BR102017013337A2 - dispositivo de liberação ocular de fármacos, nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe e processo de obtenção - Google Patents

Abstract

a presente invenção diz respeito a um dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas coaxiais, compostas preferencialmente de policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese, capaz de tratar e controlar doenças oculares associadas à angiogênese. a invenção se refere ainda a nanofibras coaxiais contendo um inibidor de angiogênese e o seu processo de obtenção.

Description

DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO OCULAR DE FÁRMACOS, NANOFIBRAS POLIMÉRICAS CONTENDO BEVACIZUMABE E PROCESSO DE OBTENÇÃO

001 A presente invenção diz respeito a um dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas coaxiais, contendo preferencialmente policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese, capaz de tratar e controlar doenças oculares associadas à angiogênese. A invenção se refere ainda a nanofibras coaxiais contendo um inibidor de angiogênese e o seu processo de obtenção.

002 A angiogênese ocorre naturalmente no organismo durante o desenvolvimento embrionário e em resposta a cicatrização de ferimentos para a restauração do fluxo sangüíneo nos tecidos lesados. Em condições normais, o organismo é capaz de manter o equilíbrio entre os mediadores angiogênicos envolvidos. Nas situações onde o organismo perde a capacidade de modular a angiogênese, surgem as doenças relacionadas a essa perda (Polverini PJ. Angiogenesis in health and disease: insights into basic mechanisms and therapeutic opportunities, Journal of Dental Education, v. 66, p. 962-975, 2002; Tonini T, Rossi F, Claudio PP. Molecular basis of angiogenesis and cancer, Oncogene, v. 22, p. 6549-6565, 2003).

003 Enquanto várias doenças isquêmicas podem ser beneficiadas pela indução da angiogênese, em outras esse processo exerce um papel importante no desenvolvimento da patologia, como nas doenças inflamatórias crônicas, artrite reumatóide, retinopatia diabética proliferativa, psoríase, endometriose e adiposidades, além de ser crucial para o crescimento e metástase tumoral. A inibição desse processo então passou a ser uma importante estratégia terapêutica (Griffioen AW, Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the

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2/34 treatment of cancer, cardiovascular diseases and chronic inflammation. Pharmacological Reviews, v. 52, p. 237-268, 2000).

004 Esse complexo processo consiste na ativação das células endoteliais por fatores de crescimento, seguido da degradação enzimática da membrana basal, descolamento das células endoteliais das proteínas de adesão, migração das mesmas para o espaço perivascular e proliferação, e finalmente, a formação de novos vasos. Essas etapas são altamente reguladas por vários fatores de crescimento e citocinas, sendo o fator de crescimento endotelial (VEGF, do termo em inglês vascular endothelial growth factor), o fator de crescimento de fibroblastos (bFGF), o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 8 (IL-8) potentes mediadores angiogênicos (Folkman J, Shing Y. Angiogenesis, Journal of Biological Chemistry, v. 267, p. 1093110934, 1992).

005 O processo de neovascularização ocular se refere ao aparecimento e/ou à divisão anormal de células endoteliais, causando e contribuindo para estados patológicos (Lee P, Wang, CC, Adamis AP. Ocular neovascularization. An epidemiological review. Survey of ophthalmology, v. 43, n. 3, p. 245-269, 1998). A neovascularização, na maioria dos casos, provoca uma redução na visão e, caso não controlada corretamente pode levar à cegueira. Os novos vasos podem crescer próximo aos tecidos oculares e afetar a córnea, a íris, a retina e o nervo óptico.

006 Embora nenhum fator explique todas as causas de ocorrência de neovascularização ocular, muitos fatores contribuintes têm sido relatados, tais como a inflamação e seus mediadores moleculares, os fatores angiogênicos do tumor e um fator de hipóxia retiniano (Lee P, Wang CC, Adamis AP. Ocular neovascularization. An epidemiological review. Survey of ophthalmology, v. 43, n. 3, p. 245-269, 1998). O principal mecanismo relatado de formação de novos vasos pode ser

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3/34 resumido da seguinte forma: um estímulo inicial causador de hipóxia dos tecidos induz um efeito compensatório de produção de fatores de crescimento endoteliais, como o VEGF, pelos tecidos envolvidos levando ao surgimento de vasos anormais (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in retinal and eye research, v. 22, n. 1, p. 1-29, 2003). Os novos vasos formados são estruturalmente fracos, apresentam vazamento de fluidos e ausência de integridade estrutural, e resultam em hemorragia, exsudatos e fibrose, causando, geralmente, a cegueira.

007 A neovascularização ocular é associada a várias doenças, geralmente causadoras de perda severa da visão e até mesmo cegueira. Entre estas doenças, a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada à idade são as mais freqüentes (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in retinal and eye research, v. 22, n. 1, p. 1-29, 2003).

008 Um dos fatores pró-angiogênicos mais importantes já identificados é o VEGF, sendo considerado o principal mediador da angiogênese retiniana. É uma glicoproteína de 46kDa com atividades angiogênicas e de permebilidade vascular, sendo produzida no olho pelas células do epitélio pigmentado da retina. Este fator se liga com alta afinidade aos receptores de membrana com atividade tirosina quinase e sua expressão é induzida principalmente em condições de hipóxia (Shima DT, Adamis AP, Ferrara N, Yeo TK, Allende R. Hypoxic induction of endothelial cell growth factors in retinal cells: identification and characterization of vascular endothelial growth factor (VEGF) as the mitogen, Molecular Medicine, v. 1, p. 182-193, 1995; Das A, Mcguire PG. Retinal and choroidal angiogenesis:pathophysiology and strategies for inhibition. Progress in Retinal and Eye Research, v. 22, p.721-748, 2003). Além de

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4/34 ser um potente mitógeno de células endoteliais, possuir ação próinflamatória e neuroprotetora, o VEGF aumenta a expressão celular de metaloproteinases, degradando a matriz extracelular e facilitando a penetração dos neovasos no tecido, ao mesmo tempo em que diminui a expressão endotelial de inibidores de metaloproteinases (Damico FM. Angiogênese e doenças da retina. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, v. 70, p. 547-553, 2007).

009 A caracterização de diferentes processos envolvidos na patogênese da retinopatia diabética e da degeneração macular ligada à idade constitui um pré-requisito para o desenvolvimento de terapias para o tratamento e eventualmente prevenção da perda da visão e cegueira (Witmer NA, Vrensen GF, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in retinal and eye research, v. 22, p. 1-29, 2003). O VEGF é a proteína envolvida no início e progressão destas doenças e, juntamente com seus receptores, se tornam potenciais alvos para intervenção farmacológica (Griffioen AW, Molema G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases and chronic inflammation. Pharmacological Reviews, v. 52, p. 237-268, 2000). 0010 A dita formulação se refere à forma farmacêutica de filme de nanofibras contendo substância ativa com atividade anti-VEGF. A formulação é aplicável à administração pelas vias ocular tópica e/ou intraocular.

0011 As terapias anti-VEGF têm sido a opção de escolha para o tratamento de doenças oculares causadoras de angiogênese. Os fármacos inibidores de VEGF, tais como pegaptanibe sódico (Macugen®, EyeTech, EUA), ranibizumabe (Lucentis®, Genentech, EUA), bevacizumabe (Avastin®, Genentech, EUA) e aflibercepte (Eylia®, Bayer

S.A, Brasil) estão se tornando terapias bastante estabelecidas para o tratamento de neovascularização ocular e tem substituído as abordagens

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5/34 iniciais de tratamento como a fotocoagulação a laser e a terapia fotodinâmica (Falavarjani KG, Nguyen QD. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye, v. 27, p. 787-794, 2013; Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al. Therapies for neovascular age-related macular degeneration: current approaches and pharmacologic agents in development. BioMed Research International, 2013:830837, 2013). O bevacizumabe tem sido o mais utilizado mundialmente devido ao seu baixo custo e eficácia semelhante aos outros da mesma classe (Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al. Therapies for neovascular age-related macular degeneration: current approaches and pharmacologic agents in development. BioMed Research International, 2013:830837, 2013; Schmidt-Erfurth U, Chong V, Loewenstein A, Larsen M,Souied E, Schlingemann R, et al. Guidelines for the management of neovascular age-related macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA), British Journal of Ophthalmology, v. 98, p. 1144-1167, 2014).

