WO2018234972A1 - Dispositivo de liberação ocular de fármacos, nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe e processo de obtenção - Google Patents

Dispositivo de liberação ocular de fármacos, nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe e processo de obtenção Download PDF

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WO2018234972A1
WO2018234972A1 PCT/IB2018/054472 IB2018054472W WO2018234972A1 WO 2018234972 A1 WO2018234972 A1 WO 2018234972A1 IB 2018054472 W IB2018054472 W IB 2018054472W WO 2018234972 A1 WO2018234972 A1 WO 2018234972A1
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nanofibers
coaxial
gelatin
bevacizumab
pcl
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PCT/IB2018/054472
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Silvia LIGÓRIO FIALHO
Maria Carolina ANDRADE GUERRA
Luiz Guilherme DIAS HENEINE
Rodrigo LAMBERT ORÉFICE
Armando Da Silva Cunha Junior
Sarah OLIVEIRA LAMAS DE SOUZA
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Fundação Ezequiel Dias
Universidade Federal De Minas Gerais
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Definitions

  • the present invention relates to a polymeric device for ocular drug delivery composed of coaxial polymer nanofibers, preferably containing polycaprolactone, gelatin, polyvinyl alcohol and an angiogenesis inhibitor, capable of treating and controlling eye diseases associated with angiogenesis.
  • the invention further relates to coaxial nanofibers containing an angiogenesis inhibitor and the method of the invention.
  • Angiogenesis occurs naturally in the body during embryonic development and in response to wound healing for restoration of blood flow in injured tissues. Under normal conditions, the organism is able to maintain the balance between the involved angiogenic mediators. In situations where the organism loses the capacity to modulate angiogenesis, diseases related to this loss arise (Polverini PJ, Angiogenesis in health and disease: insights into basic mechanisms and therapeutic opportunities, Journal of Dental Education, v. 66, p.
  • the present invention relates to a method for the treatment of angiogenesis and cancer.
  • ischemic diseases may be benefited by the induction of angiogenesis
  • this process plays an important role in the development of pathology, such as in chronic inflammatory diseases, rheumatoid arthritis, proliferative diabetic retinopathy, psoriasis, endometriosis and adiposities. tumor growth and metastasis. Inhibition of this process then became an important therapeutic strategy (Griffioen AW, Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases and chronic inflammation. Pharmacological Reviews, v. 52, p. 237-268, 2000).
  • This complex process consists of the activation of endothelial cells by growth factors, followed by enzymatic degradation of the basement membrane, detachment of the endothelial cells from the adhesion proteins, migration to the perivascular space and proliferation, and finally, formation of new vessels .
  • growth factors and cytokines such as vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (bFGF), tumor necrosis factor alpha (TNF - ⁇ ) and interleukin 8 (IL-8) potent angiogenic mediators (Folkman J, Shing Y. Angiogenesis, Journal of Biological Chemistry, v. 267, pp. 10931-10934, 1992).
  • Neovascularization refers to the onset and / or abnormal division of endothelial cells, causing and contributing to pathological states (Lee P, Wang, CC, Adamis AP, Ocular neovascularization. 43, No. 3, pp. 245-269, 1998).
  • Neovascularization in most cases, causes a reduction in vision and, if not properly controlled, can lead to blindness.
  • the new vessels can grow close to the eye tissues and affect the cornea, iris, retina and optic nerve.
  • the main reported mechanism of formation of new vessels may be summarized as follows: an initial stimulus causing tissue hypoxia induces a compensatory effect of the production of endothelial growth factors, such as VEGF, on the involved tissues leading to the appearance of abnormal vessels (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO, Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease, Progress in retinal and eye research, v. 22, no. 1, pp. 1-29, 2003).
  • the newly formed vessels are structurally weak, leak fluid and lack structural integrity, resulting in haemorrhage, exudates and fibrosis, usually leading to blindness.
  • Ocular neovascularization is associated with several diseases, usually causing severe loss of vision and even blindness.
  • diabetic retinopathy and age-related macular degeneration are the most frequent (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO, Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease, Progress in retinal and eye research, 22, No. 1, pp. 1-29, 2003).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • This factor binds with high affinity to membrane receptors with tyrosine kinase activity and its expression is induced mainly under conditions of hypoxia (Shima DT, Adamis AP, Ferrara N, Yeo TK, Allende R.
  • VEGF endothelial cell growth factors in retinal
  • VEGF enhances the cellular expression of metalloproteinases, degrades the extracellular matrix and facilitates the penetration of the neovas in the tissue, while decreasing the endothelial expression of inhibitors of (1), and (2) the presence of metalloproteinases (Damico FM, Angiogenesis and Retinal Diseases, Brazilian Archives of Ophthalmology, v. 70, p.547-553, 2007).
  • VEGF Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease
  • Said formulation refers to the pharmaceutical form of nanofibres film containing active substance with anti-VEGF activity.
  • the formulation is applicable to administration by the topical and / or intraocular ocular pathways.
  • Anti-VEGF therapies have been the option of choice for the treatment of eye diseases causing angiogenesis.
  • VEGF inhibitors such as pegaptanib sodium (Macugen®, EyeTech, USA), ranibizumab (Lucentis®, Genentech, USA), bevacizumab (Avastin®, Genentech, USA) and aflibercept (Eylia®, Bayer SA, Brazil) are becoming well established therapies for the treatment of ocular neovascularization and has replaced the approaches and the use of anti-VEGF agents in the treatment of these conditions, such as laser photocoagulation and photodynamic therapy (Falavarjani KG, Nguyen QD, Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature, 2013, Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al Therapies for neovascular age-related macular degeneration: current approaches and pharma
  • Bevacizumab has been the most widely used in the world due to its low cost and effectiveness similar to those of the same class (Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al.
  • Therapies for neovascular age-related macular The present invention relates to a method for the management of neovascular age in the treatment of neovascular age, and to the management of neovascular age.
  • Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody comprised of 214 amino acids and has a molar mass of approximately 149 kDa. It binds to VEGF, thereby inhibiting its binding to receptors present on the surface of endothelial cells, Flt-1 (VEGFR-1), KDR (VEGFR-2) and Flt-4 (VEGFR-3).
  • Flt-1 Flt-1
  • KDR FltFR-2
  • Flt-4 Flt-4
  • the neutralization of the biological activity of VEGF decreases vascularization (Rodrigues EB, Farah ME, Maia M, Penha FM, Regatieri C, Melo GB, Pinheiro MM, Zanetti CR, Therapeutic monoclonal antibodies in ophthalmology, Progress in Retinal and Eye Research, v. 28, No. 2, pp. 17-144, 2009).
  • bevacizumab has been approved by the Food and Drug Administration Administration (FDA) and the European Medicines Agency (EMEA) and is registered with ANVISA for the intravenous treatment of metastatic colorectal cancer and other cancers (Prasad OS, Schwartz SD, Hubschman JP. , Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al.
  • FDA Food and Drug Administration Administration
  • EMEA European Medicines Agency
  • the treatment regimen using intravitreal injections of bevacizumab usually requires the application of about 3 injections, one per month in the affected eye. After 30 days, the patient is reevaluated, and may or may not require subsequent injections (Ministry of Health, ANVISA, Angiogenesis Inhibitors for the treatment of age - related macular degeneration. Q No 6, 2008).
  • one alternative is the intraocular use of extended drug delivery systems capable of maintaining effective therapeutic levels for long periods of time, minimizing the possibility of adverse effects.
  • Ocular administration in the form of eye drops results in higher concentrations in the anterior tissues (cornea, conjunctiva, sclera, aqueous humor and ciliary body) and presents minimal therapeutic effect in the posterior region of the eye (lens, vitreous and retina), which is generally maintained with frequent applications of the formulation.
  • Direct administration in the subconjunctival space has some advantages over topical therapy for the treatment of diseases of the anterior segment of the eye, but does not provide effective concentration of the drug in the posterior segment.
  • the systemic pathway can be used for this purpose, but low penetration is observed in the eye due to the existence of the hematoretinal barrier, which hinders the entry of substances from the blood circulation to the retina.
  • it is necessary to administer high concentrations over a prolonged period and may cause serious adverse systemic effects (Martin DF, Parks DJ, Mellow SD, Ferris FL, Walton RC, Remaley NA, et al. Treatment of cytomegalovirus retinitis with an intraocular sustained-release ganciclovir implant A randomized controlled clinical trial Archives of Ophthalmology, v. 12, pp. 1531-1539, 1994.
  • Intravitreal injection is an alternative for obtaining adequate concentration of drugs in the vitreous and retina.
  • This pathway was restricted to the treatment of endophthalmitis, but nowadays it has been used to treat cases of proliferative vitreoretinopathy, viral retinitis and uveitis.
  • rapid local blood flow results in a reduced half-life of the administered drugs, thus, the concentration rapidly reaches sub-therapeutic levels.
  • the present invention relates to an intrascleral implant for the sustained intraocular delivery of betamethasone phosphate, and to the use of an intrascleral implant for sustained intraocular delivery of betamethasone phosphate. 44, pp. 740-74, 2003, Nair L. S, Laurencin CT Biodegradable polymers as biomaterials, Progress in Polymer Science, v. 32, pp. 762-798, 2007).
  • Synthetic biodegradable polymers represented by polyamides, polyaminoacids, polyalkylcyanacrylates, polyesters, poly (orthoesters), polyurethanes and polyacrylamides have shown increasing interest in the application as drug delivery systems (Einmahl S, Ponsart S, Bejjani RA, D'Hermies F , Savoldelli M, Heller J, et al., Ocular biocompatibility of a poly (ortho ester) characterized by autocatalyzed degradation, Journal of biomaterials research, v. 67, pp. Biodegradable Microspheres for Vitreoretinal Drug Delivery: Advanced Drug Delivery Reviews, v.
  • Bevacizumab-coated PLA nanoparticles were encapsulated in porous PLGA microparticles by supercritical infusion and pressure (Yandrapu SK, Upadhyay AK, Petrash JM, Kompella UB Nanoparticles in porous microparticles prepared by supercritical infusion and pressure quench technology for sustained delivery of bevacizumab. Molecular Pharmacology, v. 10, pp. 4676-4686, 2013.).
  • the in vitro release study showed a bevacizumab release over a period of 4 months, with no change in antibody structure and activity. Bevacizumab was detected in vivo for 2 months after intravitreal application in rats.
  • thermosensitive hydrogel was developed using block copolymers (Hu CC, Chaw JR, Chen CF, Liu HW, Controlled release bevacizumab in thermoresponsive hydrogel found to inhibit angiogenesis. Biomedical Materials Enginnering, v. 24 , pp. 1941-1950, 2014). After one month of intravitreal application of the system no changes were observed in the retina of the rabbits. In cell culture, the activity of bevacizumab incorporated into the hydrogel was maintained throughout the period of the release study. The in vivo release profile of bevacizumab incorporated into a hydrogel formulation has also been studied by Rauck et al.
  • a biodegradable polyurethane polymer system containing bevacizumab was developed by Ferreira et al., And the antiangiogenic activity of the monoclonal antibody was studied in a model of corneal neovascularization.
  • Bevacizumab released from the system was able to promote the reduction of the number of vessels in the cornea and the expression of VEGF, without causing toxicity to the tissues (Ferreira ERA, Castro BFM, Vieira LC, Cassali GD, Souza CM, Fulgêncio GO, Ayres E, Oréfice RL, Jorge R, Fialho SL, Silva-Cunha A.
  • Nanofibers or polymer nanowires are of great interest due to the properties associated with these materials, as well as to the large number of possible applications (Chronakis IS, Novel nanocomposites and nanoceramics based on polymer nanofibers using electrospinning process). , Vol. 167, pp. 283-293, 2005. Chew SY, Wen Y, DzenisY, Leong KW, The Role of Electrospinning in the Emerging Field of Nanomedicine, Current Pharmaceutical Des, v. 12, pp 4751-4770, 2006), such as in the areas of electronics, physics, chemistry, medicine, biology and materials engineering.
