WO2001060374A1 - Utilisation de derives de paullones pour la fabrication de medicaments - Google Patents

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WO2001060374A1
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Laurent Meijer
Conrad Kunick
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Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Their act. - e because d- * ru ⁇ ⁇ ⁇ ole ⁇ rreca "- e: because the link to cvclir.es rui varies during cell cycle Binding to CDK m ers causes CDK deactivation
  • GSK-3 ⁇ is an essential element of the NT signal pathway. It is involved in multiple physiological processes regulating the cell cycle by controlling Dl cvclme and ⁇ -catenm levels, dorsoventral formation during development, action of 1 insulin on glycogen synthesis, axonal outgrowth, neurotoxicity of KIV-1 mediated by Tat, and others.
  • GSK- ⁇ and CDK5 are responsible for a large part of the abnormal hyperphosphorylation of the tau protein binding microtubules as observed in the helically paired filaments in Alzheimer's disease and other "taupathies" neurodegenerative.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors disclosed to date are constituted by lithium and certain purine derivatives.
  • the selectivity of lithium has not been raoD-ortée, but given the atomic nature of the product, it is likely that it must be very low.
  • lithium only acts at considerable doses (IC 50 around
  • the invention provides a solution to these problems with the use, for the manufacture of drugs which inhibit GSK-3 ⁇ and, where appropriate, CDKs, of pauUones of high efficiency, exhibiting, with respect to GSK-3 ⁇ , IC 50 values lower than 10 ⁇ M, and even for a good number of them lower than 5 ⁇ M, or even 1 ⁇ . Some of these compounds even have IC 50 values of less than 50 rM and reaching values for some less than 10 r_M.
  • redundant paullone derivatives are used with the general formula (I):
  • - Z represents C or N
  • - Y represents, with the adjacent ring, a phenyl or thiazolyl residue; the ring or rings constituting these derivatives being optionally substituted by one or more: halogen atoms, hydroxy groups, alkylenehydroxy, alkynealkylenehydroxy, alkynehydroxycyclohexyl, alkyl, alkoxy, alkyleneealkoxy, alkylenecyano, the alkylene group being saturated or unsaturated, these radicals being straight or branched chain, from C1 to C18, said chain being optionally substituted by one or more hydroxy or amino groups; one or more trifluoromethyl groups, • -COiM -COOM; or -CKCOOM (with M representing a hydrogen atom, a C1 to C1 alkyl group, straight chain or branched, substituted where appropriate by one or more hydroxy groups and / or amir.o); nitroso; r.itro; or cyano, -
  • R D represents a hydrogen atom or a C L to C 5 alkyl group
  • R " represents a hydrogen atom, or a group -C-C0 2 - (CH 3 ) 3 , and the salts of these physiological derivatives are acceptable.
  • This family corresponds to the general formula (II):
  • R ⁇ to R 4 , R 7 to R 11 identical or different, represent a hydrogen atom, a halogen atom (F, CI, Br, I), a hydroxy group, alkylenehydroxy, alkynealkylenehydroxy, alkynehydroxycyclohexyl, alkyl, alkoxy , alkylenealkoxy, alkylenecyano, these radicals being with straight or branched chain, from C1 to C18, the alkylene group being saturated or unsaturated, said chain being optionally substituted by one or more hydroxy or amino groups; a tri luoromethyl group; a -COM group; -COOM; or -CH.COCM, (with M representing a hydrogen atom, a C1 to C13 alkyl group, straight or branched chain, optionally substituted by one or more hydroxy groups and / or a ino); a nitrcsc group; a nitro group; or a cyano group; and the physiological radicals
  • X represents CS-CH 3 or CS.
  • the derivatives of the invention advantageously have an IC 50 with respect to GSK-3 ⁇ of less than 10 ⁇ M and for a good number of them at 1 ⁇ M, IC 50 of less than 100 nM and even at 10 nM can be obtained.
  • Particularly preferred pauUones of these groups belong to the families of formula (II) or of formula (III) with R 9 chosen from -N0 2 , -CN, -C1, -Br, -CF 3 , C1 to C5 alkyl, in particular methyl, or a hydrogen atom, R. and / or R chosen from alkoxy (C 1 to C 3 for the alkyl radical) and in particular methoxy, alkylenecyano, vinylalkoxy, or propylene, the other substituents being hydrogen.
  • 9-cyano-2,3-dimethoxypaullone is a new product and as such falls within the scope of the invention.
  • the invention therefore makes it possible to have medicaments having the selectivity required for a given application.
  • these drugs are of great interest for the treatment of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease.
  • the hyperphosphorylation of the tau protein caused by CDK5 and GSK-3 ⁇ can indeed be inhibited by the derivatives of pauUones.
  • These drugs also find an application of great interest for the treatment of manic-depressive illnesses.
  • cardiovascular sphere can also be used in the cardiovascular sphere to treat or prevent in particular, atherosclerosis, restenosis or angiogenesis, by modifying the balance between proliferation and apoptosis, and by controlling ⁇ -catenm levels.
  • the active ingredients used in therapeutically effective amounts, are mixed with the pharmaceutically acceptable vehicles for the chosen mode of administration.
  • the drugs are prepared in the form of capsules, tablets, dragees, capsules, pills, drops and the like. Such drugs may contain from 1 to 100 mg of active ingredient per unit.
  • the drugs come in the form of sterile or sterilizable solutions. They can also be suspensions or emulsions.
  • the doses per unit of intake can vary from 1 to 50 mg of active ingredient.
  • the daily dosage is chosen so as to obtain a final concentration of at most 100 ⁇ M of paullone derivative in the blood of the treated patient.
  • the dosage used in humans corresponds to the following doses: thus, for example, the patient is administered in one or more doses 10 to 50 mg / day for the treatment of tumors or parasitoses.
  • FIGS. 1 to 6, which respectively represent
  • FIG. 1A the inhibitory activity vis-à-vis CDKs, CDK1 / CDK2, and GSK-3 alsterpaullone (fig. 1A) and kenpaullone (fig. 1B) concentration of these pauUones
  • FIG. 2 the pauUones formulas according to the invention
  • FIGS. 3A to 3C the ICs of pauUones according to the invention with respect to one of the kmase protein GSK3,
  • CDK1 / cyclin B CDK5 / p25 according to their IC 5 vis-à-vis the other 2 kmase proteins
  • Elemental analyzes were performed using an elemental analysis device from CHN Perkin-
  • the buffers used have the following compositions: Homogenization buffer: - 60 mM of ⁇ -glycerophosphate, 15 miM of p-nitrcphenylphosphate, 25 M of Moos (pK 7.2), 15 mM of TAGTA, 15 mM of MgCl 2 , 1 mM DTT, 1 mM sodium vanadate, 1 mM NaF, 1 mM phenylpho ⁇ phate, 10 ⁇ g leupeptin / ml, 10 ⁇ g aprotinin / ml, 10 ⁇ g soybean trypsin inhibitor / ml and 100 ⁇ M of ber.zamidine.
  • Buffer A 10 mM MgCl 2 , 1 mM ⁇ GTA, 1 mM DTT, 25 mM Tris-HCl pH, 5, 50 ⁇ g heparin / ml.
  • Buffer C homogenization buffer, but containing 5 mM of EGTA, and devoid of NaF and protease inhibitors.
  • microcystin 5 ⁇ M of microcystin, 100 ⁇ g / ml of each of the following products: leupeptin, aprotinin, pepstatin. .
  • Kinase preparations and activity determinations 5 ⁇ M of microcystin, 100 ⁇ g / ml of each of the following products: leupeptin, aprotinin, pepstatin. .
  • the kinase activities were determined in buffer A or C (unless otherwise indicated), at 30 ° C, at a final ATP concentration of 15 ⁇ .
  • the values of the blank tests were subtracted and the activities calculated in o oles of phosphate incorporated for a 10 min incubation.
  • the values of the activities are generally expressed as% of maximum activity, that is, in the absence of inhibitors.
  • the GSK-3 ⁇ used is either the enzyme purified from rabbit muscle or expressed and purified from Sf9 insect cells (Hughes et al, 1992, Eur. J. Biochem., 203: 305,311). The determinations were carried out with a 1/100 dilution in 1 mg of BSA / ml of
  • the CDKl / cyclin B used was extracted using a homogenization buffer from oocytes from starfish (Marthasterias glacialis) and purified by
  • the kinase activity was determined in buffer C, with 1 mg of histone Kl / ml, in the presence of 15 ⁇ M of [ ⁇ " P] ATP ((3000 Ci / mmol; 1 mCi / ml) in a final volume 30 ⁇ l After 10 minutes of incubation at 30 ° C., 25 ⁇ l aliquots of supernatant were deposited on phosohocellulose P81 papers and treated as described above.