0012 O bevacizumabe é um anticorpo monoclonal humanizado constituído por 214 aminoácidos e tem um massa molar de aproximadamente 149 kDa. Ele liga-se ao VEGF, inibindo desta forma sua ligação aos receptores presentes na superfície das células endoteliais, Flt-1 (VEGFR-1), KDR (VEGFR-2) e Flt-4 (VEGFR-3). A neutralização da atividade biológica do VEGF diminui a vascularização (Rodrigues EB, Farah ME, Maia M, Penha FM, Regatieri C, Melo GB, Pinheiro MM, Zanetti CR. Therapeutic monoclonal antibodies in ophthalmology, Progress in Retinal and Eye Research, v. 28, n. 2, p. 117144, 2009).

0013 Comercializado com o nome de Avastin^® (Genentech, São Francisco, CA, USA), o bevacizumabe foi aprovado pelo Food and Drug

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Administration (FDA) e European Medicines Agency (EMEA) e está registrado na ANVISA para o tratamento intravenoso de câncer colorretal metastático e outros tipos de câncer (Prasad OS, Schwartz SD, Hubschman JP. Age-related macular degeneration: Current novel therapies. Maturitas, v. 66, p. 46-50, 2010; Hanout M, Ferraz D, Ansari M, Maqsood N, Kherani S, Sepah YJ, et al. Therapies for neovascular agerelated macular degeneration: current approaches and pharmacologic agents in development, BioMed Research International, 2013:830837, 2013; Schmidt-Erfurth U, Chong V, Loewenstein A, Larsen M, Souied E, Schlingemann R, et al. Guidelines for the management of neovascular age-related macular degeneration by the European Society of Retina Specialists (EURETINA), British Journal of Ophthalmology, v. 98, p. 1144-1167, 2014). Além da sua aplicação no tratamento de vários tipos de câncer, devido ao seu efeito inibidor da angiogênese, o fármaco vem sendo utilizado frequentemente de forma off-label por meio de injeções intravítreas para tratamento de doenças oculares causadoras de angiogênese, com resultados satisfatórios (Krohne TU, Eter N, Holz FG, Meyer CH. Intraocular Pharmacokinetics of Bevacizumab After a Single Intravitreal Injection in Humans. American Journal of Ophthalmology, v. 146, p. 508-512, 2008; Conselho Brasileiro De Oftalmologia. Diretrizes em foco. Degeneração macular relacionada à idade. Revista da associação médica brasileira, v. 59, p. 106-111, 2013). O esquema de tratamento utilizando injeções intravítreas de bevacizumabe, geralmente requer a aplicação de cerca de 3 injeções, sendo uma por mês, no olho afetado. Após 30 dias, o paciente é reavaliado, podendo ou não necessitar de injeções subsequentes (Ministério da Saúde. ANVISA. Inibidores da angiogênese para o tratamento da degeneração macular relacionada à idade. BRATS - Boletim Brasileiro de Avaliação de Tecnologias em Saúde. Ano III; n° 6, 2008).

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0014 Embora os estudos clínicos tenham demonstrado a eficácia dos agentes anti-VEGF na melhora da acuidade visual, as injeções intravítreas frequentes, necessárias para o tratamento e controle da progressão das doenças, podem apresentar complicações oculares tais como endoftamite, inflamação intraocular, descolamento de retina, hemorragia ocular e efeitos adversos sistêmicos como eventos tromboembolíticos, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, hipertensão e doenças renais (Falavarjani KG, Nguyen QD. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of antiVEGF agents: a review of literature. Eye, v. 27, p. 787-794, 2013; Kaiser PK. Emerging therapies for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology, v. 120, p. S11-S15, 2013).

0015 Diante das desvantagens das injeções intravítreas, uma alternativa é o uso intraocular de sistemas de liberação prolongada de fármacos, capazes de manter níveis terapêuticos eficazes por longos períodos de tempo, minimizando a possibilidade de efeitos adversos.

0016 As formas farmacêuticas oftálmicas convencionais são relativamente simples: fármacos solúveis em água são formulados na forma de soluções e fármacos pouco solúveis em água são formuladas nas formas de suspensão ou pomada. Entretanto, essas formulações apresentam os inconvenientes de baixa biodisponibilidade corneal, exposição sistêmica devido à drenagem nasolacrimal e reduzida eficácia no segmento posterior do olho (Behar-Cohen F. Drug delivery systems to target the anterior segment of the eye: fundamental bases and clinical applications. Journal Français dOphthalmologie, v. 25, p. 537-544, 2002; Bourges JL, Bloquel C, Thomas A, Froussart F, Bochot A, Azan F, et al. Intra-ocular implants for extended drug delivery: Therapeutic applications. Advanced drug delivery reviews, v. 58, p. 1182-1202, 2006.; Bourges JL, Touchard E, Kowalczuk L, Berdugo-Polak M, Thomas-Doyle A, Bochot A, et al. Dispositifs de délivrance de principes actifs pour des applications

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8/34 ophtalmologiques. Journal Français dOphthalmologie, v. 30, p. 10701088, 2007.)

0017 O tratamento de doenças oculares no vítreo e na retina tem sido um problema devido à dificuldade de acesso a essas estruturas. A administração ocular na forma de colírios, embora seja o método mais empregado, resulta em concentrações mais elevadas nos tecidos anteriores (córnea, conjuntiva, esclera, humor aquoso e corpo ciliar) e apresenta efeito terapêutico mínimo na região posterior do olho (lente, vítreo e retina), que, geralmente, é mantido com aplicações frequentes da formulação. A administração direta no espaço subconjuntival apresenta algumas vantagens sobre a terapia tópica para o tratamento de doenças do segmento anterior do olho, mas não proporciona concentração efetiva do fármaco no segmento posterior. A via sistêmica pode ser utilizada com essa finalidade, mas se observa baixa penetração no olho em virtude da existência da barreira hematorretiniana, que dificulta a entrada de substâncias da circulação sanguínea para a retina. Para que se obtenha uma concentração do fármaco dentro da faixa terapêutica utilizando essa via, é necessária a administração de concentrações elevadas durante um período prolongado, podendo ocasionar sérios efeitos adversos sistêmicos (Martin DF, Parks DJ, Mellow SD, Ferris FL, Walton RC, Remaley NA, et al. Treatment of cytomegalovirus retinitis with an intra-ocular sustained-release ganciclovir implant. A randomized controlled clinical trial. Archives of Ophthalmology, v. 112, p. 1531-1539, 1994.; Kunou N, Ogura Y, Hashizoe M, Honda Y, Hyon S, Ikada Y. Controlled intraocular delivery of ganciclovir with use of biodegradable scleral implant in rabbits. Journal of Controlled Release, v. 37, p. 143-150, 1995; Kunou N, Ogura Y, Yasukawa T, Kimura H, Miyamoto H, Honda Y, et al. Long-term sustained release of ganciclovir from biodegradable scleral implant for the treatment of cytomegalovirus retinitis. Journal of Controlled Release, v. 68, p. 263-271, 2000.; Kimura

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H, Ogura Y. Biodegradable polymers for ocular drug delivery. Ophthalmology, v. 215(3), p. 143-155, 2001; Kuppermann BD, Blumenkranz MS, Haller JA, Williams GA, Weinberg DV, Chou C, et al. Randomized Controlled Study of an Intravitreous Dexamethasone Drug Delivery System in Patients With Persistent Macular Edema. Archives of Ophthalmology, v. 25, p. 309-317, 2007; Lajavardi L, Bochot A, Camelo S, Goldenberg B, Naud M. C.; Behar-Cohen F. Downregulation of endotoxininduced uveitis by intravitreal injection of vasoactive intestinal Peptide encapsulated in liposomes. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, v. 48, p. 3230-3238, 2007.)