  • Nanofilament polymers and continuous multifilaments can be formed from techniques such as dry spinning, wet spinnng, gel spinning and melt spinning (Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. With these techniques, the obtained fibers have a mean variation in diameter between 10 and 500 ⁇ m, (JS, Park JW, Ruckenstein E. Thermal and dynamic mechanical analysis of PVA / MC blend hydrogels, Polymer, v.42, p.4271 -4280, 2001. Sato JAP. the Nanostructured Polymerics Obtained through the Use of the Electrochemical Technique. Santo André: Federal University of ABC, 201 1. 109p.
  • Electrophilation allows obtaining a mean diameter of the mesh fibers, or blankets or polymer membranes ranging from 10nm to 10 ⁇ m (Eichhorn SJ, Sampson WW Sampson Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies, Journal of the Royai Society Interface, v.2, pp. 309-318, 2005).
  • the electrowinning system consists of three parts: a high-voltage generator, a syringe containing the polymer solution, and a collector (Bhardwaj N, Kundu SC, Electrospinning: A beautiful fiber fabrication technique, Biotechnology Advances, v.28, p325-347, 2010 ). As the electric field strength is increased, the induced charges on the surface of the liquid repel each other creating instability.
  • the parameters (viscosity, conductivity, surface tension, polymer molar mass and dielectric constant), processing (electric field, needle-collector distance and infusion rate) and the environment (humidity and temperature) influence and direct the electro- (Chakrapani VY, Gnanamani A, Giridev VR, Madhusoothanan M, Sekaran G. Electrospinning of Type I collagen and PCL nanofibers using acetic acid, Journal of Applied Polymer Science, v. 125, pp. 3221-3227, 2012).
  • Nanofibers produced from the electrowinning process have advantages such as high surface area, flexibility for a wide variety of shapes and sizes and the ability to control the composition of nanofibres to achieve desired results from their properties and functionalities (Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Science and Technology, v.63, p. 2223-2253, 2003; Bhardwaj N, Kundu SC. Electrospinning: A spectacular fiber fabrication technique. Biotechnology Advances, v.28, p325-347, 2010; Kulkarni A, Bambole VA, Mahanwar PA. Electrospinning of Polymers, Their Modeling and Applications. Polymer-Plastics Technology and Engineering, v. 49, p. 427-441, 2010; Garg K, Bowlin GL. Electrospinning jets and nanofibrous structures. Biomicrofluidics, 013403-1, 2011).
  • Biodegradable fibrous scaffoids composed of gelatin coated poly ( ⁇ -caprolactone) prepared by coaxial electrospinning Journal of Biomedical Materials Research, v. 83, pp. 372-382, 2007).
  • the main objective of using this technique in drug delivery systems is to circumvent the limitations of direct electrolysis with respect to the encapsulation of fragile and water soluble bioactive substances and also to promote a longer release of the substance and to allow the encapsulation of multiple substances with different solubility characteristics.
  • This technique is interesting not only in the development of multifunctional nanofibers, but also in matrices with different rates of degradation at different periods of use in the body.
  • Electrospun matrices for localized drug delivery current technologies and selected biomedical applications, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 81, pp. 1-13, 2012). Using this technique, prior studies have demonstrated a protein encapsulation efficiency in polymer nanofibers close to 100% (Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, 185, pp. 129-188, 1999).
  • Biocompatible and biodegradable nanofibers are produced using synthetic and natural polymers (Li X, Xie J, Lipner J, Yuan X, Thomopoulos S, Xia Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Letters, v. 9, pp. 2763-2768, 2009). For their use, it is important that they have sufficient strength and stiffness for application to the body. THE combination of the advantages of poly-e-caprolactone (PCL) as mechanical strength, with the bioactivity of gelatin can be an alternative for coaxial electrofying. (Baji A, Mai YW, Wong SC, Abtahi M, Chen P. Electrospinning of polymer nanofibers: Effects on oriented morphology, structures and tensile properties, Composite Science Technology, v. 70, pp. 703-18, 2010).
  • PCL poly-e-caprolactone
  • the present technology deals with a device for ocular release of bevacizumab composed of polymeric nanofibers and bevacizumab.
  • BRASIL no bevacizumab-containing formulation incorporated into polymeric nanofibers is commercially available or reported in the state of the art (BRASIL, Ministry of Health, National Sanitary Surveillance Agency,
  • Table 1 lists some studies of polymeric nanofibers using the coaxial electrochemical technique for prolonged protein release.
  • BMP - bone protein PEG-polyethylene glycol
  • PCL-poly-Î ⁇ -caprolactone PCL-poly-Î ⁇ -caprolactone
  • VEGF - vascular endothelial growth factor PLA-b-PEG-polylactic-b-polyethylene glycol; EIF - epidermal induction factor; BSA - serum bovine albumin; PLA - polylactic; PLGA - poly-lactic-co-glycolic; PDGF - platelet growth factor; PU - polyurethane; bFGF - fibroblast growth factor.
  • PCL and gelatin nanofibers were developed and characterized by the coaxial electrophying technique and the in vitro studies revealed the biocompatibility of these nanofibers with great proliferation of stem cells, as well as evidence of their differentiation in osteoblasts, making this biomaterial a potential alternative for use in bone tissue engineering (Pereira IHL, Ayres E, Averous L, Schlatter G, Hebraud A, Mendes STO L, Oréfice RL. Elaboration and Characterization of Coaxial Electrospun Poly (c-Caprolactone) / Gelatin Nanofibers for Biomedical Applications. Advances in Polymer Technology, v. 33, 2014).
  • US20100055154A1 entitled “Coaxial electrowinning fibers and structures and forming methods thereof” describes nanofibers and microfibers having a core covered by a polymer wall (Liao 1C, Leong KW, Chew SY. Coaxial electrospun fibers and structures and methods of forming the same United States Patent Application Publication US20100055154A1; Mar 04, 2010).
  • the core is composed of channels connecting the surface of the polymer wall to the nucleus and also by one or more substances which may be drugs, proteins, viruses, DNA plasmids, bacterial cells and nanoparticles with encapsulated drug.
  • US2016003861 1A1 entitled “Nanofiber and bioactive compositions and related methods” describes a nanofiber composition containing one or more bioactive substance, which when exposed to moisture, the nanofibers dissolve releasing the incorporated bioactive substance. (Vile GF, Hosie IC, Feasey SV. Nanofibre and bioactive compositions and related methods. United States Patent Application Publication US2016003861 1 A1; 1 1 Feb. 2016).
  • U.S. Patent 9,375,516 entitled “Polymeric nanofiber support for heparin / fibrin based growth factor release” discloses a growth factor transport support combining a heparin / fibrin based delivery system with the polymer composite nanofiber chain for tissue regeneration (Thomopoulos S, Sakiyama-Elbert S, Silva M, Gelberman R, Xia Y, Schwartz A, Xie J. Polymer nanofiber scaffold for a heparin / fibrin based growth factor delivery system, U.S. Patent Application Publication 9,375,516; 28 Jun 2016).
  • Support can transport growth factors in a controlled manner, can be implanted, biocompatible, non-cytotoxic and can be used in bone, muscle, cartilage and other tissue repair surgeries.
  • Figure 1 shows scanning electron microscopy images of PCL / gelatin-containing nanofibers (a); PCL.gelatina.Beva 1% (b); PVA (c); PVA.Beva 1% (d); Coaxial (e); Coaxial. Beva 1% (f).
  • Figure 3 is an image of the coaxial nanofiber obtained by confocal microscopy, containing fluorescein isothiocyanate.
  • Figure 4 shows TG and DTG plots of PCL / gelatin (A), PVA (B) and coaxial (C) nanofibers. The data were obtained by carrying out the analyzes under a nitrogen atmosphere with a flow rate of 30 ml / min and a heating rate of 20 ° C / min.
  • Figure 5 shows the DSC curves obtained for the heating Q for PCL (a), (b) PVA and (c) coaxial nanofibers.
  • Figure 6 shows a comparison of the FTIR-ATR spectra obtained from the coaxial nanofibers before being washed with TFE, after washing and the PVA nanofibers that were used as a control.
  • Figure 7 shows a comparison of the FTIR-ATR spectra obtained from the coaxial nanofibers before being washed with DMSO, after washing and the PCL nanofibers that were used as a control.
  • Figure 8 is a graph showing the percentage of vessels in the chorioanoanelic membrane (CAM) after application of the samples. The results were compared to the control group receiving PBS.
  • Figure 9 is a graph depicting the percent viability of ARPE-19 cells after 24 hours of sample application using the MTT assay.
  • Figure 10 is a graph depicting the percent viability of ARPE-19 cells after 72 hours of sample application using the MTT assay.
  • the present invention relates to a polymeric device for ocular drug delivery composed of coaxial polymer nanofibers, preferably containing polycaprolactone, gelatin, polyvinyl alcohol and an angiogenesis inhibitor, capable of treating and controlling eye diseases associated with angiogenesis.
  • the invention further relates to coaxial nanofibers containing an angiogenesis inhibitor and the process thereof.
  • the polymer nanofibers of the present invention are characterized in that they contain polycaprolactone, gelatin and polyvinyl alcohol, and an angiogenesis inhibitor, the angiogenesis inhibitor being preferably bevacizumab.
  • the nanofibers are preferably coaxial and contain a membrane composed preferably of polycaprolactone / gelatin and the core preferably composed of polyvinyl alcohol.
  • the diameter of the nanofibers is preferably between 185 and 480 nm.
  • the polymeric ocular drug delivery device of the present invention is characterized in that it contains the nanofibers described above and their administration may be via the topical or intraocular ocular pathways.
  • the process of obtaining the polymer nanofibers described above contains the following steps:
  • the process parameters are preferably: internal and external needle diameters of 0.5-1.0 mm and 0.5-1.5 mm, respectively.
  • the flow rate was 4.0-5.0 mL / h for PCL / gelatin solution and 1.0-2.0 mL / h for PVA solution.
  • the applied voltage is approximately + 25 / 0kV between the coaxial device and the collector disk.
  • the pickup device was positioned at a distance of 15.0-16.0 cm from the tip of the needle.
  • Example 1 Preparation of polymeric nanofibers containing bevacizumab
  • the pharmaceutical composition of the formulation described in the present invention is composed of the monoclonal antibody bevacizumab (Beva) and other synthetic and non-synthetic drugs of different classes with the possibility of activity in ocular diseases can be used.
  • the polymer component polycaprolactone (PCL), gelatin and polyvinyl alcohol (PVA) 98-99% hydrolyzed.
  • PCL polycaprolactone
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PCL and gelatin solutions were prepared separately. Each polymer, at the concentration of 5-7% w / v, was weighed and solubilized in 2,2,2-trifluoroethanol (TFE) with the aid of a magnetic stirrer for 2-4 hours at room temperature. Then the two solutions obtained were mixed in the ratio of approximately 60:40 PCL and gelatin, respectively, at the end being added 1-2 ml of a solution of approximately 0.2% v / v acetic acid in TFE .
  • the PVA solution in concentration 14-16% w / v, was prepared by dissolving the polymer in deionized water at a temperature of 80-100 W C for 1 -3 hours.
  • Bevacizumab was added to the room temperature PVA solution at concentrations w / w of 0.5% to 4% by mass of bevacizumab in PVA.
  • Example 2 Characterization of polymeric nanofibers containing bevacizumab
  • PCL / gelatin, PVA and coaxial polymeric nanofibers containing or not bevacizumab were characterized by different techniques, which will be described as follows:
  • Table 1 Mean of the diameters of nanofibers (nm) PCL / gelatin, PVA and coaxial PCL / PVA at different concentrations of Bevacizumab.
  • the polymeric nanofibers were prepared by adding CuSO 4 (8-10% w / w) to the aqueous PVA solution.
  • the nanofibers were collected directly on the Holey Carbon grid of 300mesh for 5-10 minutes and analyzed using a transmission electron microscope at a voltage of approximately 200 kV.
