BRPI1002601B1 - Composição nanoparticulada contendo antibióticos para administração intramamária de uso animal - Google Patents

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Humberto De Mello Brandão
Vanessa Carla Furtado Mosqueira
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Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa
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Universidade Federal De Ouro Preto
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Abstract

produto e processo de preparo e de nanocápsulas poliméricas caracterizadas contendo cloxacilina benzatina aplicáveis ao tratamento da mastite bovina. a presente invenção refere-se ao desenvolvimento de dois tipos de nanocápsulas poliméricas as quais encapsularão o fármaco antimicrobiano cloxacilina benzatina. mais especificamente esta invenção trata de uma nova forma de tratamento para a mastite em gado leiteiro. foram desenvolvidas duas formulações de nanocápsulas que, poderão ser utilizadas para encapsular diferentes fármacos, além de encapsular o fármaco cloxacilina benzatina objetivando uma nova terapia para a mastite em vacas, contornando o inconveniente do emprego de altas doses de fármaco empregadas nas formulações tradicionais, contribuindo para a melhora da qualidade do leite.

Description

Composição nanoparticulada contendo antibióticos para administração intramamária de uso animal
A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de duas formulações de nanocarreadores (NC) poliméricos, os quais encapsulam fármacos antimicrobianos derivados da penicilina tal como a cloxacilina benzatina. Mais especificamente esta invenção trata de uma nova composição destinada ao tratamento da mastite em animais de produção (bovinos, caprinos, ovinos, bubalinos, eqüídeos e camelídeos) no período seco.
A presente invenção descreve a técnica de preparo de duas formulações de nanocarreadores do tipo reservatório que podem encapsular diferentes fármacos com ação antibiótica, particularmente o fármaco cloxacilina benzatina, largamente utilizado no tratamento da mastite bovina. Objetiva-se uma nova terapia para a mastite em gado leiteiro, contornando o inconveniente da administração de doses repetidas, do emprego de altas doses de fármaco usadas nas formulações tradicionais, da baixa retenção do fármaco dentro do teto, contribuindo para a melhora da produção de leite. Utilizando-se esta formulação a eficácia do fármaco pode ser aumentada, devido à alta adesão dos nanocarreadores aqui mencionados aos tecidos glandulares das porções superiores do úbere dos animais. Além disso, o fármaco na sua forma livre, tal como é administrado nas formulações comercializadas, está disponível para atingir o sangue a partir do local de administração, podendo, portanto, atingir outros tecidos que não os afetados pelos microorganismos causadores da mastite. O fármaco na forma nanoencapsulada fica mais restrito aos sítios de ação no tecido e nas células alvo da infecção pelos agentes causadores da mastite microbiana, graças às especificidades dos componentes da formulação e do método de produção das formulações nanoestruturadas aqui apresentadas. O fármaco antimicrobiano encapsulado, pode assim atingir especificamente o alvo e ser liberado lentamente e, principalmente, no sítio de ação, evitando perdas e inativações do fármaco em outros tecidos. Desta maneira as doses podem ser reduzidas e a eficácia aumentada.
A mastite bovina continua sendo um fator limitante da produção leiteira em muitas propriedades no Brasil, surgindo como o mais freqüente causador de prejuízos aos produtores de leite. O tratamento se limita aos casos clínicos emergenciais quando o prejuízo já é inevitável. Antibióticos e antiinflamatórios são as drogas mais utilizadas para o tratamento da mastite (Gruet et al.,2001).
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As mastites em gado leiteiro freqüentemente ocorrem durante o período seco ou no início da lactação. A principal bactéria causadora de mastite, o Staphylococcus aureus pode formar focos encapsulados nas porções altas do úbere, desenvolvendo uma forma subclínica, o que dificulta a cura bacteriológica durante a lactação, pois os antibióticos usados nesta fase são de tiro-curto (ou seja, meia-vida curta no alvo de ação), devido ao período de retirada do leite, não permanecendo em níveis terapêuticos por tempo suficiente para determinar a eliminação completa da bactéria na forma cística. Neste caso, não havendo tratamento durante a secagem, estas bactérias podem atravessar todo o período seco e retornar na lactação seguinte. Outras bactérias têm sido isoladas durante o período seco, tais como Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae e Corynebacterium pyogenes, as quais estão também entre os agentes causadores da mastite microbiana. O tratamento dos animais no período seco reduz tanto o número de infecções durante esta fase quanto o de novas infecções no início da lactação. Em média, pode-se eliminar 90% de infecções por Streptococcus agalactiae e 70% por Staphylococcus aureus com o tratamento no período seco (Naztke, 1971). Entretanto, a eficácia pode ser aumentada se a retenção dos fármacos nos sítios de infecção também aumentar.