  • CDK5 / p35 was reconstituted by mixing equal amounts of CDKS and recombinant mammalian p35, expressed in ⁇ . coli in the form of GST fusion protein (Glutathione-S-transferase) and purified by affinity chromatography on glutathione-agarose. The enzymatic activity of the complex was determined in buffer C as described for CDK1 / cyclin 3.
  • Phosphorylation of tau in vi tro was performed using purified GSK-3 ⁇ and the recombinant human tau-32 protein as a substrate. After 30 minutes of incubation in the presence of different concentrations of alsterpaullone, under the study conditions for GSK-3 ⁇ described above, the kinase reaction was stopped by adding Laemmli buffer. The tau protein was resolved in SDS-PAG ⁇ at 10% and its phosphorylation rate visualized by autoradiography.
  • Tau transfection we excised, from a bacterial expression vector pNG2 (3iernat et al., 1993, Neuron 11: 153-163) and the gene coding for htau23,
  • the shortest human tau isoform with Xbal and BamHI.
  • the gene was inserted into the baculovirus transfer vector pVL1392 cut with the same endonucleases.
  • BaculoGold system was used for the construction of the vector containing the baculovirus tau.
  • BaculoGold DNA is a modified type of baculovirus containing a lethal deletion.
  • Co-transfection of the BaculoGold DN with a complement baculovirus transfer vector makes it possible to recover the lethal deletion of this viral DNA and to reconstitute viable virus particles carrying the sequence coding for htau23.
  • the plasmid DNA used for the transfections was purified using CIAGEN cartridges (Hilden, Germany).
  • Sf9 cells cultured in monolayers (2x10 cells in a 60 mm cell culture vessel) were co-transfected with baculovirus DNA (0.5 ⁇ g of BaculoGold DNA) and with derivatives of pVL1392 (2 ⁇ g) using the calcium phosphate co-precipitation method.
  • the presence of recombinant protein was examined in the infected cells 5 days after infection with SDS-PAG ⁇ and Western blot.
  • Treatment of Sf9 cells with kinase inhibitors Treatment of Sf9 cells with kinase inhibitors
  • Sf9 cells infected with baculovirus expressing htau23 were treated 36 hours after infection, (when the cells have already expressed levels of tau sufficient for the development of cellular processes) with 20 ⁇ M of inhibitors for 3 hours before being collected.
  • Sf9 cells were infected with a recombinant virus at an MOI of 1 to 5.
  • HLB hypotonic lysis buffer
  • Equal amounts of protein (80 ⁇ g) are subjected to an SDS-PAG ⁇ using a 15% acrylamide gel, transferred by electrophoresis to a nitrocellulose membrane and subjected to an immunoblot with a specific phosphorylation antibody which selectively detects DARPP -32 phosphorylated on Thr75.
  • Example 1 2 - Iodo-7, 12 -dihydro- indolo [3,2-] [1] be ⁇ z zépine- 6 (5ff) -one (2 -iodopaullone)
  • Example 6 7, 8-d methoxy-5- (4-n ⁇ trophenylhydrazono) -, 5- dihydro-1H- [1] benzazepm-2 (3H) -one Stirring is carried out in glacial acetic acid (10 ml), during lh at 70 ° C, 7,8 -di etnoxy-1H- [1] benzazepine-2, 5 (3h, 4H) dione (235 mg, 1 mole), (Schultz C. et al, (1999) J. Med.Chem., 42, 2909-2919), hydrochloride 4-nitrophenylhydrazine (569 mg, 3 mmol), and sodium acetate (246 mg, 3 mmol).
  • Example 7 Study of the inhibition of GSK-3 ⁇ , CDK5 / p35 and CDKl / cyclin B by pauUones. . alsterpaullone
  • alsterpaullone has been studied on several highly purified kinases.
  • GSK-3 ⁇ GS1 peptide
  • CDKs histone H1
  • Activity is expressed as a percentage of maximum activity. The results obtained are given in FIG. 1 and in Table 1. The values of IC 5 ⁇ were calculated from the dose / response curves and are expressed in ⁇ M.
  • FIGS. 3A to 3C To compare the effects of the active compounds on GSK-3 ⁇ and the CDKs, we report in FIGS. 3A to 3C the values of IC S0 with respect to each enzyme (CDKl / cyclin B, CDK5 / p25 and GSK-3 ⁇ ) as a function of the IC 50 values vis-à-vis the other 2 kinases.
  • Example 8 Study of the inhibition by GSK-3 ⁇ paullones by competition with ATP.
  • FIG. 4A The kinetic data for, determination of the activity of GSK-3 ⁇ at different concentrations of alsterpaullone are reported in FIG. 4. The enzymatic activities are described as determined above.
  • Figure 4A primary curve l / V poured l / ATP. The ATP concentrations in this reaction mixture vary from 0.5 to 4 ⁇ M. The GS-1 concentration is kept constant at 4 ⁇ . The box shows the slopes as a function of concentration from the primary curves. The apparent inhibition constant (Ki) is indicated by an arrow.
  • the inhibitory effect of alsterpaullone on the activity of GSK-3 ⁇ was determined on a tau protein binding microtubules.
  • the reco binante human tau protein expressed in bacteria can be phosphorylated in vitro by GSK-3 ⁇ and this phospnorylation is inhibited in a dose-dependent manner by alsterpaullone with an ICM close to 33nM.
  • the phophorylation rate of DARPP-32 on Thr75 was monitored by Western blot with a phosphospecific antibody and evaluated by quantification of the fingerprints. The results obtained are respectively represented in FIGS. 5A and 5B. It is found that 1 alsterpaullone is capable of inhibiting the phospnorylation of D7ARPP-32 m if you.
  • Example 11 preparation of a capsule using 9-n tropaullone as active ingredient.

Abstract

L'invention vise l'utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3β de dérivés de paullones. Application pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3β et CDK5.

Description

utilisation de dérivés de paullon.es pour
: anri ca tα.oπ. de médicaments .
" C VS— 2- '. en cbé r2.DS " icue de dérivés cis oaul! les cauilor.es ccr.3:ι: sr.: , ~< ~ ' i =*-.π^ ' aux ber.zazépircres .
Le chef de aooe : paulione, répo d à la formule suiva:
Figure imgf000002_0001
Dans Journal of Médicinal C e istry, 1999 , vol 42, n°15, cages 2509-2919, les auteurs, dont l'un est co- inventeur de la crésence demande, rapportent les propriétés in ibitrices de inases cyciines dépendantes (CDKs en- abrégé) présentées par des pauUones, et leur activité anti-cumorale in vitro.
Les CDKS jαuer.z un rôle majeur nota.-rjr.ent dans _a régulation du cycle cellulaire, contrôlant trans ssion entre les succes-= i / e≥ du cycle cellulaire. Leur act. - e car d-* ru^ ~ ^ole≤ rreca" - e: car la liaison aux cvclir.es rui varie durant le cycle cellulaire La liaison à des m io teurs de CDKs entraîne une désactivation des CDKs
Des dérivés de paulione substitués sur différences positions, et en particulier en position S se sont révélés, comme rapporté dans l'article ci-dessus, fortement inhibiteurs de CDKl/-cyclιne 3 Ainsi, la 9 - nitro- 7 , 12 -dinydromdolo [3 , 2 -d] [1] -oenzazépm- 6 (5H)-one, appelée alsterpaullone , présente une IC50 de 0,035 μ et une activité anti- tumorale in vi tro d'un ordre de grandeur supérieur à 1 (log IG50 moyenne du point du milieu du graphe = - 6 , 4M) .