0018 A injeção intravítrea é uma alternativa para a obtenção da concentração adequada de fármacos no vítreo e na retina. Essa via era restrita ao tratamento de endoftalmite, mas, atualmente, ela tem sido utilizada para tratamento de casos de vitreorretinopatia proliferativa, retinite viral e uveíte. Entretanto, a rápida circulação sanguínea no local resulta em uma reduzida meia-vida dos fármacos administrados, dessa forma, a concentração chega, rapidamente, a níveis sub-terapêuticos. Para que os níveis se mantenham dentro da faixa terapêutica, são necessárias, então, injeções repetidas, as quais podem causar desconforto para o paciente, além de ocasionar complicações oculares (Peyman G.A, Ganiban G.J. Delivery systems for intraocular routes. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 16, p. 107-123, 1995.; Okabe J, Kimura H, Kunou N, Okabe K, Kato A, Ogura Y. Biodegradable intrascleral implant for sustained intraocular delivery of betamethasone phosphate. Investigative ophthalmology and visual science, v. 44, p. 740744, 2003; Nair L. S, Laurencin C. T. Biodegradable polymers as biomaterials. Progress in Polymer Science, v. 32, p. 762-798, 2007).

0019 Por causa das razões acima descritas, diversos estudos têm sido realizados visando o desenvolvimento de sistemas que sejam capazes de manter a concentração dos fármacos no segmento posterior

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10/34 do olho, dentro da faixa terapêutica, por um período mais prolongado. Esses sistemas devem ser biocompatíveis com o organismo e, portanto, os componentes nele presentes devem ser não carcinogênicos, hipoalergênicos, e não causadores de resposta inflamatória no local de aplicação. Eles podem ser preparados a partir de polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Sistemas compostos por polímeros não biodegradáveis, embora apresentem uma taxa de liberação relativamente constante, precisam ser removidos posteriormente, o que requer processos cirúrgicos. Já os biodegradáveis são totalmente absorvidos pelo organismo, não necessitando remoção subsequente, e proporcionando melhor adesão e aceitação do paciente ao tratamento. Polímeros biodegradáveis sintéticos, representados por poliamidas, poliaminoácidos, polialquilcianacrilatos, poliésteres, poli (ortoésteres), poliuretanos e poliacrilamidas têm apresentado crescente interesse na aplicação como sistemas de liberação de fármacos (Einmahl S, Ponsart S, Bejjani RA, D'Hermies F, Savoldelli M, Heller J, et al. Ocular biocompatibility of a poly (ortho ester) characterized by autocatalyzed degradation. Journal of biomaterials research, v. 67, p. 4453, 2003.; Herrero-Vanrell R, Refojo MF. Biodegradable microspheres for vitreoretinal drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 52, p. 516, 2001; Einmahl S, Savoldelli M, D'Hermies F, Tabatabay C, Gurny R, Behan-Cohen F. Evaluation of a Novel Biomaterial in the Suprachoroidal Space of the Rabbit Eye, Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, v. 43, p. 1533-1539, 2002; Fialho SL, Rego MGB, Cardillo JA, Siqueira RC, Jorge R, Cunha-Junior AS. Implantes biodegradáveis destinados à administração intra-ocular. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, v. 66, p. 891-896, 2003.).

0020 Alguns estudos são descritos na literatura com relação à aplicação intravítrea de sistemas de liberação prolongada de bevacizumabe.

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0021 Abrishami e colaboradores desenvolveram lipossomas contendo bevacizumabe pelo método de desidratação-reidratação (Abrisham M, Zarei-Ghanavati S, Soroush D, Rouhbakhsh M, Jaafari M.R, Malaekeh-Nikouei B. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina, v. 29, p. 699-703, 2009). A formulação foi aplicada por injeção intravítrea em olhos de coelhos e comparada a uma solução do mesmo anticorpo. A concentração de bevacizumabe livre nos olhos dos animais que receberam a formulação de lipossomas foi 1 e 5 vezes superior a solução do anticorpo nos tempos de 28 e 42 dias, respectivamente.

0022 Nanopartículas de PLA revestidas de bevacizumabe foram encapsuladas em micropartículas porosas de PLGA por infusão supercrítica e pressão (Yandrapu SK, Upadhyay AK, Petrash JM, Kompella UB. Nanoparticles in porous microparticles prepared by supercritical infusion and pressure quench technology for sustained delivery of bevacizumab. Molecular Pharmacology, v. 10, p. 4676-4686, 2013.). O estudo de liberação in vitro, mostrou uma liberação do bevacizumabe por um período de 4 meses, sem alteração da estrutura e atividade do anticorpo. O bevacizumabe foi detectado in vivo durante 2 meses após aplicação intravítrea em ratos.

0023 Em um trabalho realizado por Hu e colaboradores, foi desenvolvido um hidrogel termosensível utilizando copolímeros em bloco (Hu CC, Chaw JR, Chen CF, Liu HW. Controlled release bevacizumab in thermoresponsive hydrogel found to inhibit angiogenesis. Biomedical Materials Enginnering, v. 24, p. 1941-1950, 2014). Após um mês de aplicação intravítrea do sistema não foi observada nenhuma alteração na retina dos coelhos. Em cultura de células, a atividade do bevacizumabe incorporado no hidrogel foi mantida durante todo o período do estudo de liberação.

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0024 O perfil de liberação in vivo do bevacizumabe incorporado em uma formulação de hidrogel também foi estudado por Rauck e colaboradores (Rauck BM, Friberg TR, Medina Mendez CA, Park D, Shah V, Bilonick RA, et al. Biocompatible reverse thermal gel sustains the release of intravitreal bevacizumab in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science, v. 55, p. 469-476, 2014.). A formulação foi aplicada por injeção intravítrea e foi bem tolerada em olhos de coelhos. O hidrogel foi capaz de promover a liberação do bevacizumabe por um período de 9 semanas e a concentração do fármaco foi mantida 4,7 vezes superior à concentração dos olhos que receberam apenas injeção de solução de bevacizumabe.

0025 Um sistema polimérico de poliuretano biodegradável contendo bevacizumabe foi desenvolvido por Ferreira e colaboradores, sendo a atividade antiangiogênica do anticorpo monoclonal estudada em modelo de neovascularização da córnea. O bevacizumabe liberado a partir do sistema foi capaz de promover a redução do número de vasos na córnea e a expressão do VEGF, sem causar toxicidade para os tecidos (Ferreira ERA, Castro BFM, Vieira LC, Cassali GD, Souza CM, Fulgêncio GO, Ayres E, Oréfice RL, Jorge R, Fialho SL, Silva-Cunha A. Antiangiogenic activity of a bevacizumab-loaded polyurethane device in animal neovascularization models. Journal Francais D'Ophtalmologie, p. 202208, 2017.).

0026 Nanofibras ou nanofios poliméricos são de grande interesse em função das propriedades associadas a estes materiais, bem como do grande número de possíveis aplicações (Chronakis IS. Novel nanocomposites and nanoceramics based on polymer nanofibers using electrospinning process—A review. Journal of Materials Processing Technology, v. 167, p. 283-293, 2005.; Chew SY, Wen Y, DzenisY, Leong KW. The Role of Electrospinning in the Emerging Field of Nanomedicine. Current Pharmaceutical Des, v. 12, p. 4751-4770, 2006),

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13/34 como por exemplo nas áreas de eletrônica, física, química, medicina, biologia e engenharia de materiais.

0027 Polímeros em nanofilamentos e multifilamentos contínuos podem ser formados a partir de técnicas como a fiacão a seco (dry spinning), fiação úmida (wet spinnng), fiação via gel (gel spinning) e fiação do fundido (melt spinning) (Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Composites Science and Technology, v.63, p. 2223-2253, 2003.; Sato JAP. Fabricação e Caracterização de Sistemas Poliméricos Nanoestruturados Obtidos por Meio do Uso da Técnica De Eletrofiação. Santo André: Universidade Federal do ABC, 2011. 109p. (Dissertação, Mestrado em Nanociências e Materiais Avançados). Com essas técnicas as fibras obtidas possuem uma variação média em diâmetro entre 10 a 500 pm (Park JS, Park JW, Ruckenstein E. Thermal and dynamic mechanical analysis of PVA/MC blend hydrogels. Polymer, v.42, p. 4271-4280, 2001.; Sato JAP. Fabricação e Caracterização de Sistemas Poliméricos Nanoestruturados Obtidos por Meio do Uso da Técnica De Eletrofiação. Santo André: Universidade Federal do ABC, 2011. 109p. (Dissertação, Mestrado em Nanociências e Materiais Avançados). Por outro lado, para produzir fibras com diâmetros médios muito menores é utilizado a técnica de eletrofiação ou fiação eletrostática (electrospinning). A eletrofiação permite a obtenção de um diâmetro médio das fibras das malhas, ou mantas ou membranas poliméricas variando entre 10nm a 10pm (Eichhorn SJ, Sampson WW. Sampson Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royal Society Interface, v.2, p. 309-318, 2005).