A maioria das formulações comercializadas no Brasil para o tratamento da mastite em bovinos é do tipo suspensão intramamária como no caso da Orbenin® Extra Dry Cow. Existem também associações entre antibióticos como no caso da Bovamast® (Bayer) que é uma suspensão dos antibióticos cloxacilina benzatina e ampicilina. Vários tratamentos estão disponíveis, dentre eles os que previnem a doença e os que a tratam. Sendo assim, composições para lavagem dos tetos estão apresentadas na patente U.S. 5,211,961, na qual é usada como ducha antibacteriana. Outra alternativa, presente na EP 1104233 e na EP 799047 tratam de composições capazes de formar um filme que podem ser aplicadas nos tetos dos animais para formar uma barreira à entrada de bactérias. Outra forma envolve a formação de uma barreira física no canal do teto para prevenir a entrada de patógenos como descrito em GB 1441747. Já a GB 2273443 descreve o uso de uma formulação antibacteriana e de uma barreira para tratar mastite em vacas. Por exemplo, em GB 2273441 esta barreira é formada por um gel e um sal de metal pesado não tóxico. Ao contrário do esperado, a co-administração de um produto a base de óleo com uma formulação que bloqueia o canal do teto, contendo um sal de metal pesado leva à melhora na efetividade de barreira tal como apresentado em GB
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2296424. São diversos os tipos de óleos utilizados tais como o mineral, o de silicone e os vegetais. Entretanto, existem os riscos de acúmulo de metais pesados no organismo do animal e posterior contaminação do leite no período da lactação. A grande maioria das formulações supracitadas apresentam a desvantagem de não eliminar os focos císticos de bactérias, o que acarreta a recidiva da infecção nos animais. Já as formulações que atuam como barreira (GB 1441747, GB 2296424) possuem caráter preventivo não sendo eficazes em animais já infectados.
Os produtos comercializados no Brasil para tratamento da mastite bovina apresentam o inconveniente do emprego de altas doses de fármaco (geralmente 500-600 mg por teto) por via intramamária. Estes tratamento possuem o inconveniente de múltiplas infusões (1 a 4 aplicações durante a fase seca) o que pode acarretar feridas no canal do teto do animal, devido à cânula pela qual a suspensão penetra no interior do úbere, aumentando o risco de contaminação da glândula com novos patógenos durante a administração.
As formulações tradicionais utilizadas não possibilitam a internalização do fármaco nas células alvo. O fármaco livre, mais solúvel, tem pouca chance de penetração em altas concentrações nos neutrófilos infectados, não eliminando os focos de infecção intracelulares, gerando recidivas tardias pós-tratamento. A formulação proposta, devido à sua constituição, tem capacidade de aderência e penetração intracelular nas células constituintes da glândula mamária (fagócitos e células da superfície do ácino, dueto e cisternas glandulares) penetrando por fagocitose, endocitose não específica e por adsorção física na superfície celular (Mosqueira et al., 1999), tanto por interações eletrostáticas dos nanocarreadores com a membrana celular quanto por interações hidrofóbicas com proteínas e glicoproteínas. Essas formulações possuem o grande diferencial devido à sua capacidade aumentada de residência e adesão no interior da glândula, o que aumenta as chances de resolução da infecção (eficácia) e reduz potencialmente as recidivas, principalmente por que a glândula mamária apresenta alta concentração de neutrófilos (Oliveira et al., 2009). As recidivas são freqüentes com as formulações tradicionais que não possuem penetração intracelular elevada e com isso não atingindo a concentração mínima inibitória (CMI) dentro do compartimento intracelular. O fármaco livre penetra dentro das células por outros mecanismos mais lentos e dependentes de transporte unimoleculares, ao passo que, na forma nanoparticulada um número muito maior de moléculas penetra de uma só vez dentro das células, encapsuladas dentro dos nanocarreadores, agindo de forma similar a um
4/13 “Cavalo de Tróia'1'. Outra forma é a adesão não-específica de milhares de nanocápsulas na superfície das células, o que também promove a absorção de maior quantidade de fármaco pela célula alvo. A nanoencapsulação também impede a rápida metabolização do fármaco pelas células após administração e impede a eliminação rápida do fármaco do local de ação, o que ocorre quando o fármaco é administrado na sua forma livre, ou não encapsulada. Os excipientes utilizados nas formulações propostas são inócuos, biodegradáveis, biocompatíveis, de origem natural e não comprometem as funções da glândula, não produzindo nenhum tipo de lesão celular ou citotoxicidade (Mosqueira et al., 2000 e 2001).
