BRPI0815369A2

BRPI0815369A2 - molÉcula de anticorpo quimÉrico e seu uso, anticorpo que se liga a cd37 e seu mÉtoo de produÇço, molÉcula de dna, vetor de expressço, cÉlula hospedeira, composiÇço farmacÊutica, e mÉtodo de depleÇço de cÉlulas b

Info

Publication number: BRPI0815369A2
Application number: BRPI0815369-8A
Authority: BR
Inventors: Karl-Heinz Heider; Eric Borges; Elinborg Ostermann
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2013-03-12
Also published as: CN105273086A; CN101815725A; CN103396490A; MA32665B1; CL2008002349A1; TW200916478A; WO2009019312A3; EA027499B1; ECSP11009946A; JP2011004758A; TWI535733B; US20140010808A1; UA103005C2; CA2693464C; EP2241577A1; AU2008285590A1; ECSP109946A; US20100189722A1; US20160137729A1; US20210230271A1

Abstract

ANTICORPOS ANTI-CD37. A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CD37 quiméricos e humanizados e a composições farmacêuticas que os contém, que são úteis para o tratamento de malignidades de célula B e doenças autoimunes e inflamatórias que envolvem células B em sua patologia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTI-CD37".

Introdução

A presente invenção refere-se a imunoterapias que são basea- das na depleção de célula B. Em particular, a presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo anti-CD37 para uso em tais terapias, por exemplo, no tratamento de malignidades de célula B e condições autoimunes.

Imunoterapia usando anticorpos monoclonais (mAbs) tem emer- gido como um método seguro e seletivo para o tratamento de câncer e ou- tras doenças. Em particular, o papel dos anticorpos monoclonais em terapias que são baseadas na depleção de célula B, por exemplo, no tratamento de malignidades de célula B, expandiu-se desde a introdução de rituximab (Ri- tuxan®), um anticorpo que é dirigido contra o antígeno CD20 na superfície da célula B. Numerosos estudos têm confirmado a eficácia de rituximab co- mo um agente único e na terapia de combinação em NHL de baixo grau (Hiddemann et al, 2005a; Hiddemann et al, 2005b; Hainsworth 2004; M- cLaughlin et al, 1998), Iinfoma de célula do manto (Forstpointner et al, 2004; Kahl et al, 2006; Foran et al, 2000; Howard et al, 2002; Romaguera et al, 2005), Iinfoma difuso de grande célula (DLCL) (Coiffier et al, 1998; Feugier et al, 2005), e leucemia/linfoma de Burkitt (Thomas et al, 2006). Entretanto, somente um subconjunto de pacientes responde à terapia e a maioria da- queles com o tempo recaem após tratamento com rituximab. Por isso, novos alvos terapêuticos em células B que têm sido buscados são potencialmente mais eficazes do que CD20 para a terapia de malignidades de célula B (Zhao et al, 2007). O antígeno CD37 é um antígeno de superfície celular que não foi, até agora, considerado como um alvo para malignidades de célula B até o mesmo ponto que o antígeno CD20 da célula B.

CD37, um membro da superfamília tetraspanina, é uma molécu- la de superfície celular pesadamente glicosilada com quatro domínios trans- membrana e duas alças extracelulares. CD37 é quase exclusivamente ex- presso em células B maduras, com os níveis de expressão mais altos nas células B do sangue periférico, níveis reduzidos em células plasmáticas e níveis não-detectáveis em células B precursoras CD10+ na medula óssea. Expressão de baixo nível de CD37 também foi relatada em células T em re- pouso e ativadas, granulócitos e monócitos. Na neoplasia de célula B, a ex- pressão de CD37 é principalmente observada em Iinfoma não-Hodgkin a- gressivo (NHL) e leucemia Iinfoide crônica (CLL). Alto nível da expressão de CD37 também é encontrado em Iinfoma de célula de manto (MCL). Este pa- drão de expressão faz de CD37 um alvo atraente para terapia de câncer mediada por anticorpo.

CD37 foi primeiro descrito em 1986 e caracterizado pelo anti- corpo monoclonal murino MB-1 (Link et al, 1986).

O papel fisiológico de CD37 é desconhecido. Camundongos de- ficientes para CD37 não exibem modificações no desenvolvimento e na composição celular de órgãos linfoides, mas têm reduzidos níveis de IgGI e reações imunes mediadas por célula T atenuadas (Knobeloch et al, 2000). Estudos com células T CD37"/_ sugerem um papel para CD37 na proliferação de célula T (van Spriel et al, 2004).

A expressão de CD37 em células B malignas de várias doenças foi relatada. CD37 é expresso na maioria das malignidades de célula B ma- duras como Iinfoma de Burkitt1 Iinfoma folicular e Iinfoma linfocítico (Link et al, 1986). Altos níveis de expressão de CD37 foram observados em leuce- mia de célula cabeluda e em amostras de pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL) e subtipos diferentes de Iinfoma não-Hodgkin (NHL) incluindo Iinfoma de célula de manto (MCL) (Schwartz-Albiez et al, 1988; Barrena et al, 2005). Um relato utilizando microarranjo de anticorpo para imunofenoti- pagem afirma que CD37 seja um bom discriminador entre células de CLL malignas (alta expressão de CD37) contra os linfócitos do sangue periférico normal (PB) (baixa expressão de CD37) (Belov et al, 2001).

A ligação de um mAb específico para CD37 a células de câncer pode disparar vários mecanismos de ação: Em primeiro lugar, depois que o anticorpo liga-se ao domínio extracelular do antígeno CD37, ele pode ativar a cascata de complemento e Iise da célula visada. Em segundo lugar, um anticorpo anti-CD37 pode mediar a cito- toxicidade dependente de anticorpo mediada por célula (ADCC) na célula- alvo, que ocorre após a porção Fc do anticorpo ligado ser reconhecida por receptores apropriados em células citotóxicas do sistema imune.

Em terceiro lugar, o anticorpo pode alterar a capacidade de cé-

lulas B de responder ao antígeno ou a outros estímulos. Finalmente, o anti- corpo anti-CD37 pode iniciar a morte celular programada (apoptose).

O mAb anti-CD37 MB-1 foi avaliado em dois estudos de radioi- munoterapia em pacientes com NHL-B (linfoma não-Hodgkin de célula B; Press et al, 1989; Kaminski et al, 1992). Doses terapêuticas de 131I-MB-I foram administradas a 6 pacientes em recaída com NHL em um estudo e todos os 6 pacientes alcançaram uma remissão clínica completa (CR) com uma duração mediana de 7 meses. Importante, dois dos seis pacientes mos- traram regressões clínicas já depois da administração de somente a dose traçadora de MB-1 sugerindo um efeito direto antitumoral do próprio anticor- po. No segundo estudo MB-1 radiomarcado foi aplicado para o tratamento de pacientes NHL refratários e resultou em 3 de 9 pacientes avaliados com respostas objetivas de duração limitada (Kaminski et al, 1992). Em ambos os estudos, uma rápida e transiente depleção de células B periféricas após in- jeção da dose de anticorpo traço MB-1 marcado foi relatada. Estas observa- ções apoiam a conclusão que MB-1 exerce uma atividade citotóxica por si só. Em resumo, estes estudos clínicos ressaltam a possibilidade de se ter com alvo CD37 em malignidades de célula B e apontam para uma potencial relevância clínica da terapia anti-CD37. Há evidência experimental com uma molécula de cadeia única

semelhante a um anticorpo específica para CD37 ("Small Modular Immuno- Pharmaceutical", SMIP) de que o tratamento com aquela molécula induza apoptose in vitro e retarde o crescimento de linfoma de Burkitt em um mode- lo de enxerto in vivo. A atividade antiapoptótica do anti-CD37 SMIP recombi- nante Tru 16.4 da Trubion foi descrita recentemente (Zhao et al, 2004). Tru 16.4 induziu apoptose independente de caspase em células de CLL primá- rias de pacientes com tumor. A indução de apoptose nestas células foi maior do que aquela de Rituximab e comparável com aquela de Alemtuzumab1 antagonista de CD52. O grau de indução de apoptose foi diretamente pro- porcional à expressão de CD37 na superfície celular e pode ser ainda real- çado pala ligação-cruzada com um anticorpo anti-lgG humana. Uma correla- ção da expressão de CD37 e ADCC foi demonstrada em linhagens celulares in vitro. Em um modelo murino de Iinfoma de Burkitt (Raji) o tratamento com scFv anti-CD37 revelou eficácia terapêutica (Zhao et al, 2007). Estes dados fornecem a primeira evidência que ter CD37 como alvo é uma abordagem promissora para terapia antitumoral direcionada pela indução de apoptose e ADCC.

Finalmente, foi mostrado que o antígeno CD37 é freqüentemen- te expresso em células tumorais em várias malignidades de célula B humano e em linfócitos B normais maduros e que a terapia baseada em anti-CD37 pode ser uma abordagem promissora para tratar malignidades de célula Β. A depleção de células B normais CD37-positivas não é considerada crítica uma vez que os dados clínicos de numerosos pacientes mostram que a de- pleção até mesmo prolongada de células de B até 6 meses com um mAb anti-CD20 não reduz significativamente os níveis séricos de IgG ou aumen- tam o risco de infecções (Van der Kolk et al, 2002). Embora os anticorpos anti-CD37 ou as moléculas semelhantes

ao anticorpo descritas acima(MB-1 e SMIP Tru16.4) tenham mostrado eficá- cia antitumoral em malignidades de célula B e potencial para ter como alvo CD37, há uma necessidade por inibidores anti-CD37 alternativos para me- lhorar as terapias baseadas na depleção de célula B. Sumário de invenção

Foi um objeto de a invenção fornecer novos antagonistas de CD37 para tratamento de malignidades de célula B e outros distúrbios que respondem à depleção de células B CD37 positivas.

Além disso, foi um objeto da invenção fornecer anticorpos anti- CD37 com funções efetoras melhoradas. Em particular, os inventores procu- raram fornecer mABs anti-CD37 com citotoxicidade dependente de anticorpo mediada por célula (ADCC). Para resolver o problema que é a base da invenção, um anticor- po anti-CD37 monoclonal murino foi usado como um anticorpo inicial para gerar anticorpos anti-CD37 quiméricos e humanizados que são úteis na te- rapia humana.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma mo- lécula de anticorpo que se liga ao CD37 humano e que é derivada de

a) um anticorpo monoclonal murino que é definido por

i. uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2; e

ii. uma cadeia leve variável compreendendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:4, ou de

b) um anticorpo não-humano que reconhece o mesmo epitopo do CD37 humano como o anticorpo definido em a) ou que reconhece um epitopo que está próximo ou sobreposto com o dito epitopo;

em que a dita molécula de anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.

Como será entendido a partir do seguinte, um anticorpo que é "derivado" de outro anticorpo, isto é, anticorpo inicial, significa que o dito an- ticorpo foi gerado pela modificação do anticorpo inicial como descrito abaixo.

Em uma modalidade preferencial, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo quimérica ou humanizada derivada do anticorpo inicial definido em a) um anticorpo com uma seqüência relacionada foi designado G28.1 e descrito em WO 2005/017148.

O anticorpo inicial da categoria b), por exemplo, pode ser sele- cionado a partir dos anticorpos específicos para CD37 que caracterizaram, como G28.1, o antígeno CD37 na Terceira Oficina HLDA; estes anticorpos foram designados HD28, HH1, BI14, F97-3G6 (Ling e MacLennan, 1987). Outros anticorpos específicos para CD-37 que foram descritos incluem RFB- 7, Y29/55, MB-1, M-B371, M-B372 e IPO-24. De acordo com Moldenhauer, 2000, e Schwartz-Albiez et al, 1988, todos estes anticorpos (incluindo G28.1) reconhecem o mesmo ou uma sobreposição ou proximidade do epitopo CD37. Schwartz-Albiez et al, 1988, indicam que o epitopo está situado na porção de carboidrato de CD37. Vários dos anticorpos acima estão comerci- almente disponíveis, por exemplo, HH1 (SantaCruz), RFB-7 (Biodesign), Y29/55 (Biogenesis), M-B371 (BD Biosciences), M-B372 (SantaCruz) e IPO- 24 (AbCam).

Outros anticorpos específicos para CD37 são S-B3 (Biosys), NMN46 (Chemicon) e ICO-66 (Bioprobe). Se um anticorpo reconhece o mesmo epitopo que G28.1 pode ser determinado por ensaios de ligação competitiva ou por radioimunoensaios de inibição cruzada como descrito por Moldenhauer et al, 1987 e Moldenhauer, 2000.

Por meio de exemplo, a ligação competitiva pode ser determi- nada em um ELISA, usando placas cobertas de proteína CD37 ou peptídeos CD37 ou de células CD37 positivas (ELISA Celular) e medindo a ligação do anticorpo biotinilado na presença de um anticorpo competidor concorrente. Na presença de um anticorpo competidor ou fragmento derivado do anticor- po, a ligação de G28.1 biotinilado (ou outro anticorpo conhecido por reco- nhecer o mesmo epitopo) é reduzida no caso em que os anticorpos reco- nhecem um epitopo compartilhado. Para identificar o peptídeo do epitopo G28.1, fragmentos ou polipeptídeos curtos ou proteínas recombinantes deri- vadas da seqüência de CD37 podem ser sintetizados ou produzidos e a liga- ção de G28.1 aos ditos peptídeos/polipeptídeos medida em um ensaio de ELISA. A ligação competitiva também pode ser determinada pela análise por FACS, como descrito nos Exemplos.

Um anticorpo definido em b) pode ser usado de uma maneira análoga tanto G28.1 quanto um anticorpo inicial para a geração de molécu- las de anticorpo quiméricas ou humanizadas.

Um anticorpo inicial da categoria b) também pode ser gerado de novo pelo uso de peptídeos ou fragmentos proteicos contendo o epitopo relevante, ou moléculas de DNA que codificam tais peptídeos/fragmentos, respectivamente para imunização para obter anticorpos reativos com o mesmo epitopo que G28.1.

Um anticorpo inicial b) também pode ser obtido pela imuniza- ção com células inteiras que carregam o epitopo relevante; as células de hibridoma dessa forma obtidas então são classificadas para a ligação com- petitiva dos anticorpos secretados.

O termo "molécula de anticorpo anti-CD37" abrange anticorpos anti-CD37 e fragmentos de anticorpo anti-CD37 bem como conjugados com moléculas de anticorpo. Anticorpos incluem, no sentido da presente inven- ção, anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados. O termo "anticor- po", que pode ser usado intercambiavelmente com "molécula de anticorpo", deve abranger imunoglobulinas completas (quando elas são produzidas por linfócitos e, por exemplo, apresentam-se em soros sangüíneos), anticorpos monoclonais secretados por linhagens celulares de hibridoma, polipeptídeos produzidos pela expressão recombinante em células hospedeiras, que têm a especificidade de ligação de imunoglobulinas ou anticorpos monoclonais, e moléculas que foram derivadas de tais anticorpos por modificação ou pro- cessamento adicional conservando a sua especificidade de ligação. Em uma modalidade da invenção, a molécula de anticorpo anti-

CD37 é um anticorpo quimérico definido por

i) uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2;

ii) uma cadeia leve variável compreendendo a seqüência de a- minoácido mostrada na SEQ ID NO:4;

iii)cadeias pesadas e leves constantes que são de origem hu- mana.

A construção e a produção de anticorpos murinos/humanos quiméricos são bem conhecidas na técnica (Boulianne et al, 1984). As regi- ões variáveis do anticorpo não-humano são tipicamente ligadas a pelo me- nos uma porção (Fc) da região constante da imunoglobulina de uma imuno- globulina humana. As seqüências de DNA da região constante humana po- dem ser isoladas conforme procedimentos bem conhecidos a partir de uma variedade de células humanas, preferencialmente de células B imortalizadas (ver Kabat et al, 1991; e WO 87/02671). As moléculas de anticorpo podem conter toda ou somente uma porção da região constante já que exibem liga- ção específica ao antígeno CD37 e aos receptores de Fe. A escolha do tipo e do tamanho da região constante depende de se as funções efetoras como fixação de complemento ou toxicidade dependente de anticorpo mediada por célula são desejadas, e das propriedades farmacológicas desejadas da mo- lécula de anticorpo.

Em certas modalidades, a molécula de anticorpo da invenção é

um anticorpo específico para CD37 quimérico que tem a região variável da cadeia pesada de um anticorpo não-humano definido em a) ou b) fundida à região constante da cadeia pesada humana de IgGI e à região variável da cadeia leve de um anticorpo não-humano definido em a) ou b) fundida à re- gião constante da cadeia leve kappa humana.

