BRPI0807177A2

BRPI0807177A2 - Dispositivo de enxerto de tecido tubular e métodos de preparação do mesmo e de bypass cardíaco

Info

Publication number: BRPI0807177A2
Application number: BRPI0807177-2A
Authority: BR
Inventors: El-Kurdi Mohamed; Hong Yi; Soletti Lorenzo; J. Stankus John; A. Vorp David; R. Wagner William
Original assignee: University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2014-05-27
Also published as: CN101663001A; US20080208323A1; JP2014221394A; US9333068B2; EP2111185A4; BRPI0807177B1; EP2111185B1; WO2008094971A3; CN105343932A; JP2010516437A; AU2008210523B2; CA2677033A1; AU2008210523A1; US20150150673A1; JP5950966B2; CA2677033C; US9237945B2; KR101719081B1; KR20150067388A; WO2008094971A2

Description

“Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular e Métodos de Preparação do Mesmo e de Bypass Cardíaco”

Relatório Descritivo

A doença de artéria coronária, que leva ao infarto do mio- cárdio e isquemia, é atualmente a causa número um de morbidez e de mortalidade no mundo. As alternativas de tratamento atuais consistem em angioplastia transluminal percutânea, uso de stents e enxerto de bypass (de ponte) da artéria coronária (CABG). O CABG pode ser executado usando tanto canais arteriais como venosos e é o tratamento IO mais efetiva e largamente usado para combater a estenose arterial coronária, com quase 500.000 procedimentos sendo realizados anual- mente. Além disso, há aproximadamente 80.000 cirurgias de bypass de extremidade inferior realizadas anualmente. O canal venoso usado para os procedimentos de bypass é mais frequentemente a veia de safena autógena e permanece o enxerto de escolha para 95% de cirurgi- ões que efetuam estes procedimentos de bypass. De acordo com a American Heart Association, em 2004 existiam 427.000 procedimentos de bypass executados em 249.000 pacientes. O resultado de longo prazo destes procedimentos é limitado devido à oclusão do vaso de enxerto ou do local anastomótico como resultado da hiperplasia intimai (IH), que pode acontecer ao longo de uma moldura temporal de meses até anos.

O desenvolvimento de enxertos vasculares de pequeno diâ- metro bem sucedidos projetados com tecido ou sinteticamente tem 25 ainda que ser alcançado e o uso de enxertos arteriais (mamários inter- nos, radiais ou artérias gastroepiplóicas, por exemplo) é limitado pelo pequeno tamanho, pequeno diâmetro e disponibilidade destes vasos. Apesar de seu largo uso, a falha de enxertos de veia arterial (AVGs) permanece um problema importante: 12% a 27% dos AVGs ficam 30 ocluídos no primeiro ano com uma taxa oclusiva anual subsequente de 2% a 4%. Os pacientes com AVGs que falharam morrerão ou exigem nova operação.

A IH responde por 20% a 40% de todos as falhas de AVG dentro dos primeiros 5 anos. Vários estudos determinaram que a IH 5 desenvolve-se, até certo ponto, em todos os AVGs maduros e isto é considerado por muitos como uma resposta inevitável da veia ao enxer- to. A IH é caracterizada por modulação fenotípica, seguida por de- adesão e migração de células de músculo liso (SMCs) mediais e adventi- ciais e miofibroblastos para a íntima onde elas se proliferam. Em IO muitos casos, esta resposta pode levar à estenose e ao fluxo de sangue diminuído através do enxerto. Pensa-se que a IH pode ser iniciada pela exposição abrupta das veias ao ambiente mecânico dinâmico da circu- lação arterial.

Os segmentos de veia transpostos à circulação arterial para uso como enxertos de bypass são expostos ao fluxo de sangue aumen- tado e à pressão intraluminal (Porter KE, Nydahl S, Dunlop P, Varty K, Thrush AJ e Londres NJ). The development of an in vitro flowmodel of human saphenous vein graft hiperplasia intimai Cardiovasc Res. 1996; 31(4): 607-14) e ao movimento cíclico de parede (incluindo curvatura, torção e estiramento) devido a sua ligação ao coração que bate no caso de CABGs (Vorp DA, Seveiyn DA, Corcel DL e Webster MW. A device for the application of cyclic twist and extension on perfused vascular seg- ments. Am J Physiol. 1996; 270(2 Pt 2): H787-95). Uma vez que as veias são de paredes muito mais finas e são mais frágeis que as arté- rias, elas experimentam tensões significativamente maiores no circuito arterial do que aquelas com as quais elas estão acostumadas no circui- to venoso. Realmente, Liu e Fung mostraram que a tensão de parede circunferencial (CWS) média num AVG imediatamente ao restabelecer o fluxo arterial poderia ser de 140 vezes mais do que aquela numa veia sob circunstâncias normais (Fuchs JC, Mitchener JS e Hagen PO. Post- operative changes in autologous vein grafts. Ann Surg. 1978; 188(1): 1- 15). Este aumento dramático em CWS é devido ao AVG ser expandido para seu diâmetro máximo sob pressão arterial. O tecido responde a este dano visível tornando-se espesso, o que se acredita ser uma tenta- tiva de retornar a tensão para níveis venosos. Todavia, esta resposta é 5 descontrolada e pode supercompensar, levando à estenose em vez do desejado espessamento ou “arterialização” do segmento de veia.

Foi sugerido que a resposta hiperplástica por AVGs seja um resultado direto de um “choque celular” que acontece como resultado de sua exposição abrupta ao ambiente biomecânico arterial (Angelini GD e IO colaboradores. Distention promotes platelet and leukocyte adhesion and reduces short-term desobstrucion in pig arteriovenous bypass grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 1990; 99(3): 433-9; Campbell PA e colabora- dores. Vein grafts for arterial repair: Their success and reasons for failure. Ann R Coll Surg Engl 1981; 63(4): 257-60; Campeau L LJ e colaboradores. Natural history of saphenous vein aortocoronary bypass grafts. Mod Concepts Cardiovase Dis. 1984; 53:59-63; Fuchs JC, Mitchener JS e Hagen PO. Post-operative changes in autologous vein grafts. Ann Surg. 1978; 188(1): 1-15; Huynh TT e colaboradores. Alterations in wall tension and shear stress modulate tyrosine kinase signaling and wall remodeling in experimental vein grafts. J Vase Surg. 1999; 29(2): 334-44; Liu SQ e colaboradores. Changes in the organiza- tion of the smooth musele eells in rat vein grafts. Ann Biomed Eng. 1998; 26(1): 86-95; Ramos JR e colaboradores. Histologie fate and endothelial changes of distended and nondistended vein grafts. Ann Surg. 1976; 183(3): 205-28; Resnick N e Gimbrone MA. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The Faseb J. 1995; 9(10): 874-82; Sumpio B. Hemodynamic forces and vascular cell biology. Austin: R.G. Landes Company. 1993; Szilagyi DE e colaboradores. Biologic fate of autogenous vein implants as arterial substitutes: Clinicai, angiographic and histopathologic observations in femoro-popliteal operatinos for atherosclerosis. Ann Surg. 1973; 178(3): 232-46; e Zwolak RM e colaboradores. Kinetics of vein graft hyperpla- sia: Assoeiation with tangential stress. Jomal of Vascular Surgery: Official Publication, the Society For Vascular Surgery [and] International Society For Cardiovascular Surgery. North American Chapter. 1987;

5 5(1): 126-36). Prevenir a distensão aguda de AVGs adicionando-se um suporte (ou revestimento) estrutural externo aparentemente melhorou a desobstrução de enxertos de veia (Huynh TT e colaboradores. J Vasc Surg. 1999;29(2): 334-44; Cabrera Fischer EI e colaboradores. Reduced elastic mismatch achieved by interposing vein cuff in expanded polytetra- IO fluoroethylene femoral bypass decreases Hiperplasia Intimai Artif Organs. 2005; 29(2): 122-30; Ducasse E e colaboradores. Interposition vein cuff and Hiperplasia íntimal: An experimental study. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2004; 27(6): 617-21; Huynh TT e colaboradores. Externai support modulates g protein expression and receptor coupling in 15 experimental vein grafts. Surgery. 1999; 126(2): 127-34; Jeremy JY e colaboradores. A bioabsorbable (polyglactin), nonrestrictive, externai shealth inhibits porcine saphenous vein graft thickening. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004; 127(6): 1766-72; Karayannacos PE e colabora- dores. Late failure in vein grafts: Mediating factors in subendothelial 20 fibromuscular hyperplasia. Ann Surg. 1978; 187(2): 183-8; Kohler TR e colaboradores. The effect of rigid support on vein graft adaptation to the arterial circulation. J Vasc Surg. 1989; 9(2): 277-85; Liu SQ e colabora- dores. Partial prevention of monocyte and granulocyte activation in experimental vein grafts by using a biomechanic engineering approach. J 25 Biomech. 1999; 32(11): 1165-75; Liu SQ e colaboradores. A possible role of initial cell death due to mechanical stretch in the regulation of subsequent cell proliferation in experimental veisn grafts. Biomech Model Mechanobiol 2002; 1(1): 17-27; Mehta D e colaboradores. Externai stenting reduces long-term mediai and neoíntimal thickening and platelet 30 derived growth factor expression in a pig model f arteriovenous bypass grafting. Nat Med. 1998; 4(2): 235-9; Parsonnet V e colaboradores. New stent for support of veins in arterial grafts. Arch Surg. 1963; 87:696-702; Vijayan V e colaboradores. Long-term reduction of mediai and intimai thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable externai sheath. J Vasc Surg. 2004; 40(5): 1011-9; e Vijayan V e colaboradores. Externai support and the prevention of 5 neointima formation in vein grafts. Eur J Vasc Endovase Surg. 2002; 24(1): 13-22). Todavia, devido a uma ou mais limitações fundamentais, estas abordagens prévias não resultaram num meio clinicamente viável para melhorar a desobstrução de AVG. Todas estas abordagens prévias utilizaram coberturas/ revestimentos posicionados de modo adventicial IO que eram bioduráveis e/ou de ajuste folgado.

O Papel da Biomecânica no Desenvolvimento de Hiperplasia Intimai

A IH é definida por um aumento na espessura da camada interna de um vaso sanguíneo, tipicamente como um resultado de um número e/ou tamanho aumentados de células na íntima, seguido pela deposição de quantidades volumosas de ECM por estas células. As células que contribuem para esta resposta são predominantemente SMCs de origem mediai e adventicial. A IH acontece tanto fisiologica- mente durante o desenvolvimento como no fechamento do ductus arteriosus quanto patologicamente como um resultado de dano vascu- lar. Pensa-se que a IH de AVG pode ser iniciada pela exposição abrupta das veias ao ambiente mecânico dinâmico da circulação arterial (Dobrin PB, Littooy FN e Endean ED. Mechanicfactors predisposing to Hiperpla- sia Intimai and mediai thickening in autogenous veis grafts. Surgery 1989; 105(3): 393-400). Todavia, enquanto maiores níveis de CWS têm sido mostrados para promover a formação de IH (Huynh TT, Davies MG, Trovato MJ, Svendsen E e Hagen PO. Alterations in wall tension and shear stress modulate tyrosine kinase signaling and wall remodeling vein grafts. J Vasc Surg. 1999; 29(2): 334-44 e Gusic RJ, Myung R, Petko M, Gaynor JW e Gooch KJ. Shear stress and pressure modulate saphenous vein remodeling ex vivo. J Biomech. 2005; 38(9): 1760-9), níveis elevados de tensão de cisalhamento tendem a modulá-la (Huynh TT, Davies MG, Trovato MJ, Svendsen E e Hagen PO. Alterations in wall tension and shear stress modulate tyrosine kinase signaling and wall 5 remodeling in experimental vein grafts. J Vasc Surg. 1999; 29(2): 334- 44; Gusic RJ, Myung R, Petko M, Gaynor JW e Gooch KJ. Shear stress and pressure modulate saphenous vein remodeling ex vivo. J Biomech. 2005; 38(9): 1760-9; Goldman J, Zhong L e Liu SQ. Negative regulation of vascular smooth muscle cell migration by blood shear stress. Am J IO Physiol Heart Circ Physiol. 2006; Jiang Z, Berceli SA, Pfahnl CL, Wu L, Goldman D, Tao M, Kagayama M, Matsukawa A e Ozaki CK. Wall shear modulation of cytokines in early veis grafts. J Vasc Surg. 2004; 40(2): 345-50; Jiang Z, Wu L, Miller BI, Goldman DR, Fernandez CM, Abou- hamze ZS, Ozaki CK e Berceli SA. A novel vein graft model: Adaptation 15 to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 2004; 286(1): H240-5 e Morinaga K, Oka- dome K, Kuroki M, Miyazaki T, Muto Y e Inokuchi K. Effect of wall shear stress on intimai thickening of arterially transplanted autogenous veins in dogs. J Vasc Surg. 1985;2(3): 430-3). Estes dois fatores 20 biomecânicos, que aparentemente causam respostas hiperplásticas opostas por AVGs, foram cuidadosamente explorados por Dobrin e colaboradores, que mostraram que o estiramento circunferencial aumentado tem um papel mais significativo em promover o espessa- mento intimai do que a tensão de cisalhamento aumentada tem em 25 prevenir isto (Dobrin PB, Littooy FN e Endean ED. Mechanicalfactors prdisposing to Hiperplasia Intimai and mediai thickening in autogenous vein grafts. Surgery. 1989; 105(3): 393-400). Noutro estudo que motiva este trabalho, Zwolak e colaboradores sugeriram um papel regulatório para a força biomecânica de parede na arterialização de 30 AVGs (Zwolak RM, Adams MC e Clowes AW. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangencial stress. Journal of Vacular Surgery: Official Publieation, the Society For Vascular Surgery [and] International Society For Cardiovascular Surgery, North American Chap- ter. 1987; 5(1): 126-36). Jiang e colaboradores demonstraram que maior tensão de cisalhamento de parede, na ausência de um aumento na força de parede, reduziu a resposta hiperplástica em AVGs (Jiang Z, 5 Wu L, Miller BL, Goldman DR, Femandez CM, Abouhamze ZS, Ozaki CK e Berceli SA. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 2004; 286(1): H240- 5). O trabalho in vivo de Liu e colabo- radores mostrou que, reduzindo o nível de CWS em AVGs, por meio da IO colocação de um revestimento de politetrafluoretileno permanente, pode ser reduzida a resposta hiperplástica (Cabrera Fischer EI, Bia Santana D, Cassanello GL, Zocalo Y, Crawford EV, Casas RF e Armentano RL. Reduced elastic mismatch achieved by interposing vein cuff in expanded polytetraftuoroethylene femoral bypass decreases Hiperplasia Intimai. 15 Artif Organs. 2005; 29(2): 122-30; Liu SQ, Moore MM, Glucksberg Sr, Mockros LF, Grotberg JB, e Mok AP. Partial prevention of monocyte and granulocyte activationd in experimental vein grafts by using a biome- chanic engineering approach. J Biomech. 1999; 32(11): 1165- 75 e Liu SQ, Ruan YY, Sabor D, Li YC, Goldman J e Zhong L. A possible role of 20 initial cell death due to mechanicál stretch in the regulation of subsequent cell proliferation in experimental vein grafts. Biomech Model Mechanobiol. 2002; 1(1): 17-27). É claro a partir destes estudos prévios que o ambien- te biomecânico de um AVG desempenha um papel significativo no desenvolvimento de IH. Em particular, o CWS parece regular a forma- 25 ção de IH e controlar isto foi o enfoque da abordagem descrita neste estudo.

Processos Moleculares e Celulares Associados à Hiperplasia Intimai

Uma vez que o dano é percebido por uma veia, a resposta hiperplástica é colocada em movimento e pode ser descrita por cinco distintos, mas inter-relacionados, processos de célula: 1) Modulação Feno típica de SMCs adventiciais e mediais de um estado contrátil e quiescente com baixo potencial proliferativo para um estado sintético com alto potencial proliferativo; 2) De-adesão de SMCs ou alteração de adesões focais com outras células e com o ECM; 3) Migração de SMCs das camadas exteriores pela membrana basal para a íntima, o que exige o rejuntamento seletivo de adesões focais que permitem que a célula “caminhe” ao longo do ECM; 4) Proliferação; e 5) Remodelagem do tecido, refletindo as mudanças na composição de ECM causada pelas IO SMCs sintéticas que secretam colágeno, elastina, fibronectina etc., como também enzimas de degradação da matriz tais como as várias metaloproteinases da matriz (MMPs). A fim de inibir os eventos de iniciação de IH de AVG, é provável que uma pessoa deva levar em conta cada um destes cinco processos. Uma representação esquemática da cadeia de eventos associados com a IH é mostrada na Figura 1.

Modulação Fenotípica

A modulação de Fenótipo de SMCs é uma característica proeminente na patogênese da IH. Placas abundantes com SMCs modificadas foram encontradas na íntima tão cedo quanto a segunda semana depois do enxerto. As SMCs adultas completamente diferenci- adas demonstram baixa modificação como demonstrado por baixas taxas de proliferação e de apoptose. Todavia, 48 horas depois do dano arterial, 15-40% de SMCs são mitóticas. Esta abrupta mudança na funcionalidade é relacionada ao fato que as SMCs podem existir num espectro de fenótipos, que abrange desde completamente sintético até completamente contrátil. As SMCs sintéticas respondem aos sinais regulatórios e às citocinas e são capazes de movimento de ECM bem como de produção de fator de crescimento. Por outro lado, as SMCs contráteis respondem aos sinais vasomotores e controlam o tônus do vaso. Os AVGs exibem formação neointimal dentro dos primeiros dois meses pela migração e proliferação de SMCs sintéticas e pela acumula- ção de ECM subsequente, sutentado, incluindo a produção de colágeno tipo I, na presença prolongada das SMCs do tipo dediferenciado.

O estado fenotípico das SMCs é regulado pelo menos em parte por forças mecânicas, como demonstrado pela observação que o estiramento cíclico induz uma modulação dependente de substrato da proliferação e da expressão de h-caldesmon in vitro. Estudos in vivo também mostraram a importância de dano mecânico nas SMCs fenotí- picas. A lesão de inflação de balão nos meios foi mostrada para promo- ver a síntese de ECM por SMCs como também para diminuir o conteúdo IO de alfa actina. Vários relatórios mostraram que as SMCs neointimais de veias transpostas para a circulação arterial são fenotipicamente altera- das, apoiando a noção de que a mudança do ambiente venoso para o arterial dispara a alteração fenotípica. Maior evidência vem de estudos de cultura de órgão ex vivo onde, por exemplo, descobriu-se que o estiramento cíclico foi necessário para manter a função contrátil de SMCs em culturas de veias portas de rato. Goldman e colaboradores expuseram a veia cava de rato a pressões arteriais (Goldman J, Zhong L e Liu SQ. Degradation of alpha-actin filaments in venous smooth muscle cells in response to mechanical stretch. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 2003; 284(5): H1839-47), o que levou a um grande aumento na tensão circunferencial mediai e a uma redu- ção concomitante na cobertura de actina filamentosa de SMC. De modo óbvio, as mudanças no ambiente mecânico relacionadas a enxerto de veia podem conduzir a alterações fenotípicas das SMCs murais, possi- velmente contribuindo para o desenvolvimento de IH.

Os indicadores de um fenótípo sintético incluem a presença de quantidades aumentadas de complexo de Golgi e de retículo endo- plásmatico rugoso e de quantidades reduzidas de actina filamentosa. Um fenótipo contrátil é demonstrado pela presença de um equipamento 30 contrátil intacto indicado pela expressão de proteínas contráteis como smoothelin, h-caldesmon, cadeia pesada de miosina de músculo liso e grandes quantidades de actina filamentosa.

De-adesão e Migração

A de-adesão celular é uma das mais antigas respostas na cascata de IH. Este processo refere-se a uma alteração numa adesão de 5 célula para ao ECM a partir de um estado de aderência forte, com adesões focais e fibras de tensão, para um estado de aderência mais fraca, caracterizada por uma reestruturação de adesões focais e fibras de tensão enquanto se mantém uma forma de célula de espalhamento. De-adesão de SMC, obviamente, permitirá a migração e a proliferação IO de SMC, o que contribuirá para a formação de neoíntima.

Enquanto existem muitas proteínas importantes envolvidas na regulação de adesão celular, enfocamos nossa atenção nas proteínas matricelulares, que funcionam como adaptores e moduladores de interações de célula-matriz (Bornstein P. Diversity of function is inher- ent in matricellular proteins: Na appraisal of thrombospondin I. J Cell Biol. 1995; 130(3): 503-6 e Sage EH e Bornstein P. Extracellular proteins that modulate cell-matrix interactions. Sparc, tenascin, and thrombospondin. The Journal of Biological Chemistry. 1991; 266(23): 14831-4), e proteínas de adesão intracelular, que foram mostradas para posicionar-se em sítios de adesão focal celular (Nikolopoulos SN Turner CE. Integrin-Iinked kinase (ilk) binding to paxillin IdI motif regulates ilk localization to focal adhesions. The Journal of Biological Chemistry. 2001;276(26): 23499-505 e Tu Y, Wu S, Shi X, Chen K e Wu C. Migfilin and mig-2 link focal adhesions to filamin and the actin cytoskeleton and functionincellshapemodulation. Cell. 2003;113:37-47). AtenascinC (TN-C), a trombospondina 1,2 (TSP) e a proteína ácida secretada e rica em cisteína (SPARC) são proteínas matricelulares que exibem expressão altamente regulada durante o desenvolvimento e dano celular (Murphy- Ullrich JE. The de-adhesive activity of matricellular proteins: Is interme- diate cell adhesion an adaptive state? J Clin Invest. 2001; 107(7): 785- 90). O gene inducível de Mitogene 2 (Mig-2) a uinase ligada à integrina (ILK) são proteínas intracelulares envoltas em modulação de formato celular (Nikolopoulos SN e Turner CE. Integrin-Iinked kinase (ILK) binding to paxillin IdI motif regulates ilk localization to focal adhesions.

5 The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(26): 23499- 505 e Tu Y, Wu S, Shi X, Chen K e Wu C. Migfilin and Mig-2 link focal adhesions to filamin and the actin cytoskeleton and function in cell shape modulation. Cell. 2003; 113: 37-47) e transdução de sinal mediada por integrina (Wu C e Dedhar S. Integrin-Iinked kinase (ILK) and its interactors: A new IO paradigmfor the coupling of extracellular matrix to actin cytoskeleton and signaling complexes. J CellBiol 2001; 155(4): 505-10), respectivamen- te. As ações de TN-C, TSP e SPARC sobre o citoesqueleto e adesões focais são basicamente indistinguíveis (Greenwood JA, Theibert AB, Prestwich GD e Murphy_Ullrich JE. Restructuring of focal adhesion 15 plaques by PI 3-kinase. Regulation by ptdins (3,4,5)-p(3) binding to ph- actinin. J CellBiol 2000; 150(3): 627-42 e Murphy-Ullrich JE, Lightner VA, Aukhil I, Yan YZ, Erickson HP e Hook M. Focal adhesion integrity is downregulated by the áltematively spliced domain of human tenascin. J Cell Biol. 1991; 115(4): 1127-36). Todavia, estas três proteínas têm, 20 cada uma, receptores exclusivos e têm semelhantes, mas separados, trajetos de sinalização para produzir um estado de adesão intermediá- ria, o que é um precursor para a migração de célula (Murphy-Ullrich JE. The de-adhesive activity of matricelluar proteins: Is intermediate cell adhesion na adptive state? J Clin Invest. 2001; 107(7): 785-90). Mig-2 25 e ILK também foram implicados em adesão celular (Nikolopoulos SN e Turner CE. Integrin-Iinked kinase (ILK) binding to paxillin IdI motif regulates ilk localization to focal adhesions. The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(26): 23499-505 e Tu Y, Wu S, Shi X, Chen K e Wu C. Migfilin and Mig-2 link focal adhesions to filamin and the actin 30 cytoskeleton and function in cell shape modulation. Cell. 2003; 113: 37- 47). Especificamente, foi mostrado que o Mig-2 participa na conexão entre adesões de matriz de célula e o citoesqueleto de actina como também modula a forma de célula (Tu Y, Wu S, Shi X, Chen K e Wu C. Migfilin and Mig-2 link focal adhesions to filamin and the actin cytoskele- ton and function in cell shape modulation. Cell. 2003; 113: 37-47). Estudos recentes indicaram que o ILK serve como um mediador na 5 transdução de sinal mediado por integrina (Wu C. Integrin-Iinked kinase and pinch: Partners in regulation of cell-extracellular matrix interaction and signal transduction. Journal of Cell Science. 1999; 112 (PT 24): 4485-9). Além disso, ambos o Mig-2 e o ILK são exigidos para manter as adesões focais (Nikolopoulos SN e Turner CE. Integrin-Iinked IO kinase (ilk) binding to paxillin IdI motif regulates ilk localization to focal adhesions. The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(26): 23499- 505 e Tu Y, Wu S, Shi X, Chen K e Wu C. Migfilin and Mig-2 linkfocal adhesions to filamin and the actin cytoskeleton and function in cell shape modulation. Cell. 2003; 113: 37-47). Examinando-se as mudanças nos 15 níveis de TN-C, TSP, SPARC, Mig-2 e ILK, acreditamos que poderemos tirar conclusões sobre o estado de adesão de SMCs dentro dos segmen- tos de veia. Um diagrama esquemático que mostra a localização intra- celular de TN-C, TSP, SPARC, Mig-2 e ILK é exibido na Figura 2.

Um pré-requisito para a migração de SMC in vivo é a degra- dação de proteínas de matriz circundante. As metaloproteinases da matriz (especificamente, MMP-I, MMP-2 e MMP-9) podem seletivamente degradar vários componentes do ECM vascular (Galis ZS, Muszynski M, Sukhova GK, Simon_Morrissey E, Unemori EN, Cotovia MW, Amento E e Libby-B. Cytokine-stimulated human vascular smooth muscle cells synthetise a complement of enzymes required for extracellular matrix digestion. CirculationResearch(Online). 1994; 75(1): 181-9; Newby AC, Southgate KM e Davies MG. Extracellular matrix degrading metallopro- teinases in the pathogenesis of arteriosclerosis. Basic Res Cardiol. 1994; 89(Suppl 1): 59-70; Porter KE, Naik J, Turner NA, Dickison T, Thompson MM e London JM. Simvastatin inhibits human saphenous vein neoíntima formation via inhibition of smooth muscle cell proliferation and migration. J. Vasc. Surg. 2002; 36:150-7; e Southgate KM, Davies M, Booth RF e Newby AC. Involvement of extracellular-matrix-degrading metálloproteinases in rabbit aortic smooth-muscle cell proliferation. Biochem J. 1992; 288 (PT 1): 93-9). Foi mostrado que as MMPs são 5 críticas para o desenvolvimento de lesões arteriais pela regulação da migração de SMC. O saldo entre MMPs, seu ativador (MT-1 MMP) (Lafleur MA, Hollenberg MD, Atkinson SJ, Knauper V, Murphy G e Edwards DR. Activation of pro-(matrix metalloproteinase-2) (pró-mmp-2) by thrombin is membrane-type-mmp-dependent in human umbilical vein IO endothelial cells and generates a distinct 63 kda active species. Biochem J. 2001; 357(PT 1): 107-15), e seus inibidores (especificamente, TIMP- 1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4) determina o nível de degradação de ECM (Meng X, Mavromatis K e Galis ZS. Mechanical stretching of human saphenous vein grafts induces expression and activation of matrix- 15 degrading enzymes associated with vascular tissue injury and repair. Exp MoI Pathol. 1999; 66(3): 227-37). Estudos numerosos mostraram que as MMPs e TIMPs desempenham um papel significativo nas fases iniciais da IH em resposta à hemodinâmica alterada e ao dano vascular (George SJ, Baker AH, Angelini GD e Newby AC. Gene transfer of tissue 20 inhibitor of metalloproteinase-2 inhibits metalloproteinase activity and neointima formation in human saphenous veins. Gene Ther. 1998; 5(11): 1552-60; George SJ, Johnson JL, Angelini GD, Newby AC e Baker AH. Adenovirus-mediated transfer of the human TIMP-gene inhibits smooth muscle cell migration and neointimal formation in human saphe- 25 nous vein. Hum Gene Ther. 1998; 9(6): 867-77; e Lijnen HR, Soloway P e Collen D. Tissue inhibitor of matrix metálloproteinases-1 impairs arterial neointima formation after vascular injury in mice. Circ Res. 1999; 85(12): 1186-91). Por exemplo, depois de 6 horas de perfusão ex vivo com hemdinâmica arterial, a expressão de MMP-2 e MMP-9 foi 30 aumentada em veias de safena humanas (Mavromatis K, Fukai T, Tate M, Chesler N, Ku DN e Galis ZS. Early effects of arterial hemodynamic conditions on human saphenous veins perfused ex vivo. Arterioscler Thromb VascBioL 2000; 20(8): 1889-95). Outros estudos de cultura de órgão de veia de safena humana mostraram a produção aumentada de MMP-9 e a ativação aumentada de MMP-2 (Porter KE, Thompson MM, Loftus IM, McDermott E, Jones L, Crowther M, Bell PR e London NJ.