0028 Utilizando a técnica de eletrofiação, nanofibras poliméricas são produzidas como resultado de forças elétricas repulsivas que superam a tensão superficial do líquido polimérico carregado. Basicamente, o

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14/34 sistema de eletrofiação consiste em três partes: um gerador de alta tensão, uma seringa contendo a solução polimérica e um coletor (Bhardwaj N, Kundu SC. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnology Advances, v.28, p325-347, 2010). Quando a intensidade do campo elétrico é aumentada, as cargas induzidas na superfície do líquido se repelem criando uma instabilidade. Estas forças repulsivas agem em direção oposta à da tensão superficial, que resulta na extensão da gota na ponta da agulha em uma forma cônica (Cone de Taylor) (Baji A, Mai YW, Wong SC, Abtahi M, Chen P. Electrospinning of polymer nanofibers: Effects on oriented morphology, structures and tensile properties. Composite Science Technology, v. 70, p. 703-18, 2010). Quando estas forças repulsivas superam a tensão superficial do líquido, esta gota se alonga e se transforma em um jato estável que vai em direção ao coletor de carga oposta. Neste trajeto do jato, o solvente da solução evapora e fibras são formadas no coletor. Parâmetros da solução (viscosidade, condutividade, tensão superficial, massa molar do polímero e constante dielétrica), do processamento (campo elétrico, distância agulha-coletor e taxa de infusão) e do ambiente (umidade e temperatura) influenciam e direcionam o processo de eletrofiação (Chakrapani VY, Gnanamani A, Giridev VR, Madhusoothanan M, Sekaran G. Electrospinning of Type I collagen and PCL nanofibers using acetic acid. Journal of Applied Polymer Science, v. 125, p. 3221-3227, 2012).

0029 Nanofibras produzidas a partir do processo de eletrofiação apresentam vantagens, tais como alta área superfícial, flexibilidade para uma grande variedade de formas e tamanhos e a capacidade de controlar a composição de nanofibras para alcançar os resultados desejados a partir de suas propriedades e funcionalidades (Huang ZM, Zhang YZ, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Composites

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Science and Technology, v.63, p. 2223-2253, 2003; Bhardwaj N, Kundu SC. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnology Advances, v.28, p325-347, 2010; Kulkarni A, Bambole VA, Mahanwar PA. Electrospinning of Polymers, Their Modeling and Applications. Polymer-Plastics Technology and Engineering, v. 49, p. 427-441, 2010; Garg K, Bowlin GL. Electrospinning jets and nanofibrous structures. Biomicrofluidics, 013403-1, 2011).

0030 Estudos anteriores demonstraram que utilizando a eletrofiação direta da suspensão de partículas hidrossolúveis na solução polimérica resulta em uma liberação imediata (burst release) de elevada concentração do fármaco, que pode causar sérios efeitos adversos. Por exemplo, em um estudo desenvolvido por Luu e colaboradores, mais de 60% do DNA incorporado em nanofibras de PLGA foi liberado em 2 horas (Luu YK, Kim K, Hsiao BS, CHU B, Hadjiargyrou M. Development of a nanostructured DNA delivery scaffold via electrospinning of PLGA and PLA-PEG block copolymers. Journal of Controlled Release, v. 89, p. 341-353, 2003). Por outro lado, o contato de substâncias ativas biológicas com solventes orgânicos resulta em grande possibilidade de desnaturação das proteínas e consequente perda de sua atividade (Jiang H, Wang L, Zhu K. Coaxial electrospinning for encapsulation and controlled release of fragile water-soluble bioactive agents. Journal of Controlled Release, v. 193, p. 296-303, 2014).

0031 Desta forma, recentemente, foi desenvolvida a técnica de eletrofiação coaxial, que utiliza dois capilares concentricamente alinhados e que permitem a formação de fibras em estrutura membrananúcleo (Zhao P, Jiang H, Pan H, Zhu K, Chen W. Biodegradable fibrous scaffolds composed of gelatin coated poly (ε-caprolactone) prepared by coaxial electrospinning. Journal of Biomedical Materials Research, v. 83, p. 372-382, 2007). O principal objetivo de utilização desta técnica em sistemas de liberação de fármacos é contornar as limitações da

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16/34 eletrofiação direta no que se refere ao encapsulamento de substâncias bioativas frágeis e hidrossolúveis, e também de promover uma liberação mais prolongada da substância e permitir o encapsulamento de múltiplas substâncias com diferentes características de solubilidade. Esta técnica é interessante não só no desenvolvimento de nanofibras multifuncionais, mas também de matrizes com diferentes taxas de degradação em diferentes períodos de uso no organismo. A performance mecânica de nanofibras, com específicas concentrações de polímeros no núcleo e na membrana, produzidas por tal processo, geralmente é melhor do que aquelas produzidas somente com um polímero (Huang Z.M, Zhang YZ, Ramakrishna S. Double-layered composite nanofibers and their mechanical performance. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics, v. 43, p. 2852-2861, 2005). Esta técnica também é estudada para a produção de nanofibras com liberação controlada de fármacos, onde o polímero da membrana impede a liberação inicial acelerada do fármaco encapsulado no núcleo (Meinel AJ, Germershaus O, Luhmann T, Merkle H, Meinel L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current Technologies and selected biomedical applications. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 81, p. 1-13, 2012). Utilizando esta técnica, estudos anteriores demonstraram uma eficiência de encapsulamento de proteínas em nanofibras poliméricas próxima de 100% (Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics, v. 185, p. 129188, 1999).

0032 Nanofibras biocompatíveis e biodegradáveis são produzidas utilizando polímeros sintéticos e naturais (Li X, Xie J, Lipner J, Yuan X, Thomopoulos S, Xia Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Letters, v. 9, p. 2763-2768, 2009). Para sua utilização, é importante que as mesmas possuam resistência e rigidez suficientes para aplicação no organismo. A

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17/34 combinação das vantagens da poli-e-caprolactona (PCL), como a resistência mecânica, com a bioatividade da gelatina pode ser uma alternativa para eletrofiação coaxial. (Baji A, Mai YW, Wong SC, Abtahi M, Chen P. Electrospinning of polymer nanofibers: Effects on oriented morphology, structures and tensile properties. Composite Science Technology, v. 70, p. 703-18, 2010).

0033 A presente tecnologia trata de um dispositivo para liberação ocular de bevacizumabe composto por nanofibras poliméricas e bevacizumabe. Até o momento nenhuma formulação contendo bevacizumabe incorporado em nanofibra polimérica encontra-se disponível no mercado ou relatado no estado da técnica (BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em:

<http://www7.anvisa.gov.br/datavisa/consulta_produto/Medicamentos/frm ConsultaMedicamentosPersistir.asp> Acesso em: mar. 2017).

0034 A Tabela 1 relaciona alguns estudos de nanofibras poliméricas utilizando a técnica de eletrofiação coaxial para liberação prolongada de proteínas.

Tabela 1 - Estudos relacionados ao desenvolvimento de nanofibras poliméricas para liberação prolongada de proteínas.

