BRPI0913107B1 - Reagente de lise, ligação e/ou lavagem, uso do mesmo, método e kit para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácidos nucleicos, e, uso de tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno - Google Patents

Reagente de lise, ligação e/ou lavagem, uso do mesmo, método e kit para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácidos nucleicos, e, uso de tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno Download PDF

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Homann-Wischinski Anke
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Description

(54) Título: REAGENTE DE LISE, LIGAÇÃO E/OU LAVAGEM, USO DO MESMO, MÉTODO E KIT PARA ISOLAMENTO E/OU PURIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE UMA AMOSTRA BIOLÓGICA CONTENDO ÁCIDOS NUCLEICOS, E, USO DE TENSOATIVOS NÃO-IÔNICOS COM BASE EM POLIOXIETILENO (51) Int.CI.: C12N 15/10 (30) Prioridade Unionista: 30/05/2008 DE 10 2008 026 058.4 (73) Titular(es): QIAGEN GMBH (72) Inventor(es): ROLAND FABIS; ANKE HOMANN-WISCHINSKI; THORSTEN VOSS; THOMAS HANSELLE “REAGENTE DE LISE, LIGAÇÃO E/OU LAVAGEM, USO DO MESMO, MÉTODO E KIT PARA ISOLAMENTO E/OU PURIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE UMA AMOSTRA BIOLÓGICA CONTENDO ÁCIDOS NUCLEICOS, E, USO DE TENSOATIVOS NÃO-IÔNICOS COM BASE EM POLIOXIETILENO”
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um reagente de lise, ligação e/ou lavagem e a um método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos. Os referidos reagente de lise, ligação e/ou lavagem e método são particularmente adequados para fins de uso em diagnóstico molecular. Fundamentos da Invenção
A técnica anterior divulgou uma multiplicidade de métodos para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) de células, culturas de célula ou culturas de vírus.
Nesse contexto, métodos clássicos para isolamento de ácidos nucleicos, muitos dos quais são realizados manualmente, são baseados em um método em uma etapa o qual envolve realização de uma extração após a adição de um tampão aquoso e um agente de extração orgânico. Os ácidos nucleicos permanecem na fase aquosa e podem ser isolados após a fase orgânica, a qual contém substâncias associadas indesejadas, ter sido removida.
Esses métodos usam primeiramente agentes de extração orgânicos normalmente prejudiciais, tais como clorofórmio ou fenol e, em segundo, contaminantes solúveis em água permanecem na fase aquosa, a qual contém os ácidos nucleicos e precisa ser removida em outras etapas de purificação.
Como um resultado, um método alternativo ganhou importância na técnica anterior, o qual é baseado sobre a adsorção seletiva de ácidos nucleicos a suportes sólidos, principalmente minerais, tal como dióxido de silício. O princípio de ligação é baseado em uma ligação reversível dos ácidos nucleicos sob a influência de sais caotrópicos e/ou álcool à superfície do dióxido de silício. Em um método com múltiplas etapas, várias soluções ou misturas, usualmente soluções ou misturas de lise, ligação, lavagem e/ou eluição, são adicionadas à amostra contendo ácido nucleico e, em uma etapa final do método, o ácido nucleico purificado é eluído do suporte o qual foi adicionado na etapa de ligação por fim.
O princípio básico de ambos os métodos é baseado nas células, em particular as células de planta, animal, ser humano, bacterianas ou virais, que estão sendo submetidas à lise em uma primeira etapa. Para essa finalidade, as células são primeiramente incubadas com um tampão de lise o qual rompe as células.
A técnica anterior divulgou tampões e métodos para lise de materiais celulares de uma amostra biológica. Tampões de lise conhecidos ffeqüentemente contêm o tensoativo monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween® 20). Esse tensoativo é usado para conversão de contaminações em um estado solúvel ou estabilizado durante lise de células, de forma a remover as mesmas do ácido nucleico.
De modo desvantajoso, tampões de lise contendo monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween® 20) não são estáveis durante armazenamento. Por exemplo, o pH diminui. Uma desvantagem particular é o fato de que o rendimento dos ácidos nucleicos isolados é reduzido após armazenamento quando esses tampões de lise são usados. Outra desvantagem é o fato de que os eluatos contendo ácidos nucleicos são opacos, indicando a presença de contaminações as quais podem interferir com uso adicional dos ácidos nucleicos isolados.
Portanto, foi um objetivo da presente invenção proporcionar um meio o qual supera pelo menos uma das desvantagens mencionadas acima da técnica anterior e, no processo, tenha propriedades de lise, ligação e/ou lavagem as quais são boas ou melhores, se possível.
O objetivo é atingido por um reagente de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com a reivindicação 1 da presente invenção. Conseqüentemente, um reagente de lise, ligação e/ou lavagem é proporcionado, compreendendo:
- pelo menos um composto caotrópico,
- pelo menos um composto tampão, de preferência selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), N(tri(hidroximetil)metil)glicina (Tricina), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (BICINE), ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etano-sulfônico) (HEPES), ácido piperazina-l,4-bis(2-etano-sulfônico) (PIPES), ácido N-ciclohexil-2-aminoetano-sulfônico (CHES), ácido 2-(N-morfolino)etano-sulfônico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propano-sulfônico (MOPS) e/ou tampão de fosfato e
- pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno na faixa de > 8% peso/volume a < 50% peso/volume, baseado no volume total do reagente.
O termo reagente de lise, ligação e/ou lavagem significa, para fins da presente invenção, reagentes que são reagentes de lise, reagentes de ligação ou reagentes de lavagem e também reagentes os quais atuam como reagente de lise e também como reagente de ligação e também como reagente de lavagem. Mais especificamente, o termo reagente de lise, ligação e/ou lavagem significa, para fins da presente invenção, também misturas de reagentes de lise, reagentes de ligação e/ou reagentes de lavagem da invenção.
O termo reagente significa, para fins da presente invenção, reagente de lise, ligação e/ou lavagem.
O termo composto caotrópico significa, para fins da presente invenção, compostos os quais atuam de modo desnaturante sobre proteínas e os quais destroem, em particular, a estrutura regular da água líquida, a qual é baseada na formação de ligações de hidrogênio.
O termo composto tampão significa, para fins da presente invenção, compostos os quais podem conferir tamponamento ou estabilização de pH de um solução aquosa.
O termo tampão de fosfato significa, para fins da presente invenção, sais de fosfato, tais como diidrogeno fosfatos, por exemplo, diidrogeno fosfato de potássio (KH2PO4) ou diidrogeno fosfato de sódio (NaH2PO4) e hidrogeno fosfatos, por exemplo, diidrato de hidrogeno fosfato dissódico (Na2HPO4 · 2 H2O) ou hidrogeno fosfato de dipotássio. Misturas dos sais de fosfato também podem, da mesma forma, ser usadas. Outro tampão de fosfato comum é PBS (solução salina tamponada com fosfato), a qual contém cloreto de sódio, Na2HPÜ4, cloreto de potássio e KH2PO4.
O termo ácido nucleico significa, para fins da presente invenção - mas não está limitado a - ácidos nucleicos naturais, de preferência isolados, lineares, ramificados ou circulares, tais como RNA, em particular mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA ou ribozimas, DNA, DNA de plasmídeo e semelhantes, ácidos nucleicos sintéticos ou modificados, transcritos in vitro, por exemplo, oligonucleotídeos, mais especificamente iniciadores, sondas ou padrões utilizáveis para PCR, ácidos nucleicos rotulados com digoxigenina, biotina ou corantes fluorescentes, ácidos nucleicos metilados ou PNAs (ácidos nucleicos peptídicos).
O termo tensoativo significa, para fins da presente invenção, substâncias interface-ativas e/ou superfície-ativas.
O termo álcool graxo significa, para fins da presente invenção, álcoois tendo um comprimento de cadeia de 6 a 22 átomos de carbono, de preferência 8 a 20 átomos de carbono, de preferência 10 a 18 átomos de carbono, particularmente de preferência 12 a 18 átomos de carbono. Preferência é dada, em particular, a álcoois tendo 12, 14, 16 ou 18 átomos de carbono. Embora os álcoois graxos possam ser mono- ou poliinsaturados, eles são, de preferência, álcoois graxos saturados.
Polioxietileno significa, para fins da presente invenção, uma unidade HO-(CH2CH2O)n, com n sendo, de preferência, um número inteiro de 2 a 150, mais preferivelmente de 4 a 120, ainda mais preferivelmente de 8 a 80 e, mais preferivelmente, um número inteiro selecionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 e 150.
