BRPI0711378A2 - modificações de xilanases para aumentar termofilicidade, termoestabilidade e alcalofilicidade - Google Patents

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Abstract

MODIFICAçõES DE XILANASES PARA AUMENTAR TERMOFILICIDAPE, TERMOESTABILIDADE E ALCALOFILICIDADE. é fornecida uma enzima de xilanase da Família 11 modificada compreendendo resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 para formar uma ligação de dissulfeto intramolecular. A xilanase modificada é produzida pela substituição de um aminoácido na posição 99, 118 ou ambas as posições 99 e 118 com uma cisteina para produzir a ligação de dissulfeto intramolecular. Xilanases da invenção exibem capacidade termofílica, capacidade alcalofílica ou termoestabilidade aperfeiçoadas em relação a xilanases do tipo selvagem.Tais xilanases encontram uso em uma variedade de aplicações na indústria que exigem atividades em temperaturas e/ou valores de pH acima daquele da enzima nativa.

Description

MODIFICAÇÕES DE XILANASES PARA AUMENTAR TERMOFILICIDADE, TERMOESTABILIDADE E ALCALOFILICIDADE
A presente invenção refere-se à modificação de xilanases. Mais especificamente, a invenção refere-se às xilanases modificadas que podem ter desempenho em pH e temperatura elevada.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As xilanases constituem um grupo de enzimas de ampla utilidade comercial. As principais aplicações de xilanases incluem biobranqueamento de polpa na produção de papel, agentes de clareamento em sucos e vinhos, como suplemento para aperfeiçoar a capacidade de digestão de ração de suínos e de aves domésticas, e como agentes de lavagem de semicondutores e de dispositivos de precisão (por exemplo, patente dos Estados Unidos número 5.078.802).
Na fabricação de polpa para a produção de papel, material fibroso é submetido a pressões e temperaturas elevadas na presença de produtos químicos. Esse tratamento converte as fibras em polpa e é conhecido como polpagem. Após polpagem, a polpa é alvejada. Enzimas de xilanase são utilizadas para aumentar o branqueamento da polpa. O tratamento de xilanase permite que produtos químicos de branqueamento subseqüentes como cloro, dióxido de cloro, peróxido de hidrogênio, ou combinações desses produtos químicos, alvejem a polpa de forma mais eficiente. O pré- tratamento de polpa com xilanase aumenta a brancura e qualidade do produto de papel final e reduz a quantidade de produtos químicos alvejantes que deve ser utilizada para alvejar a polpa. Isso, por sua vez, diminui a quantidade de produtos químicos alvejantes presentes no efluente produzido por tais processos.
O processo de polpagem química mais importante é a produção de polpa Kraft. Para polpa Kraft, após polpagem, e antes do tratamento de polpa com xilanase, a polpa é exposta a uma temperatura de 55-70°C e um pH altamente alcalino (por exemplo, Nissen e outros, 1992). Uma desvantagem de muitas xilanases do tipo não cultivado, comercialmente disponíveis é que essas enzimas apresentam um pH acídico ótimo e uma temperatura ótima de aproximadamente 55°C. Portanto, para utilizar xilanases de forma eficaz para aplicações de branqueamento, a polpa deve ser acidificada a um pH que se aproxima do pH ótimo para a xilanase específica utilizada. Além disso, a polpa quente deve ser resfriada a uma temperatura próxima à temperatura ótima para atividade enzimãtica da xilanase selecionada. A diminuição de temperaturas de polpa para tratamento de xilanase diminui a eficiência do branqueamento químico subseqüente. A acidificação da polpa requer o uso de grandes quantidades de ácidos. Além disso, a adição de ácidos leva â corrosão e diminui o tempo de vida de equipamento de processo. Desse modo, xilanases otimamente ativas em condições de temperaturas e pH que se aproximam das condições da polpa seriam úteis e benéficas na fabricação de polpa.
Xilanases que apresentam maior atividade em temperaturas mais elevadas poderiam ser utilizadas para tratar polpa imediatamente após o processo de polpagem, sem a necessidade de resfriar a polpa. Similarmente, xilanases que apresentam maior atividade em condições de pH mais elevado exigiriam menos ou nenhum ácido para neutralizar a polpa. Xilanases com tais propriedades forneceriam várias vantagens e benefícios econômicos substanciais em uma variedade de processos industriais.
Várias abordagens dirigidas ao aperfeiçoamento de xilanase para uso em branqueamento de polpa na técnica anterior incluem o isolamento de xilanases termoestáveis a partir de termófilos extremos que crescem a 80-100°C, como Caldocellum saccharolyticum, Thermatoga marítima e Thermatoga sp. Cepa FJSS-B.l (Luthi e outros, 199 0;
Winterhalter e outros, 1995; e Simpson e outros, 1991). Entretanto, essas enzimas de xilanase termoestáveis são grandes, com massas moleculares que variam de 35-120 kDa (320-1100 resíduos) , e têm capacidade reduzida de penetrar a massa de polpa em comparação com outras xilanases menores que apresentam melhor acessibilidade a fibras de polpa. Além disso, algumas das xilanases extremamente termofílicas, como Caldocellum saccharolyticum xilanase A, apresentam atividades tanto de xilanase como de celulase (Luthi, e outros, 1990). Essa atividade celulolítica adicional é indesejável para branqueamento de polpa devido a seu efeito prejudicial sobre a celulose, material em massa em papel. Além disso, enzimas de xilanase hiper- termoestáveis, que funcionam normalmente em temperaturas extremamente elevadas, têm baixas atividades específicas em temperaturas na faixa para branqueamento ótimo de polpa (Simpson, e outros, 1991).
Diversas xilanases foram modificadas por engenharia de proteína para aperfeiçoar suas propriedades para aplicações industriais. Por exemplo, a patente dos
Estados Unidos número 5.405.769 (Campbell e outros) revela a modificação de xilanase Bacillus circulans (BcX) utilizando mutagênese dirigida ao sitio para aperfeiçoar a termoestabilidade da enzima. As mutações específicas de sítio incluem substituir dois aminoácidos com resíduos de cisteína para criar ligações de dissulfeto intramoleculares. As mutações para criar ligações de dissulfeto incluem S179C (isto é, serina na posição 179 substituída com cisteína) para uma reticulação intermolecular entre duas moléculas de xilanase, e S100C/N148C e V98C/A152C para a criação de reticulações intramoleculares. Essas ligações de dissulfeto contribuem para a termoestabilidade da enzima, e não afetam a capacidade termofílica ou capacidade alcalofílica da enzima. WO 00/29587 (Sung e Tolan) revela a formação das reticulações de dissulfeto, 110/154 e 108/158, na xilanase fúngica de Trichoderma reesei xilanase II (TrX ou TrX II), correspondendo às ligações de dissulfeto 100/148 e 98/152 do BcX. Como no caso de BcX, essas reticulações também aumentaram a termoestabilidade de Trx II, porém não têm efeito sobre a capacidade termofílica ou capacidade alcalofílica da enzima.
A patente dos Estados Unidos número 5.4 05.769 (supra) também revela a mutação de resíduos específicos na extremidade-N da xilanase e verificou-se que essas mutações aperfeiçoam ainda mais a termoestabilidade da enzima. Em ensaios in vitro, os mutantes de dissulfeto mostraram termoestabilidade a 62°C, um aperfeiçoamento de 7°C em relação à enzima de xilanase BcX nativa. Entretanto, esses mutantes de dissulfeto termoestáveis não mostraram ganho em capacidade termofílica (Wakarchuck e outros, 1994). Mutações T3G, (numeração de aminoácido de xilanase BcX) , D4Y(F) e N8Y(F), próximo a extremidade-N da enzima de xilanase BcX, forneceram termoestabilidade a 57°C, um aumento de 2°C em relação a BcX nativa (patente dos Estados Unidos número 5.405.769). Entretanto, o uso dessas enzimas em aplicações industriais requer ainda resfriamento e acidificação de polpa após pré-tratamento antes da adição de enzimas. Portanto, aumentos adicionais em termoestabilidade, capacidade termofílica e na condição ótima de pH ainda são necessários.
É conhecido na técnica modificar Trichoderma reesei xilanase II (TrX II ou TrX) para aumentar a capacidade termofílica e capacidade alcalofílica. Por exemplo, a patente dos Estados Unidos número 5.759.840 (Sung e outros), e patente dos Estados Unidos número 5.866.408 (Sung e outros) revelam mutações na região terminal-N (resíduos 1-29) de TrX. Verificou-se que três mutações, nos resíduos 10, 27 e 29 de TrX, aumentam a atividade enzimática da enzima de xilanase em temperaturas elevadas e condições de pH alcalino.
WO 01/92487 (Sung) revela mutações S75A, L105R, N125A, I129E de TrX II, para produzir uma xilanase que mantém maior atividade em temperatura e pH mais elevados. WO 03/046169 (Sung) também descreve a aplicação de múltiplas mutações em resíduos de arginina (Y135R, H144R, Q161R) para aumentar a condição ótima de pH de Trx II. A mutação, Y118C, permitiu que a xilanase mantivesse sua atividade ótima em temperatura mais elevada.
Turunen e outros (2002) descrevem o uso de argininas múltiplas específicas na "superfície Ser/Thr" específica de TrX II para aumentar a atividade enzimática em temperaturas mais elevadas, porém com termoestabilidade diminuída. Foi também reportado que outra mutação, K58R, exibiu termoestabilidade levemente aumentada. Entretanto, essa mutação em combinação com outras argininas mostrou uma faixa mais estreita de pH eficaz.
Turunen e outros (2001) revelam mutações N11D, Q162H de TrX II com um complemento de ligações de dissulfeto similares (S110C/N154C) para melhorar a termoestabilidade da xilanase. Entretanto, essas mutações, incluindo NllD, têm também efeito adverso tanto sobre a capacidade termofílica como sobre a capacidade alcalofílica da xilanase, resultando em uma diminuição de atividade enzimática em temperaturas mais elevadas e pH alcalino- neutro em comparação com TrX II nativo.
Houve muitas tentativas para estabilizar proteínas através da introdução de ligações de dissulfeto construídas, com resultados mistos. Sowdhamini e outros (1989) descrevem um procedimento de computação denominado MODIP (ModeIing of Disulfide bridges in Proteins) para auxiliar na elaboração de proteínas com pontes de dissulfeto. Por esse método, um grande número de sítios para formação de ligação de dissulfeto em potencial ê normalmente previsto, sem meio de prever quais são mais prováveis de estabilizar a proteína. Dani e outros (2003) descrevem uma versão refinada desse método para auxiliar essa seleção. É previsto que uma exigência crucial em qualquer ligação de dissulfeto de estabilização é encerrar um loop de mais de 25 resíduos de aminoácidos entre as duas cisteínas. Um Ioop com menos de 25 resíduos oferecerá pouca estabilização.
WO 00/29587 (Sung e Tolan) relata a formação de duas ligações de dissulfeto em Trichoderma reesei xilanase II uma delas ligando as posições 110 e 154, e a outra ligando as posições 108 e 158 (ambos os loops encerrados tendo mais de 25 resíduos de comprimento). As duas ligações de dissulfeto fornecem termoestabilidade aumentada da enzima, porém não aumentam a capacidade termofílica.
Fenel e outros (2004) descrevem a formação de uma ponte de dissulfeto em TrX II através de duas mutações, T2C e T28C, que resulta em um aumento na condição ótima de temperatura e termoestabilidade da enzima sem qualquer alteração na atividade dependente de pH. A reticulação de dissulfeto encerra um Ioop tendo um comprimento de 26 resíduos de aminoácidos entre os dois resíduos de cisteína.
Embora a técnica anterior revele a modificação de xilanases para alterar várias características, as necessidades de processos industriais atuais exigem enzimas com atividade cada vez mais robusta. Há necessidade na técnica por xilanases novos que apresentem atividade enzimática aumentada em temperaturas e condições de pH elevadas. Tais enzimas seriam adaptáveis a usos em vários campos, por exemplo, a produção de polpa de papel e a lavagem de dispositivos de precisão e semicondutores.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se às xilanases modificadas. Mais especificamente, a invenção refere-se às xilanases modificadas com desempenho aperfeiçoado em condições de temperatura e/ou pH elevado.
A presente invenção refere-se a uma xilanase modificada que compreende resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 para formar uma ligação de dissulfeto intramolecular, a xilanase produzida por substituição de um aminoácido nas posições 99, 118 ou nas posições tanto 99 como 118 com uma cisteína. As posições da(s) substituição(ões) de aminoácido são determinadas a partir do alinhamento de seqüência da xilanase modificada com uma seqüência de aminoácido de xilanase II Trichoderma reesei como definido na SEQ ID NO: 16. A xilanase modificada apresenta capacidade termofílica, capacidade alcalofílica, termoestabilidade ou uma combinação dos mesmos.
A xilanase modificada pode ser derivada de uma xilanase de Família 11, incluindo, porém não limitada à xilanase Trichoderma reesei. A xilanase modificada preferivelmente não é uma xilanase Aspergillus nativa.
De acordo com a presente invenção, também é fornecida uma xilanase modificada, como descrito acima, compreendendo ainda um resíduo de aminoácido substituído na posição 40. O aminoácido substituído na posição 40 pode ser selecionado do grupo que consiste em His, Cis, Phe, Lys, Tyr e Arg. Em um exemplo específico, o aminoácido substituído na posição 4 0 é um aminoácido básico, incluindo, porém não limitado a His.
A presente invenção também se refere à xilanase modificada compreendendo resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 e compreendendo ainda um aminoácido substituído na posição 58, incluindo, porém não limitado a, um aminoácido básico, como Arg. Além disso, a xilanase modificada descrita há pouco pode compreender ainda um aminoácido substituído básico na posição 10, um aminoácido substituído hidrofõbico na posição 27 e um aminoácido substituído hidrofõbico na posição 29. O aminoácido substituído básico na posição 10 pode ser His, o aminoácido substituído hidrofõbico na posição 27 é Met e o aminoácido substituído hidrofõbico na posição 29 é um Leu (HML). Além dessas mutações, a xilanase modificada pode compreender um aminoácido substituído não polar na posição 75, um aminoácido substituído básico na posição 105, um aminoácido substituído não polar na posição 125 e um aminoácido acídico na posição 129. O aminoácido não polar na posição 75 pode ser um Ala, o aminoácido básico na posição 105 pode ser um His, o aminoácido não polar na posição 125 pode ser um Ala e o aminoácido acídico na posição 129 pode ser um Glu. A xilanase modificada pode compreender ainda um aminoácido acídico na posição 11, como um Asp. Além de uma mutação na posição 11, a xilanase modificada pode compreender ainda uma mutação na posição 131 para um Asn.
A presente invenção também inclui uma xilanase modificada que compreende resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 e compreende ainda aminoácidos básicos nas posições 40 e 58. A xilanase modificada pode compreender ainda um aminoácido substituído básico na posição 10, um aminoácido substituído hidrofõbico na posição 27, e um aminoácido substituído hidrofõbico na posição 29. O aminoácido substituído básico na posição 10 pode ser His, o aminoácido substituído hidrofõbico na posição 27 pode ser Met e o aminoácido substituído hidrofõbico na posição 29 pode ser Leu (HML). Além dessas mutações, a xilanase modificada descrita há pouco pode compreender ainda um aminoácido substituído não polar na posição 75, incluindo, porém não limitado a Ala; um aminoácido substituído básico na posição 105, incluindo, porém não limitado a, His; um aminoácido substituído não polar na posição 125, incluindo, porém não limitado a, Ala; e um aminoácido acídico na posição 12 9, incluindo, porém não limitado a, Glu. A xilanase modificada pode compreender ainda um aminoácido substituído acídico na posição 11, incluindo, porém não limitado a, Asp,· e opcionalmente um Asn na posição 131. A xilanase modificada como descrita a pouco pode compreender ainda um aminoácido substituído na posição 52, incluindo, porém não limitado a Cys. Além disso, a xilanase modificada pode compreender ainda aminoácidos substituídos básicos nas posições 144 e 161, incluindo, porém não limitado a resíduos Arg.
A presente invenção também se refere a uma xilanase modificada que compreende resíduos de aminoácidos substituídos nas posições 99 e 118 e tendo uma temperatura efetiva máxima (MET) entre aproximadamente 65°C e aproximadamente 85°C ou tendo um pH efetivo máximo (MEP) entre aproximadamente pH 6,5 e aproximadamente pH 8,0.
A presente invenção também se refere a uma xilanase modificada selecionada do grupo que consiste em:
MUTANTE NOME SEQUENCIA
<table>table see original document page 11</column></row><table> <table>table see original document page 12</column></row><table>
Xilanases da presente invenção compreendendo resíduos de cisteina nas posições 99 e 118 exibem capacidade termofílica, capacidade alcalofílica ou termoestabilidade aperfeiçoadas em relação a xilanases do tipo selvagem. Tais xilanases encontram uso em uma variedade de aplicações na indústria que requerem atividades de enzima em temperaturas e/ou valores de pH acima daquele da enzima nativa. Por exemplo, xilanases modificadas, como descrito aqui, podem ser utilizadas para fins de branquear polpa, melhorar a capacidade de digestão de ração de suíno e aves domésticas, ou o processamento de dispositivos de precisão.
A presente invenção também se refere a uma xilanase modificada que compreende um aminoãcido substituído na posição 40, a posição determinada a partir do alinhamento de seqüência da xilanase modificada com uma seqüência de aminoácido de xilanase II Trichoderma reesei como definido na SEQ ID NO: 16. A xilanase modificada como definido a pouco pode compreender ainda uma ligação de dissulfeto intramolecular tendo um Ioop entre 10 e 24 aminoácidos. A ligação de dissulfeto intramolecular pode ser produzida por substituição de um aminoácido na posição 99, 118 ou nas posições tanto 99 como 118 com uma cisteína.
A substituição de aminoácido na posição 40 é preferivelmente um aminoácido básico, incluindo, porém não limitado a His.
Esse sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características necessárias da invenção, porém que a invenção pode residir também em uma subcombinação das características descritas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Essas e outras características da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição na qual referência é feita aos desenhos apensos, onde:
A figura 1 mostra um alinhamento de seqüência de aminoácidos entre xilanase da Família 11. A numeração de aminoácidos é relativa a Trichoderma reesei xilanase II (Tr2, também mencionado aqui como TrX II) como indicado no topo das seqüências. Os resíduos na posição 99 e 118 (relativo a Tr2) estão em itálicos e indicados com um asterisco. Os aminoácidos comuns a pelo menos 75% das xilanases da Família 11 listadas são indicados em negrito. Os resíduos comuns a todas as Xilanases da Família 11 são sublinhados. Para xilanases com um domínio de ligação de celulose, somente as seqüências de núcleo catalítico são apresentadas.
A figura 2 mostra a seqüência de nucleotideos de TrX xilanase (SEQ ID N0:40), e os oligonucleotídeos sintéticos TrX (1-91) e TrX (92-190) (SEQ ID NOs:61 a 64) utilizados para construir a seqüênica codificando a enzima xilanase II Trichoderma reesei (TrX) no plasmídeo pTrX.
