BRPI1007350B1 - compostos espiro heterocíclicos bicíclicos - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS ESPIRO HETEROCÍCLICOS BICÍCLICOS. São descritos compostos espiro heterocíclicos bicíclicos; composições farmacêuticas compreendendo estes compostos; e métodos para o tratamento em um mamífero de doenças e condições que são susceptíveis à modulação do receptor muscarínico Ml, incluindo doença de Alzheimer, síndrome da resistência à insulina e diabete tipo 2. Outras realizações são também descritas.

Description

Casos Relacionados

Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório US n° 61/147.143,depositado em 26 de janeiro de 2009. O conteúdo deste pedido provisório é incorporado aqui como referência.

Campo da Invenção

A invenção refere-se a compostos espiro heterocíclicos bicíclicos que são ligantes para receptores acoplados à proteína G (GPCRs), e em particular que funcionam como agonistas do receptor muscarínico, para composições farmacêuticas compreendendo estes compostos, e a métodos para o tratamento da doença de Alzheimer, síndrome da resistência à insulina e diabetes do tipo 2 em um mamífero.

Antecedentes

Um amplo espectro de doenças com necessidades médias não atendidas compartilha alguma patogênese comum que pode ser tratável, em princípio, com ativadores da quinase C(PKC) e inibidores da glicogênio sintase quinase 3β, respectivamente. Três de tais doenças, a doença de Alzheimer (AD) (uma doença neurológica do sistema nervoso central (SNC)), e a síndrome da resistência à insulina (IRS) e a diabetes do tipo 2 (T2D) (duas doenças metabólicas que estão relacionadas entre si), são descritas resumidamente abaixo. Existe uma conexão próxima entre IRS/T2D e AD (Sima e Li, Rev. Diabetic Stud. 2006, 3:161-168).

A AD é um distúrbio cerebral degenerativo caracterizado por perda progressiva de memória, por perda sináptica, pela presença de placas neuríticas consistindo em β- amilóide (Aβ), pela presença de emaranhados neurofibrilares (NFT), e por perda de neurônios colinérgicos no prosencéfalo basal. Os Aβ são peptídeos neurotóxicos. Tau (T) são proteínas associadas a micro-túbulos necessárias para o desenvolvimento de neuritos. As proteínas tau hiperfosforiladas são, de fato, tóxicas e são o componente principal de filamentos helicoidais pareados (PHF) e NFTs. A resistência à insulina induz elevações de insulina periférica crônicas, reduz a atividade da insulina, e reduz os níveis cerebrais de insulina. A IRS e condições associadas tais como T2D e hipertensão estão associadas com incapacidade de memória relacionada à idade e à AD (Sima e Li, Rev Diabetic Stud 2006, 3:161-168).

Um número de quinases está envolvido na patologia da AD e da IRS/T2D. Desta forma, a quantidade de proteína quinase C (PKC) é reduzida em cérebros de pessoas que sofrem de AD, e mostrou-se que esta redução está correlacionada com estágios neuropatológicos. Isto enfatiza a importância desta quinase como um alvo terapêutico importante na AD (Kurumatani et al.Brain Res. 1998; 796:209-21).

Uma outra quinase, a GSK-3β, representa um papel regulador importante em uma variedade de processos celulares variando de sinalização membrana-núcleo celular, transcrição genética, tradução, organização citosquelética à progressão e sobrevivência do ciclo celular (Eldar-Finkelman, Trends Molec. Med. 2002, 8:126- 32; Bhat et al., Neurosignals 2002,11:251-61; Balaram et al.,Cell Mol. Life Sci. 2006, 63:1226-35). A GSK-3β tem sido ligada à maioria das anomalias primárias associadas com AD tais como hiperfosforilição de taude AD, neurotoxicidade induzida por Aβ e efeitos patogênicos da mutação de presenilina-1 (PS-1). A GSK-3β ativa aciona eventos de transdução de sinal que participam na morte celular, indicando que parte da patologia de AD pode resultar da expressão e atividade anormal de GSK-3β. Além disto, a desativação da GSK-3β foi correlacionada com a secreção reduzida de Aβ (Sun et al., Neurosci. Lett. 2002, 321:61-4). Presentemente, existe a hipótese de que a GSK-3β é a ligação perdida entre o β-amiloide e a patologia tau, colocando a GSK-3β como fator proeminente na patogênese da AD [Takashima, J. Alzheimers Dis. 2006, 9 (3 Supl.), 309-17], A GSK-3β fosforila glicogênio sintase e regula a rota metabólica da glicose.

Desta forma, a GSK-3β é um regulador negativo central na rota de sinalização da insulina, e pode representar um papel na resistência à insulina (Gasparini et al. Trends Pharmacol Sci 2002: 23: 288-92; Janssens et al. Investig. New Drugs 2006; 24: 263-80).

Desta forma, a inibição de GSK-3β pode mimetizar a ação de certos hormônios e fatores de crescimento, tais como a insulina, que utilizam a rota da GSK-3β. Esta estratégia pode permitir o desvio de um receptor defeituoso (por exemplo, o receptor de insulina), ou um outro componente defeituoso do maquinário de sinalização, de tal forma que o sinal biológico terá efeito mesmo quando alguns atores a montante da cascada de sinalização estão defeituosos, tal como na diabetes do tipo 2 não dependente de insulina [Tanabe et al, PLoS Biol. 2008 (2): e37; Wagman et al., Curr. Pharm. Design, 2004, 10:1105-1137], As estratégias de tratamento para as doenças mencionadas acima podem incluir ativadores de PKC e inibidores de GSK-3β. Isto pode ser obtido em princípio ou via indireta (mediada por GPCR) ou modulação direta destas quinases. No caso de ativadores diretos de PKC ou inibidores de GSK-3β, a busca é por ligantes altamente potentes e seletivos. Entretanto, tais estratégias terapêuticas não seriam livres de efeitos adversos na medida em que as quinases alvo estão envolvidas em uma pletora de processos e cascadas a jusante. O direcionamento direto para estas quinases por sua função em uma rota (e doença relacionada) irá alterar sua função em uma outra rota e potencialmente criar efeitos colaterais sérios (efeitos colaterais fora do alvo).

Desta forma, a terapia ideal para compostos que se direcionam diretamente para estas quinases deve modular seletivamente a(s) rota(s) discreta(s) envolvidas nestas doenças. Tais quinases podem ser moduladas a partir de fora da membrana celular via GPCRs. Os GPCRs convertem os sinais recebidos de fora da célula em processos biológicos no interior da célula via rotas de transdução de sinal. Tais rotas de transdução de sinal moduladas por GPCRs são sistemas elegantes pelos quais células e organismos podem amplificar sinais sutis de maneira a gerar respostas robustas. Este processo de amplificação a montante permite o desenvolvimento clínico de agonistas parciais que apresentam uma potência de ligação moderada e não causam dessensibilização da sinalização mediada por GPCR após tratamento prolongado em doenças crônicas tais como AD, IRS e T2D.

É desejável que fármacos candidatos para a modulação de GPCR apresentem seletividade para o sub-tipo de GPCR alvo de maneira a prevenir a ativação de outros sub-tipos de GPCR. Uma sub-classe de GPCRs são os receptores muscarínicos (mAChR). Cinco receptores muscarínicos humanos geneticamente distintos designados como M1-M5 foram clonados (Buckley et al. Mol. Pharmacol. 1989; 35: 469-76; Hulme et al.Ann. Ver. Pharmacol. Toxicol. 1990; 30: 633-73). O mAChR Ml, prevalente no córtex, hipocampo e no corpo estriado, representa um papel importante no processamento cognitivo e em particular na memória de curto prazo, a qual é incapacitada na AD. Agonistas muscarínicos seletivos de Ml podem servir como um fármaco de tratamento anti-demência. O potencial terapêutico de tais compostos, em princípio, deve ser menos afetado que os inibidores colinérgicos (AchE-Is) pela extensão da degeneração de terminais colinérgicos pré-sinápticos, e, desta forma, podem representar um tratamento mais racional para AD que os AchE-Is aprovados pelo FDA (Revisão: Fisher, Neurotherapeutics, 5: 433-42, 2008). Um número de compostos espiro bicíclicos, alguns relatados como sendo agonistas seletivos de Ml, foram descritos (patentes US 4.855.290, 4.981.858, 4.900.830, 4.876.260, 5.053.412, 5.407.938, 5.534.520, 5.852.029, 7.049.321, 5.221.675, 7.349.251).

Uma relação entre três das principais marcas características da AD foi reportada: a hipofunção colinérgica do SNC, formação de placas amilóides peptídicas Aβ e emaranhados contendo proteínas tau hiperfosforildadas. Neste contexto, ciclos viciosos ligam a hipofunção colinérgica em AD com o peptídeo Aβ e a fosforilação de tau. O estímulo de mAChRs Ml pode aumentar a clivagem da proteína precursora de amilóide (APP) no meio de sua região β-amiloide. Esta clivagem produz as APPs neutróficas e neuroprotetoras (a-APP) secretadas, prevenindo a formação do peptídeo Aβ. Agonistas de Ml podem ser valiosos na prevenção da formação de Aβ pela promoção seletiva da rota de processamento da a-secretase em AD. Além disto, o estímulo de mAChRs Ml pode reduzir a hiperfosforilação de tau (Revisão: Fisher, Neurotherapeutics 5:433-42, 2008). Desta forma, alguns sub-tipos de GPCR, e em particular o mAChR Ml, estão envolvidos na modulação de uma variedade de funções, tanto na saúde quanto na doença. A PKC pode ser ativada por vários GPCRs incluindo, mas não se limitando a, mAChR Ml, receptores metabotrópicos e sinalizadores Wnt (Farias et al., Neurobiol. Dis. 2004, 47:337-48; Mudher et al.,J. Neurosci. 2001, 21:4987-95; Ballou et al., J. Biol. Chem. 2001, 44: 40910-916).

Os GPCRs em geral podem conter mais de um sítio. Neste contexto, os sub- tipos de mAChR contêm tanto sítios ortostéricos (sítio de ligação primária do neuro transmissor natural, acetilcolina) quanto sítios alostéricos (podem ou não alterar o sítio ortostérico e os efeitos da acetocolina).

Muitas das características patológicas das doenças do SNC e SNP incluindo AD e IRS/T2D, respectivamente, envolvem características oxidativas relacionadas a estresse. Um estresse oxidativo em AD causado por Aβ pode propagar uma cadeia de eventos e ciclos viciosos levando a um bloqueio de alguma transdução de sinal induzida por GPCR (melhor documentada para mAChR Ml) e acumulo adicional de Aβ neurotóxico. Anti-oxidantes podem, em princípio, prevenir tais ciclos viciosos (Fisher, Jap. J. Pharmacol. 2000, 84: 101-12; Kelly et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 1996 93:6753- 58).

O estresse oxidativo pode, em última análise, levar tanto ao estabelecimento quanto a complicações subseqüentes de T2D. Embora os tratamentos anti-oxidantes possam mostrar benefícios em modelos animais de diabetes, novos e mais potentes anti- oxidantes são necessários para demonstrar se os anti-oxidantes podem ser efetivos no tratamento de complicações, além disto, parece que o estresse oxidativo é apenas um dos fatores que contribuem para complicações diabéticas; desta forma, o tratamento anti- oxidante provavelmente seria mais efetivo se fosse acoplado a outros tratamentos para complicações diabéticas. Em particular, novas rotas eu envolvem sinalização do receptor metabotrópico (por exemplo, sinalização mediada por GPCR), e GSK-3β, podem estar envolvidas na diabete e necessitariam ser abordadas em uma estratégia terapêutica compreensiva (Maiese et al, Curr. Med. Chem. 2007 14:1729-38. Revisão).

Breve Descrição da Invenção

É provido, de acordo com as realizações da invenção, um composto espiro de fórmula I:

onde A é selecionado do grupo consistindo em:

onde em todas as estruturas o carbono representado por “C” indica um carbono espiro, R é selecionado do grupo consistindo em H e Ci-6 alquil opcionalmente substituído, n e p são cada um independentemente selecionado de 0, 1, 2 e 3, desde que n+p = 1, 2 ou 3; Y é -O- ou -S-; R1, R2, R3, R4 e R6 são cada um independentemente selecionado em cada ocorrência de H, Ci^ alquil opcionalmente substituído, Ci-6 alcoxi opcionalmente substituído, Ci-6 hidroxialquil opcionalmente substituído, C2-6 alquenil opcionalmente substituído, e fenil opcionalmente substituído; R5 é selecionado de C4.7 alquil opcionalmente substituído, Ci-6 hidroxialquil opcionalmente substituído, C2-6 alquenil opcionalmente substituído, C2-6 alqumil opcionalmente substituído, (Ci-6)alquilindol opcionalmente substituído, heteroanl opcionalmente substituído e fenil opcionalmente substituído, alquil C1-6 heteroaril opcionalmente substituído, C3.7 cicloalquil opcionalmente substituído, -C(=O)-R8, -SO2- R9, e quando A é

R8 é selecionado de C1-7 alquil opcionalmente substituído, C1-7 alcoxi opcionalmente substituído, C2-7 hidroxialquil opcionalmente substituído, C2-7 alquenil opcionalmente substituído, C2-7 alquinil opcionalmente substituído, C3-7 cicloalquil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído, (Ci-6)alquilindol opcionalmente substituído, C2-3 alquenilindol opcionalmente substituído, (Ci. 6)alcoxiindol opcionalmente substituído, (Ci.6)alquilindolizina opcionalmente substituída, C2.3 alquenilindolizina opcionalmente substituída, (Ci^)alcoxi-indolizina opcionalmente substituída, (Ci-6)alquilisoindol opcionalmente substituído, C2-3 alquenilisoindol opcionalmente substituído, (Ci^)alcoxiisoindol opcionalmente substituído, (Ci^)alquilindazol opcionalmente substituído, C2-3 alquenilindazol opcionalmente substituído, (Ci-ó)alcoxiindazol opcionalmente substituído, (Ci^)alquil- benzimidazol opcionalmente substituído, C2-3 alquenilbenzimidazol opcionalmente substituído, e (Ci^) alcoxibenzimidazol; e R9 é aril substituído por um ou mais membros do grupo consistindo em alquil, halogênio, nitro, amino, hidroxil, e CF3, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

Em algumas realizações da invenção, R é metil. Em algumas realizações da invenção, pen são cada um 1.

Em algumas realizações da invenção, A é

Em algumas realizações A é

Em algumas realizações A é

Em algumas realizações A é

Em algumas realizações A é

Em algumas realizações da invenção, R1 é metil. Em algumas realizações R1 é metil e R2 é H. Em algumas realizações R1 é metil e R2, R3 e R4 são cada um H. Em algumas realizações R6 * * * io é H. Em algumas realizações da invenção, Y é S. Em algumas realizações Y é O. Em algumas realizações R5 é -C(O)-(Ci-3)-indol3-il. Em algumas realizações io R5 é -C(0)-CH2-indol-3-il. Em algumas realizações R5 é -C(O))-CH2CH2-indol-3-il.

Em algumas realizações R5 é -C(O)-CH2CH2CH2-indol-3-il. Em algumas realizações R5 é trans-C(O)-CH=CH-indol-3-il. Em algumas realizações R5 é -Sθ2-4-fluorfenil. Em algumas realizações R5 é -C(O)CH(n-propil)2. Em algumas realizações R5 é -C(O)-(4- hidroxi-3,5-di-tertbutilfenil). Em algumas realizações R5 é -C(O)-CH2CH3. Em algumas realizações R5 é -C(O)-CH(NH2)-CH2-indol-3-il. Em

É também provido, de acordo com algumas realizações da invenção, um composto selecionado do grupo consistindo em (l-2,8-dimetil-l-tia-3,8- diazaspiro[4.5]dec-3-iI)3-(lH-indol-3-il)propan-l-ona), (+)-(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro [4.5]dec-3-il)-3-(lH-indo l-3-il)propan-l-ona), (-)-(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propan-l-ona), l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona, (+)-l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona, e (-)-l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8- diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona.

É provido também, de acordo com realizações da invenção, uma composição farmacêutica compreendendo um composto como descrito acima, e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável para esta.

É provido também, de acordo com realizações da invenção, um método para o tratamento da doença de Alzheimer, compreendendo a administração a um paciente necessitando de tal tratamento de uma quantidade efetiva de um composto como descrito aqui.

É provido também, de acordo com realizações da invenção, um método para o tratamento da síndrome da resistência à insulina, compreendendo a administração a um paciente necessitando de tal tratamento de uma quantidade efetiva de um composto como descrito aqui.

É provido também, de acordo com realizações da invenção, um método para o tratamento da diabete tipo 2, compreendendo a administração a um paciente necessitando de tal tratamento de uma quantidade efetiva de um composto como descrito aqui.

É provido também, de acordo com realizações da invenção, um método para o tratamento de uma doença ou condição que seja susceptível de tratamento com um modulador de receptor muscarínico Ml, compreendendo a administração a um paciente necessitando de tal tratamento de uma quantidade efetiva de um composto como descrito aqui. Em algumas realizações, a doença ou condição é selecionada do grupo consistindo em distúrbios cerebrais mediados por amilóide; distúrbios mediados por GSK3β; anomalias na sinalização de Wnt; um dano mediado pela hiperfosforilação da protein tau,disfunção ou doença; doenças mediadas por fator de crescimento endógeno; uma combinação de fatores de risco para AD e/ou uma das doenças mencionadas acima, por exemplo, lesão cerebral, estresse oxidativo, radicais livres, apoptose, inflamação, toxinas exógenas ou endógenas, excitotoxinas, predisposição genética, disfunções ou doenças imunes ou autoimunes (por exemplo, lupus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, síndrome da fatiga crônica, fibromialgia); e doenças envolvendo distúrbios nos quais foi implicada uma disfunção colinérgica. Em algumas realizações the doença ou condição é selecionada do grupo consistindo em AD, demência do corpo de Lewy, angiopatia amilóide cerebral (CAA), amiloidose cerebral, demência fronto-temporal, demência vascular, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, demência fronto-temporal, demência vascular, demência por multi-infartos (MID), isquenia devida a derrame, MID combinada com derrame/isquemia/dano cerebral, MID e AD combinadas, AD e PD combinadas, dano cerebral humano, incapacidades de memória associada à idade, incapacidade cognitiva branda (MCI), MCI condutora a AD, distúrbio bipolar, mania, distúrbio de confusão agudo, distúrbio do déficit de atenção, estados paranóicos alucinatórios, distúrbios emocionais e de atenção, delírio pós-operatório (síndrome anticolinérgica após anestesia geral), antagonismo de efeitos adversos (tais como xerostomia, anomia, perda de memória e/ou confusão, psicose) de antidepressivos tricíclicos ou de certos fármacos (por exemplo, trihexifenidil) utilizados no tratamento de esquizofrenia e PD, esquizofrenia, distúrbio bipolar, mania, discinesia tardia, deficiência congênita de ornitina transcarbamilase, atrofia olivopontocerebelar, síndrome da abstinência alcoólica, coréia de Huntington, doença de Pick, ataxia de Friedrick, doença de Gilles de la Tourette, e síndrome de Down.

Definições

Por todo este relatório os termos e substituintes mantêm suas definições.