Ainda em outra modalidade, a molécula de anticorpo é um anti- corpo específico para CD37 quimérico que tem a região variável da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO:2 fundida à região constante da cadeia pe- sada de IgGI humana que é uma molécula IgGI com a seqüência mostrada na SEQ ID NO:24 (seqüência de DNA de codificação: SEQ ID NO: 23) ou uma molécula IgGI mutada derivada daquela e que tem a região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO:4 fundido à região constante da cadeia leve humana kappa mostrada na SEQ ID NO:26 (seqüência de DNA de codi- ficação: SEQ ID NO: 25). Outras regiões constantes humanas para quimerização de um

anticorpo inicial não-humano definido em a) ou b) estão disponíveis para a pessoa versada na técnica, por exemplo, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 IgE ou IgM (em vez de IgGI) ou Iambda (em vez de kappa). As regiões constantes tam- bém podem ser quiméricas, por exemplo, uma quimera de cadeia pesada de lgG1/lgG2 ou lgG1/lgG3.

Em certas modalidades da invenção, a molécula de anticorpo anti-CD37 é um anticorpo humanizado que é definido por

i. CDRs contidas dentro da cadeia pesada variável como mos- trado na SEQ ID NO:2 e por

ii. CDRs contidas dentro da cadeia leve variável como mostra- do na SEQ ID NO:4, iii. estruturas de suporte das ditas CDRs que são derivadas de um anticorpo humano,

iv. cadeias pesadas e leves constantes que são de um anticor- po humano.

As formas humanizadas dos anticorpos não-humanos (por e-

xemplo, anticorpos murinos, de rato ou de coelho) são imunoglobulinas, ca- deias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv1 Fab, Fab', F(ab')2 ou outras moléculas de ligação ao antígeno com subsequências de anticorpos) que contêm seqüências mínimas derivadas da imunoglobulina não-humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (do anticorpo do recipiente) nas quais os resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do anticorpo do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana (anticorpo do doador), tais como camundongo, rato ou coelho que tenham a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, os resíduos da região conservada de Fv da imunoglobulina humana são substi- tuídos por resíduos não-humanos correspondentes.

Nos anticorpos humanizados da invenção, as seqüências que codificam as CDRs de um anticorpo inicial não-humano definido em a) ou b) foram enxertadas nos respectivos genes das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina humana.

Entende-se que as "regiões de determinação de complementa- ridade" (CDRs) de um anticorpo monoclonal são aquelas seqüências de a- minoácido envolvidas na ligação ao antígeno específico de acordo com Ka- bat et al, 1991, com conecção com Chothia e Lesk (1987). Das seqüências das regiões variáveis como mostrado nas SEQ ID NO:2 e SEQ ID N0.4, a seqüência de CDR pode ser rotineiramente determinada pela busca no ban- co de dados de seqüência Kabat pelas características da seqüência.

Técnicas para obtenção de anticorpos humanizados estão roti- neiramente disponíveis para a pessoa versada, tendo sido descritas, inter alia, em US 5.225.539; US 6.548.640; e US 6.982.321.

Resíduos de região conservada apropriados do anticorpo CDR- enxertado podem ser revertidos a resíduos murinos para melhorar a afinida- de de ligação. Como descrito acima, a partir de métodos pertinentes à técni- ca, o versado sabe como obter as CDRs de um dado anticorpo não-humano, escolher e obter genes apropriados de imunoglobulina humana, enxertar CDRs nestes genes, modificar resíduos da região conservada selecionada, expressar o anticorpo CDR-enxertado em células hospedeiras apropriadas, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), e testar os anticor- pos recombinantes resultantes para afinidade e especificidade de ligação.

Para obter um anticorpo humanizado, os sítios de ligação ao an- tígeno, que são formados pelas CDRs da cadeia pesada e CDRs da cadeia leve, são retirados do DNA das células que secretam o roedor anticorpo mo- noclonal (murino) e enxertado no DNA de codificação da região conservada do anticorpo humano.

Alternativamente para enxerto da CDR não-humana, especial- mente murina, os anticorpos anti-CD37 podem ser humanizados pela cha- mada tecnologia "ressurgimento", pela qual as regiões conservadas de roe- dor são deixadas inalteradas com a exceção de resíduos expostos à superfí- cie, como descrito em US 5.639.641.

Em um aspecto adicional, a invenção relaciona-se a anticorpos humanizados que têm uma cadeia pesada variável com uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:6 e uma cadeia leve variável com uma seqüência selecionada a partir das seqüências mostradas nas SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20 e SEQ ID NO:22.

Em outro aspecto, a invenção relaciona-se a anticorpos humani- zados que têm uma cadeia pesada variável com uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:8 e uma cadeia leve variável com uma seqüência seleciona- da a partir das seqüências mostradas nas SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20 e SEQ ID NO:22.

Em outro aspecto, a invenção relaciona-se a anticorpos humani- zados que têm uma cadeia pesada variável com uma seqüência mostrada na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve variável com uma seqüência selecio- nada a partir das seqüências mostradas nas SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID Ν0:16, SEQ ID Ν0:18, SEQ ID Ν0:20 e SEQ ID ΝΟ:22.

Os anticorpos humanizados definidos acima são mostrados na Tabela 1. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado tem uma ca- deia pesada da região constante de IgGI humana e uma cadeia leve da re- gião constante kappa humana. Como descrito acima para os anticorpos quiméricos, as regiões constantes podem ser selecionadas a partir de outras classes e subclasses.

Em certas modalidades, em anticorpos humanizados da inven- ção, a cadeia pesada constante humana de IgGI é uma molécula IgGI com a seqüência mostrada na SEQ ID NO:24 ou uma molécula IgGI mutada de- rivada da mesma e a cadeia leve da região constante kappa humana tem a seqüência mostrada na SEQ ID NO:26.

As moléculas de anticorpo anti-CD37 da invenção também po- dem ser variantes dos anticorpos que são definidos pelas seqüências de aminoácido mostradas na listagem de seqüência. Usando tecnologias roti- neiramente disponíveis, a pessoa versada na técnica será capaz de prepa- rar, testar e utilizar variantes funcionais dos anticorpos definidos acima. E- xemplos são anticorpos de variantes com pelo menos uma posição em uma CDR e/ou região conservada alterada, anticorpos variantes com substitui- ções de aminoácido únicas na região da região conservada onde há um desvio da seqüência de linhagem germinativa, anticorpos com substituições amino conservativas, anticorpos que são codificados por moléculas de DNA que hibridizam, sob condições estringentes, com as moléculas de DNA a- presentadas na listagem de seqüência que codificam cadeias variáveis de anticorpo.

Considerando as propriedades dos aminoácidos individuais, substituições racionais podem ser realizadas para obter variantes de anti- corpo que conservam a estrutura molecular total do anticorpo inicial. As substituições de aminoácido, isto é, "substituições conservativas", podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade na polaridade, carga, solubili- dade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática do respecti- vo aminoácido. A pessoa versada está familiarizada com substituições de aminoácido comumente praticadas, como descrito, por exemplo, em WO 2007/042309, e métodos para obtenção dos anticorpos dessa forma modifi- cados. Considerando o código genético e as técnicas de DNA recombinante e sintética, as moléculas de DNA que codificam anticorpos variantes com uma ou mais trocas conservativas de aminoácido podem ser rotineiramente desenhadas e os respectivos anticorpos prontamente obtidos.

Em comparação com um anticorpo como definido pelas suas cadeias variáveis mostradas na listagem de seqüência, as variantes de anti- corpo abrangidas pela invenção têm uma identidade de seqüência nas regi- ões CDR de pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencial- mente ainda pelo menos 95%. Anticorpos preferenciais também têm uma similaridade de seqüência nas regiões CDR de pelo menos 80%, mais prefe- rencialmente 90% e mais preferencialmente ainda 95%. Variantes de anti- corpo preferenciais têm uma identidade de seqüência nas regiões variáveis de pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70% ou 80%, ain- da mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente ainda pelo menos 95%. Os anticorpos preferenciais também têm uma similaridade de seqüência nas regiões variáveis de pelo menos 80%, mais preferencial- mente 90% e mais preferencialmente ainda 95%.

"Identidade de seqüência" entre duas seqüências polipeptídicas indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as seqüên- cias. "Similaridade de seqüência" indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácido conservati- vas. Uma variante também pode ser obtida pelo uso de um anticorpo com uma seqüência definida como mostrada na listagem de seqüência como um ponto de partida para otimização e diversificação de um ou mais resíduos de aminoácido, preferencialmente resíduos de aminoácido em uma ou mais CDRs1 e pela classificação da coleção resultante de variantes de anticorpo em variantes com propriedades melhoradas. A diversificação de um ou mais resíduos de aminoácido em CDR3 da cadeia leve variável, CDR3 da cadeia pesada variável, CDR1 da leve variável e/ou CDR2 da cadeia pesada variá- vel tem sido comprovadamente útil. A diversificação pode ser feita por méto- dos conhecidos na técnica, por exemplo, a chamada tecnologia TRIM men- cionada em WO 2007/042309.

Em uma modalidade adicional, a molécula de anticorpo anti- CD37 da invenção é um anticorpo "maduro por afinidade".

Um anticorpo anti-CD37 "maduro por afinidade" é um anticorpo anti-CD37 derivado de um anticorpo com as seqüências mostradas na lista- gem de seqüência, que tem uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs que resultam em uma melhora na afinidade pelos os antígenos, em compa- ração com o respectivo anticorpo não maduro original. Um dos procedimen- tos para gerar tais mutantes de anticorpo envolve a exposição de fago (Hawkins et al, 1992; e Lowman et al, 1991). Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácido possíveis em cada sítio. Os mutantes de anticorpo dessa forma gerados são expostos de uma maneira monova- Iente em partículas de fago filamentosas como fusões ao produto do gene Ill de M13 empacotado dentro de cada partícula. Os mutantes expostos em fago então são classificados por sua atividade biológica (por exemplo, afini- dade de ligação), como revelado neste pedido.

Anticorpos maduros por afinidade também podem ser produzi- dos por métodos como descrito, por exemplo, por Marks et al, 1992, (matu- ração por afinidade por mistura do domínio variável da cadeia pesada (VH) e variável da cadeia leve (VL)), ou Barbas, et al, 1994; Shier et al, 1995; Yelton et al, 1995; Jackson et al, 1995; e Hawkins et al, 1992 (mutagênese randô- mica de CDR e/ou resíduos de região conservada). A afinidade preferencial de anticorpos maduros terão afinidades nanomolar ou até mesmo picomolar pelo antígeno alvo. Em uma modalidade adicional, a molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção é um anticorpo "desimunizado".

Um anticorpo anti-CD37 "desimunizado" é um anticorpo deriva- do de um anticorpo humanizado ou quimérico com uma seqüência mostrada na listagem de seqüência, que tem uma ou mais alterações em sua seqüên- cia de aminoácido que resultam em uma redução da imunogenicidade do anticorpo, em comparação com o respectivo anticorpo não-desumanizado original. Um dos procedimentos para gerar tais mutantes de anticorpo envol- ve a identificação e a remoção de epitopos de célula T da molécula de anti- corpo (Baker e Jones, 2007). Em uma primeira etapa, a imunogenicidade da molécula de anticorpo pode ser determinada por vários métodos, por exem- plo, pela determinação in vitro de epitopos de célula T ou predição in silico de tais epitopos, como foi descrita na literatura (Jones et al, 2004; Jones et al, 2005; Reche et al, 2004; Hertz et al, 2006). Uma vez que os resíduos crí- ticos para a função de epitopo de célula T foram identificados, mutações po- dem ser feitas para remover a imunogenicidade e conservar a atividade do anticorpo (Jones et al, 2005; Tangri et al, 2005). Métodos para introdução de mutações em proteínas são bem conhecidos na técnica, por exemplo, pela sobreposição de técnicas de PCR.

Uma vez que a região Fc de um anticorpo interage com diversos receptores de Fc, que resulta em diversas capacidades funcionais importan- tes (que são mencionadas "funções efetoras"), o anticorpo é, em certas mo- dalidades, um anticorpo completo ou um anticorpo que contém uma porção da região Fc1 o último desde que o anticorpo exiba ligação específica tanto à porção relevante do antígeno como a receptores de Fe. A escolha do tipo e comprimento da região constante depende de se as funções efetoras como fixação de complemento ou citotoxicidade dependente do anticorpo mediada por célula são características desejáveis, e das propriedades farmacológicas desejadas da proteína de anticorpo.

Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CD37 é um anticorpo quimérico ou humanizado com uma região Fc, ou a seção relevan- te da mesma, que foi engenheirado para modular funções efetoras, especi- almente aumentar a ligação do anticorpo a um ou mais receptores de Fc, por meio disso aumentando a função efetora de ADDC. A engenharia da região Fe medeia a função efetora do anticorpo na presença de células efetoras mais efetivamente do que aquele do anticorpo parental de Fc não engenhei- rada. Em uma modalidade, tal variante de anticorpo medeia ADCC que é maior do que aquela mediada pelo anticorpo parental. (A seguir, se não a- firmado de outra maneira, o termo "parental" no contexto de uma molécula de anticorpo, ou no contexto de IgG ou região Fc1 refere-se à molécula de anticorpo não engenheirada, região de Fc ou IgG1 respectivamente, a partir da qual a molécula mutada (engenheirada) é derivada).

Uma variedade de modificações da região Fc foi sugerida na técnica, tanto na literatura científica como em documentos de patente, por exemplo, em EP 0307434, WO 9304173, WO 9734631, WO 9744362, WO 9805787, WO 9943713, WO 9951642, WO 9958572, WO 02060919, WO 03074679, WO 2004016750, WO 2004029207, WO 2004063351, WO 2004074455, WO 2004035752, WO 2004099249, WO 2005077981, WO 2005092925, WO 2006019447, WO 2006031994, WO 2006047350, WO 2006053301, WO 2006088494 e WO 2007041635.

Em modalidades preferenciais, os anticorpos da invenção são variantes de Fc com substituições de aminoácido nas posições 332 e/ou 239 e/ou 236. Em modalidades preferenciais, os anticorpos da invenção têm mu- tações no domínio Fc selecionadas a partir do grupo de

uma substituição única na posição 332, preferencialmente

I332E;

i) uma combinação de substituições nas posições 239 e 332, preferencialmente S239D/I332E;

ii) uma combinação de substituições nas posições 236 e 332,

preferencialmente G236A/I332E;

iii) uma combinação de substituições nas posições 236, 239 e 332, preferencialmente G236A/S239D/I332E.

As substituições definidas acima foram descritas, por exemplo, por Lazar et al, 2006, em WO 2004029207 e WO 2007041635.

As variantes de Fc nos anticorpos da presente invenção são de- finidas de acordo com as modificações de aminoácido que as compõem. Dessa forma, por exemplo, I332E é uma variante de Fc com a substituição I332E em relação ao polipeptídeo parental Fe. Do mesmo modo, S239D/I332E define uma variante de Fc com as substituições S239D e I332E e S239D/I332E/G236A definem uma variante de Fc com as substitui- ções S239D, I332E, e G236A em relação ao polipeptídeo parental Fc.

A numeração está de acordo com o esquema de numeração EU (Kabat et al, 1991), que se refere à numeração do anticorpo EU (Edelman et al, 1969). A pessoa versada na técnica apreciará que estas convenções consistem na numeração não-sequencial em regiões específicas de uma seqüência de imunoglobulina, permitindo uma referência normalizada a po- sições conservadas em famílias de imunoglobulina.

Nos anticorpos definidos acima, as posições substituídas 236, 239 e 332 correspondem a posições 119, 122 e 215, respectivamente, da cadeia pesada de IgGI representada na SEQ ID NO:24. (Nas seqüências completas das cadeias pesadas de anticorpos A2, A4, B2 e B4 mostrado nas SEQ ID NOs: 28, 32, 36 e 40, os aminoácidos substituídos estão nas posi- ções 235, 238 e 331). Em certas modalidades, as variantes de Fc da invenção são baseadas nas seqüências de IgG humana, e dessa forma as seqüências de IgG humana são usadas como as seqüências "base" con- tra as quais outras seqüências são comparadas. Para os anticorpos da pre- sente invenção, a região Fc engenheirada é preferencialmente IgG, em par- ticular IgGI, mas também pode ser lgG2 ou seqüências de variantes de ou- tras classes de imunoglobulina, tais como IgA, IgE, IgGD, IgM ou versões quiméricas de duas ou mais classes de imunoglobulina (por exemplo lgG2/lgG1) e similares. Embora as variantes de Fc da presente invenção sejam engenheiradas no contexto de uma IgG parental, as variantes podem ser engenheiradas ou "transferidas" para o contexto de outras, segunda IgG parental. Isto é feito pela determinação dos resíduos "equivalentes" ou "cor- respondentes" e substituições entre a primeira e segunda IgG, tipicamente com base na homologia de seqüência ou estrutural entre as seqüências da primeira e segunda IgGs. A fim de estabelecer homologia, a seqüência de aminoácido de uma primeira IgG delineada neste pedido é diretamente com- parada à seqüência de uma segunda IgG. Após alinhar as seqüências, u- sando um ou mais dos programas de alinhamento de homologia conhecidos na técnica, considerando inserções e deleções necessárias a fim de manter o alinhamento (isto é, evitando a eliminação de resíduos conservados atra- vés de deleção e inserção arbitrária), os resíduos equivalentes a aminoáci- dos particulares na seqüência primária da primeira variante de Fc são defini- dos. Apesar de como os resíduos equivalentes ou correspondentes são de- terminados, e apesar da identidade da IgG parental na qual as IgGs são fei- tas, que se destina a ser transmitida é que as variantes de Fc usadas na presente invenção podem ser engenheiradas em qualquer segunda IgG pa- rental que tem a homologia seqüência ou estrutural significante com a vari- ante de Fe. Dessa forma, por exemplo, se um anticorpo variante é gerado em que o anticorpo parental é IgGI humana, pelo uso dos métodos descritos acima ou outros métodos para determinar resíduos equivalentes, o anticorpo variante pode ser engenheirado, por exemplo, em um anticorpo parental lgG2 humano, um anticorpo parental IgA humano (ver WO 2007041635).