Neste contexto, a administração de uma formulação nanoparticulada por via intramamária é uma alternativa promissora para tratamento efetivo da mastite em rebanhos leiteiros. Sua aplicação tem o potencial de aumentar a retenção do fármaco nas células infectadas por microorganismos, principalmente por S. aureus. Uma propriedade importante das formulações aqui apresentadas é a capacidade de permanecer no local da ação durante o período seco do animal (período de transição entre duas lactações). Assim, com intuito de obter um produto para tratamento da mastite, caracterizada por uma administração intramamária, ou mesmo por injeções locais por via parenteral, que não necessite de múltiplas infusões (dose única e liberação prolongada) e que tenha capacidade de aderir e penetrar nas células infectadas da glândula mamária do animal (direcionamento do princípio ativo) chegou-se ao resultado que é o objeto desta invenção, a qual apresenta uma nova formulação de antibiótico encapsulado em nanocarreadores de natureza lipídica e polimérica.
Apesar da existência na literatura de micropartículas contendo antibióticos para mastite nos trabalhos de: Ziv and Linder. “Encapsulated forms of slow-release dry cow products of rapidly absorbed antibiotics”. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics 6 (2008) 33 - 40; Henry-Michelland e cols.” Attachment of antibiotics to nanoparticles: preparation, drug release and antimicrobial activity in vitro”. International Journal of Pharmaceutics 35 (1987) 121-127 ; Fattal E. e cols. “Ampicillin loaded liposomes and nanoparticles: comparison of drug loading, drug release and in vitro antimicrobial activity. Journal of Microencapsulation 8 (1991) 29-36; Anderson J C. e cols.” The effect of incorporation of cioxacillin in liposomes on treatment of experimental staphylococcal mastitis in mice”. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 9 (1986) 303-9 e nos documentos de patente EP0260854 e WO 9531180 (Al), a
5/13 presente invenção trata do encapsulamento de antibióticos em nanocarreadores com capacidade adesiva no úbere dos animais.
Na pesquisa realizada na literatura e nos bancos de dados de patentes não foram encontrados registros que relacionassem o antibiótico cloxacilina benzatina e nanocarreadores com aumento de eficácia antibacteriana na mastite na forma nanoestruturada. Além disso, em nenhum desses documentos é feita referência ao uso de materiais que possibilitam a adesão dos nanocarreadores às células da parte superior do teto após administração intramamária o que aumenta as chances de eficácia destas novas formulações para uso veterinário em relação aos produtos comercializados e patenteados. No mesmo contexto, não existe referência de nanopartículas poliméricas contendo cloxacilina benzatina que tenham alta possibilidade de penetrar nas células infectadas e liberar o fármaco de forma prolongada.
A patente WO9531180 descreve um tratamento para mastite compreendendo a administração de uma formulação composta por uma suspensão aquosa de cloxacilina benzatina micronizada e em seguida de um gel contendo um metal pesado para selar o teto, o que pode causar no período de lactação uma eventual contaminação do leite por metais pesados. Além disso, neste documento os resultados referentes à velocidade de liberação do antibiótico não estão apresentados.
A patente EP0260854 descreve o microencapsulamento de uma mistura de cloxacilina benzatina e ampicilina trihidratada para tratamento da mastite, mas apresenta uma polidispersão das partículas muito grande, sendo difícil ou impossível prever a velocidade de liberação do fármaco a partir dessas microestruturas. Entretanto, as microcápsulas possuem menor capacidade de adesão à parte superior das células do teto devido ao seu maior peso, que podem levar à sedimentação próxima ao canal do teto devido à diferença de densidade, ao passo que a forma nanoparticulada não se sedimenta devido às suas características coloidais.
A patente RU2350332 descreve uma emulsão contendo doxiciclina para tratamento da mastite em vacas no período seco, apresentando o inconveniente de ser instável em meio fisiológico, principalmente no leite o qual apresenta caseína. Além disso, não possui liberação controlada, nem direcionamento do fármaco. As emulsões são menos estáveis em meios biológicos devido às interações com as lipoproteínas, liberando o fármaco mais rapidamente (Mosqueira et al., 2007). Já os nanocarreadores possuem
6/13 uma parede polimérica mais resistente à degradação e que controla a liberação do fármaco.
A patente CN101439044 descreve um gel contendo polivinilpirrolidonaiodo (PVP-I) para tratamento da mastite, mas apresenta o incoveniente de poder causar uma reação inflamatória no úbere do animal como efeito adverso do tratamento, tendo o potencial de produzir uma mastite química induzida pelo efeito irritante do iodo liberado.
As patentes KR 20080083499 e KR 20070059787 utilizam nanopartículas de prata coloidal para tratamento da mastite, mas apresentam o inconveniente de resíduos no leite ou até mesmo a prata pode atravessar a barreira hemato-glandular atingindo a circulação sistêmica.