Ces propriétés mhibitπces de CDKs, qui entraînent un arrêt du cycle cellulaire, confèrent à ces dérivés de pauUones un intérêt pour le traitement de pathologies liées à la perte du contrôle de la prolifération comme les cancers, le psoriasis, les maladies cardio-vascula res , les maladies infectieuses, la néphrologie, les maladies neurodégénératives et les infections virales De manière surprenante, les inventeurs ont à présent mis en évidence que certains de ces dérivés de pauUones exerçaient un effet inhibiteur sur une autre cible enzymatique , constituée par la glycogène synthase kmase-3β ou GSK-3β en abrégé, ainsi que le cas échéant sur les CDKs, et notamment la CDK5/p25
La GSK-3β est un élément essentiel de la voie de signaux NT Elle est impliquée dans de multiples processus physiologiques régulation du cycle cellulaire par contrôle de taux de cvclme Dl et de β-caténme, formation dorso- ventrale durant le dévelocDement , action de 1 ' insuline sur la synthèse de glycogène, excroissance axonale, neurotoxicité de KIV-l à médiation par Tat, et autres.
De plus, on sait que la GSK- β et la CDK5 sont responsables pour une bonne part de 1 ' hyperphosphorylation anormale de la protéine tau liant les microtubules comme observé dans les filaments appariés en hélice dans la maladie d'Alzheimer et autres "taupathies" neurodégénératives .
On mesure également 1 ' intérêt de pouvoir disposer de dérivés inhibiteurs de l'activité de GSK-3β pour favoriser la division cellulaire.
Or, les seuls inhibiteurs de la GSK-3β divulgués à ce jour sont constitués par le lithium et certains dérivés de purine . La v sélectivité du lithium n'a -oas été raoD-ortée, mais étant donné la nature atomique du produit, il est vraisemblable qu'elle doit être très faible. De plus, le lithium n'agit qu'à des doses considérables (IC50 autour de
II en est de même avec les dérivés de purine décrits dans la demande WO 98/16528, qui sont peu sélectifs et dont les IC50 sont autour de 10 μM .
L'invention apporte une solution à ces problèmes avec l'u ilisation, pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3β et le cas échéant de CDKs, de pauUones de grande efficacité, présentant, vis-à-vis de GSK-3β, des IC50 inférieures à 10 μM, et même pour un bon nombre d'entre elles inférieures à 5 μM, voire à 1 μ . Certains de ces composés présentent même des IC50 inférieures à 50 riM et atteignant pour certains des valeurs inférieures à 10 r_M . Conformément à l'invention, pour la fabrication desdits médicaments à effet inhibiteur notamment de GSK-3β, on utilise des dérivés de paullone redondant à la formule générale (I) :
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
- X représente un groupe C = O , C-S-CH3_ C- a , - - NKOH ;
- Z représente C ou N ;
- Y représente, avec le cycle adjacent, un résidu phényle ou thiazolyle ; le ou les cycles constituant ces dérivés étant le cas échéant substitués par un ou plusieurs : atomes d'halogène, groupes hydroxy, alkylènehydroxy, alcynealkylènehydroxy, alcynehydroxycyclohexyle, alkyle, alkoxy, alkylènealkoxy, alkylènecyano, le groupe alkylene étant saturé ou insaturé, ces radicaux étant à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, ladite chaîne étant le cas échéant substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy ou amino ; un ou plusieurs groupes trifluorométhyle ,• -COiM -COOM ; ou -CKCOOM (avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à CI 3, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amir.o) ; nitroso; r.itro ; ou cyano ,-
- RD représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CL à C5 ,
R": reorésente un atome dMcydrogène, ou un groupe -C-C02- (CH3 ) 3 , et les sels de ces dérivés physioiogique ert acceptables.
Dans une famille Dréférée, Y reorésente, avec le cycle adjacent, un résidu phényle, et Z =C . Cette famille répond à la formule générale (II) :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle,
- X, RM et R12 sont tels que définis ci-dessus, et
- R~ à R4, R7 à R11, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, d'halogène (F, CI, Br, I) , un groupe hydroxy, alkylènehydroxy, alcynealkylènehydroxy, alcynehydroxycyclohexyle , alkyle, alkoxy, alkylènealkoxy, alkylènecyano, ces radicaux étant à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, le groupe alkylene étant saturé ou insaturé, ladite chaîne étant le cas échéant substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy ou amino ; un groupe tri luorométhyle ; un groupe -COM; -COOM; ou -CH.COCM, (avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cl à C13, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou a ino) ; un groupe nitrcsc; un groupe nitro ; ou un groupe cyano ; et les sels physiologiquement acceptables de ces dérivés .
Dans une autre famille préférée, Y représente, avec le cycle adjacent, un résidu thiazolyie et Z = C.
]ette famille répond à la formule générale (III) :
Figure imgf000007_0001
dans laσuelle les substituants présentent les
20 significations données ci-dessus en rapport avec la formule
(II) •
Dans encore une autre famille, Y forme avec le cycle adjacent un groupe phényle et Z = N. Cette famille répond à la formule (IV) :
Figure imgf000007_0002
dans laquelle les substituants présentent les significations données en rapport avec la formule (II) .
Un groupe de dérivés de pauUones préférés dans ces différentes familles correspond au cas où X représente C = 0.
Dans un autre groupe X représente C-S-CH3 ou C-S.
Dans encore un autre groupe X représente -C-NHOH.
De manière générale, les dérivés de l'invention présentent avantageusement une IC50 vis-à-vis de GSK-3β inférieure à 10 μM et pour bon nombre d'entre eux à 1 μM, des IC50 inférieures à 100 nM et même à 10 nM pouvant être obtenues .
Des pauUones particulièrement préférées de ces groupes appartiennent aux familles de formule (II) ou de formule (III) avec R9 choisi parmi -N02, -CN,-C1, -Br, -CF3, alkyle en Cl à C5, en particulier methyle, ou un atome d'hydrogène, R . et/ou R choisis parmi alkoxy (en C1 à C3 pour le radical alkyle) et notamment méthoxy, alkylènecyano, vinylalkoxy, ou propylène, les autres substituants étant de l'hydrogène.
L'invention vise en particulier 1 ' utili ation pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3β, de CDK1 et de CDK5 , de dérivés de paullone de formule (II) dans laquelle X = CO, R est choisi parmi -N02, -CN, -Br, -Cl, -CF3, H, et R2 et/ou R3 représentent H, alkoxy en C^C^, notamment méthoxy, alkylènecyano, notamment méthylènecyano, les autres substituants étant de l'hydrogène.
L'invention vise tout spécialement l'utilisation de pauUones de formule (II) dans laquelle X =CO, R9 représente -N02, -CN, -Br, -Cl ou -CF3, les autres substituants représentant de l'hydrogène.
L'invention vise encore tout spécialement l'utilisation de pauUones de formule (II) dans laquelle X=CO, R9 représente les significations ci-dessus et R" et RJ représentent tous deux un groupe alkoxy en C à C5 , notamment méthoxy, ou R" représente un groupe alkylènecyano, notamment éthylènecyano .
L'invention vise également en particulier l'utilisation pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3β, de pauUones de formule générale (II) dans laquelle X = SCH3 et R9 est tel que défini ci-dessus et représente en particulier un atome d'halogène, notamment de brome. Selon un autre mode de réalisation de
1 ' invention, on utilise pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3β, CDKl et CDK5 , avec une sélectivité plus grande vis-à-vis de GSK-3β et de CDKl, des dérivés de pauUones de formule (III) dans laquelle R9 est tel que défini ci-dessus dans ses significations préférées, les autres substituants représentant un atome d'hydrogène.
On notera que la 9-cyano-2, 3-diméthoxypaullone est un produit nouveau et à ce titre entre dans le champ de l'invention.
L'invention permet donc de disposer de médicaments ayant la sélectivité requise pour une application donnée. Les médicaments fabriqués conformément à
1 ' invention en utilisant ces dérivés de caullones sont tout spécialement appropriés pour le traitement des pathologies dans lesquelles la GSK-3B est impliquée
Il en est ainsi notamment en enαocrmologie , par exemple, dans les αiacètes, où les innioiteurs de GSX-36 sont utilisables comme msulino-mimétiques On rappelle cr .a 1 ' insuline agit par une cascade α ' événements oiocmmiques conduisant à une mnib tion de la GSK-3β et que cette inhibition est responsable αe la réponse des cellules à 1 ' insuline
De même, ces médicaments présentent un grand intérêt pour le traitement de maladies neurodegeneratives, comme la maladie d'Alzheimer. L ' hyperphosphorylation de la protéine tau provoquée par CDK5 et GSK-3β peut être en effet inhibée par les dérives de pauUones. En administrant les médicaments fabriques selon l' invention, il est alors possible, grâce a leur effet inhibiteur a la fois de CDKS et de GSK-3β, d'empêcher 1 ' yperphosphorylation de la protéine tau chez les malades d'Alzheimer et de lutter contre la neurodegenerescence et l' ischémie. Ces médicaments trouvent également une application de grand intérêt pour le traitement de maladies maniaco-dépressives .