Os anticorpos da invenção visam o antígeno CD37, que pode ser vantajoso sobre ter como alvo CD20 em doenças nas quais o nível da expressão de CD37 é mais alto do que aquele de CD20, como por exemplo em leucemia linfocítica crônica, onde amostras têm mostrado altos níveis de expressão de mRNA de CD37 em comparação com a expressão de baixo nível de mRNA de CD20.

Tem sido mostrado que anticorpos da invenção são superiores a rituximab, um anticorpo anti-CD20 registrado, com relação à atividade de ADCC em células Ramos, depleção de célula B normal em sangue total e depleção de célula de Iinfoma de Burkitt Ramos. Como pode ser mostrado nos experimentos da invenção, os anticorpos da invenção (tanto a Fc não- engenheirada como a Fc engenheirada) têm uma atividade de depleção de célula B que é superior àquela de rituximab. Os anticorpos com a região Fc mutada mostram um aumento de aproximadamente 10 vezes de atividade de depleção de célula B em comparação ao rituximab (figura 11B).

Representantes de anticorpos para CD37 da invenção mostram a atividade pró-apoptótica potente sem ligação cruzada; neste aspecto, os anticorpos com esta propriedade são superiores ao SMIP Tru 16.4 anti- CD37, que não mostra apoptose sem ligação cruzada (Zhao et al, 2007). Indução de apoptose sem ligação cruzada, que pode ser mostrada para an- ticorpos da invenção tanto com ou sem contrução de Fc, é vantajosa na au- sência de um agente de ligação cruzada in vivo (por exemplo, células efeto- ras que abrigam receptores de Fcy) ou em baixa densidade do antígeno-alvo CD37 (por exemplo, células tumorais com baixo nível de expressão de CD37). Um anticorpo que induz apoptose sem ligação cruzada pode ainda causar morte celular, ao passo que um anticorpo dependente de ligação cru- zada não o faz.

Em um aspecto adicional, uma molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção é um fragmento de anticorpo que é derivado de um anticorpo específico para CD37 humanizado ou quimérico de acordo com presente invenção. Para obtenção de fragmentos de anticorpo, por exemplo, fragmen- tos Fab, digestão pode ser realizada por meio de técnicas de rotina, por e- xemplo, usando papaína. Exemplos de digestão com papaína são descritos em WO 94/29348 e US 4.342.566. Digestão com papaína de anticorpos tipi- camente produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, chamados fragmentos Fab, cada um com um sítio único de ligação a antígeno, e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação a antígeno e é capaz ainda de ligação cruzada ao antígeno.

Os fragmentos Fab obtidos por digestão do anticorpo também contêm os domínios constantes da cadeia leve e o primeiro domínio cons- tante (CHi) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferenciam-se de fragmen- tos Fab em que contêm resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CHi da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobra- diça de anticorpo. Fab1-SH é a designação neste pedido para Fab' em que o resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas na dobradiça entre eles. Os fragmen- tos de anticorpo também podem ser gerados por métodos de biologia mole- cular que produzem os respectivos fragmentos de DNA de codificação.

A molécula de anticorpo será tipicamente um tetrâmero consis- tindo em dois pares de cadeia leve/cadeia pesada, mas também pode ser dimérica, isto é, consistir de um par de cadeias leve/cadeia pesada, por e- xemplo, um fragmento Fab ou Fv, ou pode ser um anticorpo de cadeia única monomérica (scFv; Johnson e Bird, 1991), um minicorpo ou um diacorpo.

A molécula de anticorpo anti-CD37 também pode estar na forma de um conjugado, isto é, uma molécula de anticorpo que é quimicamente ligada a um agente citotóxico, particularmente um agente citotóxico que in- duza citotoxicidade (por exemplo, apoptose ou parada mitótica) de células tumorais. Em conseqüência de mecanismos de depuração farmacológica normais, um anticorpo empregado em um fármaco conjugado (um "imuno- conjugado") contata e liga-se a células-alvo somente em quantidades limita- das. Por isso, o agente citotóxico empregado no conjugado deve ser alta- mente citotóxico tal que morte celular suficiente ocorra para produzir um efei- to terapêutico. Como descrito em US 2004/0241174, exemplos de tais agen- tes citotóxicos incluem taxanos (ver, por exemplo, WO 01/38318 e WO 03/097625), agentes alquilantes de DNA (por exemplo, análogos de CC- 1065), antraciclinas, análogos de tubulisina, análogos de duocarmicina, do- xorrubicina, auristatina E, toxina ricina A e agentes citotóxicos compreen- dendo uma porção de polietileno glicol reativa (ver, por exemplo, Sasse et al 2000; Suzawa et al, 2000; Ichimura et al, 1991; Francisco et al, 2003; US 5.475.092; US 6.340.701; US 6.372.738; e US 6.436.931; US 2001/0036923; US 2004/0001838; US 2003/0199519; e WO 01/49698).

Em uma modalidade preferencial, o agente citotóxico é um mai- tansinoide, isto é, derivado de maitansina (CAS 35846538), maitansinoides sendo conhecidos na técnica por incluir maitansina, maitansinol, ésteres C-3 de maitansinol, e outros análogos de maitansinol e derivados (ver, por e- xemplo, US 5.208.020; e US 6.441.163).

Imunoconjugados de anticorpo anti-CD37 podem ser desenha- dos e sintetizados como descrito em WO 2007/077173 para imunoconjuga- dos anti-FAP.

Em uma modalidade adicional, a molécula anti-CD37 da inven- ção pode ser radioativamente marcada para formar um radioimunoconjuga- do, uma abordagem sugerida para o anticorpo anti-CD37 MB-1 (Buchsbaum et al, 1992, ver acima). Radioisótopos com propriedades de radiação vanta- josas são conhecidos na técnica, exemplos são Fósforo-32, Estrôncio-89, ítrio-90, lodo-131, Samário-153, Érbio-169, ltérbio-175, Rênio-188, que fo- ram com sucesso e estavelmente ligados a MAbs. As moléculas de anticor- po anti-CD37 da invenção podem ser marcadas com vários radioisótopos usando métodos de marcação direta ou marcação indireta conhecidos na técnica, como descrito em US 6.241.961. Uma revisão em tecnologias para gerar e aplicar novos conjugados de anticorpo radiomarcados que são úteis na presente invenção, é dado por Goldenberg e Sharkey, 2007.

Uma molécula de anticorpo da invenção, ou Fc engenheirada ou não, também pode ser bispecífica, isto é, a molécula de anticorpo que se liga a dois alvos diferentes, um deles sendo CD37, outro sendo selecionado a partir de, por exemplo, antígenos de superfície expressos por células T, por exemplo, CD3, CD16 e CD56.

A presente invenção também se relaciona a moléculas de DNA que codificam as moléculas de anticorpo anti-CD37 quiméricas ou humani- zadas da invenção. As seqüências que codificam as cadeias pesadas variá- veis das moléculas de anticorpo da invenção são mostradas nas SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9. As seqüências que codi- ficam as cadeias leves variáveis das moléculas de anticorpo da invenção são mostradas nas SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21.

Moléculas de ácido nucleico que codificam para a cadeia leve e a cadeia pesada podem ser sintetizadas quimicamente e enzimaticamente (amplificação por PCR) por métodos padrão. Em primeiro lugar, oligonucleo- tídeos adequados podem ser sintetizados com métodos conhecidos na téc- nica (por exemplo, Gait, 1984), que podem ser usados para produzir um ge- ne sintético. Métodos para gerar genes sintéticos a partir de oligonucleotí- deos são conhecidos na técnica (por exemplo, Stemmer et al, 1995; Ye et al, 1992; Hayden et Mandecki, 1988; Frank et al, 1987).

As moléculas de DNA da invenção incluem, mas não são limita- das às moléculas de DNA mostradas na listagem de seqüência. Consequen- temente, a presente invenção também se relaciona a moléculas de ácido nucleico que hibridizam às moléculas de DNA apresentadas na listagem de seqüência sob condições de alta estringência de ligação e lavagem, como definido em WO 2007/042309, onde tais moléculas nucleicas codificam um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo que tem propriedades equiva- lentes ou superiores a um anticorpo codificado por uma seqüência mostrada na listagem de seqüência. Moléculas preferenciais (de uma perspectiva do mRNA) são aquelas que têm pelo menos 75% ou 80% (preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferen- cialmente ainda pelo menos 95%) de homologia ou identidade de seqüência com uma das moléculas de DNA descritas neste pedido.

Ainda outra classe de variantes de DNA que estão dentro do es- copo da invenção pode ser definida com referência ao polipeptídeo que elas codificam. Estas moléculas de DNA desviam-se com respeito à sua seqüên- cia daquelas representadas na listagem de seqüência, mas codificam, devi- do à degeneração do código genético, anticorpos com as seqüências de a- minoácido idênticas. Por meio de exemplo, em vista da expressão dos anti- corpos em células eucarióticas, as seqüências de DNA mostradas na lista- gem de seqüência foram desenhadas para combinar-se ao códon de uso em células eucarióticas. Se for desejado para expressar os anticorpos em E. coli, estas seqüências podem ser modificadas para combinar-se ao códon de uso em E. coli. Variantes das moléculas de DNA da invenção podem ser en- genheiradas de vários modos diferentes, como descritos, por exemplo, em WO 2007/042309.

Para produzir as moléculas de anticorpo anti-CD37 recombinan- tes da invenção, as moléculas de DNA que codificam cadeias leves e pesa- das completas ou fragmentos das mesmas são inseridas em um vetor de expressão tal que as seqüências sejam operacionalmente ligadas a seqüên- cias de controle transcricional e traducional. Para produzir os anticorpos da invenção, o versado pode escolher uma grande variedade de sistemas de expressão bem conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles revistos por Kipriyanow e Le Gall, 2004. Vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmí- deos, epissomas derivados de EBV e similares. Seqüências do vetor de ex- pressão e de controle de expressão são selecionadas para ser compatíveis com a célula hospedeira. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em certas modalidades, ambas as seqüências de DNA são inseridas no mesmo vetor de expressão. Vetores adequados são aqueles que codificam uma se- qüência de CH ou CL de imunoglobulina humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados engenheirados para que qualquer se- qüência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa, como descrito acima. A cadeia constante é normalmente kappa ou Iambda para a cadeia leve do anticorpo, para a cadeia pesada do anticorpo, pode ser, sem restri- ção, qualquer isotipo IgG (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4) ou outras imunoglobuli- nas, incluindo variantes alélicas.

O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo por uma célula hospedeira. O DNA que codifica a cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo sinal seja ligado na estrutura ao terminal amino do DNA da cadeia de anticorpo madura. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo heterólogo de uma proteína não- imunoglobulina. Alternativamente, a seqüência de DNA que codifica a cadeia de anticorpo pode já conter uma seqüência de peptídeo sinal.

Além das seqüências de DNA que codificam as cadeias de anti- corpo, os vetores de expressão recombinante transportam seqüências regu- latórias incluindo promotores, potencializadores, sinais de terminação e poli- adenilação e outros elementos de controle de expressão que controlam a expressão das cadeias de anticorpo em uma célula hospedeira. Exemplos de seqüências promotoras (exemplificadas para expressão em células ma- míferas) são promotores e/ou potencializadores derivados de (CMV) (tais como o Vírus Símio CMV 40 (SV40) (tal como o promotor/potencializador SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores mamíferos fortes, tais como de promotores imunoglobulina nativa e de actina. Exemplos de sinais de poliadenilação são BGH poliA, SV40 tardio ou precoce poliA; alternativamente, 3'UTRs de ge- nes de imunoglobulina etc. podem ser usadas.

Os vetores de expressão recombinante também podem trans- portar seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. As moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno da mesma e/ou a cadeia leve ou uma porção de liga- ção ao antígeno da mesma de um anticorpo anti-CD37, e vetores compre- endendo estas moléculas de DNA podem ser introduzidas em células hos- pedeiras, por exemplo, células bacterianas ou células eucarióticas superio- res, por exemplo, células mamíferas, de acordo com métodos de transfecção bem conhecidos na técnica, incluindo transfecção mediada por lipossoma, transfecção mediada por policátion, fusão de protoplasto, microinjeções, precipitação por fosfato de cálcio, eletroporação ou transferência por vetores virais.

Preferencialmente, as moléculas de DNA que codificam a ca- deia pesada e a cadeia leve estão presentes em dois vetores que são co- transfectados para a célula hospedeira, preferencialmente uma célula mamí- fera. Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, en- tre outras coisas, células de ovário de hamster chinês (CHO, CHO-DG44), NSO, células SP2/0, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma humano (por exem- plo, Hep G2), células A549, células 3T3 ou os derivados/progênies de qual- quer dessas linhagens celulares. Outras células mamíferas, incluindo, mas não limitadas a ser humano, camundongos, rato, macaco e linhagens celula- res de roedor, ou outras células eucarióticas, incluindo mas não limitadas a células de levedura, inseto e vegetal, ou células procarióticas, tais como bac- térias podem ser usadas. As moléculas de anticorpo anti-CD37 da invenção são produzidas pela cultura das células hospedeiras por um período de tem- po suficiente para permitir a expressão da molécula de anticorpo nas células hospedeiras.

As moléculas de anticorpo são preferencialmente recuperadas do meio de cultura como um polipeptídeo secretado ou podem ser recupera- das de Iisados da célula hospedeira se, por exemplo, expressas sem um sinal secretório. É necessário purificar as moléculas de anticorpo usando métodos de purificação de proteína padrão usados para proteínas recombi- nantes e proteínas de célula hospedeira de uma maneira que preparações substancialmente homogêneas do anticorpo sejam obtidas. Por meio de e- xemplo, o estado-da-técnica dos métodos de purificação úteis para obtenção da molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção inclui, como uma primeira etapa, a remoção de células e/ou fragmentos celulares particulados no meio de cultura ou lisado. O anticorpo então é purificado de proteínas solúveis, polipeptídeos e ácidos nucleicos contaminantes, por exemplo, por fraciona- mento em colunas de imunoafinidade ou de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC em fase reversa, cromatografia em Sephadex, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica. Como uma etapa final no processo de obtenção de uma preparação de molécula de anticorpo anti- CD37, a molécula de anticorpo purificada pode ser seca, por exemplo, Iiofili- zada como descrito abaixo, para aplicações terapêuticas. Em um aspecto adicional, a presente invenção relaciona-se a uma composição farmacêutica contendo, como o ingrediente ativo, a molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção.

Para ser usado na terapia, o anticorpo anti-CD37 é incluído em composições farmacêuticas apropriadas para facilitar a administração a ani- mais ou seres humanos. Formulações típicas da molécula de anticorpo anti- CD37 podem ser preparadas pela mistura da molécula de anticorpo anti- CD37 com veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitá- veis, na forma de formulações Iiofilizadas ou secas de outra maneira ou so- luções aquosas ou suspensões aquosas ou não aquosas. Veículos, excipi- entes, modificadores ou estabilizadores são não-tóxicos nas dosagens e concentrações empregadas. Eles incluem sistemas de tampão, tais como fosfato, citrato, acetato e outros ácidos anorgânicos ou orgânicos e seus sais; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzil; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool de butila ou ben- zila; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirroli- dona ou polietileno glicol (PEG); aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, sacarose, trehalose, dextrinas ou dextranas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoóis de açúcar tais como, manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, Complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos iônicos ou não-iônicos, tais como TWEEN® (polissorbatos), PLURONICS® ou ésteres de ácido graxo, éteres de ácido graxo ou ésteres de açúcar. Solventes orgânicos também podem estar contidos na formulação de anticorpo, tais como etanol ou isopropanol. Excipientes também podem ter uma função de modificar a liberação ou mo- dificar a absorção.