5 Production and inhibition of the gelatinolytic matrix metálloproteinases in a human model of vein grat stenosis. Eur J Vase Endovase Surg. 1999; 17(5): 404-12; Porter KE, Naik J, Turner NA, Dickison T, Thompson MM e London JM. Simvastatin inhibits human saphenous vein neointima formation via inhibition of smooth muscle cell proliferation and migration. IO J. Vasc. Surg. 2002; 36: 150-7; e George SJ, Zaltsman AB e Newby AC. Surgical injury and neointima formation increase MMP-9 expression and MMP-2 activation in human saphenous vein. Cardiovasc Res. 1997; 33(2): 447-59) sob condições arteriais. Foi mostrado que o espectro largo de inibidores de MMP como simvaestatina inibe a formação de 15 neointima neste modelo (Porter KE, Naik J, Turner NA, Dickison T, Thompson MM e London JM. Simvastatin inhibits human saphenous vein neointima formation via inhibition of smooth muscle cell proliferation and migration. J. Vasc. Surg. 2002; 36:150-7 e Porter KE, Loftus IM, Peterson M, Bell PR, London NJ e Thompson MM. Marimastat inhibits 20 neointimal thickening in a model of human veingraft stenosis. Br J Surg. 1998; 85(10): 1373-7).

As forças mecânicas podem influenciar a de-adesão e a mi- gração de SMC regulando diretamente os fatores acima. Por exemplo, a expressão de MMP-lé aumentada em SMCs venosas expostas à pressão 25 de pulso comparada a controles estáticos (Redmond EM, Cahill PA, Hirsch M, Wang YN, Sitzmann JV e Okada SS. Effect of pulse pressure on vascular smooth muscle cell migration: The role of urokinase and matrix metalloproteinase. Trombosis & Haemostasis. 1999; 81(2): 293- 300), enquanto os níveis de MMP-2 mRNA são aumentados em SMCs de 30 camundongos expostos ao estiramento cíclico (Grote K, Flach I, Luchte- feld M, Akin E, Holland SM, Drexler H e Schieffer B. Mechanical stretch enhances mRNA expression and proenzyme release of matrix metallopro- teinase-2 (MMP-2) via nad(p)h oxidase-derivated reactive oxygen species. Circulation Research. 2003;92(11): 80-6). Em SMCs de veia de safena humana produzidas artificialmente, a transcrição de MMP-2 e MMP-9 e 5 os níveis de proteína aumentaram quando expostas à tensão estacioná- ria uniaxial, mas diminuíram quando expostas à tensão cíclica uniaxial (Asanuma K, Magid R, Johnson C, Nerem RM e Galis ZS. Uniaxial strain upregulates matrix- degrading enzymes produced by human vascular smooth muscle cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003; 10 284(5): H1778-84). Tem sido mostrado que a tensão cíclica de fibro- blastos aumenta os níveis de MT-I MMP (Tyagi SC, Lewis K, Pikes D, Marcello A, Mujumdar VS, Smiley LM e Moore CK. Stretch-induced membrane type matrix metalloproteinase and tissue plasminogen activa- tor in cardiac fibroblast cells. J Cell Physiol. 1998; 176(2): 374-82)[166] 15 e diminui os níveis de TIMP-I (Yamaoka A, Matsuo T, Shiraga F e Ohtsuki H. Timp-I production by human acleral fibroblast decreases in response to cyclic mechanical stretching. Opthalmic Research. 2001;33(2): 98-101). Além disso, foi mostrado que a migração de SMC é regulada por sinalização de EC induzido por tensão de cisalhamento 20 (Bassiouny HS, Song RH, Kocharyan H, Kins E e Glagov S. Low flow enhances platelet activation after acute experimental arterial injury. Journal of Vacular Surgery. 1998; 27(5): 910-8; Nakazawa T, Yasuhara H, Shigematsu K e Shigematsu H. Smooth muscle cell migration induced by shear-loaded platelets and endothelial cells. Enhanced 25 platelet-derived growth factor production by shear-loaded platelets. Int Angiol. 2000; 19(2): 142-6; Powell RJ, Carruth JA, Basson MD, Bloodgood R e Sumpio BE. Matrix-specific effect of endothelial control of smooth muscle cell migration. Journal of Vascular Surgery. 1996; 24(1): 51-7; e Shigematsu K, Yasuhara H, Shigematsu H e Muto T. Direct and 30 indirect effects of pulsatile shear stress on the smooth muscle cell. Int Angiol. 2000; 19(1): 39-46). As forças mecânicas podem influenciar a de-adesão e a migração de SMC regulando diretamente os fatores acima. Foi mostrado que a migração de SMC é regulada por sinalização de EC induzido por tensão de cisalhamento (Garanich JS, Pahakis M e Tarbell JM. Shear stress inhibits smooth muscle cell migration via nitric oxide-mediated downegulation of matrix metalloproteinase-2 activity. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 288(5): H2244-52; Bassiouny HS, Song RH, Kocharyan H, Kins E, e Glagov S. Low flow enhances platelet activation after acute experimental arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 1998; 27(5):910-8; Nakazawa T, Yasuhara H, Shigematsu K e Shigematsu H. Smooth muscle cell migration induced by shear-loaded IO platelets and endothelial cells. Enhanced platelet-derived growth factor production by shear-loaded platelets. Int Angiol. 2000; 19(2): 142-6; Powell RJ, Carruth JA, Basson MD, Bloodgood R e Sumpio BE. Matrix- specific effect of endothelial control of smooth muscle cell migration. Journal of Vascular Surgery. 1996; 24(1): 51-7; Shigematsu K, Yasu- hara H, Shigematsu H, e Muto T. Direct and indirect effects ofpulsatile shear stress on the smooth muscle cell. Int Angiol. 2000; 19(1): 39-46; e Sho M, Sho E, Singh TM, Komatsu M, Sugita A, Xu C, Nanjo H, Zarins CK e Masuda H. Subnormal shear stress-induced intimai thickening requires mediai smooth muscle cell proliferation and migration. Exp MoI Pathol 2002; 72(2): 150-60).

Proliferação

Vários fatores de crescimento foram implicados como com- ponentes chaves na resposta hiperplástica de enxertos de veia. Fator Beta de transformação de crescimento (TGF-β) parece ser de particular 25 importância. Por exemplo, Wolf e colaboradores demonstraram que a administração sistêmica de anticorpos contra o TGF-β e reduziu signifi- cativamente o desenvolvimento de IH num modelo de rato (Wolf YG, Rasmussen LM e Ruoslahti E. Antibodies against transforming growth factor-beta 1 suppress intimai hyperplasia in a rat model. J Clin Investe. 30 1994; 93(3): 1172-8). Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) também parecem ser fatores primários envolvidos na proliferação de SMC associado à IH. Por exemplo, PDGF causa uma resposta de proliferação dependente de dose em SMCs cultivadas (Uzui H, Lee JD, Shimizu H, Tsutani H, e Ueda T. The role of protein-tyrosine phosphorylation and 5 gelatinase production in the migration and proliferation of smooth muscle cells. Atherosclerosis. 2000; 149(1): 51-9), enquanto o TGF-β inibe a proliferação (Mii S, Ware JA e Kent KC. Transforming growth factor-beta inhibits human vascular smooth muscle cell growth and migration. Surgery. 1993 ;114(2): 464-70). O bFGF liberado de células mortas e IO danificadas de enxertos autólogos de veia promove a proliferação de SMC (Qian H, Zhang B e Zhao H. [gene expression of bFGF nd intimai hyperplasia of autologous vein grafts n raís]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 1996;76(11): 826-8). Foi descoberto que os níveis de mRNA de transcri- ções de PDGF como também os números de células proliferativas são os 15 mais altos na neointima de enxertos de veia em suíno (Francis SE, Hunter S, Holt CM, Gadsdon PA, Rogers S, Duff GW, Newby AC e Angelini GD. Release of platelet-derived growth factor activity from pig venous arterial grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 1994; 108(3): 540-8). Enquanto fatores de crescimento De modo óbvio desempenham um 20 papel em IH, também foi mostrado que as MMPs são críticas para o desenvolvimento de lesões arteriais regulando-se a proliferação de SMC (Southgate KM, Davies M, Booth RF e Newby AC. Involvement of ex- tracellular-matrix-degrading metálloproteinases in rabbit aortic smooth- muscle cell proliferation. Biochem J. 1992; 288 (Pt 1): 93-9; Cho A e 25 Reidy MA. Matrix metalloproteinase-9 is necessary for the regulation of smooth muscle cell replication and migration after arterial injury. Circ Res. 2002; 91(9): 845-51), enquanto foi mostrado que as TIMPs promo- vem a apoptose de SMC (Annabi B, Shedid D, Ghosn P, Kenigsberg RL, Desrosiers RR, Bojanowski MW, Beaulieu E, Nassif E, Moumdjian R e 30 Beliveau R. Differential regulation of matrix metalloproteinase activities in abdominal aortic aneurysms. J Vasc Surg. 2002; 35(3): 539-46). Foi mostrado que a IH está associada com aumentos na proliferação de SMC e ambos os aumentos e diminuições na apoptose. Pode parecer contra-intuitivo que um aumento na apoptose intimai esteja associado à IH, uma condição associada aos números aumenta- 5 dos de célula. Todavia, deve ser mantido em mente que os aumentos no número de célula é apenas um evento singular no saldo que regula a IH. Isto é, embora possa haver um aumento absoluto em apoptose, um aumento maior na proliferação de célula resultaria num aumento líquido no número de células. Por estas razões, é importante avaliar 10 ambos os lados do saldo (isto é, ambos os fatores promotores e inibido- res) quando avalia-se a proliferação.

O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e a trans- ferase mediada terminal de deoxinucleotídeo biotina-dUTP in situ nick end labeling (TUNEL) têm sido usados para classificar as células apop- tóticas e em proliferação, respectivamente, dentro de AVGs intactos, ambas in vivo (Nishibe T, Miyazaki K, Kudo F, Flores J, Nagato M, Kumada T e Yasuda K. Induction of angiotension converting enzyme in neointima after intravascular stent placement. Int Angiol. 2002; 21(3): 250-5), e in vitro (Zuckerbraun BS, McCloskey CA, Mahidhara Rs, Kim PK, Taylor BS e Tzeng E. Overexpression of mutated ikappabalpha inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and intimai hyperplasia formation. J Vasc Surg. 2003; 38(4): 812-9). A proliferação e a apopto- se de célula são processos simultâneos que acontecem dentro da adventícia e do meio da veia durante o enxerto seguinte à primeira semana, porém este equilíbrio é, depois disso, interrompido com taxas de proliferação que aumentam as sobre taxas de apoptose (Nishibe T, Miyazaki K, Kudo F, Flores J, Nagato M, Kumada T e Yasuda K. Induc- tion of angiotensin converting enzyme in neointima after intravascular stent placement. IntAngiol 2002; 21(3): 250-5). O nível de proliferação dentro do meio e neointima de pontes aorto-coronárias estenosadas extirpardas em re-operação foi mostrado ser significativamente mais alto que os controles de não estenosadas (Hilker M, Buerke M, Lehr HA, Oelert H e Hake U. Bypass graft disease: Analysis of proliferative activity in human aorto-coronary bypass grafts. 2002; 5 Suppl 4: S331- 41).

A tensão de parede aumentada foi associada com a IH de

AVG, e isto pode ser um resultado direto de um regulamento mecânico de proliferação de SMC e apoptose. Por exemplo, foram mostradas que as SMCs venosas aumentam sua proliferação comparadas às SMCs arteriais quando expostas aos níveis arteriais de estiramento cíclico IO (Predel HG, Yang Z, von_Segesser L, Turina M, Buhler FR e Luscher TF. Implications of pulsatile stretch on growth of saphenous vein and mam- mary artery smooth muscle. Lancet. 1992;340(8824): 878-9 e Dethlef- sen SM, Shepro DeD 'Amore PA. Comparison ofthe effects ofmechani- cal stimulation on venous and arterial smooth muscle cells in vitro. J 15 Vase Res. 1996; 33(5): 405- 13). Liu e colaboradores mostraram, via coloração por bromodeoxiuridina e análise de TUNEL, que o estiramento mecânico devido à hemodinâmica arterial induz à morte de célula, que possivelmente medeia a subsequente proliferação de célula num modelo de AVG de rato (Liu B, Itoh H, Louie O, Kubota K e Kent KC. The 20 signaling protein rho is necessary for vascular smooth muscle migration and survival but not for proliferation. Surgery. 2002; 132(2): 317- 25). Predel e colaboradores mostraram que o estiramento pulsátil estimula a proliferação de SMC em veias de safena, mas não em artérias mamárias internas e pode contribuir para a doença de enxerto de bypass venoso 25 (Predel HG, Yang Z, von_Segesser L, Turina M, Buhler FR e Luscher TF. Implications of pulsatile stretch on growth of saphenous vein and mam- mary artery smooth muscle. Lancet. 1992; 340(8824): 878-9). Quando as veias são transpostas para a circulação arterial elas sofrem um aumento de tensão de cisalhamento luminal em adição à tensão intra- 30 mural. Realmente foi mostrado que uma combinação de tensão de cisalhamento aumentada e o estiramento cíclico imposta em SMCs propagadas artificialmente ativam o receptor tipo alfa para PDGF (Hu Y, Bock G, Wick G e Xu Q. Activation of PDGF receptor alpha in vascular smooth muscle cells by mechanical stress. Faseb J. 1998; 12(12): 1135-42)[192].

Remodelagem

A remodelagem vascular tipicamente refere-se a uma mu- dança na morfologia ou microestrutura de um vaso sanguíneo em resposta a mudanças no ambiente biomecânico. Acredita-se que isto acontece como uma tentativa pelo tecido de restaurar a homeostase 10 biomecânica (isto é, de retornar a níveis normais de tensão de cisalha- mento e de parede). No caso de AVGs, a IH é uma forma patológica de remodelagem que inclui a espessura intimai aumentada causada por migração e proliferação de SMC, apoptose intimai aumentada, esclerose da íntima e do meio devido à deposição de ECM aumentada e hipertro- 15 fia das SMCs mediais e adventiciais.

As células vasculares produzem os componentes de ECM como colágeno e elastina. A modulação fenotípica de SMCs associada ao enxerto de veia mostrou alterar a síntese de ECM caracterizada por aumento do colágeno tipo I e da produção de elastina. As veias usadas 20 como enxertos de by-pass arteriais sofrem uma alteração de seus componentes de ECM, o que pode resultar numa perda de área lumenal e de oclusão eventual. Uma alteração na síntese de matriz diretamente leva ao conteúdo de colágeno aumentado na neointima hiperplástica durante a primeira semana depois do dano resultante da angioplastia 25 de balão. Além disso, os AVGs que sofrem esta remodelagem hiperplás- tica exibem complascência diminuída quando comparados às veias frescas, o que pode contribuir para sua falha.

Sumário

Desenvolver um meio confiável para prevenir os primeiros eventos do processo de IH contribuiria para as melhorias no resultado de procedimentos de by-pass arterial. Portanto, é proporcionado aqui um método de condicionar mecanicamente um enxerto de veia arterial, ou de qualquer tecido tubular (que preserva a estrutura celular), 5 tipicamente, mas não exclusivamente, em procedimentos de transplante xenogênico alogênico, autólogo. Para este ponto final, é proporcionado aqui um método de envolver um tecido tubular, que inclui, sem limita- ção, uma veia, artéria, uretra, intestino, esôfago, traquéia, brônquios, ureter e tubo de Falópio. O tecido tubular é envolvido com uma matriz 10 de fibra restritiva de um polímero bioerodível (também chamado de biodegradável ou bioreassorvível) sobre uma circunferência do tecido tubular. Numa modalidade não limitativo, a matriz é depositada sobre o tecido tubular por electrospinning. Numa modalidade particular não limitativo, o tecido tubular é uma veia, como uma veia de safena, que é 15 usada, por exemplo, num procedimento de by-pass arterial, como um procedimento de by-pass arterial coronariano.

A taxa de biodegradação da matriz de polímero pode ser manipulada, otimizada ou de outra forma ajustada de forma que a matriz degrada-se ao longo de um período de tempo útil. Por exemplo, 20 no caso de um by-pass de artéria coronária, é desejável que a matriz dissolva-se ao longo de 12 horas ou mais de forma a prevenir a tensão súbita substancial no enxerto. O polímero degrada-se ao longo de um período desejado de tempo de forma que o suporte mecânico oferecido pela matriz de polímero é gradualmente reduzido ao longo daquele 25 período e a veia seria exposta a níveis gradualmente crescentes de CWS.

Esta nova abordagem teria duas aplicações potenciais. Na primeira aplicação não limitativo, a matriz pode ser usada como uma ferramenta peri-operatória para a modificação de segmentos de veia pretendidos para o uso como um AVG. A modificação da veia ou de 30 outra estrutura anatômica tubular seria desempenhada por tratamento da veia na cabeceira do leito, logo depois da remoção do corpo e só antes do enxerto, por exemplo e sem limitação, o by-pass arterial. Num exemplo não limitativo, depois da veia de safena ser extraída e enquanto o cirurgião está expondo o sítio cirúrgico, a manta de polímero sofreria electrospinning sobre a veia só antes de ser usada para o procedimento 5 de by-pass.

Numa segunda modalidade não limitativo, a matriz de polí- mero pode ser usada como um novo veículo para a liberação de suporte para AVGs. Enquanto a modificação do ambiente mecânico de um enxerto de veia com o passar do tempo podia, ela mesma, melhorar a IO desobstrução de AVG, a liberação de agentes ativos e de suporte bioló- gico (celular) para os AVGs pode provar ser desejável em muitas instân- cias. Por ajuste de uma manta de polímero que sofreu electrospinning, à qual os agentes ativos e/ou biológicos são incorporados, para degra- darem-se numa taxa desejada, a taxa de liberação destas modalidades 15 de suporte podia ser controlada.

De acordo com uma modalidade, um dispositivo de enxerto de tecido tubular é proporcionado. O dispositivo compreende um tecido tubular e uma matriz de fibra restritiva de um polímero bioerodível sobre uma circunferência do tecido tubular. A matriz é tipicamente 20 contígua ou essencialmente contígua sobre uma circunferência de pelo menos uma porção (parte) do tecido tubular. Numa modalidade, o tecido tubular é obtido de uma veia (é venoso), por exemplo e sem limitação, o tecido tubular venoso é obtido de uma parte de uma veia de safena. Noutras modalidades, o tecido tubular é escolhido (obtido de 25 um órgão/tecido escolhido de) uma ou mais dentre uma artéria, uretra, intestino, esôfago, ureter, traquéia, brônquios e tubo de Falópio. A matriz do dispositivo tipicamente bioerode in situ (quando implantada) ao longo de um período de tempo variando de 12 horas até duas sema- nas, significando que a natureza suportativa da matriz é degradada ao 30 longo daquele período de tempo, não necessariamente que a matriz erode completamente. Numa modalidade, o dispositivo é preparado por electros- pinning das fibras de polímero sobre o tecido tubular. As fibras de polímero podem compreender qualquer composição útil de polímero bioerodível. Numa modalidade, mostrada abaixo, as fibras compreen- 5 dem compreendendo um polímero ligações éster e uretano, incluindo, por exemplo e sem limitação, uma ureia de poli(éster uretano). Noutras modalidades, as fibras compreendem um polímero escolhido de um ou mais dentre: um polímero derivado a partir de um ácido alfa-hidroxi, um polilactídeo, um poli(lactídeo-co-glicolídeo), um poli(L-lactídeo-co- IO caprolactona), um ácido poliglicólico, um poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo), um poli(l-lactídeo-co-dl-lactídeo), compreendendo um polímero um monômero de lactona, uma policaprolactona, compreendendo um polímero ligações de carbonato, um policarbonato, um poligliconato, um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato), um poli(glicolídeo-co-trimeti- 15 Ieno carbonato-co-dioxa-nona), compreendendo um polímero ligações de uretano, um poliuretano, uma poli(éster uretano) ureia, um elastô- mero de poli(éster uretano) ureia, compreendendo um polímero ligações de éster, um polialcanoato, um polihidroxibutirato, um polihidroxi valerato, uma polidioxanona, uma poligalactina, um polímero natural, 20 quitosan, colágeno, elastina, alginato, celulose, ácido hialurônico e gelatina. Numa modalidade, a composição de polímero compreende um poli(éster uretano)ureia com a partir de cerca de 25% em peso até cerca de 75% em peso de colágeno. Este polímero também pode compreender elastina, por exemplo e sem limitação, a partir de cerca de 25% em peso 25 até cerca de 75% em peso de uma mistura de colágeno e elastina, que são, de acordo com uma modalidade, de quantidades aproximadamente (maios ou menos) iguais.

Ainda noutra modalidade, uma ou ambas dentre uma célu- la e um agente terapêutico (por exemplo, droga, citocina, atractante químico, antibiótico, antiinflamatório, etc.) é associado (preso a, absor- vido em, adsorto para, crescido em, ligado para etc.) à matriz. Numa modalidade, as células são associadas à matriz, por exemplo e sem limitação, uma ou mais dentre células escolhidas a partir de células- tronco, células progenitoras (precursoras), células de músculo liso, mioblastos do esqueleto, células do miocárdio, células endoteliais, 5 células progenitoras endoteliais, células mesenquinais derivadas da medula óssea e células geneticamente modificadas são associadas à matriz. Noutra modalidade, um fator de crescimento é associado à matriz, por exemplo e sem limitação, um fator de crescimento escolhido a partir de um ou mais dentre o fator de crescimento básico do fibro- 10 blasto (bFGF), fator de crescimento do fibroblasto acídico (aFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento do hepatócito (HGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF), proteína da beta-pleiotrofina do fator de crescimento de transformação, proteína midkine e IGF-1. Noutra modalidade, uma droga é associada à 15 matriz. Em certas modalidades não limitativos, a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre uma droga antiinflamatória não esteróide, um antibiótico, um fator anticoagulante, um imunossupressor, um glucocorticoide, uma droga que age sobre uma imunofilina, um interfe- ron, uma proteína de ligação a TNF, um taxano, uma estatina e um 20 doador de óxido nítrico. Em outras, a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre um NSAID, ácido salicílico, indometacina, trihidrato de sódio indometacina, salicilamida, naproxen, colquicina, fenoprofen, sulindac, diflunisal, diclofenaco, indoprofen sódio salicilamida, citocinas antiinflamatórias, proteínas antiinflamatórias, reagentes antiinflamató- 25 rios esteróides, heparina, Pebac, enoxaprin, aspirina, hirudina, plavix, bivalirudina, prasugrel, idraparinux, warfarina, cumadina, clopidogrel, PPACK, GGACK, ativador de tecido plasminogeno, uroquinase, estrep- toquinase, um glucocorticoide, hidrocortisona, betametisona, dexame- tasona, flumetasona, isoflupredona, metilpred-nisolona, prednisona, 30 prednisolona, triamcinolona acetonida, um antiangiogênico, fluoruracil, paclitaxel, doxorubicina, cisplatina, metotrexato, ciclofosfamida, etopo- sida, pegaptanib, lucentis, triptofanil-tRNA sintetase, retaane, CA4P, AdPEDF, VEGF-TRAP-EYE, AG-103958, Avastin, JSM6427, TG100801, ATG3, OT-551, endoestatina, talidomida, becacizumab, neovastat, um antiproliferativo, sirolimus, paclitaxel, álcool perilílico, inibidores da farnesil transferase, FPTIII, L744, fator antiproliferativo, Van 10/4, 5 doxorubicina, 5-FU, Daunomicina, Mitomicina, dexametasona, azatio- prina, clorambucil, ciclofosfamida, metotrexato, mofetil, polipeptídeo intestinal vasoativo, um anticorpo, uma droga que age sobre imunofili- nas, ciclosporina, zotarolimus, everolimus, tacrolimus, sirolimus, um interferon, uma Proteína de ligação a TNF, um taxano, paclitaxel, IO docetaxel, uma estatina, atorvaestatina, lovaestatina, simvaestatina, pravaestatina, fluvaestatina, rosuvaestatina, um doador ou precursor de óxido nítrico, Sal de Angeli, L-Arginina, Base Livre, Dietilamina NONOato, Dietilamina NONOato/AM, Glico-SNAP-1, Glico-SNAP-2, (±)- S-Nitroso-N-acetilpenicilamina, S-Nitrosoglutationa, NOC-5, NOC-7, 15 NOC-9, NOC-12, NOC-18, NOR-I, NOR-3, SIN-I, Cloreto, Sódio Nitro- prussida, Dihidrato, Espermina NONOato, Estreptozotocina, um antibi- ótico, aciclovir, afloxacina, ampicilina, amfotericina B, atovaquona, azitromicina, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimina, dapsona, diclazaril, doxiciclina, eritromicina, etambutol, fluconazol, 20 fluorquinolonas, foscarnet, ganciclovir, gentamicina, iatroconazol, isoniazid, cetoconazol, levofioxacin, lincomicina, miconazol, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, paromomicina, penicilina, pentamidina, polimixina B, pirazinamida, pirimetamina, rifabutina, rifampina, esparfloxacina, estreptomicina, sulfadiazina, tetraciclina, tobramicina, 25 trifluoruridina, sulfato de trimetoprima, Zn-piritiona e sais de prata como cloreto, brometo, iodeto e periodato.

Também é aqui proporcionado um método de preparar um enxerto tubular que compreende depositar uma matriz de fibra de um polímero bioerodível sobre um perímetro (fora de superfície, circunfe- rência) de um tecido tubular para produzir um dispositivo de enxerto de tecido tubular. A matriz é tipicamente contígua ou essencialmente contígua sobre uma circunferência de pelo menos uma porção (parte) do tecido tubular. Numa modalidade, a matriz é depositada por electros- pinning. Como acima, a matriz tipicamente bioerode in situ ao longo de um período de tempo variando de 12 horas até duas semanas.

5 Numa modalidade, o tecido tubular é obtido de uma veia,

por exemplo e sem limitação, o tecido tubular venoso é obtido de uma parte de uma veia de safena. Noutras modalidades, o tecido tubular é escolhido a partir de (obtido de um órgão/tecido escolhido a partir de) um ou mais dentre uma artéria, uretra, intestino, esôfago, ureter, traquéia, brônquios e tubo de Falópio.