  • the TG and DTG curves of the PCL / gelatin nanofibers showed the occurrence of mass loss of 4%, associated with water evaporation between 22 ° C and 12 ° C.
  • a peak was observed at 337 ° C corresponding mass loss of 19% attributed to degradation of the gelatin present in the PCL nanofiber / gelatin.
  • a peak was observed at 423 ° C, corresponding to the 67% loss of mass attributed to the degradation of PCL.
  • DSC Differential Scanning Calorimetry
  • the DSC curve of the PCL / gelatin nanofiber showed an endothermic band associated with PCL melt at 50 Q C and an enthalpy of 49.9 mJ / mg.
  • An endothermic event related to the onset of thermal degradation of the gelatin around 180 Q C was also noted for the PCL nanofiber / gelatin.
  • endothermic events related to the loss of water was observed by DSC at a temperature of 120 C.
  • the glass transition Q of the PVA was observed around 75 Q C and the melting around 220 C.
  • the coaxial nanofibers Q showed a melting event related to PCL at 47 Q C with enthalpy of 18.5 mJ / mg and events associated with the elimination of volatiles (125 Q C) and melting of PVA.
  • FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
  • the spectra for the PCL polymer showed bands at 2943 cm- 1 and 2862 cm- 1 attributed to the symmetrical and asymmetric axial deformations, respectively, of the CH 2 group.
  • a band at 1246cm- 1 , ascribed to the asymmetric drawing COC, and a band at 1180cm- 1 , assigned to the symmetrical COC stretch were also found (Motiwalla MJ, Punyarthi PP, Mehta MK, D'Souza JS, Kelkar-Mane V.
  • the NH group occurs in a range of 3400-3440 cm- 1 , but is shifted to lower frequencies, approaching 3300 cm- 1 when the NH group of the peptides is involved in hydrogen bonding (Dash TK, Konkimalla VB Poly-e-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review Journal of Controlled Release, v.158, p.15-33, 2012.).
  • the PVA spectrum showed a band between the regions 3600-3200 cm -1 corresponding to the OH-group stretching vibration.
  • a 2950 cm- 1 absorption band was also found related to the asymmetric stretching of the -CH 2 group, a band at 2902cm- 1 related to the CH stretch, a 1425cm- 1 band related to CH 2 and an absorption band at 1096cm- 1 due to the COC (Islam MDS, Yeum JH, Electrospun Pullulan / Poly (Vinyl Alcohol) / Silver Hybrid Nanofibers: Preparation And Property Characterization For Antibacterial Activity. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v.436, p279-286, 2013; Turaga U, Singh V, Behrens R, Korzeniewski C, Jinka S, Smith E, Kendall RJ, Ramkumar S. Breathability of Standalone Poly (vinyl alcohol) Nanofiber Webs. Industrial and Engineering Chemistry Research, v.53, p.6951 -6958, 2014.).
  • Example 3 In vitro release study of polymeric nanofibers containing bevacizumab
  • polymeric nanofibers containing bevacizumab at different concentrations were cut to size 5-10mm x 5-10mm and weighed individually. Each sample was added to plastic tubes containing 1 -2 ml of PBS and kept in Shaker - type stirrer at a temperature of 35-38 C and Q speed 30-60 rpm for 21 days. The samples were collected initially after 12 and 24 hours, and then every 48 hours until they completed 21 days.
  • the ELISA method exclusively developed for analysis of this antibody using the Anti-Human IgG-peroxidase antibody as the conjugate of the technique, was used.
  • the standard curve was developed for the concentration range ranging from about 1.5 mcg / ml to 0.02 mcg / ml bevacizumab.
  • the reading was performed on a microplate reader at the wavelength of 492 nm.
  • the amount of drug released from the PVA nanofiber containing 2% Beva was approximately 50% of that pertaining to the PVA nanofiber containing 4% Beva.
  • the Beva values released are lower than those observed for the PVA nanofiber, confirming the hypothesis that the PCL / gelatin shell, because of its higher hydrophobicity, reduces the release rate of the concentrated drug in the PVA nucleus.
  • Example 4 Evaluation of the antiangiogenic activity of polymeric nanofibers containing bevacizumab on chorioallantoic membrane (CAM) of chicken eggs
  • CAM chorioallantoic membrane
  • the fertilized eggs were incubated at controlled temperature and humidity (37 Q C / 60% RH).
  • the Q 3 day incubation an opening of about 1 cm was made in the eggshell showing the inner shell membrane, which has been carefully removed to expose the chorioallantoic membrane.
  • the samples PCL / gelatin, PVA and coaxial polymeric nanofibers containing or not bevacizumab
  • the eggs received phosphate buffer solution (pH 7.4); and a drug of known action (free bevacizumab) was applied as a positive control.
  • the CAM aspect was evaluated on the seventh day.
  • Example 5 Evaluation of the cytotoxicity of the preparations developed in Example 1 by the MTT reduction method
  • the cytotoxicity study was performed on samples of polymeric nanofibers (size 3-6mmx3-6mm) of PCL / gelatin, PVA and coaxial containing or not bevacizumab and bevacizumab in solution at different concentrations (100, 178, 320, 560, 1000, 1780 ⁇ g / ml).
  • the ARPE-19 cell line which is pigmented epithelial cells of the human retina, was used.
  • ARPE-19 cells were seeded at density of 1 x 10 4 cells / well in 96-well polystyrene plates at 37 ° C and 5% CO 2 . After 24 hours, the cells were incubated with the samples evaluated in DMEM-F12 culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). ARPE-19 cells in DMEM F12 medium were used as a negative control; DMEM F12 medium, was employed as white; and DMEM F12 and ARPE-19 medium added with DMSO was used as a positive control.
  • FBS fetal bovine serum
  • MTT tetrazolium salt 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the amount of formazan produced is directly proportional to the number of viable cells.
  • the medium was removed as well as the nanofibers, and 85 ⁇ de MTT (5 mg / ml) and 105 ⁇ l DMEM-F12 medium supplemented with SFB were added.
  • Nanofibers of PCL, PVA, Coaxial and PVA and Coaxial nanofibers containing Beva presented a small reduction in cell viability, but no significant cytotoxic effect when compared to the negative control (p ⁇ 0.05).

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Abstract

A presente invenção diz respeito a um dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas coaxiais, compostas preferencialmente de policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese, capaz de tratar e controlar doenças oculares associadas à angiogênese. A invenção se refere ainda a nanofibras coaxiais contendo um inibidor de angiogênese e o seu processo de obtenção.

Description

DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO OCULAR DE FÁRMACOS COMPOSTO POR NANOFIBRAS POLIMÉRICAS CONTENDO BEVACIZUMABE E
PROCESSO DE OBTENÇÃO
001 A presente invenção diz respeito a um dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas coaxiais, contendo preferencialmente policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese, capaz de tratar e controlar doenças oculares associadas à angiogênese. A invenção se refere ainda a nanofibras coaxiais contendo um inibidor de angiogênese e o seu processo de obtenção.
002 A angiogênese ocorre naturalmente no organismo durante o desenvolvimento embrionário e em resposta a cicatrização de ferimentos para a restauração do fluxo sanguíneo nos tecidos lesados. Em condições normais, o organismo é capaz de manter o equilíbrio entre os mediadores angiogênicos envolvidos. Nas situações onde o organismo perde a capacidade de modular a angiogênese, surgem as doenças relacionadas a essa perda (Polverini PJ. Angiogenesis in health and disease: insights into basic mechanisms and therapeutic opportunities, Journal of Dental Education, v. 66, p. 962-975, 2002; Tonini T, Rossi F, Cláudio PP. Molecular basis of angiogenesis and câncer, Oncogene, v. 22, p. 6549-6565, 2003).
003 Enquanto várias doenças isquêmicas podem ser beneficiadas pela indução da angiogênese, em outras esse processo exerce um papel importante no desenvolvimento da patologia, como nas doenças inflamatórias crónicas, artrite reumatóide, retinopatia diabética proliferativa, psoríase, endometriose e adiposidades, além de ser crucial para o crescimento e metástase tumoral. A inibição desse processo então passou a ser uma importante estratégia terapêutica (Griffioen AW, Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of câncer, cardiovascular diseases and chronic inflammation. Pharmacological Reviews, v. 52, p. 237-268, 2000).
004 Esse complexo processo consiste na ativação das células endoteliais por fatores de crescimento, seguido da degradação enzimática da membrana basal, descolamento das células endoteliais das proteínas de adesão, migração das mesmas para o espaço perivascular e proliferação, e finalmente, a formação de novos vasos. Essas etapas são altamente reguladas por vários fatores de crescimento e citocinas, sendo o fator de crescimento endotelial (VEGF, do termo em inglês vascular endothelial growth factor), o fator de crescimento de fibroblastos (bFGF), o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 8 (IL-8) potentes mediadores angiogênicos (Folkman J, Shing Y. Angiogenesis, Journal of Biological Chemistry, v. 267, p. 10931 - 10934, 1992).
005 O processo de neovascularização ocular se refere ao aparecimento e/ou à divisão anormal de células endoteliais, causando e contribuindo para estados patológicos (Lee P, Wang, CC, Adamis AP. Ocular neovascularization. An epidemiological review. Survey of ophthalmology, v. 43, n. 3, p. 245-269, 1998). A neovascularização, na maioria dos casos, provoca uma redução na visão e, caso não controlada corretamente pode levar à cegueira. Os novos vasos podem crescer próximo aos tecidos oculares e afetar a córnea, a íris, a retina e o nervo óptico.
006 Embora nenhum fator explique todas as causas de ocorrência de neovascularização ocular, muitos fatores contribuintes têm sido relatados, tais como a inflamação e seus mediadores moleculares, os fatores angiogênicos do tumor e um fator de hipoxia retiniano (Lee P, Wang CC, Adamis AP. Ocular neovascularization. An epidemiological review. Survey of ophthalmology, v. 43, n. 3, p. 245-269, 1998). O principal mecanismo relatado de formação de novos vasos pode ser resumido da seguinte forma: um estímulo inicial causador de hipoxia dos tecidos induz um efeito compensatório de produção de fatores de crescimento endoteliais, como o VEGF, pelos tecidos envolvidos levando ao surgimento de vasos anormais (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in retinal and eye research, v. 22, n. 1 , p. 1 -29, 2003). Os novos vasos formados são estruturalmente fracos, apresentam vazamento de fluidos e ausência de integridade estrutural, e resultam em hemorragia, exsudatos e fibrose, causando, geralmente, a cegueira.
007 A neovascularização ocular é associada a várias doenças, geralmente causadoras de perda severa da visão e até mesmo cegueira. Entre estas doenças, a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada à idade são as mais frequentes (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in retinal and eye research, v. 22, n. 1 , p. 1 -29, 2003).
008 Um dos fatores pró-angiogênicos mais importantes já identificados é o VEGF, sendo considerado o principal mediador da angiogênese retiniana. É uma glicoproteína de 46kDa com atividades angiogênicas e de permebilidade vascular, sendo produzida no olho pelas células do epitélio pigmentado da retina. Este fator se liga com alta afinidade aos receptores de membrana com atividade tirosina quinase e sua expressão é induzida principalmente em condições de hipoxia (Shima DT, Adamis AP, Ferrara N, Yeo TK, Allende R. Hypoxic induction of endothelial cell growth factors in retinal cells: Identification and characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF) as the mitogen, Molecular Medicine, v. 1 , p. 182-193, 1995; Das A, Mcguire PG. Retinal and choroidal angiogenesis:pathophysiology and strategies for inhibition. Progress in Retinal and Eye Research, v. 22, p.721 -748, 2003). Além de ser um potente mitógeno de células endoteliais, possuir ação pró- inflamatória e neuroprotetora, o VEGF aumenta a expressão celular de metaloproteinases, degradando a matriz extracelular e facilitando a penetração dos neovasos no tecido, ao mesmo tempo em que diminui a expressão endotelial de inibidores de metaloproteinases (Damico FM. Angiogênese e doenças da retina. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, v. 70, p. 547-553, 2007).