As moléculas de anticorpo anti-CD37 também podem ser secas (secas por congelamento, secas por pulverização, secas por congelamento e pulverização, secas por gases próximos de ou supercríticos, secas a vá- cuo, secas ao ar), precipitadas ou cristalizadas ou capturadas em microcáp- sulas que são preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou pela utilização de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou gelatina e poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas coloidais de entrega de fármaco (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), em macroemulsões ou precipitadas ou imobilizadas em veículos ou superfícies, por exemplo, pela tecnologia pcmc (microcristais revestidos de proteína). Tais técnicas são re- veladas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edição, Hendrickson R. Ed. Naturalmente, as formulações a serem usadas para administra- ção in vivo devem ser estéreis; a esterilização pode ser realizada por técni- cas convencionais, por exemplo, por filtração através de membranas de -FiI— tração estéreis.

Pode ser útil aumentar a concentração do anticorpo anti-CD37 para chegar a uma chamada formulação líquida de alta concentração (H- CLF); vários modos de gerar tais HCLFs foram descritos.

A molécula de anticorpo anti-CD37 também pode estar contida em uma preparação de liberação sustentada. Tais preparações incluem ma- trizes sólidas, semisólidas ou líquidas de polímeros hidrofóbicos ou hidrofíli- cos, e podem estar na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, vare- tas ou microcápsulas e podem ser aplicadas através de um dispositivo de aplicação. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliéster, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou acetato de butirato sacarose), ou poly(vinilálcool)), polilatídeos (US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de vinil etileno não- degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis, tais co- mo LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolídeo), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Enquanto os polímeros, tais como acetato de vinil etileno e ácido lático-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais cur- tos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo por muito tempo, eles podem desnaturar ou agregar em conseqüência da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda da atividade biológica e possí- veis modificações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser in- ventadas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto é a formação de liga- ção S-S intermolecular através do intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização pode ser alcançada pela modificação de resíduos sulfidrila, liofilização (por exemplo, como descrito em WO 89/011297) de soluções acídicas, controle do conteúdo de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas.

Formulações que também podem ser usadas para a molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção são descritas em US 7.060.268 e US 6.991.790.

A molécula de anticorpo CD37 também pode ser incorporada em outras formas de aplicação, tais como dispersões, suspensões ou Iipos- somas, comprimidos, cápsulas, pós, pulverizador, adesivos transdérmicos ou intradérmicos ou cremes com ou sem dispositivos de aumento de perme- abilidade, pastilhas, formulações nasais, bucais ou pulmonares, ou pode ser produzida por células implantadas ou - após terapia gênica - pelas próprias células do indivíduo.

Uma molécula de anticorpo anti-CD37 também pode ser deriva- tizada com um grupo químico, tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila, ou um grupo carboidrato. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, aumentar a meia-vida sérica ou aumentar a ligação ao tecido. O modo preferencial de aplicação é parenteral, por infusão ou injeção (intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitonial, intradérmica), mas outros modos de aplicação tais como por inalação, transdérmico, intranasal, bucal, oral, também podem ser aplicáveis.

Para a prevenção ou o tratamento da doença, a dosagem apro- priada do anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, da severida- de e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da res- posta ao anticorpo, e do critério do médico assistente. O anticorpo é apropri- adamente administrado ao paciente na hora ou em uma série de tratamen- tos.

Dependendo do tipo e da severidade da doença, aproximada- mente 0,01 Mg/kg a 40 mg/kg (por exemplo 0,1 a 20 mg/kg) do anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por e- xemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contí- nua. Para administrações repetidas por vários dias ou mais longo, depen- dendo da condição, o tratamento é mantido até que uma supressão deseja- da de sintomas da doença ocorra. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por téc- nicas e ensaios convencionais, por exemplo, pela determinação da extensão da depleção de célula B (por exemplo, usando citometria de fluxo).

A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo a ser ad- ministrado é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou distúrbio.

A molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção e as composi- ções farmacêuticas que a contêm são úteis para depletar células B que ex- pressam CD37 na sua superfície e que causam doença cancerosa ou autoi- mune/inflamatória.

Em um primeiro aspecto, a composição farmacêutica da inven- ção é útil para o tratamento de cânceres, especialmente quaisquer maligni- dades CD37-positivas.

Malignidades de célula B incluem, sem restrição, Linfomas de célula B (por exemplo, várias formas da doença de Hodgkin, Iinfoma não- Hodgkin de célula B (NHL) e Iinfomas relacionados (por exemplo, macroglo- bulinemia de Waldenstrõm (também chamada Iinfoma linfoplasmocítico ou imunocitoma) ou Iinfomas de sistema nervoso central), Ieucemias (por e- xemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (CLL; também denominada leucemia linfocítica crônica de célula B BCLL), leucemia de célula cabeluda e leucemia mioblástica crônica) e mielomas (por exemplo, mieloma múltiplo). Malignidades de célula B adicionais inclu- em o Iinfoma linfocítico pequeno, leucemia prolinfocítica de célula B, Iinfoma linfoplasmocítico, Iinfoma esplênico da zona marginal, mieloma de célula plasmática, plasmocitoma solitário de osso, plasmocitoma extraósseo, Iinfo- ma de célula B de zona marginal extranodal de tecido Iinfoide associado à mucosa (MALT), Iinfoma de célula B de zona marginal nodal, Iinfoma folicu- lar, Iinfoma de célula do manto, Iinfoma difuso de grande célula B, Iinfoma difuso de grande célula B mediastinal (tímico), Iinfoma difuso de grande célu- la B intravascular, Iinfoma de efusão primário, linfoma/leucemia de Burkitt, Iinfoma da zona cinzenta, proliferações de célula B de potencial maligno in- certo, granulomatose Iinfomatoide e desordem Iinfoproliferativa pós- transplante.

Em um aspecto adicional, uma composição farmacêutica con- tendo anticorpos anti-CD37 é útil para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias que envolvem células B em sua patologia.

Tais doenças incluem, mas não são limitadas a: artrite, artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, policondrite, artrite psoriá- tica, psoríase, dermatite, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo de inclusão, miosite inflamatória, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma sis- têmico e esclerose, síndrome de CREST, respostas associadas com doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome descon- forto respiratório, síndrome desconforto respiratório adulto (ARDS), meningi- te, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas, eczema, asma, condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflama- tórias crônicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão leucocitária, lúpus sistêmico eritematoso (SLE), lúpus cutâneo subagudo eritematoso, lúpus discoide, lúpus mielite, lúpus cerebrite, diabetes de início juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, neuromielite ótica, febre reumática, coréa de Sydenham, respostas imunes associadas com hiper- sensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuber- culose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener e doença de Churg-Strauss, agranuIocitose, vasculite (incluindo hipersensibili- dade vasculite/angiite, ANCA e vasculite reumatoide), anemia aplástica, a- nemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica imune incluindo anemia he- molítica autoimune (AlHA), anemia perniciosa, aplasia de célula vermelha pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese leucocitária, desordens inflamatórias do sistema nervoso central (SNC), síndrome de injú- tia a múltiplos órgãos, miastenia gravis, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença antiglomerular de membrana basal, síndrome de anticorpo antifosfolipídeo, neurite alérgica, doença de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, Síndrome Miastênica de Lambert- Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen1 síndrome de Stevens- Johnson, rejeição de transplante de órgão sólido, doença enxerto contra hospedeiro (GVHD)1 penfigoide bolhoso, pênfigo, poliendocrinopatias autoi- munes, espondiloartropatias soronegativas, doença de Reiter1 síndrome te- tânica crônica, arterite de célula gigante, nefrite complexa imune, nefropatia de IgA1 polineuropatias de IgM ou neoropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoimune, doença autoimune de testículo e ovário incluindo orquite e ooforite autoimunes, hipo- tireodismos primário; doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite autoimune, tireoidite crônica (Tireoidite de Hashimoto), tireoidite subaguda, hipotireodismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatias poliglandula- res), diabetes Tipo I também referida como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite intersticial Iinfoide (VIH), bronquiolite obliterante (não-transplante) vs NSIP, Síndrome de Guillain-Barre1 vasculite de grande vaso (incluindo polimialgia reumática e arterite de célula gigante (de Takayasu)), vasculite de vaso mé- dio (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa), poliarterite nodosa (PAN) espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia de IgA), glo- merulonefrite de progressão rápida, cirrose biliar primária, psilose Celíaca (enteropatia por glúten), crioglobulinemia, crioglobulinemia associada à he- patite, esclerose lateral amiotrófica (ALS)1 doença de artéria coronária, febre Mediterrânea familiar, poliangiite microscópica, síndrome de Cogan, síndro- me de Whiskott-Aldrich e tromboangiite obliterante (ver WO 2007/014278).

Dependendo do distúrbio a ser tratado, a molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, especialmente seleciondos para danificar o DNA ou agentes de ligação à tubulina ou compostos terapeutica- mente ativos que inibem angiogênese, vias de transdução de sinal ou con- troles mitóticos em células de câncer. O agente terapêutico adicional pode ser administrado simulta- neamente, opcionalmente como um componente da mesma preparação far- macêutica, ou antes ou após administração da molécula de anticorpo anti- CD37.

Em certas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser, sem restrição, um ou mais inibidores selecionados a partir do grupo de inibidores da família EGFR, família VEGFR, IGF-1R, receptores de Insulina, AuroraA, AuroraB1 PLK e PI3 quinase, FGFR, PDGFR, Raf, KSP ou PDK1.

Exemplos adicionais de agentes terapêuticos adicionais são ini- bidores de CDKs, Akt, Src, Bcr-Abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, antagonistas de ouriço, inibidores de JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, pro- teassoma, Rho1 um inibidor de sinalização de Wnt ou sinalização de Notch ou um inibidor da via de ubiquitinação.

Exemplos de inibidores de Aurora são, sem restrição, PHA- 739358, AZD-1152, AT-9283, CYC-116, R-763, VX-667, MLN-8045, PF- 3814735, SNS-314, VX-689, GSK-1070916, TTP-607, PHA-680626, MLN- 8237 e ENMD-2076.

Um exemplo de um inibidor PLK é GSK-461364.

Exemplos de inibidores de raf são BAY-73-4506 (também um i- nibidor de VEGFR), PLX-4032, RAF-265 (também um inibidor de VEGFR), sorafenibe (também um inibidor de VEGFR), XL-281 e Nevavar (também um inibidor de VEGFR).

Exemplos de inibidores de KSP são ispinesib, ARRY-520, AZD- 4877, CK-1122697, GSK-246053A, GSK-923295, MK-0731, SB-743921, LY- 2523355 e EMD-534085.

Exemplos de inibidores de src e/ou bcr-abl são dasatinib, AZD- 0530, bosutinib, XL-228 (também um inibidor de IGF-1R), nilotinib (também um inibidor de PDGFR e cKit), imatinib (também um inibidor de cKit), NS- 187, KX2-391, AP-24534 (também um inibidor de EGFR, FGFR, Tie2, Flt3), KM-80 e LS-104 (também um inibidor de Flt3, Jak2).

Um exemplo de um inibidor de PDK1 é AR-12.

Um exemplo de um inibidor de Rho é BA-210. Exemplos de inibidores de PI3 quinase são PX-866, PX-867, BEZ-235 (também um inibidor de mTor), XL-147 e XL-765 (também um ini- bidor de mTor), BGT-226, CDC-0941.

Exemplos de inibidores de cMet ou HGF são XL-184 (também um inibidor de VEGFR1 cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (também um inibidor de VEGFR), MGCD-265 (também um inibidor de VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, AV-299, ARQ-197, MetMAb1 CGEN-241, BMS-777607, JNJ-38877605, PF-4217903, SGX-126, CEP- 17940, AMG-458, INCB-028060, e E-7050.

Um exemplo de um inibidor de c-Myc é CX-3543.

Exemplos de inibidores de Flt3 são AC-220 (também um inibidor de cKit e PDGFR), KW-2449, LS-104 (também um inibidor de bcr-abl e Jak2), MC-2002, SB-1317, Iestaurtinib (também um inibidor de VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (também um inibidor de JAK2), XL-999 (também

um inibidor de cKit, FGFR, PDGFR e VEGFR), sunitinib (também um inibidor de PDGFR, VEGFR e cKit), e tandutinib (também um inibidor de PDGFR e cKit).

Exemplos de inibidores de HSP90 são, tanespimicina, alvespi- micina, IPI-504, STA-9090, MEDI-561, AUY-922, CNF-2024 e SNX-5422.

Exemplos de inibidores de JAK/STAT são CYT-997 (também

interagindo com tubulina), TG-101348 (também um inibidor de Flt3) e XL- 019.

Exemplos de inibidores de Mek são ARRY-142886, AS-703026, PD-325901, AZD-8330, ARRY-704, RDEA-119 e XL-518.

Exemplos de inibidores de mTor são temsirolimus, deforolimus

(que também atua como um inibidor de VEGF), everolimus (além disso, um inibidor de VEGF). XL-765 (também um inibidor de PI3 quinase), e BEZ-235 (também um inibidor de PI3 quinase).

Exemplos de inibidores de Akt são perifosina, GSK-690693, RX-

0201 e triciribina.

Exemplos de inibidores de cKit são masitinib, OSI-930 (também atua como um inibidor de VEGFR), AC-220 (também um inibidor de Flt3 e PDGFR), tandutinib (também um inibidor de Flt3 e PDGFR), axitinib (tam- bém um inibidor de VEGFR e PDGFR), sunitinib (também um inibidor de Flt3, PDGFR, VEGFR), e XL-820 (também atua como um inibidor de VEGFR e PDGFR), imatini (também um inibidor de bcr-abl), nilotinib (também um inibidor de bcr-abl e PDGFR).

Exemplos de antagonistas de ouriço são IPI-609, CUR-61414, GDC-0449, IPI-926, eXL-139.

Exemplos de inibidores de CDK são seliciclibe, AT-7519, P-276, ZK-CDK (também inibindo VEGFR2 e PDGFR), PD-332991, R-547, SNS- 032, PHA-690509, PHA-848125 e SCH-727965.

Exemplos de inibidores de proteassoma são bortezomib, carfil- zomib e NPI-0052 (também um inibidor de NFkappaB).

Exemplos de inibidores de proteassoma/inibidores da via de NFkappaB são bortezomib, carfilzomib, NPI-0052, CEP-18770, MLN-2238, PR-047, PR-957, AVE-8680 e SPC-839.

Um exemplo de um inibidor da via de ubiquitinação é HBX-

41108.

Exemplos de agentes antiangiogênicos são os inibidores de FGFR, PDGFR e VEGF(R)1 e talidomidas, tais agentes que são seleciona- dos a partir de, sem restrição, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU- 14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (também um inibidor de CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs, talidomida, CC-4047, lenalidomida, ENMD-0995, CMI-D11, Ki-23057, brivanib, cediranib, 1B3, CP- 868596, CMI-3G3, R-1530 (também um inibidor de Flt3), sunitinib (também um inibidor de cKit e Flt3), axitinib (também um inibidor de cKit), Iestaurtinib (também um inibidor de Flt3 e PKC), vatalanib, tandutinib (também um inibi- dor de Flt3 e cKit), pazopanib, PF-337210, aflibercept, E-7080, CHIR-258, tosilato de sorafenib (também um inibidor de Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (também um inibidor de EGFR e Her2), BAY-57-9352 (também um inibidor de Raf), BAY-73-4506 (também um inibidor de Raf), XL-880 (também um inibidor de cMet), XL-647 (também um inibidor de EG- FR e EphB4), XL-820 (também um inibidor de cKit), nilotinib (também um inibidor de cKit e brc-abl), CYT-116, PTC-299, BMS-584622, CEP-11981, dovitinib, CY-2401401 e ENMD-2976.

O agente terapêutico adicional também pode ser selecionado a partir de inibidores de EGFR, pode ser uma pequena molécula inibidora de EGFR ou um anticorpo anti-EGFR. Exemplos de anticorpos anti-EGFR, sem restrição, são cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, zalutumumab; exem- plos de inibidores de EGFR de pequena molécula são gefitinib, erlotinib e vandetanib (também um inibidor de VEGFR). Outro exemplo de um modula- dor de EGFR é a toxina de fusão a EGF.

Além disso, inibidores de EGFR e/ou Her2 úteis para a combi- nação com uma molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção são lapatinib, trastuzumabe, pertuzumab, XL-647, neratinib, BMS-599626 ARRY-334543, AV-412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (também um ini- bidor de VEGFR), AZD-8931, ARRY-380 ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab, TAK-285, AZD-4769.

O fármaco adicional também pode ser selecionado a partir de agentes que visam o IGF-1R e as vias do receptor de insulina. Tais agentes incluem anticorpos que se ligam a IGF-1R (por exemplo, CP-751871, AMG- 479, IMC-A12, MK-0646, AVE-1642, R-1507, BIIB-022, SCH-717454, rhu Mab IGFR e novas entidades químicas que visam o domínio quinase de IGF1-R (por exemplo, OSI-906 ou BMS-554417, XL-228, BMS-754807).