Autores		Polímero (núcleo/membrana)	Proteína	Aplicação
ZHU et al.	, 2013	BMP-PEG/PCL	BMP	Regeneração tecido	de
ZHANG 2013	et al.,	VEGFquitosana/PLA-b- PEG	VEGF ou PDGF	Vaso sanguíneo
JIN et al.,	2013	EIF e BSA/ PLA e gelatina	EIF	Regeneração pele	da

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JIA et al., 2011	VEGF, BSA, heparina e dextrano/PLGA	VEGF	Engenharia de tecido vascular
LIAO et al., 2011	VEGF e PDGF/PU	VEGF, PDGF	Hemofilia
LI et al., 2010	PDGF, dextrano e BSA/ PLA	PDGF	Células músculo liso
SAHOO et al., 2010	bFGF-BSA/PLGA	bFGF	Célula tronco de medula óssea
LIAO et al., 2006	PDGF/PCL-PEG	PDGF	-
ZHANG et al., 2006	BSA-PEG/PCL	BSA	-
JIANG et al., 2006	BSA-PEG/PCL-PEG	BSA lisozima	ou

BMP - proteína óssea; PEG - polietilenoglicol; PCL - poli-e-caprolactona; VEGF - fator de crescimento endotelial vascular; PLA-b-PEG - poliláticob-polietilenoglicol; EIF - fator de indução epidermal; BSA - albumina bovina sérica; PLA - polilático; PLGA - poli-lático-co-glicólico; PDGF fator de crescimento plaquetário; PU - poliuretano; bFGF - fator de crescimento de fibroblasto. (Zhu HY, Yu D, Zhou Y, Wang MF, Gao MF, Jiang HL, et al. Biological activity of a nanofibrous barrier membrane containing bone morphogenetic protein formed by core-shell electrospinning as a sustained delivery vehicle. Journal of Biomedical Materials Research B Applications in Biomaterials, v. 101B, p. 541-552, 2013.; Zhang H, Jia XL, Han FX, Zhao J, Zhao YH, Fan YB, et al. Dualdelivery of VEGF and PDGF by double-layered electrospun membranes for blood vessel regeneration. Biomaterials, v. 34, p. 2202-2212, 2013.; Jin GR, Prabhakaran MP, Kai D, Ramakrishna S. Controlled release of multiple epidermal induction factors through core-shell nanofibers for skin

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19/34 regeneration, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 85, p. 689-698, 2013.; Jia XL, Zhao CG, LI P, Zhang H, Huang Y, Li H, et al. , Sustained release of VEGF by coaxial electrospun dextran/PLGA fibrous membranes in vascular tissue engineering. Journal of Biomaterials Sciences, v. 22, p. 1811-1827, 2011,; Liao IC, Leong KW. Efficacy of engineered FVIII-producing skeletal muscle enhanced by growth factor-releasing co-axial electrospun fibers. Biomaterials, v. 32, p. 1669-1677, 2011., Li H, Zhao CG, Wang ZX, Zhang H, Yuan XY, Kong DL. Controlled release of PDGF-bb by coaxial electrospun dextran/poly(llactide-co-e-caprolactone) fibers with an ultrafine core/shell structure. Journal of Biomaterials Science Polymers, ed. 21, p. 803-819, 2010.; Sahoo S, Ang LT, Goh JCH, Toh S.L. Growth factor delivery through electrospun nanofibers in scaffolds for tissue engineering applications. Journal of Biomedical Materials Research A, v. 93A, p. 1539-1550, 2010; Liao IC, Chew SY, Leong KW. Aligned core-shell nanofibers delivering bioactive proteins. Nanomedicine, v. 1, p. 465-471, 2006.; Zhang YZ, Wang X, Feng Y, Li J, Lim CT, Ramakrishna S. Coaxial electrospinning of (fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin)encapsulated poly(L-caprolactone) nanofibers for sustained release. Biomacromolecules , v. 7, p. 1049-1057, 2006; Jiang HL, Hu YQ, Zhao PC, Li Y, Zhu K.J. Modulation of protein release from biodegradable core-shell structured fibers prepared by coaxial electrospinning. Journal of Biomedical Materials Research B Applications in Biomaterials, v. 79B, p. 50-57, 2006)

0035 Nanofibras de PCL e gelatina foram desenvolvidas e caracterizadas pela técnica de eletrofiação coaxial e os estudos in vitro revelaram a biocompatibilidade destas nanofibras com grande proliferação de células-tronco, assim como indícios de diferenciação destas em osteoblastos, tornando este biomaterial uma potencial alternativa para uso na engenharia de tecido ósseo (Pereira IHL, Ayres

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E, Averous L, Schlatter G, Hebraud A, Mendes STO L, Oréfice RL. Elaboration and Characterization of Coaxial Electrospun Poly(sCaprolactone)/Gelatin Nanofibers for Biomedical Applications. Advances in Polymer Technology, v. 33, 2014).

0036 Existem algumas patentes depositadas referentes ao preparo e uso de nanofibras poliméricas, porém as mesmas não se tratam de sistemas de liberação modificada de fármacos para uso ocular, especificamente em doenças causadoras de angiogênese.

0037 Por exemplo, a patente US20100055154A1 intitulada “Fibras de eletrofiação coaxial e estruturas e métodos de formação das mesmas” descreve nanofibras e microfibras que apresentam um núcleo recoberto por uma parede polimérica (Liao I-C, Leong KW, Chew S-Y. Coaxial electrospun fibers and structures and methods of forming the same. United States Patent Application Publication US20100055154A1; 04 mar. 2010). O núcleo é composto de canais que ligam a superfície da parede polimérica ao núcleo e também por uma ou mais substâncias que podem ser fármacos, proteínas, vírus, plasmídeos DNA, células bacterianas e nanopartículas com fármaco encapsulado.

0038 A patente US20140227340A1 intitulada “Fibras contendo drogas pouco solúveis e/ou proteínas” descreve fibras obtidas por eletrofiação que apresentam estrutura casca-núcleo que contem drogas pouco solúveis e/ou proteínas (Freyman T, Pham Q, Mulligan RF, Picard NA, Yan X. Fibers Comprising Poorly Soluble Drugs and/or Proteins. United States Patent Application Publication US20140227340A1; 14 ago. 2014).

0039 A patente US20160038611A1 intitulada “Nanofibra e composições bioativas e métodos relacionados” descreve uma composição em nanofibra contendo uma ou mais substância bioativa, que quando exposta à umidade, as nanofibras dissolvem liberando a substância bioativa incorporada. (Vile GF, Hosie IC, Feasey SV.

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Nanofibre and bioactive compositions and related methods. United States Patent Application Publication US20160038611A1; 11 fev. 2016).

0040 A patente US 9,375,516 intitulada “Suporte de nanofibra polimérica para liberação de fator de crescimento baseado em heparina/fibrina” descreve um suporte de transporte de fator de crescimento que combina um sistema de liberação baseado em heparina/fibrina com a cadeia composta por nanofibras poliméricas para regeneração de tecido (Thomopoulos S, Sakiyama-Elbert S, Silva M, Gelberman R, Xia Y, Schwartz A, Xie J. Polymer nanofiber scaffold for a heparin/fibrin based growth factor delivery system. United States Patent Application Publication US 9,375,516; 28 jun. 2016). O suporte pode transportar fatores de crescimento de maneira controlada, pode ser implantado, é biocompatível, não citotóxico e pode ser empregado em cirurgias para reparo de ossos, músculos, cartilagem e outros tecidos.

0041 Não foi encontrado no estado da técnica, dispositivos de liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe para aplicação em doenças oculares causadoras de angiogênese.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

0042 Na Figura 1 estão apresentadas imagens de microscopia eletrônica de varredura das nanofibras contendo PCL/gelatina (a); PCL.gelatina.Beva 1% (b); PVA (c); PVA.Beva 1% (d); Coaxial (e); Coaxial.Beva 1% (f).

0043 Na Figura 2 estão apresentadas imagens de microscopia eletrônica de transmissão da estrutura de nanofibras Coaxial contendo CuSO4 visualizadas no aumento 10.000x (A) e no aumento de 200.000x (B).

0044 A Figura 3 é uma imagem da nanofibra coaxial obtida por microscopia confocal, contendo isotiocianato de fluoresceína.

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0045 Na Figura 4 estão demonstrados os gráficos de TG e DTG das nanofibras de PCL/gelatina (A), de PVA (B) e coaxial (C). Os dados foram obtidos realizando as análises sob atmosfera de nitrogênio com fluxo de 30 ml/min e taxa de aquecimento de 20°C/min.

0046 A Figura 5 apresenta as curvas DSC obtidas para o 1° aquecimento para as nanofibras de PCL (a), (b) PVA e (c) coaxial.

0047 A Figura 6 representa uma comparação dos espectros de FTIR-ATR obtidos das nanofibras coaxial antes de serem lavadas com TFE, após serem lavadas e as nanofibras de PVA que foram utilizadas como controle.

0048 A Figura 7 representa uma comparação dos espectros de FTIR-ATR obtidos das nanofibras coaxial antes de serem lavadas com DMSO, após serem lavadas e as nanofibras de PCL que foram utilizadas como controle.

0049 A Figura 8 é um gráfico que mostra o percentual de vasos na membrana corioalantóica (CAM) após aplicação das amostras. Os resultados foram comparados ao grupo controle que recebeu PBS.