Alquil pretende incluir estruturas de hidrocarbonetos lineares, ramificadas ou cíclicas e combinações destas. Quando não de outra forma restrito, o termo refere-se a alquil de 20 átomos de carbono ou menos. Alquil inferior refere-se a grupos alquil de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquil inferiores incluem metil, etil, propil, isopropil, butil, s- e t-butil e semelhantes. Cicloalquil é um sub-conjunto de alquil e inclui grupos hidrocarbonetos cíclicos de 3, 4, 5, 6, 7, e 8 átomos de carbono. Exemplos de grupos cicloalquil incluem c-propil, c-butil, c-pentil, norbornil, adamantil e semelhantes.

Hidrocarbonetos Ci a C20 (por exemplo, Ci, C2, C3, C4, Cs, CÓ,C7, Cs, C9, Cw, Cu, C12, C13, C14, Cis, C16, c17, Cis, Ci9, C20) incluem alquil, cicloalquil, alquenil, alquinil, aril e combinações destes. Exemplos incluem benzil, fenetil, ciclohexilmetil, canforil e naftiletil. O termo "fenileno" refere-se a radicais orto, meta ou para de fórmulas:

Alcoxi ou alcoxil refere-se a grupos de 1,2, 3,4,5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono de uma configuração reta, ramificada, cíclica e combinações destas ligadas à estrutura parental através de um átomo de oxigênio. Exemplos incluem metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, ciclopropiloxi, ciclohexiloxi e semelhantes. Alcoxi inferior refere-se a grupos contendo de um a quatro carbonos. Para os propósitos do presente pedido de patente, alcoxi inclui também metilenodioxi e etilenodioxi nos quais cada átomo de oxigênio está ligado ao átomo, cadeia ou anel ao qual o grupo metilenodioxi ou etilenodioxi está ligado de maneira a formar um anel. Desta forma, fenil substituído por alcoxi pode ser, por exemplo,

Oxaalquil refere-se a radicais alquil nos quais um ou mais carbonos (e seus hidrogénios associados) foram substituídos por oxigênio. Exemplos incluem metoxipropoxi, 3,6,9-trioxadecil e semelhantes. O termo oxa-alquil deve ser entendido como na técnica art [cer Naming and Indexing of Chemical Substances for Chemical

Abstracts, publicado pela American Chemical Society, 11196, mas sem a restrição da 11127(a)], isto é, refere-se a compostos nos quais o oxigênio está ligado por meio de uma Içg simples a seus átomos adjacentes (formando ligações éter). Similarmente, tia-alquil e aza-alquil referem-se a radicais alquil nos quais um ou mais carbonos foram substituídos por enxofre ou nitrogênio, respectivamente. Exemplos incluem etilaminoetil e metiltiopropil.

Acil refere-se a grupos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 átomos de carbono de uma configuração reta, ramificada, cíclica, saturada, insaturada e aromática e combinações destas, ligados à estrutura parental através de uma funcionalidade carbonil. Um ou mais carbonos no radical acil podem ser substituídos por nitrogênio, oxigênio ou enxofre, desde que o ponto de ligação à estrutura parental pemanessa no carbonil. Exemplos incluem formil, acetil, propionil, isobutiril, t-butoxicarbonil, benzoil, benziloxicarbonil e semelhantes. Acil inferior refere-se a grupos contendo de um a quatro átomos de carbono.

Aril e heteroaril referem-se a anéis aromáticos ou heteroaromáticos, respectivamente, como substituintes. Heteroaril contém um, dois ou três heteroátomos selecionados de O, N, ou S. Ambos referem-se a anéis aromáticos ou heteroaromáticos monocíclicos de 5 ou 6 membros, anéis aromáticos ou heteroaromáticos bicíclicos de 9 ou 10 membros e anéis aromáticos ou heteroaromáticos tricíclicos de 13 ou 14 membros. Anéis carbocíclicos aromáticos de 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13 e 14 membros incluem, por exemplo,, benzeno, naftaleno, indano, tetralina, e fluoreno e os anéis heterocíclicos aromáticos de 5, 6, 7, 8, 9 e 10 membros incluem, por exemplo, imidazol, piridina, indol, tiofeno, benzopiranona, tiazol, furano, benzimidazol, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, pirimidina, pirazina, tetrazol e pirazol.

Arilalquil significa um radical alquil ligado a um anel aril. Exemplos são benzil, fenetil e semelhantes. Alquil, aril, cicloalquil, heterociclil, etc., substituídos referem-se a alquil, aril, cicloalquil, ou heterociclil onde até três átomos de H em cada radical são substituídos por halogênio, haloalquil, alquil, acil, alcoxialquil, hidroxialquil inferior, fenil, heteroaril, benzenosulfonil, hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi, carboxi, carboalcoxi (também chamado de alcoxicarbonil), alcoxicarbonilamino, carboxamido (também chamado de alquilaminocarbonil), ciano, carbonil, acetoxi, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, mercapto, alquiltio, sulfóxido, sulfono, sulfonilamino, acilamino, amidino, aril, benzil, heterociclil, fenoxi, benziloxi, heteroariloxi, hidroxiimino, alcoxiimino, oxa-alquil, aminosulfonil, tritil, amidino, guanidine, urefdo, e benziloxi.

O termo "halogênio" significa flúor, cloro, bromo ou iodo.

Na caracterização de alguns dos substituintes, é dito que certos substituinte podem se combinar para formar anéis. A não ser que afirmado diferentemente, pretende-se que tais anéis possam exibir vários graus de insaturação (desde completamente saturado até completamente insaturado), possam incluir heteroátomos e possam ser substituídos com alquil ou alcoxi inferiores.

O termo "métodos de tratamento ou prevenção" significa melhora, prevenção ou alívio dos sintomas e/ou efeitos associados com a doença, estado ou condição citados. O termo "prevenção" tal como utilizado aqui refere-se à administração de um medicamento antecipadamente de maneira a evitar ou obstruir um episódio agudo ou, no caso de uma condição crônica de maneira a reduzir a probabilidade ou seriedade da condição. O especialista no na técnica médica (ao qual as presentes reivindicações de método estão direcionadas) reconhece que o termo "prevenir" não é um termo absoluto. Na técnica médica se faz referência à administração profilática de um fármaco para reduzir substancialmente a probabilidade ou seriedade de uma condição, e é este o sentido que se aplica nas reivindicações do depositante. Conforme utilizada aqui, a referência a “tratamento” de um paciente pretende incluir profilaxia.

Por todo este pedido de patente, se faz referência a várias publicações. Cada uma das patentes, pedidos de patente, publicações de patente e outras publicações mencionadas são incorporadas aqui como referência em sua totalidade.

O termo “mamífero” é utilizado em seu sentido de dicionário. O termo “mamífero” inclui, por exemplo, camundongos, hamsters, ratos, vacas, ovelhas, porcos, cabras, e cavalos, macacos, cães, gatos, coelhos, cobaias, e primatas, incluindo humanos.

Os compostos descritos aqui podem conter um ou mais centros assimétricos e podem, desta forma, produzir enantiômeros, diastereômeros, e outras formas estereoisométricas. Cada centro quiral pode ser definido, em termos de estéreo química absoluta, como (R)- ou (S)-. A presente invenção pretende incluir todos tais possíveis isômeros, bem como misturas destes, incluindo formas racêmicas e oticamente puras. Isômeros (R)- e (S), (-) e (+), ou (D)- e (L)- oticamente ativos podem ser preparados utilizando-se sintons quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos utilizando-se técnicas convencionais.

Tal como utilizada aqui, e como deve ser entendido por um especialista no assunto, a citação a “um composto” pretende incluir sais, solvatos e complexos de inclusão deste composto, bem como qualquer forma estereoisomérica, ou uma mistura de quaisquer de tais formas deste composto em qualquer proporção. Desta forma, de acordo com algumas realizações da invenção, um composto tal como descrito aqui, incluindo no contexto composições farmacêuticas, métodos de tratamento e os compostos per se, é provido como a forma de sal. Sais adequados representativos incluem os sais formados com ácidos tais como ácido clorídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, lático, malêico, fumárico, tartárico, fórmico, palmítico, benzóico, glutárico, cólico, pamóico, múcico, D-glutâmico, d-canfórico, glicólico, ftálico, láurico, esteárico, oléico, salicílico, metanosulfônico, benzenosulfônico, sórbico, pícrico, cinâmico e semelhantes.

As representações gráficas de compostos racêmicos, ambiscalêmicos, escalêmicos ou enantiomericamente puros utilizadas aqui são tomadas da Maehr J. Chem. Ed. 62. 114-120 (1985): as cunhas quebradas são utilizadas para indicar a configuração absoluta de um elemento quiral; linhas onduladas indicam a negação de qualquer implicação estereoquímica que a ligação que representa poderia gerar; linhas em negrito sólidas e quebradas são descritores geométricos indicando a configuração relativa mostrada, mas indicando um caráter racêmico; e contornos em cunha e linhas pontilhadas ou quebradas indicam compostos enatiomericamente puros de configuração absoluta indeterminada. Desta forma, por exemplo, a fórmula W pretende englobar ambos os enantiômeros puros deste par:

, enquanto que a fórmula X pretende representar os quatro diastereômeros:

significa

O termo “excesso enantiomérico” é bem conhecido na técnica e é definido para uma resolução de ab em a+b como:

O termo “excesso enantiomérico” está relacionado ao termo mais antigo “pureza ótica” na medida em que ambos medem o mesmo fenômeno. O valor de ee será um número de 0 a 100, zero sendo o enantiômero único racêmico e 100 sendo puro. Um 15 composto que no passado seria tido como 98% oticamente puro, agora é mais precisamente descrito como 96%, em outras palavras, 96% ee; em outras palavras, um 90% ee reflete a presença de 95% de um enantiômero e 5% do outro no material em questão.

A não ser que indicado diferentemente, a configuração de qualquer dupla ligação canbono-carbono mostrada aqui que não seja parte de um anel é selecionada apenas por conveniência e não pretende designar uma configuração particular; desta forma, a não ser que indicado diferentemente, uma dupla ligação carbono-carbono não 5 anel mostrada arbitrariamente aqui como E pode ser Z, E ou uma mistura das duas em qualquer proporção. Similarmente, pretende-se que todas as formas tautoméricas estejam incluídas.

As abreviações Me, Et, Ph, Tf, Ts e Ms representam metil, etil, fenil, trifluormetanosulfonil, toluenosulfonil e metanosulfonil, respectivamente. As io abreviações e termos a seguir apresentam os significados indicados: abs = absoluto Ac = acetil ACN = acetonitrila Boc = t-butiloxicarbonil Bu = butil c- = ciclo CDI = carbo diimida conc. = concentrado DCM = diclorometano = cloreto de metileno = CH2CI2 DCC = diciclohexilcarbo diimida DMAP = 4-N,N-dimetilaminopiridina Et = etil FCC = cromatografia em coluna flash GC = cromatografia gasosa HOBt = hidroxibenzotriazol HPLC = cromatografia líquida de alta performance (ou alta pressão) i- = iso- IPA = álcool isopropílico Me = metil Ph ou K = fenil ppt. = precipitado Pr = propil rt = temperatura ambiente sat’d = saturado s- = secundário t- = terciário TEA = trietilamina THF = tetrahidrofurano TLC = cromatografia em camada delgada TMS = trimetilsilil tosil = p-toluenosulfonil Uma lista compreensiva das abreviações utilizadas por químicos orgânicos (isto é, especialistas no assunto) aparece na primeira edição de cada volume do Journal of Organic Chemistry. A lista, que é tipicamente apresentada em uma tabela intitulada “Standard List of Abbreviations”, é incorporada aqui como referência. 5 Os compostos de fórmula I são moduladores de mAChR Ml, isto é, se ligam a mAChR Ml e atuam ou como agonistas ou como antagonistas deste receptor. Em alguns casos, a modulação é alostérica, em alguns casos ortostérica, e em alguns casos ambas. Embora seja possível que os compostos de fórmula I sejam administrados como 10 o produto químico bruto, freqüentemente será preferível os apresentar como parte de uma composição farmacêutica (também chamada aqui de formulação). De acordo com uma realização da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável deste, em conjunto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e 15 opcionalmente um ou mais outros ingredientes terapêuticos. O(s) veículo(s) deve(m) ser “aceitável(eis)” no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao receptor. Além disto, como dito acima, o termo “composto” inclui também sais deste, de tal forma que as reivindicações independentes que citam “um composto” devem ser entendidas como se referindo também aos sais deste composto. Não obstante, se em uma reivindicação independente se fizer referência a “um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável deste”, deve ser entendido que as reivindicações que dependem desta reivindicação independente que se refere a tal composto inclui também os sais farmaceuticamente aceitáveis do composto, mesmo se não há referência explícita ao sal na reivindicação dependente.

As formulações incluem aquelas adequadas para administração oral, parenteral (incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e intra-articular), retal e tópica (incluindo dérmica, bucal, sublingual e intraocular). A rota mais adequada pode depender da condição e do distúrbio do receptor. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Tais métodos incluem a etapa de associar um composto de fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável deste (“ingrediente ativo”) com o veículo, que é constituído de um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas pela associação uniforme e íntima do ingrediente ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e então, se necessário, dando forma ao produto para a formulação desejada.

Formulações adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, pílulas ou tabletes cada uma contendo uma quantidade determinada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou uma emulsão líquida óleo-em-água ou emulsão líquida água-em-óleo. O ingrediente ativo pode ser também apresentado como bolus, eletuário ou pasta.

Um tablete pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Tabletes comprimidos podem ser preparados pela compressão em uma máquina adequada do ingrediente ativo em forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um ligante, lubrificante, diluente inerte, surfactante ou agente dispersante. Tabletes moldados podem ser feitos por moldagem em uma máquina adequada de uma mistura do composto pulverizado umedecido com um diluente líquido inerte. Os tabletes podem ser opcionalmente revestidos e podem ser formulados de tal forma a prover liberação sustentada, retardada ou controlada do ingrediente ativo. As composições farmacêuticas podem incluir um “veículo inerte farmaceuticamente aceitável”, e esta expressão pretende incluir um ou mais excipientes inertes, o que inclui amidos, polióis, agentes de granulação, celulose microcristalina, diluentes, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração, e semelhantes. Se desejado, as dosagens em tabletes das composições descritas podem ser revestidas por técnicas padrão aquosas ou não aquosas. “Veículo farmaceuticamente aceitável” engloba também meios de liberação controlada.

Formulações para administração parenteral incluem soluções injetáveis estéreis aquosas e não aquosas, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor alvo. Formulações para administração parenteral incluem também suspensões aquosas e não aquosas, que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multi-dose, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em condição de liofilização requerendo apenas a adição de um veículo líquido estéril, por exemplo, solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou semelhante, imediatamente antes do uso. Soluções injetáveis e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e tabletes estéreis o tipo previamente descrito.

As formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com os veículos usuais tais como manteiga de cacau ou polietilenoglicol.

As formulações para administração tópica na boca, por exemplo, bucal ou sublingual, inclui comprimidos compreendendo o ingrediente ativo em uma base flavorizada tal como sacarose e acácia ou tragacanto, e pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.

As composições farmacêuticas podem também opcionalmente incluir outros ingredientes terapêuticos, agentes anti-aglutinantes, conservantes, agentes adoçantes, corantes, flavorizantes, dessecantes, plastificantes, e semelhantes. Qualquer ingrediente opcional deve ser compatível com o composto de fórmula I de maneira a assegurar a estabilidade da formulação. A composição pode conter outros aditivos, conforme necessário, incluindo, por exemplo, lactose, glicose, frutose, trealose, sacarose, maltose, rafinose, melezitose, estaquiose, lactitol, palatinite, amido, xilitol, manitol, mioinositol, e semelhantes, e seus hidratos, e aminoácidos, por exemplo, alanina, glicina e betaína, e peptídeos e proteínas, por exemplo, albumina.

Exemplos de excipientes para uso como veículos farmaceuticamente aceitáveis e os veículos inertes farmaceuticamente aceitáveis e os ingredientes adicionais mencionados acima incluem, mas não se limitam a, cargas, desintegrantes, lubrificantes, agentes anti-microbianos, e agentes de revestimento. Deve ser entendido que em adição aos ingredientes particularmente mencionados acima, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica no que diz respeito ao tipo de formulação em questão, por exemplo, aqueles adequados para administração oral podem incluir, agentes flavorizantes.

A faixa de dosagem para humanos adultos geralmente é de 0,005 mg a 10 g/dia por via oral. Tabletes ou outras formas de apresentação providas em unidades individuais podem conter convenientemente uma quantidade do composto de fórmula I que seja efetiva em tal dosagem ou como um múltiplo da mesma, por exemplo, unidades contendo 5 mg a 500 mg, usualmente em torno de 10 mg a 200 mg. A quantidade precisa do composto administrada a um paciente será responsabilidade do médico. Entretanto, a dose empregada dependerá de um número de fatores, incluindo a idade e sexo do paciente, do distúrbio preciso sendo tratado, e de sua severidade.

Uma dosagem unitária (por exemplo, uma dosagem unitária oral) pode incluir, por exemplo, de 1 a 30 mg, 1 a 40 mg, 1 a 100 mg, 1 a 300 mg, 1 a 500 mg, 2 a 500 mg, 3 a 100 mg, 5 a 20 mg, 5 a 100 mg (por exemplo, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 85 mg, 90 mg, 95 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg) de um composto descrito acima. Para informação adicional a propósito de composições farmacêuticas e suas formulações, ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edição, 2000.

Os agentes podem ser administrados, por exemplo, por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea, injeção intraperitoneana, tópica, sublingula, intra-articular (nas articulações), intradérmica, bucal, oftálmica (incluindo intraocular), intranasal (incluindo a utilização de uma cânula), ou por outras rotas. Os agentes podem ser administrados oralmente, por exemplo, como um tablete ou pílula contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, gel, pélete, pasta, xaropem bolus, eletuário, cápsula, pó, grânulos, como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso, como uma emulsão líquida óleo-em-água ou emulsão líquida água-em-óleo, via uma formulação micelar (ver, por exemplo, o documento WO 97/11682) via uma formulação em lipossoma (ver, por exemplo, os documentos EP 736299, WO 99/59550 e WO 97/13500), via as formulações descritas no documento WO 03/094886 ou em alguma outra forma. Os agentes podem ser também administrados por via transdérmica (isto é, via emplastros do tipo reservatório ou do tipo matriz, micro-agulas, poração térmica, agulhas hipodérmicas, iontoforese, eletroporação ou outras formas de sonoforese, injeção por jato, ou uma combinação de quaisquer dos métodos precedentes (Prausnitz et al. 2004, Nature Reviews Drug Discovery 3:115)).

Os agentes podem ser administrados localmente. Os agentes podem ser revestidos em um stent. Os agentes podem ser administrados utilizando-se técnicas de injeção transdérmica de partícula de alta velocidade utilizando-se a formulação em partícula de hidrogel descrita no documento US 20020061336. Formulações de partículas adicionais são descritas nos documentos WO 00/45792, WO 00/53160, e WO 02/19989. Um exemplo de uma formulação transdérmica contendo gesso e o promotor de absorção dimetilisosorbeto pode ser encontrado no documento WO 89/04179. O documento WO 96/11705 provê formulações adequadas para administração transdérmica. Os agentes podem ser administrados na forma de um supositório ou por outro meio vaginal ou retal.