Outros agentes que podem ser vantajosamente combinados em uma terapia com a molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção são molé- culas que visam CD20, incluindo anticorpos específicos para CD20 como rituximab, LY-2469298, ocrelizumab, MEDI-552, IMMU-106, GA-101 (= R7159), XmAb-0367, ofatumumab, anticorpos para CD20 radiomarcados, como tositumumab e tiuxetano de ibritumomab ou outras proteínas dirigidas a CD20, como SMIP TruOI5, PRO-131921, FBT-A05, veltuzumab, R-7159.

Anticorpos para CD37 podem ser combinados com inibidores de outros antígenos superficiais expressos em leucócitos, em particular anticor- pos ou moléculas semelhantes a anticorpo, por exemplo, anti-CD2 (siplízu- mab), anti-CD4 (zanolimumab), anti-CD19 (MT-103, MDX-1342, SAR-3419, XmAb-5574), anti-CD22 (epratuzumab), anti-CD23 (lumiliximab), anti-CD30 (iratumumab), anti-CD32B (MGA-321), anti-CD38 (HuMax-CD38), anti-CD40 (SGN40), anti-CD52 (alemtuzumab), anti-CD80 (galiximab). Um anticorpo da invenção também pode ser combinado com outro antagonista de CD37, por exemplo, TRU-016.

Outros agentes a serem combinados com anticorpos para CD37 são imunotoxinas como BL-22 (uma imunotoxina anti-CD22), ozogamicina inotuzumab (um anticorpo anti-CD23 conjugado a caliqueamicina), RFTõ.dgA (anti-CD25 de cadeia Ricina toxina A), SGN-35 (um anti-CD30 conjugado a auristatina E), e gemtuzumab ozogamicina (um anti-CD33 con- jugado a caliqueamicina), MDX-1411 (anti-CD70 conjugado), ou anticorpos radiomarcados como 90Y-epratuzumab (anti-CD22 radioimunoconjugado).

Além disso, anticorpos anti-CD37 podem ser combinados com imunomoduladores, agentes, por exemplo, anticorpos, que induzem apopto- se ou modificam vias de transdução de sinal como os moduladores de re- ceptor de TRAIL mapatumumab (um agonista do receptor TRAIL 1), Iexatu- mumab (um agonista de receptor TRAIL 2), tigatuzumab, Apomab, AMG-951 e AMG-655; um anticorpo anti-HLA-DR (como 1D09C3), um anti-CD74, um inibidor de Iigante de fator de diferenciação de osteoclasto (como denosu- mab), um antagonista de BAFF (como AMG-623a) ou um agonista de um receptor semelhante a Toll (por exemplo, TLR-4 ou TLR-9).

Outros fármacos que podem ser usados em combinação com as moléculas de anticorpo anti-CD37 da presente invenção são selecionados a partir de, mas não limitados a hormônios, análogos hormonais e anti- hormonais (por exemplo, tamoxifeno, toremifene, raloxifeno, fulvestrant, ace- tato de megestrol, flutamida, nilutamida, bicalutamida, acetato de ciprotero- na, finasterida, acetato de buserelina, fludrocortinsona, fluoximesterona, me- droxiprogesterona, caproato de hidroxiprogesterona, dietilstilbestrol, propio- nato de testosterona, fluoximesterona/equivalentes, octreotídeo, arzoxifeno, pasireotídeo, vapreotídeo, adrenocorticosteroides/antagonistas, prednisona, dexametasona, ainoglutetimida), inibidores de aromatase (por exemplo, a- nastrozol, letrozol, liarozol, exemestano, atamestano, formestano), agonistas e antagonistas de LHRH (por exemplo, acetato de goserelina, leuprolida, abarelix, cetrorelix, deslorelina, histrelina, triptorelina), antimetabólitos (por exemplo, antifolatos como metotrexato, trimetrexato, pemetrexed, análogos de pirimidina como 5-fluorouracila, fluorodesoxiuridina, capecitabina, decita- bina, nelarabina, 5-azacitidina, e gencitabina, análogos de purina e adenosi- na, tais como mercaptopurina, tioguanina, azatioprina, cladribina e pentosta- tina, citarabina, fludarabina, clofarabina); antibióticos antitumorais (por e- xemplo, antraciclinas como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e i- darrubicina, mitomicina-C, bleomicina dactinomicina, plicamicina, esplicami- cina, actinomicina D, mitoxantrona, mitoxantronaidarrubicina, pixantrona, estreptozocina, afidicolina); derivados de platina (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, lobaplatina, satraplatina); agentes alquilantes (por exemplo, estramustina, semustina, mecloretamina, melfalan, clorambucila, bussulfano, dacarbazina, ciclofosfamida, ifosfamida, hidroxiureia, temozolo- mida, nitrosoureias tais como, carmustina e lomustina, tiotepa); agentes an- timitóticos (por exemplo, alcalóides da vinca como vinblastina, vindesina, vinorrelbina, vinflunina e vincristina; e taxanos como paclitaxel, docetaxel e suas formulações, larotaxel; simotaxel, e epotilonas como ixabepilona, patu- pilona, ZK-EPO); inibidores de topoisomerase (por exemplo, epipodofilotoxi- nas como etoposídeo e etopofos, teniposídeo, ansacrina, topotecano, irino- tecano, banoxantrona, camptotecina) e diversos quimioterápicos, tais como derivados de ácido retinoico, amifostina, anagrelídeo, interferon alfa, interfe- ron beta, interferon gama, interleucina-2, procarbazina, N-metil-hidrazina, mitotano, e porfímero, bexaroteno, celecoxibe, etilenomina/metil-melamina, trietienomelamina, trietileno de tiofosforamida, hexametilmelamina, e enzi- mas L-asparaginase, L-arginase e metronidazol, misonidazol, desmetilmiso- nidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, RSU 1069, E09, RB 6145, SR4233, nicotinamida, 5-bromodesoziuridina, 5-iododesoxiuridina, bromode- soxicitidina, eritro-hidroxinonil-adenina, antracenodiona, GRN-163L (um an- tagonista-padrão competitivo por telomerase), SDX-101 (um agonista de PPAR), talabostato (um inibidor de DPP), forodesina (um inibidor de PNP), atacicept (um receptor solúvel que visa membros da família de TNF BLyS e APRIL), agentes de neutralização de TNF-alfa (Enbrel, Humira, Remicade), XL-844 (um inibidor de CHK1/2), VNP-40101M (um agente alquilante de DNA), SPC-2996 (um inibidor antissentido de bcl2), obatoclax (um inibidor de bcl2), enzastaurina (um modulador de PKC beta), vorinistato (um inibidor de HDAC), romidepsina (um inibidor de HDAC), AT-101 (um inibidor de Bcl- 2/Bcl-xL), plitidepsina (um depsipeptídeo multiacionado), SL-11047 (modula- dores de metabolismo de poliamina).

Em certas modalidades, a molécula de anticorpo anti-CD37 é aplicada em conjunto com "CHOP" (uma combinação de ciclofosfamida, do- xorrubicina, vincristina e prednisona).

A molécula de anticorpo anti-CD37 da invenção também pode ser usada em combinação com outras terapias incluindo cirurgia, radiotera- pia, terapia endócrina, modificadores de resposta biológica, hipertermia e crioterapia e agentes para atenuar qualquer efeito adverso (por exemplo, antieméticos), G-CSF, GM-CSF1 fotossensibilizadores, tais como derivados de hematoporfirina, Photofrin®, derivados de benzoporfirina, Npe6, tin etio- porfirina, feoborídeo-a bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalocianinas, fta- Iocianinas de zinco.

Anticorpos monoclonais mostram excelente especificidade por antígeno e freqüentemente somente reagem com o antígeno-alvo humano, mas não com proteínas homólogas de espécie animal. Para apoiar o desen- volvimento de anticorpos terapêuticos, modelos animais apropriados para avaliação de toxicidade e comportamento farmacodinâmico in vivo são dese- jáveis. Uma possibilidade de um modelo in vivo é um camundongo transgê- nico no qual o antígeno alvo endógeno seja substituído por seu homólogo humano ("inativação/ativação no camundongo"). Em particular, para desen- volver anticorpos anti-CD37 terapêuticos, o gene CD37 murino pode ser substituído pelo gene CD37 humano. Isto pode ser alcançado pela constru- ção de um vetor direcionado que contém a seqüência genômica que codifica o gene CD37 humano flanqueado por seqüências não traduzidas. Este vetor direcionado pode ser usado para recombinação homóloga usando células ES de camundongo. Os animais transgênicos homozigotos para a expressão de CD37 humano podem ser usados para avaliar o efeito farmacodinâmico de anticorpos dirigidos contra CD37 humano, por exemplo, pelo monitora- mento do número de células B periféricas após aplicação dos anticorpos. Alternativamente, aqueles camundongos podem ser usados para investigar efeitos tóxicos potenciais de anticorpos específicos para CD37 humano, a- pós aplicação i.v.

Outra possibilidade, no caso de falta de reatividade cruzada com animal dos anticorpos monoclonais é a geração de um chamado anticorpo substituto. Um anticorpo substituto é um anticorpo que reage com a proteína homóloga de uma espécie animal que é relevante e útil para a investigação de efeitos farmacodinâmicos e tóxicos, por exemplo, camundongo ou maca- co cinomolgus. Em caso de CD37, anticorpos monoclonais que são desen- volvidos são específicos para CD37 de macaco ou CD37 de camundongo, respectivamente. Idealmente, tal anticorpo substituto deve ter propriedades de ligação e funcionais similares como o anticorpo de desenvolvimento. Isto pode ser investigado pelo uso de sistemas de ensaio que utilizam células de expressão de CD37 de macaco ou de camundongo como células-alvo, por exemplo, para ensaios de ligação, de análise por FACS Scatchard, de ADCC e de apoptose. Enfim, o anticorpo substituto pode ser selecionado em virtude de sua atividade de depleção de célula B no sangue de camundongo ou ma- caco in vitro.

Breve Descrição das Figuras:

Figura 1: Anticorpo Quimérico AO especificamente reconhece o antígeno CD37, determinado por ensaio de competição em FACS

Figura 2: Ligação de versões humanizadas de AO ao antígeno celular CD37, determinado por FACS

Figura 3: Ligação de versões humanizadas de AO ao antígeno celular CD37, determinado por FACS

Figura 4: Afinidade de versões humanizadas de AO ao antígeno celular CD37, determinado por análise em FACS scatchard

Figura 5: Atividade de ADCC de versões humanizadas de AO em células Ramos Figura 6: Atividade pró-apoptótica de versões humanizadas de AO em células Ramos

Figura 7: Atividade de ADCC de versões de Fc engenheiradas de mAb AO em células Ramos

Figura 8: Atividade de ADCC de versões de Fc engenheiradas de mAb BO em células Ramos

Figura 9: Atividade pró-apoptótica de mAb AO e BO Figura 10: Atividade pró-apoptótica de versões de Fc engenhei- radas de mAb AO

Figura 11 A: Depleção de células B humanas normais em um ensaio de sangue total por anticorpos de Fc engenheirados A2 e B2 em comparação a Rituximab

Figura 11 B: Atividade de depleção de célula B superior de anti- corpos após Fc engenheirada em comparação a Rituximab

Figura 11 C: Anticorpos A2 e B2 não depletam células T e mo- nócitos em ensaios de sangue total

Figura 12: Atividade de ADCC superior após Fc engenheirada em comparação com Rituximab

Figura 13: Depleção de células de Iinfoma de Burkitt Ramos em um ensaio de sangue total por anticorpos de Fc engenheirada A2 e B2 em comparação a Rituximab

Figura 14: Inibição do crescimento tumoral in vivo de tumores de Ramos enxertados em camundongos nude por anticorpos de Fc engenhei- rada A2 e B2

Figura 15: Expressão de CD37 em células de mieloma múltiplo Figura 16: Atividade de ADCC de anticorpos A2 e B2 em células de mieloma múltiplo

Figura 17: Atividade pró-apoptótica de anticorpos A2 e B2 em células derivadas de paciente com CLL Exemplo 1

Geração de anticorpos anti-CD37 quiméricos e humanizados a) Geração de anticorpo quimérico AO Com base nas seqüências de aminoácido da cadeia pesada e leve variável mostradas na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4, as seqüências de DNA correspondentes são sintetizadas aplicando códon de uso otimizado para células mamíferas (GeneArt, Regensburg, Germany), adicionando na extremidade 5' um sítio de clonagem Hindlll e na extremidade 3' um BamHl As moléculas de DNA sintetizadas são digeridas com Hindlll e BamHI e os fragmentos de DNA resultantes (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3 mais sítios de restrição) são clonados em vetores de expressão baseados em pcDNA3.1 humano que codificam para a região constante de IgGI humana e para regi- ão constante da cadeia leve kappa, respectivamente (SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:26). Preparações de plasmídeo EndoFree (Qiagen) são preparadas e os plasmídeos de cadeia pesada e leve são cotransfectados em células de estilo livre HEK293 (Invitrogen) em uma concentração de 1 mg/L de cada plasmídeo de acordo com o protocolo do fornecedor. Após 72 horas, o so- brenadante é coletado e a concentração de IgG é determinada por ELISA. O anticorpo anti-CD37 quimérico resultante (designado AO) é purificado em uma coluna de proteína A modificada (GE Healthcare), eluído em um tam- pão de citrato então dializado em PBS.

b) Geração de versões humanizadas do anticorpo quimérico AO A humanização do mAb quimérico AO, como obtido em a), é rea- lizada usando uma abordagem de enxerto de CDR, como descrito, por e- xemplo, em US 5.225.539; US 6.548.640; US 6.982.321.

Para estabelecer um modelo estrutural do domínio VL de mAb AO, um molde estrutural é escolhido no Banco de Dados Proteico (PDB) de Brookhaven National Laboratory. O domínio VL da entrada de anticorpo mo- noclonal murino "1KB5" é escolhido com identidade de seqüência de 88%/similaridade de 81% e 2,5 Â de resolução. Para o domínio VH de mAb AO, a mesma estrutura de anticorpo monoclonal de camundongo de "1KB5" com identidade de seqüência de 90% e similaridade de 91% é escolhida como o molde de modelagem principal. O melhor ajuste para a região con- servada consenso humana encontrada sendo do tipo Vkappal humano (hVK1) e VH1 humano (hVH1). Como um desenho alternativo, um enxerto para os domínios consenso humanos mais estáveis hVK3 e hVH3 é escolhi- do. Para o enxerto, os modelos mAb A0_VL e mAb A0_VH são combinados com modelos de domínio consenso humanos hVK1, hVK3, hVH1A e hVH3 e combinados para produzir modelos Fv. O enxerto da alça é realizado pela inserção das regiões CDR de mAb AO murino nas regiões conservadas do anticorpo humano e as moléculas de DNA dos construtos da cadeia humani- zada são sintetizados.

As respectivas regiões variáveis humanizadas são sintetizadas e clonadas em vetores de expressão de imunoglobulina e transitoriamente expressas no sistema de expressão de estilo livre HEK 293 (Invitrogen), co- mo descrito em a), nas combinações de seqüências de cadeia pesada e leve como mostrado na Tabela 1, e purificadas em colunas de proteína A.

Tabela 1

Seqüências de cadeias variáveis pesada e leve dos anticorpos anti-CD37 quiméricos e humanizados usados nos Exemplos._

Anticorpo Cadeia Pesada SEQ ID NO: aa/DNA Cadeia Leve SEQ ID NO: a- a/DNA A (=A0) seq 2/1 seq 4/3 B seq 6/5 seq 12/11 C seq 6/5 seq 14/13 D seq 6/5 seq 16/15 H seq 8/7 seq 18/17 I seq 8/7 seq 20/19 J seq 8/7 seq 22/21 K seq 10/9 seq 18/17 L seq 10/9 seq 20/19 M seq 10/9 seq 22/21

c) Geração de anticorpos anti-CD37 quiméricos e humanizados de Fc engenheirada

A geração de mutantes de Fc é realizada como descrito por La- zar et al, 2006. A seqüência da cadeia pesada Fc engenheirada resultante é introduzida no vetor de expressão pAD-CMV1 (descrito em EP 393 438) e cotransfectada em conjunto com um plasmídeo contendo a seqüência de codificação da cadeia leve em células CHO-DG44. O anticorpo é coletado dos meios de cultura celular 5 a 7 dias após transfecção e purificado através de cromatografia em proteína A, eluída em um tampão de citrato então diali- zada em PBS. O conteúdo proteico das amostras é determinado através de HPLC em Proteína A, o conteúdo de endotoxina é determinado através do Ensaio Cromogênico Cinético Kinetic-QCL (Lonza). O conteúdo monomérico das amostras é determinado por HP-SEC1 todas as amostras usadas para teste funcional mostram um conteúdo monomérico > 95%.