A cloxacilina na forma sódica é utilizada para tratamento da mastite durante a lactação por via intramamária. De acordo com Anderson et al. (1986) a cloxacilina encapsulada em lipossomas foi direcionada para o tratamento da mastite na fase de lactação entretanto, o uso de sistemas de liberação sustentada durante este período aumenta o descarte de leite, visto que o tempo de cedência do fármaco é maior. O lipossoma tem estabilidade reduzida em meio fisiológico quando comparada aos nanocarreadores poliméricos. Este tratamento foi realizado em modelo murino, o que não está relacionado diretamente com a presente proposta. Os lipossomas são formulações bastante instáveis, onerosas e de difícil estabilização e produção comparativamente as nanocápsulas produzidas nesta invenção.
Sistemas carreadores modernos de fármacos tem sido alvo de numerosos estudos na área farmacêutica com intuito de controlar a velocidade de liberação dos fármacos no organismo, diminuindo a dose necessária e aumentando a seletividade em relação ao alvo (Schaffazick et al.,2003; Chacón et al.,1999; De Chasteigner et al., 1996; SantosMagalhães et al., 2000).
Os nanocarreadores poliméricos do tipo reservatório são constituídos de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica (Legrand et al., 1999), funcionando como carreadores de escolha para a administração de substâncias de baixa solubilidade em água como a cloxacilina benzatina, pois são formadas por polímeros estáveis, com baixa toxicidade que consistem de materiais biocompatíveis e biodegradáveis, os quais são degradados in vivo em fragmentos menores facilmente excretados, como o dióxido de carbono e água.
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Para a preparação dos nanocarradores são utilizados polímeros geralmente na faixa de 0,2 a 2% (p/p). Poliésteres, poliamidas, policianoacrilatos, policarbonatos, poliuretanos, quitosanas, quitinas, gelatinas, metacrilatos, copolímeros do ácido metacritalo e ésteres --------acrílicos, polialquilacrilatos, polimetilacrilatos, polímero do álcool vinílico, ou 5 combinações ou misturas destes materiais podem ser empregados, de forma geral.
Entretanto os mais indicados pela sua degradabilidade são os poliésteres hidroxiácidos: homo ou co-polímeros do ácido lático, glicólico e hidroxicapróico e suas diferentes combinações e proporções com peso molecular variando de 2000 a 100000. A saber: ácido poli (D, L - lático), ácido poli (glicólico), ácido poli (lático-co-glicólico), poli-ε10 caprolactona, poli-3-hidroxibutirato, poli-P-(hidroxibutirato-co-valerato) e poli(hidroxialcanoatos).
Surfactantes hidrofílicos (tais como polisorbatos 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81, 85 e 120; copolímeros de polióxido de etileno-polióxido de propileno tais como os poloxamersl24, 188, 237, 338 e 407) e lipofílicos (ésteres do sorbitano tais como 15 monolaurato de sorbitano, trilaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, triestearato de sorbitano, monooleato de sorbitano, trioleato de sorbitano; lecitinas; poligliceril-6 dioleato) também são utilizados, usualmente de 0,2 a 2% (p/p).
Os óleos empregados podem ser vegetais (óleo de soja, milho, algodão, oliva, amêndoa, 20 girassol, uva) ou minerais (parafina líquida, parafina líquida “light”) ou ésteres de ácido graxo (poligliceril-6 dioleato, polietilenoglicol-6 do óleo de oliva, amendoim e milho) e triglicerídeos de cadeia média (tal como triglicerídeo do ácido cáprico/caprílico) devendo apresentar ausência de toxicidade, não serem capazes de degradar ou solubilizar o polímero e alta capacidade de dissolver a droga em questão (Legrand et 25 ízZ.,1999).
Os nanocarreadores podem ter a superfície modificada por revestimento com quitosana. Os nanocarreadores aqui propostos obtidos de ροϋ-ε-caprolactona, por exemplo, concentram os fármacos encapsulados em células do sistema fagocitário mononuclear (SFM). As nanocarreadores convencionais revestidos com quitosana possuem uma 30 característica de bioadesividade que aumenta a retenção da partícula carregada de fármaco no local de ação, por exemplo nas partes superiores do úbere.
Neste contexto, estudos recentes com nanocarreadores do tipo reservatório têm mostrado que estas estruturas possuem vantagens específicas sobre lipossomas, pois
8/13 possuem maior estabilidade física em meio biológico, baixa toxicidade inerente, elevada encapsulação de substâncias lipofílicas em seu núcleo oleoso (Legrand et al., 1999, Mosqueira et al., 2001 e 2006). Além disto, eles podem ser produzidos por método simples, rápido, eficiente e de baixo custo. De forma similar aos lipossomas, as nanopartículas poliméricas de mesmo tamanho também podem ser captadas pelos focos inflamatórios devido ao aumento da permeabilidade vascular no local (Barratt, 2000), conforme consta das patentes US 6,171,796; US 6,632,671 e US 7,060,689 e PI0605102-2A.