0050 A Figura 9 é um gráfico que representa o percentual de viabilidade de células ARPE-19 após 24 horas de aplicação das amostras, utilizando o ensaio de MTT.

0051 A Figura 10 é um gráfico que representa o percentual de viabilidade de células ARPE-19 após 72 horas de aplicação das amostras, utilizando o ensaio de MTT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

0052 A presente invenção diz respeito a um dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos composto por nanofibras poliméricas coaxiais, contendo preferencialmente policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese, capaz de tratar e controlar doenças oculares associadas à angiogênese. A invenção se refere ainda

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23/34 a nanofibras coaxiais contendo um inibidor de angiogênese e o seu processo de obtenção.

0053 As nanofibras poliméricas da presente invenção são caracterizas por conter policaprolactona, gelatina e álcool polivinílico, e um inibidor de angiogênese, sendo o inibidor de angiogênese, preferencialmente, o bevacizumabe. As nanofibras são preferencialmente coaxiais e contém membrana composta, preferencialmente, de policaprolactona/gelatina e o núcleo composto, preferencialmente, de álcool polivinílico. O diâmetro das nanofibras é preferencialmente entre 185 e 480 nm.

0054 O dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos da presente invenção é caracterizado por conter as nanofibras descritas acima e sua administração pode ser pelas vias ocular tópica ou intraocular.

0055 Processo de obtenção das nanofibras poliméricas descritas acima contém as seguintes etapas:

a) Preparar, separadamente, soluções de PCL e gelatina 5-7% p/v em 2,2,2- trifluoroetanol (TFE);

b) agitar as soluções durante 2-4 horas sob temperatura ambiente;

c) misturar as duas soluções obtidas em “b” na proporção de 5-7 partes de PCL para 3-5 partes de gelatina, acrescentando-se, no final, 1-2 ml de solução de aproximadamente 0,2% v/v de ácido acético em TFE;

d) preparar solução de PVA, na concentração de 14-16% p/v em água deionizada, mantendo a mesma na temperatura de 80-100° C, durante 1-3 horas;

e) adicionar o bevacizumabe à solução obtida em “d”, na concentração de 0,5 a 4% p/p;

f) transferir as soluções obtidas em “c” e em “f” para seringas de vidro, e acoplar as mesmas a um dispositivo coaxial;

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g) proceder à eletrofiação coaxial.

0056 Na etapa “g” do processo acima, os parâmetros do processo são, preferencialmente: diâmetros internos e externos da agulha de 0,51,0 mm e 0,5-1,5 mm, respectivamente. A vazão de 4,0-5,0 mL/h para a solução de PCL/gelatina e 1,0-2,0 mL/h para solução de PVA. A voltagem aplicada de aproximadamente +25/0kV entre o dispositivo coaxial e o disco coletor. O dispositivo coletor foi posicionado a uma distância de 15,0-16,0 cm da ponta da agulha.

0057 A presente invenção é adicionalmente descrita nos seguintes exemplos, não limitantes.

Exemplo 1: Preparo das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe

0058 A composição farmacêutica da formulação descrita na presente invenção é composta pelo anticorpo monoclonal bevacizumabe (Beva) podendo ser utilizados outros fármacos, sintéticos ou não, e de diferentes classes, com possibilidade de atividade em doenças oculares. Como componente polimérico, foi empregada a poli-caprolactona (PCL), a gelatina e o álcool polivinílico (PVA) 98-99% hidrolisado. A técnica de eletrofiação coaxial foi empregada para o preparo das nanofibras poliméricas.

0059 Inicialmente, foram preparadas as soluções de PCL e gelatina separadamente. Cada polímero, na concentração de 5-7% p/v, foi pesado e solubilizado em 2,2,2- trifluoroetanol (TFE) com auxílio de um agitador magnético durante 2-4 horas sob temperatura ambiente. Em seguida, as duas soluções obtidas foram misturadas na proporção de aproximadamente 60:40 de PCL e gelatina, respectivamente, acrescentando-se, no final, 1-2 ml de solução de aproximadamente 0,2%v/v de ácido acético em TFE. A solução de PVA, na concentração

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25/34 de 14-16% p/v, foi preparada dissolvendo o polímero em água deionizada na temperatura de 80-100° C, durante 1-3 horas.

0060 O bevacizumabe foi adicionado à solução de PVA em temperatura ambiente nas concentrações, em porcentagem p/p, de 0,5% a 4% em massa de bevacizumabe em PVA.

0061 Para o preparo das nanofibras, as soluções preparadas contendo PCL/gelatina (membrana) e PVA (núcleo) foram transferidas para seringas de vidro, as quais foram acopladas a um dispositivo coaxial. Para ejeção das soluções foram empregadas agulhas com diâmetros internos e externos de 0,5-1,0mm e 0,5-1,5 mm. A vazão foi de 4,0-5,0 mL/h para a solução de PCL/gelatina e 1,0-2,0 mL/h para solução de PVA. A voltagem aplicada foi de aproximadamente +25/0kV entre o dispositivo coaxial e o disco coletor. O dispositivo foi posicionado a uma distância de 15,0-16,0cm da ponta da agulha. Foram preparadas nanofibras brancas, sem o fármaco e também nanofibras core-shell para cada concentração de bevacizumabe descrita no preparo das soluções.

Exemplo 2: Caracterização das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe

0062 As nanofibras poliméricas de PCL/gelatina, PVA e coaxial contendo ou não bevacizumabe foram caracterizadas por meio de diferentes técnicas, as quais estarão descritas a seguir:

0063 a) microscopia eletrônica de varredura: para obtenção das imagens, as nanofibras poliméricas foram inicialmente cortadas no tamanho de 1-2 cm x 1-2 cm. Em seguida, foram metalizadas com ouro e analisadas utilizando microscópio eletrônico de varredura na voltagem de aproximadamente 15 kV. O diâmetro das nanofibras foi determinado utilizando o software Image J pela medida de 100 fibras de cada uma das imagens obtidas.

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0064 As fibras de PCL/gelatina, PVA e coaxial apresentaram diâmetros na faixa de 195nm, 473nm e 190nm, respectivamente (Figura 1). A presença do bevacizumabe nas diferentes concentrações nas nanofibras não alterou significativamente os diâmetros das mesmas (Tabela 1).

Tabela 1 - Média dos diâmetros das nanofibras (nm) PCL/gelatina, PVA e coaxial PCL/PVA nas diferentes concentrações de Bevacizumabe.

Concentração de Beva	Tipo de nanofibra
PCL	PVA	Coaxial
-	195±47	473±194	190±40
Beva 0,5%	255±59	299±69	224±44
Beva 1,0%	248±57	326±104	244±60
Beva 2,0%	198±44	313±109	272±86
Beva 4,0%	75±38	311±90	255±87

0065 b) microscopia eletrônica de transmissão: para obtenção das imagens, as nanofibras poliméricas foram preparadas adicionando CuSO4 (8-10%p/p) na solução aquosa de PVA. As nanofibras foram coletadas diretamente no grid Holey Carbon de 300mesh por 5-10 minutos e analisadas utilizando microscópio eletrônico de transmissão na voltagem de aproximadamente 200 kV.

0066 A presença de CuSO4 no núcleo permitiu a visualização do contraste entre casca e núcleo na nanofibra coaxial conforme demonstrado na Figura 2.

0067 E para a produção das imagens fluorescentes foi utilizado o microscópio confocal Nikon Eclipse Ti com um laser C2. Neste caso, o isotiocianato de fluoresceína foi incorporado no núcleo de PVA das nanofibras. A observação da fluorescência da fluoresceína ao longo de todo comprimento das nanofibras comprova a uniforme extensão da estrutura casca-núcleo (Figura 3).

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0068 c) Termogravimetria (TG) e Termogravimetria Derivada (DTG): As curvas TG e DTG foram obtidas pela análise das nanofibras poliméricas sob atmosfera de nitrogênio com fluxo de 15-30 ml/min e taxa de aquecimento de 15-20°C/min, no intervalo de 20°C a 700°C e estão demonstradas na Figura 4.

0069 As curvas da TG e DTG das nanofibras de PCL/gelatina (Figura 4A) mostraram a ocorrência de perda de massa de 4%, associada à evaporação da água entre 22°C a 112°C. Na faixa de temperatura entre 195°C e 362°C, observou-se um pico em 337°C correspondente a perda de massa de 19% atribuído à degradação da gelatina presente nas nanofibras de PCL/gelatina. Entre 373°C a 505°C, observou-se um pico em 423°C, correspondente a perda de massa de 67%, atribuído à degradação do PCL.