Os agentes podem ser administrados em uma formulação transmembrana como descrita no documento WO 90/07923. Os agentes podem ser administrados via não invasiva das partículas desidratadas descritas na patente US 6.485.706. O agente pode ser administrado em uma formulação de fármaco entérico revestido como descrito no documento WO 02/49621. Os agentes podem ser administrados por via intranasal utilizando-se a formulação descrita na patente US 5.179.079. Formulações adequadas para injeção parenteral são descritas no documento WO 00/62759. Os agentes podem ser administrados utilizando-se a formulação de caseína descrita nos documentos US 20030206939 e WO 00/06108. Os agentes podem ser administrados utilizando-se as formulações particuladas descritas no documento US 20020034536.

Os agentes, separados ou em combinação com outros componentes adequados, podem ser administrados por rota pulmonar utilizando-se várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, instilação intratraqueal (administração de solução aos pulmões por seringa), administração intratraqueal de lipossomas, insuflação (administração de formulação em pó por seringa ou qualquer outro dispositivo similar nos pulmões) e inalação com aerossol. Aerossóis (por exemplo, nebulizadores a jato ou ultrassónicos, inaladores de dose medida (IDMs), e inaladores de pó seco (IPSs)) podem ser também utilizados em aplicações intranasais. As formulações em aerossol são dispersões ou suspensões estáveis de material sólido e gotículas líquidas em um meio gasoso e podem ser colocadas em propelentes aceitáveis pressurizados, tais como hidrofluoralcanos (HFAs, isto é, HF A-134a e HFA-227, ou uma mistura destes), diclorodifluormetano (ou outros propelentes de clorofluorcarbono tais como uma mistura de Propelentes 11, 12, e/ou 114), propano, nitrogênio, e semelhantes. Formulações pulmonares podem incluir amplificadores de permeação tais como ácidos graxos, e sacarídeos, agentes quelantes, inibidores de enzima (por exemplo, inibidores de protease), adjuvantes (por exemplo, glicolato, surfactina, span 85 e nafamostato), conservantes (por exemplo, cloreto de benzalcônio ou clorobutanol), e etanol (normalmente até 5%, mas possivelmente até 20%, em peso). O etanol é comumente incluído em composições de aerossol na medida em que pode melhorar a função da válvula medidora e em alguns casos aumentar a estabilidade da dispersão. As formulações pulmonares podem incluir também surfactantes que incluem, mas não se limitam a, sais biliares e aqueles descritos na patente US 6.524.557 e suas referências. Os surfactantes descritos na patente US 6.524.557, por exemplo, um sal de ácido graxo CS-IÓ, um sal biliar, um fosfolipídeo, ou alquil sacarídeo são vantajosos no fato de que alguns deles sabidamente são também amplificadores de absorção do composto na formulação. Também adequados na invenção são formulações de pó seco compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva do composto ativo misturado com um veículo apropriado e adaptada para uso em conexão com um inalador de pó seco. Amplificadores de absorção que podem ser adicionados às formulações de pó seco da presente invenção incluem aqueles descritos na patente US 6.632.456. O documento WO 02/080884 descreve novos métodos para a modificação superficial de pós. As formulações em aerossol podem incluir as descritas nas patentes US 5.230.884, US 5.292.499, documentos WO 017/8694, WO 01/78696, US 2003019437, US 20030165436, e WO 96/40089 (que incluem óleos vegetais).

Formulações de liberação sustentada adequadas para inalação são descritas nos documentos US 20010036481A1, 20030232019A1, e US 20040018243Al, bem como nos documentos WO 01/13891, WO 02/067902, WO 03/072080, e WO 03/079885. Formulações pulmonares contendo micropartículas são descritas nos documentos WO 03/015750, US 20030008013, e WO 00/00176. Formulações pulmonares contendo pó estável em estado vítreo são descritas nos documentos US 20020141945 e na patente US 6.309.671. Outras formulações em aerossol são descritas nos documentos EP 1338272A1, WO 90/09781, nas patentes US 5.348.730, US 6.436.367, documento WO 91/04011, e patentes US 6.294.153 e US 6.290.987 que descrevem uma formulação a base de lipossoma que pode ser administrada via via aerossol ou outro meio. Formulações em pó para inalação são descritas nos documentos US 20030053960 e WO 01/60341. Os agentes podem ser administrados por via intranasal como descrito no documento US 20010038824.

Soluções de medicamentos em solução salina tamponada e veículos similares são comumente empregadas para gerar um aerossol em um nebulizador. Nebulizadores simples operam no princípio de Bernoulli e empregam uma corrente de ar ou oxigênio para gerar as partículas de aspersão. Nebulizadores mais complexos empregam ultrassom para criar as partículas de aspersão. Ambos os tipos são bem conhecidos na técnica e são descritos em livros texto padrão de farmácia tais como “American Pharmacy” de Sprowls e “The Science and Practice of Pharmacy” de Remington. Outros dispositivos para gerar aerossóis empregam gases comprimidos, usualmente hidrofluorcarbonetos e clorofluorcarbonetos, que são misturados com o medicamento e quaisquer excipientes necessários em um recipiente pressurizado, estes dispositivos são da mesma forma descritos em livros texto padrão tais como Sprowls e Remington.

Deve ser observado também que de acordo com algumas realizações da presente invenção, os compostos de fórmula I podem ser utilizados em combinação com outros agentes ativos. Terapia de combinação pode ser obtida pela administração de dois ou mais agentes, cada um dos quais é formulado e administrado separadamente, ou por administração dos dois ou mais agentes em uma formulação única. Por exemplo, dois agentes podem ser formulados juntos e administrados em conjunção com uma formulação separada contendo um terceiro agente. Embora os dois ou mais agentes em uma terapia de combinação possam ser administrados simultaneamente, não necessitam ser. Por exemplo, a administração de um primeiro agente (ou combinação de agentes) pode preceder a administração de um segundo agente (ou combinação de agentes) em minutos, horas, dias ou semanas. Desta forma, os dois ou mais agentes podem ser administrados em minutos entre si ou em 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, ou 24 horas entre si ou em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 dias entre si ou entre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 semanas entre si. Em alguns casos intervalos ainda mais longos são possíveis. Embora em muitos casos seja desejável que os dois oi mais agentes utilizados em uma terapia de combinação estejam presentes no corpo do paciente ao mesmo tempo, isto não é necessário. A terapia de combinação pode incluir também duas ou mais administrações de um ou mais dos agentes utilizados na combinação. Por exemplo, se o agente X e o agente Y são utilizados em uma combinação. Se poderia os administrar seqüencialmente em qualquer combinação uma ou mais vezes, por exemplo, na ordem X-Y-X, X-X-Y, Y- X-Y, Y-Y-X, X-X-Y-Y, etc. A Tabela 1 lista compostos representativos das realizações da invenção.

Será observado que como moduladores do receptor muscarínico Ml, os compostos de acordo com as realizações da invenção podem ser utilizados para tratar doenças em um mamífero associadas com a função colinérgica incapacitada ou doenças em que há um desequilíbrio na função colinérgica, ou doenças com atividade incapacitada dos receptores de acrtilcolina do grupo consistindo em demência senil do tipo Alzheimer, doença de Alzheimer (AD); demência do corpo de Lewy, doença de Alzheimer misturada com doença de Parkinson; demência por multi-infartos (MID); demência fronto-temporal; demência vascular; derrame/isquemia; MID combinada com derrame/isquemia/dano cerebral, MID e AD combinadas; AD e PD combinadas; dano cerebral humano, incapacidades de memória associada à idade; incapacidade cognitiva branda (MCI); MCI condutora a AD, disfunção cognitiva (incluindo esquecimento, distúrbios de confusão aguda, distúrbios de distúrbio do déficit de atenção, distúrbios de focalização e concentração) estados paranóicos alucinatórios; distúrbios emocionais e de atenção; distúrbios do sono; delírio pós-operatório; efeitos adversos de antidepressivos tricíclicos; efeitos adversos de certos fármacos utilizados no tratamento de esquizofrenia e doença de Parkinson; xerostomia, ano mia, perda de memória e/ou confusão; psicose, esquizofrenia em comordidade com AD, esquizofrenia estabelecida tardia, parafrenia, distúrbios esquizofreniformes, ansiedade; distúrbios bipolares, mania, estabilização de humor; incapacidade cognitiva após remoção de certos gliomas; discinesia tardia; estresse oxidativo durante terapia com oxigênio; afasia; síndrome amnésica pós- encefalítica; demência por AIDs; incapacidades de memória em doenças auto-imunes incluindo lupus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, síndrome da fadiga crônica, e fibromialgia; incapacidades de memória em depressão atípica ou esquizofrenia; dor, reumatismo, artrite e doenças terminais; xeroftalmia; secura vaginal, secura dérmica; disfunções imunes; distúrbios da neurocrina e desregulagem da ingestão de alimentos, incluindo bulimia e anorexia; obesidade; deficiência congênita de ornitina transcarbamilase, atrofia olivopontocerebelar, síndrome da abstinência alcoólica, vício de substâncias incluindo sintomas de abstinência e terapia de substituição; coréia de Huntington,paralisia supranuclear progressiva; doença de Pick, ataxia de Friedrick, doença de Gilles de la Tourette, e síndrome de Down; glaucoma; presbiopia; distúrbios autonômicos incluindo disfunção e função da mobilidade gastrintestinal tal como doença inflamatória dos intestinos, síndrome dos intestinos irritáveis, diarréia, constipação, secreção gástrica ácida e úlceras; incontinência urinária, asma, DPOC. Os compostos de acordo com realizações da invenção podem ser também utilizados na preparação de medicamentos para tais tratamentos.

Similarmente, será observado que como modladores do receptor muscarínico Ml, os compostos de acordo com as realizações da invenção podem ser utilizados para prevenir ou tratar doenças do sistema nervoso central ou periférico devida a disfunção de um ou mais do que se segue: cérebro, sistema nervoso, sistema cardiovascular, sistema imunológico, sistema neurócrino, sistema gastrintestinal, ou glândulas endócrinas e exócrinas, olhos, córnea, pulmões, ou outros órgãos em que a função colinérgica é mediada por sub-tipos do receptor muscarínico, onde a dita disfunção envolve: distúrbios mediados por amilóide cerebral; distúrbios mediados pela glicogênio sintase quinase (GSK3p); danos, disfunções ou doenças mediados pela hiperfosforilação da proteína tau; danos, disfunções ou doenças mediados por hipercolesterolemia e/ou hiperlipidemia do SNC ou SNP; anomalias da sinalização mediadas por Wnt; incapacidade da neuroplasticidade; hiperglicemia; diabete; doenças mediadas por fatores de crescimento endógenos, ou combinações de fatores de risco adicionais; ou doenças que envolvem a apolipoproteína E; ou distúrbios nos quais uma disfunção colinérgica foi implicada, incluindo: demência senil do tipo Alzheimer, doença de Alzheimer (AD), retardo do estabelecimento dos sintomas de AD em um paciente em risco de desenvolver AD, demência do corpo de Lewy, angiopatia amilóide cerebral (CAA), amiloidose cerebral, demência fronto-temporal, demência vascular, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, demência por multi-infartos (MID), isquenia devida a derrame, MID combinada com derrame/isquemia/dano cerebral, MID e doença de Alzheimer combinadas, incapacidades de memória associada à idade, incapacidade cognitiva branda (MCI), MCI condutora a AD, distúrbio bipolar, mania, esquizofrenia, esquizofrenia não afetiva, parafrenia, disfunções imunológicas, distúrbios neurócrinos e desregulação da ingestão de alimentos, incluindo bulimia e anorexia, controle de peso, obesidade, inflamação. Os compostos de acordo com as realizações da invenção podem ser também utilizados na preparação de medicamentos para tais tratamentos.

Métodos de Síntese

Em geral, os compostos de fórmula I podem ser preparados pelos métodos ilustrados nos esquemas reacionais gerais, por exemplo, como descritos abaixo, ou por modificações destes, utilizando-se materiais de partida e reagentes facilmente disponíveis e procedimentos de síntese convencionais. Nestas reações, é também possível se fazer uso de variantes que são em si conhecidas, mas não são mencionadas aqui.

Os processos para a obtenção de compostos de fórmula I são apresentados abaixo. Outros compostos de fórmula I podem ser preparados de modo análogo àqueles cuja síntese é exemplificada aqui. Os procedimentos abaixo ilustram tais métodos.

Além disto, embora as sínteses mostradas aqui possam resultar na preparação de enantiômeros apresentando uma estequiometria particular, estão incluídos no escopo da presente invenção compostos de fórmula I em qualquer forma estequiométrica, e a preparação de compostos de fórmula I em formas estequiométricas outras que não as mostradas aqui é óbvia para um especialista nas técnicas químicas com base nos procedimentos apresentados aqui.

Os compostos de fórmula I podem ser sintetizados a partir dos compostos correspondentes nos quais H está presente em vez de R5, como ilustrado no Esquema 1 abaixo:

O acoplamento de aminas e ácido 3-indolcarboxílico pode ser realizado por meio da ativação do radical ácido ou por diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou uma io combinação de DCC e 1-hidroxibenzotriazol (HOBT). O acoplamento de aminas e ácido 3,5-di-íerí-butil-4-hidroxibenzóico pode ser realizado por meio da ativação do radical ácido pela combinação de DCC e 1-hidroxibenzotriazol (HOBT). O acoplamento de aminas e cloreto de valproil ou cloreto de /?-fluorbenzenosulfonil para produzir a mina substituída correspondente pode ser efetuado na presença de base (trietilamina ou hidreto de sódio).

Os compostos amino precursores podem por sua vez ser preparados como descrito em mais detalhes abaixo. Desta forma, por exemplo, o 2,8-dimetil-l-oxa-3,8- diaza-spiro[4.5]decano pode ser obtido pela reação de 4- aminometil-l-metil-piperidin- 4-ol com acetaldeído em diclorometano. O 2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]- decano pode ser obtido pela reação de l-amino-2-propanol com l-metil-4-piperidona sob refluxo. O l’,4-dimetil-spiro[3-oxa-6-azabiciclo[3.1.0]hexano-2,4’-piperidina] pode ser obtido preparando-se primeiro o 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima a partir de l-metil-4- piperidona via 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona pelo procedimento de Tsukamoto et al., Chem. Pharm. Buli. 1995, 43, 842-852, seguido da redução da oxima com Red-Al (bis(2- metoxietoxi)aluminohidreto de sódio) e então manipulação básica para produzir l’,4-dimetilspiro[3-oxa-6- azabiciclo[3.1.0]hexano- 2,4’-piperidina]. O 2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3-ilamina pode ser obtido primeiro preparando-se o 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima a partir de l-metil-4-piperidona via 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona pelo procedimento de Tsukamoto et al., Chem. Pharm. Buli. 1995, 43, 842-852, seguido da redução da oxima com hidreto de lítio/cloreto de alumínio. Os compostos de fórmula I podem então ser preparados a partir destas aminas por uma reação de acoplamento apropriada.

Na preparação de compostos de fórmula I, podem ser empregados métodos conhecidos dos químicos orgânicos, tais como métodos para a formação de anéis de cinco membros, substituição de anel, alteração do grau de saturação/insaturação do anel, interconverção de sais e bases, e assim em diante. Nestes métodos sintéticos. Os materiais de partida podem conter um centro quiral e, quando é empregado um material de partida racêmico, o produto resultante é geralmente uma mistura dos enantiômeros R e S. Alternativamente, um isômero quiral do material de partida pode ser empregado e, se o protocolo da reação empregado não racemiza este material de partida, é obtido um produto quiral. Tais protocolos de reação podem envolver a inversão do centro quiral durante a síntese. Nos casos em que racematos ou misturas de diastereômeros são obtidos, as diferentes formas estereoisoméricas podem ser separadas por métodos conhecidos na técnica. Alternativamente, um dado isômero pode ser obtido por síntese estereoespecífica ou assimétrica. Deve ser observado, assim, que embora métodos típicos de preparação de certos compostos da invenção sejam descritos, outros métodos podem ser também aplicados para a preparação dos presentes compostos, como será de conhecimento de um especialista no assunto.

Exemplos

De maneira a facilitar a preparação de novos compostos de acordo com as realizações da invenção, foram sintetizados várias estruturas espiro bicíclicas rígidas: 2,8-Dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]decano foi obtido a partir da redução de 2,8- dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-2-eno com cianoborohidreto de sódio em metanol. 2,8-Dimetil-l-oxa-3,8-diaza-spiro[4.5]decano foi obtido pela reação de 4- aminometil-l-metil-piperidin-4-ol com acetaldeído em diclorometano seco. 2,8-Dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]decano foi obtido pela reação de l-amino-2- propanol com l-metil-4-piperidona sob refluxo. r,4-Dimetilspiro[3-oxa-6-azabiciclo[3.1.0]hexano-2,4’-piperidina] foi obtido em várias etapas. Primeiro, 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima foi preparado a partir de l-metil-4-piperidona via 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3- ona de acordo com o procedimento de Tsukamoto et al.,Chem. Pharm. Buli. 1995, 43, 842-852. A redução da oxima com Red-Al seguida da manipulação básica produziram o composto título. 2,8-Dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3-ilamina foi obtido em várias etapas. Primeiro, 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima foi preparada a partir de l-metil-4-piperidona via 2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]-decan-3-ona de acordo com o procedimento de Tsukamoto et al., Chem. Pharm. Buli. 1995, 43, 842-852. A redução da oxima com LÍAIH4/AICI3 produziu o composto título. 2,8-Dimetil-l-tia-8-aza-spiro[4.5]dec-3-ilamina foi obtida em várias etapas. Primeiro, 2,8-dimetil-l-tia-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima foi preparada a partir de 1- metil-4-piperidona via 2,8-dimetil-l-tia-8-azaspiro[4.5]-decan-3-ona. A redução da oxima com Red-Al seguida da manipulação básica produziu o composto título. A não ser que apontado diferentemente, os reagentes e solventes foram utilizados tal como recebidos dos fornecedores comerciais. Os espectros de ressonância magnética nuclear de próton (NMR) foram obtidos em espectrômetros Bruker Avance- 300 e Bruker-500 a 300 ou 500 MHz, respectivamente. Os espectros são registrados em ppm (δ) e as constantes de acoplamento, J, são registradas em Hertz. Tetrametilsilano (TMS) foi utilizado como padrão interno. As seguintes abreviações são utilizadas no registro dos dados de NMR: s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, m = multiplet, br = amplo. Os espectros de 13C-NMR foram registrados em espectrômetros Bruker Avance-300 e Bruker-500. Os espectros de massa foram coletados utilizando-se um espectrômetro de massa UG 70 USEQ. Os espectros de GC-MS foram registrados com o espectrômetro Varian Saturan 2000 GC-MS/MS. Os espectros de infravermelho (IR) foram registrados em um espectrofotômetro Nicolet 380 FT-IR com Smart Multi- Bounce ZnSe HATR. Todos os solventes e reagentes foram de grau analítico. A análise da pureza química de nosso NCE foi registrada com HPLC FINNIGAN Surveyor. Exemplo 1: Síntese de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro-[4.5]decano:

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4,5]dec-2-eno (10,4 ml, 60 mmol) em metanol (150 ml) à temperatura ambiente, foi adicionado verde de bromocresol (5 mg) e a solução se tornou azul. Foi adicionado 4N HCl/MeOH à solução sob agitação até a cor se alterar para amarelo. Foi então adicionado cianoborohidreto de sódio (3,9 g, 62 mmol) de uma só vez e a mistura resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 2 h. Durante este período, cada vez que açor se alterou para verde, foi adicionado mais 4N HCl/MeOH para manter a cor da solução amarela. Ao final deste tempo, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para produzir um óleo azul-esverdeado. Foi adicionado diclorometano (100 ml) ao resíduo e a mistura foi lavada com 2N NaOH (50 ml). As duas fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (100 ml). As fases orgânicas foram combinadas, secadas com sulfato de magnésio anidro, filtradas e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2C12/MeOH/NH4OH 90/10/1) para produzir o composto título (2,18 g) como um óleo quase incolor. 'H NMR (CDC13, 500 MHz) Ô 4,61 (q, J = 6,18 Hz, 1H, CHCH3), 3,10 (d, J = 12,6 Hz, 1H, CHHNH), 2,74 (d, J = 12,6 Hz, 1H, CHHNH), 2,27- 2,19 (m, 1H), 2,23 (s, 3H, NCH3), 2,10 (m, 2H), 1,85-1,70 (m, 5H), 1,46 (d, J = 6,18 Hz, 3H, CH3CH) ppm. Exemplo 2: Síntese de 2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diaza-spiro[4.5]decano

A uma solução de 4-aminometil-l-metil-piperidin-4-ol (2,127 g, 14,77 mmol) em diclorometano (15 ml) foi adicionado sulfato de magnésio anidro (2,9 g). A mistura resultante foi resfriada para 0°C e foi adicionado acetaldeído recentemente destilado (835 □!, 14,78 mmol). Após 6h de agitação à temperatura ambiente, a mistura foi filtrada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para produzir o composto título (2,16 g) como um líquido quase incolor. NMR (CDCI3, 500 MHz) δ 4,60 (q, J = 5,40 Hz, 1H, CHCH3), 3,01 (d, J = 12 Hz, 1H, C77HNH), 2,76 (d, J = 12 Hz, 1H, CHHNH), 2,55-2,31 (m, 4H, CH2N), 2,28 (s, 3H, NCH3), 1,77-1,58 (m, 4H, CH2CO), 1,36 (d, J = 5,40 Hz, 3H, CH3CH) ppm; 13C NMR (CDCI3, 300 MHz) Ô 87,57 (CH), 57,19 (CH2), 53,14 (C), 52,96 (CH2), 46,15 (CH3), 37,28 (CH2), 35,73 (CH2), 20,32 (CH3) ppm. Exemplo 3: Síntese de 2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]decano

Uma mistura de l-amino-2-propanol (9,2 ml, 1,2 mmol) e l-metil-4-piperidona (11,5 ml, 1,0 mmol) foi aquecida sob refluxo por 2 h e deixada por uma noite à temperatura ambiente. A mistura reacional foi destilada sob pressão reduzida (~15 mmHg). O composto título foi coletado a 82-95°C. *H NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 4,02 (m, 1H, OCH), 3,25 (dd, J = 11,9, 6,3Hz, 1H, CHW), 2,68 (dd, J = 11,9, 6,6 Hz, 1H, Cí/H), 2,4-2,6 (m, 4H-piperidina), 2,1 (s, 3H, NCH3), 1,65-1,81 (m, 4H-piperidina), 1,21 (d, J = 6,1 Hz, 3H, CH3CH) ppm. Exemplo 4: Síntese de 4-dimetil-spiro-(3-oxa-6-azabiciclo[3.1.0]hexano-2.4,-piperidina)

Red-Al (solução 65% em tolueno, 5,4 ml) foi adicionado gota-a-gota a uma solução de 2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]decan-3-ona oxima (1,5 g, 7,6 mmol) em THF seco (39 ml) e a mistura reacional foi posta sob agitação durante uma noite à temperatura ambiente. A mistura reacional foi resfriada (água gelada) e decomposta por adições sucessivas de água (1,6 ml), NaOH aquoso 15% (1,6 ml) e água (4,6 ml). Foi adicionado tetrahidrofurano (THF) (40 ml) e os sólidos foram retirados por filtração em Celite. O filtrado de THF foi concentrado sob pressão reduzida. O óleo residual foi dissolvido em diclorometano, secado e evaporado. Cromatografia flash (sílica, CHCIs/MeOH/NfLjOH 60/40/1) do resíduo produziu a amina título (aparentemente como dois isômeros). ^-NMR (D2O/CDCI3, 300 MHz) δ 4,13 e 4,06 (dois q, J = 6,7 e J = 6,2 Hz, 1H, dois OCH), 2,54-2,33 (m, 6H), 2,27 (s, 3H, NCH3), 1,77-1,65 (m, 4H), 1,24 e 1,20 (dois d, J = 6,7 e J = 6,2Hz, 3H, CH3) ppm; GC-MS (Cl) 6,95 min - 183(M+1) e 6,64 min -183(M+1) para C10H18N2O. Exemplo 5: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propan-l-ona (AF710)

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano (2,18 g, 11,7 mmol) em diclorometano (230 ml) à temperatura ambiente foi adicionada diciclohexilcarbodiimida (DCC) (3,24 g, 15,7 mmol) seguida da adição de ácido 3- indolepropiônico (2,87 g, 15,2 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Durante a reação um sólido branco foi precipitado. Após a filtração, o solvente foi evaporado e o produto brito foi purificado por cromatografia flash (sílica, C^Ch/EtOH/NFUOH 90/10/1) para produzir o AF710 (2,5 g, 100% de pureza química) como um sólido branco. ÃH NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,17 (br s, 1H, NH-indol), 7,60 (d, J = 7,81 Hz, 1H, CHC arom), 7,35 (d, J = 8,08 Hz, 1H, CHC arom), 7,19 (ap. t, J = 7,53 Hz, 1H, CHCH arom), 7,12 (ap. t, J = 7,45 Hz, 1H, CHC/7 arom), 7,02 (d, J = 1,86 Hz, 1H, C//NH arom), 5,52, 5,09 (2q, J = 6,15 e J = 6,22 Hz, 1H, CHCH3), 4,62, 3,66 (2d, J = 11,76 e J = 11,5 Hz, 1H, CHHNCO), 3,29, 3,08 (2d, J = 11,48 e J = 12,0 Hz, 1H, CHHNCO), 3,18-3,11 (m, 2H), 2,72-2,66 (m, 2H), 2,64-2,46 (m, 2H), 2,26, 2,25 (2s, 3H, NCH3), 2,32-2,19, 2,12-2,02 (2m, 2H), 1,87-1,80, 1,68-1,51 (2m, 4H), 1,48,1,43 (2d, J= 6,21 e J= 6,19 Hz, 3H, CH3-CH) ppm; 13C NMR (CDCI3, 500 MHz) δ 170,58 (C), 136,39 (C), 127,25 (C), 122,19 (CH), 121,80 (CH),119,52 (CH), 118,73 (CH), 115,17 (C), 111,31 (CH), 57,48, 57,19 (CH), 55,46 (C), 54,55, 54,12 (CH2), 53,11, 52,86 (CH2), 46,21, 46,15 (CH3), 38,05, 37,32 (CH2), 36,82, 36,31 (CH2), 34,41 (CH2), 25,44, 23,47 (CH3), 21,04, 20,96 (CH2) ppm.

Exemplo 6: Separação quiral de AF710A e AF710B

A separação de AF710 de seus enantiômeros foi realizada por HPLC em uma colune semipreparativa. Foram injetados 200 Dl de uma solução de AF710 em metanol (50 mg/ml) na coluna e esta foi eluída. Após a eluição, o eluente foi evaporado à secura. HPLC: Merck-Hitachi modelo L-62000A. Detector: Merck-Hitachi modelo L-4250. Coluna: Chiralcel OJ-H, 250x10 mm. Taxa de fluxo: 4 ml/min. Temperatura da Coluna: temperatura ambiente. Fase Móvel: Hexano/Etanol 85:15. Concentration: 50 mg/ml. Detecção UV: 255 nm. Primeiro enantiômero a eluir (AF710A): 99% ee; rotação específica [a] = + 60° (C = 0,415, Metanol) Segundo enantiômero a eluir (AF710B): 99% ee; rotação específica [a] = -56° (C = 0,303, Metanol). Exemplo 7: Síntese de 3-f4-fluorbenzenosuAfonvA)- 2-8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiror4-5A-decano fAF716<*>)

2,8-Dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano (573 mg, 3,08 mmol) foi dissolvido em diclorometano seco (2 ml) sob atmosfera de argônio. Foi adicionada trietilamina destilada (644 ül, 4,62 mmol) e a solução resultante foi resfriada para 0°C. Uma solução de cloreto de p-fluorbenzenosulfonil (600 mg, 3,08 mmol) em diclorometano seco (2 ml) foi adicionada gota-a-gota com uma seringa. O frasco reacional foi deixadoaquecer para a temperatura ambiente com agitação, e um sólido branco começou a precipitar. Após 1 h sob agitação, foi adicionado diclorometano (50 ml) e a solução resultante foi lavada com água (2x10 ml). A fase orgânica foi secada com sulfato de magnésio anidro, filtrada e evaporada para produzir a mistura bruta como um óleo. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2C12/MeOH/NH4OH 93/7/1) para produzir o AF716 (496 mg, 98,8% de pureza química) como um pó esbranquiçado. ]H NMR (CDC13, 300 MHz) δ 7,89-7,85 (m, 2H, dois CHCSO2), 7,27- 7,19 (m, 2H, CHCF), 5,02 (q, J = 6,12 Hz, 1H, CH-CH3), 3,66 (d, J = 11,37 Hz, 1H, CHHNS), 3,48 (d, J = 11,37 Hz, 1H, CHHNS), 2,72-2,50 (m, 2H, CH2NCH3), 2,25 (s, 3H, NCH3), 2,16-2,07 (m, 2H, CH2NCH3), 1,95-1,88 (m, 2H, CH2CS), 1,55 (d, J = 6,12 Hz, 3H, CH3CH), 1,48 (m, 2H, CH2CS) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) Ô 166,92 e 163,54 (C), 130,05 (CH), 129,93 (CH), 129,58 (C), 116,60 (CH), 116,30 (CH), 60,76 (C), 60,24 (CH), 54,05 (CH2), 53,22 (CH2), 46,03 (CH3), 37,16 (CH2), 37,05 (CH2), 25,56 (CH3) ppm. Exemplo 8: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-2-propilpentan-l-ona (AF717)

2,8-Dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]decano (982 mg, 5,28 mmol) foi dissolvido em diclorometano seco (5 ml) sob atmosfera de argônio. Foi adicionada trietilamina destilada (1,10 ml, 7,92 mmol) e a solução resultante foi resfriada para 0°C. Fopi adicionado cloreto de valproil (910 mg, 5,60 mmol) gota-a-gota com uma seringa. O frasco reacional foi deixado aquecer para a temperatura ambiente com agitação, e um sólido branco começou a precipitar. Após 4 h sob agitação, foi adicionado diclorometano (100 ml) e a solução resultante foi lavada com água (10 ml). As duas fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (2 x 50 ml). As fases orgânicas combinadas foram secadas com sulfato de sódio, filtradas e evaporadas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, CHzClz/EtOH/NELjOH 150/10/1) para produzir o AF717 (521 mg, 99,2% de pureza química) como um pó esbranquiçado. 1H NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 5,53, 5,26 (2q, J = 6,12 e J = 6,3 Hz, 1H, CHCH3), 4,67, 3,90 (2d, J = 12,0 e J = 11,35 Hz, 1H, CHHNCO), 3,48, 3,09 (2d, J = 11,35 e J = 12,0 Hz, 1H, CHWNCO), 2,78-2,59 (m, 2H, CH2N), 2,53- 2,47 (m, 1H, CHCO), 2,30, 2,19 (2s, 3H, NCH3), 2,15-2,05 (m, 2H, CH2N), 2,02-1,84 (m, 2H, CH2CS), 1,74-1,61 (m, 4H, CH2CHCO), 1,55, 1,50 (2d, J = 6,3 e J = 6,12 Hz, 3H, CH3CH), 1,44-1,36 (m, 2H, CH2CS), 1,34-1,21 (m, 4H, CH2CH3), 0,93-0,87 (m, 6H, CH3CH2) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) δ 174,35, 174,04 (C), 59,13 (C), 57,35, 57,19 (CH), 54,52, 54,06 (CH2), 53,13, 52,77 (CH2), 46,09 (CH3), 43,77, 42,55 (CH), 38,37, 37,58 (CH2), 37,04, 36,20 (CH2), 35,76, 35,35 (CH2), 35,08, 34,77 (CH2), 26,01, 23,01 (CH3), 21,08, 20,98 (CH2), 20,73, 20,56 (CH2), 14,27, 14,22 (CH3) ppm. Exemplo 9: Síntese de (3,5-di-tert-butil-4-hidroxi-fenil)-(2,8-dimetil-l-tia-3,8- diazaspiro[4.5]dec-3-il)-metanona (AF723)

Uma solução de diciclohexilcarbodiimida (985 mg, 4,77 mmol) em diclorometano seco e destilado (10 ml) foi adicionada a uma uma solução sob agitação de ácido 3,5-di-terí-butil-4-hidroxibenzíico (1,14 g, 4,55 mmol) em diclorometano (15 ml) à temperatura ambiente sob atmosfera de argônio. A diciclohexiluréia começou a precipitar como um sólido branco. Foi adicionado 1-hidroxibenzotriazol (645 mg, 4,77 mmol) e a solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 5 min. Foi então adicionado 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano (846 mg, 4,55 mmol) em diclorometano (5 ml) e a mistura resultante foi mantida à temperatura ambiente durante uma noite. No dia seguinte a mistura foi aquecida a 30°C (temperature do banho de água) por 5 horas e então mantida à temperatura ambiente por mais 4 dias. A suspensão resultante foi filtrada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2C12/EtOH/NH4OH 140/10/1) para produzir duas frações: AF723 (224 mg, 99,16% de pureza química) e uma mistura de AF723 com um sub-produto (943 mg). A mistura de AF723 com sub-produto foi purificada por cromatografia flash em um sistema COMBI-flash utilizando gradiente linear (sílica, CH2C12/EtOH/NH4OH 220/10/1 a 140/10/1). Após a evaporação e secagem a vácuo, o AF723 (516 mg, 100% de pureza química) foi obtido como um sólido branco. ]HKMR (CDC13, 500 MHz) δ 7 (s, 2H, arom CH), 5,55 (m, 1H, CH- S), 5,44 (s, 1H, OH), 4,10 (m, 1H, CHH-N-CO), 3,40 (m, 1H, CHH-N-CO), 2,60 (m, 2H, C/Z2-NCH3), 2,28 (m, 1H, CHH-NCH3), 2,25 (s, 3H, NCH3), 2,11 (m, 1H, CHH- NCH3), 1,95-1,66 (m, 4H, dois CH2-CS), 1,60 (d, J = 6,15 Hz, 3H, CH3-CH), 1,44 (s, 18H, t-butil) ppm; 13C NMR (CDC13, 500 MHz) δ 170,78 (C=O), 155,52 (C), 135,93 (dois C), 127,39 (C), 124,30 (dois CH), 59,56 (C), 58,00 (CH), 56,40 (CH2), 54,23 (CH2), 52,82 (CH2), 45,88 (CH3), 37,68 (CH2), 36,50 (CH2), 34,28 (C), 30,21 (CH3), 23,99 (CH3) ppm; FTIR (HATR) 2943,89,1619,92,1388,67 cm’1; GC-MS (EI) 7,31 min m/z: 419 (M+l). Exemplo 10: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-il)-propan-l-ona (AF724)

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano (Exemplo 1) (0,86 g, 4,62 mmol) em diclorometano (90 ml) à temperatura ambiente foi adicionada diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1,28 g, 6,2 mmol) seguida da adição de ácido propiônico (0,41 ml, 5,5 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Durante a reação um sólido branco foi precipitado. Após filtração, 0 solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/10/1) para produzir o composto título (0,5 g) como um óleo incolor. JH NMR (CDC13, 300 MHz) δ 5,51, 5,19 (2q, J = 6,15 e J = 6,22 Hz, 1H, CHCH3), 4,63, 3,74 (2d, J = 11,88 e J = 11,57 Hz, 1H, C/7HNCO), 3,44, 3,08 (2d, J = 11,55 eJ = 12,09 Hz, 1H, CHffNCO), 2,8-2,6 (m, 2H), 2,5-2,2 (m, 7H, CH2, C#2CH3, NCH3), 2,2-2,0 (m, 1H), 2,0-1,8 (m, 3H) 1,52, 1,48 (2d, J = 6,30 e J = 6,18 Hz, 3H, CH3-CH), 1,19-1,12 (m, 3H, CH3) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) δ 171,6 (C), 57,5, 57,2 (CH), 55,5 (C), 54,7, 54,3 (CH2), 53,2, 53,0 (CH2), 46,3 (CH3), 38,4, 37,7 (CH2), 37,0, 36,4 (CH2), 28,8, 26,8 (CH2), 25,6, 23,6 (CH3), 9,6, 5 9,4 (CH3) ppm. Exemplo 11: Síntese de l-(2,8)-dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4,51dec-3 -ilV4-( lH-indol-3-il)-butan- 1 -ona (AF725)

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano io (Exemplo 1) (0,97 g, 52 mmol) em diclorometano (100 ml) à temperatura ambiente foi adicionada diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1,44 g, 6,98 mmol) seguida da adição de ácido 3-indolbutírico (1,26 g, 6,22 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Durante a reação precipitou um sólido branco. Após a filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por 15 cromatografia flash (sílica, CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/10/1) para produzir o composto título (400 mg) como um sólido. !H NMR (CDC13, 300 MHz) δ 8,21 (br s, 1H, NH- indol), 7,60 (d, J = 7,75 Hz, 1H, CHC arom), 7,35 (d, J = 8,09 Hz, 1H, CHC arom), 7,19 (ap. t, J = 7,45 Hz, 1H, CHCH arom), 7,10 (ap. t, J = 7,43 Hz, 1H, CHC# arom), 6,99 (br s, 1H, C#NH arom), 5,53, 5,08 (2q, J = 6,15 e J = 6,17 Hz, 1H, C#CH3), 4,65, 3,58 20 (2d, J = 11,96 e J = 11,55 Hz, 1H, C/7HNCO), 3,32, 3,08 (2d, J = 11,59 e J = 12,09 Hz, 1H, CHHNCO), 2,87-2,80 (m, 2H), 2,8-2,5 (m, 2H)3 2,5-2,18 (m, 3H), 2,27 (s, 3H, NCH3), 2,18-2,0 (m, 3H), 2,0-1,58 (m, 4H), 1,48, 1,43 (2d, J = 6,17 eJ = 6,24 Hz, 3H, C#3-CH) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) δ 170,99 (C), 136,54 (C), 127,65 (C), 122,13 (CH), 121,69 (CH), 119,38 (CH), 119,09 (CH), 115,77 (C), 111,33 (CH), 57,57, 25 57,17 (CH), 55,30 (C), 54,67, 54,23 (CH2), 53,21, 52,92 (CH2), 46,23 (CH3), 38,42, 37,56 (CH2), 37,04, 36,31 (CH2), 34,93, 32,97 (CH2), 25,68, 25,52 (CH2), 24,72, 24,63 (CH2), 23,56 (CH3) ppm. Exemplo 12: Síntese de l-(2,8)-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.51dec-3-il-4-(lH- indol-3-il)-etan-l-ona (AF726)