A quitosana é um polissacarídeo hidrofílico, amino derivado do processo de desacetilação da quitina que constitui a carapaça de insetos e crustáceos. Por ser um polímero natural e biodegradável a quitosana tem sido proposta como um material atraente para usos diversos, principalmente em engenharia, biotecnologia e medicina (Hirano, 1999). A quitosana é insolúvel em água, podendo ser caracterizada como um polieletrólito catiônico. E solúvel em ácidos orgânicos fracos ou diluídos como ácido acético 3% produzindo uma solução viscosa. Para se contornar o problema da insolubilidade em água, que limita sua aplicação em vetores de fármacos, principalmente para veicular peptídeos e genes, trabalhos têm sido publicados trazendo diferentes metodologias de obtenção de quitosanas solúveis em água (Signini e Campana, 2001; Garcia-Fuentes et al., 2005) desde incubação até a incorporação da quitosana em métodos de produção de nanopartículas pré-preparadas. Como exemplo, o revestimento de nanopartículas lipídicas com carga de superfície negativa tem sua carga invertida quando a quitosana é incubada no meio (Garcia-Fuentes et al., 2005). Assim, as partículas resultantes possuem propriedades de superfície e estabilidade diferentes das originais. A adaptação de metodologias de produção existentes para incorporação da quitosana pode ser avaliada no trabalho de Calvo et αΙ.(¥)97) onde a adição da quitosana na fase aquosa acidificada permitiu obter nanoemulsões e nanocápsulas com quitosana adsorvida aos fosfolípides da parede de acordo com patente US 5,843,509. Na presente invenção a quitosana na forma de sal é utilizada na fase aquosa neutra.
A cloxacilina é um antibiótico β-lactâmico usado em práticas veterinárias por causa de sua atividade contra bactérias gram-positivas e negativas. O fármaco é utilizado no tratamento e prevenção de mastite bovina causada por Staphylococus (Pérez et al.,1997).
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A vantagem desta invenção está na criação de uma nova possibilidade de terapia da mastite em gado leiteiro pela via intramamária no período seco através do encapsulamento do fármaco cloxacilina benzatina em nanocarreadores que são — --------- ------- avidamente fagocitados pelas células presentes nas regiões infectadas do interior da glândula mamária. Estes nanocarreadores possuem maior penetração em regiões onde a ~ inflamação está presente como descrito na patente PI0605102-2A.
As formulações de nanocarreadores do tipo reservatório utilizadas nesta invenção contendo a cloxacilina benzatina em seu interior foram preparadas por um método diferente do descrito por Fessi et al. (1989) no que se refere aos constituintes das formulações e nas proporções dos solventes das fases, as quais foram específicas para o fármaco utilizado.
Os polímeros utilizados na preparação dos nanocarreadores aqui propostos foram o poliε-caprolactona (PCL) e a quitosana (QUIT), ambos biocompatíveis e biodegradáveis, sendo facilmente excretados pelo organismo. Dessa forma, essas nanoestruturas são interessantes carreadores devido a sua estabilidade em meio biológico e baixa toxicidade em função da utilização de polímeros biodegradáveis. Considerando todos estes aspectos, a presente invenção foi preparada para utilização em medicina veterinária como uma nova forma de tratamento de mastite bovina por via intramamária, no período seco, tendo como vantagens principais a facilidade de manuseio no momento do uso, a simplicidade na preparação e a viabilidade para a comercialização. Além desta nova possibilidade, esses nanocarreadores também podem ser utilizados no tratamento dessas e de outras enfermidades, desde que exista afinidade entre o fármaco e o núcleo oleoso.
A invenção está baseada no fato de que esses carreadores nanoestruturados são captados pelo sistema fagocitário mononuclear e os de superfície modificada pela quitosana são bioadesivos. Portanto, ambas as formulações possuem potencial de sucesso no tratamento da mastite, pela maior penetração no tecido afetado.
Os nanocarreadores do tipo reservatório foram preparados pelo método de deposição interfacial do polímero pré-formado seguida do deslocamento dos solventes miscíveis com a água e imiscíveis com o óleo e com os polímeros hidrofóbicos.
Estudos clínicos preliminares indicam a eficácia melhorada com as formulações propostas.
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Exemplos:
Os exemplos experimentais ilustram esta invenção, sem no entanto limitar sua aplicação.