On citera en outre leur utilisation pour le traitement de cancers où leur effet inhibiteur à la fois de GSK-3β et de CDKl/2/5, qui se traduit par l'apoptose de la cellule tumorale, est avantageusement mis à profit
Ces médicaments s'avèrent également efficaces pour le traitement de maladies provoquées par des parasites unicellulaires comme la malaria les trypanosomes , les leish amas les toxoplas es les pneu ocystis et autres, ou oar des parasites pl .rιcellulaιres comme les champignons et les vers. Les génomes de ces parasites contiennent en effet des gènes GSK3 homologues, mais différentes de GSK-3 humain.
Ils sont également utilisables dans la sphère cardio-vasculaire pour traiter ou prévenir notamment, l'athérosclérose, la restenose ou 1 ' angiogenese, en modifiant l'équilibre entre la prolifération et l'apoptose, et en contrôlant les taux de β-caténme.
On les utilisera également avec avantage pour le traitement des maladies infectieuses, comme par exemple le SIDA.
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités therapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi .
Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont prépares sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.
Pour l'administration par voie injectable
(intraveineuse, sous-cutanee, intramusculaire), les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stéπlisables . Il peut s'agir également de suspensions ou d'émulsions. Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 μM en dérivé de paullone dans le sang du patient traité.
A titre d'indicatif, la posologie utilisable chez l'homme correspond" aux doses suivantes : ainsi on administre par exemple au patient en une ou plusieurs prises 10 à 50 mg/jour pour le traitement de tumeurs ou de parasitoses .
Afin d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages.
Dans ces exemples, il serait fait référence aux figures 1 à 6, qui représentent respectivement,
- les figures 1A et 1B, l'activité inhibitrice vis- à-vis de CDKs, CDK1/CDK2, et de GSK-3 de 1 ' alsterpaullone (fig. 1A) et de la kenpaullone (fig. 1B) en fonction de la concentration de ces pauUones, la figure 2, les formules de pauUones selon 1 ' invention,
- les figures 3A à 3C, les IC- de pauUones selon l'invention vis-à-vis de l'une des protéines kmases GSK3,
CDKl/cycline B, CDK5/p25 en fonction de leurs IC5 vis-à-vis des 2 autres protéines kmases,
- la figure 4, les courbes montrant l' inhibition de GSK-3β par 1 ' alsterpaullone pour compétition avec l'ATP, - la figure 5, l'effet inhibiteur de
1 ' alsterpaullone de la phophorylation de tau par GSK-3β m vi tro et m vi vo, et
- la figure 6, l' inhibition de la phosphor ion de DARPP-32 par CDK5 sur Thr75 m vivo par 1 ' alsterpaullone . • Caractérisation des pauUones
Les analyses élémentaires ont été effectuées a l'aide d'un appareil d'analyse élémentaire de CHN Perkin-
Elmer 2400. Les spectres de RNINLH ont été enregistrés à 400
MHz, de RMN"C à 100 MHz sur un appareil Bruker AMX 400, avec comme référence interne du tétraméthylsilane .
Les synthèses des composes du tableau 2 ont été réalisées selon les méthodes décrites dans J. of Médicinal
Chemistry indiqué plus haut. La synthèse des 2- îodopaullone, 2-bromo-9-r.ιtropaullone, 2,3 dιmethoxy-9- nitropaullone, 9-cyano-2,3, diméthoxy paullone, 7-bromo-5- (4-nitrophénylhydrazcno) -4, 5-dihydro-l-H-[l]benzazépin-2 (3H) - one, 7, 8-diméthoxy-5- (4-nitrophénylhydrazono) -4, 5-dihydro-lH- [l]benzazépin-2 (3H) -one, est décrite dans les exemples 1 à 6. . Tampons
Les tampons utilisés ont les compositions suivantes: Tampon d'homogénéisation: - 60 mM de β-glycérophosphate , 15 miM de p-nitrcphénylphosphate , 25 M de Moos (pK 7,2) , 15 mM d'ΞGTA, 15 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM vanadate de sodium, 1 mM de NaF, 1 mM de phénylpho≤phate , 10 μg de leupeptine/ml , 10 μg d ' aprotinine/ml , 10 μg d'inhibiteur de trypsine de soja/ml et 100 μM de ber.zamidine .
Tampon A : 10 mM de MgCl2, 1 mM de ΞGTA, 1 mM de DTT, 25 mM de Tris-HCl pH , 5 , 50 μg d'héparine/ml.
Tampon C : tampon d'homogénéisation, mais renfermant 5 mM d'EGTA, et dépourvu de NaF et d'inhibiteurs de protéase .
Tris-ta oon salin de Tween-20 (T3ST) : 50 mM de Tris pH
7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20
Tampon de lyse hypotonique (HLB) : 50 mM de Tris-HCl ph
7,4, 120 mM de NaCl, 10% de glycerol, 1% de Nonιdet-P40, 5 mM de DTT, 1 mM d'EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM d ' orthovanadate ,
5 μM de microcystine, 100 μg/ml de chacun des produits suivants : leupeptine, aprotinine, pepstatine. . Préparations de kinases et déterminations des activités
Les activités des kinases ont été déterminées dans le tampon A ou C (à moins d'indications contraires), à 30°C, à une concentration finale en ATP de 15 μ . Les valeurs des essais à blanc ont été soustraites et les activités calculées en o oles de phosphate incorporé pour une incubation de 10 min. Les valeurs des activités sont généralement exprimées en % de l'activité maximale, c'est- à-dire, en l'absence d'inhibiteurs.
Des essais témoins ont été réalisés à l'aide de dilutions appropriées de Me2SO . Dans quelques cas, comme indiqué ci-après, la phosphorylatiou des substrats est déterminée par autoradiographie après SCS -PAGE.
La GSK-3β utilisée est soit l'enzyme purifiée à partir du muscle de lapin ou exprimée et purifiée à partir de cellules d'insecte Sf9 (Hughes et al, 1992, Eur . J. Biochem., 203 : 305,311) . Les déterminations ont été effectuées avec une dilution à 1/100 dans 1 mg de BSA/ml de
DTT 10 mM, avec 5 μl de GS-1 40 μM comme substrat, dans le tampon A, en présence de 15 μM [γ32P] AT? (3000 Ci/moles ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 μl . Après 30 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 μl de surnageant ont été appliqués sur des bandes de papier de phosphocellulose Whatman P81, de 2,5 x 3 cm, et 20 secondes plus tard, les filtres ont été lavés 5 fois (pendant au moins 5 min. à chaque fois) , dans une solution de 10 ml d'acide phosphorique/1 d'eau. Les filtres humides ont fait l'objet de comptage en présence de 1 ml de fluide de scintillation ACS (Amersham) .
La CDKl/cycline B utilisée a été extraite à l'aide d'un tampon d'homogénéisation à partir d'ovocytes d'étoiles de mer ( Marthasterias glacialis) et purifiée par
CKSzs~' chromatographie d'affinité sur des billes de p9 Sépharose à partir desquelles le produit a été élue par du p9 :<shsl libre, comme décrit par Meijer et al . , 1997, (Methods in Ξnzymology, vol 283 : 113-128), et Borgne et al . , 1999, J. 3iol . Chem. 274 : 11977-11986. L'activité kinase a été déterminée dans le tampon C, avec 1 mg d'histone Kl/ml, en présence de 15 μM de [γ "P] ATP ((3000 Ci/mmol ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 μl. Après 10 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 μl de surnageant ont été déposés sur des papiers de phosohocellulose P81 et traités comme décrit ci- dessus .
La CDK5/p35 a été reconstituée en mélangeant des quantités égales de CDKS et de p35 de mammifère recombinantes, exprimées dans Ξ . coli sous forme de protéine de fusion GST (Glutathione-S- transférase) et purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathione-agarose . L'activité enzymatique du complexe a été déterminée dans le tampon C comme décrit pour CDKl/cycline 3.