As fibras de polímero podem compreender qualquer compo- sição útil de polímero bioerodível e biocompatível. Numa modalidade, mostrada abaixo, as fibras compreendem compreendendo um polímero ligações de éster e uretano, incluindo, por exemplo e sem limitação, um 15 poli(éster uretano)ureia. Noutras modalidades, as fibras compreendem um polímero escolhido a partir de um ou mais dentre: um polímero derivado de um ácido alfa-hidroxi, um polilactídeo, um poli(lactídeo-co- glicolídeo), um poli(L-lactídeo-co-caprolactona), um ácido poliglicólico, um poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo), um poli(l-lactídeo-co-dL-lactídeo), 20 compreendendo um polímero um monômero de lactona, uma policapro- lactona, compreendendo um polímero ligações de carbonato, um policarbonato, um poligliconato, um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato), um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato-co-dioxanona), compreendendo um polímero ligações de uretano, um poliuretano, uma 25 poli(éster uretano) ureia, um elastômero de poli(éster uretano) ureia, compreendendo um polímero ligações de éster, um polialcanoato, um polihidroxibutirato, um polihidroxi valerato, uma polidioxanona, uma poligalactina um polímero natural, quitosan, colágeno, elastina, algina- to, celulose, ácido hialurônico e gelatina. Numa modalidade, a compo- 30 sição de polímero compreende um poli(éster uretano)ureia com a partir de cerca de 25% em peso até cerca de 75% em peso de colágeno, inclu- indo incrementos entre os mesmos. Este polímero também pode compreender elastina, por exemplo e sem limitação, de a partir de cerca de 25% em peso até cerca de 75% em peso de uma mistura de colágeno e elastina, que são, de acordo com uma modalidade, de quantidades 5 aproximadamente (mais ou menos) iguais.

Noutra modalidade, o método compreende associar um ou ambos de uma célula e um reagente terapêutico (por exemplo, droga, citocina, atractante químico, antibiótico, antiinflamatório, etc.) é associ- ado (preso a, absorvido em, adsorto para, crescido em, ligado para etc.) IO ã matriz. Numa modalidade, as células são associadas à matriz, por exemplo e sem limitação, uma ou mais dentre células escolhidas a partir de células-tronco, células progenitoras (precursoras), células de músculo liso, mioblastos do esqueleto, células do miocárdio, células endoteliais, células progenitoras endoteliais, células mesenquinais 15 derivadas da medula óssea e células geneticamente modificadas são associadas à matriz. Noutra modalidade, um fator de crescimento é associado à matriz, por exemplo e sem limitação, um fator de cresci- mento escolhido a partir de um ou mais dentre o fator de crescimento básico do fibroblasto (bFGF), fator de crescimento do fibroblasto acídico 20 (aFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de cres- cimento do hepatócito (HGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF), proteína da beta-pleiotrofina do fator de crescimento de transformação, proteína midkine e IGF-I é associado à matriz. Em certas modalidades não limitativos, a droga é escolhida a partir de um 25 ou mais dentre uma droga antiinflamatória não esteróide, um antibióti- co, um fator anticoagulante, um imunossupressor, um glucocorticoide, uma droga que age em uma imunofilina, um interferon, uma proteína de ligação a TNF, um taxano, uma estatina e um doador de óxido nítrico. Em outras, a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre 30 um NSAID, ácido salicílico, indometacina, trihidrato de sódio indometa- cina, salicilamida, naproxen, colquicina, fenoprofen, sulindac, difluni- sal, diclofenaco, indoprofen sódio salicilamida, citocinas antiinflamató- rias, proteínas antiinflamatórias, reagentes antiinflamatórios esteróides, heparina, Pebac, enoxaprin, aspirina, hirudina, plavix, bivalirudina, prasugrel, idraparinux, warfarina, cumadina, clopidogrel, PPACK, 5 GGACK, ativador de tecido plasminogeno, uroquinase, estreptoquinase, um glucocorticoide, hidrocortisona, betametisona, dexametasona, flumetasona, isoflupredona, metilpred-nisolona, prednisona, predniso- lona, triamcinolona acetonida, um antiangiogênico, fluoruracil, paclita- xel, doxorubicina, cisplatina, metotrexato, ciclofosfamida, etoposida, IO pegaptanib, lucentis, triptofanil-tRNA sintetase, retaane, CA4P, Ad- PEDF, VEGF-TRAP-EYE, AG-103958, Avastin, JSM6427, TG100801, ATG3, OT-551, endoestatina, talidomida, becacizumab, neovastat, um antiproliferativo, sirolimus, paclitaxel, álcool perilílico, inibidores da farnesil transferase, FPTIII, L744, fator antiproliferativo, Van 10/4, 15 doxorubicina, 5-FU, Daunomicina, Mitomicina, dexametasona, azatio- prina, clorambucil, ciclofosfamida, metotrexato, mofetil, polipeptídeo intestinal vasoativo, um anticorpo, uma droga que age sobre imunofili- nas, ciclosporina, zotarolimus, everolimus, tacrolimus, sirolimus, um interferon, uma Proteína de ligação a TNF, um taxano, paclitaxel, 20 docetaxel, uma estatina, atorvaestatina, lovaestatina, simvaestatina, pravaestatina, fluvaestatina, rosuvaestatina, um doador ou precursor de óxido nítrico, Sal de Angeli, L-Arginina, Base Livre, Dietilamina NONOato, Dietilamina NONOato/AM, Glico-SNAP-1, Glico-SNAP-2, (±)- S-Nitroso-N-acetilpenicilamina, S-Nitrosoglutationa, NOC-5, NOC-7, 25 NOC-9, NOC-12, NOC-18, NOR-I, NOR-3, SIN-I, Cloreto, Sódio Nitro- prussida, Dihidrato, Espermina NONOato, Estreptozotocina, um antibi- ótico, aciclovir, afloxacinaa, ampicilina, amfotericina B, atovaquona, azitromicina, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimina, dapsona, diclazaril, doxiciclina, eritromicina, etambutol, fluconazol, 30 fluorquinolonas, foscarnet, ganciclovir, gentamicina, iatroconazol, isoniazid, cetoconazol, levofioxacin, lincomicina, miconazol, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, paromomicina, penicilina, pentamidina, polimixina B, pirazinamida, pirimetamina, rifabutina, rifampina, esparfloxacina, estreptomicina, sulfadiazina, tetraciclina, tobramicina, trifluoruridina, sulfato de trimetoprima, Zn-piritiona e sais de prata como cloreto, brometo, iodeto e periodato.

5 Ainda noutra modalidade, um método de by-pass cardíaco é

proporcionado compreendendo fazer um by-pass da artéria coronária com um dispositivo de enxerto de tecido tubular que compreende uma veia e uma matriz de fibra restritiva contígua de um polímero bioerodí- vel sobre uma circunferência da veia. A matriz de polímero bioerodível 10 contígua é qualquer matriz como descrito acima e ao longo desta revelação, e pode incluir agentes terapêuticos adicionais como descrito acima.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Exibição esquemática de progressão de hiperpla- sia intimai. Por favor note: IEL, lâmina elástica interna; SMCs, células de músculo liso. Imagem adaptada de Robbins Pathologic Basis of Disease, 1999 (Kumar V, Fausto N e Abbas A. Robbins & coltran pathologic basis of disease. Saunders. 2004).

Figura 2: Exibição esquemática mostrando a localização de Tenascina-C (TN-C), trombospondina-1,2 (TSP), proteína ácida secreta- da e rica em cistéina (SPARC), gene indutível de mitogene 2 (Mig-2) e quinase ligada à integrina (ILK). Por favor, note-se: ECM, matriz extra- celular; α e β, integrinas.

Figura 3: Exibição esquemática de um sistema de cultura 25 de perfusão/órgão de alça fechada (closed-loop). A alça é composta de uma bomba centrífuga Biomedicus que proporciona a pressão pulsátil e o fluxo (A), um trocador de calor (D), uma câmara de alojamento de tecido (C), transdutores de pressão proximal (BI) e distai (B2), uma válvula de resistência variável (E), sonda de fluxo (F), reservatório de coleta (G) e vaso de by-pass (H). Os componentes não mostrados incluem a alça de banho adventicial, micrômetro de laser He-NE e sistema de aquisição de dados. Ver Labadie (1996) e colaboradores para mais detalhe (Labadie, R.F., J.F. Antaki, J.L. Williams, S. Katyal, 5 J. Ligush, S. C. Watkins, S. M. Pham e H.S. Borovetz, “Pulsatile perfu- sion system for ex vivo investigation of biochemical pathways in intact vascular tissué’, American Journal of Physiology, 1996. 270(2 PÁG. de pT H760-8).

Figura 4: Resposta de pressão versus diâmetro de um seg- IO mento de veia jugular interna de suíno.

Figura 5: Os três painéis superiores mostram imagens re- presentativas de Micrografia Eletrônica de Varredura do lúmen de controle de linha de base (BASE), controle de perfusão “venosa” de 48 horas (venoso) e segmentos internos de veia jugular de suíno (arterial) 15 que sofreram perfusão arterial de 48 horas. Note-se a aparência de paralelepípedo de uma camada de célula endotelial intacta. A segunda fila de painéis mostra a microestrutura representativa e núcleos vivos via coloração por H&E de cada grupo (2OOx de ampliação). A terceira fila de painéis mostra as células representativas vivas (verde no original) 20 e mortas (vermelhas nos originais) dentro de cada grupo de tecido (200x de ampliação). Note que lá não parece estar um nível aumentado de necrose em tecido que sofreu perfusão quando comparado ao tecido de controle de BASE. Os três painéis inferiores mostram imagens repre- sentativas de ensaio de TUNEL de tecido a partir da mesma experiência 25 de perfusão por 48 horas (400x de ampliação debaixo de óleo de imer- são). Note que lá não parece estar um nível aumentado de apoptose em tecido que sofreu perfusão quando comparado à base. Em todos os painéis a seta designa o lúmen do vaso.

Figura 6: Exibição esquemática representando as experiên- cias de perfusão ex vivo VEN versus ART. Figura 7: Exibição esquemática representando as experiên- cias de perfusão ex vivo VEN versus cART.

Figura 8: Exibição esquemática representando as experiên- cias de perfusão ex vivo VEN versus wART.

Figura 9: Exibição esquemática que mostra uma vista de

seção reta do complexo de veia / manta.

Figura 10: Exibição esquemática de processamento de seg- mento venoso pós-perfusão para análise de extremidade. Os compri- mentos dados representam os comprimentos restantes de vasos descar- IO regados.

Figura 11: Resposta de diâmetro exterior normalizada de PIJVs para ambas as PIJVs simuladas e dilatadas. Ambas as PIJVs dilatadas (wART) e de controle de simulação sofreram perfusão debaixo de condições ART de 120/80 mm Hg de pressão e 100 ml/min de taxa 15 de fluxo médio. Note que o diâmetro normalizado das veias dilatadas (N=7) é dramaticamente reduzido quando comparado aos controles de simulação (N=5). O diâmetro exterior pressurizado (ODp) foi normaliza- do para o diâmetro exterior não pressurizado (ODup) e os dados são mostrados como a média + desvio padrão da média.

Figura 12: CWS versus tempo resulta de perfusões ex vivo

por 24 horas de segmentos de PIJV envolvidos por polímero que sofre- ram electrospinning para cada combinação na Tabela I. A linha ponti- lhada horizontal mais baixa indica o nível médio de CWS medido numa veia não envolvida sob condições venosas (CWSo -25 KPa), e a linha 25 pontilhada horizontal do meio indica o CWS médio numa artéria coro- nária (~120 KPa) (Labadie RF e colaboradores. Pulsatile perfusion system for ex vivo investigation of biochemical pathways in intact vascu- lar tissue. AmJPhysiol 1996; 270(2 PT 2): H760-8). A linha pontilha- da superior representa o CWS médio medido numa veia não envolvida (controle de simulação) sob condições ART. Na legenda, ET suporta o tempo de electrospinning. Todos os valores de CWS foram normalizados para CWSo. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

5 Figura 13: Resultados representativos de provocação vaso-

motora obtidos usando epinefrina (EPI) e nitroprussida de sódio (SNP) para estimular ambos os segmentos de PIJV dilatada e de controle de simulação. Por favor note que SNP foi imediatamente administrado ao observar um relaxamento natural do tecido pós-excitação com EPI. Isto 10 é, SNP foi administrado em tempos diferentes para as PIJVs simulada e dilatada, dependendo de quando o relaxamento natural do tecido (pós- excitação de haste com EPI) foi observado. As medidas de diâmetro exterior de cada segmento PIJV ao longo da duração das experiências foram normalizadas para o diâmetro exterior de linha de base que foi 15 medido antes da administração da primeira dose de EPI.

Figura 14: Resultados de experiências de provocação va- somotora (N=4). Lá parece não haver diferença significativa no nível de contração ou dilatação entre as PIJVs de controle de simulação e dilatada. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Figura 15: Resultados da complascência e dos cálculos de dureza β para ambas as PIJVs de simulação (A & C) e dilatadas (B & D) por 24 horas. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Figura 16: Imagens H&E (A,B) e tricromáticas de Masson

(C,D) para ambos os procedimentos antes de perfusão e depois de envolver (A,C) e depois de 24 horas de perfusão ex vivo (B,D ). É de notar a espessura uniforme da manta de polímero antes da perfusão e a ausência da manta de polímero nas imagens pós-perfusão. A seta de ponta única indica o lúmen do vaso. A seta que tem duas pontas em (A) e (C) indica a espessura da manta de polímero, o que não se pode descobrir em (B) ou (D).

Figura 17: Imagens representativas de birrefringência de seções de veia coradas com vermelho picrosirius (original em cor). As 5 condições experimentais são definidas como: condições venosas (VEN) de 20 mm Hg de pressão e 20 ml/min de taxa de fluxo; condições arteriais pulsáteis (ART) de 120/80 mm Hg de pressão e 100 ml/min de taxa de fluxo médio; e condições arteriais envoltas (wART) onde os segmentos de veia envoltas sofreram perfusão sob condições ART por 24 IO horas ex vivo. A seta indica o lúmen do vaso.

Figura 18: A coloração por pentacromo Movat de seções de tecido de veia (originais em cor). Em cada imagem o colágeno cora-se de amarelo, elastina e núcleos coram-se de preto e o músculo cora-se de vermelho. O vermelho que cora o lado adventicial das seções wART é 15 coloração não específica de proteínas de meios de cultura que ficam presas dentro do polímero durante as experiências de perfusão ex vivo. A seta indica o lúmen do vaso.

Figura 19: (A) mostra uma imagem de SEM de baixa ampli- ação do segmento de PIJV com o polímero que sofreu electrospinning 20 depositado sobre sua superfície adventicial. (B) é uma imagem de SEM (tomada em 500x de ampliação) da superfície adventicial da PIJV depois que a manta de polímero foi aplicada. Note a alta porosidade da manta de polímero. (C) é uma imagem de SEM (tomada em 500x de ampliação) mostrando a ligação da manta de polímero à veia. (D) é uma imagem 25 SEM (tomada em 500x de ampliação) da superfície luminal da veia e mostra uma camada de endotélio contínua que parece ter permanecida intacta.

Figura 20: Resultados Live/Dead™ quantificados para ava- liar o nível de necrose em PIJVs depois de electrospinning e depois de 18 e 92 horas de cultura estática pós-electrospinning. Os dados mostrados foram para uma experiência única e as barras de erro resultam dos 10 campos de vista que foram analisados pelo segmento de PIJV. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Figura 21: Imagens representativas de imunohistoquímica 5 da análise de TUNEL de base fluorescente (originais em cor). Os dois painéis superiores são de uma experiência VEN (A) versus ART (B) de 24 horas. Os próximos dois painéis são de uma experiência ART (C) versus cART (D) de 24 horas. A terceira fila de painéis é de uma experiência ART (E) versus cART (F) de 72 horas. Os dois painéis inferiores são de IO uma experiência ART (G) versus wART (H) de 24 horas. As setas indi- cam as células apoptóticas. L indica o lúmen de PIJV.

Figura 22: Resultados quantificados de imunohistoquímica de análise de TUNEL de base fluorescente para avaliar a porcentagem de células apoptóticas dentro de PIJVs a partir de experiências de perfusão vascular ex vivo. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Figura 23: Imagens representativas de imunohistoquímica da análise de PCNA baseada em HRP/ABC (originais em cor). Os dois painéis superiores são de uma experiência VEN (A) versus ART (B) de 24 20 horas. Os próximos dois painéis são de uma experiência ART (C) versus cART (D) de 24 horas. A terceira fila de painéis é de uma experiência ART (E) versus CART (F) de 72 horas. Os dois painéis inferiores são de uma experiência ART (G) versus wART (H) de 24 horas. As setas indi- cam células em proliferação. L indica o lúmen de PIJV.

Figura 24: Resultados quantificados de imunohistoquímica

de análise de expressão de PCNA baseada em HRP/ABC para avaliar a porcentagem de células em proliferação dentro de PIJVs a partir de experiências de perfusão vascular ex vivo. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média. Figura 25: Imagens representativas de imunohistoquímica da análise de complexo de Golgi baseada em HRP/ABC (originais em cor). Os dois painéis superiores são de uma experiência VEN (A) versus ART (B) de 24 horas. Os próximos dois painéis são de uma experiência 5 ART (C) versus cART (D) de 24 horas. A terceira fila de painéis é de uma experiência ART (E) versus cART (F)de 72 horas. Os dois painéis inferiores são de uma experiência ART (G) versus wART (H) de 24 horas. As setas indicam as células positivamente coradas. L indica o lúmen de PIJV.

Figura 26: Resultados quantificados de imunohistoquímica

de análise de expressão de complexo de Golgi baseada em HRP/ABC para avaliar a porcentagem de células que se coram positivo para o complexo de Golgi dentro de PIJVs a partir de experiências de perfusão vascular ex vivo. Os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Figura 27: Esquerda: segmento de PIJV envolto durante o processo de electrospinning. Metade: PIJV envolta implantada como um enxerto de interposição carótida como proposto aqui. Direita: enxerto de PIJV não envolto. Note que a PIJV envolta (B) não se expande sob pressão arterial como faz a veia não envolta (C).

Figura 28: Imagens fluoroscópicas de angiografia de ambos os AVGs de simulação e dilatados.

Figura 29: Imagens representativas de coloração por penta- cromo de Movat que foram usadas para medidas de IH (originais em cor). A razão da espessura intimai para a mediai foi calculada usando a equação acima.

Figura 30: Sumário de resultados quantificados de medidas morfométricas de IH. P<0.05 foi considerado estatisticamente significa- tivo. Note que só uma tendência para o significado estatístico foi observada.

Figura 31: Imagens de SEM de baixa ampliação (30x) de duas experiências in vivo onde os AVGs não foram ocluídos. AeB foram de uma experiência onde os enxertos foram completamente 5 patentes. CeD são de uma experiência onde os enxertos foram só parcialmente ocluídos. Estas imagens mostram a interface anastomóti- ca entre o enxerto de veia e a artéria carótida.

Descrição Detalhada

É proporcionado aqui um método de condicionar mecani- IO camente um enxerto de veia arterial ou qualquer tecido tubular, tipica- mente, mas não exclusivamente, em procedimentos de transplante xenogênico alogênico, autólogo. Para este ponto final, é proporcionado aqui um método de envolver tecido tubular, incluindo, sem limitação, uma veia, artéria, uretra, intestino, traquéia, esôfago, ureter e tubo de Falópio (significando que qualquer parte destas fontes de tecido para o enxerto, e não implicando que a estrutura anatômica declarada inteira é usada para os propósitos de enxerto, apesar de que o uso da estrutura inteira ou substancialmente a estrutura inteira é uma opção. Deste modo, quando o tecido tubular é dito ser uma veia, como uma veia de safena, isto não significa que a veia de safena inteira tem que ser usada). A estrutura é envolta com uma matriz de fibra restritiva de um polímero bioerodível sobre uma circunferência do tecido tubular. Como descrito aqui, uma “fibra” é uma estrutura alongada, esbelta, comprida, tipo roscada e/ou filamentosa. Uma “matriz” é qualquer disposição bi ou tridimensional de elementos (por exemplo, fibras), tanto organizada (por exemplo, numa malha de tecido ou de não tecido) ou fortuitamente arranjada (como é típico com um tapete de fibras tipicamente produzido por electrospinning).

A matriz tipicamente é substancialmente ou essencialmente contígua sobre uma circunferência de um tecido tubular, significando que a matriz forma um anel contínuo, de suporte sobre uma superfície e em torno de uma circunferência de uma parte, mas não necessaria- mente sobre a superfície inteira (por exemplo, o comprimento) do tecido tubular. A matriz é “restritiva”, significando que a matriz está em 5 contato substancial com a superfície exterior do tecido tubular e res- tringe, dificulta e/ou impede o estiramento circunferencial substancial do tecido tubular quando enxertada. O grau de restrição pela matriz tipicamente é tal que sob pressões arteriais típicas, o tecido tubular é impedido de distender-se para substancialmente um diâmetro de 10 distensão máximo para aquele tecido (veja, por exemplo, a Figura 4). A matriz pode ser elástica, à medida que ela é restritiva. Onde a matriz é bioerodível, a natureza restritiva da matriz declina com o passar do tempo à medida que a matriz erode.

Numa modalidade não limitativo, a matriz é depositada so- 15 bre um tecido tubular, como uma estrutura ou órgão anatômico tubular por electrospinning. Numa modalidade particular não limitativo, a estrutura anatômica é uma veia, como uma veia de safena, isto é usada, por exemplo, num procedimento de bypass arterial, como procedimento de by-pass arterial coronariano.

Embora qualquer método útil de depositar fibras finas sobre

uma superfície de um tecido tubular podesse ser empregado, o electros- pinning é um método útil de depositar substancialmente as fibras uniformes sobre tal superfície. O electrospinning permite a fabricação de andaimes que se assemelham â escala e natureza fibrosa da matriz 25 extracelular nativa (ECM). A ECM é composta de fibras, poros e outras características de superfície na escala de tamanho de submícron e de nanômetro. Essas características impactam diretamente as interações celulares com materiais sintéticos como migração e orientação. O electrospinning também permite a fabricação de fibras orientadas para 30 resultar em andaimes com anisotropia inerente. Estes andaimes alinhados podem influenciar o crescimento, a morfologia celular e a produção de ECM. Por exemplo, Xu e colaboradores encontraram o alinhamento de célula de músculo liso (SMC) com fibras poli(L-lactídeo- co-s-caprolactona) (Xu C.Y., Inai R., Kotaki M., Ramakrishna S., “Alig- ned biodegradable nanofibrous structure: a potential for blood vessel 5 engineering”, Biomaterials 2004 (25) 877-86.) e Lee e colaboradores submeteram o poliuretano não biodegradável alinhado ã excitação mecânica e descobriram que células propagadas artificialmente em andaimes alinhados produziram mais ECM que aqueles em andaimes randomicamente organizados (Lee C.H., Shin H.J., Cho I.H., Kang Y.M. 10 Kim I.A., Park K.D., Shin J.W., “Nanofiber álignment and direction of mechanical strain affect the ECM production of human ACL fibroblasf, Biomaterials 2005 (26) 1261-1270).

Geralmente, o processo de electrospinning envolve colocar um fluido contendo polímero (por exemplo, uma solução de polímero, uma suspensão de polímero ou uma fundição de polímero) num reser- vatório equipado com um orifício pequeno, como uma agulha ou ponta de conta-gotas e uma bomba de mensuração. Um elétrodo de uma fonte de alta tensão também é colocado em contato elétrico com o fluido contendo polímero ou orifício, enquanto o outro elétrodo é colocado em contato elétrico com um destino (tipicamente uma tela coletora ou mandrel giratório). Durante o electrospinning, o fluido contendo políme- ro é carregado pela aplicação de alta tensão à solução ou orifício (por exemplo, cerca de 3-15 kV) e então forçado pelo orifício pequeno pela bomba de mensuração que proporciona o fluxo fixo. Enquanto o fluido contendo polímero no orifício normalmente teria uma forma hemisférica devido à tensão de superfície, a aplicação da alta tensão faz com que o fluido contendo polímero formado de outra forma hemisfericamente no orifício alongue-se para formar um formato cônico conhecido como um cone de Taylor. Com tensão suficientemente alta aplicada ao fluido contendo polímero e/ou ao orifício, a força eletrostática repulsiva do fluido contendo polímero carregado supera a tensão de superfície e um jato de fluido carregado é ejetado da ponta do cone de Taylor e acelera- do para o destino, que tipicamente está polarizado entre -2 até -10 kV. Opcionalmente, um anel de focalização com uma polarização aplicada (por exemplo, 1-10 kV) pode ser usado para dirigir a trajetória do jato 5 carregado de fluido contendo polímero. Como o jato carregado de fluido vai para a direção do destino polarizado, ele sofre um complicado chicoteamento e movimento de curvatura. Se o fluido é uma solução ou suspensão de polímero, o solvente tipicamente evapora durante o voo intermediário, deixando para trás uma fibra de polímero sobre o destino 10 polarizado. Se o fluido é uma fundição de polímero, o polímero fundido arrefece e solidifica em voo intermediário e é coletado como uma fibra de polímero no destino polarizado. Como as fibras de polímero acumu- lam sobre o destino polarizado, uma malha porosa de não tecido (ma- triz) é formada sobre o destino polarizado.

As propriedades das matrizes elastoméricas que sofreram

electrospinning podem ser feitas sob medida variando-se as condições de electrospinning. Por exemplo, quando o destino polarizado está relativamente perto do orifício, a malha resultante de electrospinning tende a conter fibras desigualmente espessas, tais que algumas áreas 20 da fibra têm uma aparência “tipo gota”. Todavia, como o destino polarizado é deslocado para mais longe do orifício, as fibras da malha de não tecido tendem a ser mais uniforme em espessura. Além disso, o destino polarizado pode ser deslocado relativo ao orifício. Em certas modalidades, o destino polarizado é deslocado para trás e para frente de 25 um modo regular, periódico, tal que as fibras da malha de não tecido são substancialmente paralelas umas às outras. Quando isto é o caso, a malha de não tecido resultante pode ter uma resistência maior para causar tensão na direção paralela às fibras, comparado à direção perpendicular às fibras. Noutras modalidades, o destino polarizado é 30 deslocado fortuitamente em relação ao orifício, de forma que a resistên- cia para causar tensão no plano da malha de não tecido é isotrópica. O destino também pode ser um mandrel giratório. Neste caso, as proprie- dades da malha de não tecido podem ser mudadas variando-se a velocidade de rotação. As propriedades do andaime elastomérico de electrospinning podem também ser variadas mudando-se a magnitude 5 das tensões aplicadas ao sistema de electrospinning. Numa modalidade particularmente preferida, o equipamento de electrospinning inclui um orifício polarizado para 12 kV, um destino polarizado para -7 kV e um anel de focalização polarizado para 3 kV. Além disso, um diâmetro de orifício útil é 0,047" (Id.) e uma distância de destino útil é cerca de 23 10 cm. Uma faixa útil de alta tensão a ser aplicada a uma suspensão ou fundição de polímero é de 0,5 - 30 kV, com maior preferência de 5 - 25 kV, até com maior preferência 10-15 kV.

O electrospinning pode ser desempenhado usando dois ou mais bicos, onde cada bico é uma fonte de uma solução de polímero 15 diferente. Os bicos podem ser polarizados com polarizações diferentes ou a mesma polarização a fim de gerar sob medida as propriedades físicas e químicas da malha polímera de não tecido resultante. Além disso, muitos destinos diferentes podem ser usados. Em adição a um destino achatado, do tipo placa, um mandrel pode ser usado como um 20 destino.

Quando o electrospinning é para ser desempenhado usando uma suspensão de polímero, a concentração do componente de políme- ro na suspensão também pode ser variada para modificar as proprieda- des físicas do andaime elastomérico. Por exemplo, quando o componen- 25 te de polímero está presente em concentração relativamente baixa, as fibras resultantes da malha de não tecido de electrospinning têm um diâmetro menor que quando o componente de polímero está presente em concentração relativamente alta. Sem qualquer intenção de ser limitado por esta teoria, acredita-se aquelas soluções de menor concen- 30 tração têm uma menor viscosidade, levando ao fluxo mais rápido pelo orifício para produzir fibras mais finas. Uma pessoa qualificada na técnica pode ajustar as concentrações de polímero para obter fibras de características desejadas. As faixas úteis de concentrações para o componente de polímero incluem de cerca de 1% em peso até cerca de 15% em peso, de cerca de 4% em peso até cerca de 10% em peso e de cerca de 6% em peso até cerca de 8% em peso.