Polioxipropileno significa, para fins da presente invenção, uma unidade HO-(CH2CH2CH2O)n, com n sendo, de preferência, um número inteiro de 10 a 90, mais preferivelmente de 20 a 80, ainda mais preferivelmente de 30 a 70 e, mais preferivelmente, n sendo um número inteiro selecionado de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,
67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,
88, 89 e 90.
A informação “% peso/volume”, “% (peso/volume)” ou “% (peso/v)” significa, para fins da presente invenção, a informação de gramas de tensoativo por 100 ml de reagente ou componente, por exemplo.
Surpreendentemente, verificou-se que os reagentes de lise, ligação e/ou lavagem da invenção têm estabilidade aprimorada durante armazenamento. Assim, por exemplo, reagentes de lise, ligação e/ou lavagem da invenção podem ter um pH estável durante armazenamento em temperatura ambiente durante três, de preferência seis meses, ainda mais preferivelmente pelo menos oito meses. Mais especificamente, os reagentes de lise, ligação e/ou lavagem da invenção também podem ter um pH estável quando armazenados em temperaturas elevadas, por exemplo, a 50 °C, durante várias semanas, de preferência durante vários meses.
Isso se toma vantajoso para reagentes de lise, ligação e/ou lavagem, uma vez que suspeita-se que a instabilidade de pH esteja relacionada à ocorrência de contaminações no eluato obtido após isolamento, o qual contém os ácidos nucleicos.
Tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno preferidos de acordo com a invenção são polioxietileno éteres de álcool graxo.
Exemplos de polioxietileno éteres de álcool graxo adequados são álcoois laurílico, cetílico, oleílico ou estearílico polietoxilados, os quais podem ser usados isoladamente ou como mistura.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o polioxietileno éter de álcool graxo compreende um componente de álcool graxo tendo de 6 a 22 átomos de carbono e um componente de polioxietileno tendo de 2 a 150 unidades (CH2CH2O).
De acordo com uma modalidade particularmente preferida da invenção, o polioxietileno éter de álcool graxo é selecionado do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter.
Tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno, em particular polioxietileno éteres de álcool graxo, são vantajosos para uma ampla faixa de aplicações dentro da presente invenção. Estabilidade aprimorada durante armazenamento pode ser observada em particular com reagentes de lise, ligação e/ou lavagem compreendendo compostos tampão, de preferência selecionados do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), N-(tri(hidroximetil)metil)glicina (Tricina), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (BICINE), ácido N-(25 hidroxietil)piperazina-N’-(2-etano-sulfônico) (HEPES), ácido piperazina-1,4bis(2-etano-sulfônico) (PIPES), ácido N-ciclo-hexil-2-aminoetano-sulfônico (CHES), ácido 2-(N-morfolino)etano-sulfônico (MES), ácido 3-(Nmorfolino)propano-sulfônico (MOPS) e/ou tampão de fosfato.
Verificou-se que os reagentes de lise, ligação e/ou lavagem da 10 invenção têm efeitos vantajosos, em particular com um teor de tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno na faixa de > 8% (peso/volume) a < 50% (peso/volume), baseado no volume do reagente de lise, ligação e/ou lavagem.
Se misturas de tensoativos são usadas, a informação sobre concentração é, de preferência, o teor total de tensoativo, por exemplo, na faixa de > 8% (peso/volume) a < 50% (peso/volume), baseado no volume total do reagente.
Isso é vantajoso, em particular, para reagentes de lise dentro da presente invenção.
Polioxietileno éteres de álcool graxo preferidos são álcoois laurílico, cetílico, oleílico ou estearílico etoxilados selecionados do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter.
Polioxietileno éteres de álcool graxo preferidos são selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(4) lauril éter, polioxietileno(23) lauril éter, polioxietileno(2) cetil éter, polioxietileno(lO) cetil éter, polioxietileno(20) cetil éter, polioxietileno(2) estearil éter, polioxietileno(lO) estearil éter, polioxietileno(20) estearil éter, polioxietileno(2) oleil éter, polioxietileno(lO) oleil éter, polioxietileno(20) oleil éter e/ou polioxietileno(ÍOO) estearil éter. Os números aqui indicam o número médio de unidades de óxido de etileno.
Particularmente adequados de acordo com a invenção são polioxietileno éteres de álcool graxo vendidos sob a marca Brij®, por exemplo, pela ICI Surfactants.
Exemplos de polioxietileno lauril, polioxietileno cetil, polioxietileno oleil ou polioxietileno estearil éteres de álcool adequados são, de preferência, selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(4) lauril éter (Brij® 30), polioxietileno(23) lauril éter (Brij® 35), polioxietileno(2) cetil éter (Brij® 52), polioxietileno(lO) cetil éter (Brij® 56), polioxietileno(20) cetil éter (Brij® 58), polioxietileno(2) estearil éter (Brij® 72), polioxietileno(lO) estearil éter (Brij® 76), polioxietileno(20) estearil éter (Brij® 78), polioxietileno(2) oleil éter (Brij® 92), polioxietileno(lO) oleil éter (Brij® 97), polioxietileno(20) oleil éter (Brij® 98) e/ou polioxietileno(lOO) estearil éter (Brij® 700).
Polioxietileno lauril, polioxietileno cetil, polioxietileno oleil ou polioxietileno estearil éteres de álcool adequados também podem ser usados como pós, por exemplo, pó de polioxietileno(21) estearil éter (Brij® 72 IP).
Outra vantagem do reagente de lise, ligação e/ou lavagem da invenção pode ser conferida por reagentes de lise, ligação e/ou lavagem, quando usados para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos, que mostram um rendimento consistentemente bom dos ácidos nucleicos isolados, mesmo se o reagente de lise, ligação e/ou lavagem tenha sido armazenado em temperatura ambiente ou em temperaturas elevadas, por exemplo, de até 50 °C, durante várias semanas ou vários meses, enquanto que tampões da técnica anterior, em particular tampões contendo Tween® 20, mostram menores rendimentos de ácidos nucleicos após armazenamento.
Uma vantagem do uso dos reagentes de lise, ligação e/ou lavagem da invenção é o fato de que um eluato contendo os ácidos nucleicos não é ou é apenas levemente opaco, mesmo após várias semanas ou vários meses de armazenamento. Portanto, é uma vantagem que o eluato possa não conter ou pelo menos distintamente menos contaminações, desse modo, tomando o uso adicional do eluato contendo os ácidos nucleicos substancialmente mais vantajoso, porque etapas de purificação que consomem tempo que reduzem o rendimento de ácidos nucleicos podem ser dispensadas.
Menos preferência é dada a reagentes de lise, ligação e/ou lavagem compreendendo ésteres de álcool laurílico de polioxietileno, por exemplo, polioxietileno(4) lauril éter (Brij® 30) ou polioxietileno(23) lauril éter (Brij® 35). Portanto, em uma modalidade preferida, os reagentes de lise, ligação e/ou lavagem não contêm qualquer uma dessas substâncias. Em uma modalidade partícularmente preferida, o polioxietileno éter de álcool graxo do reagente de lise, ligação e/ou lavagem não é polioxietileno lauril éter.
Em uma modalidade preferida da invenção, o polioxietileno éter de álcool graxo é selecionado do grupo compreendendo polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter.
Preferência é dada a polioxietileno cetil, polioxietileno oleil ou polioxietileno estearil éteres de álcool selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(lO) cetil éter (Brij® 56), polioxietileno(20) cetil éter (Brij® 58), polioxietileno(20) estearil éter (Brij® 78) e/ou polioxietileno(20) oleil éter (Brij® 98).
Preferência particular é dada a polioxietileno cetil ou polioxietileno oleil éteres de álcool, de preferência selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(lO) cetil éter (Brij® 56), polioxietileno(20) cetil éter (Brij® 58) e/ou polioxietileno(20) oleil éter (Brij® 98).
Mais partícularmente, os reagentes de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com a invenção compreendendo polioxietileno éteres de álcool graxo, em particular polioxietileno cetil ou polioxietileno oleil éteres de álcool, em comparação, mostram um rendimento particularmente bom de ácidos nucleicos isolados, em particular DNA viral. Mais especificamente, verificou-se, surpreendentemente, que o uso de um reagente de lise e/ou ligação recentemente preparado contendo polioxietileno cetil éter de álcool e uso após várias semanas, em particular vários meses, de armazenamento a 50 °C para usando de DNA do vírus da Hepatite B (HBV) produz um rendimento acentuadamente aumentado de DNA viral em comparação com tampões de lise contendo Tween® 20. Isso pode conferir, em particular, uma vantagem particular do reagente de lise e/ou ligação da invenção porque o vírus da Hepatite B (HBV) é conhecido por ser difícil de submeter à lise. O reagente de lise da invenção é particularmente adequado para isolamento de DNA viral.