. Phos horylation de tau in vi tro et in vivo
La phosphorylation de tau in vi tro a été effectuée en utilisant de la GSK-3β purifiée et la protéine tau-32 humaine recombinante en tant que substrat. Après 30 minutes d'incubation en présence de différentes concentrations d ' alsterpaullone , dans les conditions d'étude de la GSK-3β décrite ci-dessus, la réaction de la kinase a été arrêtée par addition de tampon Laemmli . La protéine tau a été résolue en SDS-PAGΞ à 10% et son taux de phosphorylation visualisé par autoradiographie.
Cellules et virus : on a cultivé les cellules Sf9
(InVitrogen, San Diego, CA) à 27°C dans un milieu de Grâce de culture en monocouche (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal et 50 μg de genta ycine/ml et 2,5 μg d ' mphotéricine/ml . BaculoGold a été obtenu auprès de PharMingen (San Diego, CA) , et pVT.1392 de InVitrogen.
La transfection de tau : on a excisé, à partir d'un vecteur d'expression bactérien pNG2 (3iernat et ai . , 1993,Neuron 11 : 153-163) et le gène codant pour htau23,
1 ' isoforme tau humain le plus court, avec Xbal et BamHI . Le gène a été inséré dans le vecteur de transfert de baculovirus pVL1392 découpé avec les mêmes endonucléases .
Le système BaculoGold a été utilisé pour la construction du vecteur contenant le baculovirus tau. L 'ADN de BaculoGold est un type modifié de baculovirus contenant une délëtion léthaïe .
La co- transfection de 1 ' DN de BaculoGold avec un vecteur de transfert de baculovirus complément permet de récupérer la délétion léthale de cet ADN viral et de reconstituer des particules de virus viables portant la séquence codant pour htau23.
L ' ADN plasmidique utilisé pour les transfections a été purifié en utilisant des cartouches de CIAGEN (Hilden, Allemagne) .
Les cellules Sf9 cultivées en monocouches (2x10 cellules dans un récipient de culture cellulaire de 60 mm) ont été co- transfectées avec de 1 ' ADN de baculovirus (0,5 μg d'ADN de BaculoGold) et avec les dérivés de pVL1392 (2 μg) en utilisant la méthode de co-précipitation au phosphate de calcium. La présence de protéine recombinante a été examinée dans les cellules infectées 5 jours après l'infection par SDS-PAGΞ et Western blot . Traitement de cellules Sf9 avec des inhibiteurs de kinases
Pour déterminer les effets des inhibiteurs de 1 ' a inopurvalanoi et 1 ' alsterpaullone sur la phosphorylation de tau, les cellules Sf9 infectées par le baculovirus exprimant htau23 ont été traitées 36 heures après l'infection, (lorsque les cellules ont déjà exprimé des niveaux de tau suffisants pour le développement des processus cellulaires) avec 20 μM d'inhibiteurs pendant 3 heures avant d'être recueillies.
Western blot de tau :
Les cellules Sf9 ont été infectées avec un virus recombinant à une MOI de 1 à 5.
Les lysats cellulaires ont été préparés dans le tampon de lyse hypotonique (HLB) .
Après 15 minutes de centrifugation à 16000 g, le surnageant a été récupéré et sa concentration en NaCl augmentée jusqu'à 500 mM . Le surnageant a été ensuite soumis à ébullition pendant 10 min. et recentrifugé à 16000 g pendant 15 min. Les protéines (3 μg) ont été résolues par SDS-P GE, transférées sur une membrane de PVDF et étudiées avec un Western blot avec les anticorps suivants : AT- 8 (1: 2000), AT-180 (1:1000), AT-100 (1:500), PHF-1 (1:600) et l'anticorps polyclonal anti-tau K9JA. L ' immunocoloration a été visualisée en utilisant un système de chimioluminescence ECL (Amersham, Braunschweig, Allemagne) . . Inhibition in si zu de CDKS dans le striatum On prépare des coupes striatalies de cerveau de souris adulte selon la méthodologie standard. En suivant l'équilibre dans un tampon de bicarbonate de Xrebs oxygéné avec une aération continue ( 95%02/5%C02) , on traite les coupes avec différentes concentrations d ' alsterpaullone , ou avec lOμm de roscovitine pendant 50 min., ou on les laisse dans le tampon de bicarbonate de Krebs pendant la même durée. Les coupes homogénéisées par sonication dans 1% de SDS à ébullition et 50mM de NaF. On détermine les concentrations en protéines par la méthode 3CA en utilisant une courbe standard de 3SA. Des quantités égales de protéines (80 μg) sont soumises à une SDS-PAGΞ en utilisant un gel à 15% d ' acrylamide , transféré par electrophorèse sur une membrane de nitrocellulose et soumis à un immunoblot avec un anticorps rie phosphorylation spécifique qui détecte sélectivement DARPP-32 phosphorylé sur Thr75.
Exemple 1 : 2 - Iodo-7 , 12 -dihydro- indolo [3,2- ] [1] beπz zépine- 6 (5ff) -one (2 -iodopaullone)
Figure imgf000018_0001
Une bouillie de phénylhydrazine (162 mg, 1,5 mmol) et de 7- iodo-lH-[l] benzazépine-2, 5 ( 3 H, H) -dione (301 mg, 1 mmol) dans de l'acide acétique glacial (10 ~2L ) est soumise a agitation pendant 1 h à 70 °C. On ajoute de l'acide sulfurique concentré (0,1 πû et or. continue l'agitation 1 h à 70 °C. Après refroidissement à la température ambiante, le mélange est versé dans une solution aqueuse d'acétate de sodium à 5%. Le précipité est éliminé par filtration, lavé avec de l'eau et cristallisé à partir d'éthanol. On obtient 5~% de cristaux beige, PF 303°C (dec.) ; ir (Kbr) : 3270 (NK) , 1640 (C=0) ; "H-RM (CMSO- ds, 400 MHz) : δ (ppm) = 3,52 (s, 2H, CH:), 7,04-7,10 (3, 2H) , 7,19 ("t", 7,5 Hz, 1H) , 7,43 t.d, 8,2 Hz, 1 H), 7,56- 7,69 (m, 2K) , 8,07 (d, 1,5 Hz, 1H) , 10,17 (s, 1H, lactame NH) , 11,66 (s, 1H, indole NH) ; C^K^IN-jO (374,18) ; Cale. C 51,4, H 3,0, N 7,5 ; trouvé C 51,0, H 3,3, N 7,2.
Exemple 2 : 2 -Bromo-7 , 12 -dihydro-9 -nitro - indolo [3,2-d] [1] benzazépine- 6 ( 5Ξ) -one (2 -bromo-9 -nitropau11one)
Figure imgf000019_0001
La 7-3romo-5- (4 -nitrophénylhydrazono) -4 , 5-dihydro-lH- [1] benzazépine-2 (3H) -one (389 mg, 1 mmol) est mise à reflux dans du diphényl-éther (20 mL) pendant 2 h sous azote. Après refroidissement à température ambiante, on ajoute de l'hexane (50 mL) . Le précipité est filtré, lavé avec de l'hexane et cristallisé à partir d ' éthanol/toluène . On obtient des cristaux jaune foncé (35%) , ?F > 330°C ; ir (KBr) : 3310 (NH) , 1670 (C=0) ; 'H-R (DM30-d5, 400 MHz) : δ (ppm) = 3,69(s, 2H, CH2), 7,23 (d, 1H, 8,6 Hz), 7,59-7,64 (m, 2H) , 7,96(d, 1H, 2,0 Hz), 3,09 (dd, 1H, 9,1/2,0 Hz), 8,77 (d, 1H, 1,5 Hz) , 10,32 (s, 1H, lacta e NH) , 12,46 (s, 1H, iπdole NH) ; ClsK 0BrN3O3 (372,19) ; Cale. C 51,6, H 2,7, N 11,2 , 3r 21,5 ; trouvé C 51,5, H 3,0, N 10,8, 3r 21,3.
Exemple 3 : 2 , 3 -Diméthoxy-7 , 12 -dihydro-9 -ni tro - indolo [3,2- d] [1] benzazépine- 6 (5H) -one (2,3 - dirnë thoxy - 9 - nitropaullone]
Figure imgf000020_0001
La 7, 8-Diméthoxy-5- (4 -nitrophenylhdyrazono) -4 , 5 -dilhydro-i H- [1] benzazépinè-2 (3 H) -one (370 mg, 1 mmol) est mise à reflux dans du diphényl-éther (20 mL) pendant 2 h sous azote. Après refroidissement à température ambiante, on ajoute de l'hexane (50 mL) . Le précipité est filtré, lavé avec de l'hexane et crsitallisé à partir d ' éthanol/toluene .