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano (Exemplo 1) (0,97 g, 52 mmol) em diclorometano (100 ml) à temperatura ambiente foi adicionada diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1,44 g, 6,98 mmol) seguida da adição de ácido 3-indolacético (1,09 g, 6,22 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Durante a reação precipitou um sólido branco. Após filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/10/1) para produzir o composto título (600 mg) como um sólido. *HNMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,71, 8,66 (2br s, 1H, NH-indol), 7,62, 7,59 (2d, J = 7,90 e J = 8,39 Hz, 1H, CHC arom), 7,35 (m, 1H, CHC arom), 7,22-7,08 (m, 1H, 2CH arom), 7,03 (br s, 1H, CHNH arom), 5,53, 5,33 (2q, J = 6,12 e J = 6,22 Hz, 1H, C//CH3), 4,69, 3,88 (2d, J = 12,15 e J = 11,20 Hz, 1H, C/7HNCO), 3,49 e 3,81 (2s, 2H, C(O)CH2), 3,36, 3,13 (2d, J = 11,41 e J = 12,19 Hz, 1H, CHHNCO), 2,8-2,5 (m, 1H), 2,5-2,05 (m, 2H), 2,25 e 2,19 (2s, 3H, NCH3), 2,05- 1,85 (m, 2H), 1,85-1,6 (m, 1H), 1,52, 1,48 (2d, J = 6,15 e J = 6,30 Hz, 3H, CH3-CH), 1,45-1,35 (m, 1H), 1,35-1,15 (m, 1H) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) Ô 169,6(C), 136,43(C), 127,19 (C), 122,98, 122,82 (CH), 122,43 (CH), 119,88, 119,81 (CH), 118,79, 118,67 (CH), 111,52 (CH), 108,55 (C), 58,06, 57,58 (CH), 55,66 (C), 54,66, 54,15 (CH2), 53,20, 52,76 (CH2), 46,27, 46,11 (CH3), 38,45, 37,13 (CH2), 36,95, 36,13 (CH2), 33,96 (CH2), 31,37 (CH2), 25,75, 23,33 (CH3) ppm. Exemplo 13: Síntese de (E)-l-(2,8-dimetil-l-tia- 3,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propenona (AF727)

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]decano (Exemplo 1) (0,83 g, 44 mmol) em diclorometano (85 ml) à temperatura ambiente foi adicionada diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1,23 g, 5,9 mmol) seguida da adição de ácido trans-3-indolaceticrílico (1,0 g, 5,3 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Durante a reação um sólido branco foi precipitado. Após filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, C^CWMeOH/NEfiOH 90/10/1) para produzir o composto título (600 mg) como um sólido. JHNMR (l,l,2,2-Dicloroetano-d2, 300 MHz, 100°C) δ 8,56 (br s, 1H, NH-indol), 7,94 (d, J = 15,3 Hz, 1H, HC=C), 7,83 (m, 1H, CHC arom), 7,46 (br s, 1H, CHC arom), 7,42 (m, 1H, CH), 7,26 (m, 2H, 2CH arom), 6,71 (d, J = 15,3 Hz, 1H, C=CH), 5,65 (q, J = 6,12 Hz, 1H, CHCH3), 4,38 (d, J = 11,75 Hz, 1H, CHHNCO), 3,50 (d, J = 11,84 Hz, 1H, CHHNCO), 3,1-2,8 (m, 2H), 2,8-2,6 (m, 1H), 2,6-2,3 (m, 2H), 2,46 (s, 3H, NCH3), 2,2-1,9 (m, 2H), 1,9-1,8 (m, 1H), 1,64 (d, J = 6,21 Hz, 3H, CH3-CH) ppm; MS (EI+) m/z 355 (M+), 322, 185,170. Exemplo 14: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona (AF711)

A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]decano (991,2 mg, 5,8 mmol) EM diclorometano (110 ml) à temperatura ambiente foram adicionados diciclohexilcarbodiimida (1,61 g, 7,8 mmol) e ácido 3-indolepropiônico (1,43 g, 7,6 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Precipitou um sólido branco durante a reaçõa. Após filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2C12/EtOH/NH4OH 90/10/1). Após evaporação e secagem a vácuo, o AF711 (716 mg, 99,6% de pureza química) foi obtido como um sólido branco. ÃHNMR (CDCI3, 500 MHz) δ 8,50, 8,46 (2 br s, 1H, NH indol), 7,61 (d, J = 7,55 Hz, 1H, CHC arom), 7,33 (d, J = 7,85 Hz, 1H, CHCNH arom), 7,18 (ap. t, J = 7,24, 7,85 Hz, 1H, CHCHC arom), 7,11 (ap. t, J = 7,55, 7,24 Hz, 1H, CHCHC arom), 7,02 (d, J = 1,86 Hz, 1H, C/7NH indol), 5,32, 5,15 (2q, J = 5,09 e J = 5,16 Hz, 1H, CHCH3), 3,99, 3,22 (2d, J = 11 e J = 9,5 Hz, 1H, CHHNCO), 3,19 (m, 1H), 3,13-3,08 (m, 1H), 3,03, 2,97 (2d, J = 9,5 e J = 11 Hz, 1H5 CH/fNCO), 2,72-2,60 (m, 2H), 2,51-2,20 (m, 4H), 2,25, 2,23 (2s, 3H, NCH3), 1,78- 1,64 (m, 2H), 1,43, 1,31 (2d, J = 5,15 eJ = 5,15 Hz, 3H, C7/3CH), 1,39, 1,28 (2m, 1H), 1,14 (m, 1H) ppm; 13C NMR (CDC13, 500 MHz) δ 170,50, 169,85 (C), 136,30, 136,25 (C), 127,07, 126,99 (C), 121,93 (CH), 121,85 (CH), 119,24 (CH), 118,55, 118,52 (CH), 114,73 (C), 111,20, 111,12 (CH), 84,69, 84,06 (CH), 77,98 (C), 54,18 (CH2), 52,18 (CH2), 51,86 (CH2), 45,89, 45,83 (CH3), 36,38 (CH2), 34,98 (CH2), 32,99, 32,41 (CH2), 22,70, 20,50 (CH3), 20,96, 20,73 (CH2) ppm. Exemplo 15: Separação quiral de AF711A e AF711B A separação de AF711 em seus enantiômeros foi realizada por HPLC em uma coluna semipreparativa. Foram injetados 200 01 de solução de AF711 em metanol (50 mg/ml) na coluna e foi eluido. Após a eluição, o eluente foi evaporado à secura. HPLC: Merck-Hitachi modelo L-62000A Detector: Merck-Hitachi modelo L-4250 Coluna: Chiralcel OJ-H, 250 x 10 mm Taxa de fluxo: 4 ml/min Temperatura da coluna: temperatura ambiente Fase móvel: Hexano/Etanol/Metanol 95:1:4 Concentração: 50 mg/ml Detecção UV: 300 nm Primeiro enantiômero a eluir (AF711A): 99% ee (assumido como sendo 0 enantiômero (-)). Segundo enantiômero a eluir (AF711B): 99% ee, rotação específica [a] = +73,5° (C=0,365, Metanol). Exemplo 16: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.51dec-3-il]-2- propil-pentan-l-ona (AF712)

2,8-Dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]decano (1,52 g, 8,95 mmol) foi dissolvido em diclorometano seco (5 ml) sob atmosfera de argônio. Foi adicionada trietilamina destilada (1,87 ml, 13,42 mmol) e a solução resultante foi resfriada para 0°C. Foi adicionado cloreto de valproil (1,46 g, 8,95 mmol) gota-a-gota com uma seringa. O frasco reacional foi deixado aquecer para a temperatura ambiente com agitação, e um sólido branco começou a precipitar. Após 4 h de agitação, foi adicionado diclorometano (100 ml) e a solução resultante foi lavada com água (10 ml). As duas fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (2 x 50 ml). A fase orgânica combinada foi secada com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2C12/EtOH/NH4OH 130/10/1) para produzir o AF712 (389 mg, 98,7% de pureza química) como um pó amarelo. ]H KMR (CDCh, 300 MHz) δ 5,43 (q, J = 5,2 Hz, 1H, CHCH3), 4,13, 3,63 (2d, J = 11,35 e J = 9,6 Hz, 1H, C/7HNCO), 3,22, 3,00 (2d, J = 9,6 e J = 11,35 Hz, 1H, CHHNCO), 2,56-2,38 (m, 5H), 2,30, 2,29 (2s, 3H, NCH3), 1,84- 1,53 (3m, 6H), 1,44, 1,43 (2d, J = 5,2 Hz, 3H, CH3CH), 1,4-1,19 (m, 6H), 0,90 (ap. t, J = 7,11 Hz, 6H, CH3CH2) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) δ 173,92, 173,68 (C), 84,75, 84,20 (CH), 78,32, 78,09 (C), 54,24(CH2), 52,34 (CH2), 52,02 (CH2), 46,03 (CH3), 44,34, 43,64 (CH), 35,63 (CH2), 35,05 (CH2), 34,92 (CH2), 32,83 (CH2), 23,52, 20,91 (CH3), 20,59 (CH2), 20,43 (CH2), 14,30 (CH3), 14,16 (CH3) ppm. Exemplo 17: Síntese de 3-(4-fluorbenzenosulfonil)- 2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro [4.5]-decano (AF715)

2,8-Dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]decano (1,42 g, 8,38 mmol) foi dissolvido em diclorometano seco (5 ml) sob atmosfera de argônio. Foi adicionada trietilamina destilada (1,75 ml, 12,57 mmol) e a solução resultante foi resfriada para 0°C. Foi adicionado cloreto de p-fluorbenzenosulfonil (1,63 gr, 8,37 mmol) e o frasco reacional foi deixado aquecer para a temperatura ambiente com agitação, e um sólido branco começou a precipitar. Após 30 min de agitação, foi adicionado diclorometano (90 ml) e a solução resultante foi lavada com água (2x 10 ml). A fase orgânica foi secada com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (sílica, CH2Cl2/EtOH/NH4OH 140/10/1) para produzir o AF715 (1,23 g, 98,7% de pureza química) como um pó esbranquiçado. JHNMR (CDCI3, 500 MHz) δ 7,89-7,87 (m, 2H, CHCSO2), 7,27-7,22 (m, 2H, CHCF), 5,05 (q, J = 5,23, 1H, CHCH3), 3,33 (d, J = 10,26 Hz, 1H, CHHNS), 3,19 (d, J = 10,26 Hz, 1H, CHHNS), 2,52-2,42 (m, 1H), 2,34-2,25 (m, 2H), 2,23 (s, 3H, NCH3), 2,18-2,09 (m, 1H), 1,77-1,72 (m, 2H), 1,52 (d, J = 5,23 Hz, 3H, CH3CH), 1,25-1,18 (m, 1H), 1,10-1,03 (m, 1H) ppm; 13C NMR (CDC13, 500 MHz) δ 166,45 e 164,42 (C), 134,0 (C), 130,37 (CH), 130,29 (CH), 116,68 (CH), 116,50 (CH), 86,95 (CH), 66,30 (C), 55,48 (CH2), 52,57 (CH2), 52,11 (CH2), 46,04 (CH3), 35,64 (CH2), 32,84 (CH2), 22,95 (CH3) ppm. Exemplo 18: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]dec-4-il)-3-(lH-indol-3-il)ropan-l-ona (AF706)

Uma solução de 2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro [4,.5]decano (1,09 g, 6,41 mmol), ácido 3-indolpropiônico (1,57 g, 8,3 mmol), diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1,78 g, 8,65 mmol) e dimetilaminopiridina (DMAP, 0,78 g, 6,41 mol) em diclorometano (100 ml) foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 4 dias. O precipitado foi removido por filtração e o solvente foi evaporado. Cromatografia flash (sílica, CH2O2/1- PrOH/NEUOH 85/15/1) produziu o composto título que foi triturado em éter. O sólido branco obtido (AF706), 1,1 g (99,4% de pureza química), foi filtrado e secado. 'H-NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,15 (br NH), 7,63 (d, J = 7,76Hz, 1H, ArH), 7,38 (d, J = 7,98 Hz, 1H, ArH), 7,23 (dt, J = 1,12, 7,56 Hz, 1H, ArH), 7,13 (dt, J = 1,07, 7,44 Hz, 1H, ArH), 7,08 (d, J = 2,15 Hz, 1H, NCHC), 4,05 (m, 1H, OCH), 3,53 (dd, J = 9,0, 5,5 Hz, 1H, NOTH), 3,13 (m, 3H), 2,96 (t, J = 9,2Hz, 1H), 2,80-2,70 (m, 3H), 2,61-2,70 (m, 2H), 2,23-2,34 (m, 2H, CH2-piperidina), 2,31 (s, 3H, NCH3), 1,37 (m, 1H, CH-piperidina), 1,33 (m, 1H, CH-piperidina), 1,25 (d, J = 6,0 Hz, 3H, CH3) ppm; 13C-NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 169,66 (C), 136,52 (C), 122,49 (CH), 121,90 (CH), 119,24 (CH), 118,78 (CH), 115,18 (C), 111,41 (CH), 94,16 (C), 69,92 (CH), 53,25 (CH2), 52,84 (CH2), 52,70 (CH2), 45,99 (CH3), 37,52 (CH2), 33,66 (CH2), 30,90 (CH2), 20,73 (CH2), 18,26 (CH3) ppm. Exemplo 19: Síntese de l-(2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]dec-4-il)2- propil-pentan-l-ona (AF713)

A uma solução fria (0°C, banho de água gelada) de hidreto de sódio (60%, 0,6 g, 15 mmol) em THF (60 ml) foi adicionado 2,8-dimetil-l-oxa-4,8- diazaspiro[4.5]decano (2,44 g, 14,3 mmol) sob atmosfera de argônio. O banho refrigerante foi removido e a mistura reacional foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 30 min. Foi adicionado cloreto de valproil (2,36 g, 14,5 mmol) e a mistura reacional foi deixada à temperatura ambiente sob atmosfera de argônio por 2,5 h com agitação. A mistura reacional foi filtrada através de um chumaço curto de sílica. A sílica foi lavada com THF (3 x 150 ml), os filtrados foram combinados e evaporados. Cromatografia flash (sílica, CH2C12/EtOH/NH4OH 100/10/1) produziu o composto título como um sólido amarelo amarronzado. O sólido foi dissolvido em diclorometano (150 ml) e foi adicionado carvão à solução sob agitação. A filtração e a evaporação produziram o AF713 esbranquiçado (1,4 g, 97,2% de pureza química). 1H- NMR (CDC13, 300 MHz) δ 4,1-4,2 (m, 1H, OCH), 3,7-3,8 (m, 1H), 3,0-3,2 (m, 2H), 2,7-2,8 (m, 3H), 2,3-2,5 (m, 3H), 2,3 (s, 3H, NCH3), 1,55-1,67 (m, 2H), 1,4-1,52 (m, 1H), 1,26 (d, J = 6Hz, 3H, CH3), 1,2-1,4 (m, 6H), 0,89 (br t, J= 7,03Hz, 6H, 2CH3) ppm; 13C- NMR (CDC13, 300 MHz) δ 173,14 (C), 94,22 (C), 69,65 (CH), 53,41 (CH2), 52,46 (CH2), 52,30 (CH2), 45,35 (CH2), 45,06 (CH2), 35,35 (CH2), 35,21 (CH2), 32,93 (CH2), 30,27 (CH2), 20,79 (CH2), 20,73 (CH2), 18,14 (CH3), 14,33 (CH3), 14,27 (CH3) ppm; FTIR (HATR) 1627 cm’1. Exemplo 20: Síntese de 4-(4-fluor-benzenosulfonil)-2,8-dimetil-l-oxa-4,8- diazaspiro [4.5]-decano (AF714)

A uma solução fria (0°C, banho de água gelada) de hidreto de sódio (60%, 0,6 g, 15 mmol) em THF (60 ml) foi adicionado 2,8-dimetil-l-oxa-4,8- diazaspiro[4.5]decano (2,49 g, 14,6 mmol) sob atmosfera de argônio. O banho refrigerante foi removido e a mistura reacional foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 40 min. Foi adicionado cloreto de 4-fluorbenzensulfonil (2,84 g, 14,6 mmol) e a mistura reacional foi deixada à temperatura ambiente sob atmosfera de argônio durante uma noite com agitação. A mistura reacional foi filtradas através de um chumaço curto de sílica, qur foi lavado com tetrahidrofurano (THF, 2 x 150 ml). Os filtrados foram combinados e evaporados. Cromatografia flash (sílica, CH2Cl2/EtOH/NH4OH 100/10/1) produziu o composto título como um sólido amarelo amarronzado. O sólido foi recristalizado a partir de í-PrOH quente. O AF714 foi obtido como um sólido branco (1,3 g, 99,8% de pureza química). ’H-NMR (Coch, 300 MHz) δ 7,88 (m, 2H, 2H-Ar), 7,20 (m, 2H, 2H-Ar), 4,21 (m, 1H, OCH), 3,69 (dd, J = 5,4, 8,4Hz, 1H, NOTH), 2,91 (t, J = 8,8Hz, 1H, NCHW), 2,72 (m, 2H, CH2-piperidina), 2,63 (m, 1H, CH-piperidina), 2,43 (m, 1H, CH- piperidina), 2,28 (s, 3H, NCH3), 2,25 (m, 2H, CH2-piperidina), 1,72 (m, 1H, CH-piperidina), 1,43 (m, 1H, CH-piperidina), 1,28 (d, J = 6Hz, 3H, CH3); 13C-NMR (Coch, 300 MHz) δ 166,58 e 163,20 (C), 137,02 (C), 129,95 (C), 129,83 (C), 116,34 (C), 116,04 (C), 96,29 (C), 70,42 (CH), 53,49 (CH2), 52,96 (CH2), 52,79 (CH2), 45,85 (CH3), 35,88 (CH2), 34,89 (CH2), 18,08 (CH2) ppm. Exemplo 21: Sintese de N4-dimetil-6-(3-indolpropionil)-spiro-(3-oxa-6-aza- biciclo[3.1.0]-hexano-2,4’-piperidina) (AF718C)

Uma solução de ácido 3-indolpropiônico (1,63 g, 8,6 mmol) e diciclohexil-carbodiimida (DCC, 1,86 g, 9,06 mmol) em diclorometano (50 ml) foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 15 min. Foi adicionado 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1,22 gr 9,06 mmol) e a agitação foi mantida por mais 30 min. Foi adicionada l’,4-dimetil-spiro-3-oxa-6-azabiciclo[3.1.0]hexano-2,4’-piperidina (1,57 g, 8,6 mmol) e a mistura reacional foi posta sob agitação durante uma noite à temperatura ambiente. Foi adicionado diclorometano (100 ml) e a mistura reacional foi lavada com água (2 x 20 ml). As frações orgânicas foram combinadas, secadas e concentradas sob pressão reduzida. Cromatografia flash (sílica, CH2Cl2/EtOH/NH4OH 100/20/1) do resíduo produziu o AF718C (200 mg, 99,3% de pureza química) como um sólido branco. 1H- NMR (CDC13, 300 MHz) δ 8,08 (br NH), 59 (d, J = 7,72 Hz, 1H, ArH), 7,36 (d, J = 7,91 Hz, 1H, ArH), 7,21 (dt, J = 1,19, 7,45 Hz, 1H, ArH), 7,13 (dt, J = 1,13, 7,40 Hz, 1H, ArH), 6,98 (d, J = 2,24 Hz, 1H, NCHC), 4,15 (q, J = 6,77 Hz, 1H, OCH), 3,12 (t, J = 7,25 Hz, 2H, CH2), 2,92 (d, J = 4,7 Hz, 1H, NCH), 2,85 (d, J = 4,7 Hz, 1H, NCH), 2,85- 2,74 (m, 2H, CH2), 2,4-2,2 (m, 4H, 2CH2-piperidina), 2,25 (s, 3H, NCH3), 1,76-1,67 (m, 2H, CH2-piperidina), 1,66-1,56 (m, 2H, CH2-piperidina), 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 3H, CH3) ppm; 13C-NMR (CDC13, 300 MHz) δ 184,40 (C), 136,26 (C), 122,16 (CH), 121,67 (CH), 119,53 (CH), 118,65 (CH), 114,93 (C), 111,23 (CH), 78,69 (C), 74,50 (CH), 53,08 (CH2), 52,08 (CH2), 47,14 (CH), 46,25 (CH), 45,95 (CH3), 37,90 (CH2), 36,02 (CH2), 33,39 (CH2), 20,93 (CH2), 20,77 (CH3) ppm; FT-IR (HATR) 1676 cm’1; MS (Cl) 354 (M+l) para C2iH27N3O2. Exemplo 22: Síntese de r,4-dimetil-6-[3-(4-fluorbenzenosulfonil)]-spiro-(3- oxa-6-aza-biciclo[3.1.0] hexano-2,4,-piperidina) (AF721)