A figura 3 mostra o efeito de temperatura sobre a atividade enzimática de xilanases modificadas TrX-99C, TrX-58R, TrX-40H, TrX-118C, TrX-99C-118C, TrX-58-99C-118C, TrX-40H-99C-118C, TrX-40H-58R-99C-118C em comparação com TrX, em pH 5,0 durante incubações de 30 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada a 40°C.
A figura 4 mostra o efeito de temperatura sobre a atividade enzimática de xilanases modificadas TrX-99C-118C, TrX-58R-99C-118C, TrX-40H-99C-118C, e TrX-40H-58R-99C-118C, em comparação com TrX, durante incubações de 30 min. em pH 5,0. Os dados se baseiam naqueles da figura 3, porém normalizados à atividade observada na condição ótima de temperatura.
A figura 5 mostra o efeito de temperatura sobre a atividade enzimática de xilanases TrX-118C, TrX-99C-118C, TrX-4 0H-58R-99C-118C e TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C em comparação com as xilanases conhecidas, TrX, TrX-10H-27M- 29L e TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E durantes incubações de 30 minutos em pH 5,0 a menos que indicado de outro modo. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de temperatura.
A figura 6 mostra o efeito de temperatura sobre a atgiviade enzimática de xilanases modificadas TrX-10H- 27M-29L-4 0R-58R-99C-118C, TrX-10H-27M-29L-4OR-58R-7 5A-99C- 118C, TrX-IOH-27Μ-29L-75Α-99C-105Η-1 18C-125A-129E, TrX- 10H-27M-2 9L-5 8R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, TrX-IOH-IlD- 27M-2 9L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, TrX-IOH-11D-27M- 2 9L-4 0H-58R-75Α- 99C-105Η-118C-125Α-129Ε e TrX-IOH-I 1D-27M- 29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E, em comparação com a xilanase conhecida, TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A- 129E, em pH 5,5 durante incubações de 3 0 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de temperatura.
A figura 7 mostra o efeito da tempratura sobre a atividade enzimãtica de xilanases modificadas TrX-10H-IlD- 27M-2 9L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E e TrX-I OH-11D-27M- 29L-40X-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E (onde X é T, C, F, Y, R e H) em pH 5,5 durante incubações de 30 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de temperatura.
A figura 8 mostra o efeito da temperatura sobre a atividade enzimática de xilanases modificadas TrX-IOH- 27M-29L-75A-99C-105H-1 18C-125A-129E, TrX-IOH-I 1D-27M-29L- 58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, TrX-10H-IlD-27M-2 9L-4 0H- 58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E e TrX-10H-llD-27M- 29L-4 0H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, comparado com as xilanases conhecidas, TrX, TrX-10H-27M-29L e TrX-10H-27M- 29L-75A-105H-125A-12 9E (pH 5,5), em pH 5,5 durante incubações de 3 0 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada a 4 0°C.
A figura 9 mostra o efeito de tempratura sobre a atividade enzimática de xilanases modificdas TrX-I OH-IlD- 27M-29L-4 OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-161R (pH 6,5), em copmparação com a xilanase conhecida, TrX-IOH-IlD- 27M-29L-75A-105H-118C-125A-129E-144R-161R (pH 6), durante incubações de 30 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de temperatura.
A figura 10 mostra o efeito de pH sobre a atividade enzimática de xilanases TrX-99C e TrX-99C-118C, em comparação com TrX nativo e a xilanase conhecida, TrX- 118C, em pH 4,5 - 7,5, a 550C durante uma incubação de 3 0 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de pH para cada enzima.
A figura 11 mostra o efeito de pH sobre a atividade enzimática de xilanases modificadas TrX-10H-27M- 29L-75 A-99C-105H-118C-125 A- 129E, TrX-10H-27M-29L-58R-75 A-99C-105H-118C-125A-129E, TrX-10H-llD-27M-29L-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E e TrX-10H-IlD-27M-29L-4OH-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E, em comparação com a xilanase conhecida, TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E, em pH 5,0- 8,0, a 650C durante uma incubação de 3 0 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de pH para cada enzima.
A figura 12 mostra o efeito de pH sobre a atividade enzimática de xilanase modificada TrX-10H-IlD- 27M-29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-144R-16IR, em comparação com as xilanases conhecidas, TrX-10H-27M-29L-75A- 105H-125A-129E, TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R- 161R e TrX-I OH-11D-27M-29L-75A-105H-116G-118C-125 A-129E- 144R-161R, em pH 5,0-8,0, a 65°C durante uma incubação de 30 minutos. Os dados são normalizados à atividade observada na condição ótima de pH para cada enzima.
A figura 13 mostra o efieto da temperatura sobre a atividade enzimática residual de xilanase modificada, TrX-99C-118C, em comparação com a xilanase natural, TrX, a 48°C, 52°C, 56°C e 60°C durante incubações de 30 minutos sem nenhum substrato de xilano solúvel. Os dados são normalizados à atividade observada em temperatura ambiente após uma pré-incubação a 48°C.
A figura 14 mostra o efeito de temperatura sobre a percentagem de xilose máxima liberada para as xilanases modificadas RTrX-10H-11D-27M-2 9L-4OR-58R-75A-99C-105H-118C- 125A-129E-131N e TrX-10H-11D-27M-29L-4OR-58R-7 5A-99C-105H- 118C-125A-129E em 1% de substrato de arabinoxilano de trigo em pH por 60 minutos.
A figura 15 mostra o efeito de pH sobre a percentagem de xilose máxima liberada para as xilanases modificadas TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C- 125A-12 9E-13IN e TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E em polpa de folhosa (10% de consistência) a 70°C por 60 minutos.
A figura 16 mostra o efeito de pH sobre a percentagem de xilose máxima liberada para as xilanases modificadas TrX-10H-llD-27M-2 9L-4 0R-5 8R-7 5A-9 9C-105H-118C- 125A-129E-131N e TrX-10H-IlD-27M-29L-4OR-58R-75A-99C-105H- 118C-12 5A-129E em polpa de madeira resinosa (10% de consistência) a 70°C por 60 minutos.
A figura 17 mostra o efeito de temperatura de pré-incubação sobre a atividade residual relativa (%) das xilanases modificadas TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E, TrX-10H-llD-27M-29L-4 0R-5 8R-7 5A-99C- 105H-118C-125E-131N e TrX-10H-27M-29L após incubação durante 30 minutos a 50°C, 60°C, 70°C e 80°C. DESCRIÇÃO DA MODALIDADE PREFERIDA
A presente invenção refere-se a xilanases modificadas. Mais especificamente, a invenção refere-se a xilanases modificadas com desempenho aperfeiçoado em condições de temperatura e pH elevados e estabilidade aperfeiçoada em temperatura elevada.
A seguinte descrição é de uma modalidade preferida somente como exemplo e sem limitação à combinação de características necessárias para realizar a invenção.
O mecanismo pelo qual xilanases facilitam branqueamento de polpa não é plenamente entendido. Sem desejar ser limitado por teoria, foi postulado que a lignina colorida é conectada a celulose cristalina através de xilano e enzimas de xilanase facilitam branqueamento de polpa por hidrólise de xilano, liberando a lignina colorida na polpa. Xilanases modificadas como delineado aqui, podem ser utilizadas para fins de branquear polpa ou outras aplicações que requerem atividades em valores de pH e temperatura acima daqueles da enzima do tipo selvagem. Para o biobranqueamento de polpa, a xilanase preferida ê derivada de uma xilanase classificada na Família 11 (vide a tabela 1).
Enzimas de xilanase da Família 11 constituem um grupo de enzimas pequenas de massa molecular relativamente baixa (aproximadamente 20 kDa e aproximadamente 2 00 resíduos de aminoácido) . O tamanho pequeno associado a xilanases da Família 11 permite penetração fácil da massa de polpa. Outra vantagem das xilanases da Família 11 é que estão livres de atividade de celulase. Grande parte das xilanases da família 11 identificadas até o presente é mesofílica e tem baixas massas moleculares (20 kDa).
Entretanto, essa família também inclui pelo menos três xilanases termoestáveis de massa molecular mais elevada, Theromomonospora fusca xilanase A (TfX-A) de 296 aminoácidos e uma massa molecular de aproximadamente 32 kDa (Irwin e outros, 1994; WO 95/12668, que são aqui incorporados a título de referência), Thermomyces lanuginosus xilanase (Tln) de 194 aminoácidos e uma massa molecular de aproximadamente 22 kDa (Gruber e outros, 1998, que é incorporado aqui a título de referência), e Clostridium stercorarium xilanase A de 511 aminoácidos e uma massa molecular de aproximadamente 56 kDa. A enzima Clostridium stercorarium xilanase A apresenta atividade máxima em uma temperatura de 70°C (Sakka e outros, 1993, que é incorporada aqui a título de referência).
Algumas xilanases da Família 11 termoestáveis, grandes, diferem das enzimas mesofílicas pequenas pela posse de um domínio de ligação de celulose hidrofóbica (CBD) na extremidade-C estendida da enzima. A enzima TfX-A é composta de uma seqüência de núcleo catalítico de 189 resíduos comuns a todas as xilanases da Família 11, e um domínio de ligação de celulose de 107 resíduos. A xilanase A C. stercorarium maior tem duas cópias do domínio de ligação de celulose.
Proteínas são classificadas como xilanases da Família 11 se (a) apresentarem a capacidade de hidrolisar as ligações beta-1,4 glicosídicas internas entre resíduos de xilose adjacentes na cadeia principal do polímero de xilano e (b) apresentarem as assinaturas estruturais primária e secundária associadas a xilanases da Família 11. Todas as xilanases da família 11 a partir de fontes bacterianas e fúngicas compartilham a mesma estrutura molecular geral compreendendo principalmente beta-folhas, voltas e uma única alfa hélice. 0 alinhamento das seqüências de aminoácido de 82 xilanases da família 11 variando em comprimento de 173 a 22 0 aminoácidos e cobrindo uma ampla faixa de pontos isoelétricos (pi 3,5 a 10,25), condição ótima de pH (2,0 a 8,0) e condição ótima de temperatura (45°C a 75°C) identificou seqüências de assinatura altamente conservadas em filamentos beta B5, B 6 e B8 bem como na alfa hélice (Sapag e outros, 2002) . Além disso, a estrutura secundária das xilanases da Família 11 é altamente conservada. Comparações em pares dos átomos alfa- C de dez xilanases da Família 11 apresentando 31-97% de identidade em seqüência de aminoácido utilizando coordenadas estruturais a partir do Banco de Dados de proteína (PDB) mostraram que o desvio médio quadrático (rmsd) variou de 0,6 a 1,4 A (Hakulinen e outros 2003 ; incorporado aqui a título de referência) . Esse nível de desvio está compreendido na resolução típica da maioria das estruturas de cristal de raios-X. Além disso, todas as xilanases da Família 11 contêm dois resíduos de glutamato conservado nas posições 86 e 177 (vide a figura 1; com base em Trichoderma reesei xilanase II (TrX II, ou Tr2) numeração de aminoácido) , que são localizados em beta- filamentos B4 e B5 (Torronen & Rouvinen, 1995; Sapag e outros 2002, que são aqui incorporados a título de referência).
Portanto, uma xilanase da família 11 pode ser definida como compreendendo de aproximadamente 80-100% ou qualquer quantidade entre os mesmos, 90-100% ou qualquer quantidade entre os mesmos, 95-100% ou qualquer quantidade entre os mesmos, ou de aproximadamente 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100% de identidade de seqüência em cada um dos beta-f ilamentos B5, B6, B8 e alfa hélice. Uma xilanase da família 11 pode ser também definida como compreendendo glutamato nas posições 86 e 177, com base na numeração de aminoácido TrX 11 (vide a figura 1).
Dada a estrutura altamente conservada na xilanase da família 11, uma pessoa versada na técnica pode aplicar métodos conhecidos, incluindo as abordagens delineadas aqui, para aumentar a capacidade termofílica, termoestabilidade e/ou capacidade alcalofílica de qualquer xilanase da família 11, cujos exemplos não limitadores são descritos na tabela 1 abaixo. Outros exemplos não limitadores das xilanases da família 11 são apresentados por Sapag e outros (2002) e Hakulinen e outros (2003) e revelados na URL:cazy.org/fam/GHll.html, que são aqui incorporados a título de referência.
Além disso, a xilanase da Família 11 modificada pode compreender mutações adicionais além dos resíduos de cisteína introduzidos nas posições 99 e 118. Essas mutações adicionais devem ser introduzidas em posições compatíveis na seqüência de aminoácidos, por exemplo, nas posições que são não conservadas (vide a figura 1) . Além disso, o fato de se ou não uma mutação dada é compatível com a mutação de dissulfeto pode ser determinado com facilidade por uma pessoa versada na técnica por medição da capacidade termofílica, capacidade alcalofílica e/ou termoestabilidade como descrito a seguir introduzindo tal(tais) mutação(ões) . Exemplos não limitadores de mutações que são compatíveis com a mutação 99/118 são dados na Tabela 2. Essas mutações adicionais podem ser introduzidas utilizando técnicas recombinantes conhecidas ou por evolução direta e podem contribuir adicionalmente para a capacidade termofílica, termoestabilidade, capacidade alcalofílica aumentadas ou uma combinação das mesmas, da enzima.
Tabela 1. Enzimas de xilanase da família 11
<table>table see original document page 22</column></row><table> <table>table see original document page 23</column></row><table>
Os exemplos de xilanases da família 11 preferidas, que não pretendem ser limitadores, incluem Trichoderma reesei xilanase II, Trichoderma reesei xilanase I, Trichoderma viride xilanase, Streptomyces lividans xilanase B e Streptomyces lividans xilanase C. Por exemplo, a xilanase mutante da presente invenção pode compreender uma enzima de xilanase II Trichoderma reesei mutante.
Por "xilanase modificada", se quer dizer uma xilanase que compreende uma mutação ou alteração da seqüência de xilanase natural. A mutação ou alteração não é encontrada na xilanase nativa correspondente. Uma molécula de xilanase pode ser modificada utilizando técnicas que são conhecidas por uma pessoa versada na arte. Essas técnicas incluem, porém não são limitadas a, mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese de cassete, mutagênese aleatória, construção de oligonucleotídeos sintéticos, clonagem e outras técnicas de engenharia genética. Um exemplo de uma técnica apropriada para produzir mutações em xilanases que tornam a enzima mais termofílica e/ou alcalofílica em comparação com a enzima nativa é mutagênese dirigida ao sítio. Entretanto7 é também considerado compreendido no escopo da invenção utilizar outras técnicas para introduzir mutações que são conhecidas por aqueles versados na técnica. Pelo termo "atividade ótima", se quer dizer a atividade da enzima específica em um pH onde atividade máxima é observada (isto é, pH ótimo) e uma temperatura onde atividade máxima é observada (isto é, temperatura ótima) durante um dado período de tempo.
Uma xilanase é "termofílica", como utilizado aqui, se a xilanase apresentar uma temperatura efetiva máxima entre aproximadamente 600C e aproximadamente 90°C. Por "temperatura efetiva máxima" ou "MET", se quer dizer a temperatura mais elevada na qual uma xilanase apresenta pelo menos 80% de sua atividade ótima. Para fins desse relatório descritivo, a MET de uma xilanase é determinada medindo-se o perfil de temperatura de uma xilanase utilizando o ensaio padrão para medição de atividade de xilanase como detalhado no exemplo 2.3 e modificado como detalhado no exemplo 3. A atividade da xilanase é medida em sua condição ótima de pH. As temperaturas nas quais a xilanase modificada apresenta pelo menos aproximadamente 80% de sua atividade ótima (máxima) são determinadas e a temperatura mais elevada é a MET.
A xilanase modificada pode ter uma MET de aproximadamente 60°C, 62°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 11°C, 1B°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82° C, 83°C, 84°C, 86°C, 88°C ou 90°C ou qualquer temperatua entre as mesmas. Em um exemplo não limitador, a xilanase modificada pode ter uma MET entre aproximadamente 62°C e aproximadamente 85°C ou qualquer faixa entre as mesmas; entre aproximadamente 65°C e aproximadamente 85°C ou qualquer faixa entre as mesmas; entre aproximadamente 68°C e aproximadamente 85°C ou qualquer faixa entre as mesmas; ou entre aproximadamente 70°C e aproximadamente 85°C ou qualquer faixa entre as mesmas.
Uma xilanase é "termostável", como utilizado aqui, se tiver uma T50 entre aproximadamente 55°C e aproximadamente 85°C. A "T50" é a temperatura de incubação na qual a enzima modificada ou a natural retém 50% de sua atividade residual, após um tempo de incubação de 30 minutos. A T50 de uma xilanase pode ser determinada pelo ensaio detalhado no exemplo 5. Como exposto no exemplo 5, a atividade residual a 48°C é normalizada a 100%.
A xilanase modificada pode ter uma T50 de aproximadamente 55°C, 56°C, 51°C, 58°C, 59°C, 60°C, 64°C, 68 °C, 72°C, 76°C, 80°C ou 85°C, ou qualquer temperatura entre as mesmas. Em um exemplo não limitador, a xilanase modificada pode ter uma T50 entre aproximadamente 54 °C e aproximadamente 80°C ou qualquer faixa entre as mesmas; entre aproximadamente 56°C e aproximadamente 80°C ou qualquer faixa entre as mesmas; ou entre aproximadamente 58°C e aproximadamente 80°C ou qualquer faixa entre as mesmas.
O uso dos termos capacidade termofílica e termoestabilidade, no passado, foi confundido na literatura, visto que foram utilizados de forma intercambiável. Entretanto, o uso dos termos como definido aqui é compatível com o uso dos termos na técnica (Mathrani e Ahring, 1992).
Uma xilanase é alcalofilica, como utilizado aqui, se a xilanase tiver um pH efetivo máximo (MEP) entre aproximadamente pH 6,0 e aproximadamente pH 8,5. Por "pH efetivo máximo" ou "MEP", se quer dizer o pH mais elevado no qual uma xilanase apresenta pelo menos 8 0% de sua atividade ótima. O MEP pode ser determinado medindo-se o perfil de pH de uma xilanase como exposto no exemplo 4. O pH para o qual pelo menos 80% da atividade ótima (máxima) é determinado e o pH mais elevado é o MEP.
A xilanase modificada pode ter um MEP de pH 6,2, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 8,0 ou 8,5, ou qualquer pH entre os mesmos. Em um exemplo não limitador, o MEP pode estar entre aproximadamente pH 6,5 e aproximadamente 8,5 ou qualquer faixa entre os mesmos; ou entre aproximadamente pH 6,8 e 8,0 ou qualquer faixa entre os mesmos; ou entre aproximadamente pH 7,0 e aproximadamente 8,0 ou qualquer fixa entre os mesmos.
Por "numeração TrX" se quer dizer a numeração que corresponde à posição de aminoácidos com base na seqüência de aminoácido de TrX (Xyn II - tabela 1; Tr2 - figura 1 ; SEQ ID NO: 16) . Como revelado abaixo, e como é evidente pela figura 1, xilanases da família 11 apresentam um grau substancial de similaridade de seqüência. Portanto, por alinhar os aminoácidos para otimizar a similaridade de seqüência entre enzimas de xilanase, e por utilizar a numeração de aminoácido de TrX como a base para numeração, as posições de aminoácidos em outras enzimas de xilanase podem ser determinadas em relação a TrX. Métodos padrão conhecidos por uma pessoa versada na técnica podem ser utilizados para alinhar essas seqüências.