Além disso, adequados são álcoois laurílico, cetílico, estearílico ou oleílico polietoxilados os quais estão disponíveis, por exemplo, sob os nomes INCI laureth, ceteth, esteareth ou oleth.
Exemplos de outros álcoois dodecílico, laurílico, cetílico, estearílico ou oleílico etoxilados adequados estão disponíveis sob os nomes selecionados do grupo compreendendo laureth-9, laureth-4, laureth-23, ceteth2, ceteth-20, esteareth-2, esteareth-10, esteareth-20, oleth-2, oleth-10 e/ou oleth-20.
Outros tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno preferidos são polioxietileno alquilfenil éteres. Preferência é dada a polioxietileno alquilfenil éteres tendo um grupo alquila contendo de cinco a 15 átomos de carbono, de preferência contendo 6 a 10 átomos de carbono. Preferência adicional é dada a grupos C7- a Cio-alquila ramificados ou não ramificados, mais particularmente grupos Cg- e Cç-alquila ramificados ou não ramificados, particularmente de preferência grupos isooctila e grupos nonila.
Em uma modalidade preferida da invenção, o polioxietileno alquilfenil éter é selecionado do grupo compreendendo polioxietileno nonilfenil éter e/ou polioxietileno isooctilfenil éter. Polioxietileno nonilfenil éteres e polioxietileno isooctilfenil éteres adequados são obteníveis, por exemplo, sob a marca comercial Igepal®, por exemplo, da BASF.
Exemplos de polioxietileno nonilfenil éteres e polioxietileno isooctilfenil éteres adequados são, de preferência, selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(2) nonilfenil éter (Igepal® CO-210), polioxietileno(2) isooctilfenil éter (Igepal® CA-210), polioxietileno(5) nonilfenil éter (Igepal® CO-520), polioxietileno(5) isooctilfenil éter (Igepal® CA-520), polioxietileno(9) nonilfenil éter (Igepal® CO-630), polioxietileno(9) isooctilfenil éter (Igepal® CA-630), polioxietileno(12) nonilfenil éter (Igepal® CO-720), polioxietileno(12) isooctilfenil éter (Igepal® CA-720) e/ou polioxietileno(lOO) nonilfenil éter (Igepal® CO-990).
Outros tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno preferidos são copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno. Copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno são também referidos como “poloxâmeros”. Preferência é dada a copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno da fórmula empírica
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH, onde “a” refere-se ao número de unidades polioxietileno e “b” refere-se ao número de unidades polioxipropileno, com a proporção em peso a/b estando, de preferência, na faixa de 0,1 a 3.
“a” está, mais particularmente, na faixa de 2 a 150, de preferência na faixa de 4 a 120, mais preferivelmente na faixa de 8 a 80, ainda mais preferivelmente “a” é um número inteiro selecionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,
109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,
124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,
139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 e 150 e, ainda mais preferivelmente, “a” é um número inteiro selecionado de 2, 4, 10, 20, 23, 40, 55, 70 e 100.
“b” está, mais particularmente, na faixa de 10 a 90, de preferência na faixa de 20 a 80, mais preferivelmente na faixa de 30 a 70, ainda mais preferivelmente “b” é um número inteiro selecionado de 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,
75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 e 90 e, ainda mais preferivelmente, “b” é um número inteiro selecionado de 15, 18, 23, 40, 55, 67 e75.
Preferência adicional é dada a copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno tendo blocos de polioxietileno e polioxipropileno de diferentes comprimentos, nos quais um bloco de polioxipropileno tendo de 15 a 67 unidades de polipropileno é envolvido por dois blocos de polioxietileno tendo, independentemente um do outro, em cada caso, de 2 a 130 unidades de polietileno.
Copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno adequados podem ser obtidos, por exemplo, sob a marca comercial Pluronic® ou Synperonic®, por exemplo, da BASF.
Exemplos de copolímeros em bloco de polioxietilenopolioxipropileno adequados são, de preferência, selecionados do grupo compreendendo Pluronic® PE 6200, Pluronic® PE 6400, Pluronic® PE 6800, Pluronic® PE 10300, Pluronic® PE 10500, Pluronic® F127, Pluronic® F108, Synperonic® F108, Synperonic® F127 e/ou Synperonic® F68.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o reagente de lise, ligação e/ou lavagem compreende um tensoativo não-iônico na faixa de > 9% (peso/volume) a < 40% (peso/volume), de preferência na faixa de > 10% (peso/volume) a <30% (peso/volume), mais preferivelmente na faixa de > 15% (peso/volume) a < 20% (peso/volume), baseado no volume total do reagente.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o composto caotrópico é um sal de sódio ou sal de guanidínio, de preferência selecionado do grupo compreendendo iodeto de sódio, perclorato de sódio, hidrocloreto de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio e/ou uma mistura de dois ou mais sais dos mesmos. O composto caotrópico é, de preferência, um sal de guanidínio, de preferência selecionado do grupo compreendendo hidrocloreto de guanidínio, tiocianato de guanidínio e/ou isotiocianato de guanidínio.
Em particular, uma combinação dos compostos caotrópicos e tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno mencionados acima é vantajosa para lise de células virais e isolamento de ácidos nucleicos de células virais.
Concentrações e quantidades adequadas de compostos caotrópicos podem variar, dependendo do tipo de amostras ou parâmetros de lise, com concentrações do composto caotrópico na faixa de>0,lMa<10 M, baseado no volume total do reagente, sendo geralmente vantajosas. Preferência é dada à concentrações do composto caotrópico do reagente de lise, ligação e/ou lavagem na faixa de > 0,5 M a < 8 M, de preferência na faixa de > 0,9 M a < 6 M.
As concentrações do composto caotrópico do reagente de lise estão, de preferência, na faixa de > 3 M a < 7 M, particularmente de preferência na faixa de > 4 M a < 6 M. As concentrações do composto caotrópico do reagente de ligação are de preferência na faixa de > 0,5 M a < 7 M, particularmente de preferência na faixa de > 1 M a < 6 M. As concentrações do composto caotrópico do reagente de lavagem are de preferência na faixa de >0,5 M a <3,5 M, particularmente de preferência na faixa de > 0,9 M a < 3 M.
De acordo com outra modalidade preferida, o reagente de lise, ligação e/ou lavagem compreende pelo menos um composto tampão selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etano-sulfônico) (HEPES), ácido 3(N-morfolino)propano-sulfônico (MOPS) e/ou tampão de fosfato.
De acordo com uma modalidade particularmente preferida, o reagente de lise, ligação e/ou lavagem compreende pelo menos um composto tampão selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) e/ou ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etano-sulfônico) (HEPES).
O reagente de lise, ligação e/ou lavagem é, de preferência, uma solução aquosa.
De acordo com uma outra modalidade preferida, o reagente de lise, ligação e/ou lavagem tem um pH na faixa de >4 a <12, mais particularmente na faixa de > 6 a < 11, de preferência na faixa de > 7 a < 10, particularmente de preferência na faixa de > 8 a < 9.
Em modalidades preferidas, o reagente de lise, ligação e/ou lavagem, em particular o reagente de lise pode, além disso, ter enzimas, por exemplo, enzimas líticas, em particular, por exemplo, proteinase K, protease (por exemplo, Protease QIAGEN), zimolase, liticase, acromopeptidase, lisostafina, lisozima e, dependendo do uso, nucleases, por exemplo, DNase e/ou RNase.
Os reagentes de lise, ligação e/ou lavagem da invenção podem ser reagentes de lise, reagentes de ligação ou reagentes de lavagem ou misturas de reagentes de lise, reagentes de ligação e/ou reagentes de lavagem da invenção. Ácidos nucleicos são imobilizados sobre uma matriz baseada em um ou mais compostos de silício na presença de um composto caotrópico, de preferência na presença de um alcanol ramificado ou não ramificado. Preferência é dada, portanto, ao reagente de ligação compreendendo pelo menos um alcanol ramificado ou não ramificado.
De preferência, são utilizáveis alcanóis ramificados ou não ramificados de cadeia curta tendo de um a cinco átomos de carbono. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o alcanol ramificado ou não ramificado é um álcool tendo de um a cinco átomos de carbono, de preferência selecionado do grupo compreendendo metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, butanol ou pentanol ramificado e/ou não ramificado e/ou misturas dos mesmos.