009 A caracterização de diferentes processos envolvidos na patogênese da retinopatia diabética e da degeneração macular ligada à idade constitui um pré-requisito para o desenvolvimento de terapias para o tratamento e eventualmente prevenção da perda da visão e cegueira (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in retinal and eye research, v. 22, p. 1 -29, 2003). O VEGF é a proteína envolvida no início e progressão destas doenças e, juntamente com seus receptores, se tornam potenciais alvos para intervenção farmacológica (Griffioen AW, Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of câncer, cardiovascular diseases and chronic inflammation. Pharmacological Reviews, v. 52, p. 237-268, 2000).
0010 A dita formulação se refere à forma farmacêutica de filme de nanofibras contendo substância ativa com atividade anti-VEGF. A formulação é aplicável à administração pelas vias ocular tópica e/ou intraocular.
001 1 As terapias anti-VEGF têm sido a opção de escolha para o tratamento de doenças oculares causadoras de angiogênese. Os fármacos inibidores de VEGF, tais como pegaptanibe sódico (Macugen®, EyeTech, EUA), ranibizumabe (Lucentis®, Genentech, EUA), bevacizumabe (Avastin®, Genentech, EUA) e aflibercepte (Eylia®, Bayer S.A, Brasil) estão se tornando terapias bastante estabelecidas para o tratamento de neovascularização ocular e tem substituído as abordagens iniciais de tratamento como a fotocoagulação a laser e a terapia fotodinâmica (Falavarjani KG, Nguyen QD. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye, v. 27, p. 787-794, 2013; Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al. Therapies for neovascular age-related macular degeneration: current approaches and pharmacologic agents in development. BioMed Research International, 2013:830837, 2013). O bevacizumabe tem sido o mais utilizado mundialmente devido ao seu baixo custo e eficácia semelhante aos outros da mesma classe (Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al. Therapies for neovascular age-related macular degeneration: current approaches and pharmacologic agents in development. BioMed Research International, 2013:830837, 2013; Schmidt-Erfurth U, Chong V, Loewenstein A, Larsen M,Souied E, Schlingemann R, et al. Guidelines for the management of neovascular age-related macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA), British Journal of Ophthalmology, v. 98, p. 1 144-1 167, 2014).
0012 O bevacizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado constituído por 214 aminoácidos e tem um massa molar de aproximadamente 149 kDa. Ele liga-se ao VEGF, inibindo desta forma sua ligação aos receptores presentes na superfície das células endoteliais, Flt-1 (VEGFR-1 ), KDR (VEGFR-2) e Flt-4 (VEGFR-3). A neutralização da atividade biológica do VEGF diminui a vascularização (Rodrigues EB, Farah ME, Maia M, Penha FM, Regatieri C, Melo GB, Pinheiro MM, Zanetti CR. Therapeutic monoclonal antibodies in ophthalmology, Progress in Retinal and Eye Research, v. 28, n. 2, p. 1 17- 144, 2009).
0013 Comercializado com o nome de Avastin® (Genentech, São Francisco, CA, USA), o bevacizumabe foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) e European Medicines Agency (EMEA) e está registrado na ANVISA para o tratamento intravenoso de câncer colorretal metastático e outros tipos de câncer (Prasad OS, Schwartz SD, Hubschman JP. Age-related macular degeneration: Current novel therapies. Maturitas, v. 66, p. 46-50, 2010; Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al. Therapies for neovascular age- related macular degeneration: current approaches and pharmacologic agents in development, BioMed Research International, 2013:830837, 2013; Schmidt-Erfurth U, Chong V, Loewenstein A, Larsen M, Souied E, Schlingemann R, et al. Guidelines for the management of neovascular age-related macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA), British Journal of Ophthalmology, v. 98, p. 1 144-1 167, 2014). Além da sua aplicação no tratamento de vários tipos de câncer, devido ao seu efeito inibidor da angiogênese, o fármaco vem sendo utilizado frequentemente de forma off-label por meio de injeções intravítreas para tratamento de doenças oculares causadoras de angiogênese, com resultados satisfatórios (Krohne TU, Eter N, Holz FG, Meyer CH. Intraocular Pharmacokinetics of Bevacizumab After a Single Intravitreal Injection in Humans. American Journal of Ophthalmology, v. 146, p. 508-512, 2008; Conselho Brasileiro De Oftalmologia. Diretrizes em foco. Degeneração macular relacionada à idade. Revista da associação médica brasileira, v. 59, p. 106-1 1 1 , 2013). O esquema de tratamento utilizando injeções intravítreas de bevacizumabe, geralmente requer a aplicação de cerca de 3 injeções, sendo uma por mês, no olho afetado. Após 30 dias, o paciente é reavaliado, podendo ou não necessitar de injeções subsequentes (Ministério da Saúde. ANVISA. Inibidores da angiogênese para o tratamento da degeneração macular relacionada à idade. BRATS - Boletim Brasileiro de Avaliação de Tecnologias em Saúde. Ano III; nQ 6, 2008). 0014 Embora os estudos clínicos tenham demonstrado a eficácia dos agentes anti-VEGF na melhora da acuidade visual, as injeções intravítreas frequentes, necessárias para o tratamento e controle da progressão das doenças, podem apresentar complicações oculares tais como endoftamite, inflamação intraocular, descolamento de retina, hemorragia ocular e efeitos adversos sistémicos como eventos tromboembolíticos, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, hipertensão e doenças renais (Falavarjani KG, Nguyen QD. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti- VEGF agents: a review of literature. Eye, v. 27, p. 787-794, 2013; Kaiser PK. Emerging therapies for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology, v. 120, p. S1 1 -S15, 2013).
0015 Diante das desvantagens das injeções intravítreas, uma alternativa é o uso intraocular de sistemas de liberação prolongada de fármacos, capazes de manter níveis terapêuticos eficazes por longos períodos de tempo, minimizando a possibilidade de efeitos adversos.
0016 As formas farmacêuticas oftálmicas convencionais são relativamente simples: fármacos solúveis em água são formulados na forma de soluções e fármacos pouco solúveis em água são formuladas nas formas de suspensão ou pomada. Entretanto, essas formulações apresentam os inconvenientes de baixa biodisponibilidade corneal, exposição sistémica devido à drenagem nasolacrimal e reduzida eficácia no segmento posterior do olho (Behar-Cohen F. Drug delivery systems to target the anterior segment of the eye: fundamental bases and clinicai applications. Journal Français dOphthalmologie, v. 25, p. 537-544, 2002; Bourges JL, Bloquei C, Thomas A, Froussart F, Bochot A, Azan F, et al. Intra-ocular implants for extended drug delivery: Therapeutic applications. Advanced drug delivery reviews, v. 58, p. 1 182-1202, 2006.; Bourges JL, Touchard E, Kowalczuk L, Berdugo-Polak M, Thomas-Doyle A, Bochot A, et al. Dispositifs de délivrance de príncipes actifs pour des applications ophtalmologiques. Journal Français dOphthalmologie, v. 30, p. 1070- 1088, 2007.)
0017 O tratamento de doenças oculares no vítreo e na retina tem sido um problema devido à dificuldade de acesso a essas estruturas. A administração ocular na forma de colírios, embora seja o método mais empregado, resulta em concentrações mais elevadas nos tecidos anteriores (córnea, conjuntiva, esclera, humor aquoso e corpo ciliar) e apresenta efeito terapêutico mínimo na região posterior do olho (lente, vítreo e retina), que, geralmente, é mantido com aplicações frequentes da formulação. A administração direta no espaço subconjuntival apresenta algumas vantagens sobre a terapia tópica para o tratamento de doenças do segmento anterior do olho, mas não proporciona concentração efetiva do fármaco no segmento posterior. A via sistémica pode ser utilizada com essa finalidade, mas se observa baixa penetração no olho em virtude da existência da barreira hematorretiniana, que dificulta a entrada de substâncias da circulação sanguínea para a retina. Para que se obtenha uma concentração do fármaco dentro da faixa terapêutica utilizando essa via, é necessária a administração de concentrações elevadas durante um período prolongado, podendo ocasionar sérios efeitos adversos sistémicos (Martin DF, Parks DJ, Mellow SD, Ferris FL, Walton RC, Remaley NA, et al. Treatment of cytomegalovirus retinitis with an intra-ocular sustained-release ganciclovir implant. A randomized controlled clinicai trial. Archives of Ophthalmology, v. 1 12, p. 1531-1539, 1994. ; Kunou N, Ogura Y, Hashizoe M, Honda Y, Hyon S, Ikada Y. Controlled intraocular delivery of ganciclovir with use of biodegradable scleral implant in rabbits. Journal of Controlled Release, v. 37, p. 143-150, 1995; Kunou N, Ogura Y, Yasukawa T, Kimura H, Miyamoto H, Honda Y, et al. Long-term sustained release of ganciclovir from biodegradable scleral implant for the treatment of cytomegalovirus retinitis. Journal of Controlled Release, v. 68, p. 263-271 , 2000.; Kimura H, Ogura Y. Biodegradable polymers for ocular drug delivery. Ophthalmology, v. 215(3), p. 143-155, 2001 ; Kuppermann BD, Blumenkranz MS, Haller JA, Williams GA, Weinberg DV, Chou C, et al. Randomized Controlled Study of an Intravitreous Dexamethasone Drug Delivery System in Patients With Persistent Macular Edema. Archives of Ophthalmology, v. 25, p. 309-317, 2007; Lajavardi L, Bochot A, Camelo S, Goldenberg B, Naud M. C; Behar-Cohen F. Downregulation of endotoxininduced uveitis by intravitreal injection of vasoactive intestinal Peptide encapsulated in liposomes. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, v. 48, p. 3230-3238, 2007.)
0018 A injeção intravítrea é uma alternativa para a obtenção da concentração adequada de fármacos no vítreo e na retina. Essa via era restrita ao tratamento de endoftalmite, mas, atualmente, ela tem sido utilizada para tratamento de casos de vitreorretinopatia proliferativa, retinite virai e uveíte. Entretanto, a rápida circulação sanguínea no local resulta em uma reduzida meia-vida dos fármacos administrados, dessa forma, a concentração chega, rapidamente, a níveis sub-terapêuticos. Para que os níveis se mantenham dentro da faixa terapêutica, são necessárias, então, injeções repetidas, as quais podem causar desconforto para o paciente, além de ocasionar complicações oculares (Peyman G.A, Ganiban G.J. Delivery systems for intraocular routes. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 16, p. 107-123, 1995.; Okabe J, Kimura H, Kunou N, Okabe K, Kato A, Ogura Y. Biodegradable intrascleral implant for sustained intraocular delivery of betamethasone phosphate. Investigative ophthalmology and visual science, v. 44, p. 740- 744, 2003; Nair L. S, Laurencin C. T. Biodegradable polymers as biomaterials. Progress in Polymer Science, v. 32, p. 762-798, 2007).