Como aqui descrito em mais detalhe, várias xilanase mutantes foram preparadas que apresentam capacidade termofílica, capacidade alcalofIlica e/ou termoestabilidade aperfeiçoadas. Uraa lista de vários mutantes, que não deve ser considerada de modo algum como limitação, é apresentada na tabela 2.
Tabela 2. Xilanases modificadas
<table>table see original document page 27</column></row><table> TrX-HDML FRA CHC AE TrX: NIOH, Nl ID, Υ2 7Μ, N2 9L, 76
S4 OF, K58R, S75A, S99C, L105H, Yl 18C, Q125A e Ι129Ε
TrX-HDML RRA CHC AE TrX: NIOH, Nl ID, Υ2 7Μ, N2 9L, 79
S40R, K58R, S75A, S99C, L105H, Yl 18C, Q125A e Ι129Ε TrX-HDML ARA CHC AE TrX: ΝΙΟΗ, Nl ID, Υ27Μ, N29L,
S40A, K58R, S75A, S99C, L105H, Yl 18C, Q125A e Ι129Ε TrX-HDML HCRA CHC TrX: ΝΙΟΗ, Nl ID, Υ2 7Μ, N2 9L, 80
AE S40H, Q52C, K58R, S75A, S99C,
L105H, Y118C, Q125A e Ι129Ε
TrX-HDML RRA CHC TrX: ΝΙΟΗ, Nl ID, Υ27Μ, N29L, 81
AERR S40R, K58R, S75A, S99C,
L105H, Y118C, Q125A, Ι129Ε, H144R e Q161R
TrX-HDML RA CHC AEN TrX: ΝΙΟΗ, Nl ID, Υ27Μ, N29L, 82
58R, 75Α, 99C, 105Η, 118C, 125Α, 129Ε e 131Ν
Xilanases mutantes descritas em WO 03/046169,
patente dos Estados Unidos número 5.759.840, WO 01/92487 e
WO 2005/093072 (cujos teores são incorporados aqui a título
de referência) podem ser adicionalmente modificados para
introduzir resíduos de cisteína nas posições 99 e 118.
Exemplos não limitadores de xilanases mutantes que podem
ser modificados de acordo com a presente invenção são
listados na tabela 3.
TABELA 3: xilanases modificadas descritas em WO
03/046169, patente dos Estados Unidos No. 5.759.840 e WO 01/92487
Mutante TrX Mutação
TrX-Ca TrX:Yl18C TrX-HML b TrX
TrX-HML-AHAE c TrX
NlOH, Y27M e N29L ΝΙΟΗ, Y27M, N2 9L, S75A, L105H, Q125A e I129E
TrX-HDML AH CAERRa TrX: N10H, N11D, Y27M, N29L, S75A,
L105H, Y118C, Q125A, I129E, H144R e Q161R TrX-HDML AHGCAERRc TrX: N10H, NllD, Y27M, N29L, S75A,
L105H, D116G, Y118C, Q125A, I129E, H144R e Q161R
TrX-HML AHAE RRc TrX: NlOHi Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, H144R e Q161R
aWO 03/046169 (Sung) b Patente U.S. No. 5 . 759.840(Sung e outros)
cWO 01/92487 (Sung)
Aumento da capacidade termofílica de xilanase
O efeito de temperartura sobre hidrólise de xilano por Trichoderma reesei xilanase TrX com as mutações únicas S40H (TrX-40H) , K58R (TrX-58R) , S99C (TrX-99C), ou Y118C (TrX-118C) é mostrado na figura 3.
O aumento em capacidade termofílica de uma xilanase da Família 11 pela mutação única, Y118C, como na xilanase modificda, TrX-118C, foi decrito em WO 03/046169 (Sung). Entretanto, a possibilidade de produzir uma ligação de dissulfeto com base em uma cisteína na posição 118 e outra cisteína para aumentar a termoestabilidade, capacidade termofílica ou capacidade alcalofílica de uma xilanase nunca foi reportada. A presente invenção envolve a construção de uma ligação de dissulfeto 99C/118C para tal finalidade, com bsae em um Cys-118 de ocorrênica natural ou gerado com uma segunda cisteína no resíduo-99 que é de ocorrência natural ou criado via uma mutatção S99C.
Para verificar que qualuqer atividade aperfeiçoada em temperaturas mais elevadas é o resultado da formação de uma ligação de dissulfeto, a mutação única S99C foi testada (TrX-99C; figura 3). Essa xilanase mutante, TrX-99C, nãomostrou aperfeiçoametno de atividade enzimática em temperatura mais elevada, em comparação com TrX natural. Portanto, a mutação única S99C sozinha não teve efeito sobre o perfil de atividade/temperatura de TrX.
Entretanto, quando mutações S99C e Y118C foram incorporadas na forma de uma xilanase mutante dupla, TrX- 99C-118C, houve um aumento acnetuado de capacidade termofílica (figuras 3 e 4), mesmo quando comparado com o mutante único TrX-118C. 0 aperfeiçoamento da condição ótima de temperatura do mutante duplo TrX-99C-118C em relação à xilanase natural (TrX) e TrX-118C é de aproximadamente 70C e 5°C, respectivamente (figuras 3 e 4). Além de uma condição ótima de temperatura mais elevada, TrX-99C-118C também apresentou atividade ótima mais elevada do que TrX em sua respectiva condição ótima de temperatura (figura 3).
A mutação única, S40H, em xilanase TrX-40H mostrou uma atividade enzimática aperfeiçoada em temperatura mais elevada (figura 3) , em comparação com o TrX do tipo selvagem. 0 efeito posiivo sobre capacidade termofílica devido a esta mutação foi confirmado em outra xilanase mutante, TrX-40H-99C-118C, (figuras 3 e 4) quando comparado com TrX-99C-118C.
No caso da xilanase modificda TrX-58R, a mutação K58R por si só poderia não melhorar a atividade de TrX natural (figura 3), como anteriormente reportado por Turunen e outros (2002). Entretanto, nas xilanases mutantes contendo as mutações S99C e Y118C, a mutança K58R aumentou a atividade enzimática em temperaturas mais elevadas. Isso foi confirmado por comparar a capacidade termofílica das xilanases mutantes TrX-58R-99C-118C e TrX-40H-58R-99C-118C (figuras 3 e 4) com aquela das xilanases TrX-99C-118C e TrX-40H-99C-118C, respetivamente. Embora a mutação, K58R, por si só falhasse em melhroar a atividade de xilanase em temepratura mais elevada, tem um efeito positivo sobre a capacidade termofílica em combinação com as outras mutações S40H e S99C/Y118C.
As mutações acima são compatíveis com outras mutações de xilanase vantajosas anteriormente descritas na técnica. O efeito aditivio dessas mutações em combinação com mutações anteriormente reveladas foi demosntrado na construção das xilanases variantes combinadas que possuem uma condição ótima de temperatura mais elevada e atividade ótima, como descrito abaixo.
As mutações N10H, Y27M e N29L foram mostradas como aumentando a capacidade termofílica de TrX na forma do mutante TrX-10H-27M-29L (TrXL-HML; vide a patente dos Estados Unidos no. 5.759.840). A incorpoação de mutações S40H, K58R e S99C/Y118C em TrX-10H-27M-29L criou a xilanase variante TrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C, com aperfeiçoamento adicional em atividade enzimática em temepraturas mais elevadas (figura 5).
As mutações N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A e 1129E também foram mostradas como aumentando a capacidade termofílica de TrX (TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E mutante; vide WO 01/92487) . A incorporação de mutações S40H, K58R e S99C/Y118C em TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A- 129E criou as xilanases variantes TrX-10H-27M-29L-40R-58R- 75A-99C-118C, TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E e TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, mostrando atividade enzimática aumetnada em temperaturas mais elevadas (figuras 6 e 8).
A adição de uma mutação NllD criou xilanase modificda TrX-10H-llD-27M-2 9L-58R-7 5A-99C-105H-118C-125A- 129E (figuras 6, 7 e 8) . Uma série de mutantes baseados nessa xilanase contendo outra mutação na posição 4 0 foi construída para determinar aqueles resíduos de aminoácidos que aumentam a capacidade termofílica da enzima. Mutações diferentes na posição 40 (S40C, F, R, Υ, A ou T) foram introduzidas para criar sete novas xilanases mutantes: TrX- IOH-IlD-27M- 29L-40X-5 8R-75A-99C-105H-118C-125A-129E (onde X é A, C, F, H, R, Y ou T) . Similar a xilanases TrX-40H e TrX-4OH-99C-118C, com um número menor de mutações, a introdução de mutações S4 0H ou S4 0R aperfeiçoou moderadamente a atividade relativa das xilanases variantes resultantes em uma temperatura mais elevada em comparação com a enzima de origem (figuras 6, 7 e 8) . Outras mutações como S40C, S4 0F e S4 0Y também apresentaram o mesmo efeito de intensificação (figura 7) , enquanto S40T e S40A não mostraram nenhum tal efeito de intensificação sobre o perfil de temperatura/atividade (figura 7).
O efeito positivo sobre a capacidade termofílica das xilanases da família 11 através da mutação dee Ser 4 0 em Cys, Phe, Tyr, His ou Arg não foi descrito anteriormente. Nenhuma xilanase da Família 11 conhecida possui o resíduo Cys, Phe, Tyr ou His na posição 40. O resíduo Arg, embora presente no Thermomyces lanuginosus termofílico Xyn (figura 1) , também existe no Steptomyces lividan mesofílico Xln B. Outra mutação, Q52C, foi introduzida em TrX-IOH- 11D-27M-29L-40H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E. A xilanase mutante resultante TrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E foi capaz de reter atividade relativamente significaivamente mais elevda em 80 e 85°C, em comparação com a enzima de origem (figuras 6, 7 e 8) . Nenhuma xilanase de Família 11 possui o resíduo Cys na posição 52.
As mutações H144R e Q161R foram anteriormente 10 mostradas como aumentando a condição ótima de pH de xilanase TrX-IOH-11D-27M-29L-75A-105H-118C-125A-129E-144R- 161R (Trx-HDML-AH-118C-AE-RR; WO 03/046169). A adição de mutações S40R, K58R e S99C resultou na xilanase mutante TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E- 144R-161R, que retém maior atividade em temepraturas mais elevadas de 80 e 85°C (figura 9).
Os resultados acima demonstram que o efeito de intensificação das mutações S4 0X (onde X é C, F, H, R ou Υ), Q52C, K58R e S99C/Y118C sobre a capacidade termofílica da xilanase mutante não são somente complementares ou aditivos entre si, como também a outras mutações descritas na patente dos Estados Unidos número 5.759.840, WO 01/92487 e WO 03/046169.
A mutação 13IN foi introduzida na xilanase modificada TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C- 125A-129E. A xilanase mutante resultante TrX-10H-11D-27M- 29L-4 0R-5 8R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N mostrou uma condição ótima de temperatura levemente mais elevada do que TrX-10H-11D-27M-29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E (figura 14). Esses resultados demonstram que a mutação 13IN é compatível com a mutação de dissulfeto 99C/118C e outras mutações que aumentam a capacidade termofílica.
Aumento de capacidade alcalofílica de xilanase
O efeito da mutação de dissulfeto S99C/Y118C sobre o perfil de atividade/pH de xilanase é mostrado na figura 10. A xilanase mutante TrX-99C-118C manteve maior atividade nos valores de pH mais elevados de 6,5 - 7,5 em comparação com a xilanase natural TrX. A faixa de pH para xilanase TrX-99C-118C para manter 8 0% de atividade óptima é 4,8 - 7,0, que é mais ampla do que a faixa de 4,8 - 6,0 para a xilanase natural ou nativa TrX correspondente. Esses resultados demonstram a contribuição positiva das mutações 99C/118C sobre a capacidade alcalofílica da xilanase TrX.
Para identificar a causa direta de atividade mais elevada em pH mais elevado, xilanases com somente uma das mutações S99C/Y118C foram comparadas tanto com TrX-99C-118C como com xilanase natural TrX. Essas duas xilanases com uma mutação única, TrX99C ou TrX-118C, mostraram perfis de atividade/pH similares como TrX (figura 10). Isso confirmou que o aperfeiçoamento de atividade em pH mais elevado é um resultado de ligação de dissulfeto formada via uma comibnação de mutações S99C e Y118C, e não as mutações Cys únicas.
O efeito das mutações S4 0X (onde X é H ou R) , K58R e S99C/Y118C sobre o perfil de atividade/pH de xilanase também foi estudado em dois grupos de mutantes construídos como descrito acima.
O primeiro grupo foi derivado do mutante TrX-IOH- 27M-2 9L-75A-105H-125A-129E (vide WO 01/92487) . A xilanase mutante de dissulfeto TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C- 125Α-129Ε mostrou atividade aumentada de 75, 60 e 50% em valores de pH respectivos de 7,0, 7,5 w 8,0 (figura 11) versus a xilanase de origem, TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A- 129E, que mostrou somente 60, 40 e 22% de atividade aumetnada nesses valores de pH, respectivamente. Isso confirma a contribuição das mutações 99C/118C sobre a capacidade alcalofílica de xilanases com compatibilidade com as mutações alcaloficas e termofílicas anteriormente reveladas na técnica.
Outros membros desse grupo foram construídos com mutações adicionais nas posições 40 e 58, que também continham mutação de dissulfeto 99C/118C. Isso inclui TrX- 10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E, TrX-10H-IlD- 27M-2 9L-58R-75A-99C-105H-118C-12 5A-129E e TrX-10H-IlD-27M- 29L-4 0H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E. Entretanto, esses mutantes não mostraram nenhuma atividade apefeiçodada no pH mais elevado (figura 11) em comparação com a xilanase de origem TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E. Embora essas mutações termofílicas nas posições 40 e 58 não pudessem melhorar a capacidade alcalofílica da xilanse, não têm efeito adverso, desse modo demonstrando que são copmatíveis na construção de uma xilanase termofílica e alcalofílica com outras mutações vantajosas.
O efeito de intensificação das mutações S99C/Y118C foi adicionalmente demonstrado em um segundo grupo baseado em TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-125A-129E- 144R-161R, uma xilanase contendo duas mutações, H144R e Q161R, que aumetnaram com sucesso a condição ótima de pH de uma xilanase em WO 01/92487. Com as mutações 99C/118C, a 30 xilanase mutante TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E-144R-161R apresentou maior atividade em pH mais elevado do que sua TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E- 144R-161R de origem (figura 12) . Também teve desempenho melhor do que outra xilanase, TrX-10H-11D-27M-29L-75A-105H- 116G-118C-125A-129E-144R-161R (figura 12), uma xilanase mutante que mostrou o perfil de atividade/ph mais aperfeiçoado entre xilanases mutantes em WO 03/046169. Esse é outro exemplo não limitador que demonstra a comptabilidade das mutações 99C/118C com outras mutações alcalofIlicas.
O efeito da mutação 13IN sobre o perfil de atividade/pH da xilanase mutante TrX-10H-llD-27M-29L-40R- 58R-75A-99C-105H-118C-125Ά-12 9E também foi investigado. Como mostrado nas figuras 15 e 16, a xilanase modificada TrX-10H-11D-27M-29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E-
13IN teve uma condição ótima de pH levemente mais ampla sobre tanto folhosa (figura 15) como madeira resinosa (figura 16) do que TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E. Esse é ainda outro exemplo não limitador que demonstra a compatibilidade das mutações 99C/118C com outras mutações que aumentam a capacidade alcalof1Iica.
Aximento da termoestabilidade de xilanase A termoestabilidade da xilanase mutante foi comparada via incubação na ausência de substrato em diferentes temperaturas. Após 3 0 minutos, a atividade residual da xilanase foi determinada através de um ensaio padrão com xilano solúvel como substrato.
O efeito das mutações 99C/118C sobre a termoestabilidade de xilanase foi determinado através do estudo coparativo do mutante TrX-99C-118C e TrX natural. Após incubação em temperaturas mais elevadas por 3 0 minutos, o primiero reteve maior atividade residual do que o último (figura 13).
A T50 foi determinada. Para a xilanase de dissulfeto TrX-99C-118C, a T50 foi de 58°C, como comparado com 51°C para a xilanase natural TrX. Isso representou um aumento na termoestabilidade, como medido pela "T50", em aproximadamente 7°C através da introdução das mutações 99C/118C.
A termoestabilidade de xilanases modificadas contendo as mutações 99C/118C em combinação com mutações adicionais também foi testada e comparada com TrX-10H-27M- 29L. Como mostrado na figura 17, tanto TrX-10H-llD-27M-29L- 4OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-13IN como TrX-IOH-IlD- 27M-2 9L-4 OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E apresenta termoestabilidade superior em relação a TrX-10H-27M-29L.
Em resumo, xilanases mutantes termofílicas, alcalofílicas e/ou termoestáveis aperfeiçoadas da invenção compreendem resíduos de cistelna nas posições 99 e 118. A xilanase modificada pode compreender ainda uma ou mais de uma das seguintes substituições de aminoácido:
(i) um aminoácido substituído na posição 5 8 como um aminoácido básico, incluindo, porém não limitado a Arg;
(ii) um aminoácido substituído na posição 40, incluindo, porém não limitado a, um aminoácido selecionado entre Arg, Cys, Phe, His e Tyr;
(iii) substituiçõtes de aminoácido nas posições 10, 27 e 29, como aminoácido substituído básico na posição 10, incluindo, porém não limitado a His; um aminoácido substituído hidrofóbico na posição 27, incluindo, porém não limitado a, Met; e um aminoácido substituído hidrofóbico na posição 29, incluindo, porém não limitado a, Leu; e
(iv) qualquer combinação das mutações expostas em (i) a (iii).
Além disso, a xilanase modificada descrita acima pode compreender ainda uma ou mais de uma das seguintes substituições de aminoácido:
(v) substituições nas posições 75 e 125 como aminoácidos substituídos não polares, incluindo, porém não limiados a, Ala ou Gly; uma substituição de aminoácido na posição 105 como um aminoácido básico substituído, incluindo, porém não limitado a His, Arg ou Lys; e/ou uma substituição de aminoácido na posição 129 como um aminoácido acídico substituído incluindo, porém não limitado a Asp ou Glu;
(vi) uma substituição de aminoácido na posição 52, incluindo, porém não limitado a Cys;
(vii) uma substituição de aminoácido na posição 11, como um aminoácido acídico, incluindo, porém não limitado a Asp;
(viii) uma substiuição de aminoácido na posição 144 e/161, incluindo, porém não limitado a um aminoácido básico como Arg;
(ix) uma substituição de aminoácido na posição 131 para um Asn; e
(x) qualuqer combinação das mutações descritas em (v) a (viii).
Exemplos não limitadores de mutantes de xilanase compreendendo uma ligação de dissulfeto 99C/118C em combinação com as substituições de aminoácido listadas acima são dados na tabela 2.
Também está compreendido no escopo da invenção introduzir uma ou mais de uma das substituições de aminoácido de (v) a (x) em uma xilanase modificda compreendendo uma mutação 99C/118C e que não contém as mutações expostas em (i) a (iv). Além disso, a xilanasae modificda pode compreender substituições de aminoácido não listadas acima em combinação com as mutações 99C/118C. Além disso, as mutações 99C/118C podem ser também introduzidas em qualuqer um dos mutantes de xilanase descritos na patente dos Estados Unidos número 5.759.840, WO 03/046169, WO 01/92487 ou WO 2005/093072, que são incorporados auqi a título de referência.