Em uso, o mandrel é colocado dentro de um tecido tubular, como uma veia e as fibras de polímero são depositadas sobre a circun- ferência de pelo menos uma parte do tecido por rotação do mandrel. O mandrel pode ser longitudinalmente reciprocado entre a fiandeira e o IO coletor para aumentar a cobertura do tecido tubular.

A espessura da matriz pode ser controlada tanto por ajuste da viscosidade da composição de polímero a ser depositada e/ou por ajuste da duração do electrospinning. O uso de composição de polímero mais viscosa pode resultar em fibras mais espessas, exigindo menos 15 tempo para depositar uma matriz de uma espessura desejada. O uso de uma composição de polímero menos viscoso pode resultar em fibras mais finas, exigindo tempo de deposição aumentado para depositar uma matriz de uma espessura desejada. A espessura da matriz e das fibras dentro da matriz afeta a velocidade de bioerosão da matriz. Estes 20 parâmetros são otimizados, dependendo do uso final da matriz, para alcançar um efeito fisiológico desejado ou favorável.

A taxa de biodegradação da matriz de polímero pode ser manipulada, otimizada ou de outra forma ajustada de forma que a matriz degrada-se ao longo de um período de tempo útil. Por exemplo, 25 no caso de um by-pass de artéria coronária, é desejável que a matriz dissolva-se por 12 horas ou mais de forma a prevenir a tensão súbita substancial sobre o enxerto. O polímero degrada-se ao longo de um período desejado de tempo de forma que o suporte mecânico oferecido pela matriz de polímero é gradualmente reduzido ao longo daquele 30 período e a veia seria exposta a níveis gradualmente crescentes de CWS. Esta nova abordagem teria duas aplicações potenciais. Na primeira aplicação não limitativo, a matriz pode ser usada como uma ferramenta peri-operatória para a modificação de segmentos de veia pretendidos para uso como um AVG. A modificação de uma veia ou de 5 outro tecido tubular ou estrutura anatômica pode ser desempenhada no leito do doente, logo depois da remoção do corpo e só antes do enxerto, por exemplo e sem limitação, durante a cirurgia de ponte de safena arterial. Num exemplo não limitativo, depois da veia de safena ser ceifada e enquanto o cirurgião está expondo o sítio cirúrgico (enxerto), a IO manta de polímero sofreria electrospinning sobre a veia só antes de ser usada para o procedimento de by-pass.

Numa segunda modalidade não limitativo, a matriz de polí- mero pode ser usada como um veículo para a liberação de suporte para os AVGs. Enquanto a modificação do ambiente mecânico de um enxer- 15 to de veia com o passar do tempo podia, ela mesma, melhorar a desobs- trução de AVG, a liberação de agentes ativos e suportes biológicos (celulares) para os AVGs pode provar ser desejável em muitas instân- cias. Por ajuste de uma manta de polímero que sofreu electrospinning, à qual os agentes ativos e/ou biológicos são incorporados, para degra- 20 dar-se numa taxa desejada, a taxa de liberação destas modalidades de suporte podia ser controlada.

As abordagens prévias para colocação perivascular de uma manta para entregar suporte para os AVGs tiveram barreiras limitativos de taxa para translação clínica e a abordagem apresentada aqui, usando um polímero biodegradável que sofreu electrospinning, dedica-se a estas limitações.

O uso de um revestimento externo ao redor dos enxertos de veia foi primeiro descrito por Parsonnet e colaboradores. Eles mostra- ram que o revestimento preveniu a dilatação, que ele foi bem aceito pelo tecido anfitrião e que não existiu diferença na resistência à tensão entre os vasos suportados e os não suportados (Parsonnet V, Lari AA, e Shah IH. New stent for support of veins in arterial grafts. Arch Surg. 1963; 87: 696-702). Karayannacos e colaboradores mostraram a trombose reduzida e a proliferação sub-endotelial em AVGs com ambos os reves- 5 timentos de malha de Dacron de ajuste frouxo ou apertado comparados com os enxertos de controle sem suporte (Karayannacos PE, Hostetler JR, Bond MG, Kakos GS, Williams RA, Kilman JW e Vasko JS. Late failure in vein grafts: Mediating factors in subendothelial fibromuscular hyperplasia. Ann Surg. 1978; 187(2): 183-8). Mehta e colaboradores 10 demonstraram que a colocação de um stent de poliéster, não restritivo, macroporoso, externo, reduz a formação de neointima em enxertos de veia suína (Mehta D, George SJ, Jeremy JY, Izzat MB, Southgate KM, Bryan AJ, Newby AC, e Angelini GD. Externai stenting reduces Iong- term mediai and neoíntimal thickening and platelet derived growth factor 15 expression in a pig model of arteriovenous bypass grafting. Nat Med. 1998; 4(2): 235-9). Mais recentemente, foram usados revestimentos de politetrofluoretileno para restringir permanentemente os AVGs de expansão sob pressão arterial e isto levou à formação reduzida de IH num modelo de porco (Liu SQ, Moore MM, Glucksberg MR, Mockros LF, 20 Grotberg JB e Mok AP. Partial prevention of monocyte and granulocyte activation in experimental vein grafts by using a biomechanical engineer- ing approach. JBiomech 1999; 32(11): 1165-75).

A translação clínica de suporte mecânico permanente para AVGs ainda não foi reportado, mais provavelmente devido à resposta 25 inflamatória desfavorável aos materiais sintéticos bioduráveis em aplicações vasculares (Bunt TJ. Synthetic vascular graft infections. I. Graft infections. Surgery. 1983; 93(6): 733- 46 e Edwards WH, Jr., Martin RS, 3rd, Jenkins JM, Edwards WH, Sr. e Mulherin JL, Jr. Primary graft infections. J Vase Surg. 1987; 6(3): 235-9). Esta limita- 30 ção motivou Vijayan e colaboradores e Jeremy e colaboradores a usa- rem um revestimento biodegradável baseado em poliglactina para reduzir a IH em AVGs (Jeremy JY, Bulbulia R, Johnson JL, Gadsdon P, Vijayan V, Shukla N, Smith FC e Angelini GD. A bioábsorbable (poly- glactin), nonrestrictive, externai sheath inhibits porcine saphenous vein graft thickening. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004; 127(6): 1766-72;

5 Vijayan V, Shukla N, Johnson JL, Gadsdon P, Angelini GD, Smith FC, Baird R e Jeremy JY. Long-term reduction of mediai and intimai thicken- ing in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable externai sheath. J Vase Surg. 2004; 40(5): 1011-9; e Vijayan V, Smith FC, Angelini GD, Bulbulia RA e Jeremy JY. Externai supports and the IO prevention of neointima formation in vein grafts. Eur J Vase Endovasc Surg. 2002; 24(1): 13-22). Os efeitos benéficos notados incluíram o desenvolvimento realçado de neo-vasa-vasorum sobre controles não envoltos (Vijayan V, Shukla N, Johnson JL, Gadsdon P, Angelini GD, Smith FC, Baird R e Jeremy JY. Long-term reduction of mediai and 15 intimai thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable externai sheath. J Vase Surg. 2004; 40(5): 1011-9). Todavia, estes revestimentos biodegradáveis eram de ajuste frouxo e permitiram aos AVGs expandirem-se para seus diâmetros máximos sob pressão arterial e, deste modo, não ofereceram suporte mecânico contra 20 o nível aumentado de CWS. Antes da abordagem usada por Vijayan e colaboradores (Vijayan V, Shukla N, Johnson JL, Gadsdon P, Angelini GD, Smith FC, Baird R e Jeremy JY. Long-term reduction of mediai and intimai thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable externai sheath. J Vase Surg. 2004; 40(5): 1011-9 e 25 Vijayan V, Smith FC, Angelini GD, Bulbulia RA, e Jeremy JY. Externai supports and the prevention of neointima formation in vein grafts. Eur J Vase Endovasc Surg. 2002; 24(1): 13-22) e por Jeremy e colaboradores (Jeremy JY, Bulbulia R, Johnson JL, Gadsdon P, Vijayan V, Shukla N, Smith FC e Angelini GD. A bioábsorbable (polyglactin), nonrestrictive, 30 externai sheath inhibits porcine saphenous vein graft thickening. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004; 127(6): 1766-72), Huynh e colaborado- res usaram um suporte de tubo de colágeno externo temporário para reduzir a formação de IH em enxertos de veia de coelho. Estes tubos de colágeno também eram não restritivos e nenhuma menção da cinética de degradação foi reportada (Huynh TT, Iaccarino G, Davies MG, Safi HJ, Koch WJ e Hagen PO. Externai support modulates g protein expres- 5 sion and receptor coupling in experimental vein grafts. Surgery. 1999; 126(2): 127-34). Foi reportado que o colágeno cross-linked que sofreu electrospinning degrada-se muito rapidamente numa solução aquosa (Rho KS, Jeong L, Lee G, Seo BM, Park YJ, Hong SD, Roh S, Cho JJ, Park WH e Min BM. Electrospinning of collagen nanofibers: Effects on 10 the behavior of normal human keratinocytes and early-stage wound healing. Biomateríals. 2006; 27(8): 1452-61) e consequentemente, o suporte estrutural oferecido aos AVGs por revestimentos feitos só de colágeno pode ser muito temporário para ser efetivo a longo prazo. Um revestimento de AVG externo desenvolvido por Liao e colaboradores foi 15 projetado para degradar-se numa taxa desejada a fim de transferir CWS para um AVG gradualmente com o passar do tempo. Lâminas de ácido poli láctico-co glicólico foram pré-fabricadas em tubos pelo envolvimento ao redor de uma barra de Teflon, e portanto não são customizáveis para cada AVG (Liao SW, Lu X, Putnam AJ, e Kassab GS. A novel time- 20 varying poly lactic-co glycolic acid externai sheath for vein grafts de- signed under physiological loading. Tissue Eng. 2007; 13(12): 2855- 62). Isto é, tal como com as abordagens prévias, a abordagem de Liao e colaboradores permite a expansão de um AVG sob pressão arterial antes de entregar qualquer suporte mecânico. A cinética de degradação 25 e o perfil resultante de CWS versus tempo nos revestimentos, não na parede do meio de AVG como descrito aqui, foram reportados. As nossas abordagem dedicam-se às duas limitações importantes associa- das com o trabalho prévio descrito acima, especificamente com respeito aos revestimentos externos bioduráveis e/ou não restritivos.

A liberação de suporte mecânico para os AVGs é apenas

uma possibilidade para uma manta adventicial. Outras aplicações podiam ser como um veículo para a liberação local de bioquímicos, drogas, genes ou células. Kanjickal e colaboradores usaram um hidro- gel de poli(etileno glicol) para a liberação local sustentada de ciclospori- na para os AVGs e, com sucesso, reduziram o desenvolvimento de IH 5 anastomótico (Kanjickal D, Lopina S, Evancho-Chapman MM, Schmidt S, Donovan D e Springhetti S. Polymeric sustained local drug delivery system for the prevention of vascular intimai hyperplasia. J Biomed Mater Res A. 2004; 68(3): 489-95). Em outro estudo, Cagiannos e colaboradores usaram um revestimento de politetrafluoretileno para 10 entregar localmente rapamicina (sirolimus) para os AVGs e reduziram efetivamente a IH anastomótica num modelo de porco (Cagiannos C, Abul-Khoudoud OR, DeRijk W, Shell DHt, Jennings LK, Tolley EA, Handorf CR e Fabian TC. Rapamycin-coated expanded polytetrafluoro- ethylene bypass grafts exhibit decreased anastomotic neoíntimal hyper- 15 plasia in a porcine model. J Vase Surg. 2005; 42(5): 980-8). Mais recentemente, Kohler e colaboradores usaram uma malha biodegradável para entregar paclitaxel para reduzir efetivamente a IH na anastomose de veia enxertada num modelo de ovelha de acesso de diálise (Kohler TR, Toleikis PM, Gravett DM e Avelar RL. Inhibition of neointimal 20 hyperplasia in a sheep model of dialysis access failure with the bioab- sorbable vascular wrap paclitaxel-eluting mesh. J Vase Surg. 2007; 45(5): 1029-1037; discussion 1037-8). Essas atividades teoricamente podiam ser incorporadas usando a técnica de manta de polímero que sofreu electrospinning, com o potencial para controlar a taxa de libera- 25 ção, até certo ponto, por sintonização da taxa de degradação da manta de polímero que sofreu electrospinning.

Para nosso conhecimento, a liberação de células por meio de uma manta/ revestimento de AVG biodegradável não tem sido previamente reportada e, consequentemente, esta possível aplicação futura da manta adventicial seria inovativa. O polímero que foi usado aqui foi caracterizado (Stankus JJ, Guan J e Wagner WR. Fabrication of biodegradable elastomeric scaffolds with sub-micron morphologies. J Biomed Mater Res A. 2004; 70(4): 603-14), e micro-integrado com sucesso às SMCs viáveis (Stankus JJ, Guan J, Fujimoto K e Wagner WR. Microintegrating smooth muscle cells into a biodegradable, elas- 5 tomeric fiber matrix. Biomaterials. 2006; 27(5):735-44), e emprestaria a si mesmo para esta aplicação futura potencial.

Um polímero biodegradável é “biocompatível” já que o polí- mero e os produtos de degradação do mesmo são substancialmente não tóxicos, incluindo não carcinológicos e não imunogênicos e são limpos IO ou de outra forma degradados num sistema biológico, como um orga- nismo (paciente) sem efeito tóxico substancial. Exemplos não limitati- vos de mecanismos de degradação dentro de um sistema biológico incluem reações químicas, reações de hidrólise e clivagem enzimática. Os polímeros biodegradáveis incluem polímeros naturais, polímeros 15 sintéticos e misturas de polímeros naturais e sintéticos. Por exemplo e sem limitação, os polímeros naturais incluem quitosan, colágeno, elastina, alginato, celulose, polialcanoatos, ácido hialurônico ou gelati- na. Os polímeros naturais podem ser obtidos de fontes naturais ou podem ser preparados por métodos sintéticos (incluindo por métodos 20 recombinantes) em seu uso no contexto das tecnologias descritas aqui. Exemplos não limitativos de polímeros sintéticos incluem: homopolíme- ros, heteropolímeros, co-polímeros e polímeros de bloco ou co-políme- ros.

Como usado aqui, o termo “composição de polímero” é uma 25 composição que compreende um ou mais polímeros. Como uma classe, os “polímeros” incluem homopolímeros, heteropolímeros, co-polímeros, polímeros de blocos, co-polímeros de bloco e podem ser tanto naturais como sintéticos. Os homopolímeros contêm um tipo de bloco ou mo- nômero de construção, considerando que os co-polímeros contêm mais 30 de um tipo de monômero. Por exemplo e sem limitação, os polímeros compreendendo monômeros derivados de ácidos alfa-hidroxi incluindo polilactídeo, um poli(lactídeo-co-glicolídeo), poli(L-lactídeo-co-caprolac- tona), ácido poliglicólico, poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo), poli(l-lactídeo-co- dl-lactídeo); monômeros derivados de ésteres incluindo polihidroxibuti- rato, polihidroxivalerato, polidioxanona e poligalactina; monômeros 5 derivados de lactonas incluindo policaprolactona; monômeros derivados de carbonatos incluindo policarbonato, poligliconato, poli(glicolídeo-co- trimetileno carbonato), poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato-co-dioxa- nona); monômeros juntados por ligações de uretano, incluindo poliure- tano, poli(éster uretano) elastômero de ureia.

IO De acordo com uma modalidade não limitativa, a composi-

ção de polímero compreende um ou ambos dentre um colágeno e uma elastina. O colágeno é um componente de ECM comum e é tipicamente degradado in vivo numa taxa mais rápida que muitos polímeros sintéti- cos bioerodíveis. Portanto, a manipulação de conteúdo de colágeno na 15 composição de polímero pode ser usada como um método de modificar as taxas de bierosão in vivo. O colágeno pode estar presente na compo- sição de polímero em qualquer faixa útil, incluindo, sem limitação, de cerca de 2% em peso até cerca de 95% em peso, mas mais tipicamente na faixa de cerca de 25% em peso até cerca de 75% em peso, além de 20 todas as faixas e pontos entre as mesmas, incluindo de cerca de 40% em peso até cerca de 75%, incluindo cerca de 75% em peso e cerca de 42,3% em peso. A elastina pode ser incorporada na composição de polímero a fim de proporcionar a elasticidade aumentada. O uso de elastina pode permitir a expansão circunferencial leve da matriz restriti- 25 va a fim de ajudar o tecido tubular, como uma veia, a adaptar-se a sua nova função, como um uso arterial. A elastina pode estar presente na composição de polímero em qualquer faixa útil, incluindo sem limitação, de cerca de 2% em peso até cerca de 50% em peso, além de todas as faixas e pontos entre as mesmas, incluindo de cerca de 40% em peso e 30 cerca de 42,3% em peso, além de todos os números inteiros e todos os pontos entre as mesmas e equivalentes às mesmas. Numa modalidade não limitativa, o colágeno e a elastina estão presentes em quantidades aproximadamente iguais na composição de polímero. Noutra modalida- de, a soma do conteúdo de colágeno e elastina na composição de polímero está em qualquer faixa útil, incluindo, sem limitação, de cerca 5 de 2% em peso até cerca de 95% em peso, porém mais tipicamente na faixa de cerca de 25% em peso até cerca de 75% em peso, além de todas as faixas e pontos entre as mesmas, incluindo de cerca de 40% em peso até cerca de 75%, incluindo cerca de 75% em peso e cerca de 42,3% em peso.

IO Todas as faixas ou valores numéricos declarados aqui, se

ou não precedidos pelo termo “cerca de”, a menos que declarado de outra forma, são considerados como precedidos pelo termo “cerca de” para considerar as variações em precisão de medida e faixas funcional- mente equivalentes. Por exemplo, o colágeno pode ser declarado como 15 estando presente numa composição de polímero a 10% em peso, mas, devido à variação de medida, pode estar literalmente presente a 10% em peso ± 0,05% em peso, 0,10% em peso ou 1,0% em peso e é provável que funcione da mesma maneira em tais porcentagens de peso.

Como usados aqui, pretende-se que os termos “compreen- dendo” ou “compreendido” ou variações dos mesmos sejam abertos (não limitados). Pretende-se que os termos “um” e “uma” se refiram a um ou mais.

Como usados aqui, os termos “paciente” ou “sujeito” refe- rem-se a membros do reino animal incluindo, mas de forma limitada, os seres humanos.

Um polímero “compreende” ou é “derivado de” um monôme- ro declarado se aquele monõmero é incorporado ao polímero. Deste modo, o monõmero incorporado que o polímero compreende não é o mesmo que o monõmero antes da incorporação a um polímero, já que no mínimo, certos grupos são incorporados à estrutura do polímero. Um polímero parece compreender um tipo específico de encadeamento se aquele encadeamento está presente no polímero.

Os polímeros biodegradáveis descritos aqui são ditos serem bioerodíveis. Por “bioerodíveF é entendido que o polímero, uma vez 5 implantado e colocado em contato com fluidos e tecidos corpóreos, degradará ou parcialmente ou completamente por reações químicas com os fluidos e/ou tecidos corpóreos, tipica e frequentemente de preferência ao longo de um período de tempo de horas, dias, semanas ou meses. Exemplos não limitativos dessas reações químicas incluem IO reações ácido/base, reações de hidrólise e clivagem enzimática. Em certas modalidades, os polímeros contêm metades químicas instáveis, exemplos dos quais incluem ésteres, anidridos, polianidridos ou ami- das. Alternativamente, os polímeros podem conter peptídios ou bioma- cromoléculas como blocos de construção que são reações químicas 15 suscetíveis uma vez colocadas in situ. Por exemplo, o polímero pode conter a seqüência de peptídeo de alanina-alanina-lisina, que confere labilidade enzimática ao polímero. Noutra modalidade, o polímero pode incluir uma proteína de matriz extracelular como um bloco de constru- ção, como colágeno.

O polímero ou os polímeros serão tipicamente selecionados

de forma que ele degrada-se in situ ao longo de um período de tempo para otimizar o condicionamento mecânico do tecido. Os exemplos não limitativos de taxas de degradação in situ úteis incluem entre 12 horas e 2 semanas e incrementos de 1, 2, 3, 6, 12, 24 e/ou 48 horas entre os mesmos.

Os polímeros biodegradáveis úteis aqui também podem ser elastoméricos. Geralmente, qualquer polímero elastomérico que tem propriedades semelhantes àquela do tecido suave a ser reposto ou consertado é apropriado. Por exemplo, em certas modalidades, os poli- meros usados para fazer a manta são altamente distensíveis. Exemplos não limitativos de polímeros apropriados incluem aqueles que têm tensão de ruptura de 100% até 1700%, com maior preferência entre 200% e 800% e até com maior preferência entre 325% e 600%. Em modalidades particularmente preferidas, a tensão de ruptura do políme- 5 ro está entre 5% e 50%, com maior preferência entre 10% e 40% e até com maior preferência entre 20% e 30%. Além disso, é frequentemente útil selecionar polímeros com resistências à tensão de 10 kPa - 30 MPa, com maior preferência de 5 - 25 MPa e até com maior preferência entre 8 e 20 MPa. Em certas modalidades, o módulo inicial está entre 10 kPa IO e 100 MPa, com maior preferência entre 10 e 90 MPa e até com maior preferência entre 20 e 70 MPa.

Em certas modalidades, os polímeros usados aqui também liberam agentes terapêuticos quando eles degradam-se dentro do corpo do paciente. Por exemplo, os blocos de construção individuais dos 15 polímeros podem ser escolhidos de forma que os blocos de construção, por eles mesmos, proporcionam um benefício terapêutico quando liberados in situ pelo processo de degradação. Numa modalidade parti- cularmente preferida, um dos blocos de construção de polímero é putrescina, que foi implicada como uma substância que causa o cres- 20 cimento de célula e a diferenciação de célula.

Numa modalidade, as fibras compreendem um elastômero de poli(éster uretano) ureia (PEUU) biodegradável. Um exemplo de tal PEUU é um polímero elastomérico feito a partir de policaprolactonadiol (MW 2000) e de 1,4 diisocianatobutano, com uma diamina, como 25 putrescina como o extensor de cadeia. Um polímero de PEUU apropria- do pode ser feito por um processo de polimerização de duas etapas pelo qual policaprolactonadiol (MW 2000), 1,4-diisocianatobutanos e putres- cina são combinados numa relação molar de 2:1:1. Na primeira etapa de polimerização, uma solução de 15 % em peso de 1,4 diisocianatobu- 30 tanos em DMSO é continuamente mexida com uma solução de 25 % em peso de diol em DMSO. Na segunda etapa, é adicionado octoato esta- nhoso e a mistura tem permissão para reagir a 75°C por 3 horas, com a adição de trietilamina para ajudar a dissolução. O polímero elastoméri- co pode também ser um elastômero de poli (éter éster uretano) ureia (PEEUU). Por exemplo, o PEEUU pode ser feito reagindo-se copolímeros 5 de tribloco de policaprolactona- fo-polietileno glicol-b-policaprolactona com 1,4-diisocianatobutano e putrescina. Numa modalidade preferida, o PEEUU é obtido por uma reação de duas etapas usando-se uma estoiquiometria de reagente a 2:1:1 de l,4-diisocianatobutano:copolí- mero tribloco:putrescina. Na primeira etapa de polimerização, uma IO solução a 15 % em peso de 1,4-diisocianatobutano em DMSO é conti- nuamente mexida com uma solução a 25 % em peso de diol copolímero tribloco em DMSO. Na segunda etapa, octoato estanhoso é adicionado e a mistura tem permissão para reagir a 75°C por 3 horas. A mistura de reação é então arrefecida para a temperatura ambiente e permitida a 15 continuar por 18 h. A solução de polímero de PEEUU é então precipi- tada com água destilada e o polímero molhado é submerso em isopro- panol por 3 dias para remover o monõmero não reagido e secado sob vácuo.

Noutras modalidades, pelo menos um agente terapêutico é adicionado às fibras bioerodíveis. Os agentes terapêuticos úteis inclu- em qualquer substância que pode ser coberta, presa, absorvida, adsor- ta, embutida ou de outra forma associada às fibras bioerodíveis que proporcionariam um benefício terapêutico a um paciente. O agente terapêutico pode ser misturado com o polímero enquanto o polímero está sendo processado. Por exemplo, o agente terapêutico pode ser dissolvido num solvente (por exemplo, DMSO) e adicionado à mistura de polímero durante o processamento. Noutra modalidade, o agente terapêutico é misturado com um polímero portador (por exemplo e sem limitação, um hidrogel de polietileno glicol ou micropartícuias de ácido poliláctico-glicólico) que é subsequentemente processado com o políme- ro elastomérico. Misturando-se o agente terapêutico com um polímero portador ou o próprio polímero elastomérico, a taxa de liberação do agente terapêutico pode ser controlada pela taxa de degradação de polímero. Numa modalidade, um hidrogel bioerodível que compreende um agente ativo ou células é aplicado às fibras bioerodíveis depois delas 5 serem aplicadas a uma superfície de um tecido tubular.

Conforme aqui usado, “biodegradável”, bioreabsorvível” e “bioerodível” são sinônimos. Também, o descritor “tubular” não se refere especificamente a um tubo geometricamente perfeito que tem um diâmetro permanente e um corte transversal circular. Ele também 10 abrange tecidos que têm cortes transversais não circulares e variados e pode ter um diâmetro variável e, deste modo, qualquer forma tendo uma parede contígua circundando um lúmen (isto é, eles são ocos) e duas aberturas no lúmen, de forma que um líquido, sólido ou gás pode viajar de uma abertura para a outra. Como indicado aqui, exemplos 15 específicos não limitativos, mas ilustrativos de tecidos tubulares inclu- em tecido arterial, uretral, intestinal, esofageal, ureter, traqueano, bron- quial e de tubo de Falópio.

Além disso, outros agentes ativos que podem ser incorpora- dos às fibras bioerodíveis incluem, sem limitação, antiinflamatórios, como, sem limitação, NSAIDs (drogas antiinflamatórias não esteróides) como ácido salicílico, indometacina, trihidrato de sódio indometacina, salicilamida, naproxen, colquicina, fenoprofen, sulindac, diflunisal, diclofenaco, indoprofen sódio salicilamida, citocinas antiinflamatórias e proteínas antiinflamatórias ou agentes antiinflamatórios esteróides); antibióticos; fatores anticoagulantes como heparina, Pebac, enoxaprin, aspirina, hirudina, plavix, bivalirudina, prasugrel, idraparinux, warfari- na, cumadina, clopidogrel, PPACK, GGACK, ativador de tecido plasmi- nogeno, uroquinase e estreptoquinase; Fatores de crescimento. Outros agentes ativos incluem, sem limitação: (1) imunossupressores; glucocor- ticoides como hidrocortisona, betametisona, dexametasona, flumetaso- na, isoflupredona, metilpred-nisolona, prednisona, prednisolona e triamcinolona acetonida; (2) antiangiogênicos como íluoruracil, paclita- xel, doxorubicina, cisplatina, metotrexato, ciclofosfamida, etoposida, pegaptanib, lucentis, triptofanil-tRNA sintetase, retaane, CA4P, Ad- PEDF, VEGF-TRAP-EYE, AG-103958, Avastin, JSM6427, TG100801, ATG3, OT-551, endoestatina, talidomida, becacizumab, neovastat; (3) antiproliferativos como sirolimus, paclitaxel, álcool perilílico, inibidores da farnesil transferase, FPTIII, L744, fator antiproliferativo, Van 10/4, doxorubicina, 5-FU, Daunomicina, Mitomicina, dexametasona, azatio- prina, clorambucil, ciclofosfamida, metotrexato, mofetil, polipeptídeo IO intestinal vasoativo e PACAP; (4) anticorpos; drogas que agem em imunofllinas, como ciclosporina, zotarolimus, everolimus, tacrolimus e sirolimus (rapamicina), interferons, Proteínas de ligação a TNF; (5) taxanos, como paclitaxel e docetaxel; estatinas, como atorvaestatina, lovaestatina, simvaestatina, pravaestatina, fluvaestatina e rosuvaestati- na; (6) doadores ou precursores de óxido nítrico, como, sem limitação, Sal de Angeli, L-Arginina, Base Livre, Dietilamina NONOato, Dietilamina NONOato/AM, Glico-SNAP-1, Glico-SNAP-2, (±)-S-Nitroso-N- acetilpenicilamina, S- Nitrosoglutationa, NOC-5, NOC-7, NOC-9, NOC- 12, NOC-18, NOR-1, NOR-3, SIN-1, Cloreto, Sódio Nitroprussida, Dihidrato, Espermina NONOato, Estreptozotocina; e (7) antibióticos, como, sem limitação: aciclovir, afloxacina, ampicilina, anfotericina B, atovaquona, azitromicina, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimina, dapsona, diclazaril, doxiciclina, eritromicina, etambutol, fluconazol, fluorquinolonas, foscarnet, ganciclovir, gentamicina, iatro- conazol, isoniazid, cetoconazol, levofloxacina, lincomicina, miconazol, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, paromomicina, penicilina, penta- midina, polimixina B, pirazinamida, pirimetamina, rifabutina, rifampi- na, esparfloxacina, estreptomicina, sulfadiazina, tetraciclina, tobramici- na, trifluoruridina, sulfato de trimetoprima, Zn-piritiona e sais de prata como cloreto, brometo, iodeto e periodato.