A menos que de outro modo descrito, a definição alcanol ramificado ou não ramificado, em particular propanol, butanol e pentanol, compreende quaisquer formas isoméricas consumíveis dos radicais em particular. Assim, por exemplo, propanol ramificado ou não ramificado compreende n-propanol e isopropanol, butanol ramificado ou não ramificado compreende isobutanol, sec-butanol e terc-butanol e pentanol ramificado ou não ramificado compreende, por exemplo, n-pentanol e isopentanol. Preferência é dada ao uso de álcoois selecionados do grupo compreendendo metanol, etanol, isopropanol e/ou misturas dos mesmos e preferência particular é dada ao uso de álcoois selecionados do grupo compreendendo etanol, isopropanol e/ou misturas dos mesmos.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o reagente de ligação compreende um alcanol ramificado ou não ramificado na faixa de > 20% em volume a < 80% em volume, de preferência na faixa de > 40% em volume a < 70% em volume, de preferência na faixa de > 50% em volume a < 60% em volume, baseado no volume total do reagente de ligação.
Quando os teores em volume e/ou peso são especificados, é evidente para aqueles versados no campo que os referidos teores em volume e/ou peso dos componentes individuais são escolhidos de uma forma tal que o volume total ou peso total dos componentes não excede a 100% em volume ou 100% em peso.
A presente invenção, além disso, refere-se ao uso de um reagente de lise, ligação e/ou lavagem da invenção para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos.
A presente invenção, além disso, refere-se a um método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico compreendendo as etapas de método a seguir:
a) lise da amostra biológica,
b) imobilização do(s) ácido(s) nucleico(s) liberado(s) sobre uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício na presença de um composto caotrópico e/ou um alcanol ramificado ou não ramificado,
c) opcionalmente, lavagem do(s) ácido(s) nucleico(s) imobilizado(s) sobre a matriz,
d) opcionalmente, remoção do ácido nucleico ligado, em que lise e/ou imobilização é realizada na presença de uma 20 composição de lise e/ou ligação compreendendo:
- pelo menos um composto caotrópico e
- pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno na faixa de >0,1% peso/volume a <50% peso/volume, baseado no volume total da composição.
O termo composição significa, para fins da presente invenção, composição de lise e/ou ligação.
Em modalidades preferidas do método, um reagente de lise da invenção é usado para lise da amostra. O reagente de lise é mantido em contato com a amostra biológica a ser submetida à lise. Uma ou mais enzimas podem ser adicionadas independentemente umas das outras em vários pontos de tempo, dependendo do tempo. A amostra pode estar na forma líquida, por exemplo, no caso de amostras clínicas líquidas. Amostras clínicas as quais contêm componentes sólidos, tais como amostras de fezes ou amostras de esffegaço, são usualmente suspensas em soluções aquosas adequadas antes de outra análise. Culturas de célula são usualmente removidas do meio de cultura antes de lise, mas secagem da amostra completamente é evitada na maioria dos casos. No caso de amostras completamente secas, por exemplo, liofilizados, a amostra é reconstituída em soluções aquosas antes de outro processamento, por exemplo, liofilizados de padrões virais. As amostras a serem submetidas à lise, portanto, usualmente contêm algum líquido. Esse líquido presente na amostra é mantido em contato com o reagente de lise. A esse respeito, um método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra usualmente envolve uma composição de lise a qual contém reagente de lise e outro líquido da amostra ou de soluções já adicionadas à referida amostra.
O termo composição de lise e/ou ligação refere-se, para fins da presente invenção, a um reagente de lise e/ou ligação o qual é usado em um método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra e o qual pode conter ainda líquido, além do reagente de lise, ligação e/ou lavagem. A composição de lise e/ou ligação pode, de preferência, compreender o reagente de lise e/ou ligação da invenção.
De acordo com uma outra modalidade preferida do método, o ácido nucleico liberado é imobilizado sobre uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício na presença de uma composição de ligação da invenção.
Preferência é dada ao contato do reagente de lise e/ou ligação da invenção com a amostra submetida à lise. A composição de lise ou outra solução na qual lise foi realizada pode ser removida antes que a amostra seja mantida em contato com o reagente de ligação. Preferência é dada à não remoção da composição de lise. De preferência, um reagente de ligação é mantido em contato com uma amostra compreendendo composição de lise.
De acordo com uma modalidade particularmente preferida do método, lise é realizada na presença de uma composição de lise e imobilização é realizada na presença de uma composição de ligação. Conseqüentemente, imobilização é, de preferência, realizada na presença de uma mistura de uma composição de lise e composição de ligação.
Opcionalmente, o reagente de lise pode também ser empregado como reagente de ligação ao mesmo tempo. Ainda opcionalmente, o reagente de ligação pode também ser empregado como reagente de lise. Também opcionalmente, o reagente de ligação pode também ser empregado como reagente de lavagem.
A composição de lise e/ou ligação compreende pelo menos um composto caotrópico e pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno na faixa de >0,1% (peso/volume) a <50% (peso/volume), baseado no volume total da composição. Se misturas de tensoativos são usadas, de preferência, o teor total de tensoativo está, por exemplo, na faixa de > 0,1% (peso/volume) a < 50% (peso/volume) no total, baseado no volume total da composição.
A vantagem de tal método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico, por exemplo, é aquela de um eluato contendo os ácidos nucleicos não ser ou ser apenas ligeiramente opaco, mesmo após várias semanas ou vários meses de armazenamento em temperatura ambiente ou temperaturas elevada, por exemplo, 50°C, quando uma composição de lise e/ou ligação compreendendo pelo menos um composto caotrópico e pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno na faixa de >0,1% (peso/volume) a < 50% (peso/volume), baseado no volume total da composição, é usado. Portanto, vantajosamente, o eluato pode não conter ou conter pelo menos distintamente menos contaminações. Isso toma o uso adicional do eluato contendo os ácidos nucleicos substancialmente mais vantajoso, porque outras etapas de purificação que consomem tempo, as quais reduzem o rendimento dos ácidos nucleicos, podem ser dispensadas.
Outra vantagem de tal método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico, por exemplo, é aquela de tomar possível um rendimento particularmente bom dos ácidos nucleicos isolados, em particular DNA viral, por exemplo, o DNA do vírus da Hepatite B (HBV).
Uma amostra biológica pode ser entendida como significando um material em uma base em partícula ou molecular, em particular vírus, fagos e células, tais como células bacterianas, células de levedo ou mofo ou células de ser humano, animal ou planta. O método é particularmente adequado para o isolamento de ácidos nucleicos, tais como DNA ou RNA, de materiais de amostra de origem humana ou animal, por exemplo, amostras clínicas, tais como sangue, plasma, soro, esffegaços da boca, garganta e nariz, lavagens brônquio-alveolares, urina, fluido cerebral, escarro, saliva, fezes, aspirados, esfregaços tais como, por exemplo, esffegaços nasais, esfregaços bucais, esfregaços cervicais, esfregaços vaginais, esfregaços uretrais, esfregaços faringeais, esfregaços permeais e esfregaços retais, fezes, aspirados, esfregaços epiteliais, biópsias e outras amostras de medula óssea ou tecido e também culturas desses materiais de amostra em meios nutrientes adequados.
A amostra pode também ser do campo de análise ambiental, análise de alimentos ou pesquisa biológica molecular, por exemplo, de culturas bacterianas, culturas de levedo ou fungicas, culturas virais, lisatos de fago ou produtos de processos de amplificação, por exemplo, de uma reação em cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR).
O método da invenção é, de preferência, adequado para isolamento e/ou purificação de DNA genômico, DNA mitocondrial, DNA de plasmídeo, DNA viral e RNA viral e para o isolamento e purificação de RNA intracelular de sangue íntegro, por exemplo, para reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction - RT-PCR) e também para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos livremente em circulação presentes em materiais de amostra isentos de célula. O método da invenção é particularmente adequado para o isolamento e/ou purificação de DNA viral.
A amostra biológica é submetida à lise na etapa a) do método. Em princípio, os métodos listados abaixo, selecionados do grupo compreendendo lise com o auxílio de tensoativos iônicos e não-ionogênicos, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulphate - SDS), dodecil sulfato de lítio (Lithium Dodecyl Sulphate - LiDS) ou lauroil sarcosinato de sódio (Sarkosyl) em reagente s ou tampões adequados, o uso de sais caotrópicos, dilaceramento mecânico, por exemplo, por meio de ultrasom, uma prensa Francesa, trituração com partículas tais como esferas de vidro, esferas de cerâmica ou partículas metálicas ou em nitrogênio líquido, mediante ciclos repetidos de congelamento e descongelamento ou através de ebulição, lise enzimática, lise por meio de liofilização, lise através de choque osmótico, microondas e/ou tratamento térmico e/ou combinações dos mesmos, são adequados para a lise de uma amostra biológica. A lise é, de preferência, realizada na presença de sais caotrópicos.