Será também reconhecido que se uma das duas posições, 99 ou 118, já tiver um resíduo Cys, a criação de uma ligação de dissulfeto 99C/118C poderia ser também produzida por uma substituição de um aminoácido somente em uma das posições 99 ou 118 para Cys. Desse modo, a presente invenção refere-se a uma xilanase modificda compreendendo resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 para formar uma ligação de dissulfeto 99C/118C, a xilanase produzida pela substituição de um aminoácido na posição 99, 118 ou ambas as posições 99 e 118 com uma cisteína.
Há exemplos naturais de xilanases Apergillus com resíduos de cisteína nas posições que correspondem às posições 99 e 118 de Trichoderma reesei xilanase II, por exemplo, A. niger, var. awamori; A. kawachii XynC; A. tubigensis (figura 1) . Entretanto, como a TrX natural, as xilanases Aspergillus podem funcionar somente em baixa temperatura (Fushinobu e outros, 1998) e pH acídico (Krengerl e Dijkstra, 1996), e são somente estáveis até 40°C (Ito e outros, 1992, Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:906-912). Portanto, a existência de resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 nessas xilanases Aspergillus mesofilicas não sugere que a criação de uma ligação de dissulfeto em uma xilanase aumentará sua atividade em temepraturas elevadas. Além disso, essas xilanases Aspergillus podem funcionar somente em valores pH acídicos, com um pH ótimo acídico em torno de 2-3 (Krengel e Dijkstra, 1996; Fushinobu e outros, 1998, Esteves e outros, 2004; Hakulien e outros, 2003). Portanto não sugere que a criação de uma ligação de dissulfeto similar em outra xilanase acidofílica, incluindo, porém não limitada a, TrX aumentará sua atividade em pH mais elevado. Além disso, mutações de dissulfeto são raramente observadas como contribuindo para a capacidade alcalofílica de uma enzima.
Portanto, a xilanase modificada da presente invenção pode ser derivada de uma xilanase de Família 11, incluindo porém não limitado a uma xilanase Trichoderma reesei. A xilanase modificada preferivelmente não é xilanase Aspsergillus nativa. Entretanto, a xilanase Aspergillus, compreendendo resíduos de cisteína de ocorrência natural nas posições 99 e 118 (numeração TrXII) pode ser uitlizada para derivar uma xilanase modificda compreendendo mutações adicionais, como descrito aqui, para aumentar as prorpiedades de capacidade termofílica e capacidade alcalofílica da xilanase Aspergillus.
Além disso, um procedimento de computação denominado MODIP (Sowdhamini e outros, 1989; Dani e outros, 2003), que foi estabelecido para auxiliar na elaboração de uma ponte de dissulfeto para esabilizar proteína, previu que qualuqer ligação de dissulfeto de estabilização deve encerrar um loop, isto é, o número de resíduos entre as duas cisteínas, de 25 resíduos de aminoácidos ou mais. Outr estudo relacionado também concluiu que há pouca estabilização se o comprimento de loop for maior do que 25 resíduos. A ligação de dissulfeto 99C/118C da presente invenção, com um loop de 19 resíduos, ê consideravelmente menor do que o mínimo previsto de 25 resíduos para um aligação de dissulfeto de estabilização. 0 menor loop de qualuer ligação de dissulfeto de estabilização reportado em uma xilanase de família 11 é uma ligação de dissulfeto de 2/28 com um comprimento de loop de 26 resíduos, criado na extremidade-N de TrX (Fenel e outros, 2004) . Essa ligação de dissulfeto 2/28 não aumentou a atividade de xilanase em faixa de pH mais elevda.
A descrição acima não pretende de modo algum limitar a invenção reivindicada. Além disso, a combinação discutida de caracterísicas poderia não ser absolutamente necesária para a solução inventiva.
A presente invenção será adicionalmente ilustarda nos exemplos a seguir. Entretanto, deve ser entendido que esses exmeplos são somente para fins ilustrativos e não devem ser uitlizados de modo algum para limitar o escopo da presente invenção.
EXEMPLOS
A construção de xilanases variantes nos exemplos exigiu o uso de um plasmídeo precursor que continha somente um gene de xilanase parcial (Tabela 4) . O plasmídeo precursor é incapaz de expressar uma xilanase. A síntese do plasmídeo precursor foi descrita anteriormente.
TABELA 4: Plasmídeo contendo um gene de xilanase parcial para a construção de novas xilanases mutantes
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aWO 01/92487 (Sung)
As novas xilanases variantes construídas nos exemplos a seguir foram também compardas com várias xilanases mutantes conhecidas, selecionadas. Os plasmídeos que expressaram essas xilanases mutantes anteriormente conhecidas são descritos na tabela 5.
TABELA 5: plasmídeos que expressam xilanase reportados na técnica
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a WO 03/04619 (Sung)
b patente dos Estados Unidos no. 5.759.840 (Sung
e outros)
c WO 01/92487 (Sung)
EXEMPLO 1: Construção de xilanases mutantes Trichoderma reesei
Métodos de DNA recombinante básicos como preparação de plasmídeo, digestão de enzima de restrição, reação de cadeia de polimerase, fosforilação de oligonucleotídeos, ligação, transformação e hibridização de DNA foram executados de acordo com protocolos bem estabelecidos familiares para aqueles versados na técnica (por exemplo, Sung e outros, 1986), ou conforme recomendado pelo fabricante das enzimas ou do kit. Os tampões para muitas enzimas foram fornecidos como parte de um kit ou feitos de acordo com as instruções do fabricante. Enzimas de restrição, polinucleotídeo cinase T4 e ligase de DNA T4 foram adquiridos da New England BioLabs Ltd., Mississauga, Ontário. O kit de reagente PCR GeneAmp foi adquirido da Perkin-Elmer. Um plasmídeo precursor, pXYbc, que é um plasmídeo do tipo pUC com um gene de xilanase Bacillus circulans inserido, foi previamente preparado e publicado (Sung e outros, 1993; Campbell e outros, patente dos Estados Unidos no. 5.405.769). Uma cepa E. coli comumente utilizada, HBlOl (Clonetech Lab., Palo Alto, CA), foi utilizada como um hospedeiro de expressão e transformação para todas as construções de gene. Xilano de vidoeiro e R- D-Xilano azul brilhante Remazol foram adquiridos através de Sigma (St. Louis, MO). Hidrazida de ácido hidróxi benzóico (HBAH) foi adquirido da Aldrich. Oligonucleotídeos foram preparados com um sintetizador de DNA da APPLIED BIOSYSTEM (modelo 38OB). Todos os ensaios enzimáticos de xilanase foram executados em um banho de água em circulação coberto (Haake tipo F 4391) e mantidos em uma faixa de temperatura de ± 0,1°C.
1.1 Construção de plasmídeo precursor pTrX abrigando TrX sintético (SEQ ID NO: 40)
O plasmídeo precursor pTrX para mutações reveladas abaixo foi descrito (Sung e outros, 19 95) . Esse plasmídeo foi derivado de um plasmídeo pUC119 com uma seqüência de nucleotídeo sintético que codifica uma xilanase de Trichoderma reesei (TrX; figura 2) . A expressão dessa xilanase e de outras xilanases mutantes subseqüentemente descritas está sob o controle do promotor Z Iac do plasmídeo pUC. A montagem total do gene de xilanase Trichoderma exigiu dois estágios, inicialmente envolvendo a ligação da região 92-190, a seguir seguido pela região 1-92 (numeração TrX) . 0 protocolo para a construção desse gene é de rotina e idêntico ao procedimento publicado padrão para muitos outros genes. O protocolo requer fosforilação enzimática de oligonucleotídeos sintéticos de sobreposição que codifica uma xilanase. Isso é seguido por sua ligação em um plasmídeo apropriadamente cortado.
Para a construção de TrX (92-190) , os dez oligonucleotídeos de sobreposição seguintes (vide a figura 2) foram elaborados:
XyTv-101, SEQ ID N0:30;
XyTv-102, SEQ ID NO:31;
TrX-103, SEQ ID NO:32;
XyTv-104, SEQID NO:33;
XyTv-105, SEQID NO:34;
XyTv-106, SEQID NO:39;
XyTv-107, SEQ ID NO:38;
TrX-108, SEQID NO:37,
XyTv-109, SEQ DD NO:36
XyTv-110, SEQ ID NO: 35.
Esses mutantes foram elaborados com uma freqüência de uso de códon que imita aquela de E. coli. As exrtremidades coesas SalI e BglII de dois oligonucleotídeos terminais psermitiram a ligação enzimática dos dez fragmenots no plasmídeo linearizado pXYbc. Os dez oligonucleotídeos (50 pmol, 1 μΙ. para cada) codificando a região TrX(92-190) de xilanase Trichoderma foram fosforilados em uma mistura contendo 10 X tampão de cinase padrão (0,4 μL,) , 1 mM ATP (4 μL,) , T4 DNA cinase (5 unidades) e água (3 μL,) . Reações de fosforilação foram realizadas por 1 hora a 3 7 °C. As soluções foram então combinadas e aquecidas a 70°C por 10 minutos. Após ser resfriada lentamente à temperatura ambinete, as soluções combinadas foram adicionadas a uma mistura de 4 mM ATP (3,5 μL) , plasmídeo linearizado SalI/BglII pXYbc (0,1 pmol), e ligase DNA T4 (3,5 μΙΟ e incubadas a 12°C por 20 h.
Alíquotas da mistura de ligação foram uitlizadas para tarsnformar E. coli HBlOl em em placas YT (8g de extrato de levedo, 5g de bacto-triptona, 5 g NaCl, 15 g de ágar em 1 L de água) contendo ampicilina (100 mg/L).
Para a preparação de uma sonda de hibridização, um dos oligonucleotídeos, por exemplo, XyTv-110 (10 pmol, 1 μL) foi fosforilado com 32P-ATP (10 pmol, 3 L,) uitlizando T4 DNA cinase (1 μL) , tampão de cinase IOX (1 μL) e água (4 μL) a 37°C por 1h.
Trasnformantes foram selecionados aleatoriamente para análise de hibridização. Colônias foram cultivadas em placas YT com ampicilina durante a noite e transferidas para sobre filtros de náilon. Foram então desnaturadas com 0,5 N NaOH - 1.5 M NaCl (10 minutos) e neutralizadas com 0.5 N Tris-HCl (pH 7,0) - 1.5 M NaCl (10 minutos). Após irradiação ultravioleta a 254 nm por 8 minutos, os filtros foram lavados com 6X SSC - 0,05% Triton X-100 por 30 minutos. Resíduos de células foram raspados totalmente. Após outro período de 30 minutos em solução nova, filtros duplicatas foram transferidos individualmente para misturas separadas de 6X SSC -1% de sulfato de dextrano - 0,05% Triton X-100 - 1X fluido de hibridização de Denhardt. A sonda rotulada 32P foi adicionada ao filtro. Após 16 h a 45 °C, o filtro foi lavado duas vezes com 6X SSC - 0,05% Triton X-100 em temperatura ambinete por 5 minutos e então a 65°C por 30 minutos. Clones positivamente hibridizados com o plasmídeo intermediário pBcX-TrX foram identificados por análise auto-radiográfica.
O protocolo acima, envolvendo fosforilação enzimática de oligonucleotídeos sintéticos em sobreposição e ligação em um plasmídeo linearizado, foi empreagdo na montagem da região TrX (1-92) e na mutagênese de cassete para a geração subsequente de outras xinalases mutantes descritas na presente invenção.
Para a montagem da região TrX (1-92; numeração TrX) para completar o gene de xilanase II Trichoderma reesei de copmrimento total (TrX), o plasmídeo intermediário pBcX-TrX foi linearizado por endonucleases NheI e KpnI para liberar a inserção de DNA para BcX(1-83). Com extremidades coesas NheI e KpnI, oito oligonucleotídeos de sobreposição:
TrX-I, SEQ ED NO:22 XyT v-2, SEQID NO:23 TrX-3, SEQID NO:24 XyT v-4, SEQID NO:25 XyTv-5, SEQID NO:29 TrX-6, SEQID NO:28 XyTv-7, SEQID NO:27 TrX-8 SEQID NO:26 codificando a seqüência TrX(1-91) foram ligados no plasmídeo linearizado pBcX-TrX (figura 2) através do protocolo descrito acima. 0 novo plasmídeo pTrX, portanto, abrigou um gene TrX sintético (SEQ ID NO:40).
Todos os genes de xilanase mutantes descritos abaixo foram construídos através do método de mutagênese de cassete. O protocolo para mutagênese de cassete era idêntico aquele descrito para montagem de gene descrita acima. Genericamente, mutagênese de cassete envolveu (i) fosforilação enzimática de oligonucleotídeos sintéticos de sobreposição, (ii) ligação de oligonucleotídeos sintéticos com um plasmídeo linearizado, (iii) transformação do plasmídeo em células competentes HBlOl de E. coli, (iv) identificação de transformantes mutantes via hibridização com o oligonucleotídeo rotulado, e (v) confirmação da mutação através de seqüenciamento de nucleotídeo dideóxi.
1.2 Construção de plasmídeo pOmp-TrX abrigando a seqüência líder de secreção da proteína de membrana externa A (SEQ ID Nos: 41 e 42)
Seguindo o protocolo experimental de 1.1, os oligonucleotídeos Omp-TX-I, -2, -3 e -4, que codificam a seqüência líder de secreção da proteína de membrana externa de E. coli Aea região TrX (1-7) reconstruída, foram ligados ao plasmídeo cortado Nhel/PinAI pTrX. 0 plasmídeo resultante pOmp-TrX pode produzir a xilanase funcional via expressão e secreção.
Omp-TX-I
[OmpA 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
KKTAIAIAVALAG
5'-CT AGC AAG AAG ACA GCA ATA GCA ATC GCT GTG GCA TTA GICC GGC _G TTC TTC TGT CGT TAT CGT TAG ICGA CAC CGT AAT C GG CCG
Nhel Omp-TX-4 Orap-TX-3
Omp-TX-2 TrX sequence 15 16 17 18 19 20 21] [ 1 2 3 4 5 6 7 FATVAQAQTIQPGT
TTT GCG ACC GTT GCT CAG GCC CAG ACC ATA CAA CCA GGA A (SEQ ID NO: 41) AAA CGC TGG CAA CGA GTC CGG GTC TGG TAT GTT GGT CCT TGG CC (SEQ ID NO: 42) PinAI
1.3 Construção do plasmídeo precursor pOmp-TrX (1-113)
O plasmídeo pOmp-TrX-(1-113) compreende a seqüência de aminoácido 1-113 de TrX e não pode expressar uma xilanase ativa. Tais transformantes foram confirmados pela ausência de uma zona de limpeza ou halo em torno das colônias de transformante nas placas de xilano azul.
O plasmídeo foi construído via (i) remoção da seqüência de codificação TrX(114-190) de plasmídeo pOmp-TrX através de corte com enzimas de restrição BamHI e Bg1II, (ii) ligação das extremidades coesas idênticas do plasmídeo linearizado, (iii) transformação nas células competentes HB101 de E.coli seguido por revestimento na placa YT (contendo 5 g de extrato de levedo, 3 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl, 15 g de ágar em 1 L de água, 1 g de R-D-xilano azul brilhante Remazol) e ampicilina (100 mg/L), (iv) identificação dos transformantes mutantes através da perda de atividade de xilanase (ausência de uma zona de limpeza ou halo em torno das colônias na placa de xilano azul durante a noite a 40°C), e (v) confirmação da mutação através de seqüenciamento de nucleotídeo dideóxi. O protocolo para cada uma dessas etapas foi similar àquele para montagem de genes descrita acima.
1.4 Construção do plasmídeo precursor pTrX-HML
A construção desse plasmídeo precursor pTrX-HML foi descrita em detalhe na patente dos Estados Unidos número 5.759.840 (vide o Exemplo IN, aqui incorporado a título de referência; plasmídeo denominado pNI-TX13). TrX- HML compreende a xilanase TrX nativa, juntamente com três mutações em NlOH (Asn na posição 10 é substituído com His) , Y27M e N2 9L. Os trinta primeiros aminoácidos da seqüência compreendendo NlOHf Y27M e N29L são mostrados abaixo.
TrX 1 2 3 4 5 6 7 8 aminoácido Q T I Q P G T G
5' - CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ACC GGT 3' -G ATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCT TGG CCA Nhel PinAI
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 YHNGYFYSYWNDGHGG TAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAT GGC CAT GGA GGC ATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTA CCG GTA CCT CCG 25 26 27 28 29 30
VTMTLG GTC ACA ATG ACT CTG GGG (SEQ ID NO: 43) CAG TGT TAC TGA GAC CCC (SEQ ID NO: 44)
1.5 Construção dos plasmídeos precursores pOmp- TrX-HML (1-113) e pOmp-TrX-HDML (1-113)
Plasmídeos pOmp-TrX-HML (1-113) e pOmp-TrX-HDML (1-113) compreendem a seqüência de aminoácidos 1-113 de TrX e não podem expressar uma xilanase ativa. Tais transformantes são confirmados pela ausência de uma zona de limpeza ou halo em torno das colônias de transformante em placas de xilano azul.
Na construção de plasmídeos pOmp-TrX-HML (1-113), PCR foi utilizado para gerar uma região de codificação de fragmento de DNA (extremidade 8-C) com os iniciadores de PCR TX-10H-1 (SEQ ID NO: 45) e TX-Cl, e gabarito pTrX-HML (Tabela 5) . O corte do produto de PCR com enzimas de restrição PinAl e BamHI forneceu a seqüência (8-113).
Na construção do plasmídeo pOmp-TrX-HDML (1-113) , PCR foi repetido com o iniciador TX-10H11D-1 (SEQ ID NO: 46, que foi descrito em WO 03/046169) , substituindo o TX- IOH-1, para gerar a seqüência (extremidade 8-C). O corte do produto PCR com as enzimas de restrição, PinAI e BamHI, forneceu a seqüência (8-113).
TX-10H-1 (SEQ ID NO: 45) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 GTGYHNGYFYSYW 1 -GGA ACC GGT TAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG PinAI
TX-10H11D-1 (SEQ ID NO:4 6 ) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 GTGYHDGYFYSYW 5' -GGA ACC GGT TAC CAC GAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG PinAI
O iniciador PCR inverso TX-Cl compreendeu: TX-Cl (SEQ ID NO: 47) 183 184 185 186 187 188 189 190 ter GSASITVS CCA AGG CGA TCA TAA TGT CAC TCG ATT TCT AGA ACT TCG AAC CC-5' BglI HindIII
O gabarito PCR apropriado, pTRX-HML (Tabela 5), iniciadores e as enzimas de restrição para cortar a extremidade dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 6).
Tabela 6
<table>table see original document page 50</column></row><table>
Os produtos PCR cortados (a) e (b) (Tabela 6) foram ligados em um plasmídeo linearizado PinAI/BglII pOmp- TrX (descrito em 1.2) para gerar plasmídeos pOmp-TrX-(l- 113) e pOmp-TrX-HDML (1-113) respectivamente.