0070 Para as nanofibras de PVA (Figura 4B) foi observada degradação na faixa de 23°C a 119°C de 7%, associada à evaporação da água/solventes. Na faixa de temperatura de 182°C a 347°C um pico em 274°C, correspondente a 70% de perda de massa, foi atribuído à fragmentação da cadeia do PVA e eliminação de moléculas menores. Tais valores se mostram consistentes ao encontrado na literatura (Parparita E, Cheaburu CN, Vasile C. Morphological, Thermal And Rheological Characterization Of Polyvinyl Alcohol/Chitosan Blends. Cellulose Chemistry And Technology 2012;46:571-581.; Won JJ, Nirmala R, Navamathavan R, Kim HY. Electrospun Core-Shell Nanofibers From Homogeneous Solution Of Poly (Vinyl Alcohol)/Bovine Serum Albumin. International Journal of Biological Macromolecules, Elsevier 2012;50:1292-1298). Na faixa de temperatura entre 391°C a 495°C, com pico centrado em 430°C, correspondente a 14% de perda de massa foi atribuída à degradação dos fragmentos restantes da molécula.

0071 Para a nanofibra coaxial (Figura 4C), na faixa de temperatura de 38°C a 117°C, com pico máximo em 67°C, observou-se perda de

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28/34 massa de 3% associada à evaporação da água. Na faixa de temperatura de 189°C à 363°C, com pico centrado em 324°C correspondente a perda de massa de 22% foi atribuída a degradação da gelatina e degradação parcial do PVA. E, na faixa de temperatura de 367°C a 534°C, com pico centrado em 422°C, correspondente a perda de massa de 62%, foi atribuída à degradação térmica do PCL e PVA.

0072 d) Calorimetria exploratória diferencial (DSC): As curvas de DSC foram obtidas pela análise das nanofibras poliméricas sob atmosfera de nitrogênio, aquecimento de 30°C a 250°C, resfriamento até - 50°C, e reaquecimento até 250°C com taxa de aquecimento de 10°C /min e estão demonstradas na Figura 5.

0073 A curva de DSC da nanofibra de PCL/gelatina apresentou banda endotérmica associada à fusão do PCL na temperatura de 50°C e uma entalpia de 49,9 mJ/mg. Um evento endotérmico relacionado ao início da degradação térmica da gelatina em torno de 180°C também foi notado para as nanofibras de PCL/gelatina. Para as nanofibras de PVA, eventos endotérmicos relacionados à perda de água, foram verificados por DSC na temperatura de 120°C. A transição vítrea do PVA foi observada em torno de 75°C e fusão em torno de 220°C. As nanofibras coaxiais apresentaram evento de fusão relacionado ao PCL a 47°C com entalpia de 18,5 mJ/mg e eventos associados com a eliminação de voláteis (125°C) e de fusão do PVA. Estes resultados reforçam as informações reveladas por MET e comprovam a presença de PVA nas nanofibras coaxiais. A razão entre as entalpias de fusão dos polímeros nas nanofibras isoladas e nas nanofibras coaxiais se mostra próxima da composição teórica destes polímeros nos sistemas que é na razão de 50/50 em massa de PVA/PCL.

0074 e) Espectroscopia de Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR): Os espectros das nanofibras poliméricas foram obtidos

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29/34 por meio da técnica de reflexão total atenuada (ATR). Foram realizadas 10-20 varreduras e resolução de 3-5cm^-1.

0075 O espectro para o polímero PCL apresentou bandas em 2943cm^-1 e 2862cm^-1 atribuídas às deformações axiais simétricas e assimétricas, respectivamente, do grupo CH2. Uma intensa banda em 1724cm^-1 foi observada e atribuída ao sinal de deformação axial de carbonila (C=O) do grupo éster. Uma banda em 1246cm^-1, atribuída ao estiramento assimétrico C-O-C, e uma banda em 1168cm^-1, atribuída ao estiramento simétrico C-O-C também foram encontradas (Motiwalla MJ, Punyarthi PP, Mehta MK, D'Souza JS, Kelkar-Mane V. Studies on degradation efficiency of polycaprolactone by a naturally-occurring bacterium. Journal of Environmental Biology, v.34, p.43-49; 2013; Swain PK, Das M, Nayak PL.Biodegradation Studies of ChitosanPolycaprolactone (PCL) Nanocomposite In Soil Burial Test. Middle-East Journal of Scientific Research, v.23, p.253-258, 2015). Foi observada a banda 3288 cm^-1 atribuída à vibração do grupo amina N-H relacionada a gelatina presente na nanofibra de PCL, como também as bandas 1642 cm^-1 e 1530 cm^-1. Segundo Dash e Konkimalla, o grupo N-H ocorre em um intervalo entre 3400-3440cm^-1, mas é deslocada para frequências mais baixas, aproximando de 3300cm^-1 quando o grupo N-H dos peptídeos está envolvido em ligação de hidrogênio (Dash TK, Konkimalla VB. Poly-e-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review. Journal of Controlled Release, v.158, p.15-33, 2012.). O espectro do PVA apresentou uma banda entre as regiões 3600-3200 cm^-1 correspondente à vibração de estiramento do grupo OH. Foram encontradas também uma banda de absorção em 2950 cm^-1 relacionada ao estiramento assimétrico do grupo -CH2, uma banda em 2902cm^-1 relacionada ao estiramento C-H, uma banda em 1425cm^-1 relacionada a CH2 e uma banda de absorção em 1096cm^-1, devido ao estiramento C-O-C (Islam MDS, Yeum JH. Electrospun Pullulan/Poly

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30/34 (Vinyl Alcohol)/Silver Hybrid Nanofibers: Preparation And Property Characterization For Antibacterial Activity. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v.436, p279-286, 2013; Turaga U, Singh V, Behrens R, Korzeniewski C, Jinka S, Smith E, Kendall RJ, Ramkumar S. Breathability of Standalone Poly (vinyl alcohol) Nanofiber Webs. Industrial and Engineering Chemistry Research, v.53, p.6951-6958, 2014.).

0076 Para comprovar a presença do PCL e PVA na nanofibra coaxial, foi realizada a remoção de cada polímero isoladamente por meio da solubilização em solventes específicos para cada um deles. A uma amostra de nanofibra coaxial foi adicionado TFE, que permitiu a remoção do PCL e avaliação do PVA, que serviu como controle (Figura 6). Outra amostra da nanofibra coaxial foi acrescentada de DMSO, que permitiu a remoção do PVA e avaliação do PCL, que serviu como controle (Figura 7). Em ambos os casos foi possível evidenciar as bandas características de cada polímero isoladamente.

0077 Os espectros infravermelho das nanofibras PCL/gelatina, PVA e Coaxial contendo 0,5%, 1%, 2% e 4% do Beva apresentaram as mesmas bandas específicas de cada polímero já citadas no tópico anterior, não havendo diferença dos espectros em relação às diferentes concentrações de Beva.

Exemplo 3: Estudo de liberação in vitro das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe

0078 Para realização deste estudo, as nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe em diferentes concentrações foram cortadas no tamanho de 5-10mm x 5-10mm e pesadas individualmente. Cada amostra foi adicionada a tubos plásticos contendo 1-2 ml de PBS e mantidas em agitador do tipo Shaker em temperatura de 35-38°C e velocidade de 30-60 rpm durante 21 dias. As amostras foram coletadas

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31/34 inicialmente após 12 e 24 horas e, em seguida, a cada 48 horas até completarem 21 dias.

0079 Para quantificação do bevacizumabe liberado, foi utilizado o método de ELISA, desenvolvido exclusivamente para análise deste anticorpo empregando-se o anticorpo Anti-Human IgG-peroxidase como conjugado da técnica. A curva padrão foi desenvolvida para a faixa de concentração que variou de cerca de 1,5 mcg/ml a 0,02mcg/ml de bevacizumabe. A leitura foi realizada em leitor de microplacas no comprimento de onda de 492 nm.

0080 Os resultados mostraram que aproximadamente 60% do Beva incorporado foi liberado nas primeiras 12 horas do ensaio. O restante foi liberado de forma controlada até o final dos 21 dias de teste.