Preferência é dada à lise da amostra biológica na presença de uma composição de lise compreendendo pelo menos um composto caotrópico e pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietilenopolioxipropileno na faixa de >0,1% (peso/volume) a <50% (peso/volume), baseado no volume total da composição de lise.
Mais especificamente, uma combinação de agentes caotrópicos e tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno é particularmente eficaz na lise de células virais.
A composição de lise e/ou ligação compreende pelo menos um composto caotrópico e pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno selecionado do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno.
Referência é feita aqui aos conteúdos todos da descrição acima com relação a tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno.
Exemplos de álcoois graxos etoxilados adequados são álcoois dodecílico, laurílico, cetílico, oleílico ou estearílico etoxilados, os quais podem ser usados isoladamente ou como uma mistura. Polioxietileno éteres de álcool graxo preferidos são álcoois laurílico, cetílico, oleílico ou estearílico etoxilados selecionados do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter.
Polioxietileno éteres de álcool graxo preferidos são selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(4) lauril éter, polioxietileno(23) lauril éter, polioxietileno(2) cetil éter, polioxietileno(lO) cetil éter, polioxietileno(20) cetil éter, polioxietileno(2) estearil éter, polioxietileno(lO) estearil éter, polioxietileno(20) estearil éter, polioxietileno(2) oleil éter, polioxietileno(lO) oleil éter, polioxietileno(20) oleil éter e/ou polioxietileno(lOO) estearil éter. Os números aqui indicam o número médio de unidades de óxido de etileno.
Exemplos de polioxietileno lauril, polioxietileno cetil, polioxietileno oleil, ou polioxietileno estearil éteres de álcool adequados são, de preferência, selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(4) lauril éter (Brij® 30) ou polioxietileno(23) lauril éter (Brij® 35), polioxietileno(2) cetil éter (Brij® 52), polioxietileno(lO) cetil éter (Brij® 56), polioxietileno(20) cetil éter (Brij® 58), polioxietileno(2) estearil éter (Brij® 72), polioxietileno(lO) estearil éter (Brij® 76), polioxietileno(20) estearil éter (Brij® 78), polioxietileno(2) oleil éter (Brij® 92), polioxietileno(lO) oleil éter (Brij® 97), polioxietileno(20) oleil éter (Brij® 98) e/ou polioxietileno(lOO) estearil éter (Brij® 700).
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o polioxietileno éter de álcool graxo compreende um componente de álcool graxo tendo de 6 a 22 átomos de carbono e um componente de polioxietileno contendo de 2 a 150 unidades (CH2CH2O).
Em uma modalidade particularmente preferida do método, o polioxietileno éter de álcool graxo é selecionado do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter.
Em uma modalidade preferida do método, o polioxietileno éter de álcool graxo é selecionado do grupo compreendendo polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter. Nessa modalidade, menos preferência é dada à composição de lise e/ou ligação compreendendo éteres de álcool laurílico de polioxietileno, por exemplo, polioxietileno(4) lauril éter (Brij® 30) ou polioxietileno(23) lauril éter (Brij®
35). Preferência é dada, portanto, à composição de lise e/ou ligação não contendo qualquer uma dessas substâncias. Em uma modalidade particularmente preferida, o polioxietileno éter de álcool graxo da composição de lise e/ou ligação não é polioxietileno lauril éter.
Preferência é dada a polioxietileno cetil, polioxietileno oleil, ou polioxietileno estearil éter de álcool, de preferência selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(lO) cetil éter (Brij® 56), polioxietileno(20) cetil éter (Brij® 58), polioxietileno(20) estearil éter (Brij® 78) e/ou polioxietileno(20) oleil éter (Brij® 98). Preferência particular é dada a polioxietileno cetil ou polioxietileno oleil éteres de álcool, de preferência selecionados do grupo compreendendo polioxietileno(lO) cetil éter (Brij® 56), polioxietileno(20) cetil éter (Brij® 58) e/ou polioxietileno(20) oleil éter (Brij® 98).
Além disso, adequados são álcoois laurílico, cetílico, estearílico ou oleílico polietoxilados os quais estão disponíveis, por exemplo, sob os nomes INCI laureth, ceteth, esteareth ou oleth.
Outros tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno preferidos são polioxietileno alquilfenil éteres. Preferência é dada a polioxietileno alquilfenil éteres tendo um grupo alquila contendo de cinco a
15 átomos de carbono, de preferência contendo 6 a 10 átomos de carbono.
Preferência adicional é dada a grupos C7- a Cio-alquila ramificados ou não ramificados, mais particularmente grupos C8- e Cç-alquila ramificados ou não ramificados, particularmente de preferência grupos isooctila e grupos nonila. Em uma modalidade preferida do método, o polioxietileno alquilfenil éter é selecionado do grupo compreendendo polioxietileno nonilfenil éter e/ou polioxietileno isooctilfenil éter. Polioxietileno nonilfenil éteres e polioxietileno isooctilfenil éteres adequados são obteníveis, por exemplo, sob a marca comercial Igepal®, por exemplo, da BASF.
Outros tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno preferidos são copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno. Copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno são também referidos como “poloxâmeros”. Preferência é dada a copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno da fórmula empírica
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH, onde “a” refere-se ao número de unidades polioxietileno e “b” refere-se ao número de unidades polioxipropileno, com a proporção em peso a/b estando, de preferência, na faixa de 0,1 a 3.
“a” está, mais particularmente, na faixa de 2 a 150, de preferência de 4 a 120, mais preferivelmente de 8 a 80, ainda mais preferivelmente “a” é um número inteiro selecionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 e 150 e, ainda mais preferivelmente, “a” é um número inteiro selecionado de 2, 4, 10, 20, 23, 40, 55, 70 e 100.
“b” está, mais particularmente, na faixa de 10 a 90, de preferência na faixa de 20 a 80, mais preferivelmente na faixa de 30 a 70, ainda mais preferivelmente “b” é um número inteiro selecionado de 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,
75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 e 90 e, ainda mais preferivelmente, “b” é um número inteiro selecionado de 15, 18, 23, 40, 55, 67 e75.
Preferência adicional é dada a copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno tendo blocos de polioxietileno e polioxipropileno de diferentes comprimentos, nos quais um bloco de polioxipropileno tendo de 15 a 67 unidades de polipropileno é envolvido por dois blocos de polioxietileno tendo, independentemente um do outro, em cada caso, de 2 a 130 unidades de polietileno.
Copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno adequados podem ser obtidos, por exemplo, sob a marca comercial Pluronic® ou Synperonic®, por exemplo, da BASF.
De acordo com uma modalidade preferida do método, a composição de lise e/ou ligação compreende um tensoativo não-iônico na faixa de > 0,2% (peso/volume) a < 30% (peso/volume), de preferência na faixa de > 3% (peso/volume) a < 10% (peso/volume), de preferência na faixa de > 3,2% (peso/volume) a < 8% (peso/volume), baseado no volume total da composição.
Verificou-se que isso é particularmente vantajoso para composições de lise e para misturas de composições de lise e ligação.
De acordo com uma modalidade preferida do método, o composto caotrópico da composição de lise e/ou ligação é um sal de sódio ou sal de guanidínio, de preferência selecionado do grupo compreendendo iodeto de sódio, perclorato de sódio, hidrocloreto de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio e/ou uma mistura de dois ou mais sais dos mesmos. O composto caotrópico é, de preferência, um sal de guanidínio, de preferência selecionado do grupo compreendendo hidrocloreto de guanidínio, tiocianato de guanidínio e/ou isotiocianato de guanidínio.
Em particular, verificou-se que uma combinação dos compostos caotrópicos e dos tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno mencionados acima é vantajosa para lise de células virais e isolamento de ácidos nucleicos de células virais.
Concentrações do composto caotrópico da composição de lise e/ou ligação na faixa de >0,1 M a < 10M são vantajosas. Preferência é dada à concentrações do composto caotrópico na faixa de > 1 M a < 8 M, de preferência na faixa de > 3 M a < 7 M, particularmente de preferência na faixa de > 4 M a < 6 M.