Exemplo 1: Produção de nanocarreadores do tipo reservatório revestidos com quitosana (NC PCL QUIT) contendo antibiótico de uso veterinário. Os nanocarreadores de cloxacilina benzatina foram preparados de acordo com os seguintes constituintes (%
P/P)
Ροϋ-ε-caprolactona------------------0,80%
Lecitina de soja-----------------------0,40%
Labrafac CC--------------------------0,25%
Poloxamer 188-----------------------0,60%
Quitosana-----------------------------0,10%
Cloxacilina benzatina---------------0,25%
Água qsp------------------------------100%
Para o preparo das nanocarreadores revestidos (NC-PCL-QUIT) contendo cloxacilina benzatina, o polímero poli-s-caprolactona (PCL) foi dissolvido em 23 ml de uma solução de acetona contendo lecitina de soja (Epikuron 170) e Labrafac CC . O fármaco cloxacilina benzatina foi previamente solubilizado em 7 ml de metanol e adicionado à solução de acetona. Esta fase permaneceu por agitação e aquecimento 20 moderado (30 a 45°C) até completa dissolução dos componentes. Em seguida, a solução orgânica foi vertida em solução aquosa previamente preparada contendo poloxamer 188 e 10 mg de quitosana solúvel em água. Seguiu-se agitação em velocidade moderada, a temperatura ambiente, com o auxílio de agitador magnético por dez minutos. Posteriormente esta suspensão foi levada ao evaporador rotativo, mantendo-se a 25 temperatura do banho em 40-45°C para evaporação dos solventes orgânicos à pressão reduzida. O tamanho e o potencial zeta das nanocápsulas obtidas foram 291 nm e +16 mV respectivamente. A eficiência de encapsulação foi de 87%.
Exemplo 2: Produção de nanocarreadores convencionais (NC PCL) contendo antibiótico de uso veterinário. Os nanocarreadores de cloxacilina benzatina foram 30 preparados de acordo com os seguintes constituintes (% p/p).
Ροϋ-ε-caprolactona------------------0,60%
Monoleato de sorbitano-------------0,40%
Plurol oleique-------------------------0,25%
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Poloxamer 188-----------------------0,75%
Cloxacilina benzatina---------------0,05%
Água qsp------------------------------100%
Para o preparo de nanocarreadores convencionais contendo cloxacilina benzatina foram dissolvidos em 7 ml de uma solução de acetona: o polímero poli-c-caprolactona (PCL), monooleato de sorbitano e plurol oleique. O fármaco (cloxacilina benzatina) previamente solubilizado em 3 ml de metanol foi adicionado à solução de acetona. Em seguida, a solução orgânica foi vertida em uma solução aquosa contendo poloxamer 188. Seguiu-se agitação com auxílio de agitador magnético por dez minutos. A evaporação dos solventes orgânicos foi feita de acordo com a metodologia acima. O tamanho foi determinado por espectroscopia de correlação de fótons e o potencial zeta por anemometria do laser dopler. Os valores obtidos foram 322 nm e -28 mV respectivamente. A eficiência de encapsulação foi de 37%. Através da microscopia de força atômica (MFA) imagens das nanocápsulas foram obtidas, evidenciando-se o caráter esférico e homogêneo das partículas.
Tabela 1: Análise do tamanho e potencial zeta dos nanocarreadores contendo diferentes concentrações de cloxacilina benzatina.
o/ /0 (p/v) PCL % (p/v) QUIT Concentração de CLOXB (mg/mL) Tamanho médio ± DP1 (nm) Potencial zeta3 ± DP2 (mV)
NC- PCL 0,6 — 0 308,9 ± 8,2 -30,47± 2,01
0,6 — 0,5 322,4 ± 3,9 -28,20 ± 0,62
NC- PCL- QUIT 0,8 0,1 0 214,3 ±1,5 +21,00 ± 0,53
0,8 0,1 2,5 291 ± 5,6* +16,53 ± 2,75
0,8 0,1 5 242,9 ± 5,7* +14 ± 2,75*
1 DP = Desvio padrão (n = 3); 2 I. ’ = índice de po idispersão (n=3); 3Largura do pico
igual a 1,6 em todas as amostras. A análise estatística foi realizada através do teste t student entre as diferentes formulações, em relação às NC brancas. P<0,05 para os parâmetros mostrados na tabela em relação à formulação branca, exceto os identificados com *.
Tabela 2: Eficiência e rendimento de encapsulação das NC contendo diferentes concentrações de cloxacilina benzatina.
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Nanocarreadores EE(%) Rendimento
NC PCL cloxacilina benzatina 0,5 mg/ml 34% 23%
NC PCL cloxacilina benzatina 2,5 mg/ml instável ND
NC PCL-QUIT cloxacilina benzatina 2,5 mg/ml 87% 76%
NC PCL-QUIT cloxacilina benzatina 5,0 mg/ml instável ND
ND - não determinado
No caso das nanoestruturas de PCL-QUIT, há a presença de quitosana na superfície dessas partículas, um polímero carregado positivamente que interage com o ânion cloxacilina, aumentando sua adsorção na superfície.