0019 Por causa das razões acima descritas, diversos estudos têm sido realizados visando o desenvolvimento de sistemas que sejam capazes de manter a concentração dos fármacos no segmento posterior do olho, dentro da faixa terapêutica, por um período mais prolongado. Esses sistemas devem ser biocompatíveis com o organismo e, portanto, os componentes nele presentes devem ser não carcinogênicos, hipoalergênicos, e não causadores de resposta inflamatória no local de aplicação. Eles podem ser preparados a partir de polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Sistemas compostos por polímeros não biodegradáveis, embora apresentem uma taxa de liberação relativamente constante, precisam ser removidos posteriormente, o que requer processos cirúrgicos. Já os biodegradáveis são totalmente absorvidos pelo organismo, não necessitando remoção subsequente, e proporcionando melhor adesão e aceitação do paciente ao tratamento. Polímeros biodegradáveis sintéticos, representados por poliamidas, poliaminoácidos, polialquilcianacrilatos, poliésteres, poli (orto- ésteres), poliuretanos e poliacrilamidas têm apresentado crescente interesse na aplicação como sistemas de liberação de fármacos (Einmahl S, Ponsart S, Bejjani RA, D'Hermies F, Savoldelli M, Heller J, et al. Ocular biocompatibility of a poly (ortho éster) characterized by autocatalyzed degradation. Journal of biomaterials research, v. 67, p. 44- 53, 2003.; Herrero- Vanrell R, Refojo MF. Biodegradable microspheres for vitreoretinal drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 52, p. 5- 16, 2001 ; Einmahl S, Savoldelli M, D'Hermies F, Tabatabay C, Gurny R, Behan-Cohen F. Evaluation of a Novel Biomaterial in the Suprachoroidal Space of the Rabbit Eye, Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, v. 43, p. 1533-1539, 2002; Fialho SL, Rego MGB, Cardillo JA, Siqueira RC, Jorge R, Cunha-Junior AS. Implantes biodegradáveis destinados à administração intra-ocular. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, v. 66, p. 891 -896, 2003.).
0020 Alguns estudos são descritos na literatura com relação à aplicação intravítrea de sistemas de liberação prolongada de bevacizumabe. 0021 Abrishami e colaboradores desenvolveram lipossomas contendo bevacizumabe pelo método de desidratação-reidratação (Abrisham M, Zarei-Ghanavati S, Soroush D, Rouhbakhsh M, Jaafari M.R, Malaekeh-Nikouei B. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina, v. 29, p. 699-703, 2009). A formulação foi aplicada por injeção intravítrea em olhos de coelhos e comparada a uma solução do mesmo anticorpo. A concentração de bevacizumabe livre nos olhos dos animais que receberam a formulação de lipossomas foi 1 e 5 vezes superior a solução do anticorpo nos tempos de 28 e 42 dias, respectivamente.
0022 Nanopartículas de PLA revestidas de bevacizumabe foram encapsuladas em micropartículas porosas de PLGA por infusão supercrítica e pressão (Yandrapu SK, Upadhyay AK, Petrash JM, Kompella UB. Nanoparticles in porous microparticles prepared by supercritical infusion and pressure quench technology for sustained delivery of bevacizumab. Molecular Pharmacology, v. 10, p. 4676-4686, 2013.). O estudo de liberação in vitro, mostrou uma liberação do bevacizumabe por um período de 4 meses, sem alteração da estrutura e atividade do anticorpo. O bevacizumabe foi detectado in vivo durante 2 meses após aplicação intravítrea em ratos.
0023 Em um trabalho realizado por Hu e colaboradores, foi desenvolvido um hidrogel termosensível utilizando copolímeros em bloco (Hu CC, Chaw JR, Chen CF, Liu HW. Controlled release bevacizumab in thermoresponsive hydrogel found to inhibit angiogenesis. Biomedical Materials Enginnering, v. 24, p. 1941 -1950, 2014). Após um mês de aplicação intravítrea do sistema não foi observada nenhuma alteração na retina dos coelhos. Em cultura de células, a atividade do bevacizumabe incorporado no hidrogel foi mantida durante todo o período do estudo de liberação. 0024 O perfil de liberação in vivo do bevacizumabe incorporado em uma formulação de hidrogel também foi estudado por Rauck e colaboradores (Rauck BM, Friberg TR, Medina Mendez CA, Park D, Shah V, Bilonick RA, et al. Biocompatible reverse thermal gel sustains the release of intravitreal bevacizumab in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science, v. 55, p. 469-476, 2014.). A formulação foi aplicada por injeção intravítrea e foi bem tolerada em olhos de coelhos. O hidrogel foi capaz de promover a liberação do bevacizumabe por um período de 9 semanas e a concentração do fármaco foi mantida 4,7 vezes superior à concentração dos olhos que receberam apenas injeção de solução de bevacizumabe.
0025 Um sistema polimérico de poliuretano biodegradável contendo bevacizumabe foi desenvolvido por Ferreira e colaboradores, sendo a atividade antiangiogênica do anticorpo monoclonal estudada em modelo de neovascularização da córnea. O bevacizumabe liberado a partir do sistema foi capaz de promover a redução do número de vasos na córnea e a expressão do VEGF, sem causar toxicidade para os tecidos (Ferreira ERA, Castro BFM, Vieira LC, Cassali GD, Souza CM, Fulgêncio GO, Ayres E, Oréfice RL, Jorge R, Fialho SL, Silva-Cunha A. Antiangiogenic activity of a bevacizumab-loaded polyurethane device in animal neovascularization models. Journal Francais DOphtalmologie, p. 202- 208, 2017.).
0026 Nanofibras ou nanofios poliméricos são de grande interesse em função das propriedades associadas a estes materiais, bem como do grande número de possíveis aplicações (Chronakis IS. Novel nanocomposites and nanoceramics based on polymer nanofibers using electrospinning process— A review. Journal of Materials Processing Technology, v. 167, p. 283-293, 2005. ; Chew SY, Wen Y, DzenisY, Leong KW. The Role of Electrospinning in the Emerging Field of Nanomedicine. Current Pharmaceutical Des, v. 12, p. 4751-4770, 2006), como por exemplo nas áreas de eletrônica, física, química, medicina, biologia e engenharia de materiais.
0027 Polímeros em nanofilamentos e multifilamentos contínuos podem ser formados a partir de técnicas como a fiação a seco (dry spinning), fiação úmida (wet spinnng), fiação via gel (gel spinning) e fiação do fundido (melt spinning) (Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Composites Science and Technology, v.63, p. 2223-2253, 2003.; Sato JAP. Fabricação e Caracterização de Sistemas Poliméricos Nanoestruturados Obtidos por Meio do Uso da Técnica De Eletrofiação. Santo André: Universidade Federal do ABC, 201 1 . 109p. (Dissertação, Mestrado em Nanociências e Materiais Avançados). Com essas técnicas as fibras obtidas possuem uma variação média em diâmetro entre 10 a 500 μιη (Park JS, Park JW, Ruckenstein E. Thermal and dynamic mechanical analysis of PVA/MC blend hydrogels. Polymer, v.42, p. 4271 -4280, 2001 .; Sato JAP. Fabricação e Caracterização de Sistemas Poliméricos Nanoestruturados Obtidos por Meio do Uso da Técnica De Eletrofiação. Santo André: Universidade Federal do ABC, 201 1 . 109p. (Dissertação, Mestrado em Nanociências e Materiais Avançados). Por outro lado, para produzir fibras com diâmetros médios muito menores é utilizado a técnica de eletrofiação ou fiação eletrostática (electrospinning). A eletrofiação permite a obtenção de um diâmetro médio das fibras das malhas, ou mantas ou membranas poliméricas variando entre 10nm a 10μιη (Eichhorn SJ, Sampson WW. Sampson Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royai Society Interface, v.2, p. 309-318, 2005).
0028 Utilizando a técnica de eletrofiação, nanofibras poliméricas são produzidas como resultado de forças elétricas repulsivas que superam a tensão superficial do líquido polimérico carregado. Basicamente, o sistema de eletrofiação consiste em três partes: um gerador de alta tensão, uma seringa contendo a solução polimérica e um coletor (Bhardwaj N, Kundu SC. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnology Advances, v.28, p325-347, 2010). Quando a intensidade do campo elétrico é aumentada, as cargas induzidas na superfície do líquido se repelem criando uma instabilidade. Estas forças repulsivas agem em direção oposta à da tensão superficial, que resulta na extensão da gota na ponta da agulha em uma forma cónica (Cone de Taylor) (Baji A, Mai YW, Wong SC, Abtahi M, Chen P. Electrospinning of polymer nanofibers: Effects on oriented morphology, structures and tensile properties. Composite Science Technology, v. 70, p. 703-18, 2010). Quando estas forças repulsivas superam a tensão superficial do líquido, esta gota se alonga e se transforma em um jato estável que vai em direção ao coletor de carga oposta. Neste trajeto do jato, o solvente da solução evapora e fibras são formadas no coletor. Parâmetros da solução (viscosidade, condutividade, tensão superficial, massa molar do polímero e constante dielétrica), do processamento (campo elétrico, distância agulha-coletor e taxa de infusão) e do ambiente (umidade e temperatura) influenciam e direcionam o processo de eletrofiação (Chakrapani VY, Gnanamani A, Giridev VR, Madhusoothanan M, Sekaran G. Electrospinning of Type I collagen and PCL nanofibers using acetic acid. Journal of Applied Polymer Science, v. 125, p. 3221 -3227, 2012).
0029 Nanofibras produzidas a partir do processo de eletrofiação apresentam vantagens, tais como alta área superficial, flexibilidade para uma grande variedade de formas e tamanhos e a capacidade de controlar a composição de nanofibras para alcançar os resultados desejados a partir de suas propriedades e funcionalidades (Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Composites Science and Technology, v.63, p. 2223-2253, 2003; Bhardwaj N, Kundu SC. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnology Advances, v.28, p325-347, 2010; Kulkarni A, Bambole VA, Mahanwar PA. Electrospinning of Polymers, Their Modeling and Applications. Polymer-Plastics Technology and Engineering, v. 49, p. 427-441 , 2010; Garg K, Bowlin GL. Electrospinning jets and nanofibrous structures. Biomicrofluidics, 013403-1 , 201 1 ).
0030 Estudos anteriores demonstraram que utilizando a eletrofiação direta da suspensão de partículas hidrossolúveis na solução polimérica resulta em uma liberação imediata (burst release) de elevada concentração do fármaco, que pode causar sérios efeitos adversos. Por exemplo, em um estudo desenvolvido por Luu e colaboradores, mais de 60% do DNA incorporado em nanofibras de PLGA foi liberado em 2 horas (Luu YK, Kim K, Hsiao BS, CHU B, Hadjiargyrou M. Development of a nanostructured DNA delivery scaffold via electrospinning of PLGA and PLA-PEG block copolymers. Journal of Controlled Release, v. 89, p. 341 -353, 2003). Por outro lado, o contato de substâncias ativas biológicas com solventes orgânicos resulta em grande possibilidade de desnaturação das proteínas e consequente perda de sua atividade (Jiang H, Wang L, Zhu K. Coaxial electrospinning for encapsulation and controlled release of fragile water-soluble bioactive agents. Journal of Controlled Release, v. 193, p. 296-303, 2014).
0031 Desta forma, recentemente, foi desenvolvida a técnica de eletrofiação coaxial, que utiliza dois capilares concentricamente alinhados e que permitem a formação de fibras em estrutura membrana- núcleo (Zhao P, Jiang H, Pan H, Zhu K, Chen W. Biodegradable fibrous scaffoids composed of gelatin coated poly (ε-caprolactone) prepared by coaxial electrospinning. Journal of Biomedical Materials Research, v. 83, p. 372-382, 2007). O principal objetivo de utilização desta técnica em sistemas de liberação de fármacos é contornar as limitações da eletrofiação direta no que se refere ao encapsulamento de substâncias bioativas frágeis e hidrossolúveis, e também de promover uma liberação mais prolongada da substância e permitir o encapsulamento de múltiplas substâncias com diferentes características de solubilidade. Esta técnica é interessante não só no desenvolvimento de nanofibras multifuncionais, mas também de matrizes com diferentes taxas de degradação em diferentes períodos de uso no organismo. A performance mecânica de nanofibras, com específicas concentrações de polímeros no núcleo e na membrana, produzidas por tal processo, geralmente é melhor do que aquelas produzidas somente com um polímero (Huang Z.M, Zhang YZ, Ramakrishna S. Double-layered composite nanofibers and their mechanical performance. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics, v. 43, p. 2852-2861 , 2005). Esta técnica também é estudada para a produção de nanofibras com liberação controlada de fármacos, onde o polímero da membrana impede a liberação inicial acelerada do fármaco encapsulado no núcleo (Meinel AJ, Germershaus O, Luhmann T, Merkle H, Meinel L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current Technologies and selected biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 81 , p. 1 -13, 2012). Utilizando esta técnica, estudos anteriores demonstraram uma eficiência de encapsulamento de proteínas em nanofibras poliméricas próxima de 100% (Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics, v. 185, p. 129- 188, 1999).