De acordo com uma modalidade preferida do método, a composição de lise e/ou ligação compreende pelo menos um composto tampão selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), N-(tri(hidroximetil)metil)glicina (Tricina), N,N-bis(2hidroxietil)glicina (BICINA), ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etanosulfônico) (HEPES), ácido piperazina-1,4-bis(2-etano-sulfônico) (PIPES), ácido N-ciclo-hexil-2-aminoetano-sulfônico (CHES), ácido 2-(Nmorfolino)etano-sulfônico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propano-sulfônico (MOPS) e/ou tampão de fosfato.
De acordo com outra modalidade preferida do método, a composição de lise e/ou ligação compreende pelo menos um composto tampão selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etano-sulfônico) (HEPES) e/ou tampão de fosfato. De acordo com ainda uma outra modalidade preferida do método, a composição de lise e/ou ligação compreende pelo menos um composto tampão selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) e/ou ácido N-(2-hidroxietil)piperazinaN’-(2-etano-sulfônico) (HEPES).
A amostra biológica pode ser submetida à lise em temperatura ambiente, por exemplo, a 15°C a 25°C ou em uma temperatura elevada, por exemplo, em temperaturas na faixa de > 37°C a < 75°C.
Em modalidades preferidas, a composição de lise pode, além disso, ter enzimas, por exemplo, proteinase K, protease (por exemplo, Protease QIAGEN), zimolase, liticase, acromopeptidase, lisostafma, lisozima e, dependendo do uso, nucleases, por exemplo, DNase e/ou RNase.
O(s) ácido(s) nucleico(s) liberado(s) é(são) imobilizado(s) sobre uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício na presença de um composto caotrópico e/ou um alcanol ramificado ou não ramificado.
Preferência é dada à composição de ligação compreendendo um alcanol ramificado ou não ramificado. De acordo com uma modalidade preferida, o alcanol ramificado ou não ramificado é um álcool tendo de um a cinco átomos de carbono, de preferência selecionado do grupo compreendendo metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, terc-butanol, n-pentanol, isopentanol e/ou misturas dos mesmos.
De acordo com uma modalidade preferida, a composição de ligação compreende um alcanol ramificado ou não ramificado na faixa de > 1% em volume a < 80% em volume, de preferência na faixa de > 5% em volume a < 70% em volume, de preferência na faixa de > 10% em volume a <60% em volume, mais preferivelmente na faixa de > 15% em volume a < 50% em volume, baseado no volume total da composição de ligação.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, uma mistura da composição de ligação compreende o reagente de lise e opcionalmente um ou mais de outros aditivos, de preferência um alcanol ramificado ou não ramificado na faixa de >1% em volume a < 80% em volume, de preferência na faixa de > 5% em volume a < 70% em volume, de preferência na faixa de > 15% em volume a < 50% em volume, baseado no volume total da mistura.
Os ácidos nucleicos são isolados por meio de contato da amostra com uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício, tais como dióxido de silício (sílica), silicato, vidro e/ou gel de sílica e incubação da mesma tempo o bastante para ligação. A matriz pode ter o design usual conhecido da técnica anterior tal como, por exemplo, na forma de partículas, como uma membrana ou filtro. Para facilitar sua remoção, preferência é dada à partículas tendo propriedades magnéticas. Tempos de incubação entre 10 segundos e 30 minutos podem ser convenientes para ácidos nucleicos. Tempos de incubação em uma faixa de 1 minuto a 20 minutos, em particular de aproximadamente 10 minutos, são vantajosos.
Os ácidos nucleicos são isolados, de preferência, usando partículas magnéticas tendo um revestimento de sílica gelatinoso. Os ácidos nucleicos são isolados, de preferência, usando partículas magnéticas tendo um revestimento de sílica gelatinoso e tendo um tamanho médio de partícula na faixa de > 1 pm a < 25 pm, de preferência na faixa de > 5 pm a < 15 pm e, particularmente de preferência, na faixa de > 6 pm a < 10 pm, de preferência com um distribuição de tamanho limitada. Mais preferivelmente, os ácidos nucleicos são isolados usando partículas magnéticas tendo um revestimento de sílica gelatinoso e tendo um tamanho médio de partícula na faixa de > 1 pm a > 5 pm, de preferência com uma distribuição de tamanho limitada.
Em uma outra modalidade preferida, as partículas magnéticas ou magneticamente atraentes têm um núcleo magnético baseado em óxido de ferro, de preferência selecionado do grupo compreendendo magnetita (Fe3O4), magemita (y-Fe2-O3) e/ou ferritas.
Partículas magnéticas de sílica as quais podem ser usadas de uma maneira vantajosa são descritas, por exemplo, no Pedido Internacional WO 01/71732, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência na íntegra.
Em uma modalidade preferida, uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício na forma de partículas magnéticas ou magneticamente atraentes tendo uma superfície de sílica pode ser usada.
Preferência é dada à realização de ligação em temperaturas na faixa de > 15°C a < 75°C, de preferência na faixa de > 20°C a < 70°C, particularmente de preferência na faixa de > 46°C a < 65°C, mais preferivelmente de > 50°C a < 60°C. Ligação pode também ser realizada em temperatura ambiente, por exemplo, de > 15°C a < 28°C.
Após incubação, os ácidos nucleicos ligados à matriz baseada em um ou mais compostos de silício são removidos da composição de lise e/ou ligação. Quando de uso de partículas magnéticas de sílica, isso pode ser obtido com o auxílio de um campo magnético. Por exemplo, as partículas magnéticas podem ser retiradas da parede do vaso no qual incubação tenha sido realizada, coletadas em pontas de pipeta adequadas mediante aplicação de um campo magnético ou imobilizadas sobre hastes magnéticas protegidas por revestimentos plásticos. Exemplos de etapas de método adequadas para remoção da composição de lise e/ou ligação são remoção mediante pipetamento ou aspiração do líquido ou elevação das partículas magnéticas com as pontas da pipeta ou sobre as hastes magnéticas ou diminuição da mistura de lise e/ou ligação, com as partículas magnéticas separadas restantes no mesmo nível.
Opcionalmente, o(s) ácido(s) nucleico(s) imobilizado(s) sobre a matriz pode(m) ser lavado(s) antes de remoção. A etapa de lavagem é, de preferência, realizada mediante incubação de uma solução de lavagem com as partículas carregadas envolvendo, de preferência, ressuspensão das referidas partículas, por exemplo, por meio de agitação ou aplicando um campo magnético. A solução de lavagem contaminada é, de preferência, removida, assim como a composição de lise e/ou ligação restante após ligação, em particular uma mistura de composição de lise e/ou composição de ligação.
O reagente de lavagem usado pode ser um tampão de lavagem convencional ou qualquer outro meio adequado. Geralmente, preferência é dada a reagentes de lavagem tendo uma resistência iônica baixa a moderada, por exemplo, uma solução de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) a 10 mM. Além disso, utilizáveis são tampões de lavagem tendo concentrações relativamente altas de sal, por exemplo, uma solução de hidrocloreto de guanidínio a 4-6 M. Os reagentes de lavagem da invenção, descritos acima são, da mesma forma, reagentes de lavagem adequados.
Além disso, reagentes de lavagem contendo álcool podem também ser usados, por exemplo, soluções aquosas de álcoois tendo de um a cinco átomos de carbono, de preferência soluções aquosas de etanol, em particular soluções aquosas de etanol com resistência de 50-100 por cento.
Preferência é dada à lavagem do(s) ácido(s) nucleico(s) imobilizado(s) sobre a matriz várias vezes, por exemplo, 2 a 4 vezes, de preferência com diferentes reagentes de lavagem. Em modalidades preferidas, a lavagem é realizada primeiro com reagentes de lavagem tendo uma resistência iônica baixa a moderada e, então, com uma solução aquosa e etanol com resistência de 70-100 por cento.
Mais especificamente, uso de partículas magnéticas permite que etapas de separação e/ou lavagem sejam realizadas facilmente em virtude de agregação magnética das partículas.
A última etapa de lavagem ou uma etapa de enxágüe com água pode ser seguida por uma etapa de secagem, de preferência das partículas magnéticas, por exemplo, in vacuo ou por meio de evaporação do líquido ou deixando que o líquido evapore.
De acordo com a etapa d) do método, os ácidos nucleicos ligados podem ser removidos da matriz. Remoção dos ácidos nucleicos é também referida pela Requerente como eluição.
Preferência pode também ser dada ao uso de ácidos nucleicos ligados à matriz, em particular às partículas magnéticas, sem uma etapa de remoção, por exemplo, para PCR ou outros métodos de amplificação, métodos de detecção de DNA ou métodos de identificação de DNA.