Figura 1: Perfil de liberação da CLOXB in vitro a 37°C em meio PBS contendo 1% de polietilenoglicol e 1% leite a partir de cloxacilina livre e das formulações de NC de PCL 0,5mg e NC PLC-QUIT 2,5mg em condições sink. (
A avaliação do perfil de liberação in vitro da cloxacilina benzatina a partir dos nanocarreadores do tipo reservatório foi realizado de acordo com a técnica de diálise direta em dois diferentes meios de liberação. Sacos de diálise foram inseridos em recipientes contendo solução salina tamponada e 1% polietilenoglicol 300 (PBS:PEG) ou salina tamponada contendo 1% leite desnatado (PBSdeite) a 37°C com agitação moderada. Em sacos de diálise distintos com poros de 12.000-14.000 (cut off) foram inseridos: CLOXB livre, suspensão de NC-PCL 0,5 mg/ml e suspensão de NC-PCLQUIT 2,5 mg/ml nos meios PBS:PEG e PBSdeite. Em intervalos de tempo prédefinidos foram retiradas alíquotas e o meio foi readicionado com o mesmo volume retirado. Logo após, as amostras foram preparadas e o sobrenadante dosado.
De acordo com a figura 1 , observa-se um perfil de liberação mais lento com as NC de 0,5 de CLOXB, uma vez que provavelmente a quantidade de fármaco adsorvida na superfície e pronta para desorção é menor que nas NC de 2,5 de CLOXB. Essas últimas apresentam um perfil com plateau, provavelmente devido ao maior teor de fármaco adsorvido na superfície das NC contendo quitosana. Nas duas formulações de NC a liberação apresenta um perfil quase linear, o que indica liberação controlada, nas primeiras 6h, seguido do aparecimento de um plateau, com retenção do restante da CLOXB, provavelmente relativo à quantidade localizada no interior do núcleo oleoso das NC. Irwin et al. (1984) observaram que a CLOXB possui sua dissolução dependente do valor de pH. Seu grupo realizou um estudo de dissolução da CLOXB em meios com
13/13 diferentes valores de pH: 2, 6 e 9, onde foi observado que em pH 2 e 9 a cloxacilina se degrada e em pH 6 á sua dissolução é dependente da solubilidade até 300 minutos de ensaio. Neste trabalho, a dissolução foi realizada em pH 7,4 pois trata-se do pH do leite
- de animais com mastite (Gruet et al., 2001). Não se observou degradação do fármaco 5 até 540 minutos de ensaio por CLAE nessas condições experimentais.
Já em relação à liberação do fármaco das nanocápsulas nos diferentes meios, observa-se que seus perfis são diferentes. As NC-PCL-QUIT 2,5mg contendo CLOXB apresentaram uma liberação mais rápida, mais de 70% em 6hs em meio contendo 1% de leite do que no meio contendo 1% de PEG. Ao contrário, as NC-PCL com CLOXB 10 apresentaram liberação mais rápida em meio contendo 1% de PEG do que em meio contendo 1% de leite. Entre os três gráficos nota-se semelhança no perfil de liberação da CLOXB livre e da encapsulada em NC-PCL. A liberação foi maior em meio contendo 1% de PEG, diferentemente da NC-PCL-QUIT que possuiu maior liberação em leite. Sendo assim, nanocápsulas contendo o antibiótico cloxacilina benzatina apresentam-se 15 promissoras para administração intramámaria em gado leiteiro.
Como pode ser observado na figura 1, a retenção da cloxacilina benzatina nos nanocarreadores é maior com o polímero PCL (Figura IA). Mesmo em meio contendo leite (Figura IB) a retenção do fármaco e a menor velocidade de liberação são evidentes comparadas com a cloxacilina benzatina não carreada. Esses dados atestam da eficácia 20 das formulações para liberação lenta de CLOXB no teto do animal.
Figura 2 Imagens de MFA modo intermitente de NC-PCL. Imagem de altura.