On obtient des cristaux jaune foncé (63%) , PF > 330°C ; ir (Kbr) : 3340 (NH) , 1660 (C=0) ; LH-RMN (DMSO-ds, 400 MHz) : δ (ppm) = 3,58 (s, 2H, CH2) , 3,81 (s, 3H, OCH3 ) , 3,88 (s,
3H, OCH3), 6,90 (S,1H), 7,31 (s, 1H) , 7,31 (s, 1H) , 7,59 (d, 1H, 9,2 Hz), 8,05 (dd,lH, 8,9/2,3 Hz), 8,69 (d, 1H, 2,0
Hz) , 9,94 (s, 1H, lactame NH) , 12,32 (s, 1H, indole NH) ;
C13H15N305 (353,35) ; Cale. C 51,2, H 4,3, N 11,9 ; trouvé C
60, 9, H4,4, N 11, 8. Exemple 4 : 2 , 3 -Dimé•:hoxy- 6 -oxo-5 , 6 , 7 , 12 - tetrahydro- indolo
[3 , 2 - d] [1] benzazépine-9 -carbonitrile ( 9 -cyano -2,3- di éthoxypaullone)
Figure imgf000021_0001
La 9-3romo-2 , 3 -diméthoxy-7 , 12 -dihydro- indolo [3 , 2 -d] [1] benzazépine-6 ( 5H) -one (387 mg, 1 mmol) et du cyanure de cuivre (I) (179 mg, 2 mmol) sont mis à reflux pendant 2 h dans de la N-méthyl-2-pyrrolidone (10 mL) . Après refroidissement à température ambiante, on ajoute de l'eau (10 mL) et .Le mélange réactionnel est soumis à agitation pendant 15 min. Le précipité est éliminé par filtration et soumis à agitation pendant encore 15 min. dans un mélange d'eau (10 mL) et d'éthylè.e diamine (2,5 mL) . Le précipité est éliminé par filtration, lavé avec une solution aqueuse à 10% de cyanure et cristallisé à partir d ' éthanol/toluene . On obtient des cristaux incolores (40%) , PF > 330°C ; ir (Kbr) : 3300/3200 (NH) , 2220 (CN), 1660 (C=0) ; LH-RMN (DMSO-ds, 400 MHz) : δ (ppm) = 3,53 (s, 2H, CH2) , 3,80 (s, 3H, OCH3) , 3,87 (s, 3H, OCH3 ) , 6,89 (s,lH), 7,29 (s, 1H) , 7,49 (s, 1H) , 7,49 (dd, 1H, 8,6/1,5 Hz), 7,58 (d, 1H, 8,2 Hz,), 8,27 (s, 1H) , 9,89 (s, 1H, lactame NH) , 12,10 (s, 1H, indole NH) ; C19H15N303 (333,36) ; Cale. C 68,5, H 4,5, N 12., 6 ; trouvé C 68,0, H 4,5, M 12,0. Exemple 5 : 7-bromo-5- (4-nιtrophénylhydrazono) -4 , 5-d hydro-l- H- [ 1 ] benzazepιn-2 (3H) -one
On soumet à agitation, dans de l'acide acétique glacial (10 ml), pendant lh a 70°C, de la 7-bromo-lH- [ 1 ] benzazépme-2, 5 (3H, 4H) dione (254 mg, Immole), (Kunick C.
(1991), Arch. Pharm. ( einheim) 324, 579-581, du chlorhydrate de 4-nιtrophénylhydrazιne (284 mg, l,5mmole), et de l'acétate de sodium (123 mg, 1,5 m ole).
Apres refroidissement a température ambiante, le mélange est verse dans une solution aqueuse d'acétate de sodium 5 (20 ml) . Le précipite est récupéré par filtration, lavé avec de l'eau, et cristallisé a partir d'éthanol. On obtient des cristaux jaunes, avec un rendement de 52 J; PF 300°C (déc,.); IR (KBr)/3220 (NH) , 1670 (C=0); RMN-'H (diméthylsulfoxyde-d , 400 MHz) :
- δ (p. p. .) = 2.56-2.59 and 3.02-3.06 (m, AA'XX',
4H, CH.-CHJ, 6.99 (d, 1H, 8.1 Hz), 7.33 (d, 2H, 9.2 Hz), 7.56
(dd, 1H, 8.7/2.6 Hz), 7.75 (d, 1H, 2.0 Hz), 8.16 (d, 2H,
9.6 Hz), 7.56 (dd, 1H, 8.7/2.6 Hz), 7.75 (d, 1H, 2.0 Hz), 8.16 (d, 2H, 9.6 Hz), 9.87 (s, 1H, NH) , 10.19 (s, 1H, NH)
C^H^BrN.C (389.22) ; Calcd. C 49.4, H 3.4, N 14.4, Br 20.5 ; Found C 49.1, H 3.4, N 14.1, Br 20.2.
Exemple 6 : 7 , 8-d méthoxy-5- (4-nιtrophénylhydrazono) - , 5- dihydro-lH- [1 ] benzazépm-2 (3H) -one On soumet à agitation, dans de l'acide acétique glacial (10 ml), pendant lh a 70°C, de la 7,8 -di etnoxy-lH- [1] benzazépine-2, 5 (3h, 4H) dione (235 mg, 1 m ole), (Schultz C. et al, (1999) J.Med.Chem., 42, 2909-2919), du chlorhydrate de 4-nitrophénylhydrazine (569 mg, 3 mmoles), et de l'acétate de sodium (246mg, 3 mmoles) . A.près refroidissement à température ambiante, le mélange est versé dans une solution aqueuse d'acétate de sodium 5 Î (20 ml) . Le précipité est récupéré par filtration, lavé avec de l'eau, et cristallisé à partir d'éthanol. On obtient des cristaux jaunes, avec un rendement de 60 Ô ; PF 286°C (déc); IR (KBr)/3260 /3180 (NH) , 1680 (C=0) ; RMN-XH ( diméthylsulfoxyde-d,;, 400 MHz) :
- δ (p. p.m.) - 2.53-2.56 and 2.99-3.03 (m, AA'XX',
4H, CH:-CH:), 3.77 (s, 3H, OCHJ , 3.81 (s, 3H, OCH3) , 6.65 (s, 1H) , 7.20 (s, 1H) , 7.32 (d, 2H, 9.2 Hz), 8.13 (d, 2H, 9.2 Hz), 9.53 (s, 1H, NH) , 10.06 (s, 1H, NH) ; C^H^ ^ (370.38) ; calculated. C 58.4, H 4.9, N 15.1 ; found C 57.8, H 4.9, N 14.8.
Exemple 7 : Etude de l'inhibition de GSK-3β , de CDK5/p35 et de CDKl/cycline B par les pauUones. . Alsterpaullone
L'activité de 1 ' alsterpaullone a été étudiée sur plusieurs kinases hautement purifiées.
Les activités kinases ont été déterminées ave un substrat approprié (GSK-3β: GS1 peptide; CDKs : histone Hl ) en présence de 15 μM d'ATP et à des concentrations croissantes en alsterpaullone et kenpaullone.
L'activité est exprimée en pourcentage de l'activité maximale. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 1 et dans le tableau 1. Les valeurs de IC5υ ont été calculées à partir des courbes dose/réponse et sont exprimées en μM.
Tableau 1
(< 001 μM( ), 001 - 0.1 μM( ), 01 - 1 μM ( ), 1-1 0uM( r~~l)>10μM<
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
On constate que la plupart des kinases testées sont faiblement ou pas du tout inhibées (IC50 >10 μM) .
On notera qu'en plus de l'effet sur la CDKl/cycline B, 1 ' alsterpaullone inhibe la CDK2/cycline A, la CDK2/cycline E, la CDK5/p25 et la GSK-3α/GSK-3β (IC50 respectivement de 15, 200, 40 et 4nM) . Autres pauUones selon la formule I
Dans les tableaux 2A et 23 donnés ci -après et su: la figure 2, on a rapporté l'effet inhibiteur de paullor.es utilisées selon l'invention vis-à-vis de GSK-3β, CDK5/p25 et CDKl/cvclme 3.