As células podem ser microintegradas dentro da matriz res- tritiva, bioerodível usando uma variedade de métodos. Por exemplo, a matriz pode ser submersa num meio de crescimento apropriado para as células de interesse e, então, diretamente exposta às células. As células têm permissão para proliferar na superfície e interstícios da matriz. A 5 matriz é então removida do meio de crescimento, lavada se necessário e implantada. Mas porque texturas de não tecido que sofreram electros- pinning frequentemente têm tamanhos de poro que são relativamente pequenos (por exemplo, comparados aos tamanhos de poro de texturas de não tecido fabricados por outros métodos como lixiviação de sal ou IO separação de fase termicamente induzida), cultivar células sobre a superfície do andaime é normalmente usado quando a microintegração de células só próximas à superfície do andaime elastomérico é desejada.

Noutra modalidade, as células de interesse são dissolvidas numa solução apropriada (por exemplo, um meio ou tampão de cresci- mento) e então pulverizadas sobre uma matriz restritiva, bioerodível enquanto a matriz está sendo formada por electrospinning. Este método é particularmente apropriado quando uma construção projetada de tecido altamente celularizado é desejada. Numa modalidade, a pressão que pulveriza (isto é, pulverizar células de um bico sob pressão) é usada para depositar as células. Noutra, as células são eletropulverizadas sobre a malha de não tecido durante o electrospinning. Como descrito aqui, a eletropulverização envolve sujeitar uma solução contendo célula com uma viscosidade e concentração apropriada a um campo elétrico suficiente para produzir um spray de pequenas gotículas carregadas de solução que contém células. Numa experiência (não mostrada), a viabilidade da célula foi examinada para células de músculo liso (SMCs) pulverizadas sob condições diferentes. Estas condições diferentes incluem pulverizar somente, pulverizar sobre um destino carregado a - 15kV, pulverizar sobre um destino carregado a -15 kV com electrospin- ning de PEUU, eletropulverizar a 10 kV sobre um destino carregado a - 15kV e eletropulverizar a 10 kV sobre um destino carregado a -15 kV com electrospinning de PEUU. Uma redução significativa em viabilidade de SMC resultou de pulverizar células pelo bico. Sem qualquer inten- ção de estar preso por teoria, acredita-se que as forças físicas do spray pressurizado em combinação com a exposição de células aos solventes 5 de processamento podem ter causado este resultado uma vez que a viabilidade foi perdida tanto por pulverização somente e até mais por pulverização durante a fabricação de PEUU que sofreu electrospinning (e-PEUU). A viabilidade diminuída a partir de pulverização de aerossol de célula foi reportada por outros e foi descoberta que depende larga- IO mente do diâmetro de bico, da pressão de pulverização e da viscosidade de solução (Veazey W.S., Anusavice K. J., Moore K., uMammalian cell delivery via aerosol deposition”, J. Biomed. Mater. Res. 2005 (72B)334- 8.). Portanto, as células também foram pulverizadas a partir de meios suplementados com gelatina para aumentar a viscosidade e ajudar a 15 proteger as células de tensões mecânicas e químicas. A viabilidade foi recuperada e a integridade mecânica das matrizes de PEUU foi inter- rompida por causa da gelificação dentro da rede de fibra.

Em contraste com a pulverização pressurizada, eletropulve- rizar as células não afeta significativamente a viabilidade ou prolifera- ção de célula. Isto é consistente com relatórios de outros que células podem sobreviver à exposição a campos elétricos de tensão alta (veja, por exemplo, Nedovic V.A., Obradovic B., Poncelet D., Goosen M.F.A., Leskosek-Cukalovic O., Bugarski B., “Cell immobiliation by electrostatic droplet generatiorf, Landbauforsch VoIk 2002, (241) 11-17; Temple M.D., Bashari E., Lu J., Zong W.X., Thompson CB., Pinto N.J., Monohar S.K., King R.C.Y., MacDiarmid A.G., “Electrostatic transportation of living cells through air*, Abstracts of Papers, 223 ACS National Meeting, Orlando, FL, Abril 7-11, 2002). Até na presença de electrospinning de PEUU, a viabilidade de SMC não foi reduzida, talvez porque o electros- pinning positivamente carregado e os fluxos de eletropulverização repeliram-se um ao outro e evitaram expor as células ao solvente antes da deposição. Também, devido à distância de electrospinning relativa- mente grande de 23 cm, fibras de PEUU foram provavelmente livres de solvente quando elas foram depositadas. A eletropulverização de meios suplementados com gelatina resultou num número maior de células 5 viáveis comparado à eletropulverização de meios sem gelatina. Todavia, o uso de gelatina leva a reduzidas propriedades mecânicas de constru- ção. Consequentemente, em muitos casos a eletropulverização a partir de meio sozinho pode ser um método de incorporação celular preferido.

As células que podem ser incorporadas sobre ou na matriz bioerodível incluem células-tronco, células progenitoras (precursoras), células de músculo liso, mioblastos do esqueleto, células do miocárdio, células endoteliais, células progenitoras do endotélio, células mesen- quinais derivadas da medula óssea e células geneticamente modifica- das. Em certas modalidades, as células geneticamente modificadas são capazes de expressar uma substância terapêutica, como um fator de crescimento. Os exemplos de fatores de crescimento apropriados incluem o fator angiogênico ou neurotrófico, que opcionalmente pode ser obtido usando técnicas recombinantes. Exemplos não limitativos de fatores de crescimento incluem o fator de crescimento básico do fibro- blasto (bFGF), fator de crescimento do fibroblasto acídico (aFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento do hepatócito (HGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF), proteína da beta-pleiotrofina do fator de crescimento de transformação, proteína midkine. Numa modalidade preferida, o fator de crescimento é IGF-I.

Exemplos

Os procedimentos de safena autógena permanecem o enxer- to de escolha para ambos os procedimentos de by-pass arterial corona- riano (500.000 anualmente) e periférico (80.000 anualmente). A falha de AVGs permanece um problema importante e pacientes com enxertos falhados morrerão ou exigem reoperação. A IH responde por 20% a 40% de todas as falhas de AVG. Acredita-se que a IH é ativada por exposição abrupta de AVGs ao ambiente biomecãnico severo e novo da circulação arterial e aos níveis elevados de CWS associados com o sistema arterial (aumento de 140 vezes comparado às condições veno- sas nativas). A hipótese de trabalho aqui é que a resposta de IH pode ser reduzida ou eliminada por expor mais gradualmente os AVGs a níveis arteriais de CWS. Isto é, se um AVG recebe uma oportunidade ampla de adaptar-se e remodelar-se às tensões de seu novo ambiente, o IO dano celular pode ser reduzido, deste modo limitando os mecanismos de iniciação de IH. De modo óbvio, desenvolver um meio confiável para prevenir os primeiros eventos do processo de IH contribuiria significati- vamente para as melhorias no resultado clínico de procedimentos de by- pass arterial. Portanto, a meta em longo prazo deste trabalho é desen- volver um novo paradigma de condicionamento mecânico, na forma de uma manta de polímero biodegradável, periadventicialmente colocada, para segura e funcionalmente “arterializar” os AVGs in situ. A manta de polímero é ajustada de forma que ela degrada-se ao longo de um perío- do desejado de tempo, o suporte mecânico oferecido por ela é reduzido e a veia é exposta a níveis gradualmente crescentes de CWS in situ.

Vários dos sinais moleculares esboçados aqui e a justificati- va para selecioná-los como metas para este estudo são resumidos na Tabela 1. Tabela I

Sumário e justificativa para os pontos finais escolhidos neste estudo

Pontos Finais Função na IH Justificativas suportadas propostos neste pela literatura estudo Complexo de Golgi Modulação Fenotípica Quantidades aumentadas Síntese de Proteína em SMCsa sintéticas versus contráteis PCNA Proliferação Proliferação de célula aumentada em AVGsb expostos abruptamente TUNEL Apoptose Apoptose alterada em AVGsc expostos abrupta¬ mente Complascência Desempenho Clínico Preditor importante de Inflexibilidade Desempenho Clínico desobstrução de AVGd. A complascência diminui em AVGs arterializados expostos abruptamente, aumentando, portanto, a divergência de complas¬ cência® Preditor importante de desobstrução de AVGd. A inflexibilidade aumenta em AVGs arterializados expostos abruptamente e pode contribuir para reduzir o desempenho clínico/

a Morisaki N e colaboradores. Cell cycle-dependent inhibition of DNA synthesis by prostaglandin i2 in cultured rabbit aortic smooth muscle cells. Atherosclerosis. 1988; 71(2-3): 165-71; Campbell GR e colabora- 5 dores. Arterial smooth muscle. A multifunctional mesenchymal cell. Arch Pathol Lab Med. 1988; 112(10): 977-86; e Nagai R e colabora- dores. Identification of two types of smooth muscle myosin heavy chain isoforms by cdna cloning and immunoblot analysis. The Journal of Biological Chemistry. 1989; 264(17): 9734-7.

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Exemplo 1 Fabricação de estruturas de PEUU

Por meio de bomba de seringa num vaso capilar de aço ino- xidável suspenso 13 cm verticalmente acima de um mandrel de alumí- nio de 4,5" de diâmetro, a solução de PEUU a 5 % em peso em hexafluo- risopropanol (HFIP) foi alimentada a 1,0 mL/h. PEUU foi carregado com + 12kV e o destino de alumínio com -7kV usando geradores de alta tensão (Pesquisa de Alta Tensão Gama). As fibras de PEUU alinha- das foram formadas por electrospinning sobre o destino que gira em velocidades variando de 0,0 a 13,8 m/s. Os andaimes tiveram permis- são para secar durante a noite em temperatura de quarto e então colocados sob vácuo por 48 h a 30°C. Uma parte de cada amostra foi montada num padrão possuidor de difração de Raio X para análise, de forma que a orientação da fibra foi paralela ao feixe de Raio X. As amostras foram executadas num Difratômetro PANalytical X1Pert Pro usando radiação de cobre. O número médio e o peso médio de peso molecular de PEUU foram 228.700 e 87.600, respectivamente, resul- tando num índice de polidispersão de 2,61. DSC demonstrou uma temperatura de transição de vidro de -54,6°C e uma temperatura de fundição do segmento leve de PEUU a 41,0°C.

Construção tubular que sofreu electrospinning para o projeto de tecido de vaso sanguíneo

Este exemplo descreve um método de produzir uma cons- trução de vaso sanguíneo altamente celularizada que é capaz de tam- bém proporcionar suporte mecânico elastomérico substancial. O método envolve uma abordagem micro-integrada na qual um sistema de malha de fibras elastoméricas de submícron é construído numa parede 5 de vaso com ou sem o processo de colocação celular. A celularidade pode ser desenvolvida através de métodos de cultura in vitro ou in vivo. Estes métodos são aplicáveis para o revestimento de tecidos tubulares como descrito aqui.

Este exemplo proporciona um método para luminalmente IO endireitar e colocar canais de poliuretano que sofreram electrospinning de pequeno diâmetro que podem ser usados para revestir os tecidos tubulares como descrito aqui. A tecnologia de electrospinning é usada para incorporar células durante a fabricação de andaime para melhor encorajar o desenvolvimento de tecido.

A poli(éster uretano) ureia foi sintetizada a partir de poli(s-

caprolactona)diol e 1,4-diisocianatobutano com extensão de cadeia de putrescina. PEUU foi dissolvido a 6% em peso em hexafluorisopropanol e sofreu electrospinning. As condições de electrospinning incluíram uma taxa de fluxo volumétrico de solução de 1,0 mL/hr, uma distância entre 20 o bico e o destino de 13,5 cm e tensões de +12 kV para o bico e -3 kV para o destino. O destino usado para a fabricação de tubos de pequeno diâmetro para implantação foi um mandrel de aço inoxidável do Tipo 316 de 1,3 mm de diâmetro que estava girando a 250 rpm.

O mandrel também estava transladando ao longo do seu ei- 25 xo 8 cm numa fase linear a uma velocidade de aproximadamente 8 cm/s para produzir uma espessura de canal mais uniforme. As amos- tras sofreram electrospinning por 15 minutos para produzir construções tubulares porosas com espessuras de parede na ordem de 150 a 200 μιη. Para os estudos de endotelialização, um mandrel inoxidável de 4,7 30 mm foi, ao invés, utilizado com as mesmas condições do processo. PEUU a 6% em peso em HFIP sofreu electrospinning sobre um mandrel giratório negativamente carregado a 250 rpm para produzir uma construção tubular. Os tubos que sofreram electrospinning pos- suíam diâmetros internos de 1,3 mm, comprimentos de até 8 cm e 5 espessuras de parede de 150-200 μπι. Os tamanhos de fibra eram aproximadamente na faixa de ΙΟΟΟμιη. Além disso, estas construções eram suturáveis e retinham seus lúmens.

Depois da fabricação, o mandrel foi imerso em etanol a 70% a fim de mais facilmente removê-lo do mandrel de aço. O canal foi, 10 então, enxaguado em água desionizada múltiplas vezes, corado a seco e então secado sob vácuo em temperatura de quarto por 24 a 48h. Os canais foram, então, examinados em sua estrutura bruta com um microscópio de dissecar ou suas morfologias fibrosas com microscópio de varredura de elétron. A fim de visualizar um corte transversal 15 fibroso ininterrompido, as amostras foram imersas em líquido N2 por 1 minutos e então fraturadas antes do revestimento por deposição de vapor para SEM.

Os canais de PEUU (4,7 mm) foram posicionados dentro de um dispositivo de semeação a vácuo rotacional projetado sob medida e 20 semeados com 20 x IO6 células-tronco derivadas de músculo (MDSCs). Mais especificamente, o canal que sofreu electrospinning foi colocado sobre cepos de metal e um vácuo leve foi aplicado ao exterior do canal. MSDCs que foram subcultivadas sofreram, então, perfusão através do lúmen do canal e foram forçadas para a parede lateral do lúmen fibroso 25 do tubo por vácuo. Construções foram propagadas artificialmente sob condições estáticas em pratos de Petri por 24 h. Depois de 24 h de cultura estática, as células foram viáveis, aderidas ao lúmen e forma- ram uma monocamada.

Andaimes tubulares porosos que sofreram electrospinning de 1,3 mm de diâmetro interno foram implantados como enxertos de interposição na aorta abdominal de ratos. As construções eram suturá- veis e facilmente retinham seus lúmens in vivo. As ratas de Lewis pesando 250-300 g foram anestesiadas com isofluorano a 1% e 2,5 2.5mg/100g de ketamina. Foi realizada uma incisão abdominal média e a cavidade retroperitoneal exposta. A aorta descendente abaixo do nível renal foi dissecada, fixada proximalmente e secccionada distal- mente para fazer um intervalo de 1 cm. O canal que sofreu electrospin- ning foi, então, implantado de ponta a ponta usando suturas de prolene 10,0. Foi administrada heparina intravenosa antes do aperto com 200 IO Unidades/kg. A parede abdominal foi fechada em duas camadas com suturas de Vicryl 2.0. Os ratos foram capazes de se recuperar das cirurgias com função de membro. Os ratos foram sacrificados com 2 semanas e amostras de tecido animal fixadas em 10% de formalina tamponada neutra em temperatura de quarto. 2 semanas depois da implantação, os enxertos permaneram patentes e funcionais. As amostras foram, então, embebidas em parafina e seccionadas antes da coloração com Hematoxilina e Eosina ou Tricromo de Masson. A coloração por hematoxilina e eosina demonstrou a formação de cápsula externa em torno dos enxertos explantados. A coloração por tricromo de Masson indicou que a cápsula era composta de colágeno alinhado junto com a presença de vasos capilares recentemente desenvolvidos. A célula e o tecido em crescimento foram observados ao longo das cons- truções com a presença de desenvolvimento de colágeno. As células também foram demonstradas ter formado uma monocamada em posi- ções em torno dos lúmens da construção.

Considerando que o exemplo prévio proporciou a aborda- gem in vivo, uma poli (éster uretano) ureia biodegradável e citocompatí- vel, elastomérica sofreu electrospinning em tubos de pequeno diâmetro apropriados para implantação num modelo de rato.

Como o exemplo prévio, este exemplo proporciona métodos

para fabricar uma construção de vaso sanguíneo altamente celularizada que também proporciona substancial suporte mecânico elastomérico. Todavia, o modelo prévio foi uma abordagem in vivo na qual uma biodegradável e citocompatível, elastomérica poli (éster uretano) ureia sofreu electrospinning em tubos de pequeno diâmetro apropriados para 5 a implantação num modelo de rato. Este exemplo proporciona uma abordagem in vitro, em que as SMCs foram semeadas em nanofibras que sofreram electrospinning concorrentemente com a fabricação de andaime usando uma técnica de microintegração.

As células de músculo liso vascular (SMCs) isoladas de aor- 10 tas de rato foram expandidas em placas de cultura de poliestireno de cultura de tecido (TCPS) debaixo de Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina- estreptomicina. A microintegração foi desempenhada semelhante à previamente descrita com algumas modificações para permitir um 15 mandrel de eletropulverização/electrospinning de menor diâmetro.

7,5 x IO6 SMCs/mL foram subcultivadas num meio e ali- mentadas a 0,1 mL/min num vaso capilar estéril de aço inoxidável do Tipo 316 carregado a 8,5 kV e colocadas a 4,5 cm do destino. 6 % em peso de PEUU ou 6 % em peso de PEUU/colágeno (75/25) em HFIP 20 foram alimentados a 1,5 mL/min num vaso capilar carregado a 12 kV e colocados a 23 cm do destino. O destino consistiu de um mandrel estéril de aço inoxidável (4,7 mm de diâmetro) carregado a -3 kV e girando a 250 rpm enquanto transladava 8 cm ao longo do seu eixo a 1,6 mm/s. Um tempo de fabricação de 30 minutos foi usado para 25 produzir cada canal microintegrado. Depois da fabricação, o canal e o mandrel foram suavemente colocados com técnica asséptica numa garrafa de cilindro e cultivados estaticamente por 16 h. Depois de 16 h, as amostras foram suavemente removidas do mandrel para cultura. As amostras foram, então, cortadas em comprimentos de 15 mm e sutura- 30 das em cepos de metal e meio que sofreu perfusão com fluxo pulsátil por 3 dias no dispositivo substancialmente, como mostrado na Figura 3. Em pontos de tempo de 1 e 4 dias depois da fabricação, as amostras foram caracterizadas. Um ensaio mitocondrial de MTT foi usado para medir a viabilidade da célula. Para a investigação histológi- ca, as amostras foram fixadas em 10% de formalina tamponada neutra 5 em temperatura de quarto. As amostras foram, então, embebidas em parafina, seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina. As amos- tras foram analisadas por suas propriedades biomecânicas imediata- mente depois da fabricação. As propriedades medidas incluíram a resistência de anel, complascência dinâmica e pressão de ruptura. A IO fim de medir a resistência de anel, pinças de aço inoxidável foram inseridas em seções tubulares de 5 mm de comprimento e, então, nas alças de um testador elástico uniaxial (A TS). Usando uma célula de 10 libras de carga e uma taxa de deslocamento de 10,05 mm/minuto, as amostras foram tensionadas até romper.

Para complascência dinâmica e resistência de ruptura, as

amostras tubulares de 15 mm de comprimento foram montadas numa alça de fluxo dirigida por uma bomba centrífuga (Biomedicus) e sub- mersas em PBS a 37°C. A pressão foi monitorada e registrada a 30 Hz usando um transdutor de pressão Strain-gage padrão em linha e uma 20 placa de captura de PC. A construção de vaso sofreu perfusão com um fluxo pulsátil (110/70 mm Hg, 1,2 Hz) e a complascência dinâmica, C, foi medida registrando-se o diâmetro externo da amostra com um micrômetro a laser He-Ne (Beta Lasermike). A complascência foi calculada como:

Q _ x ^rain )

~ D (P -P ■ )

rmn V max rmn /

25

para cada pulso (D = diâmetro máximo ou mínimo, P = pressão máxima ou mínima). Uma artéria mamária suína foi usada como um controle para a comparação com PEUU microintegrado em estudos de complas- cência. Para medir a pressão de ruptura, a saída da amostra foi fecha- da hermeticamente e o fluxo foi aumentado até a ruptura do tubo. A pressão máxima antes da ruptura foi tomada como a pressão de ruptu- ra.

A fim de estender a tecnologia de microintegração celular aos tubos de diâmetro pequeno, um mandrel de aço inoxidável de 4,7 mm de diâmetro foi usado no lugar do mandrel de 19 mm de diâmetro previamente empregado para microintegração de lâmina. A fim de microintegrar construções tubulares altamente celulares e livres de defeito, foi útil diminuir ligeiramente a distância de eletropulverização de 0,5 cm e abaixar a carga negativa do mandrel de -10 kV para -3 kV a partir de métodos anteriores. Durante a fabricação, PEUU pareceu rosa e brilhando no mandrel, indicativo de eletropulverização celular unifor- me. Depois da remoção do mandrel, as amostras tanto de PEUU como de PEUU/colágeno (75/25) foram descobertas ser mecanicamente robustas já que elas eram suturáveis e podiam reter seus lúmens depois da compressão.

A colocação de célula e a viabilidade nas construções micro- integradas de SMC foram investigadas inicialmente e novamente depois de 4 dias de cultura estática ou de perfusão. Depois da perfusão, as 20 amostras foram suavemente removidas dos cepos e, então, seccionadas em fatias representativas para MTT e histologia. Os resultados de MTT indicaram células viáveis 1 dia depois da fabricação. Além disso, as células permaneceram viáveis no dia 4 com uma cultura estática ou de perfusão com valores de número de célula reportados ligeiramente mais 25 altos para cultura de perfusão. As amostras foram fixadas e coradas com corantes de hematoxilina e eosina. A coloração por H&E mostrou a integração de célula inicial uniforme dentro da construção tubular.

A resistência de anel, a pressão de ruptura e a resistência de retenção de sutura foram avaliadas nas construções microintegradas depois da fabricação. As seções de tubo pequeno (anéis) eram mecani- camente robustas e flexíveis com tensão máxima e valores de tensão de 6,3 MPa e 170%, respectivamente. As amostras de anel não se rompe- ram completamente em cada caso e pareceram desprender-se ou delaminar-se ao passar pelo último valor de tensão. A fim de calcular a complascência dinâmica das construções microintegratas, as amostras foram expostas a fluxo pulsátil e a relação de pressão/diâmetro foi avaliada. Esta relação foi comparada com um artéria mamária suína (pMA) exposta ao mesmo fluxo pulsátil. A resposta mecânica de ambos o pMA e o PEUU microintegrado foi bem parecida com os valores que IO caem para ambas as amostras que caem entre um e outro. Os valores de complascência foram 1,02 ± 0,33 x IO 3 mm Hg1 para pMA e 0,71 ± 0,13 x IO'3 mm Hg-1 para PEUU microintegrada a SMC. Os valores de pressão de ruptura para todas as amostras foram maiores que 1500 mm Hg. Os valores de pressão de ruptura foram aproximações devido à natureza porosa dos tubos microintegrados.

Este método produziu andaimes elastoméricos altamente celularizados. As células eram viáveis depois da fabricação e prolifera- ram sob cultura de perfusão. A fim de estender esta tecnologia para microintegrar as células nas construções tubulares de pequeno diâme- 20 tro como um protótipo de vaso sanguíneo, foi vantajoso modificar algumas variáveis do processo. Por exemplo, a fim de destinar e eletro- pulverizar as células sobre o mandrel de menor diâmetro foi útil dimi- nuir a distância entre o bico de eletropulverização e o mandrel. Tam- bém, foi útil evitar uma grande polarização negativa sobre o mandrel. 25 Usar uma alta carga negativa para o destino de mandrel giratório resultou em defeitos de protrusão de polímero, ou “picos” no tubo que podiam romper a integridade do canal e a viabilidade de célula. Portan- to, foi útil diminuir a carga do mandrel para resultar em canais tubula- res homogeneamente celulares e fibrosos. Estas construções foram, 30 então, cultivadas sob um biorreator de perfusão para encorajar a melhor troca de nutrientes, resíduos e oxigênio para as células no interior do tubo. Os resultados de H&E e MTT indicaram células viáveis presentes dentro das construções depois da fabricação e da cultura de perfusão.

Exemplo 2 Mudanças nas Propriedades Mecânicas Devido à Arterialização de Enxerto de Veia

Na faixa de pressão arterial, um AVG é essencialmente um tubo rígido devido ao grau de sua distensão excedente (Stooker W, Gok M, Sipkema P, Niessen HW, Baidoshvili A, Westerhof N, Jansen EK, IO Wilde vuur CR e Eijsman L. Pressure-diameter relationship in the human greater saphenous vein. AnnThoracSurg. 2003; 76(5): 1533-8). Para confirmar isto, realizamos uma experiência de salto de pressão. Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 4. Pode ser visto que a veia alcança a distensão máxima em aproximadamente 30 15 mm Hg. Por conseqüência, em níveis arteriais de pressão uma veia é muito dura e esperamos contrariar este fenômeno proporcionando suporte estrutural externo temporário com uma manta adventicial biodegradável.

O grau de distensão de AVG está diretamente relacionado 20 às propriedades de veia como complascência, que, por sua vez, é relacionada às taxas de desobstrução de acordo com Davies e colabora- dores (Davies AH, Magee TR, Baird RN e Horrocks M. Prevention of malalignment during non-reversed femorodistal bypass. Ann R Coll Surg Engl. 1992; 74(6): 434-5 e Davies AH, Magee TR, Baird RN, Sheffield E, 25 e Horrocks M. Pre-bypass morphological changes in vein grafts. Eur J Vase Surg. 1993; 7(6): 642-7), que reportaram taxas de desobstrução mais baixas de AVGs menos complacentes em cirurgia de ponte de safena periférica. Esta reduzida desobstrução tem sido largamente atribuída à divergência de complascência entre o AVG e a artéria nativa à qual ele é enxertado (Bandyk DF e Mills JL. The failing graft: An evolving concept. Semin Vase Surg. 1993; 6(2): 75-7; Bassiouny HS, White S, Glagov S, Choi E, Giddens DP, e Zarins CK. Anastomotic intimai hyperplasia: Mechanieal injury or flow indueed. J Vase Surg.

5 1992; 15(4): 708-16; discussion 716-7; e Berkowitz HD, Fox AD, e Deaton DH. Reversed vein graft stenosis: Early diagnosis and manage- ment. J Vase Surg. 1992; 15(1): 130-41; discussion 141-2). As veias são inerentemente menos complacentes que as artérias (Tai NR, Sala- cinski HJ, Edwards A, Hamilton G, e Seifalian AM. Compliance proper- 10 ties of conduits used in vascular reconstruction. Br J Surg. 2000; 87(1 1): 1516-24) e tornam-se até menos complacentes na arterialização abruptamente exposta (Jacot JG, Abdullah I, Belkin M, Gerhard- Herman M, Gaccione P, Polak JF, Donaldson MC, Whittemore AD e Conte MS. Early adaptation of human lower extremity vein grafts: Wall 15 stiffness changes accompany geometric remodeling. J Vasc Surg. 2004; 39(3): 547-55). Isto aparenta que a mudança na complascência de AVG é um importante preditor de falha de AVG.