Claims (19)

1. Processo de preparação de suspensões coloidais de uso veterinário contendo partículas de tamanho variando entre 100 e 800 nm, as quais contendo cloxacilina benzatina, a cloxacilina benzatina com aplicação no tratamento ou profilaxia da mastite em animais no período seco por administração intramamária, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
i. preparo de uma fração A, que consiste de uma solução contendo: (a) poli-s-caprolactona, (b) um óleo e, (c) pelo menos um surfactante dissolvido em solventes orgânicos miscíveis em água;
ii. preparo de uma fração B contendo cloxacilina benzatina solubilizada em solvente alcoólico;
iii. preparo de uma fração C que consiste misturar as frações A e B;
iv. preparo de uma fração D que consiste de uma solução aquosa nutra contendo tensoativo e polímero catiônico do grupo das quitosanas na forma de sal solúvel em água;
v. combinação simultânea das frações C e D com formação subsequente de nanopartículas revestidas de filme polimérico
2. Nanoreservatório revestido com quitosana, seus sais ou derivados neutros solúveis em água, de acordo com reivindicação 1, constituído de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica, caracterizado por constituírem-se em carreadores de agentes antibacterianos, preferencialmente cloxacilina benzatina, para tratamento e prevenção de focos inflamatórios e infecciosos na glândula mamária de animais no período seco;
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3. Preparação de nanoreservatórios de acordo com reivindicação 1, caracterizado por conter núcleo oleoso líquido, semi-sólido ou sólido a temperatura ambiente, contendo cloxacilina benzatina, envolto por uma membrana polimérica;
4. Processo de acordo com reivindicações 1 a 4 caracterizado pela % de óleo que varia de 0,25 a 5% p/v em relação ao volume final do meio aquoso;
5. Composição de acordo com reivindicação 5 caracterizado pelo núcleo oleoso composto por triglicerídeo de cadeia média, tal como triglicerídeo do ácido cáprico/caprílico, ou ésteres de ácido graxo de 6 a 18 átomos de carbono ou óleos de origem vegetal, tais como óleo de soja, milho, algodão, oliva, amêndoa, girassol, uva, ou óleo mineral tal como parafina líquida, ou poligliceril-6 dioleato ou polietilenoglicol-6 do óleo de oliva ou de amendoim ou de milho;
6. Nanocarreadores de acordo com reivindicação 1 caracterizados por conterem em sua composição polímeros hidrofóbicos estáveis no interior da glândula mamária, serem biocompatíveis e biodegradáveis, tais como: poli-εcaprolactona;
7. Processo de acordo com reivindicação 3 caracterizado pela % de quitosana de baixo peso molecular que varia de 0,05 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso;
8. Composição de acordo com reivindicações 1, 2 e 3 caracterizado pela % de tensoativo hidrofílico variando de 0 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso que pode ser o polisorbato 20 ou 21 ou 40 ou 60 ou 61 ou 65 ou 80 ou 81 ou 85 ou 120; ou pode ser um derivado do copolímero de polióxido
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3/4 de etileno-polióxido de propileno tal como o poloxamer 124 ou 188 ou 237 ou 338 ou 407;
9. Composição de acordo com reivindicações 1, 2 e 3 caracterizado pela % de tensotivo lipofílico variando de 0,2 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso, que pode ser um derivado dos ésteres do sorbitano tais como o monolaurato de sorbitano, o trilaurato de sorbitano, o monopalmitato de sorbitano, o monoestearato de sorbitano, o triestearato de sorbitano, o monooleato de sorbitano, o trioleato de sorbitano; ou um derivado da lecitina, tal como a lecitina de soja;
10. Nanoreservatórios poliméricos de acordo com reivindicações 1 a 11 caracterizado por conter antibiótico cloxacilina benzatina (e/ou derivados) os quais podem ser administrados por via oral, parenteral, ocular e/ou combinação destas vias;
11. Processo de acordo com reivindicações 1, 2 e 3 caracterizado pelos nanocarreadores hidrofóbicos possuírem carga superficial negativa podendo variar de -45 a -25 mV, e positiva para os nanocarreadores revestidos com quitosana podendo sua carga variar de +30 a +10 mV;
12. Nanoreservatórios de acordo com reivindicações 1 a 14 caracterizado por ser capaz de liberar o fármaco com velocidade controlada;
13. A suspensão coloidal de nanocarreadores de acordo com reivindicações 1 a 15, é caracterizada por ser administrada em veículo farmaceuticamente aceitável aquoso que pode ser um tampão, um gel, ou um spray;
14. De acordo com reivindicação 1 composição veterinária é caracterizada por uma dose única contendo de 5 a 50 % (p/p) de antibiótico em relação aos
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4/4 polímeros totais para uma dose total menor ou igual a 1000 mg de cloxacilina benzatina na formulação;
15. Processo de acordo com reivindicação 1 onde os nanocarreadores são caracterizados por serem preparados por um processo utilizando dois solventes orgânicos miscíveis com água onde está presente o antibiótico de uso veterinário;
16. Processo de acordo com reivindicação 18, caracterizado pela fase orgânica ser misturada com uma fase aquosa neutra podendo conter tensoativos, sendo que os solventes totais são evaporados para menos de um terço do volume total da mistura ao final do processo;
17. Processo de acordo com reivindicação 19 caracterizado pela fase aquosa conter também um sal polimérico de reação neutra que é capaz de adsorver ou reagir com o ânion da cloxacilina, podendo este ser um sal de aminopolissacarídeo do grupo das quitosanas, com variados pesos moleculares;
18. O método de acordo com reivindicações 1, 2, 3 e 21 é caracterizado pelas nanopartículas contendo cloxacilina benzatina e esterilizadas por passagem em filtros estéreis de diâmetros de 0,2 a 0,8 pm;
19. Misturas caracterizadas por quaisquer proporções entre as formulações de nanocarreadores descritas nas reivindicações de 1 a 18, entre si e com a cloxacilina benzatina na forma não estruturada, para administração intramamária.
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