Etapas subseqüentes envolveram (i) transformação nas células competentes HBlOl de E. coli, seguido por revestimento em uma placa YT (contendo 5 g de extrato de levedo, 3 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl, 15 g de ágar em 1 L de água, Ig de R-D-xilano de azul brilhante Remazol) e ampicilina (100 mg/L) , (ii) identificação dos transformantes mutantes através da perda de atividade de xilanase (ausência de uma zona de limpeza ou halo em torno das colônias na placa de xilano azul durante a noite a 40°C), e (iii) confirmação da mutação através de seqüenciamento de nucleotideo de dideóxi. O protocolo para cada uma dessas etapas foi similar àquele para a construção de plasmídeo pOmp-TrX (1-113) descrito em 1.3.
1.6 Construção de plasmídeo pTrX-58R
O plasmídeo pTrX-58R, com a mutação adicional K58R comparada com o plasmídeo precursor pTrX, foi preparado.
PCR foi utilizado para gerar um fragmento de DNA que codifica a região (54-190) com a mutação K58R. O
iniciador de PCR com a mutação K58R (em tipo em negrito) é mostrado abaixo.
TX-58R-1 (SEQ ID NO:48 )
53 54 55 56 57 58 59 60 61 PGTKNRVIN 5 ' - CAA CCC GGG ACC AAA AAT AGG GTG ATC AAC Xmal
Com o gabarito PCR apropriado pTrX (Tabela 5), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 7).
Tabela 7
<table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table>
O produto PCR cortado (c) (Tabela 7) foi ligado em um plasmídeo linearizado Xmal/HindIII pTrX(1-113) para gerar o plasmídeo pTrX-58R.
1.7 Construção de plasmídeos pTrX-40H e pTrX-40R
Plasmídeos pTrX-40H e pTrX-40R; com as mutações adicionais S4-H e S4 0R comparadas com o plasmídeo precursor pTrX, foram preparados.
PCR foi utilizado para gerar uma região de codificação de fragmento de DNA (3 9-190) com a mutação S4 0H e S40R. Os iniciadores PCR com as mutações 40H e 40R (em tipo em negrito) são mostrados abaixo.
TX-40H-1 (SEQ ID NO: 49) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
WHNSGNFVGG
5 ' - GTC AAT TGG CAT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
TX-40R-1 (SEQ ID NO:50) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
WRNSGNFVGG
5 ' - GTC AAT TGG CGT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
Com o gabarito PCR apropriado pTrX, os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 8).
Tabela 8
<table>table see original document page 52</column></row><table> Os produtos PCR cortados (d) e (e) (Tabela 8) foram ligados em um plasmídeo linearizado Muni/HindIII pTrX (1-113) para gerar os plasmídeos pTrX-40H e pTrX-40R.
1.8 Construção de plasmídeo pTrX-99C
Plasmídeo pTrX-99C, com a mutação adicional S99C não presente no plasmídeo precursor pTrX, foi preparado.
PCR foi utilizado para gerar uma região de codificação de fragmento de DNA (95-190) com a mutação S99C.
Os iniciadores PCR com mutação (em tipo em negrito) são mostrados abaixo.
TX-99C-1 (SEQ ID NO:51) 95 96 97 98 99 100 101 T Y N P C T G
51 - TTC GGT ACC TAC AAT CCG TGT ACC GGC Kpn I
Com o gabarito PCR apropriado, pTrX, os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 9).
Tabela 9
<table>table see original document page 53</column></row><table>
O produto PCR cortado (f) (Tabela 9) foi ligado em um plasmídeo linearizado Kpnl/HindIII pTrX(1-113) (Tabela 4) para gerar o plasmídeo pTrX-99C.
1.9 Construção de plasmídeo pOmpTrX-99C-118C
O plasmídeo pOmpTrX-99C-118C, com as mutações adicionais S99C e Y118C e uma seqüência de sinal principal de secreção não presente no plasmídeo precursor pTrX, foi preparado.
PCR foi utilizado para gerar uma região de codificação de fragmento de DNA (95-190) com a mutação S99C e Y118C.
Com o gabarito PCR apropriado pTrX-118C (vide a tabela 5, WO 03/046169), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 10).
Tabela 10
<table>table see original document page 54</column></row><table>
O produto PCR cortado (g) (Tabela 10) foi ligado em um plasmídeo linearizado Kpnl/HindIII pOmpTrX (1-113), (descrito em 1.3) para gerar o plasmídeo pOmpTrX-99C-118C.
1.10 Construção de plasmídeo pOmpTrX-58R-99C-118C
O plasmídeo pOmpTrX-58R-99C-118C, com mutações adicionais de K58R, S99C e Y118C, e uma seqüência de sinal principal de secreção, comparado com o plasmídeo precursor pTrX, foi preparado.
PCR foi utilizado para gerar um fragmento de DNA que codifica a região (54-190) com as mutações K58R, S99C e Y118C.
Com o gabarito PCR apropriado, pOmpTrX-99C-118C (descrito em 1.9), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 11).
Tabela 11
<table>table see original document page 54</column></row><table> <table>table see original document page 55</column></row><table>
O produto PCR cortado (h) (Tabela 11) foi ligado em um plasmídeo linearizado Xmal/HindIII pOmpTrX(1-113) (descrito em 1.3) para gerar o plasmídeo pOmpTrX-58R-99C- 118C.
1.11 Construção de plasmideos pOmpTrX-4OH-99C- 118C e pOmpTrX-40H-58R-99C-118C
O plasmídeo pOmpTrX-40H-99C-118C, com mutações adicionais de S40H, S99C e Y118C, e uma seqüência de sinal principal de secreção, comparado com plasmídeo precursor pTrX, foi preparado. O plasmídeo pOmpTrX-40H-58R-99C-118C tem uma mutação extra de K58R.
PCR foi utilizado para gerar fragmentos de DNA codificando a região (39-190) com as mutações S40H, S99C e Y118C, com ou sem a mutação K58R, como determinado pelos gabaritos de plasmídeo apropriados.
Para a criação de pOmpTrX-40H-99C-118C com o gabarito PCR apropriado, pOmpTrX-99C-118C (descrito em 1.9), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 12).
Tabela 12
<table>table see original document page 55</column></row><table>
Para a criação de pOmpTrX-40H-58R-99C-118C com o gabarito PCR apropriado, pOmpTrX-58R-99C-118C (descrito em 1.10), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 13).
Tabela 13
<table>table see original document page 56</column></row><table>
O produto PCR cortado (i) (Tabela 12) e (j) (tabela 13) foi ligado em um plasmídeo linearizado MunI/HindlII, pOmpTrX (1-113) (descrito em 1.3), para gerar plasmídeos pOmpTrX-40H-99C-118C e pOmpTrX-40H-58R-99C-118C, respectivamente.
1.12 Construção de plasmídeo pOmpTrX-HML-4QR-58R- 99C-118C
O plasmídeo pOmpTrX-HML-40R-58R-99C-118C, com mutações adicionais de S40R, K58R, S99C e Y118C, e uma seqüência de sinal principal de secreção, comparado com o plasmídeo precursor pTrX-HML, foi produzido.
Com o gabarito apropriado, pOmpTrX-58R-9 9 C-118C (descrito em 1.10), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 14).
Tabela 14
<table>table see original document page 56</column></row><table>
O produto PCR cortado (k) (Tabela 14) foi ligado em um plasmídeo linearizado Muni/HindIII pOmpTrX-HML (1- 113) (descrito em 1.5) para gerar plasmídeo pOmpTrX-10H- 27M-29L-40R-58R-99C-118C.
1.13 Construção de plasmídeo pQmpTrX-10H-27M-29L- 4 0R-58R-75A-99C-118C
O plasmídeo pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-75A-99C- 118C, com a mutação adicional S75A comparado com o plasmídeo pOmpTrX-10H-27M-29L-40R-58R-99C-118C, foi preparado. Os iniciadores PCR com mutação S75A (em tipo em negrito) são mostrados abaixo.
TX-75A-1 (SEQ ID NO:52)
69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 NGNSYLAVYGWSR 5' -T GGG AAT TCA TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG TCT AG EcoRI
Com os gabaritos PCR apropriados pOmpTrX-10H-27M-
29L-4 0R-58R-99C-118C (descrito em 1.12) para ambos os produtos PCR (1) e (m) , os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 15).
Tabela 15
<table>table see original document page 57</column></row><table>
Os produtos PCR cortados (1 em) (Tabela 15) foram ligados em um plasmídeo linearizado PinAI/HindIII, pOmpTrX(1-113) (descrito em 1.3), para gerar o plasmídeo pOmpTrX-IOH-27M-2 9L-4 OR-5 8R-75A-99C-118C.
1.14 Construção de plasmídeo pQmpTrX-10H-27M-29L- 75A-99C-105H-118C-125A-12 9E
O plasmídeo pOmpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H- 118C-125A-129E foi preparado através de duas reações PCR, envolvendo os seguintes iniciadores:
TX-118 C-1 (SEQ ID NO:53) 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 D G S V Y D I C R T Q R 5'-GAC GGA TCC GTA TAT GAT ATC TGC CGT ACC CAA CGC BamHI
TX-99C105H-Ir (SEQ ID NO:54) 114 113 112 111 110 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 V S G D S T V E G H K T A G T 5' -TAC GGA TCC ATC ACT AGT GAC TTC GCC GTG TTT TGT GGC GCC GGT BamHI KasI
99 98 97 96 C P N Y ACA CGG ATT GTA Kasi
Com plasmídeo pTrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E como gabarito PCR (Tabela 5) , um produto PCR (n) foi sintetizado para codificar a seqüência (8-112), e outro produto PCR (o) para codificar a região (113-190) .
Com o plasmídeo de gabarito PCR apropriado pTrX- 10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E (Tabela 5), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 16).
Tabela 16
<table>table see original document page 58</column></row><table>
Os produtos PCR cortados (n e o) (Tabela 16) foram ligados em um plasmídeo linearizado PinAI/HindIII, pOmpTrX-HML (1-113) (descrito em 1.5) para gerar plasmídeo pOmpTrX-10H-2 7M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E.
1.15 Construção de plasmídeo pOmpTrX-10H-27M-29L- 58R-75Α-99C-105Η-118C-125Α-12 9Ε
O plasmídeo pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E, com uma mutação adicional K58R comparada com o plasmídeo precursor pC)mpTrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H- 118C-125A-129E (em 1.14), foi criado.
Com o gabarito PCR apropriado pOmpTrX-IOH-27M- 29L-75A-99C-105H-118C-12 5A-12 9E (em 1.14), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 17).
Tabela 17
<table>table see original document page 59</column></row><table>
O produto PCR cortado (p) (Tabela 17) foi ligado em um plasmídeo linearizado Xmal/HindIII pOmpTrX-HML (1- 113) (descrito em 1.5) para gerar o plasmídeo pOmpTrX-lOH- 2 7M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E.
1.16 Construção de plasmídeo pQmpTrX-10H-llD-27M- 29L-58R-75A-99C-105H-118C-12 5A-12 9E
O plasmídeo pOmpTrX-10H-llD-27M-29L-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E, com uma mutação NllD extra, foi preparado utilizando a mesma estratégia que para o plasmídeo pC>mpTrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A- 129E em 1.15.
O produto PCR cortado (p) (Tabela 17) que foi preparado para a construção de plasmídeo pC)mpTrX-10H-27M- 29L-58R-75A- 99C-105H-118C-125A-129E (em 1.15), foi ligado em um plasmídeo linearizado Xmal/HindIII pOmpTrX-HDML (1- 113) (descrito em 1.5) para gerar o plasmídeo pOmpTrX-IOH- IlD-2 7Μ-2 9L-58R-75Α-99C-105Η-118C-125Α-129Ε.
1.17 Construção de plasmídeo pQmpTrX-10H-llD-27M- 29L-4OX-5 8R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, onde X é C, F, H, R, Υ, A ou T
Os plasmídeos pOmpTrX-10H-llD-27M-29L-40X-58R- 75A-99C-105H-118C-125A-129E, onde X é C, F, Hf R, Υ, A ou T, foram preparados utilizando a mesma estratégia, com um iniciador PCR abrigando a mutação apropriada: TX-40C-1 (SEQ ID NO:55) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 WCNSGNFVGG 51 - GTC AAT TGG TGT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
TX-4OY-I (SEQ ID NO:56) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
WYNSGNFVGG 5'- GTC AAT TGG TAT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
TX-4OF-I (SEQ ID NO:57) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 WFNSGNFVGG
51 - GTC AAT TGG TTT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
TX-40T-1 (SEQ ID NO:58) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
W TNS G NFVGG 5' - GTC AAT TGG ACT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
TX-4 0A-1 (SEQ ID NO:59) 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
WAN S GN F VGG 5'- GTC AAT TGG GCT AAC TCC GGA AAC TTC GTA GGT GGA Mun I
TX-4OH-I e TX-40R-1 foram descritos em 1.8. Com o plasmídeo de gabarito PCR apropriado
pOmpTrX-10H-27M-29L-58R-7 5A-99C-105H-118C-125A-12 9E (descrito em 1.15), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 18).
Tabela 18
<table>table see original document page 61</column></row><table>
Os produtos PCR cortados (q, r, s, t, u, v e w) (Tabela 18) foram ligados em um plasmídeo linearizado MunI/HindIII (pOmpTrX-HDML (1-113) (descrito em 1.5) para gerar os plasmídeos pC)mpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-58R-75A- 99C-105H-118C-125A-129E, pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R- 75A-99C-105H-118C-125A-129E, pOmpTrX-10H-11D-27M-29L-40C- 58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, pOmpTrX-10H-11D-27M-29L- 40Y-58R-7 5A-99C-105H-118C-125A-12 9E, pOmpTrX-10H-11D-27M- 29L-40F-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E, pOmpTrX-10H-11D- 27M-29L-40T-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E e pOmpTrX-10H- 11D-27M-29L-40A-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E, respectivamente.
1.18 Construção de plasmídeo pOmpTrX-10H-11D-27M- 29L-40H-52C-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E.
O plasmídeo pC)mpTrX-10H-11D-27M-29L-40H-52C-58R- 75A-99C-105H-118C-125A-12 9E foi preparado através de ligação de duas seqüências PCR, a saber um fragmento linearizado PinAI/Xmal (8-53) e um fragmento linearizado Xmal/HindIII (54-190). A seqüência anterior foi sintetizada via um PCR com o seguinte iniciador abrigando a mutação Q52C:
TX-52C-lr (SEQ ID NO:60)
54 53 52 51 50 49 48 47 46 45 44 GPCWGKGGVFN
5'-GT CCC GGG ACA CCA ACC TTT TCC ACC TAC GAA GT Xmal
Com o plasmídeo de gabarito PCR apropriado, pOmpTrX-IOH-11D-27M-2 9L-4 0H-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E (descrito em 1.17), os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (Tabela 19).
Tabela 19
<table>table see original document page 62</column></row><table>
O fragmento (54-190) já foi preparado como o produto PCR cortado Xmal/HindIII (p) da tabela 17 em 1.15.
A ligação do fragmento cortado PinAI/Xmal (8-53) (x) (Tabela 19) e o fragmento cortado Xmal/HindIII (54-190) (p) (Tabela 17) no plasmídeo precursor linearizado PinAI/HindlII pOmp-TrX-(1-113) (descrito em 1.3), forneceu o novo plasmídeo pOmpTrX-10H-llD-27M-29L-40H-52C-58R-75A- 99C-105H-118C-12 5A-12 9E.
1.19 Construção do plasmídeo pQmpTrX-10H-llD-27M- 2 9L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-114R-161R O plasmídeo pOmpTrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A- 99C-105H-118C-125A-129E-114R-161R foi criado, que diferiu do plasmídeo pOmpTrX-10H-llD-27M-29L-40H-52C-58R-75A-99C- 105H-118C-12 5A-12 9E de 1.18 por duas mutações: H114R e Q161R.
Foi sintetizado via uma ligação de dois produtos PCR apropriadamente cortados. A primeira região de codificação de inserto (39-112) foi gerada através de um corte MunI/BamHI do produto PCR (r) já descrito na tabela 18 de 1.17.
0 segundo inserto que codifica a região (113-190) foi preparado via PCR com o plasmídeo de gabarito PCR apropriado pTrX-10H-2 7M-29L-75A-105H-125A-12 9E-114R-161R (WO 03/046169). Os iniciadores e as enzimas de restrição para cortar as extremidades dos produtos PCR são listados abaixo (tabela 20).
Tabela 20
<table>table see original document page 63</column></row><table>
Os dois produtos PCR apropriadamente cortados (y) (Tabela 20) e o corte MunI/BamHI (r) foram ligados em um plasmídeo linearizado MunI/HindIII pOmpTrX-HDML (1-113) (descrito em 1.5) para gerar o plasmídeo pOmp-TrX-lOH-llD- 27M-29L-4 OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-114R-161R.
EXEMPLO 2: Caracterização de xilanases mutantes
2.1 Produção de xilanases
As condições de cultura compreendiam uma cultura de 5 mL de inoculante durante a noite em meio 2YT (16 g bacto-triptona, IOg de extrato de levedo, 5 g de NaCl, 1 L de água) contendo ampicilina (100 mg/L) . A cultura foi espalhada em uma bandeja (32 χ 25 cm) uniformemente coberta por 0,5 L de ágar YT solidificado (8 g de extrato de levedo, 5 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl, 15 g de ágar em 1 L de água) contendo ampicilina (100 mg/L). As culturas foram cultivadas a 37°C. Após 40 h., as células (2 g) foram colhidas para extração de xilanase.
2.2 Purificação de xilanases mutantes
As células colhidas foram colocadas em um tubo para uma extração de xilanase de congelar-descongelar. O procedimento compreendeu um período de congelamento em um banho de etanol/gelo seco por 5 minutos, seguido por banho de gelo/água por 10 minutos. O procedimento foi repetido três vezes. As células foram extraídas com tampão (5 mL, 100 mM de citrato Na, pH 5,5). A centrifugação em 8000 χ g por 30 minutos forneceu um sobrenadante contendo xilanase. A solução de xilanase foi ajustada em pH 5,2. 0 precipitado que apareceu foi removido através de centrifugação na mesma condição. O sobrenadante foi aquecido em uma faixa de 50- 60°C, dependendo da termoestabilidade da xilanase recombinante, por 3 0 minutos para converter proteínas bacterianas mais indesejáveis em precipitado que foram removidas por centrifugação.
Antes da cromatografia de coluna, o sobrenadante foi ajustado em pH 6,4 por ácido acético e centrifugado para remover qualquer precipitado. O método subseqüente para cromatografia de coluna foi idêntico para todas as xilanases mutantes.
Após acidificação e centrifugação, a amostra de xilanase foi bombeada sobre uma coluna de permuta de cátion, fluxo rápido de CM-sefarose, volume de leito de 50 mL (Pharmacia Biotech,, Uppsala), equilibrada em 10 mM de acetato de sódio (pH 5,1). A xilanase foi eluída com um gradiente linear de 250 mL (0 a 0.6 M NaCl em 10 mM acetato de sódio, pH 5,1) em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. As xilanases eluem em 150 a 200 mL do gradiente. Alíquotas a partir das frações coletadas são examinadas por SDS-PAGE, e foram agrupadas aquelas frações tendo grande parte da xilanase presente. A xilanase purificada foi quantificada por espectrofotometria em 280 nm utilizando um coeficiente de extinção entre 54.600 e 53.400 M"1, para a maior parte das xilanases TrX mutantes. Uma purificação típica de 10 g de células forneceu 25 mg de xilanase.