0081 Como já era esperado, a quantidade de fármaco liberada da nanofibra de PVA contendo 2% de Beva foi aproximadamente 50% daquela referente à nanofibra de PVA contendo 4% de Beva. Referente à nanofibra coaxial, os valores de Beva liberados são inferiores aos observados para a nanofibra de PVA, confirmando a hipótese que a casca de PCL/gelatina, por apresentar maior hidrofobicidade, reduz a taxa de liberação do fármaco concentrado no núcleo de PVA.

Exemplo 4: Avaliação da atividade antiangiogênica das nanofibras poliméricas contendo bevacizumabe em membrana corioalantóica (CAM) de ovos de galinha

0082 Esta avaliação foi realizada utilizando a membrana corioalantóica (“chorioallantoic membrane”, CAM) de ovos de galinhas fertilizados. Para realização do teste, os ovos fertilizados foram incubados a temperatura e umidade controladas (37°C / 60% UR). No 3° dia de incubação, uma abertura de cerca de 1 cm foi realizada na casca do ovo evidenciando a membrana interna da casca, que foi retirada cuidadosamente, expondo a membrana corioalantóica. No quinto dia, as

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32/34 amostras (nanofibras poliméricas de PCL/gelatina, PVA e coaxial contendo ou não bevacizumabe) foram aplicadas diretamente sobre a CAM e o ovo foi selado com uma fita adesiva transparente, retornando para a incubadora. Como controle negativo, os ovos receberam solução tampão fosfato (pH 7,4); e, como controle positivo foi aplicado um medicamento de ação conhecida (bevacizumabe livre). O aspecto da CAM foi avaliado no sétimo dia.

0083 Os resultados obtidos mostraram uma redução significativa (p <0,05) dos vasos no grupo com250pg do Bevacizumabe, como também das nanofibras de PVA contendo Beva 2% e 4% e Coaxial contendo Beva 2% e 4% em relação ao grupo controle negativo (PBS) (Figura 8). Não houve diferença significativa na resposta obtida entre as nanofibras de PVA contendo Beva 0,5% e 1% e coaxial contendo Beva 0,5% e 1% em relação ao controle (PBS).

Exemplo 5: Avaliação da citotoxicidade das preparações desenvolvidas no Exemplo 1 pelo método de redução do MTT 0084 O estudo de citotoxicidade foi realizado nas amostras de nanofibras poliméricas (tamanho 3-6mmx3-6mm) de PCL/gelatina, PVA e coaxial contendo ou não bevacizumabe e bevacizumabe em solução em diferentes concentrações (100, 178, 320, 560, 1000, 1780pg/mL). Foi utilizada a linhagem celular ARPE-19, que são células epiteliais pigmentadas da retina humana.

0085 As células ARPE-19 foram semeadas na densidade de 1 x 10⁴ células/poço em placas de poliestireno de 96 poços na temperatura de 37°C e 5% de CO2. Após 24 horas, as células foram incubadas com as amostras avaliadas em meio de cultura DMEM-F12 suplementados com 10% de soro fetal bovino (SFB). Células ARPE-19 em meio DMEM F12 foram usadas como controle negativo; meio DMEM F12, foi empregado

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33/34 como branco; e o meio DMEM F12 e ARPE-19 adicionado de DMSO foi utilizado como controle positivo.

0086 Após 24 horas, a viabilidade celular foi avaliada utilizado o método de MTT que se baseia na capacidade de enzimas desidrogenases, presentes nas mitocôndrias de células viáveis, em converter o sal de tetrazólio 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio bromide (MTT), solúvel em água, no cristal de formazan, produto insolúvel em água. A quantidade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de células viáveis. Para avaliação, o meio foi removido, assim como as nanofibras, e adicionou-se 85 pL de MTT (5 mg/mL) e 105 uL de meio DMEM-F12 suplementado com SFB. Após 2 horas de incubação, os cristais de formazan precipitados foram solubilizados por adição de 55pL dodecilsulfato de sódio (SDS) contendo 10% de HCl. A densidade óptica foi medida a 595 nm usando um leitor de microplacas.

0087 Os dados foram expressos como percentagem de viabilidade celular em comparação com o controle (média ± desvio padrão). O controle positivo foi considerado com 100% de viabilidade celular e as amostras forma consideradas citotóxicas se menos de 50% de viabilidade celular fosse encontrado.

0088 Após 24 horas do ensaio, o grupo controle negativo e os grupos contendo a solução do Beva não apresentaram redução na viabilidade celular (Figura 9). As nanofibras de PCL, PVA, Coaxial e as nanofibras de PVA e Coaxial contendo Beva apresentaram pequena redução da viabilidade celular, mas sem efeito citotóxico significativo quando comparado ao controle negativo (p< 0,05).

0089 Em 72 horas (Figura 10) foi observada redução da viabilidade celular do grupo que recebeu a solução de Beva nas concentrações de 1000 e 1780pg/mL, mas sem efeito citotóxico significativo quando

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34/34 comparado ao controle negativo. As nanofibras não apresentaram redução da viabilidade celular quando comparadas ao grupo controle.

Claims (13)

1 Dispositivo polimérico para liberação ocular de fármacos caracterizado por conter nanofibras poliméricas de policaprolactona, gelatina e álcool polivinílico, e um inibidor de angiogênese.

2 O dispositivo, como descrito na reivindicação 1, caracterizado pelo inibidor de angiogênese ser o bevacizumabe.

3 O dispositivo, como descrito na reivindicação 1, caracterizado pelas nanofibras poliméricas serem coaxiais.

4 O dispositivo, como descrito nas reivindicações 1 e 3, caracterizado pela membrana das nanofibras ser composta de policaprolactona/gelatina e o núcleo das nanofibras ser composto de álcool polivinílico.

5 O dispositivo, como descrito nas reivindicações 1 a 4, caracterizado pelas nanofibras possuírem diâmetro entre 185 e 480 nm.

6 O dispositivo, como descrito nas reivindicações 1 a 5, caracterizado pela administração poder ser pelas vias ocular tópica ou intraocular.

7 Nanofibras poliméricas caracterizadas por conter policaprolactona, gelatina, álcool polivinílico e um inibidor de angiogênese.

8 As nanofibras, como descrito na reivindicação 7, caracterizadas pelo inibidor de angiogênese ser o bevacizumabe.

9 As nanofibras, como descrito na reivindicação 7, caracterizadas por serem coaxiais.

10 As nanofibras, como descrito nas reivindicações 7 e 9, caracterizadas pela membrana ser composta de policaprolactona/gelatina e o núcleo ser composto de álcool polivinílico.

11 As nanofibras, como descrito nas reivindicações 7 a 10, caracterizadas por possuírem diâmetro entre 185 e 480 nm.

12 Processo de obtenção das nanofibras poliméricas, definidas nas reivindicações 7 a 11, caracterizado por possuir as seguintes etapas:

a) Preparar, separadamente, soluções de PCL e gelatina 5-7% p/v em 2,2,2- trifluoroetanol (TFE);

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2/2

b) agitar as soluções durante 2-4 horas sob temperatura ambiente;

c) misturar as duas soluções obtidas em “b” na proporção de 5-7 partes de PCL para 3-5 partes de gelatina, acrescentando-se, no final, 1-2 ml de solução de aproximadamente 0,2% v/v de ácido acético em TFE;

d) preparar solução de PVA, na concentração de 14-16% p/v em água deionizada, mantendo a mesma na temperatura de 80-100° C, durante 1-3 horas;

e) adicionar o bevacizumabe à solução obtida em “d”, na concentração de 0,5 a 4% p/p;

f) transferir as soluções obtidas em “c” e em “f” para seringas de vidro, e acoplar as mesmas a um dispositivo coaxial;

g) proceder à eletrofiação coaxial.

13 O processo, de acordo com a reivindicação 12 etapa “g”, caracterizado pelos parâmetros serem: diâmetros internos e externos da agulha de 0,5-1,0mm e 0,5-1,5 mm, respectivamente; vazão de 4,0-5,0 mL/h para a solução de PCL/gelatina e 1,0-2,0 mL/h para solução de PVA; voltagem aplicada de aproximadamente +25/0kV entre o dispositivo coaxial e o disco coletor; e distância entre o dispositivo e a ponta da agulha de 15,0-16,0 cm.