~-_ uM. La concentration en GS-1 est maintenue constante à 4 ~.M. Dans l'encadré, on a représenté les 20 pentes en fonction de la concentration à partir des courbes primaires. La constante d'inhibition apparente (Ki) est indiquée par une flèche.
Les e:cpériences de cir_étique démontrent crue l'alsterpaullone est également en compétition par rapport à
?5 1'ATP pour 1a liaison sur GSK-3~i.
La constante d'inhibition apparente (ki) est de 2 0 rit .

Exemple 9: Etude de l'inhibition par l'alsterpaullone de la phosphorylation de tau in vitro et in vivo par GSK-3(3.
L'effet inhibiteur de l'alsterpaullone sur l'activité de la GSK-3(3 a été déterminé sur une protéine tau liant ïes microtubules. La protéine tau humaine recombinante exprimée dans des bactéries peut être phosphorylée in vitro par GS:~-3(3 et cette phosphorylation est inhibée d'une manière dose-dépendante par l'alsterpaullone avec une IC:, voisine de 33nM.
On a rapporté sur la figure 5A les résultats de la résolution par SDS-PAGE, suivi d'une autoradiographie. Sur la figure 5B, on donne les résultats obtenus avec des celluîes Sf9 exprimant htau23 (témoin non traité), ou exposées à
l'alsterpaullone ou à l'aminopurvalanol pendant 3 h. Les lysats cellulaires (3 ~~g htau23) sont résolus par SDS-PAGE, colorés au bleu de Coomassie ou soumis à un immunoblot avec différents anticorps . K9JA (anticorps pantau) qui reconnaît tau indépendamment de 1a phosphorylation, AT100, qui reconnaît tau phosphorylée sur Thr212 et Ser214, cette réaction étant très spécifique de la protéine tau d'Alzheimer, PHF-1 (phosphorylé sur Ser396/Ser-404, AT8 (phosphorylé sur Ser202/Thr205), et AT10C (phosphorylé sur Thr231/Ser235).
Exemple 10 Etude de l'inhibition de la phosphorylation de DARPP-32 par CDKS in vivo.
Le rôle de la protéine D_~1RPP-32, en tant que substrat physiologique de CDKS/p25, a été récemment identifié
par Bibble J.A. et a1,(1999) Nature, 402, 669-671. Cette protéine devient un inhibiteur de PKA lorsqu'elle est phosphorylée sur Thr75 par CDKS/p25. In vivo, on n'observe pas de phosphorylation sur ce site dans les tissus p35-/-.

Pour déterminer la capacité inhibitrice de CDK5 dans le cerveau de l'alsterpaullone, on a traité des coupes de striatum (région du cerveau exprimant DARPP-32) avec différentes concentrations en alsterpaullone. Les coupes ont été incubées avec 0, l, 10 et 50 ~.tM d' alsterpaullone, pendant 60 mn. Le taux de phophorylation de DARPP-32 sur Thr75 a été
contrôlé par Western blot avec un anticorps phospho-spécifique et évalué par quantification des empreintes. Les résultats obtenus sont respectivement représentés sur les 10 figures 5A et 5B. On constate que l'alsterpaullone est capable d'inhiber 1a phosphorylaticn de DARPP-32 in situ.
Exemple 11 préparation d'une gélule en utilisant la 9-nitropaullone comme principe actif.

On mélange 20 mg de 9-nitropaullone avec les excipients classiquement utilisés pour la fabrication de gélules.