2.3 Ensaio padrão para a medição de atividade enzimática
O ensaio quantitativo determinou o número de extremidades de açúcar de redução geradas a partir de xilano solúvel. O substrato para esse ensaio foi a fração de xilano de vidoeiro que dissolveu em água a partir de uma suspensão de 5% de xilano de vidoeiro (Sigma Chemical Co.). Após remover a fração insolúvel, o sobrenadante foi liofilizado e armazenado em um dessecador. A medição de atividade foi executada como a seguir. Misturas de reação contendo 100 μL de 3 0 mg/mL de xilano anteriormente diluído em tampão de ensaio (50 mM de citrato de sódio, pH 5,5 ou o pH ótimo da xilanase testada) , 150 μL de tampão de ensaio, e 50 μL de enzima (15 μg/mL) diluída em tampão de ensaio foram incubados a 40°C. Em vários intervalos de tempo, porções de 50 μL foram removidas e a reação parada por diluição em 1 mL de 5 mM NaOH. A quantidade de açúcares de redução foi determinada com o reagente de hidrazida de ácido hidróxi benzóico (HBAH) (Lever, 1972, que é incorporado aqui a título de referência).
EXEMPLO 3: Capacidade termofílica de xilanases mutantes
A capacidade termofílica foi examinada para testar o efeito de diferentes temperaturas sobre a hidrólise enzimática de xilano solúvel por xilanases mutantes diferentes.
O procedimento de ensaio foi similar ao ensaio padrão com alterações na temperatura de incubação e tempo. As xilanases (15 μ9/πιΐ0 e substrato de xilano de vidoeiro solúvel, em 50 mM de tampão de citrato de sódio de pH 5,5, ou dito de outro modo, foram misturados e incubados em um banho de água em circulação em diferentes temperaturas.
Após uma incubação de 3 0 minutos, a quantidade de açúcares de redução liberadas a partir de xilano foi determinada por análise HBAH e foi calculada como uma atividade relativa, com o valor a 40 0C ou a condição ótima de temperatura representando 100%.
Oefeito de temperatura sobre a hidrólise de xilano por xilanase Trichoderma reesei TrX com mutações individuais como S40H, K58R, S99C ou Y118C é mostrado na figura 3.
A mutação S4 0 em xilanase TrX-4OH mostrou uma atividade enzimática moderadamente aperfeiçoada em temperatura mais elevada em comparação com TrX (figura 3) .
No caso da xilanase TrX-58R, a mutação K58R por si só não mostrou aperfeiçoamento em relação a TrX (figura 3) , como já reportado por Turunen e outros (2002).
O aumento de capacidade termofílica pela mutação única Y118C como na xilanase TrX-IlSC (figura 3) foi descrito na técnica (WO 03/046169), porém a possibilidade de uma ligação de dissulfeto criada através da introdução de uma cisteína-118 nunca foi estudada. Essa mutação pode formar potencialmente uma ligação de dissulfeto com uma substituição de císteína no resíduo 99.
Inicialmente a única mutação S99C foi testada na forma de uma xilanase mutante, TrX-99C (figura 3), sem aperfeiçoamento aparente de atividade enzimática em temperatura mais elevada, portanto demonstrando que essa mutação não tem efeito sobre o perfil de temperatura/atividade de TrX. Entretanto, quando as mutações S99C e Y118C foram incorporadas na forma da xilanase mutante dupla TrX99C-118C houve uma intensificação acentuada de capacidade termofílica (figura 3), mesmo quando comparado com o mutante único TrX-118C. O aperfeiçoamento da condição ótima de temperatura do mutante duplo TrX-99C-118C em relação à xilanase natural, TrX, é aproximadamente 70C (figura 4) . Além da condição ótima de temperatura mais elevada (figura 4) , TrX-99C-118C também apresentou atividade ótima mais elevada do que TrX em sua respectiva condição ótima de temperatura (figura 3).
O efeito aditivo das mutações S40H e K58R sobre as mutações 99C/118C para aumentar a atividade enzimática em temperaturas mais elevadas foi confirmado na forma das xilanases mutantes TrX-58R-99C-118C, TrX-4OH-99C-118C e TrX-4OH-58R-118C (figuras 3 e 4) . Embora a mutação K58R por si só falhasse em melhorar a atividade de xilanase em temperatura mais elevada (figura 3), demonstrou um efeito positivo em combinação com outras mutações S4 0H e S99C/Y118C.
As novas mutações são compatíveis com outras mutações vantajosas que foram descritas na técnica. Isso foi demonstrado abaixo na criação de variantes de xilanase com atividade ótima e a condição ótima de temperatura mais elevada.
As mutações de N10H, Y27M e N29L para aumentar a capacidade termofílica de TrX, na forma do mutante TrX-IOH- 2 7M-29L (ou TrX-HML), foram descritas (patente dos Estados Unidos número 5.759.840). Xilanases variantes TrX-10H-27M- 2 9L-4 OR-58R-99C-118C (figura 5) e TrX-10H-27M-29L-40R-58R- 7 5A-99C-118C foram criadas com capacidade termofílica aperfeiçoada adicional (figura 5).
As mutações de N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A e 1129E para aumentar a capacidade termofílica de TrX, na forma do mutante TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E (TrX-HML-AHAE), são descritas em WO 01/92487. Xilanases variantes TrX-10H-27M-2 9L-75A-9 9C-10 5H-118C-12 5A-12 9E (figuras 6 e 8) e TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C- 125A-12 9E (figura 6) foram criadas, ambas com capacidade termofílica aumentada adicional.
A mutação de NllD é descrita em WO 03/046169. A adição dessa mutação criou uma variante TrX-10H-llD-27M- 29L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E (figuras 6, 7 e 8). Variações de mutação 40 (S40C, A, F, H, R, Y ou T) foram introduzidas nessa variante para criar os novos mutantes TrX-10H-IlD-27M-2 9L-40X-5 8R-75A-99C-105H-118C-125A-129E (onde X = C, A, F, H, R, YeT). Como indicado no estudo acima, a introdução de mutações S4 0H ou S4 0R melhorou moderadamente a atividade relativa em temperatura mais elevada em comparação com a enzima hospedeira (figuras 6, 7 e 8). Além disso, outras mutações S40C, S40F e S40Y apresentaram o mesmo efeito de intensificação (figura 7) , enquanto S4 0T e S4 0A não mostraram tal efeito de intensificação sobre o perfil de atividade/temperatura (figura 7).
Outra mutação, Q52C, foi introduzida em TrX-IOH- 11D-27M-2 9L-4 OH-5 8R-7 5A-99C-105H-118C-125A-12 9E. A xilanase mutante TrX-10H-llD-27M-2 9L-4 0H-52C-5 8R-75A-99C-105H-118C- 125A-129E foi capaz de reter atividade relativa significativa em temperaturas mais elevadas de 80 e 85 0C (figuras 6, 7 e 8).
As mutações H144R e Q161R (descritas em WO 03/046169) foram mostradas como aumentando a condição ótima de pH da xilanase TrX-10H-llD-27M-29L-75A-105H-118C-125A- 12 9E-144R-161R (ou TrX-10H-IlD-27M-29L-AH-118C-AE-RR) . A adição de mutações S40R, K58R e S99C permitiu que a xilanase mutante TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-12 9E-144R-161R retivesse maior atividade em temperaturas mais elevadas de 80 e 85°C (figura 9).
Os resultados acima demonstram que o efeito de intensificação das mutações S40X (X = C, F, H, R ou Υ) , Q52C, K58R, e a mutação S99C/Y118C de dissulfeto sobre a capacidade termofílica da xilanase mutante não são somente complementares ou aditivos entre si, como também a outras mutações reveladas na técnica (patente dos Estados Unidos número 5.759.840, WO 01/92487 e WO 03/046169).
EXEMPLO 4: capacidade alcalofílica de xilanases mutantes
A capacidade alcalofílica de xilanases geneticamente modificadas foi examinada para testar o efeito que diferentes condições de pH tiveram sobre a hidrólise enzimática de xilano de vidoeiro solúvel por xilanases mutantes. O procedimento de ensaio foi similar ao ensaio padrão com alterações no tempo e temperatura de incubação. Alíquotas de xilanases geneticamente modificadas (15 μg/mL) e substrato de xilano solúvel em 50 mM de tampões de citrato de sódio que variaram entre pH 4-8 foram incubados juntas a 55° ou 65°C como mencionado. Após incubações de 30 minutos, a quantidade de açúcares de redução liberados a partir do substrato de xilano foi determinada por análise HBAH e a atividade enzimática como uma função de pH foi calculada para uma variedade de xilanases mutantes com a atividade máxima tomada como 100%.
O efeito das mutações S99C/Y118C sobre o perfil de atividade/pH de xilanase foi investigado. O novo mutante de dissulfeto TrX99C-118C manteve maior atividade em valores de pH elevados de 6,5 - 7,5 (figura 10), em comparação com a xilanase natural TrX. A faixa de pH para manter 80% de atividade ótima é 4,8 - 7,0 para a xilanase mutante de dissulfeto TrX-99C-118C e somente 4,8 - 6,0 para xilanase natural TrX, indicando uma faixa de pH eficaz mais ampla para o primeiro.
Xilanases com as mutações individuais TrX-99C e TrX-118C foram também comparadas com TrX-99C-118C e a xilanase natural TrX. Tanto TrX-99C como TrX-118C tem o mesmo perfil de atividade/pH que TrX (figura 10). Isso confirmou que o aperfeiçoamento de atividade em pH mais elevado é um resultado da combinação de mutações de S99C e Y118C para formar a ligação de dissulfeto, e não as mutações Cys únicas.
O efeito das mutações S40X (X é H ou R), K58R e o dissulfeto S99C/Y118C sobre o perfil de atividade/pH de xilanase também foi estudado em dois grupos de mutantes construídos acima.
O primeiro grupo foi derivado do mutante TrX-IOH- 2 7M-2 9L-7 5A-105H-12 5A-12 9E (ou TrX-HML-AH-AE) e é descrito em WO 01/92487. Derivados como TrX-10H-27M-29L-75A-99C- 105H-118C-125A-12 9E, TrX-10H-27M-2 9L-58R-7 5A-99C-105H-118C- 125A-12 9E, TrX-IOH-IlD-27M-29L-58R-7 5A-99C-105H-118C-125A- 129E e TrX-IOH-IlD-27M-29L-4 0H-58R-75A-99C-105H-118C-125A- 129E mostraram maior atividade em pH mais elevado (figura 11), em comparação com TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E de origem. Entretanto, o maior aperfeiçoamento de atividade por TrX-10H-27M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-129E em relação a xilanase de origem TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E foi através da adição do dissulfeto 99C/118C. As outras xilanases mutantes nessa série (figura 11) com mutações S40H ou K58R, não mostraram efeito adicional sobre a atividade de xilanase.
O efeito de intensificação das mutações S99C/Y118C foi adicionalmente demonstrado no segundo grupo baseado em TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R, uma xilanase contendo duas mutações H144R e Q161R que foi mostrada como aumentando com sucesso a condição ótima de pH de xilanase (vide WO 01/92487). Essa construção, TrX-IOH- 11D-27M-2 9L-4 0R-5 8R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E-144R-161R, apresentou maior atividade em pH mais elevado do que seu TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E-144R-161R de origem (figura 12) . Também teve melhor desempenho do que outra xilanase TrX-10H-llD-27M-2 9L-75A-105H-116G-118C-12 5A-12 9E- 144R-16IR (figura 12) , uma xilanase mutante que mostrou anteriormente o perfil de atividade/pH mais aperfeiçoado entre xilanases mutantes em WO 03/046169.
EXEMPLO 5: termoestabilidade de xilanases mutantes
A tolerância de xilanase à incubação em diferentes temperaturas na ausência de substrato foi investigada. A xilanase (150 μg/mL) em tampão de ensaio (50 mM de citrato de sódio, pH 5,0) foi incubada por 30 minutos a 48, 52, 56 e 60°C. Alíquotas foram resfriadas à temperatura ambiente (em torno de 20°C) e a atividade enzimática residual das amostras foi determinada via ensaio de HBAH a 55°C por 30 minutos. A atividade enzimática residual a 48°C foi normalizada a 100%.
O mutante dissulfeto, TrX-99C-118C, reteve maior atividade residual do que a xilanase natural TrX (figura 13) após incubação em temperaturas mais elevadas. A T50 era 58 0C para a xilanase de dissulfeto, em comparação com uma T50 de 510C para a xilanase natural TrX (figura 13), que é um aumento na termoestabilidade da primeira em aproximadamente 7°C.
Embora a presente invenção tenha descrito xilanase mutantes que apresentam capacidade termofílica, capacidade alcalofílica e termoestabilidade aperfeiçoadas, e os benefícios associados a essas enzimas na produção de polpa de papel, essas xilanases mutantes também podem ser de uso em outros processos industriais, por exemplo, porém não limitados a, lavagem de dispositivos de precisão e semicondutores. Além disso, em virtude de sua capacidade termofílica e termoestabilidade aumentadas as xilanases mutantes podem ser utilizadas em processos químicos que empregam pequenas quantidades de meios de desnaturação ou detergentes ou na presença de solventes, por exemplo, porém não limitados a, pequenas quantidades de solventes apolares, como, porém não limitados a, hexano, dioxanos, tetracloreto de carbono, benzeno, éteres, clorofórmio, ácido acético e cloreto de metileno, e solventes polares, como, porém não limitados a, acetona, álcoois, dimetil formamida, acetonitrila, sulfolano, dimetil sulfóxido e água.
EXEMPLO 6: isolamento de DNA genômico de Trichoderma reesei e construção de bibliotecas genômicas de T. reesei
A cepa de Trichoderma reesei M2C3 8 é uma cepa de propriedade de Iogen Corporation derivada de Trichoderma reesei RutC30 (ATCC número 56765; Montenecourt and Eveleigh, 1979) , que foi, por sua vez, derivada de Trichoderma reesei Qm6A (ATCC número 13 631; Mandeis e Reese, 1957). É bem entendido por aqueles versados na técnica que os procedimentos descritos aqui, as construções genéticas dessas cepas, e as expressões das construções genéticas nessas cepas são aplicáveis a todas as cepas de Trichoderma derivadas de Qm6A.
Para isolar DNA genômico, 50 mL de Caldo de Dextrose de Batata (Difco) foi inoculado com espórios de T. reesei coletados de uma placa de Ágar de Dextrose de Batata com um Ioop de inoculação estéril. As culturas foram agitadas a 200 rpm por 2-3 dias a 28 °C. Os micélios foram filtrados em um filtro de microfibra de vidro GFA ((Whatman) e lavados com água deionizada, fria. As tortas fúngicas foram congeladas em nitrogênio líquido triturado em um pó com um almofariz e pilão pré-resfriado; 0,5 g de biomassa em pó foram resuspensas em 5 mL de 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,5 mas 1% de sulfato de dodecil de sódio (SDS). O lisado foi centrifugado (5000 g por 20 min., 4°C) para resíduos de célula em pelota. O sobrenadante foi extraído com tampão de 1 volume (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) fenol saturado seguido por extração com 1 volume de tampão-fenolsaturado:clorofórmio: álcool de isoamila (25:24:1) para remover proteínas solúveis. DNA foi precipitado a partir da solução por adição de 0,1 volume de 3 M acetato de sódio, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 95% frio. Após incubar por pelo menos 1 h a -20°C, o DNA foi formado em pelotas por centrifugação (5000 g por 20 min., 4°C), enxaguado com 10 mL de etanol a 70%, seco em ar e suspenso novamente em 1 mL de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0. O RNA foi digerido pela adição de Ribonuclease A (Boehringer Mannheim) adicionado a uma concentração final de 0,1 mg/mL e incubação a 37°C por 1 hora. Extrações seqüenciais com 1 volume de tampão-fenol saturado e 1 volume de tampão-fenol saturado:clorofórmio:álcool de isoamila (25:24:10) foi utilizado para remover a ribonuclease a partir da solução de DNA. O DNA foi novamente precipitado com 0,1 volume de 3 M acetato de sódio, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 95% frio, peletizado por centrifugação, enxaguado com 70% etanol, seco em ar e suspenso novamente em 5 0 μL de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, ρΗ 8,0. A concentração de DNA foi determinada por medição da absorvência da solução a 26 0 nm (p. C1 em Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2" edição, Cold Spring Harbor, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Duas bibliotecas de plasmideo e uma biblioteca de fagos foram construídas utilizando DNA genômico isolado da cepa T. reesei M2C38. As bibliotecas de plasmideo foram construídas no vetor pUC119 (Viera e Messing, 1987) como a seguir: 10 μg de DNA genômico foi digerido por 20 h a 37°C em um volume de 100 μL com 2 unidades/^g de enzimas de restrição BamHl ou EcoRl. 0 DNA digerido foi fracionado em um curso de gel agarose a 0,75% em 0.04 M tris-acetato, 1 mM EDTA e colorido com brometo de etídio. Fatias de gel correspondendo aos tamanhos dos genes de interesse (com base em informação publicada e Southern blots) foram excisadas e submetidas a eletro-eluição para recuperar os fragmentos de DNA (Sambrook e outros, pãg. 6.28-6.29). Essas frações enriquecidas de DNA foram ligadas em pUC119 para criar bibliotecas de gene em reações de ligação contendo 20-50 μg/mL de DNA em uma razão molar 2:1 de vetor:DNA de inserto, 1 mM ATP e 5 unidades T4 DNA ligase em um volume total de 10-15 μL a 4 °C por 16 h. A cepa Escherichia coli HBlOl foi submetida a eletroporação com as reações de ligação utilizando o Cell Porator System (Gibco/BRL) seguindo o protocolo do fabricante e transformantes selecionados em ágar LB contendo 70 μg/mL de ampicilina.
A biblioteca de fagos foi construída no vetor lambda XDASH (Stratagene, Inc.) como a seguir: DNA genômico (3 μg) foi digerido com 2, 1, 0,5 e 0,5 unidades/^g de BamHI por 1 hora a 370C para gerar fragmentos com tamanho de 9-23 kB. 0 DNA de cada digesto foi purificado por extração com 1 volume de Tris-fenol saturado:clorofórmio:álcool de isoamila (25:24:1), seguido por precipitação com 10 μl; 3M de acetato de sódio, pH 5,2 e 250 μl etanol a 95% (-20°C). 0 DNA digerido foi peletizado por microcentrifugação, enxaguado com 0,5 mL de etanol a 70% frio, seco a ar e suspenso novamente em 10 μl; de água deionizada, estéril. 0 enriquecimento de fragmentos de DNA com tamanho de 9-23 kB foi confirmado por eletroforese de gel agarose (0,8% agarose em 0.04 M tris-acetato, 1 mM EDTA). DNA digerido (0,4 μg) foi ligado a 1 de braços de ÀDASH pré-digeridos com BamHI (Stratagene) em uma reação contendo 2 unidades de T4 DNA ligase e 1 mM ATP em um volume total de 5 μΐ a 40C durante a noite. A mistura de ligação foi acondicionada em partículas de fago utilizando os extratos de acondicionamento GigaPack®II Gold (Stratagene) seguindo o protocolo do fabricante. A biblioteca foi titulada utilizando a cepa hospedeira E.coli XLl-Blue MRA (P2) e verificou-se conter 3 χ IO5 de clones independentes.