Tabela 2

Seqüências das cadeias variáveis pesada e leve (colunas Ill e IV) e mutações de Fc (coluna II) dos anticorpos anti-CD37 quiméricos e hu- manizados (anticorpo AO, BO1 CO etc. é idêntico ao anticorpo AeB1C etc. na Tabela 1).

Seqüências completas das cadeias pesada e leve são listadas nas colunas V e VI. (As seqüências na coluna V marcada com * referem-se à seqüência de IgGI da SEQ ID NOs 24 e 23 (seqüências de tipo selvagem) que foram modificadas para ter a substituição(ões) correspondente à coluna II, e a(s) respectiva(s) mutação (ões) no DNA de codificação).

Ab

AO

Il

Substituição (ões) de Fc (numeração Ka- bat)

A1

A2

I332E

S239D/I332E

SEQ ID NO: cadeia pe- sada ν a- a/DNA

IV

seq 2/1

SEQ ID NO: cadeia leve ν aa/DNA

seq 4/3

A3

A4

BO

B1

I332E/G236A

S239D/I332E/G236A

I332E

seq 2/1

seq 6/5

seq 4/3

V

SEQ ID NO: cadeia pesada completa a- a/DNA

2/1 fundida a 24/23

2/1 fundida a 24723*

Vl

SEQ ID NO: cadeia leve completa a- a/DNA

4/3 fundida a 26/25

28/27

seq 4/3

seq 12/11

2/1 fundida a 24723*

32/31

6/5 fundida a 24/23

6/5 fundida a 24723*

4/3 fundida a 26/25

30/29

4/3 fundida a 26/25

34/33

12/11 fundida a 26/25

12/11 fundida a 26/25 I Il Ill IV V Vl Ab Substituição (ões) de Fc (numeração Ka- bat) SEQ ID NO: cadeia pe- sada ν a- a/DNA SEQ ID NO: cadeia leve ν aa/DNA SEQ ID NO: cadeia pesada completa a- a/DNA SEQ ID NO: cadeia leve completa a- a/DNA Β2 S239D/I332E seq 6/5 seq 12/11 36/35 38/37 Β3 I332E/G236A seq 6/5 seq 12/11 6/5 fundida a 24723* 12/11 fundida a 26/25 Β4 S239D/I332E/G236A seq 6/5 seq 12/11 40/39 42/41 CO - seq 6/5 seq 14/13 6/5 fundida a 24/23 14/13 fundida a 26/25 C1 1332E seq 6/5 seq 14/13 6/5 fundida a 24723* 14/13 fundida a 26/25 C2 S239D/I332E seq 6/5 seq 14/13 6/5 fundida a 24723* 14/13 fundida a 26/25 C3 I332E/G236A seq 6/5 seq 14/13 6/5 fundida a 24723* 14/13 fundida a 26/25 C4 S239D/I332E/G236A seq 6/5 seq 14/13 6/5 fundida a 24723* 14/13 fundida a 26/25 DO - seq 6/5 seq 16/15 6/5 fundida a 24/23 16/15 fundida a 26/25 D1 I332E seq 6/5 seq 16/15 6/5 fundida a 24723* 16/15 fundida a 26/25 D2 S239D/I332E seq 6/5 seq 16/15 6/5 fundida a 24723* 16/15 fundida a 26/25 D3 I332E/G236A seq 6/5 seq 16/15 6/5 fundida a 24/*23* 16/15 fundida a 26/25 D4 S239D/I332E/G236A seq 6/5 seq 16/15 6/5 fundida a 24/*23* 16/15 fundida a 26/25 HO - seq 8/7 seq 18/17 8/7 fundida a 24/23 18/17 fundida a 26/25 H1 1332E seq 8/7 seq 18/17 8/7 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 H2 S239D/I332E seq 8/7 seq 18/17 8/7 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 H3 332E/G236A seq 8/7 seq 18/17 8/7 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 H4 5239D/I332E/G236A seq 8/7 seq 18/17 8/7 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 -0 ; seq 8/7 seq 20/19 3/7 fundida a 20/19 fundida a I Il Ill IV V Vl Ab Substituição (ões) de Fc (numeração Ka- bat) SEQ ID NO: cadeia pe- sada ν a- a/DNA SEQ ID NO: cadeia leve ν aa/DNA SEQ ID NO: cadeia pesada completa a- a/DNA SEQ ID NO: cadeia leve completa a- a/DNA 24/23 26/25 1-1 I332E seq 8/7 seq 20/19 8/7 fundida a 24*/23* 20/19 fundida a 26/25 I-2 S239D/I332E seq 8/7 seq 20/19 8/7 fundida a 24*/23* 20/19 fundida a 26/25 I-3 I332E/G236A seq 8/7 seq 20/19 8/7 fundida a 24723* 20/19 fundida a 26/25 I-4 S239D/I332E/G236A seq 8/7 seq 20/19 8/7 fundida a 24723* 20/19 fundida a 26/25 JO - seq 8/7 seq 22/21 8/7 fundida a 24/23 22/21 fundida a 26/25 J1 I332E seq 8/7 seq 22/21 8/7 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25 J2 S239D/I332E seq 8/7 seq 22/21 8/7 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25 J3 I332E/G236A seq 8/7 seq 22/21 8/7 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25 J4 S239D/I332E/G236A seq 8/7 seq 22/21 8/7 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25 KO - seq 10/9 seq 18/17 10/9 fundida a 24/23 18/17 fundida a 26/25 K1 I332E seq 10/9 seq 18/17 10/9 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 K2 S239D/I332E seq 10/9 seq 18/17 10/9 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 K3 I332E/G236A seq 10/9 seq 18/17 10/9 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 K4 S239D/I332E/G236A seq 10/9 seq 18/17 10/9 fundida a 24723* 18/17 fundida a 26/25 LO - seq 10/9 seq 20/19 10/9 fundida a 24/23 20/19 fundida a 26/25 L1 332 E seq 10/9 seq 20/19 10/9 fundida a 24723* 20/19 fundida a 26/25 L2 S239D/I332E seq 10/9 seq 20/19 10/9 fundida a 24723* 20/19 fundida a 26/25 I .3 332E/G236A seq 10/9 | seq 20/19 10/9 fundida a 20/19 fundida a I Il Ill IV V Vl Ab Substituição (ões) de Fc (numeração Ka- bat) SEQ ID NO: cadeia pe- sada ν a- a/DNA SEQ ID NO: cadeia leve ν aa/DNA SEQ ID NO: cadeia pesada completa a- a/DNA SEQ ID NO: cadeia leve completa a- a/DNA 24*/23* 26/25 L4 S239D/I332E/G236A seq 10/9 seq 20/19 10/9 fundida a 24*/23* 20/19 fundida a 26/25 MO - seq 10/9 seq 22/21 10/9 fundida a 24/23 22/21 fundida a 26/25 M1 I332E seq 10/9 seq 22/21 10/9 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25 M2 S239D/I332E seq 10/9 seq 22/21 10/9 fundida a 24*/23* 22/21 fundida a 26/25 M3 I332E/G236A seq 10/9 seq 22/21 10/9 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25 M4 S239D/1332 E/G236A seq 10/9 seq 22/21 10/9 fundida a 24723* 22/21 fundida a 26/25

Exemplo 2

MAb quimérico AO reconhece especificamente o antígeno CD37 A especificidade de MAB AO por CD37 celular é testada em um ensaio de competição em FACS em células de Iinfoma de Burkitt Ramos (ATCC N0 CRL-1596). Células são cultivadas em frascos de cultura de tecido (175 cm2) usando RPMI-1640 + GIutaMAX suplementado com soro fetal bo- vino 10% inativado pelo calor, HEPES a 12,5 mM, piruvato de sódio a 1 mM, aminoácidos não essenciais 1% em MEM como meio de cultura. Células são cultivadas com uma densidade inicial de 3x105 células/ml a 37°C e CO2 5% em uma atmosfera úmida por três dias. As culturas são mantidas em uma concentração celular entre 3x105 e 1,8x106/ml por subcultura em uma razão de 1:6 com meio de cultura fresco 2 a 3 vezes por semana. Para análise de competição em FACS, o mAb específico para CD37 HH1 (Santa Cruz) dire- tamente marcado com ficoeritrina (PE) é usado em uma concentração de 1 pg/ml. O anticorpo é pré-incubado com o anticorpo competidor não marcado AO por 10 minutos a 4°C na razão molar indicada. Após isso, 1x105 células Ramos são incubadas por 30 min com a mistura de anticorpo em gelo. Após isso, as células são lavadas duas vezes em salina tamponada de fosfato (PBS)1 ressuspensas em tampão de FACS e medidas em um BD FACS Canto. Os resultados de tal ensaio são mostrados na figura 1. A adição de um anticorpo IgGI humano controle (Sigma IgGI kappa) em excesso molar de 20 vezes não reduz significativamente a média de intensidade de fluores- cência (MFI) das células Ramos. A adição de anticorpo HH1 não marcado ou do anticorpo AO em excesso molar de 20 vezes quase completamente anulou a ligação do anticorpo HH1 diretamente marcado. Isto indica que an- ticorpos AO e HH1 reconhecem epitopos idênticos ou similares em células Ramos e competem pela ligação ao antígeno celular CD37.

Exemplo 3

Ligação de versões humanizadas de mAb AO a antígeno celular

CD37

Versões humanizadas de AO são testadas para sua ligação ao antígeno celular CD37 pela análise em FACS. Anticorpos são adicionados a células Ramos nas concentrações indicadas e deixados para ligação de 30 min a 4°C. Após isso, o anticorpo ligado é detectado com anticorpo anti-lgG humana de cabra marcado com PE (Sigma), as células são lavadas duas vezes com PBS1 e após isso as células são ressuspensas em tampão de FACS e analisadas por FACS em um BD FACS Canto. Exemplos são mos- trados nas figuras 2 e 3 (anticorpos A, B, C, D, I ou A, Η, I, J, K, L e M, res- pectivamente; ver Tabela 1). Várias das versões humanizadas de AO mos- tram ligação similar a células Ramos como o anticorpo parental AO, indican- do que a humanização não reduz a ligação ao antígeno celular CD37.

Exemplo 4

Análise por FACS scatchard de versões humanizadas de mAb quimérico AO

A afinidade de versões humanizadas do anticorpo AO (designa- das B, C, D, Η, I e K; ver Tabela 1) ao antígeno celular CD37 é determinada pela análise por FACS "scatchard" como descrito em outro lugar (Brockhoff et al, 1994). Resumidamente, diluições de anticorpo são preparadas em pla- cas 96 poços iniciando com 100 a 400 nM no primeiro poço (80 μΙ), seguido por 11 etapas de diluição (1:2, 40 + 40 μΙ). 50 μΙ de diluições de mAb são adicionados a tubos de FACS1 150 μΙ de células (0,8x106/ml=1,2x105 célu- las/tubo) são adicionados a cada tubo de FACS. As células são suavemente misturadas e incubadas por 1 h em gelo. Após isso, 50 μΙ de anticorpo se- cundário conjugado a FITC (conc. 15 pg/ml; mAb IgG anti-hu de camundon- go de todas as subclasses, Zymed 05-4211) são adicionados, misturados, e incubados por 30 min em gelo. 4 ml de PBS em pH 7,2 contendo ácido a 0,02% são adicionados após isso, as células são precipitadas e ressuspen- sas em 300 μΙ de PBS pH 7,2 e submetidas à análise por FACS usando um BD FACS Canto. Todas as etapas experimentais são realizadas em gelo molhado, todas as diluições de anticorpo são feitas em PBS/BSA a 0,5% + ácido a 0,02%. A calibração de FACS é realizada usando Contas de Alto nível Quantum FITC MESF (Premix) (Bangs Laboratories). Todas as amos- tras são medidas usando os mesmos parâmetros de FACS. A razão de IgG ligado versus IgG livre é calculada por valores de MFI em diferentes concen- trações de anticorpo e mostrada como gráfico scatchard. A figura 4 mostra a relação MFI/concentração de anticorpo de diversas variantes humanizadas de AO. Os resultados mostram ligação similar a células Ramos de algumas das versões humanizadas como o anticorpo inicial, com constantes de dis- sociação (Kd) na faixa de 2,15 a 4,90 nanomols/litro.

Exemplo 5

Atividade de ADCC de versões humanizadas do mAb quimérico

AO

A capacidade de versões humanizadas de AO (designadas B, C, D, H, J, K; ver Tabela 1) de mediar a citotoxicidade mediada por célula de- pendente de anticorpo (ADCC) é avaliada usando células Ramos como célu- las alvo e PBMCs humanas estimuladas com IL2 como células efetoras. Cé- lulas Ramos (linfoma de Burkitt; ATCC N0 CRL-1596) foram adquiridas de ATCC. Células são cultivadas em frascos de cultura de tecido (175 cm2) u- sando RPMI-1640 + GIutaMAX suplementado com soro fetal bovino a 10% inativado pelo calor, HEPES 12,5 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais a 1% em MEM como meio de cultura. Células são cultivadas com uma densidade inicial de 3x105 células/ml a 37°C e CO2 5% em uma atmosfera úmida por três dias. As culturas são mantidas em uma concentra- ção celular entre 3x105 e 1,8x106/ml por subcultura em uma razão de 1:6 com meio de cultura fresco 2 a 3 vezes por semana. Uma alíquota da cultura celular em uma densidade celular entre 1,5x106/ml e 1,8x106/ml e crescendo na fase Iog é centrifugada (200 χ g, isto é, 1000 rpm) por 10 min. As células são lavadas uma vez com meio de lavagem (RPMI 1640 s/ L-glutamina) e precipitadas (200 χ g, isto é, 1000 rpm; 10 min). O precipitado celular é res- suspenso no meio de ensaio [BSA 1% em RPMI s/ L-glutamina] e a conta- gem celular é determinada. A concentração celular é ajustada para 2x105/ml.

Aproximadamente 50 a 80 ml de sangue total extraído de doa- dores saudáveis são usados para isolamento de PBMC. 10 ml de sangue total são diluídos 1:3,6 com 26 ml de HBSS (Solução Salina Balanceada de Hanks s/ cálcio e magnésio) em um tubo de 50 ml. 18 ml de sangue total diluído é disposto sobre 12 ml de Lymphoprep (Nycomed Pharma) em um tubo de 50 ml e centrifugado em 370 χ g (1400 rpm) por 35 min. As células mononucleares da interface são aspiradas e lavadas primeiro com HBSS (750 χ g, isto é, 1900 rpm; 10 min), então uma segunda vez com HBSS (300 χ g, isto é, 1200 rpm; 10 min) e finalmente com HBSS (160 χ g, isto é, 900 rpm; 10 min). As células peletizadas são suavemente ressuspensas em meio de cultura/meio de ensaio (soro AB humano 10% inativado por calor em RPMI 1640 s/ L-glutamina) usando uma pipeta e a contagem celular é de- terminada no contador celular. A concentração de PBMC é ajustada a 1x107/ml. As PBMC recentemente isoladas (5x105/ml) são mantidas em meio de cultura (RPMI 1640 s/ L-glutamina suplementada com soro AB hu- mano 10%) em um frasco de cultura de tecido (75 cm2) a 37°C em uma in- cubadora de CO2 durante a noite. No dia seguinte, as células são estimula- das com hlL-2 em uma concentração final de 1 U/ml por 3 dias adicionais. PBMC estimuladas por IL-2 são separadas dos fragmentos celulares em um gradiente de Lymphoprep. PBMC estimuladas por IL-2 purificada são sus- pensas em meio de cultura/meio de ensaio em uma concentração de 1x107/ml. A cocultura de células efetoras com células-alvo na presença do anticorpo específico ou não-específico é realizada em duplicatas ou triplica- tas em placas de microtítulo 96 poços de fundo redondo em um volume final de 200 μΙ de meio de ensaio por poço consistindo de soro AB humano a 10% e BSA a 1% em RPMI em razão 1:1. Primeiro as células efetoras (célu- las PBMC recentemente isoladas em 100 μΙ de soro AB humano a 10% em RPMI por poço) são plaqueadas, seguido pelas células alvo e a solução de anticorpo diluída em 50 μΙ de BSA a 1% em RPMI. Como um controle, célu- las efetoras são cultivadas em meio de ensaio somente (células efetoras controle) e células alvo são cultivadas em meio de ensaio somente (lise es- pontânea) ou em meio de ensaio suplementado com Triton X-100 1% (lise máxima). A cocultura é incubada a 37°C em uma incubadora úmida de CO2 por 3 horas. No fim da incubação, as células são removidas do meio de cul- tura por centrifugação (200 χ g, isto é, 1000 rpm; 10 min) à temperatura am- biente. Sobrenadantes livres de célula (100 μΙ/poço) são transferidos em po- ços correspondentes de uma placa de 96 poços de fundo chato. Para deter- minar a atividade de LDH nestes sobrenadantes, 100 μΙ da mistura de rea- ção (recentemente misturado com 250 μΙ de catalisador com 11,25 ml de solução corante) são adicionadas a cada poço e incubadas 30 min à tempe- ratura ambiente no escuro. Então a absorvância é medida como descrito abaixo.