Uma solução de cloreto de 4-fluorbenzenosulfonil (1,04 g, 5,3 mmol) em diclorometano seco (5 ml) foi adicionada a uma solução de amina [ver síntese de AF718C parte (a), 0,97 g, 5,3 mmol] e trietilamina seca (1,1 ml, 8 mmol) em diclorometano seco (12 ml). A mistura reacional foi posta sob agitação durante uma noite à temperatura ambiente. Foi adicionado diclorometano (50 ml) e a mistura reacional foi lavada com água (10 ml). A fase orgânica foi secada e concentrada sob pressão reduzida. Cromatografia flash do resíduo produziu o AF721 (óleo, 0,8 g). 1H- NMR (CDCI3 300 MHz) δ 8,01-7,95 (m, 2H, 2CH), 7,28-7,16 (m, 2H, 2CH), 4,24 (q, J = 6,83 Hz, 1H, OCH), 3,54-3,48 (dois d, J = 5,38 e J = 5,38 Hz, 2H, 2CH), 2,53-2,3 (m, 4H), 2,23 (s, 3H, NCH3), 2,16-1,73 (m, 4H), 1,25 d, J = 6,84 Hz, 3H, CH3) ppm; 13C- NMR (CDC13, 300 MHz) δ 167,5 e 164,1 (CF), 134,2 (C), 130,7 (CH), 130,6 (CH), 116,6 (CH), 116,3 (CH), 79,6 (C), 75,0 (CH), 52,8 (CH2), 52,2 (CH2), 50,9 (CH), 49,9 (CH), 46,0 (CH3), 36,3 (CH2), 33,1 (CH2), 20,9 (CH3) ppm. Exemplo 23: Síntese de l-(2,8-Dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(l- metil-indol-3-il)propan-l-ona (AF732) A uma solução de diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1,3 g, 6,3 mmol) em diclorometano (50 ml) à temperatura ambiente foi adicionado ácido 3-(l-metil-indol-3- il)propanóico (1,18 g, 5,8 mmol) e uma solução de 2,8-dimetil-l-tia-3,8- diazaspiro[4.5]decano (1,2 g, 6,4 mmol) em diclorometano (50 ml). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 48 h. Durante a reaçãoprecipitou um sólido branco. Após filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CHzCVEtOH/NEUOH 100/10/1) para produzir o composto título (0,7 g) como um óleo incolor. ’HNMR (CDCI3, 300 MHz) δ 7,60 (d, J = 7,82 Hz, 1H, CHC arom), 7,35-7,2 (m, 2H, 2CHC arom), 7,23 (dt, J = 1,06, 7,45 Hz, 1H, CHCH arom), 6,90 (s, 1H, C//NH arom), 5,54, 5,07 (2q, J = 6,16 e J = 6,25 Hz, 1H, CHCH3), 4,63, 3,68 (2d, J = 12,0 eJ = 11,5 Hz, 1H, C/fHNCO), 3,75, 3,74 (2s, 3H, NCH3), 3,32 (d, J = 11,5 Hz, 0,6H, CHHNCO), 3,17-3,05 (m, 2,4H), 2,8-2,4 (m), 2,68 [t, J = 7,6 Hz, C(O)CH2], 2,28, 2,26 (2s, 3H, NCH3), 2,3-2,2 (m), 2,1-2,0 (m), 2,0-1,8 (m), 1,7-1,4 (m), 1,48, 1,43 (2d, J = 6,18 e J = 6,26 Hz, 3H, CH3-CH) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) δ 170,6 (C), 137,1 (C), 126,8 (C), 126,7 (CH), 121,8 (CH), 119,0(CH), 118,9 (CH), 113,7(C), 109,4 (CH), 59,0 (C), 57,5, 57,2 (CH), 54,6, 54,2(CH2), 53,2, 52,9 (CH2), 46,3, 46,2 (CH3), 38,1, 37,4 (CH2), 36,9, 36,6 (CH2), 36,4, 34,7 (CH2), 32,7 (CH3), 25,5, 23,5 (CH3), 21,0, 20,9 (CH2) ppm. Exemplo 24: Síntese de N-(2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH- indol-3-il)-propionamida (AF730)

Síntese de 2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3-ilamina: Uma solução of 2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]decan-3-ona oxima (1,24 g, 6,3 mmol, preparada de acordo com o procedimento de Tsukamoto et al. Chem. Pharma. Bull.1995, 43, 842- 852) em THF seco (30 ml) foi adicionada gota-a-gota a uma suspensão de hidreto de lítio alumínio (1,13 g, 30 mmol) e cloreto de alumínio (0,2 g, 1,5 mmol) em THF seco (50 ml). A mistura reacional foi posta sob agitação por 10 h à temperatura ambiente. A mistura reacional foi resfriada (gelo) e a reação foi interrompida pela adição de água (3 ml), NaOH aquoso 15% (3 ml) e água (7 ml). O sólido foi retirado por filtração em celite e 0 filtrado de THF foi concentrado a vácuo. O óleo residual foi dissolvido em diclorometano (200 ml) e a solução foi secada com sulfato de sódio. O solvente foi removido e a amina bruta foi tomada para a etapa seguinte. A uma solução sob agitação de diciclohexil-carbodiimida (DCC) (1,49 g, 7 mmol) em diclorometano (100 ml) à temperatura ambiente foi adicionada uma solução de 2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3-ilamina (todo o composto obtido na etapa anterior) em diclorometano (20 ml), seguida da adição de ácido 3-indolepropiônico (1,3 g, 6,9 mmol). A mistura reacional foi posta sob agitação à temperatura ambiente durante uma noite. Durante a reação precipitou um sólido branco. Após filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, gradiente de CH2C12/MeOH/NH4OH 140/10/1 a CH2C12/MeOH/NH4OH 100/10/1) para produzir um sólido branco de AF730 como uma mistura de dois isômeros geométricos (isômero I/isômero II 1:2). ’HNMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,07 (br s, 1H, NH-indol), 7,61 (d, J = 7,81 Hz, 1H, CHC arom), 7,36 (d, J = 8,0 Hz, 1H, CHC arom, isômero II), 7,35 (d, J = 7,9 Hz, 1H, CHC arom, isômero I), 7,20 (m, 1H, C/fCH arom), 7,15 (m, 1H, CHC77 arom), 7,02 (m, 1H, C//NH arom), 5,36 (d, J = 8,85 Hz, 1H, NH isômero I), 5,18 (d, J - 8,0 Hz, 1H, NH isômero II), 4,35 (m, 1H, CH isômero I), 4,04 (m, 1H, CH isômero II), 3,93 (m, 1H, C/7CH3 isômero I), 3,48 (m, 1H, CHCH3 isômero H), 3,13 (t, J = 7,0 Hz, 2H, COCH2Ctt2), 2,58 (m, 2H, COCH2), 2,4 (m, 2H, CH2), 2,29 (m, 2H, CH2), 2,25 (s, 3H, NCH3 isômero II), 2,23 (s, 3H, NCH3 isômero I), 2,10 (dd, J = 12,9, 8,2 Hz, 1H, CHHCH isômero II), 1,96 (dd, J = 13,6, 7,1 Hz, 1H, CHHCH isômero I), 1,7-1,4 (2m), 1,4-1,2 (2m), 1,15 (d, J = 6,1 Hz, 3H, CH3-CH isômero II), 0,97 (d, J = 6,3 Hz, 3H, CH3-CH isômero I) ppm; 13C NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 172,9, 172,5 (C), 136,6, 136,5(C), 127,2, 127,1 (C), 122,2, 122,1 (CH), 119,6, 119,5 (CH), 118,8 (CH), 114,6, 114,5 (C), 111,6, 111,5 (CH), 78,2, 74,5 (CH), 55,5 (CH), 53,0 (C), 52,9, 52,7 (CH2), 46,6, 46,2 (CH3), 38,7, 38,5 (CH2), 37,7, 37,6 (CH2), 21,8, 21,7 (CH2), 19,7,15,0 (CH3) ppm. Os isômeros geométricos (200 mg) foram separados por cromatografia flash em um sistema Combi-Flash Companion (Isco, Inc) (HP 40-coluna de ouro sílica, gradiente linear CH2C12/MeOH/NH4OH 120/10/1 a CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/10/1). AF730 I (isômero menos polar): ’HNMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,09 (br s, 1H, NH-indol), 7,61 (d,J = 7,80 Hz, 1H, CHC arom), 7,35 (d, J = 8,0 Hz, 1H, CHC arom), 7,19 (dt, J = 1,1, 7,4 Hz, 1H, C#CH arom), 7,12 (dt, J = 1,01, 7,4 Hz, 1H, CHC# arom), 7,03 (d, J = 2,2 Hz, 1H, C#NH arom), 5,36 (d, J = 8,6 Hz, 1H, NH), 4,35 (m, 1H, CH), 3,93 (dq, J = 6,3, 6,3 Hz, 1H, C#CH3), 3,13 (t, J = 7,1 Hz, 2H, COCH2C#2), 2,58 (m, 2H, COCH2), 2,5-2,1 (m, 4H, 2CH2), 2,24 (s, 3H, NCH3), 1,96 (dd, J = 13,6, 7,1 Hz, 1H, CHHCH), 1,7-1,4 (2m, 2H), 1,4-1,3 (m, 2H), 1,31 (dd, J = 13,6, 2,7 Hz, 1H, CHHCH), 0,97 (d, J = 6,3 Hz, 3H, CH3-CH) ppm. AF730 II (isômero mais polar): XH NMR (CDC13, 300 MHz) δ 8,1 (br s, 1H, NH-indol), 7,60 (d, J = 7,82 Hz, 1H, CHC arom), 7,36 (d, J = 8,0 Hz, 1H, CHC arom), 7,20 (dt, J = 1,1, 7,5 Hz, 1H, C#CH arom), 7,12 (dt, J = 1,1, 7,4 Hz, 1H, CHCH arom), 7,01 (d, J = 2,2 Hz, 1H, C77NH arom), 5,19 (d, J = 8,30 Hz, 1H, NH), 4,03 (m, 1H, CH), 3,46 (m, 1H, C#CH3), 3,13 (t, J = 7,1 Hz, 2H, COCH2C#2), 2,57 (t, J = 7,1 Hz, 2H, COCH2), 2,5-2,3 (m, 2H, CH2), 2,3-2,1 (m, 2H, CH2), 2,24 (s, 3H, NCH3), 2,10 (dd, J = 12,9, 8,2 Hz, 1H, CHHCH), 1,7-1,4 (2m, 4H), 1,26 (dd,, J = 12,7, 7,6 Hz, 1H, CHHCH), 1,15 (d, J = 6,1 Hz, 3H, C#3-CH) ppm. Exemplo 25: N-(2,8-Dimetil-l-tia-8-aza-spiro[4.5]dec-3-il)- 3-(lH-indol-3-il)- propionamida (AF731)

(a) Síntese de 2,8-dimetil-l-tia-8-azaspiro[4.5]-decano-3-ona. Emum frasco de fundo redondo de três gargalos equipado com um termômetro, foram colocados um finil de gotejamento e um tubo de secagem de cloreto de cálcio, hidreto de sódio 60% em óleo mineral (8,74 g, 0,218 mol) e éter seco (300 ml). A esta suspensão sob agitação e resfriada foi adicionada uma solução de tiolactato de etila (28,4 g, 95%, 0,200 mol) em éter seco (100 ml) a 5-10°C, seguida de adição lenta de metanol (100 ml) na mesma temperatura. Então a mistura reacional foi posta sob agitação à temperatura ambiente por uma hora. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida e foi adicionado ao resíduo dimetilsulfóxido seco (170 ml). A solução obtida foi resfriada para 15°C e foi adicionado (l-metil-4-piperidinilideno)acetato de etila (40 g, 0,22 mol). A mistura reacional foi posta sob agitação à temperatura ambiente por dois dias, então derramada em água gelada (600 ml). A mistura reacional foi então acidificada com ácido clorídrico concentrado, e então tornada básica (pH 8) com bicarbonato de sódio. A mistura reacional foi então extraída com diclorometano (4 x 450 ml) e os extratos combinados foram lavados com salmoura (2 x 400 ml), secados (MgSO4) e os solventes foram removidos para produzir um óleo (59,40 g) que continha algum dimetilsulfóxide. A parte do produto acima (27,6 g), foi adicionado ácido clorídrico (1,3 N, 200 ml), e a solução obtida foi posta em refluxo por 11 horas, após o que foi extraída com hexano (3 x 75 ml) que foi descartado. A fase aquosa foi tomada básica (pH 13) com hidróxido de sódio aquoso 35%, então extraída com diclorometano (3 x 120 ml), os extratos combinados foram lavados com salmoura (2 x 80 ml), secados (MgSÜ4) e o solvente foi evaporado para produzir um óleo (9,2 g) que foi purificado por cromatografia em uma coluna de sílica gel. A eluição com metanol/diclorometano/amônia 4/96/1 produziu a cetona (7,0 g, 37,9% de rendimento para as duas etapas). XH-NMR CDCI3) δ 1,40 (d, J = 7,0 Hz, CH3C), 1,75-2,15 (m, 4H), 2,20-2,80 (m, 4H), 2,32 (s, CH3N), 2,57 e 2,65 (2d, J = 17,2 Hz, CH2C=O), 3,59 (q, J = 7,0 Hz, CHS). (b) Síntese de 2,8-dimetil-l-tia-8-aza-spiro[4,5]-decan-3-ona oxima. Uma solução de 2,8-dimetil-l-tia-8-azaspiro[4.5]decano-3-ona (0,669g, 3,36 mmol) em metanol (9 ml) foi adicionada a uma solução de hidroxilamina hidrocloreto (0,270 g, 3,88 mmol) e acetato de sódio (0,320 g, 3,90 mmol) em água (1,5 ml). A mistura foi aquecida a 80°C por 2 horas. Os solventes foram removidos à pressão reduzida e o resíduo foi cromatografado em uma coluna de sílica gel. A eluição com metanol/diclorometano/amônia [5/94/1] produziu a primeira oxima azztz-configuração (0,267 g) e então uma mistura dos dois isômeros (syn-e anti-)da oxima (0,316 g) (81% de rendimento). O zzrc/z-isômero foi cristalizado a partir de acetato de etila, pf. 148- 149°C. XH-NMR (CDC13, aníz-isômero) δ 1,46 (d, J = 6,6, CH3C), 1,73-1,96 (m, 3H), 2,05 (m, 1H), 2,15-2,40 (m, 1H), 2,32 (s, CH3N), 2,47 (m, 1H), 2,70 (m, 2H), 2,78 e 2,86 (2d, J = 17,4 Hz, CH2C=N), 3,99 (q, J = 6,6Hz, CHS), 10,1 (bs, -NOH). 13C- NMR (CDC13, zzzzíz-isômero) δ 19,7 (CH3), 38,2 (CH2), 38,9 (CH2), 42,5 (CH), 42,8(bs, CH2), 45,9 (CH3), 52,3 (C), 53,1 (CH2), 53,4 (CH2), 163,7 (C). Gc-Ms m/z 215 (M+l)+, 197 (M-OH)+, 96. aH-NMR (CDCI3, syn-isômero, calculado pela subtração do espectro de NMR para 0 an/z-isômero do espectro de NMR spectrum para a mistura dos isômeros syne anti) δ 1,48 (d, J = 6,8, CH3C), 1,60-1,73 (m, 1H), 1,74-1,95 (m, 2H), 1,95-2,25 (m, 2H), 2,31 (s, CH3N), 2,44 (m, 1H), 2,54 e 2,77 (2d, J = 14,5 Hz, CH2C=N), 2,60- 2,90 (m, 2H), 4,37 (q, J = 6,7 Hz, CHS), 10,2 (bs, NOH). 13C-NMR (CDC13, syn- isômero) δ 21,0 (CH3), 37,9 (CH2), 38,2 (CH2), 38,4 (CH), 46,0 (CH3), 46,6 (bs, (CH2), 51,7 (C), 52,6 (CH2), 53,8 (CH2), 163,8(C). (c) Síntese de 2,8-dimetil-l-tia-8-aza-spiro[4.5]dec-3-ilamina: a uma suspensão sob agitação de hidreto de lítio alumínio (1,00 g, 26,35 mmol) e cloreto de alumínio (0,110 g, 0,825 mmol) em tetrahidrofurano seco (45 ml) sob atmosfera de nitrogênio, à temperatura ambiente, foi adicionada lentamente uma solução de 2,8-dimetil-l-tia-8- azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima (1,24 g, 5,79 mmol). A agitação à temperatura ambiente foi mantida por três dias. A mistura reacional foi então resfriada (banho de água gelada) e água (3,0 ml) foi adicionada lentamente, então uma solução aquosa de hidróxido de sódio (15%, 4,0 ml) e então água (4,0 ml). O precipitado foi filtrado e lavado com uma pequena quantidade de diclorometano. O filtrado e as lavagens foram combinados e evaporados para produzir um óleo que foi purificado por cromatografia em uma coluna de sílica gel eluída com 10% metanol-89% diclorometano-1% amónia para produzir a amina como um óleo (0,430 g, 37% de rendimento). Os dados de 1H- NMR indicam que o produto consistia em dois pares de diastereômeros, um par sendo mais abundante que ou outro. Nos dados asequir, * indica os isômeros mais abundantes, # indica os isômeros menos abundantes. XH-NMR (CDC13) δ 1,25* (d, J = 6,9Hz, CH3C), 1,31* (d, J = 6,4Hz, CH3C), 1,60-2,08 (m, 4H)5 1,72 (m, um de CH2CNH2), 2,08-2,45 (m, 2H), 2,18 (dd, um de CH2CNH2), 2,29 (s, CH3N), 2,67 (m, 2H), 3,00* (m, CHS), 3,10 (m, CHNH2), 3,37* (m, CHS); GC-ms m/z 201(M+l)+, 184 (M-NH2)+. (d) Síntese de N-(2,8-dimetil-l-tia-8-azaspiro[4.5] dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il- propionoamida (AF 731). A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-8-aza- spiro[4.5]-dec-3-ilamina (0,375 g, 1,872 mmol) em diclorometano (20 ml) à temperatura ambiente foram adicionados uma solução de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (0,520 g, 2,52 mmol) em diclorometano (8 ml) então ácido 3-indolpropiônico (0,458 g, 2,42 mmol) em diclorometano (15 ml). A mistura reacional foi posta sob agitação à temperatura ambiente por três dias. O sólido formado foi filtrado e lavado com uma pequena quantidade de diclorometano, o filtrado e a lavagem combinados foram evaporados para produzir uma espuma que foi purificada por cromatografia em coluna de sílica gel. A eluição com misturas de solventes de 5 a 7% metanol em diclorometano contendo amónia 1% produziu primeiro o produto como uma mistura de isômeros (325 mg, 46,7% de rendimento) e então amina não reagida (90 mg). Os dados de JH-NMR indicam que o produto consiste em dois pares de diastereômeros, um par sendo mais abundante que o outro. Nos dados a seguir, * indica os isômeros mais abundantes, # indica os isômeros menos abundantes. JH-NMR (CDC13) δ 0,99* (d, J = 6,9, CH3C), 1,19* (d, J = 6,6, CH3C), 1,53 e 2,05 (2m, CH2CHNH), 1,60-2,18 (m, 4H), 2,18-2,85 (m, 2H), 2,28* (s, CH3N), 2,30* (s, CH3N), 2,59 (m, 2H), 2,95* (m, CHS), 3,13 (t, 2H), 3,50# (m, CHS), 4,24* (m, CHN), 4,51# (m, CHN), 5,28* (d, J = 8,7 Hz, NHCO), 5,55* (d, J = 8,4 Hz, NHCO), 7,03* (d, J = 2,3 Hz, 1H Ar), 7,04* (d, J = 2,4 Hz, 1H Ar), 7,11 (t, 1H Ar), 7,20 (m, 1H Ar), 7,38 (d, J = 8,0 Hz, 1H Ar), 7,60 (d, J = 7,8 Hz, 1H Ar), 8,22 (bs, NH indol). Exemplo 26: (3E)-2.8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona-O-[3-(lH- indo 1-3-il)propanoil] oxima (AF733)