0032 Nanofibras biocompatíveis e biodegradáveis são produzidas utilizando polímeros sintéticos e naturais (Li X, Xie J, Lipner J, Yuan X, Thomopoulos S, Xia Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Letters, v. 9, p. 2763-2768, 2009). Para sua utilização, é importante que as mesmas possuam resistência e rigidez suficientes para aplicação no organismo. A combinação das vantagens da poli-e-caprolactona (PCL), como a resistência mecânica, com a bioatividade da gelatina pode ser uma alternativa para eletrofiação coaxial. (Baji A, Mai YW, Wong SC, Abtahi M, Chen P. Electrospinning of polymer nanofibers: Effects on oriented morphology, structures and tensile properties. Composite Science Technology, v. 70, p. 703-18, 2010).
0033 A presente tecnologia trata de um dispositivo para liberação ocular de bevacizumabe composto por nanofibras poliméricas e bevacizumabe. Até o momento nenhuma formulação contendo bevacizumabe incorporado em nanofibra polimérica encontra-se disponível no mercado ou relatado no estado da técnica (BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em:
<http://www7.anvisa.gov.br/datavisa/consulta_produto/Medicamentos/frm ConsultaMedicamentosPersistir.asp> Acesso em: mar. 2017).
0034 A Tabela 1 relaciona alguns estudos de nanofibras poliméricas utilizando a técnica de eletrofiação coaxial para liberação prolongada de proteínas.
Tabela 1 - Estudos relacionados ao desenvolvimento de nanofibras poliméricas para liberação prolongada de proteínas.
Polímero
Autores Proteína Aplicação
(núcleo/membrana)
Regeneração de
ZHU et al ., 2013 BMP-PEG/PCL BMP
tecido
VEGF-
ZHANG et al., VEGF ou
quitosana/PLA-b- Vaso sanguíneo 2013 PDGF
PEG
EIF e BSA/ PLA e Regeneração da
JIN et al., 2013 EIF
gelatina pele VEGF, BSA,
Engenharia de tecido
JIA et al., 201 1 heparina e VEGF
vascular
dextrano/PLGA
VEGF,
LIAO et al., 201 1 VEGF e PDGF/PU Hemofilia
PDGF
PDGF, dextrano e
LI et al., 2010 PDGF Células músculo liso
BSA/ PLA
SAHOO et al., Célula tronco de bFGF-BSA/PLGA bFGF
2010 medula óssea
LIAO et al., 2006 PDGF/PCL-PEG PDGF -
ZHANG et al.,
BSA-PEG/PCL BSA - 2006
BSA ou
JIANG et al., 2006 BSA-PEG/PCL-PEG - lisozima
BMP - proteína óssea; PEG - polietilenoglicol; PCL - poli-e-caprolactona;
VEGF - fator de crescimento endotelial vascular; PLA-b-PEG - polilático- b-polietilenoglicol; EIF - fator de indução epidermal; BSA - albumina bovina sérica; PLA - polilático; PLGA - poli-lático-co-glicólico; PDGF - fator de crescimento plaquetário; PU - poliuretano; bFGF - fator de crescimento de fibroblasto. (Zhu HY, Yu D, Zhou Y, Wang MF, Gao MF, Jiang HL, et al. Biological activity of a nanofibrous barrier membrane containing bone morphogenetic protein formed by core-shell electrospinning as a sustained delivery vehicle. Journal of Biomedical Materials Research B Applications in Biomaterials, v. 101 B, p. 541 -552, 2013.; Zhang H, Jia XL, Han FX, Zhao J, Zhao YH, Fan YB, et al. Dual- delivery of VEGF and PDGF by double-layered electrospun membranes for blood vessel regeneration. Biomaterials, v. 34, p. 2202-2212, 2013.; Jin GR, Prabhakaran MP, Kai D, Ramakrishna S. Controlled release of multiple epidermal induction factors through core-shell nanofibers for skin regeneration, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 85, p. 689-698, 2013.; Jia XL, Zhao CG, LI P, Zhang H, Huang Y, Li H, et al. , Sustained release of VEGF by coaxial electrospun dextran/PLGA fibrous membranes in vascular tissue engineering. Journal of Biomaterials Sciences, v. 22, p. 181 1 -1827, 201 1 ,; Liao IC, Leong KW. Efficacy of engineered FVIII-producing skeletal muscle enhanced by growth factor-releasing co-axial electrospun fibers. Biomaterials, v. 32, p. 1669-1677, 201 1 ., Li H, Zhao CG, Wang ZX, Zhang H, Yuan XY, Kong DL. Controlled release of PDGF-bb by coaxial electrospun dextran/poly(l- lactide-co-e-caprolactone) fibers with an ultrafine core/shell structure. Journal of Biomaterials Science Polymers, ed. 21 , p. 803-819, 2010.; Sahoo S, Ang LT, Goh JCH, Toh S.L. Growth factor delivery through electrospun nanofibers in scaffolds for tissue engineering applications. Journal of Biomedical Materials Research A, v. 93A, p. 1539-1550, 2010; Liao IC, Chew SY, Leong KW. Aligned core-shell nanofibers delivering bioactive proteins. Nanomedicine, v. 1 , p. 465-471 , 2006.; Zhang YZ, Wang X, Feng Y, Li J, Lim CT, Ramakrishna S. Coaxial electrospinning of (fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin)- encapsulated poly(c-caprolactone) nanofibers for sustained release. Biomacromolecules , v. 7, p. 1049-1057, 2006; Jiang HL, Hu YQ, Zhao PC, Li Y, Zhu KJ. Modulation of protein release from biodegradable core-shell structured fibers prepared by coaxial electrospinning. Journal of Biomedical Materials Research B Applications in Biomaterials, v. 79B, p. 50-57, 2006)
0035 Nanofibras de PCL e gelatina foram desenvolvidas e caracterizadas pela técnica de eletrofiação coaxial e os estudos in vitro revelaram a biocompatibilidade destas nanofibras com grande proliferação de células-tronco, assim como indícios de diferenciação destas em osteoblastos, tornando este biomaterial uma potencial alternativa para uso na engenharia de tecido ósseo (Pereira IHL, Ayres E, Averous L, Schlatter G, Hebraud A, Mendes STO L, Oréfice RL. Elaboration and Characterization of Coaxial Electrospun Poly(c- Caprolactone)/Gelatin Nanofibers for Biomedical Applications. Advances in Polymer Technology, v. 33, 2014).
0036 Existem algumas patentes depositadas referentes ao preparo e uso de nanofibras poliméricas, porém as mesmas não se tratam de sistemas de liberação modificada de fármacos para uso ocular, especificamente em doenças causadoras de angiogênese.
0037 Por exemplo, a patente US20100055154A1 intitulada "Fibras de eletrofiação coaxial e estruturas e métodos de formação das mesmas" descreve nanofibras e microfibras que apresentam um núcleo recoberto por uma parede polimérica (Liao l-C, Leong KW, Chew S-Y. Coaxial electrospun fibers and structures and methods of forming the same. United States Patent Application Publication US20100055154A1 ; 04 mar. 2010). O núcleo é composto de canais que ligam a superfície da parede polimérica ao núcleo e também por uma ou mais substâncias que podem ser fármacos, proteínas, vírus, plasmídeos DNA, células bacterianas e nanopartículas com fármaco encapsulado.
0038 A patente US20140227340A1 intitulada "Fibras contendo drogas pouco solúveis e/ou proteínas" descreve fibras obtidas por eletrofiação que apresentam estrutura casca-núcleo que contem drogas pouco solúveis e/ou proteínas (Freyman T, Pham Q, Mulligan RF, Picard NA, Yan X. Fibers Comprising Poorly Soluble Drugs and/or Proteins. United States Patent Application Publication US20140227340A1 ; 14 ago. 2014).
0039 A patente US2016003861 1A1 intitulada "Nanofibra e composições bioativas e métodos relacionados" descreve uma composição em nanofibra contendo uma ou mais substância bioativa, que quando exposta à umidade, as nanofibras dissolvem liberando a substância bioativa incorporada. (Vile GF, Hosie IC, Feasey SV. Nanofibre and bioactive compositions and related methods. United States Patent Application Publication US2016003861 1 A1 ; 1 1 fev. 2016).
0040 A patente US 9,375,516 intitulada "Suporte de nanofibra polimérica para liberação de fator de crescimento baseado em heparina/fibrina" descreve um suporte de transporte de fator de crescimento que combina um sistema de liberação baseado em heparina/fibrina com a cadeia composta por nanofibras poliméricas para regeneração de tecido (Thomopoulos S, Sakiyama-Elbert S, Silva M, Gelberman R, Xia Y, Schwartz A, Xie J. Polymer nanofiber scaffold for a heparin/fibrin based growth factor delivery system. United States Patent Application Publication US 9,375,516; 28 jun. 2016). O suporte pode transportar fatores de crescimento de maneira controlada, pode ser implantado, é biocompatível, não citotóxico e pode ser empregado em cirurgias para reparo de ossos, músculos, cartilagem e outros tecidos.
0041 Não foi encontrado no estado da técnica, dispositivos de liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe para aplicação em doenças oculares causadoras de angiogênese.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
0042 Na Figura 1 estão apresentadas imagens de microscopia eletronica de varredura das nanofibras contendo PCL/gelatina (a); PCL.gelatina.Beva 1 % (b); PVA (c); PVA.Beva 1 % (d); Coaxial (e); Coaxial. Beva 1 % (f).
0043 Na Figura 2 estão apresentadas imagens de microscopia eletronica de transmissão da estrutura de nanofibras Coaxial contendo CuS04 visualizadas no aumento 10.000x (A) e no aumento de 200.000x (B).
0044 A Figura 3 é uma imagem da nanofibra coaxial obtida por microscopia confocal, contendo isotiocianato de fluoresceína. 0045 Na Figura 4 estão demonstrados os gráficos de TG e DTG das nanofibras de PCL/gelatina (A), de PVA (B) e coaxial (C). Os dados foram obtidos realizando as análises sob atmosfera de nitrogénio com fluxo de 30 ml/min e taxa de aquecimento de 20°C/min.
0046 A Figura 5 apresenta as curvas DSC obtidas para o 1 Q aquecimento para as nanofibras de PCL (a), (b) PVA e (c) coaxial.
0047 A Figura 6 representa uma comparação dos espectros de FTIR-ATR obtidos das nanofibras coaxial antes de serem lavadas com TFE, após serem lavadas e as nanofibras de PVA que foram utilizadas como controle.
0048 A Figura 7 representa uma comparação dos espectros de FTIR-ATR obtidos das nanofibras coaxial antes de serem lavadas com DMSO, após serem lavadas e as nanofibras de PCL que foram utilizadas como controle.
0049 A Figura 8 é um gráfico que mostra o percentual de vasos na membrana corioalantóica (CAM) após aplicação das amostras. Os resultados foram comparados ao grupo controle que recebeu PBS.
0050 A Figura 9 é um gráfico que representa o percentual de viabilidade de células ARPE-19 após 24 horas de aplicação das amostras, utilizando o ensaio de MTT.
0051 A Figura 10 é um gráfico que representa o percentual de viabilidade de células ARPE-19 após 72 horas de aplicação das amostras, utilizando o ensaio de MTT.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
0052 A presente invenção diz respeito a um dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas coaxiais, contendo preferencialmente policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese, capaz de tratar e controlar doenças oculares associadas à angiogênese. A invenção se refere ainda a nanofibras coaxiais contendo um inibidor de angiogênese e o seu processo de obtenção.