O ácido nucleico ligado pode ser removido das partículas por meio de um reagente de eluição tendo um baixo teor de sal. Mais especificamente, reagentes tendo um teor de sal de menos de 0,1 mol/1 podem ser usados como o reagente de eluição tendo um baixo teor de sal. Preferência particular é dada ao reagente de eluição contendo o composto tampão tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). Particularmente adequada para eluição é, além disso, água desmineralizada, opcionalmente contendo um ou mais aditivos, por exemplo, agentes de formação de complexo, tais como tetraacetato de etilenodiamina (EDTA), azida e/ou compostos tampão, por exemplo, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS).
Uso da composição de lise e/ou ligação resulta, em particular, em um método particularmente vantajoso para isolamento de ácidos nucleicos de amostras biológicas, em particular para isolamento de DNA viral.
Vantagens surgem, em particular, dos bons rendimentos obteníveis, mesmo após armazenamento dos reagentes de lise e/ou ligação.
A presente invenção, além disso, refere-se a um kit para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico compreendendo um reagente de lise, ligação e/ou lavagem da invenção.
Em modalidades preferidas, o kit pode, além disso, conter uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício, em particular uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício na forma de partículas magnéticas ou magneticamente atraentes tendo uma superfície de sílica. Exemplos de partículas de sílica magnética contidas preferencialmente no referido kit são divulgados no Pedido Internacional WO 01/71732, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência na íntegra.
Em uma outra modalidade preferida, o kit pode, além disso, conter reagentes de lavagem e/ou eluição adequados, em particular o reagente de lavagem de acordo com a invenção.
Em outra modalidade preferida, o kit pode conter outros materiais de suporte silanizados que não partículas de sílica magnéticas, de preferência colunas centrífugas com membranas de sílica.
A presente invenção, além disso, refere-se ao uso de tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno selecionados do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno, em particular polioxietileno éteres de álcool graxo selecionados do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter, para solubilização de lipídios de uma amostra biológica.
O termo lipídio significa, para fins da presente invenção, substâncias naturais insolúveis em água ou pelo menos principalmente insolúveis em água. O termo lipídio compreende, para fins da presente invenção, ácidos graxos, o grupo de triglicerídeos compreendendo gorduras e óleos, ceras, fosfolipídios, esfingolipídios, lipossacarídeos e o grupo de isoprenóides compreendendo esteróides e carotenóides. Mais especificamente, o termo lipídio significa componentes lipídicos ou componentes estruturais das membranas celulares de organismos, tais como fosfolipídios e esfingolipídios.
Preferência é dada ao uso de tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno selecionados do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno para solubilização de lipídios de uma amostra biológica em métodos para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico.
Referência é feita aqui à descrição toda acima com relação aos tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno.
Preferência particular é dada ao uso de polioxietileno éteres de álcool graxo selecionados do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter para solubilização de lipídios de uma amostra biológica em métodos para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico.
Preferência particular é dada ao uso de tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno, em particular polioxietileno éteres de álcool graxo, para solubilização de lipídios de uma amostra biológica em métodos para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos usando uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício, de preferência na forma de partículas magnéticas ou magneticamente atraentes tendo uma superfície de sílica.
Vantajosamente, verificou-se que o eluato não contém ou contém pelo menos acentuadamente menos contaminações quando de uso dos tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno, em particular polioxietileno éteres de álcool graxo, em métodos para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos usando uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício, de preferência na forma de partículas magnéticas ou magneticamente atraentes tendo uma superfície de sílica.
Além disso, a invenção refere-se ao uso de tensoativos não20 iônicos com base em polioxietileno selecionados do grupo compreendendo polioxietileno éter de álcool graxo, polioxietileno alquilfenil éter e/ou copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxipropileno, de preferência polioxietileno éter de álcool graxo selecionado do grupo compreendendo polioxietileno lauril éter, polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter, para o preparo de reagentes de lise, ligação e/ou lavagem estáveis ao armazenamento.
Referência é feita aqui à descrição toda acima com relação aos tensoativos não-iônicos com base em polioxietileno.
Estável ao armazenamento significa aqui, de preferência, para fins da invenção, que as propriedades do reagente de lise, ligação e/ou lavagem que são relevantes para o uso em particular não mudam quando de armazenamento durante um período de três meses, de preferência de 6 meses, mais preferivelmente de pelo menos 8 meses, de forma tal que prejudique substancialmente o referido uso. Em uma modalidade preferida, a estabilidade ao armazenamento é mostrada em temperatura ambiente, mais preferivelmente também em uma temperatura de armazenamento elevada de 50 °C, por exemplo.
Verificou-se que o pH é uma das propriedades dos reagentes que é relevante para o uso. De preferência, portanto, o primeiro não muda substancialmente durante armazenamento dos reagentes, com o pH, de preferência, diminuindo em menos de 1 durante armazenamento dos reagentes.
Outros detalhes, características e vantagens do assunto da invenção podem ser encontrados nas reivindicações dependentes e na descrição aqui abaixo das figuras em anexo e exemplos, os quais ilustram modalidades exemplificativas da presente invenção à guisa de exemplo.
As Figs. Ia, lb representam a alteração no pH do reagente de lise B da invenção, representada como barras vazadas e do reagente de lise A contendo Tween 20®, representada como barras sólidas, durante 33 semanas de armazenamento a 25°C (Fig. Ia) e 50°C (Fig. lb).
A Fig. 2 representa as médias de valores de CT após PCR em tempo real HBV-específica de HBV-DNA após realização de preparados de DNA viral com o reagente de lise B da invenção e o reagente de lise A contendo Tween® 20.
A Fig. 3 representa as médias de valores de CT após PCR em tempo real HBV-específica de HBV-DNA após realização de preparados de DNA viral com o reagente de lise B da invenção e o reagente de lise A contendo Tween® 20 após 10 semanas de armazenamento a 50°C. Aqui, um reagente de lise A, o qual foi armazenado em temperatura ambiente durante cerca de 4 semanas, foi usado como referência. Em cada caso, 6 μΐ e 24 μΐ do eluato foram usados para a PCR em tempo real, com os resultados para 6 μΐ do eluato sendo representados em barras vazadas e os resultados para 24 μΐ de eluato sendo representados em barras sólidas.
A invenção será ilustrada abaixo, da mesma forma, com base nos exemplos. Será apreciado que os últimos deverão ser considerados meramente ilustrativos e não limitam a presente invenção.
Exemplo 1: Teste de Estabilidade
Um reagente de lise A contendo Tween® 20 a 20% (peso/v) (Fluka), isotiocianato de guanidínio e tris(hidroximetil)aminometano e reagente de lise B, no qual Tween® 20 foi substituído por Brij® 58 a 20% (peso/v) (Sigma) foram recentemente preparados em água duplamente destilada e cada um armazenado em vasos vedados a 25°C e 50°C durante 33 semanas.
O pH de cada solução foi determinado aqui com auxílio de um medidor de pH (Metrohm) em temperaturas na faixa de 20°C a 28°C no início de armazenamento e em intervalos semanais.
O gráfico de barras representado na Fig. la indica que o pH do reagente de lise A diminuiu ligeiramente, de um pH de aproximadamente 7,8 para um pH de 7,2 durante 33 semanas de armazenamento a 25°C, enquanto que o pH diminuiu de um pHde aproximadamente 7,8 para um pH de aproximadamente 5,9 durante 33 semanas de armazenamento a 50°C, conforme representado na Fig. lb. Em contraste, o pH do reagente de lise B permaneceu estável em um pH de aproximadamente 8 durante 33 semanas de armazenamento a 25°C e 50°C.
Exemplo 2: Extração de DNA viral
Plasma humano negativo, isto é, sem vírus ECBV, foi misturado com 104 sgU/ml de vírus da hepatite B (HBV). O DNA viral foi extraído, em cada caso, de 1000 μΐ da amostra de plasma, usando a plataforma automática comercialmente disponível QIAsymphony® (Qiagen), por meio do protocolo automático para purificação de ácidos nucleicos virais de amostras plasmáticas.