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation pour la fabrication de médicaments pour le traitement de pathologies impliquant l'inhibition de la GSK-3.beta. de dérivés de paullones répondant à la formule générale (I) :
dans laquelle - X représente un groupe C = O, C-S-CH3, C-S, -C-NHOH;
- Z représente C ou N;
- Y représente, avec le cycle adjacent, un résidu phényle ou thiazolyle;
le ou les cycles constituant ces dérivés étant le cas échéant substitués par un ou plusieurs : atomes d'halogène, groupes hydroxy, alkylènehydroxy, alcynealkylènehydroxy, alcynehydroxycyclohexyle, alkyle, alkoxy, alkylènealkoxy, alkylènecyano, le groupe alkylène étant saturé ou insaturé, ces radicaux étant à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, ladite chaîne étant le cas échéant substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy ou amino; un ou plusieurs groupes trifluorométhyle ; -COM ; -COOM ; ou -CH2COOM

(avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, à chaîne droite ou ramiriée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino);
nitroso; nitro ; ou cyano ;

- R5 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1 à C5, - R12 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -C-CO2-(CH3)3;

et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce crue les dérivés de paullone répondent à
1a formule (II) dans laquelle, - X, R5 et R12 sont tels que définis dans la revendication 1, et - R1 à R4, R7 à R11, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, d'halogène (F, C1, Br, I), un groupe hydroxy, alkylènehydroxy, alcynealkylènealkoxy, alcynehydroxycyclohexyle, alkyle, alkoxy, alkylènealkoxy, alkylènecyano, ces radicaux étant à
chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le groupe alkylène étant saturé ou insaturé, ladite chaîne étant le cas échéant substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy ou amino; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM;
ou CH2COOM, (avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas écheant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino); un groupe nitroso; un groupe nitro;
ou un groupe cyano;
et les sels physiologiquement acceptables de ces dérivés.

3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dérivés de paullone répondent à
la formule (III), dans laquelle les substituants présentent les significations données dans la revendication 2 en rapport avec la formule (II).

4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dérivés de paullone répondent à
la formule générale (IV):

dans laquelle les substituants présentent les significations données dans la revendication 2 en rapport avec la formule (II).

5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que X représente C = O.

6. Utilisation selon selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que X représente C-S-Ch3 ou C-S.

7. Utilisation selon selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que X représente -C-NHOH.

8. Utilisation selon la revendicaiotn 2 ou 3, caractérisée en ce que les dérivés de paullone répondent aux formules (II) ou (III), avec R9 choisi parmi -NO2 -CN,-Cl, -Br, -CF3, alkyle en C1 à C5, en particulier méthyle, ou un atome d'hydrogène, R2 et/ou R3 choisis parmi alkoxy (en C2 à C3 pour le radical alkyle) et notamment méthoxy, alkylènecyano, vinylalkoxy, ou propylène, les autres substituants étant de d'hydrogène.

9. Utilisation selon la revendication 8, pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3.beta., de CDK1 et de CDK5, de dérivés de paullones de formule (II), selon la revendication 2, dans laquelle X = CO, R9 est choisi parmi -NO2, -CN, - Br, -Cl, -CF3, H, et/ou R3 représentent H, alkoxy en C1-C5, notamment méthoxy, alkylènecyano, notamment méthylènecyano, les autres substituants étant de l'hydrogène.

10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que X =CO, R9 représente les -NO2, -CN, -Br, -Cl ou -CF3 les autres substituants représentant de l'hydrogène.

11. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que X=CO, R9 présente les significations ci-dessus et R2 et R3 représentent tous deux un groupe alcoxy en C1 à C5 notamment méthoxy, ou R2 représente un groupe alkylènecyano, notamment éthylènecyano.

12. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que R9 est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 11, et représente en particulier un atome d'halogène, notamment de brome.

13. Utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3.beta., de CDK1 et de CDK5, de la 9 -nitro-7,12-dihydroindolo[3, 2-d] [1]-benzazépin-6 (5H) -one.

14. Utilisation pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3.beta., de paullones de formule (II) selon la revendication 2, dans laquelle X - SCH3 et R9 est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 11, et représente en particulier un atome d'halogène, notamment de brome.

15. Utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3.beta., CDK1 et CDK5, avec une sélectivité plus grande vis-à-vis de GSK-3.beta. et de CDK1, des dérivés de paullones de formule (III) selon la revendication 3, dans laquelle R9 est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à
11, les autres substituants représentant un atome d'hydrogène.

16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie orale, sous forme de gélules, comprimés, dragées ou capsules.

17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.

18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3.beta. et CDK5.