O Kit de Detecção de Citotoxicidade (LDH; Roche) é usado para medir a atividade de ADCC. A detecção da citotoxicidade é baseada na me- dida da atividade da enzima LDH liberada no plasma por células com mem- brana danificadas. LDH liberada nos sobrenadantes da cultura reduz o sal de tetrazólio do conjunto à formazana. A absorção máxima do corante for- mazana é medida em 490 nm contra um comprimento de onda de referência de 650 nm em um leitor de placa de ELISA. Para calcular a porcentagem de citotoxicidade mediada por célula, cinco controles são realizados em cada configuração experimental.

Controle de fundo I (1): Atividade de LDH contida no meio de ensaio, que é subtraído de valores (3) e (5). Controle de fundo Il (2): Atividade de LDH contida em Triton- X100 1 % em meio de ensaio, que é subtraído dos valores de liberação de LDH máximos (4).

Liberação de LDH espontânea (3): Atividade de LDH liberada das células alvo sozinhas.

Liberação de LDH máxima (4): Atividade de LDH liberável má- xima nas células alvo.

Célula efetora de controle (5): Atividade de LDH liberada por cé- lulas efetoras somente.

Para determinar a porcentagem de citotoxicidade mediada por célula, a absorvância média das triplicatas ou duplicatas é calculada e o fun- do é subtraído de acordo com instruções do fabricante. Na figura 5, os resul- tados de um ensaio de ADCC usando uma razão E:T de 25:1 e células-alvo Ramos são mostradas. Anticorpos são adicionados em uma concentração de 30 ng/ml. Ambos o mAb inicial e as versões humanizadas do mesmo exi- biram atividade de ADCC contra as células Ramos similar. Finalmente, a humanização de mAb A anti-CD37 não altera significativamente sua capaci- dade de induzir ADCC.

Exemplo 6

Atividade pró-apoptótica de versões humanizadas do mAb qui-

mérico AO

A atividade pró-apoptótica de mAb AO (=A) e versões humani- zadas do mesmo (B, C, D e I; ver Tabela 1) é avaliada pela medida de célu- las positivas para Anexina V/PI após incubação das células Ramos com mAbs. Células Ramos (linfoma de Burkitt; ATCC N0 CRL-1596) são recebi- das de ATCC. Células são cultivadas em frascos de cultura de tecido (175 cm2) usando RPMI-1640 + GIutaMAX suplementado com soro fetal bovino 10% inativado pelo calor, HEPES 12,5 mM, piruvato de sódio 1 mM, amino- ácidos não essenciais 1% em MEM como meio de cultura. Células são culti- vadas com uma densidade inicial de 3x105 células/ml a 37°C e CO2 5% em uma atmosfera úmida por três dias. As culturas são mantidas em uma con- centração celular entre 3x105 e 1,8x106/ml por subcultura em uma razão de 1:6 com meio de cultura fresco 2 a 3 vezes por semana. Uma alíquota da cultura celular em uma densidade celular entre 1,5x106/ml e 1,8x106/ml e crescendo na fase Iog é centrifugada (200 χ g, isto é, 1000 rpm) por 10 min. As células são lavadas uma vez com meio de lavagem (RPMI 1640 s/ L- glutamina) e precipitadas (200 χ g, isto é, 1000 rpm; 10 min). O precipitado celular é ressuspenso no meio de ensaio [BSA 1% em RPMI s/ L-glutamina] e a contagem celular é determinada. A concentração celular é ajustada para 1x106/ml. 100 μΙ da suspensão celular por poço são plaqueados em placas de 96 poços de fundo redondo. Os anticorpos são diluídos em meio de cultu- ra celular contendo SFB 10% e 100 μΙ de solução de anticorpo são adiciona- dos por poço. As células são incubadas de 20 a 24 horas a 37°C em incuba- dora de CO2 e após isso marcadas com o conjunto de ensaio de apoptose Vybrant N0 2. Anexina V marcada com Alexa Fluor 488 e solução de iodeto de propídeo são adicionados às células e incubados por 15 min no escuro. Após isso, as células são ressuspensas em 400 μΙ de tampão de ligação a- nexina V e submetido a análise por FACS usando um BD FACS Canto. A porcentagem de células Anexina V positivas/PI negativas e células Anexina V/PI positivas é determinada em gráfico de ponto bidimensionais usando os canais FL1/FL2. Um isotipo combinado que não se liga ao anticorpo (lgG1 humana Sigma) é usado como controle negativo.

Na Figura 6, o efeito pró-apoptótico de várias versões humani- zadas de mAb A em células Ramos é mostrado. As células são incubadas com o anticorpo em 10 μg/ml por 24 horas, a porcentagem total de células positivas para Anexina V (PI positiva e Pl negativa) é mostrada. mAb A pa- rental mostra potente atividade pró-apoptótica. Surpreendentemente, as ver- sões humanizadas mostram um número significativamente reduzido de célu- las positivas para Anexina V em comparação a mAb A parental, indicativo de atividade pró-apoptótica alterada dos anticorpos humanizados. Finalmente, a humanização de MAB A conduz a uma redução de sua atividade pró- apoptótica nesta configuração experimental.

Exemplo 7

Atividade de ADCC das versões de Fc engenheiradas de mAb AO quimérico

A atividade de ADCC das versões de Fc engenheiradas de mAb AO (designadas A1, A2, A3, A4; ver Tabela 2) é avaliada usando célu- las Ramos como células-alvo. O ensaio de ADCC é realizado como descrito acima (Exemplo 5). O resultado do experimento é mostrado na figura 7. As versões de Fc engenheirada de AO mostram claramente potência e eficácia melhoradas em comparação ao mAb AO parental. Certas variantes de Fc mostram melhora na Iise máxima de até 100% em comparação ao mAb pa- rental e melhora na EC5O de até 10 vezes em comparação ao mAb parental. Finalmente, a introdução de mutantes de Fc específicos aumenta fortemente a atividade de ADCC de mAb AO quimérico.

Exemplo 8

Atividade de ADCC das versões de Fc engenheirada de mAb BO

A atividade de ADCC das versões de Fc engenheirada de mAb BO (designadas B1, B2, B3, B4; ver Tabela 2) é avaliada usando células Ramos como células alvo. O ensaio de ADCC é realizado como descrito a- cima (Exemplo 5). As versões de Fc engenheirada de BO mostram claramen- te potência e eficácia melhoradas em comparação ao mAb BO parental. Cer- tas variantes de Fc mostram melhora na Iise máxima de até 80% em compa- ração ao mAb parental e melhora na EC5O de até de 20 vezes em compara- ção ao mAb parental. Finalmente, a introdução de mutantes de Fc específi- cos aumenta fortemente a atividade ADCC de mAb BO humanizado. Os re- sultados dos experimentos são mostrados na figura 8.

Exemplo 9

Atividade pró-apoptótica de mAbs AO e BO

A atividade pró-apoptótica de mAbs AO e BO em células Ramos antes e após ligação cruzada com mAb anti-lgG é mostrada na figura 9. O ensaio apoptótico é realizado como descrito no Exemplo 6, para a ligação cruzada ao anticorpo, um anticorpo anti-lgG humana (cadeia específica γ; Sigma) é adicionado aos anticorpos em uma razão de 1:1 e incubado por 15 min a 37°C antes da adição às células alvo. Na Figura 9, mAbs específicos para CD-37 são adicionados em uma concentração de 1 pg/ml com e sem ligação cruzada. mAb AO quimérico é um potente indutor de apoptose mes- mo sem ligação cruzada, este efeito é significativamente aumentado após ligação cruzada do mAb. Surpreendentemente, sem ligação cruzada, o mAb humanizado BO é completamente destituído de atividade pró-apoptótica, en- tretanto, mostra potente atividade pró-apoptótica após ligação cruzada com Ab anti-lgG. Finalmente, este experimento mostra que a atividade pró- apoptótica de uma versão humanizada de mAb AO pode ser restaurada após ligação cruzada a anticorpo.

Exemplo 10

Atividade pró-apoptótica das versões de Fc engenheirada de

mAb AO

A atividade pró-apoptótica das versões de Fc engenheirada de mAb AO quimérico em células Ramos é avaliada pela marcação Anexina V/PI como descrito no Exemplo 6. O anticorpo parental AO e variantes de Fc engenheirada A2 e A4 são tituladas em uma concentração na faixa de 0,1 a 10,000 ng/ml. Como pode ser visto na Figura 10, os 3 anticorpos mostram atividade pró-apoptótica similar. Finalmente, este experimento mostra que a Fc engenheirada do mAb AO não altera sua atividade pró-apoptótica.

Exemplo 11

a) Atividade de depleção de célula B de anticorpos de Fc enge- nheirada A2 e B2 em um ensaio de sangue total

A eficácia e a potência da depleção de células B normais do sangue humano são avaliadas usando um ensaio de sangue total. Neste formato de ensaio, o anticorpo de teste é adicionado a amostras tratadas com EDTA de sangue humano de indivíduos saudáveis e posteriormente, após 3 a 4 h de incubação a 37°C, o número de células B é quantitativamen- te medido por um ensaio de FACS de 4 cores. Pela comparação com tam- pão ou controles de IgG, o grau de depleção de célula B pelo agente teste pode ser calculado. Devido à presença de níveis de IgG humana e células efetoras similares à situação em seres humanos in vivo, este tipo de ensaio é considerado de alta relevância para predição do efeito dos anticorpos teste in vivo. Um ensaio de FACS quantitativo é usado para determinar o nú- mero de células B e/ou células Ramos apiciformes em amostras de sangue derivadas de indivíduos saudáveis. A quantificação é realizada usando tubos BD Trucount contendo um número conhecido de contas fluorescentes que servem como padrão interno para quantificação da população celular de in- teresse. Células B são identificadas pela análise de 4 cores usando 4 mar- cadores de CD diferentes (cD3/cD14/cD19/CD45) em combinação com aná- lise por FSC/SSC. 270 μΙ sangue fresco por poço é incubado em uma placa de 48 poço em conjunto com 30 μΙ de diluição de anticorpo (em PBS) ou PBS (tampão controle) em duplicatas. As amostras são incubadas por 4h a 37°C e após isso imediatamente colocadas em gelo. 33 μΙ de mistura master de CD marcador são adicionados aos tubos Trucount e 50 μΙ da mistura de sangue-anticorpo são adicionados. As amostras são vortexadas e incubadas por 15 min à temperatura ambiente. Após isso, 450 μΙ de tampão de Iise são adicionados, vortexados, e incubados por 15 min adicionais à temperatura ambiente. As amostras são colocadas em gelo e imediatamente submetidas à análise por FACS usando um Citômetro de Fluxo BD FACS Canto®. A avaliação dos dados é realizada usando o programa BD FACSDiva (Versão 5.0.2).

mAbs quiméricos e humanizados A2 e B2 de Fc engenheirada mostram excelente potência na depleção de célula B normal com valores de EC50 na faixa de 0,15 a 0,35 nM. O grau de depleção de célula B normal va- ria de 57% a 65%. Rituximab, um anticorpo registrado usado para o trata- mento de NHL-B, é testado em paralelo e produz depleção significativamen- te mais baixa de células B neste formato de ensaio (figura 11 A).

b) Engenharia de Fc introduz a atividade de depleção de célula B superior de AO e BO em comparação com Rituximab

O efeito de mAbs na depleção de célula B no sangue humano derivado de indivíduos saudáveis é avaliado como descrito em a). Os mAbs AO e BO com Fc não engenheirada mostram atividade de depleção de célula B na faixa de 13% a 26%, similar a Rituximab. Engenharia de Fc resulta em um aumento dramático da atividade de depleção de célula B para ambos os mAbs, com uma porcentagem média de depleção de 75%. Isto claramente demonstra a superioridade de A2 e B2 em comparação a Rituximab (figura 11 B).

c) Anticorpos A2 e B2 não depletam células T e monócitos em ensaios de sangue total

O efeito de A2 e B2 em linfócitos T (CD3-positivos) e monócitos (CD14-positivos) é avaliado em paralelo ao efeito sobre os linfócitos B. Ne- nhuma modificação significante de números de células T ou de números de monócito é observado, ao passo que uma redução significante do número de células B é vista (figura 11C). Isto indica que A2 e B2 especificamente deple- tam células B do sangue humano.

Exemplo 12

Engenharia de Fc introduz atividade de ADCC superior em comparação a Rituximab

A atividade de ADCC da versão A2 de Fc engenheirada de mAb AO é avaliada usando células Ramos como células alvo. O ensaio de ADCC é realizado como descrito acima (Exemplo 5). O anticorpo AO de Fc não engenheirada mostra uma Iise máxima de células alvo Ramos que é inferior a Rituximab, um anticorpo específico para CD20 que é um tratamen- to aprovado para pacientes sofrendo de Iinfomas de célula B. Surpreenden- temente, a engenharia de Fc de AO leva a uma potência e eficácia claramen- te melhoradas de A2 sobre Rituximab. Isto indica, que em densidades anti- gênicas similares de CD20 e CD37 em células Ramos, o mAb A2 anti-CD37 de Fc engenheirada mostra claramente atividade de ADCC melhorada em relação a Rituximab (figura 12).

Exemplo 13

Atividade de depleção de célula de Iinfoma de anticorpos A2 e B2 de Fc engenheirada em um ensaio de sangue total

A eficácia e a potência da depleção de células Ramos, uma li- nhagem celular de sangue humano derivada de Iinfoma de Burkitt é avaliada usando um ensaio de sangue total como descrito no Exemplo 11. Em uma modificação do ensaio, as células tumorais Ramos são apicíformes em apro- ximadamente um excesso de dez vezes em comparação com células B en- dógenas na matriz de sangue total, e sua depleção também é monitorada pela análise por FACS. mAbs quimérico e humanizado A2 e B2 de Fc enge- nheirada mostram boa potência na depleção de célula Ramos com valores de EC50 variando de 0,35 a 0,54 nM. O grau de depleção de célula Ramos varia de 36% a 55%. Rituximab, um anticorpo registrado usado para o trata- mento de NHL-B, é testado em paralelo e produz uma depleção significati- vamente menor de células Ramos neste formato de ensaio (figura 13).

Exemplo 14

Eficácia in vivo de anticorpos A2 e B2 de Fc engenheirada em modelo relacionado à doença

A eficácia antitumoral in vivo de mAbs A2 e B2 é avaliada usan- do um modelo de Iinfoma de Burkitt Ramos em camundongos nus. Células Ramos CD37-positivas são injetadas subcutaneamente no flanco dos ani- mais e o tratamento i.v. dos animais começou quando os tumores são esta- belecidos. Um esquema de tratamento de duas vezes por semana é escolhi- do (q3/4d), duas doses diferentes (8 mg/kg e 25 mg/kg) são testadas em paralelo. Ambos mAbs mostram significante eficácia antitumoral com valores T/C variando de 0,2% a 26%. Nenhuma diferença significante entre os dois níveis de dose e entre os dois anticorpos é observada. Entretanto, há uma tendência em direção à melhor eficácia nos animais tratados com alta dose de A2, com T/C de 0,2% e 5/10 regressões de tumor completas. Todos os tratamentos são bem tolerados sem perda de peso evidente. Finalmente, mAbs A2 e B2 mostraram significante eficácia antitumoral no modelo de Iin- foma de Burkitt Ramos, com a atividade máxima já obtida no nível de dose de 8 mg/kg. A atividade é comparável àquela de rituximab que é testado em paralelo. Foi observado que a atividade in vivo observada com os anticorpos A2 e B2 de Fc engenheirada pode ser subestimada uma vez que que estes mAbs são otimizados para interação com células efetoras humanas mas não murinas. Esta interação otimizada, que leva à atividade de ADCC fortemente melhorada in vitro usando células efetoras humanas (Exemplo 8), não é re- fletida no modelo de camundongo usado. Entretanto, os dados obtidos neste experimento (mostrado na figura 14) fornecem prova in vivo do conceito de ter como alvo CD37 e dessa forma pode ser usado para estimar a dose te- rapêutica em seres humanos.

Exemplo 15

Correlação do efeito farmacocinético e farmacodinâmico de A2 e

B2 em camundongos para estimar a dose terapêutica em seres humanos

Uma correlação entre as concentrações séricas de A2 e B2 ao seu efeito farmacodinâmico é estabelecida em camundongos usando mode- lo de enxerto tumoral Ramos. Estes estudos demonstram que uma dose de

A2 e B2 de 8 mg/kg (formulado em um tampão de citrato: Citrato de Na a 25 mM, NaCI a 115 mM, Tween 80 a 0,04%, pH 6,0) causa a significante retar- do do crescimento tumoral neste modelo tumoral agressivo s.c. (subcutâneo) usando um esquema de dosagem de anticorpo padrão q3 ou 4D em camun- dongos, dessa forma indicando atividade continuada ao longo do intervalo

de dosagem. Além disso, dados farmacocinéticos são estabelecidos para a mesma dose. Usando esta associação PK/PD em camundon-

gos, uma dose humana estimada pode ser calculada usando dados publica- dos para a depuração (CL) de anticorpos humanizados em seres humanos (Lobo et al, 2004).