TABLEAU 2A
Numéro Composés GS 3 CDKl CDK5
98 N 215 a ieφaudone ;9-NιuOpauilonel 0004J 0035" 0040"
98 N 210 9-cyanopaullone 0010" 0024° 0044°
98 N 356 2.3-dιmethox -9-nιcropauUone 0013" 0024° 0021°
98 N 217 9-cvano-2.3-duneihoxypau.Hone 0018° 0044° 00o0°
96 N ô 19 enpaulLone (9-Bromopaulυne) 0023° 0400e 0850-
97 N 3-13 9-chloropaullone 0024 0600e 0800e
97 N 487 9-cπtluoromet ylpaulloπe 0030° 0400e 0600e
98 N 357 3-(6-ϋλθ-9-trιfluoromethyl-5.ά,712-tetranylro- 0033° 0047° 0033° ιndolo[2-3-<i][l]benzazepιn-2-y0-propιcnιtrιle (B) 98 N 002 2.3-Uιmcthoxy-9-cπfluormethylpjuUone 0075° 0280e 0430e
98 N 048 9-bro o-l2-methyloxycarbonyimeLhylpaullone 0075° 1400" 350000-
97 N 353 9-tluoropaullone 0080° 1600" 1300e
97 LS 608 9-bromo-2-3-dιme-boxypaulloπe 0 [00e 200e 0500e
97 N 483 9-bromo-23-dιhydroxypaulloπe 0120e 3000" 8000"
97 N 352 9-meώylpauIlone 0130e 2.0O0" 6.300"
97 N 345 10-bromopauilone 0140e 1.300" 2.700"
97 N 313 2-bromopauilone 0.200e 3300" 5000"
9 N 3-U 11 -chloropaullone 0.200e 1400" 2.900"
98 N 351 2-(3-bydrθλy-l-propιnyl)-9-tπfluoromeώylpa_Jlone (C) 0200e 0.300e 2.000" 98 N 354 2-bromo-9-nιtropaullone 0200e 0.053° 0.120e
98 N 259 2-ιodopauiloπe 0.250e 3.700" 7.400"
98 N 051 9-bromo-12-(2-bydroxyethyl)-pauiIone 0.300e 3.000" 140000e
98 N 211 9-bromo- 12- methyl pauUone 0400e 6.200" 400000e
98 N 350 (D-3-(6-oxo-9-tπl!luθfθ ethyl-5.â.7.12-(etnι ydro- 0.400e 0.270e 9J00" ιndolo(2-3-f][lIbcαzazepin.2-yl-acrylθQjtπle (E)
97 N 486 9-brorno-5-(rne_h.ylθxycarbυnylmethyl)paullone 0500e 6400" 5.300"
98 N 223 1 l-methyipaullone 0.500e 3.000" 9000"
97 N 317 paullnne (A) 0.620e 7000" 10100e
98 N 225 11-eιhylpauUone 0700e 3.800" 23000-
98 N 216 9-bromo-7,12-dιhydro-6-('hydroxyamιno>-jndolo(2-3^il[l]benzazeptne ;Fl 0750e 1.000" 2.100"
97 N 609 2.9-dιbromopaullone 0.800e 0.300e 10000e
97 N 347 11-brotnopaullone 0900e. 1300" 1400"
97 N 485 2.3-dιmeιhoxypaullone 0.900e 4.300" 5400"
98 N 262 tE)-3-(6-oxo-9-tπluoromethyl-5.6.712-ccιrahydro- 0900e 4.300" 130.000e ιndolo[2-3-<ιT,[l]benzazcptn-2-yl)-acryUc acid methyl ester (D)
97 N 610 9-bromo7.12-dιhydro-6-met ylt ιo-ιndolo[2-3-dl[[]benzazepιne (G) 1200" 43000- 450 oo<r
98 N 35S (.£y2-(3-oxo-l-bu.tenyl)-9-tπfluoromechylpauUoιιe (H) I400d 0320e 34000e 98 N 213 9-bromo-12-ethylpaullone 1.500" 23.000e 260000e
97 N 612 9-bro o-7.12-dώydjO-ιfldolo(2-3-rf][llbenzazep e-6(5W-thιone il 2.000" 2.300" 8.000"
98 N 047 2-bromo-9-tπfluoromethylpauUone 2.000" 0.240e 3.000"
9S N 349 2-[2-(l-bydroxy yclo exy -ethιnyl]-9-tn luoromet ylpauUone (S) 2.000" 3.200" 8.300"
97 N 613 9-bfomo-5-mehylpauUone 2.100" 20.000e 130.000e
97 N 351 9-methoxypaullone 2.200" 0900e 2.100"
98 N 236 2-ιodo-9-tnfluoromethylρaullone 2.200" 0.700e 7000"
98 N 046 9-bromol2-(/£rr.-butyloxycarbonyl)-paulloπe 1300" 70.000" 300.000e
98 N 212 9-bromo-l2-(2-propenyl)-paulloπe 4.000" 60.000e 240000e
97 N 482 9-bromo-l-hycirox.ypaiLllooe 4300" 40.000e 850.000e
98 N 0-^ S.lO-dichloropaulIoπe 5.000" 2.500" 350000e
98 N 001 5-benzyl-9-bromoρaullone IO.OOO1- 35000e 270.000e
97 N 607 9-bromo-4-methoxypaullone 16.000e 250.000e 400000e
98 N 224 9-bromo-5-ethylpaullone 24.000e 470.000 300000e
98 N 209 9-bromo-5.7-bS-(!*rr.-butyloxycarbonyl)-paullone 130.000e 80.000e > 1000e
97 N 484 4-methoxypaulloπe 140000e 430.000° 1000.000e
98 N 347 9-bromo-5.6,7.i2-ι.etrahydπ-benzo[6-71cyclohept[l.2-o]mdole (K) 180.000e 51.000e 360000e
98 N 214 2-phenyl-i-( -t enyl)-5j¥-pyπdo[2-3-d][lJbenzazepιne-6(7ffl-thιoπe (L) 35000(7" 33.000e 700000e
98 N 208 9-bromo-5.7,12-tn-(«rτ.-butyloxycarbony -paullone 500.000e 150000e 1000000"
97 N 611 9-bromo-5.12-bιs-(f?rr.-butyloιycarbonyl)-paullone 640000e 1000000e > 1 00e
98 N 220 4-(4-chlorophenyn-2-(2-αaphι y0-
5fY-pyrιdo[2-3-<f][l]benzazepιne-ό(70-thιone iΛO > 1 00- > 1000e > I OO-
98 N 348 5.6.7,i2-tetxahydro-benzof6-71cyclonepc[l.2-(?luιdole , N") > 100O- 130000e > 1000- < 001 μM. "001-01 μM. c 01-1 μM. 1-10 μM. e 10 μM. Dans le tableau 23, on indique également les IC50 pour GSK3 , CDKl et CDKS pour d'autres dérivés de pauUones utilisés selon l'invention. Les significacions présentées par les substituants sont indiqués, pour chaque composé lorsqu'il ne s'agit pas d'un atome d'hydrogène.
Tableau 2B
Figure imgf000028_0001
Pour comparer les effets des composés actifs sur GSK-3β et les CDKs, on rapporte sur les figures 3A à 3C les valeurs de ICS0 vis-à-vis de chaque enzyme (CDKl/cycline B, CDK5/p25 ec GSK-3β) en fonction des valeurs de IC50 vis-à- vis des 2 autres kinases .
Cette analyse montre que les efficacités des paullones vis-à-vis de CDKl et CDKS sont très liées, et le sont beaucoup moins vis-à-vis de GSK-3β ec des CDKs.
Exemple 8 ; Etude de l'inhibition par les paullones de GSK- 3β par compétition avec 1 ' ATP .
On rapporte sur la figure 4 les données cinétiques de, détermination de l'activité de GSK-3β à différentes concentrations en alsterpaullone. Les activités enzymatiques sont décrites comme déterminé ci-dessus. Figure 4A : courbe primaire l/V versés l/ATP. Les concentrations en ATP dans ce mélange réactionnel varient de 0,5 à 4 μM . La concentration en GS-1 est maintenue constante à 4 μ . Dans l'encadré, on a représenté les pentes en fonction de la concentration à partir des courbes primaires. La constante d'inhibition apparente (Ki) est indiquée par une flèche .
Les expériences de cinétique démontrent que 1 ' alsterpaullone est également en compétition par rapport à l'ATP pour la liaison sur GSK-3β.