Exemplo 3 AVG coberto com uma matriz de polímero restritivo

Os dados proporcionados aqui cobrem duas áreas distintas

de pesquisa contínua: i) investigação da resposta mecanopatobiológica de segmentos de veia intactos à hemodinâmica arterial; e ii) desenvol- vimento de um polímero biodegradável que sofreu electrospinning para uso como uma manta adventicial.

Foi desenvolvido um equipamento de perfusão vascular ex

vivo para estudar as respostas de segmentos e enxertos vasculares intactos às realistas, bem controladas, condições biomecânicas e metabólicas. A Figura 3 mostra tal dispositivo. Este dispositivo permite a exposição ex vivo de segmentos da veia jugular interna suína à hemodinâmica precisamente controlada e aos gases dissolvidos (pH, ρθ2, PCO2) para simular várias condições, incluindo o ambiente de AVG venoso e realista. Alcançar estas condições controladas é realizado usando dois sistemas independentes de cultura de perfusão/órgão (mostrados esquematicamente na Figura 3). O projeto de perfusão de 5 alça fechada permite a circulação de perfusato estéril (Meio 199 de cultura de tecido suplementado com 1% de soro bovino fetal, 0,5 g/litro de Cefoxitina). Uma segunda bomba de cilindro circula um banho adventicial (DMEM com 1% de soro bovino fetal e 0,5 g/litro de Cefoxi- tina) em torno do espécime, que é montado numa câmara fechada IO hermeticamente.

Para simular a hemodinâmica e a biomecânica venosas na- tivas, a bomba de cilindro e os resistores de fluxo da alça de perfusão são configurados para proporcionar fluxo não pulsátil de 20 ml/min e pressão de 20 mm Hg. Para simular a hemodinâmica de AVG, a bomba 15 e os resistores de fluxo são configurados para proporcionar uma forma de onda de pressão pulsátil de 120/80 mm Hg e um fluxo de meio de perfusato de 100 ml/minuto. O regime de “condicionamento de AVG” começará primeiro configurando-se o sistema de perfusão para propor- cionar condições arteriais como as descitas acima. A tensão de parede 20 circunferencial num segmento de veia que sofreu perfusão será contro- lada por meio da aplicação de uma manta de polímero que sofreu electrospinning perivascular biodegradável ajustada. Isto é, o perfil da tensão de parede circunferencial da parede de metade da veia versus tempo envolverá a imposição gradual a partir de níveis venosos (apro- 25 ximadamente 25 KPa) até níveis arteriais (aproximadamente 140 Kpa de pico), aumentando linearmente ao longo de um período de 24 ou de 192 horas. Alcançar esta desejada taxa de degradação faria do condiciona- mento mecânico in vivo de AVGs uma alternativa de tratamento possível que talvez melhorasse as taxas de desobstrução em todos os AVGs.

Para, além disso, validar as capacidades de perfusão ex vi-

vo, a análise de viabilidade de tecido de segmentos de veia que sofreram perfusão sob condições venosas versus arteriais foi realizada e os resultados para o nível de linha de base de viabilidade de tecido foi comparada. Micrografia Eletrônica de varredura, coloração por H&E, coloração por Live/Dead™ e análises de TUNEL foram realizadas depois 5 de 48 horas de perfusão ex vivo (ver a Figura 5). A micrografia eletrôni- ca de varredura e a coloração por H&E indicaram que a integridade morfológica do tecido estava intacta depois do colhimento e depois de 48 horas de perfusão. As análises de Live/Dead e de TUNEL não revelaram nenhuma necrose ou apoptose significativa, respectivamente, 10 em nenhuma uma das condições venosas ou arteriais quando compa- radas à linha de base em 48 horas. Observações semelhantes foram feitas para perfusões que duram 14 dias usando uma geração antiga deste sistema (Ligush, J., R.F. Labadie, S.A. Berceli, J.B. Ochoa e H.S. Borovetz, Evaluation of endotheliumderivecL nitric oxide mediated vasodi- 15 lation utilizing ex vivo perfusion of an intact vessel. The Journal of Surgical Research, 1992, 52(5): p. 416-21). Estas experiências demons- tram a habilidade de realizar as perfusões propostas de veia jugular interna suína ex vivo, com a manutenção de condições estéreis e da viabilidade do tecido.

Vários conjuntos de experiências de perfusão vascular ex

vivo foram realizadas. Inicialmente, um conjunto de experiências (N=6 animais por conjunto) foi realizado para estabelecer a resposta hiper- plástica aguda de PIJVs abruptamente expostas às condições biomecâ- nicas arteriais e para comparar esta resposta a PIJVs expostas às 25 condições venosas nativas. A Figura 6 é uma exibição esquemática que mostra este projeto experimental, que também está descrito em detalhe abaixo. Nós, então, tentamos atenuar esta resposta hiperplástica aguda expondo gradualmente os segmentos de veia jugular interna suína (PIJVs) aos desejados perfis de CWS via ajuste manual da pressão 30 validada do sistema de perfusão vascular ex vivo (EVPS). A Figura 7 é uma exibição esquemática que mostra este projeto experimental que também está descrito em detalhe abaixo. Estas experiências estavam diretamente relacionadas a estabelecer um perfil de CWS necessário para alcançar uma resposta hiperplástica aguda reduzida por segmen- tos de veia recentemente extirpados que sofreram perfusão ex vivo sob 5 condições arteriais incrementalmente impostas comparadas a abrupta- mente expostas. Usando estes resultados, também quisemos ajustar a taxa de degradação de uma manta de polímero biodegradável adventici- al para alcançar os mesmos perfis de CWS e, então, usar esta manta para atenuar a resposta hiperplástica aguda em PIJVs comparadas a 10 controles não envoltos. A Figura 8 é uma exibição esquemática que mostra este projeto experimental, que também está descrito em detalhe abaixo. Cada uma das experiências descritas acima foram “emparelha- das” para considerar a variabilidade de animal para animal e geralmen- te, procederam como se segue. As PIJVs bilaterais foram cirurgicamen- 15 te ceifadas de porcos juvenis e amarradas em EVPSs independentes, separados (ver abaixo). As experiências de perfusão vascular foram executadas por 24 ou 72 horas uma vez que a maioria dos pontos finais sob investigação foram detectados com sucesso dentro de algumas horas a partir destes pontos de tempo (ver referências na Tabela 1, 20 acima). Na conclusão de cada experiência, o tecido foi processado (ver abaixo) para ensaios biológicos para avaliar os pontos finais esboçados na Tabela 1.

Ceifa e Transporte de Tecido

A veia jugular interna suína (PIJV) foi escolhida como um 25 modelo por causa de sua semelhança em diâmetro interno e espessura de parede com a maior veia de safena humana, e porque este tecido foi previamente usado para investigar a resposta patológica de veias expostas às condições hemodinâmicas arteriais. O procedimento de ceifa cirúrgica foi realizado na maneira de uma safenectomia para by- 30 pass. Resumidamente, o animal anestesiado foi colocado em posição supina, incisões cervicais foram bilateralmente feitas e a dissecação foi feita em camadas na fáscia vascular do pescoço. Cada PIJV foi identifi- cada e dissecada proximal à confluência jugular e distai ao forame jugular. Todos os tributários foram identificados e cuidadosamente ligados para evitar vazamento. Depois que o comprimento desejado (6-8 5 cm) foi exposto, o segmento foi canulado em cada extremidade com cânula de vaso bicuda de pato. Só antes do explante, uma pinça vascular projetada sob medida (Ligush J, Labadie RF, Berceli SA, Ochoa JB, e Borovetz HS. Evaluation of endothelium-derived nitric oxide mediated vasodilation utüizing ex vivo perfusion of an intact vessel. J IO Surg Res. 1992; 52(5): 416-21) foi presa sobre as extremidades da cânula para manter o comprimento in vivo da remoção seguinte do vaso. O vaso foi, então, cortado em um ou outro lado entre a cânula pinçada e as ligaduras. Imediatamente depois da remoção, os vasos foram colocados numa caixa de transporte estéril (contendo soluto de 15 ringer-lactato suplementado com heparina (500 unidades/litro), papa- verina (60 mg/litro) e Cefoxitina (1,0 g/litro). O tempo entre a ceifa de tecido e a montagem no sistema de perfusão descrito abaixo foi sempre menos que uma hora.

Colocação Perivascular de Manta de Polímero Biodegradável que sofreu Electrospinning

O composto de polímero biodegradável usado para formar a manta adventicial foi baseado no material de poli(éster uretano) ureia (PEUU) desenvolvido por Guan e colaboradores (Guan J, Sacks MS, Beckman EXJ e Wagner WR. Synthesis, characterization, and cytocom- 25 patibility of elastomeúc, biodegradable poly(ester-urethane)ureas based on poly(caprolactone) and putrescine. J Biomed Mater Res. 2002; 61(3): 493-503) e depois caracterizado em formato que sofreu electrospinning por Stankus e colaboradores (Stankus JJ, Guan J e Wagner WR. FabHcation of biodegradable elastomeúc scaffolds with sub-micron 30 morphologies. JBiomedMaterResA. 2004; 70(4): 603-14 e Stankus JJ, Guan J, Fujimoto K e Wagner WR. Microintegrating smooth muscle cells into a biodegradable, elastomeric fiber matrix. Biomaterials. 2006; 27(5): 735-44). Este polímero sofreu degradação hidrolítica in vitro em produtos de degradação não citotóxicos e foi mostrado degradar-se para próximo da conclusão in vivo em aproximadamente 3 meses (Fujimoto KL, Guan J, Oshima H, Sakai T e Wagner WR. In vivo evaluation of a porous, elastic, biodegradable patch for reconstructive cardiac proce- dures. Ann Thorac Surg. 2007; 83(2): 648-54 e Fujimoto KL, Tobita K, Meriyman WD, Guan J, Momoi N, Stolz DB, Sacks MS, Keller BB e IO Wagner WR. An elastic, biodegradable cardiac patch induces contractile smooth muscle and improves cardiac remodeling and function in subacute myocardial infarctíon. J Am Coll Cardiol. 2007; 49(23): 2292- 300). Para controlar a taxa de degradação da manta, um composto de PEUU, colágeno e proteínas de elastina foi utilizado, com adição de proteína usada para apressar a perda de massa.

O PEUU foi sintetizado a partir de poli(e-caprolactona)diol e 1,4-diisocianatobutano com extensão de cadeia de putrescina. PEUU, colágeno e elastina foram combinados em solução em 1,1,1,3,3,3- hexafluor-2-propanol (HFIP) e, então, sofreram electrospinning sobre um 20 segmento de PIJV usando um procedimento explicado em detalhe em outro lugar (Stankus JJ, Guan J e Wagner WR. FabHcation of biode- gradable elastomeric scaffolds with sub-micron morphologies. J Biomed Mater Res A. 2004; 70(4): 603-14). Resumidamente, as condições de electrospinning incluíram uma taxa de fluxo volumétrico de solução de 25 mistura de 0,28 μL/s, uma distância entre bico e destino de 17 cm e cargas elétricas de +12 kV para o bico e -3 kV para o destino. O destino usado para fabricação de AVGs dilatados para implantação foi um mandrel de aço inoxidável do Tipo 316 de 3 mm de diâmetro que foi cuidadosamente inserido no lúmen do AVG para evitar dano endotelial. 30 O mandrel e a veia coaxial foram girados juntos a 250 rpm e translada- dos axialmente sobre um estágio linear a uma velocidade de aproxima- damente 8 cm/s ao longo de 10 cm para produzir uma espessura de revestimento mais uniforme.

Existiam três parâmetros usados para ajustar as proprie- dades mecânicas e a taxa de degradação do polímero: 1) a concentração 5 de polímero final numa solução de mistura; 2) a relação de PEUU:colágeno:elastina na solução de mistura; e 3) a espessura da manta, que era proporcional ao tempo de electrospinning. Um sumário de todas as combinações testadas destes parâmetros é mostrado na Tabela 2.

IO Tabela 2 Sumário das combinações de parâmetros

de sintonização de polímero

Combinação PEUU: coláge no: Tempo de Electros¬ Concentração elastina pinning (min) Final (%) A 14,3:42,3:42,3 20 6 B 25:75:0 15 6 C 50:50:0 15 6 D 50:50:0 20 12 Condições de Perfusão ex vivo

Os segmentos de veia foram montados em nosso bem esta-

belecido, validado sistema de cultura de perfusão/órgão vascular ex vivo (EVPS, ver, por exemplo, Labadie RF, Antaki JF, Williams JL, Katyal S, Ligush J, Watkins SC, Pham SM e Borovetz HS. Pulsatile perfusion system for ex vivo investigation of biochemical pathways in intact vascular tissue. Am J Physíol. 1996; 270(2 Pt 2): H760-8; Severyn DA, Muluk SC e Vorp DA. The influence of hemodynamics and wall biomechanics on the thrombogenicity of vein segments perfused in vitro. J Surg Res. 2004; 121(1): 31-7 e Muluk SC, Vorp DA, Severyn DA, Gleixner S, Johnson PC e Webster MW. Enhancement of tissue 5 factor expression by vein segments exposed to coronary arterial hemody- namics. Journal of Vascular Surgery: Official Publication, the Society For Vascular Surgery [and] International Society For Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 1998; 27(3): 521-7). Resumidamente, o projeto de perfusão de alça fechada permite a circulação de perfusato 10 estéril (Meio 199 de cultura de Tecido suplementado com 1% de soro bovino fetal e 1,0 g/ litro de cefoxitina) pelo segmento vascular, como também a circulação de um banho adventicial (DMEM com 1% de soro bovino fetal e 1,0 g/litro de cefoxitina) dentro de uma câmara fechada hermeticamente. Ambos o perfusato e o meio de banho foram mantidos 15 a 37°C e níveis fisiológicos de gases dissolvidos. As experiências utiliza- ram uma de duas condições hemodinâmicas simuladas (Severyn DA, Muluk SC e Vorp DA. The influence of hemodynamics and wall biome- chanics on the thrombogenicity of vein segments perfused in vitro. J Surg Res. 2004; 121(1): 31-7 e Muluk SC, Vorp DA, Severyn DA, Gleixner S, 20 Johnson PC e Webster MW. Enhancementoftissuefactorexpressionby vein segments exposed to coronary arterial hemodynamics. Journal of Vascular Surgery: Offidal Publication, the Society For Vascular Surgery [and] International Society For Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 1998; 27(3): 521-7) - qualquer uma das condições nativas 25 venosas (VEN) ou arteriais (ART). Para simular a hemodinâmica VEM, a alça de perfusão foi configurada para proporcionar fluxo não pulsátil de 20 ml/min e pressão de 20 mm Hg. Para simular a hemodinâmica ART, o sistema foi configurado para proporcionar uma forma de onda de pressão pulsátil de 120/80 mm Hg com um fluxo de perfusato médio de 30 100 ml/minuto. As experiências separadas foram desempenhadas para examinar as veias não envoltas sob condições ART ou VEN e veias envoltas sob condições ART (wART). Cada experiência de perfusão durou 24 horas com pressão intraluminal, diâmetro exterior e taxa de fluxo sendo medidos toda hora. Os segmentos de veia foram, então, analisados ou histologicamente ou via imunohistocquímica como descrito abaixo.

Experiências VEN versus ART

A Figura 6 é uma exibição esquemática que representa o primeiro conjunto de experiências ex vivo que foram realizadas. Nestas experiências avaliamos os efeitos benéficos de uma manta de polímero biodegradável que sofreu electrospinning em PIJVs, a exposição abrupta IO de PIJVs às condições ART versus PIJVs expostas às condições VEN por

24 horas.

Experiências ART versus cART

A Figura 7 é uma exibição esquemática que representa o segundo conjunto de experiências ex vivo que foram desempenhadas. Nestas experiências avaliamos os efeitos de um paradigma de condicio- namento mecânico (condições cART) sobre PIJVs versus PIJVs abrup- tamente expostas às condições ART por 24 e 72 horas.

Experiências ART versus wART

A Figura 8 é uma exibição esquemática que representa o terceiro conjunto de experiências ex vivo que foram desempenhadas. Nós avaliamos os efeitos benéficos de uma manta de polímero biodegra- dável sintonizada sobre PIJVs em condições ART (wART) versus PIJVs não envoltas expostas às condições ART por 24 horas.

Cálculo de CWS num Cilindro de Composto

Uma vez que se acredita que uma exposição abrupta de

AVGs a níveis arteriais de CWS pode contribuir para suas modalidades de falha, acreditamos que uma aplicação potencial da manta de polí- mero biodegradável que sofreu electrospinning seria expor gradualmente os AVGs a níveis arteriais de CWS. As tentativas prévias para limitar CWS usando um revestimento externo não têm sido completamente bem sucedidas porque elas foram ou bioduráveis e/ou de ajuste frouxo. Para demonstrar como a manta pode modular CWS e como a manta 5 pode ser ajustada para alcançar os resultados desejados, examinamos o perfil de CWS com o passar do tempo para cada uma das combina- ções de manta dadas na Tabela 1 e comparamos estes aos segmentos de veia não envoltos expostos às condições venosas ou arteriais. Isto foi alcançado usando os dados coletados de experiências de perfusão ex IO vivo e de um modelo matemático para CWS.

Para os propósitos de modelagem biomecânica, considerem- se as exibições esquemáticas na Figura 9 que mostram um corte transversal idealizado do complexo veia/manta. A camada exterior do tubo composto de bicamada é tomada como a manta de polímero que 15 sofreu electrospinning e a camada interna concêntrica é o segmento de veia.

As suposições seguintes foram, então, feitas (Vorp DA, Ra- ghavan ML, Borovetz HS, Greisler HP e Webster MW. Modeling the transmural stress distríbution during healing of bioresorbable vascular prostheses. AnnBiomedEng. 1995; 23(2): 178-88):

i) não existe deslizamento ou separação entre as camadas;

ii) a compatibilidade de deformação através da interface é

mantida;

iii) existe só uma pequena deformação sob pressão arterial

média;

iv) o sistema está sob um estado de tensão plana;

v) ambas as camadas são materiais incompressíveis, isotró- picas, homogêneos e linearmente elásticos; vi) cada camada separada pode ser generalizada como um único cilindro, de parede espessa, cercado sujeita a pressão interna e externa.

O modelo matemático desenvolvido por Vorp e colaborado- 5 res (Id.) foi adaptado para o modelo representado pela Figura 9. Em resumo, usamos a clássica solução de Lamé para tensões de parede radial e circunferencial (or e οθ, respectivamente), e deformação radial (ur) em qualquer raio, r, num cilindro aberto, de paredes espessas sob a ação de pressões internas e externas (Id.). Para a camada interna (veia) IO mostrada na Figura 9, obtemos (Id.):

2? 2

0V.V =

_ a1Pi -VP2 (Pi -P2)a2b Cb2 - a2)r2

b2 -a2

a2Pi - b P2 (Pi-P2)flV

b2 - a2 (b2 - a2)r2

Ur,V ~

1 - Kv (a2Pi - b2P2)r \ + Vy (Pi - P2)a2b2

b2 - a2

Ev (b2 - a2)r

"\

(15a)

S» para a.<,r<b (15b)

(16)

onde ο “V” subscrito refere-se às quantidades com respeito à veia e a e b são os raios interno e externo, respectivamente, da cama- da de veia. Pi é a pressão interna e P2 é a pressão interfacial que age 15 entre as duas camadas do cilindro concêntrico resultante de sua diferença em propriedades mecânicas, v é a relação de Poisson e E é o módulo de elasticidade de Young. Para a camada exterior (manta) mostrada na Figura 9, temos: 2

_ VP2-CiP0 (Ρj -Pa)b c

0r’W ~ -2 .2

C2-bz (c2 -b2)r2

(17a)

2 2

, _b‘p2-ep, ,(P2-Pjb2C σ'*~ S -b2 + (c=-y)r»

S- para b<.r<c

(17b)

urU/ =■

I-Vw (b2P2 —c2P0)r l + Vw (P2 ~P0)b2c

c2-b2

■ + -

(c —b)r

(18)

onde o “W’ subscrito refere-se às quantidades da região ocupada pela manta, e b e c são os raios interno e externo, respectivamente, da camada de manta. Po é a pressão externa. Com compatibilidade de deformações através da interface entre as camadas, deve ser que:

Wr,v = Ur.w em r=b (19)

Substituindo (16) e (18) em (19), deixando vw = vv = v = 0,5 (ambos os materiais assumidos para serem incompressíveis), configu- rando Po = O (isto é, pressão atmosférica), e resolvendo para P2, obte- mos:

P =_U2Pi(I-V)Ew^C2 -b2)+{l + y)Ew(c2-b2^a2P1_

2 b2(\-v)Ewb(c2-b2) + (l-v)a3Ev(b2-a2) + (l + v)Ew(c2-b2)ba2 + c2Evb(b2 -a2)

Seja relembrado que Pi e o diâmetro exterior (isto é, c) fo- ram medidos em nossas experiências de perfusão ex vivo. Portanto, tivemos que estimar os raios interno (r = a) e interfacial (r = b) para cada 15 conjunto de Pi e c medido. Uma vez que utilizamos a suposição que ambas a veia e manta são materiais incompressíveis, que exigem que o volume de cada cilindro seja constante em qualquer estado de deforma- ção, deve ser que:

[x(r02 - rf )4 = [π{κσ2 - r,2 )l\ (21)

onde Π3 e n são os raios externo e interno, respectivamente, e L é o comprimento de cada cilindro, e os u e p subscritos referem-se aos estados despressurizado e pressurizado, respectivamente. Aplicar a equação (21) para a geometria do cilindro “de manta” na Figura 9, rende:

ser calculado. De modo semelhante, ao considerar só o cilindro “de veia” na Figura 9 e utilizar a equação (22) para bp, encontramos:

e avaliando na pressão média arterial e r = -p ^&p , podemos calcular a CWS da parede do meio na veia envolta de polímero. Nós assumimos 15 que Ew = 7,5 MPa (Stankus JJ, Guan J e Wagner WR. Fabrication of biodegradable elastomeric scaffolds with sub-micron morphologies. J Biomed Mater Res A. 2004; 70(4): 603-14) e que Ev = 600 KPa (Wesly RL, Vaishnav RN, Fuchs JC, Patel DJ e Greenfield JC. Static linear and nonlinear elastic properties of normal and arterialized venous tissue in 20 dog and man. Circulation Research (Online). 1975; 37(4): 509-20) em nossos cálculos.

Para avaliar os efeitos do processo de electrospinning na vi- abilidade de tecido, examinamos os segmentos de PIJV com (“dilatado”) e sem (“simulado”) a manta de polímero no lugar, bem como tecido não tratado recentemente extirpado (“de controle”). Para os segmentos de

(22)

5

Portanto, para qualquer Cp e Lp medido, um valor de bp pode

(23)

Substituindo as equações (20), (22) e (23) na equação (15b)

+ b„

Experiências de Provocação Vasomotora PIJV simulados sem a manta de polímero que sofreu electrospinning, imitamos o processo de electrospinning até o ponto de realmente colocar a manta de polímero (isto é, incluindo a inserção do mandrel e giran- do/transladando a veia dentro do campo elétrico). A funcionalidade do 5 tecido foi avaliada usando uma provocação vasomotora ex vivo como previamente descrita (Labadie RF, Antaki JF, Williams JL, Katyal S, Ligush J, Watkins SC, Pham SM e Borovetz HS. Pulsatile perfusion system for ex vivo investigation of biochemical pathways in intact vascu- lar tissue. Am J Physiol 1996; 270(2 Pt 2): H760-8 and Ligush J, IO Labadie RF, Berceli SA, Ochoa JB e Borovetz HS. Evaluation of endothe- lium-derived nitric oxide mediated vasodilation utilizing ex vivo perfusion of an intact vessel. J Surg Res. 1992; 52(5): 416-21). Em resumo, os segmentos de vaso foram canulados, colocados sob uma pressão intraluminal constante de 20 mm Hg e expostos a doses com aumentos 15 de epinefrina (EPI). Ao longo da experiência, o diâmetro do vaso exterior (D) foi continuamente medido com um micrômetro de laser (Labadie RF, Antaki JF, Williams JL, Katyal S, Ligush J, Watkins SC, Pham SM e Borovetz HS. Pulsatile perfusion system for ex vivo investigation of biochemical pathways in intact vascular tissue. Am J Physiol. 1996; 20 270(2 Pt 2): H760-8; Brant AM, Rodgers GJ e Borovetz HS. Measure- ment in vitro of pulsatile arterial diameter using a helium-neon laser. J Appl Physiol. 1987; 62(2): 679-83; e Ligush J, Labadie RF, Berceli SA, Ochoa JB e Borovetz HS. Evaluation of endothelium- derived nitric oxide mediated vasodilation utilizing ex vivo perfusion of an intact vessel. J 25 Surg Res. 1992; 52(5): 416-21). O diâmetro de linha de base (Dünha de base) foi medido antes da injeção da primeira dose de EPI. EPI foi subse- quentemente injetado para concentrações finais de 2x10 5, 2x10 4, e 2xl0'3 mg/ml aos 1, 4,5 e 10 minutos, respectivamente. Em seguida à observação de vasoconstrição maximal com cada dose, cada dose 30 subsequente foi administrada. Depois da administração da dose maximal de EPI e observação do nível maximal de constrição (Dconstricto), um bolo de 2 ml de 25 mg/ml de sódio nitroprussida (SNP) foi injetado para dar uma concentração final de 0,125 mg/ml. Quando a dilatação completa foi observada, Ddiiatado foi registrado. O nível de constrição em resposta ao EPI foi calculado como:

/° Constrição Dlinha de base — Dconstricto * 100

Dconstricto

De modo semelhante, o nível de dilatação em resposta a SNP foi calcu- lado como:

% Dilatação = Ddilatado — Dconstricto * 100

pressão pulsátil intraluminal (Pj foram feitas durante as experiências de perfusão de 24 horas ART versus wART (N=6) descritas acima. Estas medidas foram usadas para calcular a complascência (C) e a dureza-β 08) de ambas as PIJVs dilatadas e de controle de similação. Usando uma frequência de amostragem de 150 Hz, as medidas de hora em hora foram tomadas por 5 segundos de forma que aproximadamente 5 “ciclos cardíacos” completos de dados foram coletados. Os sinais adquiridos foram, então, filtrados e plotados. Usando os valores máximo (ODs e Ps) e mínimo (ODd e Pd) para todo o ciclo, a equação 26 foi usada para calcular Cea equação 27 foi usada para calcular β (Hayashi K. Ex- perimental approaches on measuring the mechanical properties and constitutive Iaws of arterial walls. J Biomech Eng. 1993; 115(4B): 481- 8). Os 5 valores foram rateados e os valores únicos de C e β foram calculados a cada hora.

Dconstrieto

IO

Complascência e Medidas de dureza-β

De hora em hora as medidas de diâmetro exterior (OD) e

(26)

(27) Processamento de Tecido Pós-perfiisão

Nós avaliamos as pontos finais a partir de experiências de duração de 1 dia e de 3 dias. Nós estabelecemos que a manutenção da viabilidade do tecido é realizável para esta duração de perfusão quando utilizando segmentos vasculares recentemente extirpados (Ligush J, Labadie RF, Berceli SA, Ochoa JB e Borovetz HS. Evaluation of endo- thelium-derived nitric oxide mediated vasodilation utilizing ex vivo perfusion of an intact vessel. J Surg Res. 1992;52(5): 416-21). A resposta hiperplástica das veias será quantificada medindo-se os vários pontos finais cuidadosamente escolhidos resumidos na Seção 1.2. Estes pontos finais podem ser agrupados em três categorias baseadas no processamento de tecido exigido: i) histologia (incluindo mi- cro/ultraestrutura); ii) análise de RNA; e iii) análise de proteína. Todos os segmentos de veia foram segmentados e processados de acordo com a Figura 10.