EXEMPLO 7: isolamento de clones genômicos a partir de bibliotecas de M2C38 de T. reesei
7.1 Clonagem de genes de celobioidrolase I (cbhl) e celobioidrase II (cbh2) a partir de bibliotecas pUC119
Transformantes HBlOl de E. coli que abriga clones cbhl ou cbh2 a partir de bibliotecas de pUC119-BamHl ou EcoRI recombinantes foram identificados por hibridização de elevação de colônia: 1 - 3 χ IO4 colônias foram transferidas sobre membranas de náilon HyBond™ (Amersham); membranas foram colocadas lado para cima da colônia sobre papel mata-borrão (VW 238) saturado com 0.5 M NaOH, 1 M NaCl por 5 min. para lisar as células bacterianas e desnatura o DNA; as membranas foram então neutralizadas por colocar as mesmas lado para cima da colônia sobre papel mata-borrão (VWR 23 8) saturado com 1.5 M Tris, pH 7,5 mais 1 M NaCl por 5 min. , as membranas foram deixadas secar em ar por 3 0 min. e o DNA foi então fixo às membranas por cozimento a 800C por 2 h.
Sondas rotuladas 32P foram preparadas por amplificação de PCR de fragmentos curtos (0,7 - 1,5 kB) das regiões de codificação cbhl e cbh2 a partir do pool enriquecido de fragmentos de BamHl ou EcoRl, respectivamente, em uma reação de rotulação contendo 10-50 ng DNA alvo, 0,2 mM cada de d(GCT)TP, 0,5 μΜ dATP, 20-40 μCi a-32P-dATP, 10 pmol de iniciadores de oligonucleotídeo e 0,5 unidades de polimerase Taq em um volume total de 20 μl. A reação foi submetida a 6-7 ciclos de amplificação (95 ° C, 2 min.; 56°C, 1,5 min.; 70°C. 5 min.). 0 DNA rotulado 32P amplificado foi precipitado pela adição de 0,5 mL de ácido tricloroacético a 10% (peso/v) e 0,5 mg de tRNA de levedo. O DNA foi peletizado por microcentrifugação, lavado duas vezes com 1 mL de etanol a 7 0%, seco em ar e suspenso novamente e 1 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA.
Membranas de náilon sobre as quais os plasmídeos pUC119 recombinantes tinham sido fixados foram pré- hibridizadas em sacos vedados a calor por lha 60-65°C em 1 M NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,5 com 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão ceifado desnaturado. Hibridizações foram realizadas em sacos vedados a calor no mesmo tampão com somente 50 μg/ml. de DNA de esperma de salmão ceifado desnaturado e 5 χ 10^6 - 5 χ 10^7 cpm de sonda cbhl ou cbh2 desnaturado por 16-20 h a 60-65°C. Membranas foram colocadas novamente em sacos vedados a calor e expostas a filme de raios-X Kodak RP a 16-48 h a -70°C. O filme de raios-X foi revelado seguindo os protocolos do fabricante. Colônias que fornecem sinais fortes ou fracos foram pegas e cultivadas em meios 2xYT suplementados com 70 μg/mL de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo foi isolado dessas culturas utilizando o método de Iise alcalina (Sambrook, e outros, pág. 1.25-1.28) e analisado por digesto de restrição, hibridização Southern (Sambrook, e outros, pág. 9.3 8 - 9.44) e análise de PCR (Sambrook, e outros, pág. 14.18 - 14.19).
Clones contendo o gene cbhl foram identificados por hibridização de elevação de colônia da biblioteca pUCl 19-BamHl com uma sonda de cbhl de 0,7 kh preparada utilizando iniciadores de oligonucleotídeo projetados para amplificar bp 5 97-1361 da seqüência de cbhl publicada (Shoemaker e outros, 1983). Um clone cbhl, pCOR132, foi isolada contendo um fragmento BamHI 5.7 kb correspondendo ao promotor (4.7 kb) e 1 kb do gene estrutural cbhl (2,3 kb) . A partir disso, um fragmento de EcoRI de 2,5 kb contendo o promotor cbhl (2,1 kb) e extremidade 51 da região de codificação cbhl (0,4 kb) foi subclonada em pUC119 para gerar pCB152. Os clones contendo o gene cbh2 foram identificados por hibridização de elevação de colônia da biblioteca pUC119-EcoRl com uma sonda cbh2 de 1,5 kb preparada utilizando iniciadores de oligonucleotídeos projetados para amplificar bp 58-2114 da seqüência cbh2 publicada (Chen e outros, 1987). Um clone cbh2, pZUK600 foi isolado contendo um fragmento EcoRI 4,8 kb correspondendo ao promotor (600 bp), gene estrutural (2,3 kb) e terminador (1,9 kb).
7.2 Clonagem de terminador cbhl e gene de xilanase II (xln2) a partir de bibliotecas XDASH
Sondas rotuladas de Digoxigen-11-dUTP foram preparadas a partir de regiões de codificação amplificadas por PCR dos genes cbhl e xln2 por rotulação de iniciar aleatória utilizando o kit de Rotulação e Detecção DIG (Boehringer Mannheim) e seguindo os protocolos do fabricante. Clones genômicos contendo os genes cbhl e xln2 foram identificados por hibridização de elevação de placa da biblioteca XDASH. Para cada gene de interesse, 1 χ IO4 clones foram transferidos para membranas de náilon Nytran® (Schleicher e Schull). As partículas de fago foram lisadas e o DNA de fago desnaturado por colocar as membranas com lado para cima de placa em papel mata-borrão (VWR23 8) saturado com 0.5 M de NaOH, 1 M NaCl por 5 min.; as membranas foram então neutralizadas por colocar as mesmas placa com lado para cima sobre papel mata-borrão saturado com 1.5 M Tris, pH 7,5 mais 1 M NaCl por 5 min.; as membranas foram deixadas secar em ar por 3 0 min. e o DNA foi então fixo às membranas por cozimento a 80 0C por 2 h.
As membranas foram pré-hibridizadas em sacos vedados a calor em uma solução de 6X SSPE, 5X de Denhardt, 1% SDS mais 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão ceifado, desnaturado a 65 0C por 2 h. As membranas foram então hibridizadas em sacos vedados a calor na mesma solução contendo 50 μg/mL, de DNA de esperma de salmão ceifado desnaturado e 0,5 de sondas rotuladas de dUTP-digoxigen a 65°C durante a noite. As membranas foram lavadas duas vezes por 15 min. em 2X SSPE, 0,1% SDS em RT, duas vezes por 15 min. em 0,2XSSPE, 0,1% SDS a 650C e uma vez por 5 min. em 2X SSPE. Clones de hibridização positiva foram identificados por reação com um conjugado de anticorpo de fosfatase alcalina/anti-digoxigenin, 5-bromo-4-cloro-3- fosfato de indoíla e 4-nitro cloreto de tetrazólio azul (Boehringer Mannheim) seguindo o protocolo do fabricante. Clones de hibridização positiva foram adicionalmente purificados por um segundo round de triagem com as sondas rotuladas dUTP-digoxigen.
Clones individuais foram isolados e o DNA de fago purificado como descrito em Sambrook e outros (1989) pág. 2.118-2.121 com a exceção de que a etapa de gradiente CsCl foi substituída por extração com 1 volume de fenol:clorofórmio:álcool de isoamila (25:24:1) e 1 volume de clorofórmio:álcool de isoamila (24:1). 0 DNA foi precipitado com 0,1 volume de 3 M acetato de sódio, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 95% frio. O DNA de fago precipitado foi lavado com 0,5 mL de etanol a 70% frio, seco a ar e suspenso novamente em 50 μL de 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0. Fragmentos de restrição contendo os genes de interesse foram identificados por digestos de restrição do DNA de fago purificado e hibridização de Southern blot (Sambrook, e outros, pág. 9.38 - 9.44) utilizando as mesmas sondas rotuladas dUTP-digoxigen utilizadas para classificar a biblioteca XDASH. As membranas foram hibridizadas e fragmentos de hibridização positiva visualizados pelos mesmos métodos utilizados para elevações de placa. Após os fragmentos de restrição desejados a partir de cada clone XDSAH serem identificados, os digestos de restrição foram repetidos, os fragmentos foram decompostos em um gel agarose a 0,8% em TAE e as faixas desejadas excisadas. 0 DNA foi eluído a partir das fatias de gel utilizando o Kit Sephaglas BandPrep (Pharmacia) seguindo o protocolo do fabricante.
Clones contendo o gene cbhl foram identificados por hibridização de elevação de colônia da biblioteca XDASH (Exemplo 7) com uma sonda cbhl compreendendo bp 45-2220 da seqüência cbhl publicada (Shoemaker e outros). Um fragmento BamHI de 1.8 kb contendo a extremidade 31 da região de codificação cbhl (0,5 kb) e terminador cbhl (1,3 kb) foi isolado por digestão de restrição de DNA de fago purificado a partir de um clone cbhl XDASH. Esse fragmento foi subclonado no sítio BamHI do vetor de plasmídeo E.coli pUC119 para gerar o plasmídeo pCBITa. Clones contendo o gene xln2 foram identificados por hibridização de elevação de colônia da biblioteca ÃDASH (Exemplo 7) com uma sonda xln2 compreendendo bp 100-783 da seqüência xln2 publicada (Saarelainen e outros, 1993, Mol. Gen. Genet. 241: 497- 503). Um fragmento Kpnl de 5,7 kb contendo o promotor (2,3 kb), região de codificação (0,8 kb) e terminador (2,6 kb) o gene xln2 foi isolado por digestão de restrição de DNA de fago purificado a partir de um clone xln2 ÀDASH. Esse fragmento foi subclonado no sítio Kpnl de pUC119 para gerar o plasmídeo pXYN2K-2.
EXEMPLO 8: construção de um vetor orientando a expressão de xilanase da família 11 modificadas em Trichoderma reesei.
Um fragmento de 2,4 kb contendo o promotor e sinal de secreção do gene xln2 (bp - 2150 a +195 onde +1 indica o códon de partida ATG e +193-195 representam códon 32) foi amplificado com Pwo polimerase a partir do subclone xln2 genômico pXYN2K-2 (exemplo 7) utilizando um iniciador especifico de xln2 contendo um PinAl em bp 19-195 ou códons 31 e 32 e o iniciador reverso de pUC (no. do cat. 18432- 013, Gibco/BRL) que anela a jusante do sítio Kpml na extremidade 5' do gene xln2. Esse produto PCR xln2 foi inserido como um fragmento de extremidade embotada no sítio SmaI do poli-reticulador pUC119 em tal orientação que o sítio BamHI do poli-reticulador está 3' para o sítio PinAI; isso gerou o plasmídeo pUC/XynPSS(Pin). O mesmo produto PCR xln2 foi isolado novamente de pUC/XynPSS(Pin) por digestão com EcoRl (que foi amplificado como parte do poli- reticulador pUC119 a partir de pXYN2K-2) e BamHI e inserido no plasmídeo pBR322L (um derivado de pBR322 contendo um adaptador Sphl-Notl-Sall entre os sítios Sphl e Sall originais em bp 565 e 650) , também digerido com EcoRl e BamHI, para gerar o plasmídeo pBR322LXP. Para facilitar expressão de nível elevado das xilanases modificadas, um fragmento HindIII de 1.3 kb compreendendo bp -1400 a -121 do promotor xln2 em pBR322LXP foi substituído com um fragmento HindIII de 1,2 kb compreendendo bp -1399 a -204 do promotor cbhl que foi isolado por digestão de HindIII de pCOR132; isso gerou o plasmídeo pBR322LXC. Finalmente, o sítio EcoRl de pBR322LXC foi então moderado com ligadores Klenow e Spel (no. do cat. 1086, New England Biolabs) foram adicionados para gerar pBR322SpXC. Um fragmento contendo códons 1-190 do gene de xilanase contendo as mutações N27H, Y27M, N29L foi isolado a partir do plasmídeo pUC/HML (descrito no exemplo 9.1 abaixo) por digestão com NheI e BamHI inserido no pCB219N-N digerido com NheI e BamHI para gerar pHML/C2ter. Para fazer pCB219N-N, um fragmento terminador cbh2 foi amplificado a partir do gabarito pZUK600 (descrito no exemplo 7, acima) utilizando um iniciador homólogo a bp 2226-2242 da região não traduzida 31 publicada do gene cbh2 (Chen e outros, 1987) contendo um poli-ligador curto compreendendo sítios XbaI-NheI-BamHI-SmaI-Kpnl na extremidade 5' e iniciador avançado de pUC (no. do cat. 1224, New England Biolabs) que anela a montante do sítio EcoRl na extremidade 3' de cbh2 em pZUK600. Esse fragmento foi digerido nos sítios XbaI e EcoR1 construídos e inserido nos sítios correspondentes de pUC119 para gerar pCB219. Um adaptador de EcoRl-Notl (no. do cat. 35310-010, Fibco/BRL) foi inserido no sítio EcoR1 exclusivo de pCB219 para gerar pCB219N. Um fragmento de 2,7 kb compreendendo códons 9-190 do gene HTX4 e terminador cbh2 foi isolado a partir de pHTX4/C2ter por digestão com PinAI e NotI e inserido no pBR322SpXC digerido com PinAI e NotI para gerar o cassete de expressão pc/xHML-EC.
EXEMPLO 9: Mutagênese de xilanase II de T. reesei para gerar a variante TRX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E-13IN
9.1 Introdução de mutações N10H, 27M, Y29L O DNA sintético compreendendo códons 32-190 em pTrX-HML (exemplo 1.4) foi substituído pelo fragmento genômico correspondente de T. reesei xln2, contendo um íntron de 108 bp no códon 58, que foi amplificado utilizando DNA de Τ. reesei genômico como um gabarito e introduzindo um sítio PinAI exclusivo nos códons 31 e 3 2 e um BamHI exclusivo diretamente a jusante do códon de parada TAG. Isso gera pUC/HML.
9.2 Introdução de mutações 75A, 105H, 125A, 129E
Um fragmento SstI de 3,2 kb contendo as regiões promotoras, o gene xln2, e parte do terminador cbh2 foi isolado a partir de pc/xHML-EC (exemplo 8) e clonado no sítio SstI no poli-ligador do vetor de mutagênese, pALTER® -1 (Promega) . Quatro rounds seqüenciais de mutagênese foram executados para alterar aminoácidos específicos utilizando iniciadores especificamente projetados para incorporar as mutações desejadas:
S75A: AGCTACCTCG CCGTGTACGG (SEQ ID NO:83)
L105H: CCACCAAGCA CGGCGAGGT (SEQ ID NO:84)
S125A: ACGCAGCGCG TCAACGCCCC GTCCATCATC GGC (SEQ ID NO:85)
H29E: AACGCCCCGT CCATCGAGGG CACCGCCACC TTT (SEQ ID NO:86)
(vide WO 01/92487 e WO 03/046169; que são incorporados aqui a título de referência, para métodos associados); isso gerou o plasmídeo pALT-TrX-10H-27M-29L- 75A-105H-125A-129E. A incorporação de todas as mutações foi verificada por análise de seqüência de DNA.
9.3 Introdução de mutações K58R, S99C, Y118C
Um round de mutagênese foi executado no plasmídeo pALT-TrX-10H-27M-29L-75A-105H-125A-129E utilizando O Sistema de Mutagênese in vitro II da Promega Altered Sites® e as seqüências iniciadoras:
K58R: GGC ACC AAG AAC CGC TAA GAC TAC CEA (SEQ ID NO:87)
S99C: ACC TAC AAC CCG TGC ACG GGC GCC ACC (SEQ ID NO:88}
Yl 18C: C TAC GAC ATT ToC CGC AOG C (SEQ ID NO: 89)
para introduzir as mutações K58R, S99C, e Y118C e gerar pALT-TrX-10H-27M-2 9L-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E.
A incorporação de todas as mutações foi verificada por análise de seqüência de DNA.
9.4 Introdução de mutações NllD, S4 0R
Um round de mutagênese foi executado no plasmídeo pALT-TrX-10H-27M-29L-58R-75A-99C-105H-118C-12 5A-129E
utilizando o Sistema de Mutagênese in vitro II da Promega
Altered Sites® e as seqüências iniciadoras: Nl ID: GGT IAC CAC GAC GGT IAC T (SEQ ID NO: 90)
S40R: TCC GIC AAC TOG OGC AAC TOG GGC AAC (SEQ ID NO: 91) para introduzir as mutações NllD e S4 0R e gerar
pALT-TrX-IOH-11D-27M-2 9L-4 OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A- 129E utilizando o Sistema de Mutagênese in vitro II da
Promega Altered Sites® e as seqüências iniciadoras: T13 IN: CCG TCC ATC GAG GGC AAC GCC ACC TTT TAC (SEQ ID NO:92)
para introduzir as mutações T131N e gerar pALT-
TrX-IOH-IlD-27M-29L-4OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E- 131N. A incorporação da mutação foi verificada por análise de seqüência de DNA.
EXEMPLO 10: construção de um vetor orientando a expressão de TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-
125A-129E-13IN em Trichoderma reesei.
O fragmento SacI de 3 64 0 bp contendo as regiões promotoras, o gene xln2 modificado e parte do terminador cbh2 a partir de pALT-TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C- 105Η -118C -125Α-12 9Ε-13IN foi clonado no sítio SacI de um plasmídeo contendo a seqüência de terminador cbh2 restante em pSP72. Essa etapa gera o cassete de expressão contendo plasmídeo pc/x TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E-131N-PSP. O plasmídeo contendo o cassete de seleção, pNCBglNSNB(r) , foi derivado de um plasmídeo contendo N. crassa pyr4, pFB6 (Radford e outros, 1985). Um fragmento BglII de 3,2 kb a partir de pFB6 contendo o gene N. crassa pyr4 (GenBank acessão M1344 8) bem como seu promotor, terminador e algumas seqüências de UTR 5' foi clonado no sítio BamHI de pUC119 modificado para conter sítios NotI, SmaI, NheI e BglII no poli-Iigador (entre EcoRI e Saci) para gerar pNCBgl-NSNB(r). Um fragmento de KpnI de 2238 bp contendo a região de codificação N. crassa pyr4 inteira, seqüências de terminador e promotor foi isolado de pNCBgl-NSNB(r) e clonado no sítio KpnI exclusivo do plasmídeo contendo cassete de expressão para gerar pc/x TRX-10H-11D-2 7M-2 9L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E- 13IN-TV.
EXEMPLO 11: transformação de Trichoderma reesei M2C38.