Cálculo completo de A2:

• AUC(0-°°) média após dose única de 8 mg/kg = 6099

pgh/mL.

• Dada AUC(0-°°) em camundongos = AUC(ss,t) em ca- mundongos, e AUC(ss,t)/t = C(ave,ss).

· C(ave,ss) em camundongos (para τ = 84 horas) = 73

pg/mL, que é presumivelmente equivalente a C(ave,ss) em homens (para τ = 168h).

• Uma vez que AUC(ss,t) em homens = D/CL, e usando a depuração do anticorpo humanizado (CL) varia em humanos relatado por

Lobo et al, 2004.: CL = 7 mL/h/70 kg a 15 mL/h/70 kg.

• Para 7 mL/h/70 kg: 168 h χ 7 = 1176 mL χ 73 pg = 86 mg. • Para 15 mL/h/70 kg: 168 h χ 15 = 2520 mL χ 73 pg = 184 mg.

Por isso, para A2, a dose semanal estimada para um ser hu- mano de 70 kg está na faixa de 86 a 184 mg. Usando as mesmas suposi- ções como descrito acima, a dose semanal humana estimada calculada de B2 para um ser humano de 70 kg é 189 a 404 mg.

Exemplo 16

Anticorpos A2 e B2 mostram a atividade de ADCC sobre células de mieloma múltiplo

A expressão de CD37 em um painel de linhagens celulares de mieloma múltiplo é avaliada pela análise por FACS usando anticorpos espe- cíficos para CD37. As células são incubadas com um anticorpo anti-CD37 diretamente fluorescentemente marcado ou um anticorpo específico para CD37 não marcado seguido por um segundo anticorpo marcado fluorescen- temente direcionado contra o anticorpo primário. A atividade de fluorescên- cia das células marcadas é medida com um Citômetro de Fluxo FACS Canto (BD Biosciences) e intensidade de fluorescência é registrada como MFI u- sando o programa FACS Diva. 6 de 11 mielomas múltiplos testados demons- tram expressão na superfície celular de CD37 (figura 15). Uma linhagem ce- lular (RPMI 8226) é posteriormente testada em um ensaio de ADCC como descrito no Exemplo 5 usando anticorpos específicos para CD-37 A2 e B2. Ambos os anticorpos demonstram atividade de ADCC potente em células RPMI 8226 com valores de EC50 na faixa de 25 ng/ml e uma Iise celular má- xima de aproximadamente 20% (figura 16). Este exemplo demonstra que células de mieloma múltiplo CD37-positivas são suscetíveis à Iise celular mediada por ADCC usando os mAbs A2 e B2 específicos para CD37.

A figura 15 mostra que análise por FACS de seis linhagens celu- lares derivadas de mieloma múltiplo para expressão de CD37. As curvas abertas indicam reatividade com o anticorpo específico para CD37, as cur- vas cheias representam o anticorpo de controle negativo.

Exemplo 17

Atividade pró-apoptótica de anticorpos A2 e B2 em células deri- vadas de paciente com CLL

A atividade pró-apoptótica de A2 e B2 é avaliada em células de leucemia linfocítica crônica (CLL) derivadas de paciente. Células mononu- cleares do sangue periférico (PBMCs) são preparadas a partir de um pacien- te com CLL diagnosticada, após consentimento informado de acordo com a declaração de Helsinki ter sido obtida. As células de CLL primária são purifi- cadas do sangue recentemente coletado de acordo com o procedimento de Ficoll-Paque® plus (StemCeII Technologies, Meylan1 France) e armazenadas a 4°C em meio de cultura RPMI 1640 contendo soro AB humano inativado pelo calor 10% (Sigma, France) até uso. Meio de cultura das células de CLL primária é RPMI 1640 suplementado com L-glutamina a 2 mM e soro AB humano inativado pelo calor a 10%. Para uso experimental, células CLL pri- márias são contadas em um hemocitômetro e sua viabilidade é avaliada por exclusão por azul de tripan a 0,25%. A viabilidade das amostras de CLL é mais de 90%. As células são incubadas a 37°C por 24 horas com os anticor- pos a 30 pg/ml e após isso, a porcentagem de células positivas para Anexi- na V é determinada como descrito no Exemplo 6. Como mostrado na figura 17, anticorpos A2 e B2 de Fc engenheirada mostram forte atividade pró- apoptótica sobre as células de CLL primária com aproximadamente 90% (A2) e 40% (B2) células positivas para Anexina V. Ambos os mAbs são cla- ramente superiores ao rituximab, um anticorpo específico para célula B a- provado para o tratamento de NHL-B. Mab A2 também demonstra atividade claramente superior em comparação a alemtuzumabe, um anticorpo aprova- do para o tratamento de CLL-B.

Exemplo 18

Geração de um modelo de camundongo transgênico no qual o gene CD37 endógeno é substituído por seu homólogo humano

Um vetor de direcionamento é construído o qual contém a se- qüência de codificação de CD37 humano (BAC (cromossomo artificial bacte- riano) IDs: RP11-433N13, RP11-50111) flanqueado por seqüências não- traduzidas. Este vetor de direcionamento (que contém, além disso, sítios IoxP flanqueando os éxons 3 a 4 e o marcador de seleção neo flanqueado por sítios frt) então é usado para recombiriação homóloga, usando células ES de camundongo e tecnologia-padrão para substituição dos éxons 1 a 8 da seqüência genômica do camundongo com seqüências equivalentes hu- manas. Para este fim, a linhagem celular C57BL/6N ES é cultivada na ca- mada alimentadora inativada mitoticamente compreendida de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) no meio DMEM de Alta Glicose con- tendo FBS a 20% (PAN) e 1200 U/mL de Fator Inibitório de Leucemia (Milli- pore ESG 1107). 1x107 células e 30 g do vetor de DNA Iinearizado são ele- troporados (Biorad Gene Pulser) a 240 V e 500 F. A seleção por G418 (200 g/mL) começou em d2. Contrasseleção com Gancyclovir (2 M) começa em d5 após eletroporação. Os clones de ES são isolados em d8 e analisados por Southern Blotting de acordo com procedimentos padrão, por exemplo, pelo uso de sondas de DNA radiomarcadas específicas para o gene alvo após expansão e congelamento dos clones em nitrogênio líquido. Os ani- mais transgênicos então são gerados por procedimentos-padrão conhecidos na técnica, por exemplo, por injeção do blastocisto e subsequente geração de animais quiméricos. Animais heterozigotos e homozigotos para CD37 humano são obtidos por melhoramento convencional de animais quiméricos e heterozigotos, respectivamente. A inativação bem sucedida do gene CD37 murino e a ativação do gene CD37 humano é monitorado no nível proteico usando procedimentos padrão, por exemplo, análise por FACS de linfócitos do sangue periférico ou análise por imunohistoquímica de seções de tecido.

Exemplo 19

Geração de anticorpos substitutos

Os anticorpos monoclonais específicos para CD37 de macaco são gerados por imunização genética de camundongos e coelhos usando a seqüência de codificação completa do antígeno CD37 de macaco (Número de acesso ENSMMUT00000020744). Os anticorpos específicos são selecio- nados usando células HEK293 ou CHO recombinantes expressando o antí- geno CD37 de macaco, por exemplo, por técnicas-padrão ELISA ou FACS. As seqüências de codificação de cadeia variável pesada e leve destes anti- corpos são recuperadas pela clonagem por PCR e usadas para a geração de anticorpos quiméricos (como descrito no Exemplo 1) que abrigam a regi- ão VH e VL derivada do anticorpo inicial murino ou de coelho e a porção de Fc idêntica àquela de um anticorpo da invenção, por exemplo, A2 ou B2. As propriedades de ligação e funcionais podem ser investigadas pelo uso de sistemas de ensaio que utilizam células expressando CD37 de macaco co- mo células-alvo, por exemplo, por ensaios de ligação, FACS, análise por Scatchard, ADCC e apoptose. Enfim, o anticorpo substituto é selecionado em virtude de sua atividade de depleção de célula B no sangue de macaco Cinomolgus in vitro.

Exemplo 20

Preparação de clones para produção de anticorpos A fim de preparar clones para produção de anticorpos da in- venção, por exemplo, anticorpos A2, A4, B2 ou B4, a molécula de DNA que codifica a cadeia pesada completa, por exemplo, com a seqüência mostrada nas SEQs ID NO: 27, 31, 35 ou 39, respectivamente, é inserida no vetor de expressão eucariótica designado pBI-26, que codifica ainda o marcador de seleção redutase dihidrofolato de hamster.

A molécula de DNA que codifica a cadeia leve completa, repre- sentada nas SEQs ID NO: 29, 33, 37 e 41, respectivamente, é inserida em vetor de expressão eucariótica designado pBI-49, que codifica ainda o mar- cador de seleção fosfotransferase neomicina. As seqüências de DNA das cadeias pesada e leve inteiras são completamente sequenciadas.

A linhagem celular CHO-DG44 de hamster, cultivada em sus- pensão em meios quimicamente definidos, é cotransfectada com vetores de expressão eucariótica para a cadeia pesada e leve dos anticorpos, como descrito acima. As células transfectadas são selecionadas em meio sem hi- poxantina e timidina e na presença do antibiótico G418. Posteriormente, as células são submetidas à seleção e amplificação graduais usando concen- trações crescentes de metotrexato (MTX). Na etapa de amplificação de MTX 800 nM, um único clone celular é selecionado com base no desempenho de crescimento e produção de anticorpo em corridas giratórias, e é criopreser- vado em um Banco Celular de Segurança (SCB). BIBLIOGRAFIA

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Claims

1. Molécula de anticorpo que se liga a CD37 humano e que é derivada de a) um anticorpo monoclonal murino que é definido por i) uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2; e ii) uma cadeia leve variável compreendendo a seqüência de a- minoácido mostrada na SEQ ID NO:4, ou de b) um anticorpo não-humano que reconhece o mesmo epitopo de CD37 humano que o anticorpo definido em a) ou que reconhece um epi- topo que está próximo ou sobreposto ao dito epitopo; em que a dita molécula de anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.

2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo quimérico definido por i) uma cadeia pesada variável compreendendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2; ii) uma cadeia leve variável compreendendo a seqüência de a- minoácido mostrada na SEQ ID NO:4, iii) as cadeias pesadas e leves constantes que são de origem humana.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, em que i) a cadeia pesada constante é uma cadeia IgGI, e ii) a cadeia leve constante é uma cadeia kappa.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, em que a dita cadeia pesada constante i) compreende a seqüência de aminoácido mostra- da na SEQ ID NO:24 e em que a dita cadeia leve constante ii) compreende a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO:26.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que é um anti- corpo humanizado definido por a) CDRs contidas dentro da cadeia pesada variável como mos- trado na SEQ ID NO:2, b) CDRs contidas dentro da cadeia leve variável como mostrado na SEQ ID NO:4, c) suporte das estruturas das ditas CDRs que são derivadas de um anticorpo humano, d) as cadeias pesadas e leves constantes que são de um anti- corpo humano.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, compreendendo uma cadeia pesada variável com uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:6.

7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, compreendendo uma cadeia leve variável com uma seqüência mostrada nas SEQ ID NO: 12, 15 14, 16, 18, 20 ou 22.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, compreendendo uma cadeia pesada variável com uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:8.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, compreendendo uma cadeia leve variável com uma seqüência mostrada nas SEQs ID NO: 12, 20 14, 16, 18, 20 ou 22.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, compreendendo uma cadeia pesada variável com uma seqüência mostrada na SEQ ID N0:10.

11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, compreenden- do uma cadeia leve variável com uma seqüência mostrada nas SEQs ID NO:12, 14, 16, 18, 20 ou 22.

12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o dito anticorpo tem uma ou mais mutações no domínio Fc que modulam uma ou mais funções efetoras.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, em que a dita modulação da função efetora é um aumento na citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo.

14. Anticorpo de acordo com as reivindicações 12 e 13, em que uma ou mais ditas mutações no domínio Fc é uma substituição única na po- sição 332, numerada de acordo com o índice de numeração de EU Kabat.

15. Anticorpo de acordo com as reivindicações 12 e 13, em que uma ou mais ditas mutações no domínio Fc é uma combinação de substitui- ções nas posições 239 e 332, numeradas de acordo com o índice de nume- ração de EU Kabat.

16. Anticorpo de acordo com as reivindicações 12 e 13, em que uma ou mais ditas mutações no domínio Fc é uma combinação de substitui- ções nas posições 236 e 332, numeradas de acordo com o índice de nume- ração de EU Kabat.

17. Anticorpo de acordo com as reivindicações 12 e 13, em que uma ou mais ditas mutações no domínio Fc é uma combinação de substitui- ções nas posições 236, 239 e 332, numeradas de acordo com o índice de numeração de EU Kabat.

18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que as ditas substituições são I332E, S239D e G236A.

19. Anticorpo que se liga a CD37 humano e tem uma cadeia pe- sada compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:28.

20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 19, que tem uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N0:30.

21. Anticorpo que se liga a CD37 humano e tem uma cadeia pe- sada compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:36.

22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, que tem uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:38.

23. Anticorpo que se liga a CD37 humano e tem uma cadeia pe- sada compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:32.

24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, que tem uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:34.

25. Anticorpo que se liga a CD37 humano e tem uma cadeia pe- sada compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N0:40.

26. Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, que tem uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:42.

27. Molécula de DNA compreendendo uma região que codifica a cadeia pesada variável de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

28. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 27, em que a região de codificação de dita cadeia pesada variável é fundida a uma regi- ão que codifica uma cadeia pesada constante de origem humana.

29. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 28, em que a dita cadeia pesada constante humana é lgG1.

30. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 29, em que a dita IgGI é codificada por uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:23.

31. Molécula de DNA de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 28 a 30, em que a dita cadeia pesada constante humana tem uma ou mais substituições na região Fc como definidas em qualquer uma das reivin- dicações 14 a 18.

32. Molécula de DNA compreendendo uma região que codifica a cadeia leve variável de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

33. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 32, em que a região de codificação da dita cadeia leve variável é fundida a uma região que codifica uma cadeia leve constante de origem humana.

34. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 33, em que a dita cadeia leve constante é uma cadeia kappa.

35. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 34, em que a dita cadeia leve kappa é codificada por uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:25.

36. Vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA como definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 31, e/ou uma molé- cula de DNA como definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 35.

37. Célula hospedeira que carrega um ou mais vetores como definidos na reivindicação 36.

38. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 37, que carrega um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA co- mo definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 31, e um segundo vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA como definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 35.

39. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 37, que é uma célula mamífera.

40. Método para produzir um anticorpo como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 26, compreendendo transfecção de uma célula hospedeira mamífera com um ou mais vetores como definidos na rei- vindicação 36, cultura da célula hospedeira e recuperação e purificação da molécula de anticorpo.

41. Composição farmacêutica compreendendo, como o ingredi- ente ativo, uma ou mais moléculas de anticorpo anti-CD37 como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, e um veículo farmaceuticamen- te aceitável.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, compreendendo ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42, em que um ou mais ditos agentes terapêuticos adicionais são selecionados a partir de agentes que têm como alvo um antígeno de célula B exceto CD37.

44. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 43, em que o dito antígeno de célula B é CD20.

45. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42, em que um ou mais ditos agentes terapêuticos adicionais são selecionados a partir de agentes que induzem apoptose.

46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45, em que o dito agente é um modulador de um receptor TRAIL.

47. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindica- ções 41 a 46 para depletar células B que expressam CD37 em sua superfí- cie.

48. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 47, para o tratamento de malignidades de célula B.

49. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 48, em que a dita malignidade de célula B é selecionada a partir de Iinfoma não- Hodgkins de célula B, leucemia linfocítica crônica de célula B e mieloma múl- tiplo.

50. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 47, para o tratamento de doenças autoimunes ou inflamatórias que envolvem células B em sua patologia.

51. Método de depleção de células B que expressam CD37 a partir de uma população de células, compreendendo administração à dita população de células de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 26, ou uma composição farmacêutica con- tendo tal molécula de anticorpo.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, que é realizado in vitro.

53. Método para tratar um paciente sofrendo de uma malignida- de da célula B selecionada a partir de Iinfoma não-Hodgkins de célula B, leucemia linfocítica crônica de célula B e mieloma múltiplo, compreendendo administração ao dito paciente de uma quantidade eficaz de uma composi- ção farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.