Carbonildiimidazol (CDI) (0,19 g, 1,2 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido 3-indolpropiônico (0,22 g, 1,2 mmol) em THF seco (10 ml) sob atmosfera de argônio. The mistura reacional foi posta sob agitação por 0,5 h à temperatura ambiente, então foi adicionada dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona oxima (0,23 g, 1,2 mmol, preparada de acordo com o procedimento de Tsukamoto et al. Chem. Pharma. Bull. 1995, 43, 842-852). A mistura reacional foi posta sob agitação por 4 h à temperature ambiente e então por 8 h a 45°C. A mistura reacional foi resfriada para a temperatura ambiente, foi adicionado diclorometano (80 ml) e a mistura foi lavada com água (10 ml). As duas fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (30 ml). As fases orgânicas foram combinadas, secadas com sulfato de sódio anidro, filtradas e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em um sistema Combi-Flash Companion (Isco, Inc) (HP coluna 12 de ouro sílica, CH2Cl2/MeOH/NH4OH 90/10/1) seguida de cromatografia flash adicional em um sistema Combi-Flash Companion (Isco, Inc) (HP coluna 12 de ouro sílica, CHiCla/MeOH/NFLiOH 120/10/1). O resíduo foi triturado em éter para produzir o AF733 (104 mg), obtido como um sólido branco. *H NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,17 (br s, 1H, NH-indol), 7,60 (d, J= 7,73Hz, 1H, CHC arom), 7,35 (d, J = 7,98 Hz, 1H, CHC arom), 7,19 (ap. t, J = 7,76 Hz, 1H, CHCH arom), 7,12 (ap. t, J = 7,43 Hz, 1H, CHC// arom), 7,04 (d, J = 2,11 Hz, 1H, CHNH arom), 5,56 (q, J = 6,3 Hz, 1H, CHCH3), 3,18 (t, J = 7,37 Hz, 2H, CH2), 2,83 (t, J = 7,41 Hz, 2H, COCH2), 2,40 (ABq, J = 18,6 Hz, 2H, CH2), 2,5-2,3 (m, 4H), 2,28 (s, 3H, NCH3), 1,74 (2m, 3H), 1,5 (m, 1H), 1,43 (d, J = 6,36 Hz, 3H, CH3-CH) ppm; 13C NMR (CDC13, 300 MHz) δ 173,4 (C), 171,0 (C), 136,5 (C), 127,3(C), 122,2 (CH), 122,1 (CH), 119,5 (CH), 118,8 (CH), 114,5 (C), 111,4 (CH), 78,7 (C), 72,5 (CH), 52,5 (CH2), 52,2 (CH2), 46,1 (CH3), 40,0 (CH2), 37,4 (CH2), 34,4 (CH2), 33,7 (CH2), 20,9 (CH2), 19,5(CH3) ppm. Exemplo 27: Síntese de (D)-2-amino-l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diaza- spiro[4.5]dec-3-il-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona (AF728)

1) A uma solução sob agitação de 2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]decano (0,97 g, 5,2 mmol) em diclorometano (100 ml) à temperatura ambiente foi adicionada diciclohexilcarbodiimida (DCC) (1,44 g, 6,98 mmol) seguida da adição de N-Boc-D- triptofano (1,88 g, 6,2 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente por 48 h. Durante a reação precipitou um sólido branco. Após filtração, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CHzCl^MeOH/NKtOH 90/10/1) para produzir éster íerí-butílico de ácido (7?)-3-(2,8- dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-il)-2-(lH-indol-3-ilmetil)-3-oxo-propiônico (1,1 g) como um sólido. 2) A uma solução sob agitação de éster ZerZ-butílico de ácido (7?)-3-(2,8-dimetil- l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-il)-2-(lH-indol-3-ilmetil)-3-oxo-propiônico (0,9 g, 2,1 mmol) em diclorometano (20 ml) à temperatura ambiente foi adicionado ácido trifluoracético (TFA, 1,2 ml, 16,2 mmol). A solução resultante foi posta sob agitação à temperatura ambiente até a completa remoção do grupo protetor Boc. A mistura reacional foi diluída com diclorometano (20 ml), tratada com resina Amberlyst A-21 (20 g; descrita em Srinivasan et al., Mol. Diversity 9 (2005) 4, 291-293) por 1 h, filtrada e lavada com diclorometano (20 ml). Os filtrados combinados foram evaporados e o produto bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica, CFhClz/MeOH/NFUOH 90/10/1) para produzir o produto título (0,1 g) como um sólido. ]H NMR (CDCI3, 300 MHz) δ 8,14 (br s, 1H, NH-indol), 7,62 (d, J = 7,65 Hz, 1H, CHC arom), 7,38 e 7,37 (2d, J = 7,96 Hz and/ = 7,88 Hz, 1H, CHC arom), 7,22 (ap. t, J = 7,0 Hz, 1H, CF/CH arom), 7,10 (ap. dt, J = 1,0, 7,4 Hz, 1H, CHC// arom), 7,09 e 7,06 (dois d, J = 2,28 Hz e J = 2,25 Hz, 1H, C/7NH arom), 5,48, 4,98 (2q, J = 6,2 e J = 6,3 Hz, 1H, C//CH3), 4,42, 3,69 (2d, J = 12,0 e J = 11,6 Hz, 1H, CHHNCO), 3,98 e 3,92 (2t, J = 7,3 e J = 7,05 Hz, 1H, CHCH2), 3,12 (m, 2H, CHC//2), 2,80 (d, J = 11,4 Hz, 0,72H, CH/7NCO), 2,6 (m, 2H), 2,3-2,2 (m, 1H), 2,26 e 2,25 (2s, 3H, NCH3), 2,15-2,0 (m, 1H), 1,52, 1,38 (2d, J = 6,3 e J = 6,2 Hz, 3H, CH3-CH) ppm.

Ensaios Biológicos

Os compostos de fórmula I foram testados para a atividade biológica utilizando- se uma variedade de ensaios.

O ensaio da mobilização do íon cálcio intracelular (Ca2+) em culturas de células que foram transfectadas de forma estável com um GPCR (por exemplo, sub-tipos de mAChR) pode prover informação tanto da atividade (agonista ou antagonista) do composto testado, quanto de sua seletividade para um sub-tipo de receptor particular. Os níveis de Ca2+ intracelular foram determinados em células vivas pelo monitoramento da fluorescência do indicador de fluorescência de Ca2+, Fluo-4 NW (Molecular Probes, catálogo #36206). Este método é útil para a caracterização farmacológica e da função de GPCR. A medida de Ca2+ foi realizada utilizando-se uma leitora de placa NOVOstar® com um injetor e um sistema de pipeta (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha). Um dia após o experimento, as células transfectadas de forma estável com um dos sub- tipos de receptores muscarínicos M1-M5 foram coletadas e enxaguadas com meio de cultura (meio de Eagle da Dulbecco Modificado, Gibco, UK) suplementado com soro bovino fetal 10%, aminoácidos não essenciais MEME (GIBCO, UK), glutamina, penicilina, estreptomicina, anfotericina e G418 (Biological Industries, Israel) e plaqueadas uniformemente em placa de 96 poços de fundo ótico claro e parede preta (Nunc, Rochester NY, EUA) a uma densidade de of 40000 células/poço. NO dia do experimento, as células foram totalmente confluentes. O meio de crescimento foi removido e foi adicionado cuidadosamente 80 pl de tampão de carga, contendo probenecid 2,5 mM (ácido (4-dipropilsulfamoil)benzóico) (tampão de carga preparado de acordo com o manual do kit de ensaio FLUO-4 NW). As placas com células foram incubadas a 37°C por 30 minutos, então à temperatura ambiente por mais 30 minutos. De maneira a se avaliar os efeitos dos compostos testados sobre o Ca2+ intracelular (Ca2+-i), em alguns experimentos foi utilizado EGTA [ácido etilenoglicol tetracético] para eliminar a fonte de cálcio extracelular. EGTA (10 dl de 50 mM dissolvido em HBSS (Solução Salina Tamponada de Hank) foi adicionado a cada poço automaticamente, utilizando-se o sistema injetor NOVOstar, seguindo-se agitação por 0,5 minutos (1 mm de largura, 600 rpm) e então incubou-se por mais 10 minutos. Foram então adicionados (10 pl) apenas HBSS ou o composto de teste dissolvido em HBSS seqüencialmente em poços separados utilizando-se o sistema de pipetagem robótico NOVOstar. A intensidade de fluorescência foi medida a intervalos de 0,5 segundos, por 25 segundos para cada poço, utilizando-se um comprimento de onda de excitação de 458 nm (largura da banda de 10 nm) e de emissão de 520 nm (largura de banda de 10 nm), corte em 515 nm.

De maneira a avaliar a seletividade de um sub-tipo de mAChR, em particular o mAChR Ml vs. mAChR M3 e M5, os ensaios foram calibrados utilizando-se ligantes que apresentam uma atividade combinada, por exemplo, perfis Ml agonística e M3 antagonística ou Ml agonística e M5 antagonística, respectivamente. Isto pode eliminar os efeitos devidos a diferentes reservas de receptor nos ensaios baseados em célula.

Observou-se que os compostos AF710, AF710B, AF711, AF711A, AF718C, AF721, AF730, AF730 I, AF730 II e AF733 são agonistas parciais no mAChR Ml, e suas atividades agonísticas relativas a 100 DM vs. carbacol (agonista muscarínico total, 100%) seguem a ordem AF733 (90%) > AF730 I (745) > AF710B (66%) > AF711A (45%) > AF718C (43%) > AF710 (40%) > AF730 (40%) > AF730 II (36%) > AF711 (19%) > AF721 (13%) (ver Tabela). Os efeitos agonísticos destes agonistas foram bloqueados pelo agonista seletivo de Ml selective, pirenzepina. Encontrou-se que o AF710B como sendo altamente seletivo para o mAChR Ml e que não mostrou atividade agonista detectável nos sub-tipos mAChR M2-M5, respectivamente.

Os compostos AF706, AF712-AF716, AP726 e AF727 (100 ÜM) mostraram atividade antagonista no mAChR Ml como evidenciado por uma troca para a direita da curva de concentração de carbacol (Tabela).

A atividade ortostérica ou alostérica do agonista muscarínico de Ml pode ser testada na presença ou ausência do modulados alostérico de Ml brucina (Sur et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 2003, 100:13674-13679). Pré-incubação com Brucina (100 DM) de culturas de células transfectadas de forma estável com mAChR Ml ou em células de ovário de hamster chinês transfectadas de forma estável tanto com mAChR Ml quanto a proteína precursora de amilóide 695 provocou um efeito de potencialização forte sobre a elevação dos íons cálcio intracelular induzida pelo agonista ortostérico tal como carbacol, como mostrado por uma troca para a esquerda de suas curvas respostas de concentração, respectivamente. Brucine não apresentou tal efeito seja em AF710 seja em AF710B, e induziu uma ligeira inibição dos efeitos de AF710B; tomados em conjunto, estes resultados mostram que AF710 e AF710B não interagem com o sítio ortostérico do mAChR Ml, e, desta forma, são agonistas alostéricos. Ver Fig. 1.

O ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) mede as alterações que ocorrem dentro das células, envolvendo a ativação mitocondrial, indicativa de um processo qie eventualmente leva à morte celular (Fagarasan et al., Mol. Psychiat. 1996, 1:398-403). Este ensaio é um indicador específico precoce do mecanismo da morte celular mediada por β-amiloide (Shearman et al.,PNAS USA 1994, 91:1470-74). Este ensaio foi utilizado para avaliar compostos de fórmulas I e II. Células de feocromocitoma de rato (PC 12) foram plaqueadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 10000 celulas/poço, e mantidas em meio de Eagle modificado da Dulbecco (Gibco, Cat. 21969) suplementado com soro fetal bovino 5% (Biological Industries, Cat. 04-121-1A), soro eqüino desativado a quente 10% (Gibco Cat. 26050), L-glutamina 200 mM (Biological Industries, Cat,03-020-lC), penicilina 10000 U/ml (Biological Industries, Cat 03-031-1C), e anfotericina B 50 mg/ml (Biological Industries, Cat. 01-029-1C). NO dia seguinte, o meio foi renovado com meio livre de soro e as células foram tratadas com 5 DM β-amiloidw 25-35 (H- 1192,0001, Bachem) na presença e na ausência do composto de teste. Os compostos foram testados por 6 horas, respectivamente, em concentrações finais variando entre 0,1 nM e 100 DM. Ácido 3- indol-propiônico (3-DPA, Cat. 220027, Sigma Aldrich) serviu como anti-oxidante de referência. 3-IPA, AF710 e AF711 protegeram as células contra toxidez induzida por Aβ 25-35 (um peptídeo quecontém a seqüência de aminoácidos (AA) 25-35 do β- amilóide que contém 40 ou 42 aminoácidos) em uma faixa de concentração de 10 ÜM-1 nM. Estes rusultados mostram que AF710 e AF711 apresentam propriedades antioxidantes.

Estudos de secreção de oc-APPs após incubação com os compostos testados foram realizados como descrito em Haring, et al.J. Neurochem., 1998, 71:2094-103. Células de ovário de hamster chinês (CHO) duplamente transfectadas com APP695 humano e com mAChR Ml humano, ou células de feocromocitoma de rato (PC 12) transfectadas de forma estável com mAChR Ml de rato foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 x 106 celulas/poço. Um dia mais tarde, as células foram lavadas duas vezes com meio livre de soro, e tratadas com o composto de teste em várias concentrações variando de 0,1 nM a 100 CM. Em cada placa, um pço serviu como controle (sem tratamento) e um poço como referência positiva na qual as células foram tratadas ou com 1 ou com 100 CM de carbacol (CCh) (resposta máxima). Após 1 hora o meio condicionado foi coletado para tubos Eppendorf frios, que incluíam uma mistura de inibidores de protease (0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF); 5 □g/ml de leupeptina; 5 Dg/ml de pepstatina e 5 unidades/ml de aprotinina) para a determinação da liberação de αAPPs release. O conteúdo de proteína em cada amostra foi concentrado utilizando-se tubos Centricon (Amicon, Beverly, MA). Após a determinação da proteína (ensaio de proteína Bio-Rad), quantidades iguais de proteína (30 üg proteína/pista) foram carregadas em Géis NuPage Novex Bis-Tris 4-12% (hivitrogen, CA) e então submetidas a eletroforese. Quando a eletroforese estava completa, os géis foram colocados sobre membranas Immuno-Blot PVDF (0,2 Dm, Bio-Rad Lab, CA) utilizando-se unidades de transferência Hoefer semi-secas (Semi-Phor, Hoefer Scientific Inst., San Francisco, CA). As membranas foram então bloqueadas com leite em pó integral 5% dissolvido em solução salina de tampão fosfato da Dulbecco sem cálcio e magnésio (DPBS; Gibco, Cat 14200) com 0,1% de Tween-20 (Sigma, Cat P5927). As bandas de células CHO duplamente transfectadas com APP695 humano e mAChR Ml APPs foram submetidas a sondas utilizando-se proteína beta anti-amilóide (1:1000, anticorpo monoclonal 6E10, MAB1560, Chemicon) e IgG de coelho anti-camundongo ligada a peroxidase (1:5000; Jackson Immuno Research, PA). As bandas de celuças PC12 transfectadas de forma estável com mAChR Ml APPs foram submetidas a sondas utilizando-se a proteína precursora anti-Alzheimer A4 (1:4000; anticorpo monoclonal 22C11 antibody, Boehringer Mannheim) e a IgG de coelho anti-camundongo ligada a peroxidase (1:20,000; Jackson Immuno Research, PA). Após lavagem extensiva, as membranas foram tratadas com Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, MA) seguindo-se exposição a filme SuperRX (Fuji Medical X-ray film, Tóquio, Japão). A determinação quantitativa das bandas de APPs total foi realizada pelo programa Scion Image (NIH, Bethesda, EUA). As amostras de controle e CCh foram ensaiadas em paralelo e assim possibilitaram a compilação de dados de experimentos separados. O AF710 aumentou a liberação de cxAPPs nas células CHO e PC12 transfectadas, por concentrações variando de 0,1 nM a 1 ÜM. Os níveis elevados de ccAPPs observados nas células PC12 transfectadas não foram observados nas células PC 12 que não foram transfectadas.

Em comparação com as células de controle não tratadas, a secreção máxima de αAPPs nas células CHO duplamente transfectadas foi aumentada na seguinte ordem: AF710B (0,01 DM 225%) > AF710 (0,1 DM 175%) > AF710A (1 DM 125%).

A detecção dos níveis de GSK-3β foi avaliada utilizando-se Western Blotting em células de feocromocitoma de rato (PC12) transfectadas de forma estável com mAChR Ml tratadas com os compostos de teste (+/- Aβ] 25-35, 20 ÜM) utilizando-se um protocolo similar ao descrito em Fang et al., Mol. Cell. Biol. 2002, 22:2099-110), mas utilizando-se anticorpos seletivos para Fosfo-GSK3β (Ser 9), isto é, a forma inativa de GSK3β (ver Doble et al.,J. Cell. Sei. 2003, 116:1175-86), adquiridos da Cell Signaling Technology, EUA. Este anticorpo não detecta a GSK-3β não fosforilada (até 1 üg) e não apresenta reação cruzada com GSK-3a. O anti-GSK-3 (Santa Cruz Biotechnology) é um anticorpo monoclonal independente de fosforilação reativo tanto com GSK-3a quanto com GSK3β. Nos mesmos experimentos o status fosforilação da proteína tau foi estudado utilizando-se o anticorpo monoclonal de camundongo anti- Tau-1 (Chemicon, CAT number MAB3420), que reconhece um epitopo não fosforilado de tau. A presença de Aβ25-35 (20 ÜM) resultou em uma redução de 40-50% na marcação pela Fosfo-GSK3β (Ser 9), que rotula a forma inativa de GSK3β. Isto indica uma elevação da presença da forma ativa. AF710B (100 DM-10 nM) inibiu a super- ativação de GSK-3β indzida por Aβ25-35 (20 DM). Nos mesmos experimentos Aβ25- 35 (20 DM) reduziu em 40-60% a marcação de Tau-1 e AF710B (100 QM - 10 nM) restaurou estes efeitos para o nivel de controle. Tomados em conjunto estes resultados mostram que o AF710B reduziu a super-ativação de GSK3β e a super-fosforilação da proteína tau.