Análises Biológicas

Os pontos finais biológicos propostos acima podem ser ca- racterizados como com base histológica ou molecular com respeito ao tipo de ensaio exigido. Os pontos finais histológicos incluíram avaliação 20 de microestructura, apoptose, proliferação, um indicador fenotípico de SMC e um indicador de adesão celular. Os pontos finais de expressão de proteína de gene exigiram o isolamento de proteína e RNA e são classificados como moleculares.

As amostras dedicadas para análise histológica (Figura 10) 25 foram tiradas do congelador e imediatamente embebidas em Tissue Freezing Medium™ (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) e congeladas a -65°C. Seções transversais de cinco mícrons foram cortadas usando um criótomo e colocadas em lâminas de vidro de microscópio positivamente carregadas. As lâminas foram armazenadas 30 a -80°C até que elas podiam ser processadas para ensaios histológicos ou imunohistoquímicos.

Histologia

Em seguida à remoção seguinte das veias do sistema de perfusão ex mvo, elas foram fixadas em 4% de paraformaldeído por 4 5 horas a 4°C seguido por 30% de sacarose a 4°C durante a noite. Os anéis de tecido de 5mm foram cortados, lavados com PBS, embebidos em Tissue Freezing Medium™ (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) e cortados em seções de 5 μιη. As seções de tecido foram coradas com hematoxilina e com eosina (H&E), ou Tricromo do Masson (MTC), IO ou vermelho picrosirius ou corantes de pentacromo de Movat. As seções de tecido coradas foram, então, visualizadas usando um micros- cópio de luz Olympus Provis (Olympus, Center Valley, PA, EUA) e comparadas qualitativamente.

Microscopia Eletrônica de Varredura

As PIJVs envoltas que sofreram electrospinning foram exa-

minadas sob Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM). Em resumo, os segmentos de tecido designados para SEM foram fixados em ultrapu- ro gluteraldeído a 2,5 %, desidratados por uma série graduada de soluções de etanol (30-100%), secados em ponto crítico (Emscope, CPD 20 750, Ashford, Kent, Reino Unido), então revestidos com carbono vapori- zado (Cressington freeze Fracture Device, Cressington, Oxicoco, PA, EUA). O tecido foi visualizado usando um SEM de canhão de emissão de campo JEOL JEM-6335F (JEOL, Peabody, MA, EUA).

Necrose

Para avaliar os efeitos do processo de electrospinning na vi-

abilidade do tecido, examinamos os segmentos dilatados e simulados de PIJV, bem como o tecido não tratado recentemente extirpado (“de controle”). A necrose de tecido foi examinada usando coloração Li- ve/Dead™ (Molecular Probes, Carlsbad, CA, EUA) de crioseções, de acordo com as instruções do fabricante. Cada segmento (de controle, de controle de simulação e dilatado) pretendido para coloração Li- ve/Dead™ foi cortado na metade e colocado em cultura estática dentro de um prato de Petri sob condições de incubadora padrões. Uma 5 metade de cada segmento foi avaliada depois de 18 horas de cultura, a outra depois de 92 horas. Anéis de 5 mm foram cortados de cada amostra e embebidos em criomatrix (TBS, Durham, NC) e depois congelados. Cinco seções de 8 μπι foram cortadas de cada anel e representadas sob 20x de ampliação usando um microscópio epifluo- IO rescente (Nikon, Model E800, Melville, NY, EUA). Duas imagens foram tomadas por seção, de forma que um total de 10 campos de vista foram quantificados por segmento de PIJV. Imagem de Scion (Versão Beta 4.02, NIH, Bethesda, MD) foi usada para contar o número total de células num campo de vista. Para determinar a porcentagem de células 15 vivas num campo de vista, as células mortas foram contadas manual- mente, divididas pelo número total de células e multiplicadas por 100%. A porcentagem de células mortas foi subtraída de 100% para calcular a porcentagem de células vivas.

Apoptose

A apoptose foi avaliada usando o In Situ Cell Death Kit, flu-

oresceína (TUNEL) (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Este ensaio usa a tecnologia de TUNEL que identifica o componente de clivagem de DNA genômico de apoptose. Resumidamente, cortes transversais foram secados a 37°C por 20 minutos, fixados em 4% de 25 paraformaldeído por 20 minutos e re-hidratados em tampão fosfato- salino (PBS) por 30 minutos. As amostras foram, então, incubadas em temperatura de quarto por 10 minutos cada em 10μg/ml de Proteinase K seguidos por uma solução recentemente preparada de 0,1 % de Triton X-100 e 0,1 % de citrato de sódio para a permeabilização de membra- 30 nas. Rupturas de fita de DNA foram identificadas por incubação a 37°C por uma hora com Terminal deoxinucleotídeo transferase e fluoresceína denominada dUTP (ambos proporcionados no kit de Roche). Os núcleos foram descorados com Hoechst 33258. Um conjunto pequeno de amostras foi tratado com lOOU/ml de DNase I para servir como contro- les positivos cada vez que o ensaio foi realizado para assegurar a 5 eficácia. Todos os parâmetros de preparação de amostra, incluindo tempos de incubação, temperaturas e concentrações de reativo, foram otimizados usando controles positivos tratados de DNase I. Os contro- les negativos foram incubados com dUTP etiquetadas sem a enzima transferase.

A quantificação do porcentual de células positivas de TÚ-

NEL foi desempenhada usando um procedimento de contagem manual. As células positivas de cada um dos 5 FOVs (campos de vistas) de um dado corte transversal de 5 μηι foram rateadas para definir a média porcentual de células positivas para aquele corte transversal. A média 15 porcentual de células positivas de TUNEL de um segmento (Figura 10) foi ideterminada.

Proliferação

A proliferação foi avaliada pela expressão de proliferação de antígeno de célula nuclear (PCNA) determinada por imunohistoquímica. Os cortes transversais de cinco mícrons foram secados, fixados e permeabilizados como descrito para o ensaio de TUNEL. A ligação não específica de anticorpos foi bloqueada incubando as amostras por 15 minutos com 1% de soro de cavalo em PBS. Após isto, as amostras foram incubadas com um anticorpo primário monoclonal de camun- dongo contra o PCNA humano (Dako Cytomation, Clone PC10, Dina- marca) durante a noite a 4°C, numa câmara úmida, para prevenir a secagem da amostra. O anticorpo primário não ligado foi removido por lavagens subsequentes em PBS. Em seguida, cortes transversais foram incubados com um anticorpo secundário biotinilado universal (anti-rato e anti-coelho) que foi parte da peroxidase de horse-radish de Vectastain Elite™ e do sistema de detecção avidina-biotina (Vector Labs, Cat.# PK- 6200, Burlingame, CA) por 60 minutos a 37°C numa câmara úmida e, então, enxaguados 3 vezes com PBS. A incubação com o reativo de Vectastain™ foi, então, desempenhada por 30 minutos em temperatura de quarto. Para detectar células positivamente coradas, um substrato de diaminobenzidina (DAB) (Vector Labs, Cat.# SK-4100, Burlingame, CA) foi usado. A reação enzimática fez com que as células positivas de PCNA corassem de marrom, o que foi visualizado via microscópio (IOOx de ampliação) até que o nível desejado de coloração fosse alcançado. A IO reação foi, então, parada colocando-se as lâminas em água deioinizada. Para a visualização nuclear, as células foram descoradas com Hemato- xilina (Vector Labs, Cat.# H-3401, Burlingame, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação do porcentual de células positivas de PCNA foi desempenhada usando a mesma metodologia que para o TUNEL.

Fenôtipo de SMC

Para detectar um fenótipo de SMC sintético, usamos um anticorpo monoclonal de camundongo aplicado contra o complexo de Golgi humano (Abcam, Cat.# abl4487, Cambridge, MA). O mesmo 20 procedimento como descrito acima (PCNA) foi usado para quantificar a porcentagem média de células positivas de complexo de Golgi por segmento de veia.

Estatística

Para os dados de provocação vasomotora e os dados de quantificação de imagem imunohistoquímica, foi realizado um teste t de Student emparelhado para média e P<0,05 foi considerado estatistica- mente significativo. A menos que de outra forma declarado, todos os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Resultados Perfis de CWS

O suporte estrutural oferecido a uma veia pela manta é evi- dente quando examinarmos os perfis de diâmetro externo na Figura 11. Foi mostrado que uma veia com uma manta não se expande para o 5 mesmo grau sob condições ART como uma veia sem uma manta. A redução em diâmetro efetivamente reduziu o CWS na parede de veia versus controles não envoltos sob o mesmo nível de pressão arterial como descrito abaixo.

O perfil de CWS com o passar do tempo para as combina- IO ções de solução de polímero da Tabela 3.1 era bastante variável (Figura

12). Num caso (combinação B), a manta degradou-se muito depressa e resultou num aumento rápido em CWS sob condições ART. Outras combinações (C e D) não degradaram-se depressa o suficiente e resulta- ram em nenhum aumento apreciável em CWS ao longo de um período 15 de 24 horas. A combinação A degradou-se numa taxa que resultou numa variação quase linear ao longo do período de 24 horas entre níveis VEN e ART de CWS. Esta combinação foi repetida (N=7) e o efeito foi encontrado ser repetível.

Resultados de Provocação Vasomotora

Os resultados de uma típica experiência de provocação va-

somotora são mostrados na Figura 13. O segmento de PIJV simulado respondeu numa maneira dependente de dose previsível para a excita- ção com EPI, enquanto a PIJV dilatada exibiu uma contração única começando com a dose mais baixa de EPI. A vasodilatação em resposta 25 a SNP foi semelhante para ambas as PIJVs de controle e dilatada, cada uma resultando num diâmetro exterior maior que aquele em linha de base, sugerindo um certo nível de tom basal em ambas as PIJVs simu- lada e dilatada. Geralmente, não existiu diferença significativa no nível de contração (Figura 14A) ou de dilatação (Figura 14B) entre os segmen- 30 tos de PIJV simulada e dilatada. Complascência e dureza-β

Nas Figuras 15A e 15C, vemos que as PIJVs são muito du- ras (e consequentemente, muito menos complacentes) quando expostas a níveis arteriais de pressão. Sob as mesmas condições hemodinâmi- 5 cas, a manta de polímero ajustada que foi dilatada sobre a superfície adventicial das PIJVs ofereceu suporte estrutural que é evidente pela dureza diminuída (Figura 15B) e complascência aumentada (Figura 15D). Por favor, note que devido a assuntos técnicos, a pressão e as medidas de diâmetro para um dentre os controles de simulação não IO foram possíveis e, deste modo, existia um conjunto a menos de dados (N=5) que no grupo dilatado (N=6).

Análises Biológicas Histologia

As imagens histológicas foram consistentes com as imagens 15 de SEM já que elas também mostraram que a manta de polímero está bem presa à superfície adventicial da veia e que ela pode sofrer electros- pinning com uma espessura aproximadamente uniforme (Figuras 16A e 19C). Além disso, o polímero degradou-se quase completamente em seguida ao período de 24 horas de perfusão (Figuras 16B e 16D).

A Figura 17 mostra imagens de birefringência representati-

vas de seções de veia coradas com vermelho picrosirius. Em cada imagem, a faixa de cor de vermelho até verde indica uma faixa de organização de fibra de colágeno com vermelho sendo mais organizado e verde sendo menos organizado. A aparência granulada da coloração 25 indica o estado de fibra de colágeno corrugado natural, considerando que as fibras estiradas parecerem estriadas em vez de granuladas. Estes resultados sugerem que a manta de polímero reduz o nível de fibra de colágeno que estira (incluindo a melhor organização e a reduzi- da corrugação) quando comparado a um segmento de PIJV de controle que sofreu perfusão ex vivo sob condições ART por 24 horas.

As imagens representativas de seção de tecido corada por pentacromo de Movat são mostradas na Figura 18. A lâmina elástica interna parece rota nas PIJVs que sofreram pefusão sob condições ART 5 quando comparada a ambas as condições VEN e wART. Como com o corante vermelho picrosirius, este dados sugerem que a manta de polímero foi bem sucedida em reduzir o nível de estiramento dentro da parede da veia quando exposta a condições ART.

SEM

IO A manta adventicial que sofreu electrospinning exibiu poro-

sidade alta e aderência apertada para a superfície adventicial das veias (Figuras 19 A-C), o que sugere que a manta proporcionaria suporte estrutural para um AVG sem inibir o nutriente adventicial e a difusão de gás no tecido. Outra observação importante foi que o processo de 15 electrospinning não pareceu danificar a camada endotelial, que perma- neceu contínua (Figura 19D).

Necrose

Não existiu diferença significativa em viabilidade do tecido entre cada grupo experimental para cada ponto no tempo (Figura 20).

Apoptose

A Figura 21 mostra imagens de imunohistoquímica fluores- centes representantivas que formaram um par de coloração por TUNEL de todas as quatro experiências de perfusão vascular ex vivo descritas acima. A Figura 22 mostra os resultados de análise de TUNEL quantifi- 25 cados destas experiências. Pode ser visto que existe um aumento por meio estatisticamente significativo em células apoptóticas dentro de PIJVs abruptamente expostas a condições ART versus controles VEN. Todavia, o paradigma de condicionamento mecânico imposto via condi- ções cART (para ambas 24 e 72 horas) e via a manta de polímero biodegradável que sofreu electrospinning (condições wART) estatística e significativamente reduziu o número de células apoptóticas dentro das PIJVs versus condições de controle ART.

Proliferação

A Figura 23 mostra imagens representativas de imunohis- toquímica baseada em HRP/ABC emparelhados de coloração por PCNA de todas as quatro experiências de perfusão vascular ex vivo descritas acima. A Figura 24 mostra os resultados de análise de TUNEL quantifi- IO cados destas experiências. Pode ser visto que existe uma estatistica- mente significativa diminuição em células em proliferação dentro de PIJVs abruptamente expostas a condições ART versus controles VEN. Todavia, o paradigma de condicionamento mecânico imposto via condi- ções cART (24 horas) e via a manta de polímero biodegradável que 15 sofreu electrospinning (condições wART) estatística e significativamente inibiu a diminuição no número de células em proliferação dentro das PIJVs versus condições de controle ART. O número de células em proliferação dentro das PIJVs expostas a condições cART por 72 horas não foi estatística e significativamente diferente que os controles ART.

Fenótipo de SMC

A Figura 25 mostra imagens representativas de imunohis- toquímica baseada em HRP/ABC emparelhados de coloração por complexo de Golgi de todas as quatro experiências de perfusão vascular ex vivo descritas acima. A Figura 26 mostra os resultados de análise de 25 complexo de Golgi quantificados destas experiências. Pode ser visto que existe um aumento estatisticamente significativo no número de células que coram positivo para o complexo de Golgi dentro das PIJVs abrup- tamente expostas a condições ART versus controles VEN. O paradigma de condicionamento mecânico imposto via condições cART (para ambas 30 24 e 72 horas) e via a manta de polímero biodegradável que sofreu electrospinning (condições wART) sugere só uma tendência para estatís- tica e significativamente inibir o aumento no número de células positi- vamente coradas pelo complexo de Golgi dentro das PIJVs versus condições de controle ART.

Discussão

O trabalho apresentado neste capítulo mostra que uma manta de polímero biodegradável que sofreu electrospinning pode sofrer uniforme (Figura 16) e seguramente (Figuras 13 e 14) electrospinning sobre segmentos de veia e que a manta pode ser sintonizada para IO degradar-se completamente (Figura 16) de tal modo que CWS é aplicado a um AVG numa taxa desejada (Figura 12). Ter o controle sobre a taxa de biodegradação de uma manta de polímero que sofreu electrospinning adventicialmente posicionada podia emprestar-se a si mesmo para três modalidades de suporte potencialmente benéficas para atenuar a IH em 15 AVGs. Como mostrado aqui, o suporte biomecânico pode ser entregue numa taxa desejada. Por conseqüência, a liberação de ambos os suportes bioquímicos (drogas) e biológicos (celulares) poderia ser teoricamente alcançada usando a mesma abordagem (Stankus JJ, Guan J, Fujimoto K e Wagner WR. Microintegrating smooth muscle cells 20 into a biodegradable, elastomeric fiber matrix. Biomaterials. 2006; 27(5): 735-44 e Stankus JJ, Soletti L, Kazuro F, Hong Y e Vorp DA. Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. 2007; Accepted). Os efeitos potenci- almente benéficos da manta de polímero em microestructura de AVG

foram observados a partir da coloração por vermelho picrosirius e pentacromo de Movat (Figuras 17 e 18, respectivamente). A manta de polímero parece proporcionar suporte estrutural para os AVGs, o que resulta numa configuração mais naturalmente corrugada das fibras de colágeno (Figura 17), como também menos dano para a lâmina elástica 30 interna (Figura 18). Manter a integridade das proteínas estruturais que compreendem a parede do AVG pode ajudar a minimizar os disparado- res mecânicos prejudiciais recebidos pelos ECs e SMCs vasculares e consequentemente podia ajudar a atenuar a IH em AVGs. Também avaliamos o nível de necrose via coloração por Live/Dead™ nas PIJVs que sofreram electrospinning e mostramos nenhum aumento apreciável 5 em necrose devido ao electrospinning nos controles estático e simulado (Figura 19). Estes dados, além dos dados de provocação vasomotora (Figuras 13 e 14), são mais evidências para mostrar que a viabilidade do tecido não é afetada por electrospinning.

Os resultados de imunohistoquímica sugerem que a exposi- IO ção gradual versus abrupta de AVGs aos níveis arteriais de CWS pode ser benéfica. O saldo entre apoptose e proliferação, como visto nas Figuras 22 e 24, respectivamente, foi mostrado ser interrompido devido à exposição abrupta de PIJVs às condições ART sobre os controles VEN. O aumento observado em apoptose e a redução em proliferação em PIJVs que sofreram perfusão sob condições ART sugerem que existe uma imediata mudança na função celular devido ao ambiente biomecâ- nico alterado da veia. Este mudança na função celular dentro das veias foi mostrado ser inibido por imposição mais gradual de níveis arteriais de CWS via condições de perfusão ex vivo cART e wART. Além disso, conforme esperado, o nível de expressão de complexo de Golgi em PIJVs expostas às condições ART foi aumentado acima dos controles VEN (Figura 26), sugerindo uma modulação no fenótipo de SMC para um estado mais sintético. Esta mudança observada na função celular não foi estatística e significativamente inibida pela exposição gradual de CWS a níveis ART via condições cART ou wART. Uma tendência obser- vada para a inibição, porém, desta mudança foi mostrada na Figura 26. Experiências adicionais são exigidas para determinar se esta tendência torna-se estatisticamente significativa.

A alteração observada em fenótipo de SMC que resultou de expor PIJVs a condições ART concorda com os dados previamente reportados (Simosa HF, Wang G, Sui X, Peterson T, Narra V, Altieri DC e Conte MS. Survivin expression is up-regulated in vascular injury and identifies a distinct cellular phenotype. J Vase Surg. 2005;41(4): 682- 90; Zhang WD, Bai HZ, Sawa Y, Yamakawa T, Kadoba K, Taniguchi K, Masuda J, Ogata J, Shirakura R e Matsuda H. Association of smooth 5 muscle cell phenotypic modulation with extracellular matrix alterations during neointima formation in rabbit vein grafts. J Vase Surg. 1999; 30(1): 169-83; e Wolff RA, Malinowski RL, Heaton NS, Hullett DA e Hoch JR. Transforming growth factor-betal antisense treatment of rat vein grafts reduces the accumulation of collagen and increases the accumula- IO tion of h-caldesmon. J Vase Surg. 2006; 43(5): 1028-36). Oconceitode imposição mais gradual de níveis arteriais de CWS para os AVGs não foi previamente reportado, mas podia resultar num meio para retardar ou inibir a modulação fenotípica de SMC que por conseqüência podia reduzir a resposta hiperplástica. A redução em apoptose em PIJVs 15 expostas às condições ART versus VEN também concorda com os resultados publicados (Liu B, Itoh H, Louie O, Kubota K e Kent KC. The signaling protein rho is necessary for vascular smooth muscle migration and survival but not for proliferation. Surgery. 2002; 132(2): 317-25; Pintucci G, Saunders PC, Gulkarov I, Sharony R, Kadian- Dodov DL, 20 Bohmann K, Baumann FG, Galloway AC e Mignatti P. Anti-proliferative and antiinflammatory effects of topical mapk inhibition in arterialized vein grafts. Faseb J. 2006; 20(2): 398-400; Alcocer F, Whitley D, Salazar J, Jordan W e Bland KI. Mutual exclusion of apoptosis and hsp70 in human vein intimai hyperplasia in vitro. J Surg Res. 2001; 25 96(1): 75-80; Igase M, Okura T, Kitami Y e Hiwada K. Apoptosis and bcl- xs in the intimai thickening of balloon-injured carotid arteries. 1999; 96(6): 605-12; Kamenz J, Seibold W, Wohlfrom M, Hanke S, Heise N, Lenz C e Hanke H. Incidence of intimai proliferation and apoptosis following balloon angioplasty in an atherosclerotic rabbit model. Cardio- 30 vasc Res. 2000; 45(3): 766-76; e Wang GJ, Sui XX, Simosa HF, Jain MK, Altieri DC e Conte MS. Regulation of vein graft hyperplasia by survivin, an inhibitor of apoptosis protein. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005; 25(10):2081-7). Todavia, a redução em proliferação em PIJVs que sofreram perfusão por ART versus grupos VEN, cART e wART foi incon- sistente com alguns dados publicados (Nishibe T, Miyazaki K, Kudo F, Flores J, Nagato M, Kumada T e Yasuda K. Induction of angiotensin converting enzyme in neoíntima after intravascular stent placement. Int Angiol. 2002; 21(3):250-5; Predel HG, Yang Z, von_Segesser L, Turina M, Buhler FR e Luscher TF. Implications ofpulsatile stretch on growth of saphenous vein and mammary artery smooth muscle. Lancet. 1992; 340(8824): 878- 9 e Dethlefsen SM, Shepro D e D1Amore PA. Compari- son of the effects of mechanical stimulation on venous and arterial smooth muscle cells in vitro. J Vase Res. 1996; 33(5): 405-13). Liu e colaboradores sugeriram, porém, que o estiramento mecânico devido à hemodinâmica arterial induz à morte da célula, o que possivelmente medeia a proliferação de célula subsequente (Liu B, Itoh H, Louie O, KubotaKeKentKC. Thesignalingproteinrhoisnecessaryforvascular smooth muscle migration and survival but not for proliferation. Surgery. 2002; 132(2): 317-25). Os pontos de tempo em curto prazo estudados nesta dissertação podem não ter sido longos o suficiente para ver uma subida na proliferação depois do aumento inicial em apoptose nas PIJVs que sofreram perfusão ART.

Várias limitações deste capítulo devem ser notadas. Embo- ra a analise Live/Dead™ seja usada extensamente para avaliar a necrose em células e tecidos vivos, discutivelmente não foi idealmente adequada para o nosso pedido. Isto foi devido à distância limitada que 25 os reativos puderam difundir pela espessura do tecido vascular. Foi observado que a coloração ocorreu predominantemente nas camadas intimai e adventicial da parede da veia, enquanto o meio foi largamente destituído de sinal. É verdade que o efeito adverso do processo de electrospinning estaria na área de contato entre a manta de polímero e a 30 parede da veia (isto é, a adventicia), como também na área de contato entre o mandrel e a parede da veia (isto é, o lúmen). O ensaio Li- ve/Dead™ pareceu trabalhar bem em ambas destas áreas e mostrou nenhum aumento apreciável no nível de necrose quando comparado ao tecido de controle. Além disso, os dados de provocação vasomotora indicaram que a PIJV dilatada poderia contrair com a mesma intensi- 5 dade que a de controle de simulação, o que demonstrou a viabilidade das SMCs compreenderem a camada mediai do tecido. Finalmente, teríamos comparado idealmente as respostas vasomotoras das PIJVs simuladas e dilatadas a uma resposta de controle de linha de base - isto é, com um segmento de PIJV recentemente extirpado. Todavia, obter IO um terceiro segmento de PIJV para prova imediata não foi possível uma vez que podíamos ceifar apenas dois segmentos de PIJV por animal. Nós sentimos que a escolha de um controle de simulação sobre um controle de linha de base foi aceitável naquilo que quisemos avaliar as diferenças associadas só com electrospinning.

Conclusão

Mostramos aqui que uma manta de polímero ajustável pode ser aplicada a segmentos de veia sem comprometer a viabilidade ou a função, e demonstramos uma aplicação potencial; isto é, gradualmente impor o CWS da parede do meio em veias envoltas expostas a níveis 20 arteriais de pressão. A imposição gradual de níveis arteriais de CWS, em lugar da exposição abrupta, pode ser um importante novo meio para reduzir a resposta hiperplástica de AVGs, promovendo, ao invés, a arterialização segura.

A incorporação de produtos farmacêuticos ou de células 25 numa manta de polímero adventicial representa uma aplicação futura possível e pode, além disso, realçar a desobstrução de AVGs. Para nosso conhecimento, a liberação controlada de suporte celular via uma manta/revestimento de AVG biodegradável não foi previamente reporta- da e consequentemente esta possível aplicação futura da manta adven- 30 ticial seria inovativa. O polímero que foi usado neste Relatório foi caracterizado e, com sucesso, microintegrado com SMCs viáveis e emprestaria a si mesmo para esta possível aplicação futura.

Exemplo 4 Enxerto de Veia Arterial In Vivo

5 Oito (n=8) experiências de enxerto de veia de interposição

da carótida tipo “prova de conceito” foram realizadas. Nós quisemos avaliar o efeito de mitigação da manta adventicial de PEUU que sofreu electrospinning sobre a resposta hiperplásica aguda e crônica de seg- mentos de veia implantados como enxertos de interposição da carótida IO num modelo pré-clínico. Para isto, usamos um protocolo autólogo unilateral de enxerto de interposição da carótida para porcos. Os porcos foram divididos em dois grupos: um grupo de AVG “dilatado” e um grupo de AVG “de controle de simulação”. Cada animal serviu como seu próprio doador de enxerto de veia. Em resumo, as PIJVs foram ceifadas como descrito no Exemplo 2 e foram ou dilatadas com a mesma composição de manta e espessura como descrito naquele exemplo que usa o processo de electrospinning descrito no mesmo ou designadas como controles de simulação. Novamente, para os segmen- tos de PIJV simulados sem a manta de polímero que sofreu electrospin- ning, imitamos o processo de electrospinning até o ponto de realmente colocar a manta de polímero (isto é, incluindo a inserção do mandrel e girando/transladando a veia dentro do campo elétrico). Os AVGs foram, então, implantados nos enxertos de interposição da carótida (como descritos abaixo) por 30 dias (ou em observação de complicações irreversíveis), uma duração de implante suficiente para permitir que a IH seja grosseiramente aparente no grupo de controle de simulação (Angelini GD, Biyan AJ, Williams HM, Morgan R e Newby AC. Disten- tion promotes platelet and leukocyte adhesion and reduces short-term patency in pig arteriovenous bypass grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 1990; 99(3): 433-9; Vijayan V, Shukla N, Johnson JL, Gadsdon P, Angelini GD, Smith FC, Baird R e Jeremy JY. Long-term reduction of mediai and intimai thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable externai sheath. J Vase Surg. 2004; 40(5): 1011-9 e Jeremy JY, Dashwood MR, Timm M, Izzat MB, Mehta D, Biyan 5 AJ e Angelini GD. Nitric oxide synthase and adenylyl and guanylyl cyclase activity in porcine interposition vein grafts. Ann Thorac Surg. 1997; 63(2): 470-6) ao qual o grupo dilatado foi comparado. Além de avaliar a desobstrução via angiografia, os AVGs explantados foram processados para avaliação histológica de IH. Por favor, note-se que os IO pontos finais quantificados dos estudos in vivo foram estritamente de natureza histológica.