La constante d'inhibition apparente (ki) est de 0nM. Exemple 9: Etude de l'inhibition par 1 ' alsterpaullone de la phosphorylation de tau in vitro et in vivo par GSK-3β .
L'effet inhibiteur de 1 ' alsterpaullone sur l'activité de la GSK-3β a été déterminé sur une protéine tau liant les microtubules . La protéine tau humaine reco binante exprimée dans des bactéries peut être phosphorylée m vitro par GSK-3β et cette phospnorylation est inhibée d'une manière dose-dépendante par 1 ' alsterpaullone avec une ICM voisine de 33nM.
On a rapporté sur la figure SA. les résultats de la résolution par SDS-PAGE, suivi d'une autoradiographie. Sur la figure 53, on donne les résultats obtenus avec des cellules Sf9 exprimant htau23 (témoin non traité), ou exposées à 1 ' alsterpaullone ou à 1 ' am opurvalanol pendant 3 h. Les lysats cellulaires (3 μg htau23) sont résolus par SDS-PAGE, colorés au bleu de Coomassie ou soumis à un immunoblot avec différents anticorps : K9JA (anticorps pantaα) qui reconnaît tau indépendamment de la phosphorylation, AT100, qui reconnaît tau phosphorylée sur Thr212 et Ser214, cette réaction étant très spécifique de la protéine tau d'Alzheimer, PHF-1 (phosphorylé sur Ser396/Ser-404 , AT8 (phosphorylé sur Ser202/Thr205) , et AT180 (phosphorylé sur Thr231/Ser235) .
Exemple 10 : Etude de l'inhibition de la phosphorylation de DARPP-32 par CDKS in vivo .
Le rôle de la protéine DARPP-32, en tant que substrat physiologique de CDKS/p25, a été récemment identifié par Bibble J.A. et al, (1999) Nature, 402, 669-671. Cette protéine devient un inhibiteur de PKA lorsqu'elle est phosphorylée sur Thr75 par CDK5/p25. In vi vo, on n'observe pas de pnosphorylation sur ce site dans les tissus p35~/~. Pour déterminer la capacité mhibitrice de CDK5 dans le cerveau de 1 ' alsterpaullone, on a traite des coupes de stπatum (région du cerveau exprimant DARPP-32) avec différentes concentrations en alsterpaullone. Les coupes ont ete incubées avec 0,1, 10 et 50 μM d ' alsterpaullone, pendant 60 mn . Le taux de phophorylation de DARPP-32 sur Thr75 a ete contrôle par Western blot avec un anticorps phospho- specifique et évalue par quantification des empreintes. Les résultats obtenus sont respectivement représentes sur les figures 5A et 5B . On constate que 1 ' alsterpaullone est capable d'inhiber la phospnorylation de D7ARPP-32 m si tu .
Exemple 11 : préparation d'une gélule en utilisant la 9- n tropaullone comme principe actif.
On mélange 20 mg de 9-nιtropaullone avec les excipients classiquement utilises pour la fabrication de gélules .

Claims

REVENDICATIONS
1. utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3β de dérivés de paullones répondant à la formule générale (I) :
Figure imgf000032_0001
dans laquelle
X représente un groupe C = 0,C-Ξ-CH3 C-S,
• C - NrlOH
- Z représente C ou N ;
- Y représente, avec le cycle adjacent, un résidu phényle ou thiazolyle
le ou les cycles constituant ces dérivés étant le cas échéant substitués par un ou plusieurs : atomes d'halogène, groupes hydroxy, alkylèr.ehydroxy, alcynealkylènehydroxy, alcynehydroxycyclohexyle, alkyle, alkoxy, alkylènealkoxy, alkylènecyano, le groupe alkylene étant saturé ou insature, ces radicaux étant à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C18, ladite chaîne étant le cas échéant substituée par un ou plusieurs groupes hydroxy ou a ino ,- un ou plusieurs groupes tr fluoromé hyle ; -COM ; -COOM. ; ou -CH:C00M (avec M représentant m atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Ci à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino) nitroso,- nitro ; ou cyar.o ; - D représente u atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CL à C5 , "" représente un atome d'hydrogène ou un groupe -C-CO,- (CH3) 3 ; et les sels de ces dérivés physiolαgiquement acceptables .
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dérivés de oaullone répondent à la formule (II) :
Figure imgf000033_0001
dans laquelle,
- X, R5 et R" sont tels que définis dans la revendication 1, et
- R- à R4, R7 à R11, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, d'halogène (F, Cl, 3r, D , n groupe hydroxy, alkylèr.ehydroxy, alcynealkylènehvdroxy, alcynehydroxycyciohexyle , alkyie, alkoxy, alkylènealkoxy, alkylènecyano, ces radicaux étant à chaîne droite ou ramifiée, en Cl à C13, le groupe alkylene étant saturé ou insaturé, ladite chaîne étant le cas échéant substituée par n ou plusieurs groupes hydroxy ou amino ; un groupe trifluorométhyle ; un groupe -COM; -COCM; ou -CH2COOM, (avec M représentant un atome d ' hydrogène , un groupe alkyle en Cl à CI3, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino) ; un groupe nitroso; un groupe nitro ,- ou un groupe cyano ; et les sels physiologiquemer.t acceptables de ces dérivés .
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dérivés de oaullone répondent à la formule (III) ,
Figure imgf000034_0001
dans laquelle les substituants présentent les significations données dans la revendication 2 en rapport avec la formule (II) .
4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les dérivés de oaullone répondent a la formule générale (IV) •
Figure imgf000035_0001
10 dans laquelle les substituants présentent les significations données dans la revendication 2 en rapport avec la formule (II) .
5. Utilisation selon l'une quelconque des 5 revendications 2 à 4, caractérisée en ce que X représente C = O.
6. Utilisation selon selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce crue X représente C-S-CH3 ou C-S. 0 7. Utilisation selon selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que X représente -C-NHOH.
8. Utilisation selon la revendicaiotn 2 ou 3, caractérisée en ce que les dérivés de oaullone répondent > aux formules (II) ou (III), avec R9 choisi parmi -NO,, -CN,-C1, -Br, -CF3, alkyle en Cl à C5 , en particulier methyle, ou un atome d'hydrogène, R2 et/ou R choisis parmi alkoxy (en C à C3 pour le radical alkyle) et notamment méthoxy, alkylènecyano, vinylalkoxy, ou propylène, les autres substituants étant de l'hydrogène.
9. Utilisation selon la revendication 8, pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3β, de CDKl et de CDKS, de dérivés de paullones de formule (II) , selon la revendication 2_, dans laquelle X = CO, R est choisi parmi -NO,,
CN, -Br, -Ci, -CF3, H, et R" et/ou ?M représentent H, alkoxy en C1-C3, notamment méthoxy, alkylènecyano, notamment méthylènecyano, les autres substituants étant de 1 ' hydrogène . 10. Utilisation selon la revendication 9, g caractérisée en ce que X =CO, R représente -N02, -CN, -Br, -Cl ou -CF3 les autres substituants représentant de 1 ' hydrogène .
11. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que X=C0, R présente les significations ci-dessus et R" et R représentent tous deux un groupe alcoxy en C à C5 , notamment méthoxy, ou ?„" représente un groupe alkylènecyano, notamment éthylènecyano .
12. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que R est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 11, et représente en particulier un atome d'halogène, notamment de brome.
13. Utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3β, de CDKl et de CDKS, de la 9 -nitro-7, 12 -dihydroindolo[3 , 2-d] [l]-benzazépin- 6 (5H)- one .
14. Utilisation pour la fabrication de médicaments sélectivement inhibiteurs de GSK-3β, de paullones de formule (II) selon la revendication 2, dans laquelle X = SCH3 et R9 est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 a 11, et représente en particulier un atome d'halogène, notamment de brome.
15. Utilisεtior pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3β, CDKl et CDK5, avec une sélectivité plus grande vis-a-vis de GSK-3β et de CDKl, des dérives de paullones de formule (III) selon la revendication 3, dans laquelle R est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 11, les autres substituants représentant un atome d'hydrogène. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que les médicaments sont prépares pour une administration par voie orale, sous forme de gélules, comprimes, dragées ou capsules.
17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 a 15, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.
18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3β et CDK5.
19. En tant que nouveau compose la 9-cyano-2,3- dimethoxypaullone .
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