Estudos de ligação foram realizados utilizando-se homogeinados de cérebro de rato (córtex ricos em mAChR Ml), como descrito em Fisher et al.,J. Pharmacol. Exptl. Therap. 1991, 257:392-403. O córtex cerebral foi dissecado e colocado em gelo, limpo,pesado e transferido para tampão Tris-HCl 20 mM, 2mM EDTA, pH 7,4. O tecido foi homogeneizado no tampão (1:10 peso/volume) utilizando-se homogeneizador politron e após um cilco -70°C congelamento/descongelamento, os homogeinados foram centrifugados a 35000 g a 4°C por 10 min. O sobrenadante foi removido e os péletes foram re-suspendidos em tampão Tris em uma razão de 1:6 (peso/volume). Os homogeinados foram divididos em aliquotas de 1 ml cada e então armazenados a 70°C até o momento da utilização. O perfil de ligação para a ligação do composto de teste ao mAChR foi estudado utilizando-se o antagonista seletivo de Ml, (3HJ- pirenzepina ([3H]PZ; atividade específica 86 Ci/mmol, adquirido da Perkin-Elmer, MA, EUA) nas membranas corticais de rato. Várias concentrações de um composto testado (por exemplo, lO^-lO4 M de concentração final) foram pipetadas em tubos de vidro de 13 x 100 mm contendo [3H]PZ (nas concentrações finais variandoentre 4-6 nM em cada experimento idividual), 20 mM de tampão Tris/Mn, pH 7,4, contendo 1 mM de EDTA e 2 mM de MnCL e membranas corticais (diluídas como especificado acima) em conjunto em um volume final de 0,2 ml. As ligações total e não específica foram determinadas na ausência do ligante competitivo ou na presença de 10 ÜM de atropina, respectivamente. Todos os ensaios foram conduzidos em triplicata a 25°C oor 1 hora. Ao final do período de incubação, os tubos foram imersos em um banho de gelo e seus conteúdos foram filtrados. O material ligado foi aprisionado em filtros pré-embebidos (0,5% polietilenimina por 1 hora) GF/B 317 x 57 mm (Whatman, Tamar, Jerusalém, Israel) utilizando-se um sistema Brandel (M-24R, Gaithersburg, MD, EUA). Os filtros foram então secadoa e colocados em frascos. Foi adicionado fluido de cintilação (Biodegradable Counting Scintillant, Amersham, EL, EUA) e a radioatividade foi medida utilizando-se um contador de cintilação de líquido PerkinElmer TriCarb 2800. Os valores de curvas de competição, KH, KL foram derivados utilizando-se o programa de computador GraphPad Prism, versão 3.0. Neste estudo, o AF710B mostrou uma curva de ligação de dois locais para mAChR Ml em membranas corticais de rato, com um intervalo de magnitude da ordem de 5 vezes entre os dois locais de ligação, um local de ligação de maior afinidade KH = 0,23 nM (37%) e um local de ligação de menor afinidade KL = 34,5 DM (63%).

Uma determinação de perfil de alta resuloção que consiste em uma coleta ampla de 80 transmembranas e receptores solúveis, canais de íon e transportadores de monoamin, foi realizada em AF710B. Foi especificamente desenvolvida para produzir informação não apenas quanto as limitações potenciais dos fármacos candidatos, mas também para a identificação de atividade fora do alvo. Os resultados obtidos indicam que AF710B se liga aos mAChR Ml e M2 e a outros receptores. Em uma extensão adi deste estudo, foram realizados estudos funcionais na maioria destes receptores. Foi encontrado que efeitos mediados por mAChR Ml de AF710B em leituras neuroquímicas a montante (por exemplo, αAPPs, GSK3β, tau) foram detectados em concentrações com ordem de magnitude 3-5 menores vs. Interações com o outro GPCR.

Estudo de toxicidade aguda em ratos: AF710B (1, 10 e 50 mg/kg) e um veículo inativo como controle foram administrados oralmente por gavagem a grupos de 3 machos + 3 fêmeas / dose e avaliou-se para possíveis efeitos tóxicos ou outros efeitos evidentes. No dia da dosagem, exames clínicos cuidadosos foram realizados e registrados periodicamente durante as primeiras 4 após a dosagem e ao final do respectivo dia de trabalho. Após isto, os animais foram inspecionados e sinais clínicos foram registrados pelo menos uma vez ao dia por todo o período de observação de 14 dias. As observações incluíram alterações na pele, pelo, olhos, membranas mucosas, ocorrência de secreções e excreções (por exemplo, diaréia) e atividade autonômica (por exemplo, lacrimejamento, salivação, piloereção, tamanho de pupila, pdrão respiratório não usual). Alterações de andamento, postura e resposta a manipulação, bem como a presença de comportamento bizarro, tremores, convulsão, sono e coma foram também examinados. Nenhuma mortalidade ocorreu em qualquer dos dos animais tratados com o item de teste ou com os animais tratados com o veículo de controle antes da eutanásia agendada, realizada 14 dias após a administração por gavagem oral (PO). Nenhuma reação adversa óbvia relacionada ao tratamento foi observada entre os animais tratados com o item de teste ou com os animais tratados com o veículo de controle no dia respectivo da dosagem ou durante todo o periodo de observação de 14 dias, excluindo uma ligeira redução da atividade motora e dispinéia ligeira, observada 5 minutos após a dosagem em um único rato macho, submetido ao item de teste com nível de dose de 50 mg/kg e completamente recuperado 100 minutes após a administração. Tendo em vista o método seqüencial aplicado no presente estudo e de maneira a padronizar, tanto quanto possível, todos os valores de peso corporal e ganho de peso corporal, foi calculada a respectiva percentagem de alteração no peso corporal vs. o dia da dosagem para cada dia de dosagem para cada animal e grupo de animais. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi revelada entre todos os grupos tratados com o item de teste vs. o grupo de veículo de controle, excluindo uma redução estatisticamente significativa (p < 0,05) na alteração do peso corporal percentual médio do grupo de um grupo de ratas (nível de dose de 10 mg/kg), observado 7 dias após a dosagem. Todos os animais foram submetidos a uma necropsia completa detalhada e exame patológico completo após o sacrifício agendado. Na necropsia, todos os animais foram submetidos a exame completo, incluindo a superfície externa do corpo, todos os orifícios, cavidades cranianas, torácicas e abdominais e seus conteúdos. Nenhuma observação patológica importante ficou evidente macroscopicamente entre todos os animais tratados com o item de teste ou os aminais tratados com veículo de controle no momento de de sua necropsia agendada, conduzida 14 dias após a administração por gavagem oral (PO). Foi calculada uma Dose Tolerada Máxima (MTD) do item de teste AF710B, após uma administração por gavagem oral (PO) ao rato.

Trihexifenidil é um antagonista muscarínico seletivo de Ml que atravessa a barreira hemato-cerebral e induz incapacidades de memória e de aprendizado (Bymaster et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther. 267: 16-24, 1993; Roldan et al., Neurosci. Lett. 230: 93- 96, 1997; Kimura et al., Brain Res. 834: 6-12, 1999). Desta forma, a administração sistêmica deste composto é útil como ferramenta farmacológica para a investigação do papel dos receptores muscarínicos cerebrais Ml nos processos de aprendizado e memória. Foram utilizados ratos Wistar Naive nos experimentos abaixo. A tarefa de evitar passivamente (PA) consiste em uma fase de treinamento (aquisição) e uma fase de retenção. No procedimento de treinamento cada rato foi colocado individualmente no compartimento pequeno iluminado e após 60 segundos de familiarização/adaptação, a porta para o compartimento grande foi aberta e a latência em entrar foi medida (Latência Inicial). Imediatamente após a entrada no0 compartimento escuro, a porta foi fechada e foi aplicado um choque inescapável no pé (0,6 mA por 3 s) por meio de um chão em grade. Um ponto de corte de 180 s foi utilizado para a latência inicial. Os animais que falharam em entrar em 180 s foram excluídos do experimento. Após o teste de aquisição o rato foi retornado para sua gaiola original. A retenção da tarefa de evitar passivamente foi medida 24 h mais tarde, colocando-se novamente o rato no compartimento iluminado e após um intervalo de adaptação de 60 s, a porta foi aberta e a latência em re-entrar no compartimento escuro foi medida. Um ponto de corte de 300 s foi utilizado para a latência de retenção. Os animais que falharam em entrar em 300 s foram removidos do aparelho e uma latência de 300 s foi registrada para estes. Os ratos foram divididos em 2 grupos. Um grupo (N = 40) foi tratado com trihexifenidil (5 mg/kg, s.c.) e o segundo grupo (N = 30) foi tratado com água duplamente destilada (DDW 1 ml/kg, s.c.), 30 minutos antes do choque. Em cada grupo, os ratos foram divididos em 4 sub-grupos de tratamento (N = 9-11 para o grupo tratado com for the trihexyfenidil e N = 7-8 para o grupo tratado com DDW): um sub-grupo foi tratado com DDW (10 ml/kg, p.o.), e tres sub-grupos foram tratados com AF710B (0,01, 0,03 & 0,1 mg/kg, p.o.) 60 minutos antes do choque. Uma interação significativa foi encontrada entre os tratamentos com trihexifenidil e DDW (F(2/63) = 4,0, p < 0,023). A latência de retenção dos ratos trihexifenidil tratados com DDW (54,22 ± 14,60 s) foi significativamente mais curta que a dos ratos de controle tratados com DDW (242,00 ± 30,60 s) (p < 0,001). Entretanto, a latência de retenção dos ratos trihexifenidil tratados com AF710B 0,01 mg/kg (252,50 ± 32,30 s), e 0,03 mg/kg (178,82 ± 32,70 s) foi significativamente mais longa que os ratos trihexifenidil tratados com DDW (p < 0,01-0,001). A latência de retenção dos ratos trihexifenidil tratados com AF710B 0,1 mg/kg (122,00 ± 34,60 s) não foi diferente da dos ratos trihexifenidil tratados com DDW. Desta forma, foi encontrado que o AF710B é efetivo mesmo em doses de 0,01 mg/kg, p.o. (0,028 ümol/kg, p.o.).

De maneira a avaliar se os compostos de fórmula I seriam transportados para o SNC, foram calculados os coeficientes de partição para os compostos mostrados na Tabela 1. Os coeficientes de partição são uma medida da lipofilicidade e podem ser expressos numericamente como valores “log P”, onde log P é o logaritmo do coeficiente de partição de octanol-água ou tampão. Os valores de Log P podem ser ou determinados experimentalmente, incluindo por métodos de HPLC, ou por métodos computacionais previsores. Quanto mais alto o valor de log P, maior a lipofilicidade e, desta forma, a solubilidade em lipídeo da entidade química em questão. Substâncias com valores de log P altos se dissolvem melhor em gorduras e óleos que em água. Isto amplifica sua capacidade em entrar em membranas lipídicas (a base de gordura) no corpo por difusão passiva, aumentando assim seu potencial de absorção. Muitos fármacos apresentam um valor de log P entre 1 e 4, os tornando adequados para métodos orais de administração. Desta forma, o valor de log P provê uma orientação geral de se o fármaco pode acessar rapidamente o SNC ou não. O log P para os compostos mostrados na Tabela 1, calculados utilizando-se o programa de rede disponibilizado através da "Molinspiration"(www.molinspiration.com/cgi-bin/ properties. Molinspiration Calculation Services), um pacote para o cálculo de propriedades moleculares, foi em todos os casos entre 1 e 4.

* Calculado utilizando-se o programa de rede disponibilizado através da "Molinspiration", um pacote para o cálculo de propriedades moleculares Molinspiration Calculation Services (wwí!:.©oHnspir.ation.com£ç^-bm/properties). # Os efeitos em mAChR Ml foram avaliados por meio da imobilização de íons cálcio intramoleculares, como descrito acima. O mAChR Ml representa um GPCR particular. A presente invenção não está limitada aos compostos encontrados nos exemplos acima, e muitos outros compostos que recaem no escopo da invenção podem ser também preparados utilizando-se os procedimentos apresentandos nos esquemas de síntese io acima. A preparação de compostos adicionais de fórmula I utilizando-se estes métodos será óbvia a um especialista nas técnicas de química. A invenção foi descrita em detalhe com referência particular a algumas realizações desta, no entanto deve ser entendido pelos especialistas na técnica que variações e modficações podem ser efetuadas dentro do espírito e escopo da invenção.

Claims (19)

1. Composto espiro caracterizado pelo fato de apresentar a fórmula I:

onde A é selecionado do grupo consistindo em:

onde em todas as estruturas o carbono representado por “C” indica o carbono espiro, R é selecionado do grupo consistindo em H e Ci-6 alquil opcionalmente substituído, n e p são cada um independentemente selecionado de 0, 1 e 2, desde que n+p = 2; Y é -O- ou -S-; R1, R2, R3, R4 e R6 são cada um independentemente selecionado em cada ocorrência de H, Ci-6 alquil opcionalmente substituído, Ci-6 alcoxi opcionalmente substituído, Ci-6 hidroxialquil opcionalmente substituído, C2-6 alquenil opcionalmente substituído, e fenil opcionalmente substituído; R5 é selecionado do grupo consistindo em -C(O)-(Ci-3)-indol-3-il, -SO2-4- fluorfenil, -C(O)CH(n-propil)2, -C(O)-(4-hidroxi-3,5-di-tertbutilfenil), -C(O)-CH(NH2)- CH2-indol-3-il, e -C(O)-CH2CH3 opcionalmente substituídos; desde que quando A for outro que não

o composto é selecionado do grupo consistindo em:

(l-(2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]dec-4-il-3-(ÍH-indol-3-il)-propan-l-ona),

(1 -(2-dimetil-1 -oxa-4,8-diaza-spiro[4.5]dec-4-il)-2-propil-pentan-1 -ona),

(4-(4-fluoro-benzenosulfonil)-2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diaza-spiro[4.5]-decano),

(1 ',4-dimetil-6-(3 -indolpropionil)-spiro-(3 -oxa-6-aza-biciclo [3.1.0] -hexano-2,4'- piperidina)), e

(l’4-dimetil-6-[3-(4-fluorbenzenosulfonil)]-spiro-(3-oxa-6-aza-biciclo[3.1.0]hexano- 2,4'-piperidina)),

N-(2,8-dimetil-l-oxa-8-aza-spiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propionamida,

N-(2,8-Dimetil-1 -tia-8-aza-spiro[4.5] dec-3-il)-3-(1 H-indol-3-il)-propionamida, e

(3E)-2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona-O-[3-(lH-indol-3- il)propanoil] oxima; ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R ser metil.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de p e n serem cada um 1.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de A ser

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R1 ser metil.

6. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de R2 ser H.

7. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de R3 e R4 serem cada um H.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de Y ser S.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de Y ser O.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R5 ser -C(O)-(Ci-3)-indol-3-il opcionalmente substituído.

11. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de R5 ser selecionado do grupo consistindo em -C(O)-CH2-indol-3-il, -C(O)-CH2CH2-indol- 3-il, -C(O)-CH2CH2CH2-indol-3-il, trans-C(O)-CH=CH-indol-3-il e -C(O)-CH(NH2)- CH2-indol-3-il.

12. Composto de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de A ser

e R5 ser O-C( =O)-CH2CH2-indol-3-il.

13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de R5 ser selecionado do grupo consistindo em -SO2-4-fluorfenil, -C(O)CH(n-propil)2, R5 ser - C(O)-(4-hidroxi-3,5-di-tertbutilfenil) e -C(O)-CH2CH3.

14. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado de um dos seguintes:

(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propan-l-ona),

((R)-1 -(2,8-dimetil-1 -tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propan-1 -ona),

((S)-l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propan-l-ona),

1 -(2,8-Dimetil- l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(l -metil-indol-3-il)propan-1 -ona,

(3-(4-fluorbenzenosulfonil)-2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]-decano),

(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro [4.5]dec-3-il)-2-propilpentan-l-ona),

((3,5-di-tert-butil-4-hidroxi-fenil)-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-il)- metanona),

(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-4-(lH-indol-3-il)butan-l-ona,

(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-2-(ÍH-indol-3-il)etan-l-ona),

(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-propan-l-ona),

(l-(2,8-dimetil-1 -tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-( lH-indol-3-il)prop-2-eno-1 -ona),

l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(ÍH-indol-3-il)-propan-l-ona,

(R)-1 -(2,8-dimetil-1 -oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-1 -ona,

((S)-l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona),

(1 -(2,8-dimetil-1 -oxa-3,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-il)-2-propil-pentan-1 -ona),

(3-(4-fluorbenzenosulfonil)-2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]-decano),

(l-(2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diazaspiro[4.5]dec-4-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona),

(1 -(2,8-dimetil-1 -oxa-4,8-diaza-spiro[4.5]dec-4-il)-2-propil-pentan-1 -ona),

(4-(4-fluorbenzenosulfonil)-2,8-dimetil-l-oxa-4,8-diaza-spiro[4.5]-decano),

(1 ’,4-dimetil-6-(3-indolpropionil)-spiro-(3-oxa-6-aza-biciclo[3.1.0]-hexano-2,4’- piperidina)), e

(1 ’,4-dimetil-6-[3-(4-fluorbenzenosulfonil)]-spiro-(3-oxa-6-aza-biciclo[3.1.0]hexano-2,4’-piperidina)),

N-(2,8-dimetil-1 -oxa-8-aza-spiro [4.5] dec-3 -il)-3 -(1 H-indol-3 -il)-propionamida,

N-(2,8-Dimetil-l-tia-8-aza-spiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propionamida,

(3£)-2,8-dimetil-l-oxa-8-azaspiro[4.5]decan-3-ona-O-[3-(lH-indol-3-il)propanoil] oxima, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

15. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo em (l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(1 H-indol-3 -il)propan-1 - ona),(1 H-indol-3 -il)propan-1 - ona), (1 H-indol-3-il)propan-1 -ona), (+)-(1 -(2,8-dimetil-1 -tia-3,8-diazaspiro [4.5] dec-3 -il)-3 - (-)-(1 -(2,8-dimetil-1 -tia-3,8-diazaspiro [4.5] dec-3 -il)-3 - l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH- indol-3-il)-propan-l-ona, (+)-l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH- indol-3-il)-propan-l-ona, e (-)-l-(2,8-dimetil-l-oxa-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH- indol-3 -il)-propan-1 -ona.

16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um composto de acordo com a reivindicação 1 e um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável para este.

17. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser

(l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)propan-l-ona), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

18. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser

((R)-l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

19. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser

((S)-l-(2,8-dimetil-l-tia-3,8-diazaspiro[4.5]dec-3-il)-3-(lH-indol-3-il)-propan-l-ona), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

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