De acordo com o protocolo usado, a amostra foi exposta aos volumes protocolo-definidos de reagente de lise B contendo isotiocianato de guanidínio, tris(hidroximetil)aminometano e Brij® 58 a 20% (peso/v) (Sigma) e proteinase K e uma solução AVE contendo RNA veículo. Isso foi seguido por incubação a 65°C para submeter a amostra à lise. A mistura de amostra foi, então, adicionado o volume protocolo-definido de reagente de ligação C contendo isotiocianato de guanidínio, tris(hidroximetil)aminometano e Brij® 58 a 9% (peso/v) (Sigma) e isopropanol. Após mais 3 minutos de incubação, suspensão MagAttract, a qual continha as partículas magnéticas de dióxido de silício, foi adicionada e misturada, conforme especificado no protocolo. Durante esse tempo, os ácidos nucleicos se ligam às partículas de dióxido de silício. As partículas de dióxido de silício magnéticas foram, então, separadas e a fase líquida foi removida. As partículas de dióxido de silício foi, então, adicionado o volume protocolo-definido de solução de lavagem contendo tiocianato de guanidínio e etanol e as partículas foram suspensas na solução de lavagem. O sobrenadante foi novamente removido e um volume protocolo-definido de solução de lavagem contendo Tris, NaCl e etanol foi adicionado e uma segunda etapa de lavagem foi realizada. Após separação e remoção da fase líquida, as partículas foram lavadas com volumes protocolodefinidos de etanol aquoso com resistência de 80%. Após separação das partículas, o sobrenadante foi removido e as partículas foram secas em ar durante 8 minutos. Para eluir o DNA, volumes protocolo-definidos de solução E de eluição foram adicionados, com as partículas sendo suspensas na mesma durante 3 minutos. As partículas foram, então, removidas e o eluato foi obtido.
De acordo com o referido protocolo, DNA viral foi extraído de mais 1000 μΐ de amostra de plasma, com a modificação do uso de reagente de lise A contendo Tween® 20 a 20% (peso/v) (Fluka) e reagente de ligação D contendo Tween® 20 a 9% (peso/v) (Fluka).
Os eluatos obtidos foram submetidos, em cada caso, a uma PCR em tempo real (RT-) HBV-específica, com 24 μΐ de eluato sendo usados em cada caso. As médias, representadas na Fig. 2, dos valores de CT (ciclo limiar), as quais descrevem o ciclo no qual a fluorescência começa a aumentar logaritmicamente, revelaram que a extração usando o reagente de lise B e o reagente de ligação C da invenção obteve um maior rendimento.
Exemplo 3: Extração de DNA viral após armazenamento do reagente de lise
Os reagentes de lise B contendo isotiocianato de guanidínio, tris(hidroximetil)aminometano e Brij® 58 a 20% (peso/v) (Sigma) e A, no qual Brij® 58 foi substituído por Tween® 20 a 20% (peso/v) (Fluka) foram, cada um, armazenados em vasos vedados a 50°C durante 10 semanas.
O ácido nucleico viral foi, então, extraído usando a plataforma automática comercialmente disponível QIAsymphony® (Qiagen), por meio do protocolo automático para purificação de ácido nucleico viral de amostras plasmáticas.
De acordo com o protocolo descrito no Exemplo 2, o DNA viral foi extraído, em cada caso, de 1000 μΐ da amostra de plasma usando a plataforma automática comercialmente disponível QIAsymphony® (Qiagen) com, para diferentes misturas, reagente de lise B contendo isotiocianato de guanidínio, tris(hidroximetil)aminometano e Brij® 58 a 20% (peso/v) (Sigma) e reagente de lise A no qual Brij® 58 foi substituído por Tween® 20 a 20% (peso/v) (Fluka) armazenado, em cada caso, a 50°C durante 10 semanas. A referência usada foi um reagente de lise A, o qual foi armazenado em temperatura ambiente durante cerca de 4 semanas.
Foi verificado que os eluatos obtidos usando o reagente de lise
A armazenado a 50 °C eram muito opacos, enquanto que os eluatos obtidos usando o reagente de lise B eram claros.
Em cada caso, 6 μΐ e 24 μΐ dos eluatos obtidos foram submetidos a uma PCR em tempo real (RT-) HBV-específica. As médias dos valores de CT, representadas na Fig. 3, revelaram que a extração usando o reagente de lise B e o reagente de ligação C da invenção obteve um maior rendimento.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Reagente de lise, ligação e/ou lavagem, caracterizado pelo fato de compreender:
    - pelo menos um composto caotrópico,
    5 - pelo menos um composto tampão, de preferência selecionado do grupo compreendendo tris(hidroximetil)aminometano, N(tri(hidroximetil)metil)glicina, N,N-bis(2-hidroxietil)glicina, ácido 3-(Nmorfolino)propano-sulfônico, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etanosulfônico), ácido piperazina-1,4-bis(2-etano-sulfônico), ácido N-ciclo-hexil-210 aminoetano-sulfônico, ácido 2-(N-morfolino)etano-sulfônico e/ou tampão de fosfato e
    - pelo menos um tensoativo não iônico baseado em polioxietileno, que é polioxietileno éter de álcool graxo, selecionado do grupo consistindo em polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou
    15 polioxietileno oleil éter na faixa de > 8% peso/volume a < 30% peso/volume, baseado no volume total do reagente.
  2. 2. Reagente de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polioxietileno éter de álcool graxo compreende um componente de polioxietileno contendo de 2 a 150
    20 unidades (CH2CH2O).
  3. 3. Reagente de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polioxietileno éter de álcool graxo é um polioxietileno cetil éter.
  4. 4. Reagente de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com 25 qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o reagente de lise, ligação e/ou lavagem compreende o tensoativo não-iônico na faixa de > 9% peso/volume a < 30% peso/volume, de preferência na faixa de > 10% peso/volume a < 30% peso/volume, de preferência na faixa de > 15% peso/volume a < 20% peso/volume, baseado no volume total do reagente.
    Petição 870180018877, de 08/03/2018, pág. 19/22
  5. 5. Reagente de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o composto caotrópico é um sal de sódio ou sal de guanidínio, de preferência selecionado do grupo compreendendo iodeto de sódio, perclorato de sódio,
    5 hidrocloreto de guanidínio, tiocianato de guanidínio, isotiocianato de guanidínio e/ou uma mistura de dois ou mais sais dos mesmos.
  6. 6. Reagente de lise, ligação e/ou lavagem de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o reagente de ligação compreende um alcanol ramificado ou não ramificado, de
    10 preferência um álcool ramificado ou não ramificado tendo de um a cinco átomos de carbono, de preferência selecionados do grupo compreendendo metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, butanol ou pentanol ramificado ou não ramificado e/ou misturas dos mesmos.
  7. 7. Uso de um reagente de lise, ligação e/ou lavagem como
    15 definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos.
  8. 8. Método para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
    20 a) lise da amostra biológica,
    b) imobilização do(s) ácido(s) nucleico(s) liberado(s) sobre uma matriz baseada em um ou mais compostos de óxido de silício na presença de um composto caotrópico e/ou um alcanol ramificado ou não ramificado,
    25 c) opcionalmente lavagem do(s) ácido(s) nucleico(s) imobilizado(s) sobre a matriz,
    d) opcionalmente remoção do ácido nucleico ligado, em que lise e/ou imobilização é realizada na presença de uma composição de lise e/ou ligação compreendendo:
    Petição 870180018877, de 08/03/2018, pág. 20/22
    - pelo menos um composto caotrópico,
    - pelo menos um composto tampão, e
    - pelo menos um tensoativo não-iônico baseado em polioxietileno que é polioxietileno éter de álcool graxo selecionado do grupo
    5 consistindo em polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter na faixa de > 0,1% peso/volume a < 30% peso/volume, baseado no volume total da composição.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polioxietileno éter de álcool graxo compreende um componente
  10. 10 de polioxietileno contendo de 2 a 150 unidades (CH2CH2O).
    10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o polioxietileno éter de álcool graxo é um polioxietileno cetil éter.
  11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 15 a 10, caracterizado pelo fato de que a composição de lise e/ou ligação compreende um tensoativo não-iônico na faixa de > 0,2% peso/volume a < 30% peso/volume, de preferência na faixa de > 3% peso/volume a < 10% peso/volume, de preferência na faixa de > 3,2% peso/volume a < 8% peso/volume, baseado no volume total da composição.
    20
  12. 12. Kit para isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra biológica contendo ácido nucleico, caracterizado pelo fato de compreender um reagente de lise, ligação e/ou lavagem como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
  13. 13. Uso de tensoativos não-iônicos com base em
    25 polioxietileno, nomeadamente polioxietileno éter de álcool graxo, selecionados do grupo consistindo em polioxietileno cetil éter, polioxietileno estearil éter e/ou polioxietileno oleil éter, para o preparo de reagentes de lise, ligação e/ou lavagem estáveis ao armazenamento como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
    Petição 870180018877, de 08/03/2018, pág. 21/22
  14. 14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polioxietileno éter de álcool graxo é um polioxietileno cetil éter.
    Petição 870180018877, de 08/03/2018, pág. 22/22
    1/2
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