5 x 106 espórios de M2C3 8aux5 foram revestidos sobre celofane estéril em ágar de Dextrose de batata suplementado com 5 mM de uridina e são incubados por 20 horas a 30ºC para facilitar germinação de espório e crescimento de micélio. Discos de celofane foram transferidos para 10 mL de uma solução de protoplasto contendo 7,5 g/L de Driselase e 125 unidades de β-glucanase livre de protease (InterSpex Products Inc., nos. Do cat. 0465-1 e 0410-3, respectivamente) em 50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 6,5 contendo 0.6 M de sulfato de amônio (Tampão Ρ). A esteira de micélios foi digerida por 5 horas com agitação a 60 rpm. Protoplastos foram separados de micélios não digeridos por filtração através de MI RACLOTHtm no. 30 estéril, e coletados em um tubo centrífugo de fundo redondo de 50 mL, estéril, e recuperados por centrifugação em 1000 - 1500 χ g por 10 min. em temperatura ambiente. Protoplastos foram lavados com 5 mL de tampão P e centrifugados novamente em 1000 - 1500 χ g por 10 min. em temperatura ambiente. Protoplastos foram suspensos novamente em 1 mL de tampão STC (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5). Para transformação, 0,1 mL de protoplastos ressuspensos foram combinados com 10 μg de DNA de vetor e 25 μL de solução PEG (25% PEG 4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5). Após incubação em um banho de água gelada por 30 min., 1 mL de solução PEG foi adicionada e a mistura incubada por 5 min. em temperatura ambiente. A mistura de transformação foi diluída com 2 mL de 1.2 M sorbitol em solução PEG e a mistura inteira foi adicionada a 25 mL de meio ágar MMSS fundido (vide abaixo) resfriado em aproximadamente 47°C e a suspensão de protoplasto derramada sobre ágar MMSS. As placas foram incubadas a 300C até que o crescimento de colônia seja visível. Os transformantes foram transferidos para placas individuais contendo ágar MM e deixados esporular. Os espórios foram coletados e revestidos em diluição elevada em ágar MM para isolar transformantes de homocarion, que foram então revestidos sobre PDA para permitir crescimento e esporulação suficiente para inocular as culturas de triagem como descrito no exemplo 12 abaixo. Ágar de meio mínimo (MM) contém os componentes
expostos na tabela 21.
Tabela 21
<table>table see original document page 88</column></row><table>
Ágar MMSS contém os mesmos componentes que ágar MM mais 1,2 M sorbitol, 1 g/L YNB (Base de nitrogênio de levedo w/o aminoácidos a partir de DIFCO no. de cat. 291940) e 0,12 g/L de aminoácidos (Suplemento Ura DO a partir de BD Biosciences No. do cat. 630416) .
EXEMPLO 12: detecção de atividade de xilanase termofílica em filtrados de cultura T. reesei
A presença de atividade de xilanase termofílica em filtrados de cultura de transformantes de T. reesei foi determinada medindo-se a liberação de açúcares de redução a partir de um substrato de arabinoxilano de trigo solúvel a 65°C. Especificamente, 30 μL de uma diluição apropriada de filtrado de cultura foi pré-incubado a 65 °C por 5 min. Subseqüentemente, 300 μL de uma solução de arabinoxilano de trigo a 1,5% (Megagzyme International) redissolvido em tampão de fosfato pH 7,0 contendo 0,04% de Tween, também pré-incubado a 65°C por 5 min., foi adicionado à amostra de enzima em um tubo de microcentrí fuga. Os tubos foram submetidos à vórtice brevemente para facilitar a mistura e então a reação foi incubada a 65 0C por 20 min. A reação de hidrólise enzimática foi parada pela adição de 15 0 μΣ· da solução de parada contendo 53,64 mM de 2-hidróxi-3,5-ácido dinitrobenzóico, 0,93 M de tartrato de potássio de sódio, 0,4 M de hidróxido de sódio e 0,4 M de hidróxido de potássio. A solução resultante foi então fervida por 10 minutos para facilitar a reação de 2-hidróxi-3,5-ácido dinitrobenzóico com os açúcares de redução liberados a partir do substrato de arabinoxilano pela enzima. Os tubos foram resfriados em gelo por 5 minutos e então 1,5 mL de água deionizada foi adicionada. A absorvência da solução foi medida a 53 0 nm. A quantidade de açúcar de redução liberada pelas xilanases termofílicas durante a incubação foi calculada a ^partir de uma curva padrão de medições A5 3 0 de várias diluições de uma solução de xilose pura reagida com a mesma solução de parada.
EXEMPLO 13: Produção de xilanases modificadas em culturas líquidas
Colônias individuais de Trichoderma foram transferidas para placas PDA para a propagação de cada cultura. Esporulação foi necessária para as microculturas de inoculação uniforme que foram utilizadas no teste da capacidade da cultura de produzir as xilanases termofílicas e celulase. O meio de cultura é composto do seguinte:
Tabela 22
<table>table see original document page 89</column></row><table> KH2PO4 8,00
MgSO4. 7Η20 4, 00
CaCl2.2Η20 1,02
Líquido em infusão de milho 5,00
CaCO3 20,00
Fonte de carbono** 30-35
Elementos residuais* 2 mL/L
*A solução de elementos residuais contém 5 g/L de FeSO4. 7H20; lm6 g/L MnSO4-H2O; 1,4 g/L ZnSO4. 7H20.
** glicose, floco Solka, lactose, celobiose, soforose, xarope de milho ou Avicel. A fonte de carbono pode ser esterilizada separadamente como uma solução aquosa em pH 2 a 7 e adicionada ao meio restante inicialmente ou através do curso da fermentação.
Transformantes individuais foram cultivos no meio acima em culturas de 1 mL em microplacas de 24 cavidades. O pH inicial era 5,5 e o meio esterilizado por autoclave a vapor por 30 minutos a 121°C antes da inoculação. Para células tanto nativas como transformadas, espõrios foram isolados a partir das placas de PDA, suspensos em água e 10^4-10^6 espórios por mL foram utilizados para inocular cada cultura. As culturas foram agitadas a 500 rpm em uma temperatura de 30°C por um período de 6 dias. A biomassa foi separada a partir do filtrado contendo a proteína secretada por centrifugação a 12.000 rpm. A concentração de proteína foi determinada utilizando o Ensaio de Proteína Bio-Rad (no. do cat. 500-0001). A atividade de xilanase foi determinada como descrito no exemplo 12. Cepas que expressa a atividade de xilanase mais elevada e apresentando produção de proteína geral elevada foram selecionadas para crescimento em fermentações piloto de 30 litros.
EXEMPLO 14: Produção de xilanases em fermentações de bateiada alimentadas de 30 L.
Cepas de T. reesei foram cultivadas em Ágar de dextrose de batata a 28-30°C até se obter um estrutura confluente de espórios. Espórios foram coletados e utilizados para inocular 750 mL de meio Berkeley (10 g/L de glicose, 1,4 g/L (NH4)2SO4, 2,0 g/L KH2PO4, 0,31 g/L de MgSO4.7H20, 0,53 g/L de CaCl2; 5,1 g/L de infusão de milho seco, 5 mg/L de FeSO4.7H20; 0,8 mg/L de MnSO4-H2O, 0,7 mg/L de ZnSO4.7H20) em um frasco com defletor de 2 L. Após 3 dias de crescimento a 28 0C e 150 rpm, essa cultura foi utilizada para inocular 23 L de meio de fermentação com a seguinte composição inicial: 31 g/L de glicose, 4,4 g/L de (NH4)2SO4, 2,77 g/L de KH2PO4, 1,4 g/L de MgSO4. 7H20, 0,3 7 g/L de CaCl2, 12 g/L de infusão de milho seco, 3,5 mg/L de FeSO4. 7H20, 1,12 mg/L de MnSO4-H2O, 0,98 g/L de ZnSO4.7HzO.
Uma fermentação aeróbica de batelada alimentada utilizando uma ou mais das fontes de carboidrato de indução listadas no exemplo 13 foi feita por 6 dias em pH 4,5 e 28 0C em um fermentador New Brunswick Microferm de 3 0 L. Após 6 dias, a cultura foi filtrada sobre Harborlite e o filtrado de cultura ajustado a pH 4,5 e preservado com 0,5% de benzoato para evitar crescimento microbiano.
A concentração de proteína em amostras diárias do fermentador foi determinada utilizando o Ensaio de proteína Bio-Rad (No. de cat. 500-0001). A atividade de xilanase foi determinada como descrito no exemplo 12.
A expressão de TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A- 99C-105H-118C-12 5A-129E-131N- e TrX-IOH-IlD-27M-29L-4OR- 58R-7 5Α-99C-105Η-118C-125Α-129Ε a partir de cepas T. reesei transformadas (atividade de xilanase e biomassa) em fermentações de 30 L é apresentada na Tabela 23 abaixo.
Tabela 23
<table>table see original document page 92</column></row><table>
EXEMPLO 15: Capacidade alcalofílica e capacidade termofílica das xilanases modificadas TrX-10H-llD-27M-29L- 40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N e TrX-IOH-11D-27M- 29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E
Os perfis de temperatura e pH das xilanases modificadas TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C- 125A-129E-131N e TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E feitos por cepas Trichodermas P345A e P275H são mostrados nas figuras 14, 15 e 16. Os dados foram gerados por medição de liberação de açúcar de redução a partir de arabinoxilano de trigo, polpa de folhosa, ou polpa de madeira resinosa com condições variáveis.
A figura 14 mostra a condição ótima de temperatura de TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E-131N é levemente mais elevado do que a condição ótima de TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C-105H- 118C-125A-129E. Perfis de temperatura para cada enzima foram gerados em um substrato de arabinoxilano de trigo a 1% (Megazyme International) em pH 7 por 60 minutos.
As figuras 15 e 16 mostram que a enzima termofílica/alcalofílica TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A- 99C-105H-118C-12 5A-129E-131N a partir de P345A tem uma faixa da condição ótima de pH mais ampla em polpa tanto de folhosa como de madeira resinosa do que TrX-10H-llD-27M- 29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E a partir da cepa P275H. Os perfis de pH foram gerados a 70°C por 60 minutos em polpa com 10% de consistência. A enzima TrX-10H-llD-27M- 29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-12 5A-129E-131N foi adicionada em uma dose de 400 mL/t de polpa e a enzima TrX-IOH-IlD- 27M-29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E foi adicionada em uma dose de 800 mL/t de polpa.
EXEMPLO 16: teste de termoestabilidade das xilanases modificadas TrX-10H-llD-27M-29L-40R-58R-75A-99C- 105H-118C-125A-129E-131N# TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-7 5A- 99C-105H-118C-125A-129E e TrX-10H-27M-29L
A tolerância de xilanases modificadas TrX-IOH- 11D-27M-29L-4 0R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N, TrX- 10H-IlD-2 7M-29L-4 OR-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E e TrX- 10H-27M-2 9L à incubação em temperaturas diferentes na ausência de substrato foi investigada. As xilanases modificadas foram diluídas 10 a 50 vezes em 200 mM tampão de bis-tris propano em pH 8,0 e incubadas por 30 min. a 50 °C, 60 ° C, 70 0C e 80 ° C. Ao término do período de incubação, a atividade residual de enzima foi determinada como descrito no exemplo 12 com a seguinte exceção: uma alíquota da solução de enzima tratada foi adicionada em uma diluição de 100 vezes a uma solução de xilano de vidoeiro a 1% em 200 mM de tampão de bis-tris propano em pH 7,0 que tinha sido pré-incubado a 70°C (para TrX-10H-11D-27M-29L- 40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E-131N e TrX-10H-11D-27M- 29L-40R-58R-75A-99C-105H-118C-125A-129E) ou pH 6,5 pré- incubado a 55°C. A atividade residual foi normalizada para a atividade medida para cada enzima após 0 min. de pré- incubação a 50°C.
Tanto TrX-10H-11D-27M-29L-4OR-5 8R-75A-99C-105H- 118C-125A-12 9E-13IN como TrX-10H-11D-27M-29L-40R-58R-75A- 99C-105H-118C-125A-12 9E contendo o dissulfeto 99C-118C mostrou termoestabilidade superior a TrX-HML, que não tem o dissulfeto 99C-118C. A T50 foi determinada como sendo 71- 72°C para as xilanases de dissulfeto, em comparação com uma T50 de 65°C para a TrX-10H-27M-29L (figura 17) .
A presente invenção foi descrita com relação a modalidades preferidas. Entretanto, será óbvio para pessoas versadas na técnica que diversas variações e modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção como descrito aqui.
Todas as referências e citações são aqui incorporadas a título de referência.
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Claims (36)

1. Xilanase modificada caracterizada por compreender resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 para formar uma ligação de dissulfeto intramolecular, a xilanase produzida por substituição de um aminoácido na posição 99, -118 ou ambas as posições 99 e 118 com uma cisteína, as posições determinadas a partir do alinhamento de seqüência da xilanase modificada com uma seqüência de aminoácido de xilanase II Trichoderma reesei como definido na SEQ ID NO: -16, onde a xilanase modificada é termofílica, alcalofílica, termoestável, ou uma combinação da mesma e onde a xilanase é uma xilanase da Família 11.
2. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído na posição 4 0 selecionado do grupo que consiste em Arg, Cys, Phe, Tyr e His.
3. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído básico na posição 40.
4. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o aminoácido básico na posição 40 é um His.
5. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído básico na posição 58.
6. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender o aminoácido substituído básico na posição 58 é um Arg.
7. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a xilanase da Família 11 é uma xilanase Trichoderma reesei.
8. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a xilanase modificada não é derivada de uma xilanase com resíduos de cisteína de ocorrência natural nas posições 99 e 118.
9. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído básico na posição 10, um aminoácido substituído hidrofóbico na posição 27 e um aminoácido substituído hidrofóbico na posição 29.
10. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o aminoácido substituído básico na posição 10 é um His, o aminoácido substituído hidrofóbico na posição 27 é um Met e o aminoácido substituído hidrofóbico na posição 2 9 é um Leu (HML).
11. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído não polar na posição 75, um aminoácido substituído básico na posição 105, um aminoácido substituído não polar na posição 125 e um aminoácido acídico na posição 129.
12. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o aminoácido substituído não polar na posição 75 é um Ala, o aminoácido substituído básico na posição 105 é His, o aminoácido substituído não polar na posição 125 é Ala e o aminoácido acídico na posição 12 9 é Glu.
13. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por compreender ainda um aminoácido acídico na posição 11.
14. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o aminoácido acídico na posição 11 é um Asp.
15. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por compreender ainda um Asn na posição 131.
16. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído básico em cada uma das posições 40 e 58.
17. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o aminoácido básico na posição 40 é um His e o aminoácido básico na posição 58 é um Arg.
18. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído básico na posição 10, um aminoácido substituído hidrofóbico na posição 27 e um aminoácido substituído hidrofóbico na posição 29.
19. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o aminoácido substituído básico na posição 10 é um His, o aminoácido substituído hidrofóbico na posição 27 é um Met e o aminoácido substituído hidrofóbico na posição 29 é um Leu (HML).
20. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído não polar na posição 75, um aminoácido substituído básico na posição 105, um aminoácido substituído não polar na posição 125 e um aminoácido acídico na posição 129.
21. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o aminoácido substituído não polar na posição 75 é Ala, o aminoácido substituído básico na posição 105 é His, o aminoácido substituído não polar na posição 125 é um Ala e o aminoácido acídico na posição 129 é Glu.
22. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por compreender um aminoácido acídico na posição 11.
23. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o aminoácido acídico na posição 11 é um Asp.
24. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender ainda um Asn na posição 131.
25. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender ainda uma Cys na posição 52.
26. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por compreender ainda um aminoácido substituído básico em cada uma das posições 144 e 161.
27. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o aminoácido substituído básico em cada uma das posições 144 e 161 é um Arg.
28. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a xilanase modificada tem uma temperatura efetiva máxima (MET) entre aproximadamente 65°C e aproximadamente 85°C.
29. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a xilanase modificada tem um pH efetivo máximo (MEP) entre aproximadamente pH 6,5 e aproximadamente pH 8,0.
30. Xilanase modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a xilanase modificada é derivada de Aspergillus, Bacillus, Cellulomonas, Chainia, Clostridium, Fibrobacter, Neocallimastix, Ruminococcus, Schizophyllum, Streptomyces, Thermobifida, Thermomyces, Piromyces, Talaromyces, Orpinomyces, Phanerochaete, Gibberella, Cochliobolus, Aureobasidium, Chaetomium, Dictyoglomus, Magnaporthe, Penicillium, Fusarium, Humicola, Trichoderma ou Hypocrea.
31. Xilanase da Família 11 modificada caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em: TrX-99C-118C (SEQ ID NO: 66); TrX-40H-99C-118C (SEQ ID NO: 67); TrX-58R-99C-118C (SEQ ID NO: 68); TrX-40H-58R-99C-118C (SEQ ID NO: 69); TrX-10H-2 7M-2 9L-40R-58R-99C-118C (SEQ ID NO: 70); TrX-10H-27M-29L-40R-5 8R-75A-99C-118C (SEQ ID NO: 71); TrX-10H-2 7M-29L-75A-99C-105H-118C-125A-12 9E (SEQ ID NO: 72); TrX-10H-27M-29L-58R-7 5A-99C-105H-118C-125A-129E (SEQ ID NO: 73); TrX-10H-11D-27M-2 9L-58R-7 5A-9 9C-105H-118C-125A- -129Ε (SEQ ID NO: 74); TrX-IOH-IlD-27M-2 9L-4OX-58R-75A-99C-105H-118C- -125A-129E, onde X é C, Ff Η, Y ou R (SEQ ID NOs: 75, 76, -77, 78 e 79, respectivamente); TrX-IOH-IlD-27M-29L-4OH-5 8R-7 5A-99C-105H-118C- -125A-129E (SEQ ID NO: 80); TrX-IOH-11D-27M-29L-4OR-5 8R-75A-99C-105H-118C- -125A-12 9E-144R 161R (SEQ ID NO: 81); e TrX-10H-IlD-27M-2 9L-5 8R-75A-99C-10 5H-118C-12 5A- -129E-131N (SEQ ID NO: 82).
32. Xilanase de Família 11 modificada, caracterizada por compreender resíduos de cisteína nas posições 99 e 118 para formar uma ligação de dissulfeto intramolecular, a xilanase produzida por substituição de um aminoácido na posição 99, 118 ou ambas as posições 99 e 118 com uma cisteína, as posições determinadas a partir do alinhamento de seqüência da xilanase modificada com uma seqüência de aminoácido de xilanase II Trichoderma reesei como definido na SEQ ID NO: 16.
33. Xilanase de Família 11 modificada, caracterizada por compreender um aminoácido básico substituído na posição 40, a posição determinada a partir do alinhamento de seqüência da xilanase modificada com uma seqüência de aminoácido de xilanase II Trichoderma reesei como definido na SEQ ID NO: 16.
34. Xilanase de Família 11 modificada, caracterizada por compreender um aminoácido substituído básico na posição 40, a posição determinada a partir do alinhamento de seqüência da xilanase modificada com uma seqüência de aminoácido de xilanase II Trichoderma reesei como definido na SEQ ID NO: 16 e uma ligação de dissulfeto intramolecular encerrando um loop tendo entre 10 e 24 aminoácidos.
35. Xilanase de Família 11 modificada, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a ligação de dissulfeto intramolecular é produzida por substituição de um aminoácido na posição 99, 118 ou ambas as posições 99 e 118 com uma cisteína.
36. Xilanase de Família 11 modificada, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o aminoácido básico na posição 40 é um His.
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