0053 As nanofibras poliméricas da presente invenção são caracterizas por conter policaprolactona, gelatina e álcool polivinílico, e um inibidor de angiogênese, sendo o inibidor de angiogênese, preferencialmente, o bevacizumabe. As nanofibras são preferencialmente coaxiais e contém membrana composta, preferencialmente, de policaprolactona/gelatina e o núcleo composto, preferencialmente, de álcool polivinílico. O diâmetro das nanofibras é preferencialmente entre 185 e 480 nm.
0054 O dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos da presente invenção é caracterizado por conter as nanofibras descritas acima e sua administração pode ser pelas vias ocular tópica ou intraocular.
0055 Processo de obtenção das nanofibras poliméricas descritas acima contém as seguintes etapas:
a) Preparar, separadamente, soluções de PCL e gelatina 5-7% p/v em 2,2,2- trifluoroetanol (TFE);
b) agitar as soluções durante 2-4 horas sob temperatura ambiente; c) misturar as duas soluções obtidas em "b" na proporção de 5-7 partes de PCL para 3-5 partes de gelatina, acrescentando-se, no final, 1 -2 ml de solução de aproximadamente 0,2% v/v de ácido acético em TFE;
d) preparar solução de PVA, na concentração de 14-16% p/v em água deionizada, mantendo a mesma na temperatura de 80-100Q C, durante 1 -3 horas;
e) adicionar o bevacizumabe à solução obtida em "d", na concentração de 0,5 a 4% p/p;
f) transferir as soluções obtidas em "c" e em "f" para seringas de vidro, e acoplar as mesmas a um dispositivo coaxial; g) proceder à eletrofiação coaxial.
0056 Na etapa "g" do processo acima, os parâmetros do processo são, preferencialmente: diâmetros internos e externos da agulha de 0,5- 1 ,0 mm e 0,5-1 ,5 mm, respectivamente. A vazão de 4,0-5,0 mL/h para a solução de PCL/gelatina e 1 ,0-2,0 mL/h para solução de PVA. A voltagem aplicada de aproximadamente +25/0kV entre o dispositivo coaxial e o disco coletor. O dispositivo coletor foi posicionado a uma distância de 15,0-16,0 cm da ponta da agulha.
0057 A presente invenção é adicionalmente descrita nos seguintes exemplos, não limitantes.
Exemplo 1 : Preparo das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe
0058 A composição farmacêutica da formulação descrita na presente invenção é composta pelo anticorpo monoclonal bevacizumabe (Beva) podendo ser utilizados outros fármacos, sintéticos ou não, e de diferentes classes, com possibilidade de atividade em doenças oculares. Como componente polimérico, foi empregada a poli-caprolactona (PCL), a gelatina e o álcool polivinílico (PVA) 98-99% hidrolisado. A técnica de eletrofiação coaxial foi empregada para o preparo das nanofibras poliméricas.
0059 Inicialmente, foram preparadas as soluções de PCL e gelatina separadamente. Cada polímero, na concentração de 5-7% p/v, foi pesado e solubilizado em 2,2,2- trifluoroetanol (TFE) com auxílio de um agitador magnético durante 2-4 horas sob temperatura ambiente. Em seguida, as duas soluções obtidas foram misturadas na proporção de aproximadamente 60:40 de PCL e gelatina, respectivamente, acrescentando-se, no final, 1 -2 ml de solução de aproximadamente 0,2%v/v de ácido acético em TFE. A solução de PVA, na concentração de 14-16% p/v, foi preparada dissolvendo o polímero em água deionizada na temperatura de 80-100Q C, durante 1 -3 horas.
0060 O bevacizumabe foi adicionado à solução de PVA em temperatura ambiente nas concentrações, em porcentagem p/p, de 0,5% a 4% em massa de bevacizumabe em PVA.
0061 Para o preparo das nanofibras, as soluções preparadas contendo PCL/gelatina (membrana) e PVA (núcleo) foram transferidas para seringas de vidro, as quais foram acopladas a um dispositivo coaxial. Para ejeção das soluções foram empregadas agulhas com diâmetros internos e externos de 0,5-1 ,0mm e 0,5-1 ,5 mm. A vazão foi de 4,0-5,0 mL/h para a solução de PCL/gelatina e 1 ,0-2,0 mL/h para solução de PVA. A voltagem aplicada foi de aproximadamente +25/0kV entre o dispositivo coaxial e o disco coletor. O dispositivo foi posicionado a uma distância de 15,0-16, Ocm da ponta da agulha. Foram preparadas nanofibras brancas, sem o fármaco e também nanofibras core-shell para cada concentração de bevacizumabe descrita no preparo das soluções.
Exemplo 2: Caracterização das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe
0062 As nanofibras poliméricas de PCL/gelatina, PVA e coaxial contendo ou não bevacizumabe foram caracterizadas por meio de diferentes técnicas, as quais estarão descritas a seguir:
0063 a) microscopia eletrônica de varredura: para obtenção das imagens, as nanofibras poliméricas foram inicialmente cortadas no tamanho de 1 -2 cm x 1 -2 cm. Em seguida, foram metalizadas com ouro e analisadas utilizando microscópio eletrônico de varredura na voltagem de aproximadamente 15 kV. O diâmetro das nanofibras foi determinado utilizando o software Image J pela medida de 100 fibras de cada uma das imagens obtidas. 0064 As fibras de PCL/gelatina, PVA e coaxial apresentaram diâmetros na faixa de 195nm, 473nm e 190nm, respectivamente (Figura 1 ). A presença do bevacizumabe nas diferentes concentrações nas nanofibras não alterou significativamente os diâmetros das mesmas (Tabela 1 ).
Tabela 1 - Média dos diâmetros das nanofibras (nm) PCL/gelatina, PVA e coaxial PCL/PVA nas diferentes concentrações de Bevacizumabe.
Concentração Tipo de nanofibra
de Beva PCL PVA Coaxial
- 195±47 4731194 190140
Beva 0,5% 255±59 299169 224144
Beva 1 ,0% 248±57 3261104 244160
Beva 2,0% 198±44 3131109 272186
Beva 4,0% 4-— 75138 31 1190 255187
0065 b) microscopia eletrônica de transmissão: para obtenção das imagens, as nanofibras poliméricas foram preparadas adicionando CuS04 (8-10%p/p) na solução aquosa de PVA. As nanofibras foram coletadas diretamente no grid Holey Carbon de 300mesh por 5-10 minutos e analisadas utilizando microscópio eletronico de transmissão na voltagem de aproximadamente 200 kV.
0066 A presença de CuS04 no núcleo permitiu a visualização do contraste entre casca e núcleo na nanofibra coaxial conforme demonstrado na Figura 2.
0067 E para a produção das imagens fluorescentes foi utilizado o microscópio confocal Nikon Eclipse Ti com um laser C2. Neste caso, o isotiocianato de fluoresceína foi incorporado no núcleo de PVA das nanofibras. A observação da fluorescência da fluoresceína ao longo de todo comprimento das nanofibras comprova a uniforme extensão da estrutura casca-núcleo (Figura 3). 0068 c) Termogravimetria (TG) e Termogravimetria Derivada (DTG): As curvas TG e DTG foram obtidas pela análise das nanofibras poliméricas sob atmosfera de nitrogénio com fluxo de 15-30 ml/min e taxa de aquecimento de 15-20°C/min, no intervalo de 20°C a 700°C e estão demonstradas na Figura 4.
0069 As curvas da TG e DTG das nanofibras de PCL/gelatina (Figura 4A) mostraram a ocorrência de perda de massa de 4%, associada à evaporação da água entre 22°C a 1 12°C. Na faixa de temperatura entre 195QC e 362QC, observou-se um pico em 337°C correspondente a perda de massa de 19% atribuído à degradação da gelatina presente nas nanofibras de PCL/gelatina. Entre 373°C a 505°C, observou-se um pico em 423°C, correspondente a perda de massa de 67%, atribuído à degradação do PCL.
0070 Para as nanofibras de PVA (Figura 4B) foi observada degradação na faixa de 23°C a 1 19°C de 7%, associada à evaporação da água/solventes. Na faixa de temperatura de 182QC a 347QC um pico em 274°C, correspondente a 70% de perda de massa, foi atribuído à fragmentação da cadeia do PVA e eliminação de moléculas menores. Tais valores se mostram consistentes ao encontrado na literatura (Parparita E, Cheaburu CN, Vasile C. Morphological, Thermal And Rheological Characterization Of Polyvinyl Alcohol/Chitosan Blends. Cellulose Chemistry And Technology 2012;46:571 -581 .; Won JJ, Nirmala R, Navamathavan R, Kim HY. Electrospun Core-Shell Nanofibers From Homogeneous Solution Of Poly (Vinyl Alcohol)/Bovine Serum Albumin. International Journal of Biological Macromolecules, Elsevier 2012;50:1292-1298). Na faixa de temperatura entre 391 °C a 495°C, com pico centrado em 430°C, correspondente a 14% de perda de massa foi atribuída à degradação dos fragmentos restantes da molécula.
0071 Para a nanofibra coaxial (Figura 4C), na faixa de temperatura de 38°C a 1 17°C, com pico máximo em 67°C, observou-se perda de massa de 3% associada à evaporação da água. Na faixa de temperatura de 189QC à 363QC, com pico centrado em 324°C correspondente a perda de massa de 22% foi atribuída a degradação da gelatina e degradação parcial do PVA. E, na faixa de temperatura de 367°C a 534°C, com pico centrado em 422°C, correspondente a perda de massa de 62%, foi atribuída à degradação térmica do PCL e PVA.
0072 d) Calorimetria exploratória diferencial (DSC): As curvas de DSC foram obtidas pela análise das nanofibras poliméricas sob atmosfera de nitrogénio, aquecimento de 30°C a 250°C, resfriamento até - 50°C, e reaquecimento até 250°C com taxa de aquecimento de 10°C /min e estão demonstradas na Figura 5.
0073 A curva de DSC da nanofibra de PCL/gelatina apresentou banda endotérmica associada à fusão do PCL na temperatura de 50QC e uma entalpia de 49,9 mJ/mg. Um evento endotérmico relacionado ao início da degradação térmica da gelatina em torno de 180QC também foi notado para as nanofibras de PCL/gelatina. Para as nanofibras de PVA, eventos endotérmicos relacionados à perda de água, foram verificados por DSC na temperatura de 120QC. A transição vítrea do PVA foi observada em torno de 75QC e fusão em torno de 220QC. As nanofibras coaxiais apresentaram evento de fusão relacionado ao PCL a 47QC com entalpia de 18,5 mJ/mg e eventos associados com a eliminação de voláteis (125QC) e de fusão do PVA. Estes resultados reforçam as informações reveladas por MET e comprovam a presença de PVA nas nanofibras coaxiais. A razão entre as entalpias de fusão dos polímeros nas nanofibras isoladas e nas nanofibras coaxiais se mostra próxima da composição teórica destes polímeros nos sistemas que é na razão de 50/50 em massa de PVA/PCL.
0074 e) Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR): Os espectros das nanofibras poliméricas foram obtidos por meio da técnica de reflexão total atenuada (ATR). Foram realizadas 10-20 varreduras e resolução de 3-5cm"1.