Métodos

Enxertação Unilateral

de Interposição da Carótida Suína

Os animais foram trazidos para a instalação 7-10 dias antes

do dia da experiência e mantidos NPO por 12 horas antes da cirurgia. Antes da cirurgia, os animais foram anestesiados com Acepromazina, 0,15 mg/kg IM e Ketamina, 15,0 mg/kg, combinação IM, entubados e mantidos num plano cirúrgico de anestesia com Isoflurano (1-3% em 20 oxigênio). Uma vez que cada animal foi aparado e preparado para os procedimentos, ele foi deslocado para a sala de cirurgia e colocado em ventilação de pressão positiva e instrumentado com equipamento de monitoração (ECG). A oximetria de pulso e a pressão sanguínea foram monitoradas ao longo do procedimento cirúrgico. Depois da indução de 25 anestesia, a cirurgia asséptica foi realizada.

A incisão cervical unilateral foi feita para expor a artéria ca- rótida comum. O animal foi, então, heparinizado (300 UI/Kg) e a artéria pinçada proximal e distalmente usando pinças vasculares atraumáticas. O segmento entre as pinças foi extirpado (~6cm). Cada porco serviu como seu próprio doador de enxerto. Uma ceifagem de IJV fresca unilateral foi desempenhada no porco como descrito acima. A IJV ceifada foi, então, ou dilatada (como descrito acima e em Stankus e colaboradores [47]) ou designada como o controle de simulação. O 5 segmento de veia foi, então, implantado como um enxerto unilateral interposição da carótida (de ponta a ponta) usando suturas de Prolene 7-0 interrompidas.

Pós-operativamente, os animais foram recuperados e aloja- dos numa unidade de tratamento intensivo. Em seguida ao procedi- IO mento cirúrgico e à cessação de inalação de anestesia, o animal foi extubado quando ele exibiu um reflexo de deglutição e os reflexos de tosse protetora eram funcionais. Os animais foram continuamente monitorados por 24 horas e os parâmetros seguintes foram registrados a cada hora: taxa de pulso, resistência de pulso, tempo de refil capilar, 15 taxa respiratória, saída urinária e defecação. A temperatura do corpo foi determinada e registrada a cada 2 horas. O animal foi mantido aquecido e seco para impedir a hipotermia. Foi administrado cloreto de buprenorfina (0,005-0,01 mg/kg, IM, ql2h) em intervalos regulares por

4 dias para a dor e continuado a ser administrado para gerenciamento 20 da dor se sinais de dor eram exibidos. A dor aguda em animais é expressa por guarding (espasmos do músculo), vocalização, mutilação, inquietude, recumbência por uma duração incomum de tempo, depres- são (relutância para deslocar ou dificuldade em levantar-se) ou aparên- cia anormal (cabeça para baixo, abdômen dobrado, encurvado). Os 25 grampos/suturas da pele foram removidos 10 dias pós-operação. Todos os animais foram diariamente monitorados por um quadro de emprega- dos treinados, com Veterinários, Técnicos Veterinários Registrados e pessoal que cuida de animais.

Foi usado um regime de anticoagulação para combater a fa- lha de AVG aguda via trombose. Doses orais de aspirina (325 mg/dia) e de Plavix (75 mg/dia) foram ambas iniciadas 3 dias pré-operativamente. A aspirina foi diariamente administrada pelo período inteiro de pós- operação de 30 dias e Plavix foi diariamente administrado por só 14 dias após a operação.

Depois de um tempo de sobrevivência de 30 dias (ou ao ob- 5 servar complicações irreversíveis), os animais foram eutanizados. Os porcos foram profundamente anestesiados com Acepromazina, 0,15 mg/kg IM e Ketamina, 30,0 mg/kg, combinação IM e os animais foram, então, eutanizados por injeção de uma overdose de cloreto de potássio intravenoso para induzir a parada cardíaca. Os sinais vitais foram IO monitorados para o efeito.

Angiografia Fluoroscópíca

Depois da eutanásia e só antes ao explante do enxerto, a angiograíla fluoroscópica foi realizada para avaliar a desobstrução do enxerto. A artéria carótida foi pinçada aproximadamente 3 cm a 15 montante da anastomose proximal do enxerto, e meio de contraste foi infuso na artéria carótida imediatamente distai à pinça. Angiogramas foram registrados (Modelo OEC 9800 Plus, General Electric Inc.) para verificar o fluxo pelo segmento de enxerto inteiro. Se o fluxo não podia ser estabelecido por um enxerto (isto é, devido à oclusão), a angiografia 20 não foi realizada.

Processamento de Tecido Pós-explante

Os enxertos foram extraídos e metade do tecido foi imedia- tamente fixado em 4% paraformaldeído e analisado histologicamente como descrito abaixo. A outra metade do tecido foi fixada em gluteral- deído 2,5% ultrapuro para análise de SEM como descrita em Seção acima.

Medidas Histológicas de IH

A análise morfométrica foi realizada em seções da região central dos enxertos explantados. Usando as técnicas padrões de coloração por pentacromo de Movat, as espessuras intimai e mediai foram medidas. As relações de espessuras intimais para mediais foram calculadas a partir destas medidas. As medidas foram feitas de 4 5 campos de vista e rateadas para produzir um único valor para cada seção de AVG.

Microscopia Eletrônica de Varredura

O mesmo procedimento como descrito acima foi usado para processar e representar por imagem os AVGs explantados a partir das IO experiências in vivo.

Estatística

Um teste t de Student não emparelhado foi realizado sobre os dados de relação de espessura intimai para mediai. P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A menos que de outra forma indicado, os dados são apresentados como média + desvio padrão da média.

Resultados

A manta de polímero adventicial teve um efeito imediata- mente aparente de manter o AVG num diâmetro consistente com aquele 20 da veia nativa (compare a Figura 27 do meio e da direita) sob pressão arterial. Além disso, os AVGs envoltos exibiram excursões radiais pulsáteis (isto é, complascência) semelhantes a da artéria carótida nativa, considerando que a AVG não envolta pareceu ser um tubo rígido sem pulsações detectáveis. Isto é, ao estabelecer o fluxo pelos enxertos 25 de controle, foi observado que, diferentemente das artérias carótidas nativas e veias dilatadas, as veias de controle de simulação não muda- ram de diâmetro em resposta à pressão pulsátil.

Fora das 8 experiências in vivo que foram realizadas, ape- nas 1 experiência foi completamente bem sucedida. Isto é, os AVGs de ambos os porcos dilatados e simulados foram 100 % patentes depois de 30 dias. As imagens de angiografia destes AVGs podem ser vistas na Figura 28. As experiências restantes foram julgadas mal sucedidas 5 devido a uma dentre 3 razões: 1) oclusão parcial de um ou ambos os AVGs dilatado e simulado devido à IH ou trombose; 2) as complicações pós-operativas levaram à morte de um animal no grupo dilatado; e 3) infecção que resulta na necessidade de eutanizar um animal no grupo dilatado depois de 1 semana pós-operatória. Todavia, com os 2 AVGs IO patentes e os AVGs que foram só parcialmente ocluídos (simulado, N=6; dilatado, N=4) desempenhamos medidas morfométricas para avaliar o desenvolvimento de IH para comparação entre os dois grupos. As imagens representativas de coloração por pentacromo de Movat que foram usadas na análise morfométrica são mostradas na Figura 29, que 15 também mostra uma medida de amostra. Os resultados quantificados podem ser vistos na Figura 30. Parece haver só uma tendência para o significado estatístico entre as relações de espessura intimai e mediai dos grupos dilatado versus de controle de simulação.

As imagens de SEM foram tomadas dos AVGs de uma expe- 20 riência completamente bem sucedida (Figuras 3IA e 31B) como também de outra experiência onde os AVGs não foram comletamente ocluídos (Figura s31C e 31 D). A interface anastomótica entre o enxerto de veia e a artéria, comprovada pela linha de sutura, pode ser vista em cada imagem.

Discussão

Embora tivésssemos observado apenas uma tendência para uma diferença estatisticamente significativa na relação de espessura intimai para a mediai entre os grupos dilatado e simulado, é provável que esta diferença se tornasse estatisticamente significativa, se o número de experiências fosse aumentado. Os resultados morfométricos quantificados como também os resultados de SEM qualitativos sugerem que a manta de polímero biodegradável que sofreu electrospinning ofereça um efeito favorável para os AVGs. Todavia, investigação mais além é necessária para determinar se estes efeitos são, de fato, consis- 5 temente benéficos. Além da variabilidade inerente associada aos dados mecanopatobiológicos, houve também variabilidade introduzida em nossos resultados por ter 3 cirurgiões diferentes, de experiência varia- da, que realizaram as cirurgias. Também é verdadeiro que existe uma “curva de aprendizado” associada ã criação de anastomoses usando um IO AVG de duas camadas (grupo dilatado) em vez do AVG normal de uma camada (grupo simulado). Como com qualquer procedimento cirúrgico novo, como o nível de conforto do cirurgião que desempenha a cirurgia aumenta, a taxa de sucesso da cirurgia aumenta em conseqüência.

Os estudos prévios que tentaram usar um revestimento ex- 15 terno para reduzir a IH de AVG, descritos acima, enfocaram na libera- ção de suporte mecânico (como descrito nesta dissertação) e bioquímico para os AVGs em vários modelos animais. A translação clínica destas abordagens prévias não foi alcançada devido a duas limitações princi- pais. Especificamente, elas todas usaram ou revestimentos de ajuste 20 frouxo/biodegradáveis ou revestimentos de ajuste frouxo/bioduráveis. Neste trabalho, desejamos combater estas limitações desenvolvendo um meio de “envolver” de forma segura um AVG com um polímero muito justo e biodegradável.

Existem limitações para o trabalho apresentado aqui. O fa- 25 to que os controles de simulação não foram emparelhados aos AVGs dilatados (isto é, do mesmo porco) nos proporciona menos poder estatís- tico no estudo. Todavia, o projeto experimental não emparelhado que foi usado foi julgado necessário, a fim de evitar complicações pós- operatórias nos animais. Sentimos que era mais seguro realizar cirur- 30 gias unilaterais em vez de bilaterais, de forma que o retorno de sangue venoso do cérebro não fosse excessivamente alterado. Outra limitação origina-se da experiência variada dos cirurgiões que realizaram os procedimentos. É provável que os resultados fossem estatisticamente mais significativos se fosse aumentada a taxa de desobstrução dos AVGs. Se os procedimentos forem todos realizados pelo cirurgião mais

5 experiente, a manta de polímero biodegradável que sofreu electrospin- ning pode ter IH significativamente reduzido nos AVGs em relação aos controles de simulação. Uma terceira limitação é que a duração de 30 dias dos implantes era muito curta. São exigidas experiências de prazo mais longo, talvez tão longa quanto 6 meses, para determinar se a IO eficácia de nossa abordagem em reduzir a IH de AVG é sustentada com

o passar do tempo.

Claims

1.“Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular e Métodos de Preparação do Mesmo e de Bypass Cardíaco” Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, caracterizado por que compreende um tecido tubular e uma matriz de fibra restritiva de um polímero bioerodível sobre uma circunferência do tecido tubular.

2. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o tecido tubular é venoso.

3.Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o tecido tubular venoso é obtido a partir de uma veia safena.

4. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o dispositivo é preparado por electrospinning das fibras de polímero sobre o tecido venosa.

5. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende ligações éster e uretano.

6.Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que as fibras compreendem uma ureia de poli(éster uretano).

7. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o tecido tubular é escolhido a partir de um ou mais dentre uma artéria, uretra, intestino, esôfago, ureter, traquéia, brônquios e tubo de Falópio.

8 . Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o dispositivo é preparado por electrospinning das fibras de polímero sobre o tecido tubular.

9. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero escolhido a partir de um ou mais dentre: um polímero deriva- do a partir de um ácido alfa-hidroxi, um polilactídeo, um poli(lactídeo- co-glicolídeo), um poli(L-lactídeo-co-caprolactona), um ácido poliglicóli- co, um poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo), um poli(l-lactídeo-co-dl-lactídeo), um polímero compreendendo um monômero de lactona, uma policapro- lactona, um polímero compreendendo ligações de carbonato, um poli- carbonato, um poligliconato, um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbona- to), um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato-co-dioxa-nona), um polímero compreendendo ligações de uretano, um poliuretano, uma poli(éster uretano) ureia, um elastômero de poli(éster uretano) ureia, um polímero compreendendo ligações de éster, um polialcanoato, um polihidroxibutirato, um polihidroxi valerato, uma polidioxanona, uma poligalactina, um polímero natural, quitosan, colágeno, elastina, algina- to, celulose, ácido hialurônico e gelatina.

10. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero derivado de um ácido alfa-hidroxi.

11.Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros escolhidos a partir de um polilactídeo, um poli(lactídeo- co-glicolídeo), uma poli(L-lactídeo-co-caprolactona), um ácido poliglicóli- co, um poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo) e um poli(l-lactídeo-co-dl-lactídeo).

12. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende um monômero de lactona.

13. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que as fibras compreendem uma policaprolactona.

14. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero compreendendo ligações de carbonato.

15. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros escolhidos a partir de policarbonato, poligliconato, poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato) e poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato-co-dioxanona).

16. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende ligações de uretano.

17. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros escolhidos a partir de um poliuretano e um elastômero de poli(éster uretano) ureia.

18. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que as fibras compreendem um elastômero de poli(éster uretano) ureia.

19. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que as fibras compreendem colá- geno.

20. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que as fibras compreendem desde mais ou menos 25% em peso até cerca de 75% em peso de colágeno.

21. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por que as fibras compreendem ainda elastina.

22. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que as fibras compreendem desde cerca de 25% em peso até mais ou menos 75% em peso de uma mistura de colágeno e elastina.

23. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 21, caracterizado por que a elastina e o colágeno estão presentes nas fibras em quantidades aproximadamente iguais.

24. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por as fibras compreendem ligações de éster.

25. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por que o poliéster é um polialcanoato.

26. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que o polihidroxialcanoato é escolhido a partir de um ou mais dentre um polihidroxibutirato, um polihidroxivalerato e uma polidioxanona.

27.Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por que o polímero é poligalactina.

28. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero natural.

29.Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros naturais escolhidos a partir de quitosan, colágeno, elastina, alginato, celulose, polialcanoatos, ácido hialurônico e gelatina.

30. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as fibras compreendem coláge- no.

31. Dispositivo de Bnxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que as fibras compreendem elasti- na.

32. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 30, caracterizado por que a matriz bioerode in situ ao longo de um período de tempo que varia desde 12 horas para duas semanas.

33. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda um ou ambos dentre uma célula e um agente ativo associado à matriz.

34. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 33, caracterizado por que uma ou mais dentre células escolhidas a partir de células-tronco, células progenitoras (precursoras), células de músculo liso, mioblastos do esqueleto, células do miocárdio, células endoteliais, células progenitoras do endotélio, células mesen- químais derivadas da medula óssea e células geneticamente modifica- das são associadas à matriz.

35. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 33, caracterizado por que um fator de crescimento é associado ã matriz.

36. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 35, caracterizado por que um fator de crescimento escolhido a partir de um ou mais dentre o fator de crescimento básico do fibroblasto (bFGF), fator de crescimento do fibroblasto acídico (aFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de cres- cimento do hepatócito (HGF), fatores de crescimento semelhantes ã insulina (IGF), proteína da beta-pleiotrofina do fator de crescimento de transformação, proteína midkine e IGF-I é associado à matriz.

37. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 33, caracterizado por que uma droga é associada à matriz.

38. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 37, caracterizado por que a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre uma droga antiinflamatória não esteróide, um antibiótico, um fator anticoagulante, um imunossupressor, um gluco- corticoide, uma droga que age sobre uma imunofilina, um interferon, proteínas de ligação a TNF, um taxano, uma estatina e um doador de óxido nítrico.

39. Dispositivo de Enxerto de Tecido Tubular, de acordo com a Reivindicação 37, caracterizado por que a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre um NSAID, ácido salicílico, indometacina, trihidrato de sódio indometacina, salicilamida, naproxen, colquicina, fenoprofen, sulindac, diflunisal, diclofenaco, indoprofen sódio salicilamida, citocinas antiinflamatórias, proteínas antiinflamatórias, agentes antiinflamatórios esteróides, heparina, Pebac, enoxaprin, aspirina, hirudina, plavix, bivalirudina, prasugrel, idraparinux, warfarina, cumadina, clopidogrel, PPACK, GGACK, ativador de tecido plasminogeno, uroquinase, estrep- toquinase, um glucocorticoide, hidrocortisona, betametisona, dexame- tasona, ílumetasona, isoflupredona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, triamcinolona acetonida, um antiangiogênico, fluoruracil, paclitaxel, doxorubicina, cisplatina, metotrexato, ciclofosfamida, etopo- sida, pegaptanib, lucentis, triptofanil-tRNA sintetase, retaane, CA4P, AdPEDF, VEGF-TRAP-EYE, AG-103958, Avastin, JSM6427, TG100801, ATG3, OT-551, endoestatina, talidomida, becacizumab, neovastat, um antiproliferativo, sirolimus, paclitaxel, álcool perilílico, inibidores da farnesil transferase, FPTIII, L744, fator antiproliferativo, Van 10/4, doxorubicina, 5-FU, Daunomicina, Mitomicina, dexametasona, azatio- prina, clorambucil, ciclofosfamida, metotrexato, mofetil, polipeptídeo intestinal vasoativo, um anticorpo, uma droga que age sobre imunofili- nas, ciclosporina, zotarolimus, everolimus, tacrolimus, sirolimus, um interferon, uma Proteína de ligação a TNF, um taxano, paclitaxel, docetaxel, uma estatina, atorvaestatina, lovaestatina, simvaestatina, pravaestatina, fluvaestatina, rosuvaestatina, um doador ou precursor de óxido nítrico, Sal de Angeli, L-Arginina, Base Livre, Dietilamina NONOato, Dietilamina NONOato/AM, Glyco-SNAP-1, Glyco- SNAP-2, (±)-S-Nitroso-N-acetylpenicilamina, S-Nitrosoglutationa, NOC-5, NOC-7, NOC-9, NOC-12, NOC-18, NOR-I, NOR-3, SIN-I, Cloreto, Sódio Nitro- prussida, Dihidrato, Espermina NONOato, Estreptozotocina, um antibi- ótico, aciclovir, afloxacinaa, ampicilina, amfotericina B, atovaquona, azitromicina, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimina, dapsona, diclazaril, doxiciclina, eritromicina, etambutol, fluconazol, fluorquinolonas, foscarnet, ganciclovir, gentamicina, iatroconazol, isoniazid, cetoconazol, levofioxacin, lincomicina, miconazol, neomicina, noríloxacina, ofloxacina, paromomicina, penicilina, pentamidina, poli- mixina B, pirazinamida, pirimetamina, rifabutina, rifampina, esparflo- xacina, estreptomicina, sulfadiazina, tetraciclina, tobramicina, trifluo- ruridina, sulfato de trimetoprima, Zn-piritiona, e sais de prata como cloreto, brometo, iodeto e periodato.

40. Método de Preparação de Enxerto Tubular, caracterizado por que compreende depositar uma matriz de fibra restritiva de um políme- ro bioerodível sobre um perímetro de um tecido tubular para produzir um dispositivo de enxerto de tecido tubular.

41. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que a matriz é depositada por electrospinning.

42.Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que o tecido tubular é obtido a partir de uma veia.

43. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que o tecido tubular é obtido a partir de uma parte de uma veia de safena.

44. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que o dispositivo é preparado por electrospinning das fibras de polímero sobre o tecido tubular.

45. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero escolhido a partir de um ou mais dentre: um polímero deriva- do de um ácido alfa-hidroxi, um polilactídeo, um poli(lactídeo-co- glicolídeo), um poli(L-lactídeo-co-caprolactona), um ácido poliglicólico, um poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo), um poli(l-lactídeo-co-dL-lactídeo), um polímero compreendendo um monômero de lactona, uma policaprolac- tona, um polímero compreendendo ligações de carbonato, um policar- bonato, um poligliconato, um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato), um poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato-co-dioxanona), um polímero compreendendo ligações de uretano, um poliuretano, uma poli(éster uretano) ureia, um elastômero de poli(éster uretano) ureia, um polímero compreendendo ligações de éster, um polialcanoato, um polihidroxibuti- rato, um polihidroxi valerato, uma polidioxanona, uma poligalactina um polímero natural, quitosan, colágeno, elastina, alginato, celulose, ácido hialurônico e gelatina.

46. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 44, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende ligações de éster e uretano.

47. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 46, caracterizado por que as fibras compreendem uma poli(éster uretano) ureia

48. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que o tecido tubular é escolhido a partir de um ou mais dentre uma artéria, uretra, intestino, esôfago, ureter, traquéia, brônquios e tubo de Falópio.

49. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que o dispositivo é preparado por electrospinning das fibras de polímero sobre o tecido tubular.

50. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero derivado a partir de um ácido alfa-hidroxi.

51. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 50, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros escolhidos a partir de um polilactídeo, um poli(lactídeo- co-glicolídeo), uma poli(L-lactídeo-co-caprolactona), um ácido poliglicóli- co, um poli(dl-lactídeo-co-glicolídeo) e um poli(l-lactídeo-co-dl-lactídeo).

52. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende um monômero de lactona.

53. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 52, caracterizado por que as fibras compreendem uma policaprolactona.

54. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende ligações de carbonato.

55. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 54, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros escolhidos a partir de policarbonato, poligliconato, poli(glicolídeo-co-trimetileno carbonato) e poli(glicolídeo-co- trimetileno carbonato-co-dioxanona).

56. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero que compreende ligações de uretano.

57. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 56, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros escolhidos a partir de um poliuretano e um elastômero de poli(éster uretano) ureia.

58. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 57, caracterizado por que as fibras compreendem um elastômero de poli(éster uretano) ureia.

59. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 58, caracterizado por que as fibras compreendem um colágeno.

60. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 59, caracterizado por que as fibras compreendem desde cerca de 25% em peso até mais ou menos 75% em peso de colágeno.

61. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 59, caracterizado por que as fibras compreendem ainda elastina.

62. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que a matriz bioerode in situ ao longo de um período de tempo que varia de 12 horas a duas semanas.

63. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 61, caracterizado por que as fibras compreendem desde cerca de 25% em peso até mais ou menos 75% em peso de uma mistura de colágeno e elastina.

64. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 61, caracterizado por que a elastina e o colágeno estão presentes nas fibras em quantidades aproximadamente iguais.

65.Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem liga- ções de éster.

66. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 65, caracterizado por que o poliéster é um polialcanoato.

67. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 66, caracterizado por que o polihidroxialcanoato é escolhido a partir de um ou mais dentre um polihidroxibutirato, um polihidroxivalerato e uma polidioxanona.

68. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 66, caracterizado por que o polímero é poligalactina

69. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem um polímero natural.

70. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 69, caracterizado por que as fibras compreendem um ou mais polímeros naturais escolhidos a partir de quitosan, colágeno, elastina, alginato, celulose, polialcanoatos, ácido hialurônico e gelatina.

71. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que as fibras compreendem colá- geno.

72. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 71, caracterizado por que as fibras compreendem elasti- na.

73. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que o tecido tubular é uma veia de safena.

74. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que compreende, além disso, antes de depositar a matriz sobre o tecido tubular, remover o tecido tubular a partir de um paciente e, subseqüente à deposição da matriz sobre o tecido tubular, enxertar o dispositivo no paciente.

75. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que compreende, além disso, associar uma ou ambas dentre uma célula ou uma substância terapêu- tica com a matriz.

76. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 75, caracterizado por que uma ou mais de células escolhidas a partir de células-tronco, células progenitoras (precursoras), células de músculo liso, mioblastos do esqueleto, células do miocárdio, células endoteliais, células progenitoras endoteliais, células mesenqui- nais derivadas da medula óssea e células geneticamente modificadas são associadas à matriz.

77. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 75, caracterizado por que um fator de crescimento é associado à matriz.

78.Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 77, caracterizado por que um fator de crescimento escolhido a partir de um ou mais dentre o fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento do fibroblasto acídico (aFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de cres- cimento hepatócito (HGF), fatores de crescimento semelhantes à insuli- na (IGF), proteína beta pleiotrofina do fator de crescimento de transfor- mação, proteína midkine e IGF-I está associado à matriz.

79. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 75, caracterizado por que uma droga é associada à matriz.

80.Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 79, caracterizado por que a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre uma droga antiinflamatória não esteroide, um antibiótico, um fator anticoagulante, um imunossupressor, um gluco- corticoide, uma droga que age sobre uma imunofilina, um interferon, uma proteína de ligação a TNF, um taxano, uma estatina e um doador ou precursor de óxido nítrico.

81. Método de Preparação de Enxerto Tubular, de acordo com a Reivindicação 79, caracterizado por que a droga é escolhida a partir de um ou mais dentre um NSAID, ácido salicílico, indometacina, trihidrato de sódio indometacina, salicilamida, naproxen, colquicina, fenoprofen, sulindac, diflunisal, diclofenaco, indoprofen sódio salicilamida, citocinas antiinflamatórias, proteínas antiinflamatórias, agentes antiinflamatórios esteróides, heparina, Pebac, enoxaprin, aspirina, hirudina, plavix, bivalirudina, prasugrel, idraparinux, warfarina, cumadina, clopidogrel, PPACK, GGACK, ativador da plasminogênese tecidular, uroquinase, estreptoquinase, um glucocorticoide, hidrocortisona, betametisona, dexametasona, flumetasona, isoflupredona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, triamcinolona acetonida, um antiangiogênico, fluoruracil, paclitaxel, doxorubicina, cisplatina, metotrexato, ciclofosfamida, etopo- sida, pegaptanib, lucentis, triptofanil-tRNA sintetase, retaane, CA4P, AdPEDF, VEGF-TRAP-EYE, AG-103958, Avastin, JSM6427, TG100801, ATG3, OT-551, endoestatina, talidomida, becacizumab, neovastat, um antiproliferativo, sirolimus, paclitaxel, álcool perilílico, inibidores da farnesil transferase, FPTIII, L744, fator antiproliferativo, Van 10/4, doxorubicina, 5-FU, Daunomicina, Mitomicina, dexametasona, azatio- prina, clorambucil, ciclofosfamida, metotrexato, mofetil, polipeptídeo intestinal vasoativo, um anticorpo, uma droga que age sobre imunofili- nas, ciclosporina, zotarolimus, everolimus, tacrolimus, sirolimus, um interferon, uma proteína de ligação a TNF, um taxano, paclitaxel, docetaxel, uma estatina, atorvaestatina, lovaestatina, simvaestatina, pravaestatina, fluvaestatina, rosuvaestatina, um doador ou precursor de óxido nítrico, Sal de Angeli, L-Arginina, Base Livre, Dietilamina NONOato, Dietilamina NONOato/AM, Glico-SNAP-1, Glico-SNAP-2, (±)- S-Nitroso-N-acetylpenicillamine, S- Nitrosoglutationa, NOC-5, NOC-7, NOC-9, NOC-12, NOC-18, NOR-I, NOR-3, SIN-I, Cloreto, Sódio Nitro- prussida, Dihidrato, Espermina NONOato, Estreptozotocina, um antibi- ótico, aciclovir, afloxacina, ampicilina, anfotericina B, atovaquona, azitromicina, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimina, dapsona, diclazaril, doxiciclina, eritromicina, etambutol, fluconazol, fluorquinolonas, foscarnet, ganciclovir, gentamicina, iatroconazol, isoniazid, cetoconazol, levofloxacina, lincomicina, miconazol, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, paromomicina, penicilina, pentamidina, poli- mixina B, pirazinamida, pirimetamina, rifabutina, rifampina, esparflo- xacina, estreptomicina, sulfadiazina, tetraciclina, tobramicina, trifluo- ruridina, sulfato de trimetoprima, Zn-piritiona e sais de prata tais como cloreto, brometo, iodeto e periodato.

82. Método de Bypass Cardíaco, caracterizado por que compreende ultrapassar uma artéria coronária com um dispositivo de enxerto de tecido tubular compreendendo uma veia e a matriz de fibra restritiva de um polímero bioerodível sobre uma circunferência da veia como reivin- dicado na Reivindicação 1.