0075 O espectro para o polímero PCL apresentou bandas em 2943cm"1 e 2862cm"1 atribuídas às deformações axiais simétricas e assimétricas, respectivamente, do grupo CH2. Uma intensa banda em 1724cm"1 foi observada e atribuída ao sinal de deformação axial de carbonila (C=0) do grupo éster. Uma banda em 1246cm"1 , atribuída ao estiramento assimétrico C-O-C, e uma banda em 1 168cm"1 , atribuída ao estiramento simétrico C-O-C também foram encontradas (Motiwalla MJ, Punyarthi PP, Mehta MK, D'Souza JS, Kelkar-Mane V. Studies on degradation efficiency of polycaprolactone by a naturally-occurring bacterium. Journal of Environmental Biology, v.34, p.43-49; 2013; Swain PK, Das M, Nayak PLBiodegradation Studies of Chitosan- Polycaprolactone (PCL) Nanocomposite In Soil Burial Test. Middle-East Journal of Scientific Research, v.23, p.253-258, 2015). Foi observada a banda 3288 cm"1 atribuída à vibração do grupo amina N-H relacionada a gelatina presente na nanofibra de PCL, como também as bandas 1642 cm"1 e 1530 cm"1. Segundo Dash e Konkimalla, o grupo N-H ocorre em um intervalo entre 3400-3440cm"1 , mas é deslocada para frequências mais baixas, aproximando de 3300cm"1 quando o grupo N-H dos peptídeos está envolvido em ligação de hidrogénio (Dash TK, Konkimalla VB. Poly-e-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. Journal of Controlled Release, v.158, p.15-33, 2012.). O espectro do PVA apresentou uma banda entre as regiões 3600-3200 cm"1 correspondente à vibração de estiramento do grupo - OH. Foram encontradas também uma banda de absorção em 2950 cm"1 relacionada ao estiramento assimétrico do grupo -CH2, uma banda em 2902cm"1 relacionada ao estiramento C-H, uma banda em 1425cm"1 relacionada a CH2 e uma banda de absorção em 1096cm"1 , devido ao estiramento C-O-C (Islam MDS, Yeum JH. Electrospun Pullulan/Poly (Vinyl Alcohol)/Silver Hybrid Nanofibers: Preparation And Property Characterization For Antibacterial Activity. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v.436, p279-286, 2013; Turaga U, Singh V, Behrens R, Korzeniewski C, Jinka S, Smith E, Kendall RJ, Ramkumar S. Breathability of Standalone Poly (vinyl alcohol) Nanofiber Webs. Industrial and Engineering Chemistry Research, v.53, p.6951 -6958, 2014.).
0076 Para comprovar a presença do PCL e PVA na nanofibra coaxial, foi realizada a remoção de cada polímero isoladamente por meio da solubilização em solventes específicos para cada um deles. A uma amostra de nanofibra coaxial foi adicionado TFE, que permitiu a remoção do PCL e avaliação do PVA, que serviu como controle (Figura 6). Outra amostra da nanofibra coaxial foi acrescentada de DMSO, que permitiu a remoção do PVA e avaliação do PCL, que serviu como controle (Figura 7). Em ambos os casos foi possível evidenciar as bandas características de cada polímero isoladamente.
0077 Os espectros infravermelho das nanofibras PCL/gelatina, PVA e Coaxial contendo 0,5%, 1 %, 2% e 4% do Beva apresentaram as mesmas bandas específicas de cada polímero já citadas no tópico anterior, não havendo diferença dos espectros em relação às diferentes concentrações de Beva.
Exemplo 3: Estudo de liberação in vitro das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe
0078 Para realização deste estudo, as nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe em diferentes concentrações foram cortadas no tamanho de 5-10mm x 5-10mm e pesadas individualmente. Cada amostra foi adicionada a tubos plásticos contendo 1 -2 ml de PBS e mantidas em agitador do tipo Shaker em temperatura de 35-38QC e velocidade de 30-60 rpm durante 21 dias. As amostras foram coletadas inicialmente após 12 e 24 horas e, em seguida, a cada 48 horas até completarem 21 dias.
0079 Para quantificação do bevacizumabe liberado, foi utilizado o método de ELISA, desenvolvido exclusivamente para análise deste anticorpo empregando-se o anticorpo Anti-Human IgG-peroxidase como conjugado da técnica. A curva padrão foi desenvolvida para a faixa de concentração que variou de cerca de 1 ,5 mcg/ml a 0,02mcg/ml de bevacizumabe. A leitura foi realizada em leitor de microplacas no comprimento de onda de 492 nm.
0080 Os resultados mostraram que aproximadamente 60% do Beva incorporado foi liberado nas primeiras 12 horas do ensaio. O restante foi liberado de forma controlada até o final dos 21 dias de teste.
0081 Como já era esperado, a quantidade de fármaco liberada da nanofibra de PVA contendo 2% de Beva foi aproximadamente 50% daquela referente à nanofibra de PVA contendo 4% de Beva. Referente à nanofibra coaxial, os valores de Beva liberados são inferiores aos observados para a nanofibra de PVA, confirmando a hipótese que a casca de PCL/gelatina, por apresentar maior hidrofobicidade, reduz a taxa de liberação do fármaco concentrado no núcleo de PVA.
Exemplo 4: Avaliação da atividade antiangiogênica das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe em membrana corioalantóica (CAM) de ovos de galinha
0082 Esta avaliação foi realizada utilizando a membrana corioalantóica ("chorioallantoic membrane", CAM) de ovos de galinhas fertilizados. Para realização do teste, os ovos fertilizados foram incubados a temperatura e umidade controladas (37QC / 60% UR). No 3Q dia de incubação, uma abertura de cerca de 1 cm foi realizada na casca do ovo evidenciando a membrana interna da casca, que foi retirada cuidadosamente, expondo a membrana corioalantóica. No quinto dia, as amostras (nanofibras poliméricas de PCL/gelatina, PVA e coaxial contendo ou não bevacizumabe) foram aplicadas diretamente sobre a CAM e o ovo foi selado com uma fita adesiva transparente, retornando para a incubadora. Como controle negativo, os ovos receberam solução tampão fosfato (pH 7,4); e, como controle positivo foi aplicado um medicamento de ação conhecida (bevacizumabe livre). O aspecto da CAM foi avaliado no sétimo dia.
0083 Os resultados obtidos mostraram uma redução significativa (p <0,05) dos vasos no grupo com250μg do Bevacizumabe, como também das nanofibras de PVA contendo Beva 2% e 4% e Coaxial contendo Beva 2% e 4% em relação ao grupo controle negativo (PBS) (Figura 8). Não houve diferença significativa na resposta obtida entre as nanofibras de PVA contendo Beva 0,5% e 1 % e coaxial contendo Beva 0,5% e 1 % em relação ao controle (PBS).
Exemplo 5: Avaliação da citotoxicidade das preparações desenvolvidas no Exemplo 1 pelo método de redução do MTT
0084 O estudo de citotoxicidade foi realizado nas amostras de nanofibras poliméricas (tamanho 3-6mmx3-6mm) de PCL/gelatina, PVA e coaxial contendo ou não bevacizumabe e bevacizumabe em solução em diferentes concentrações (100, 178, 320, 560, 1000, 1780μg/mL). Foi utilizada a linhagem celular ARPE-19, que são células epiteliais pigmentadas da retina humana.
0085 As células ARPE-19 foram semeadas na densidade de 1 x 104 células/poço em placas de poliestireno de 96 poços na temperatura de 37°C e 5% de C02. Após 24 horas, as células foram incubadas com as amostras avaliadas em meio de cultura DMEM-F12 suplementados com 10% de soro fetal bovino (SFB). Células ARPE-19 em meio DMEM F12 foram usadas como controle negativo; meio DMEM F12, foi empregado como branco; e o meio DMEM F12 e ARPE-19 adicionado de DMSO foi utilizado como controle positivo.
0086 Após 24 horas, a viabilidade celular foi avaliada utilizado o método de MTT que se baseia na capacidade de enzimas desidrogenases, presentes nas mitocôndrias de células viáveis, em converter o sal de tetrazolio 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio bromide (MTT), solúvel em água, no cristal de formazan, produto insolúvel em água. A quantidade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de células viáveis. Para avaliação, o meio foi removido, assim como as nanofibras, e adicionou-se 85 μΙ_ de MTT (5 mg/ml_) e 105 uL de meio DMEM-F12 suplementado com SFB. Após 2 horas de incubação, os cristais de formazan precipitados foram solubilizados por adição de 55μΙ_ dodecilsulfato de sódio (SDS) contendo 10% de HCI. A densidade óptica foi medida a 595 nm usando um leitor de microplacas.
0087 Os dados foram expressos como percentagem de viabilidade celular em comparação com o controle (média ± desvio padrão). O controle positivo foi considerado com 100% de viabilidade celular e as amostras forma consideradas citotóxicas se menos de 50% de viabilidade celular fosse encontrado.
0088 Após 24 horas do ensaio, o grupo controle negativo e os grupos contendo a solução do Beva não apresentaram redução na viabilidade celular (Figura 9). As nanofibras de PCL, PVA, Coaxial e as nanofibras de PVA e Coaxial contendo Beva apresentaram pequena redução da viabilidade celular, mas sem efeito citotóxico significativo quando comparado ao controle negativo (p< 0,05).
0089 Em 72 horas (Figura 10) foi observada redução da viabilidade celular do grupo que recebeu a solução de Beva nas concentrações de 1000 e 1780μg/mL, mas sem efeito citotóxico significativo quando comparado ao controle negativo. As nanofibras não apresentaram redução da viabilidade celular quando comparadas ao grupo controle.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 Dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos caracterizado por conter nanofibras poliméricas de policaprolactona, gelatina e álcool polivinílico, e um inibidor de angiogênese.
2 O dispositivo, como descrito na reivindicação 1 , caracterizado pelo inibidor de angiogênese ser o bevacizumabe.
3 O dispositivo, como descrito na reivindicação 1 , caracterizado pelas nanofibras poliméricas serem coaxiais.
4 O dispositivo, como descrito nas reivindicações 1 e 3, caracterizado pela membrana das nanofibras ser composta de policaprolactona/gelatina e o núcleo das nanofibras ser composto de álcool polivinílico.
5 O dispositivo, como descrito nas reivindicações 1 a 4, caracterizado pelas nanofibras possuírem diâmetro entre 185 e 480 nm.
6 O dispositivo, como descrito nas reivindicações 1 a 5, caracterizado pela administração poder ser pelas vias ocular tópica ou intraocular.
7 Nanofibras poliméricas caracterizadas por conter policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese.
8 As nanofibras, como descrito na reivindicação 7, caracterizadas pelo inibidor de angiogênese ser o bevacizumabe.
9 As nanofibras, como descrito na reivindicação 7, caracterizadas por serem coaxiais.
10 As nanofibras, como descrito nas reivindicações 7 e 9, caracterizadas pela membrana ser composta de policaprolactona/gelatina e o núcleo ser composto de álcool polivinílico.
1 1 As nanofibras, como descrito nas reivindicações 7 a 10, caracterizadas por possuírem diâmetro entre 185 e 480 nm.
12 Processo de obtenção das nanofibras poliméricas, definidas nas reivindicações 7 a 1 1 , caracterizado por possuir as seguintes etapas:
a) Preparar, separadamente, soluções de PCL e gelatina 5-7% p/v em 2,2,2- trifluoroetanol (TFE); b) agitar as soluções durante 2-4 horas sob temperatura ambiente; c) misturar as duas soluções obtidas em "b" na proporção de 5-7 partes de PCL para 3-5 partes de gelatina, acrescentando-se, no final, 1 -2 ml de solução de aproximadamente 0,2% v/v de ácido acético em TFE;
d) preparar solução de PVA, na concentração de 14-16% p/v em água deionizada, mantendo a mesma na temperatura de 80-100Q C, durante 1 -3 horas;
e) adicionar o bevacizumabe à solução obtida em "d", na concentração de 0,5 a 4% p/p;
^transferir as soluções obtidas em "c" e em "f" para seringas de vidro, e acoplar as mesmas a um dispositivo coaxial;
g) proceder à eletrofiação coaxial.
13 O processo, de acordo com a reivindicação 12 etapa "g", caracterizado pelos parâmetros serem: diâmetros internos e externos da agulha de 0,5-1 ,0mm e 0,5-1 ,5 mm, respectivamente; vazão de 4,0-5,0 mL/h para a solução de PCL/gelatina e 1 ,0-2,0 mL/h para solução de PVA; voltagem aplicada de aproximadamente +25/0kV entre o dispositivo coaxial e o disco coletor; e distância entre o dispositivo e a ponta da agulha de 15,0-16,0 cm.
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