CN101528929B - 具有提高的热稳定性、嗜热性和嗜碱性的家族6纤维素酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了来自家族6纤维素酶的氨基酸序列，根据SEQ ID NO：1的氨基酸编号，该氨基酸序列在413位上包含脯氨酸残基。另外，根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的编号，该氨基酸序列可包含选自以下的一个或多个修饰：231位上的丝氨酸或苏氨酸残基，305位上的丝氨酸或苏氨酸残基，和410位上的谷氨酰胺或天冬酰胺残基；其中该纤维素酶显示以下的一种或多种：提高的热稳定性、提高的嗜热性、提高的嗜碱性或其组合。
Description
技术领域
本发明涉及经修饰的纤维素酶。更具体地，本发明涉及具有提高的热稳定性(thermostability)、嗜碱性(alkalophilicity)和/或嗜热性(thermophilicity)的经修饰的家族6纤维素酶。本发明还涉及包含编码经修饰家族6纤维素酶的核苷酸序列的遗传构建体，用于从宿主菌株中生产经修饰的家族6纤维素酶的方法，以及经修饰的家族6纤维素酶在纤维素水解中的用途。
发明背景
生物圈中最丰富的多糖--纤维素由通过β-1，4糖苷键在线性链中连接在一起的D-葡萄糖单元组成。这些链长度可变化，并经常由成千上万个单元组成。纤维素链形成了大量分子内和分子间氢键，这导致形成不溶的纤维素微原纤维。这种结晶纤维素是天然半衰期超过五百万年的坚韧材料。
为了利用这种重要的可更新碳源，微生物(如细菌和真菌)产生了将结晶纤维素分解为葡萄糖的酶混合物。三大类纤维素酶协同作用，将结晶纤维素水解为简单的能源葡萄糖。内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)随机水解结晶纤维素的无定形区，产生多种长度的寡糖，并因而产生新链末端。纤维二糖水解酶(或外切-β-1，4-纤维二糖水解酶，EC 3.2.1.91)从纤维素链的一端连续水解纤维二糖单元。最后，β-1，4-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)将纤维二糖水解为葡萄糖。
大部分纤维二糖水解酶和内切-β-1，4-葡聚糖酶是由催化核心结构域和纤维素结合结构域组成的多结构域蛋白质，所述催化核心结构域和纤维素结合结构域由柔性的接头区隔开。纤维素结合结构域促进该酶吸附至纤维素底物区域(Tomme.P.等1988.Eur.J.Biochem 170：575-581：Lehtio.J.等2003Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.100：484-489)，而催化核心结构域负责纤维素的切割。接头区可确保核心结构域与纤维素结合结构域之间最佳的结构域间距离(Srisodsuk.M.等1993.J.Biol.Chem. 268：20756-20761)。
基于氨基酸序列相似性将催化结构域归类为糖苷水解酶家族，该家族包括具有相似的折叠和水解机制但是底物特异性可能不同的酶。里氏木霉(Trichoderma reesei)含有已知的纤维素酶基因，它们是两种纤维二糖水解酶，即Cel7A(也称为CBH1，其为家族7的成员)和Cel6A(CBH2)；至少八种内切-β-1，4-葡聚糖酶，即Cel7B(EG1)、Cel5A(EG2)、Cel12A(EG3)、Cel61A(EG4)、Cel45A(EG5)、Cel74A(EG6)、Cel61B(EG7)和Cel5B(EG8)；和至少七种β-1，4-葡萄糖苷酶，即Cel3A(BG1)、Cel1A(BG2)、Cel3B(BG3)、Cel3C(BG4)、Cel1B(BG5)、Cel3D和Cel3E(Foreman.P.K.等2003.J.Biol.Chem.278：31988-31997)。
里氏木霉Cel6A(或TrCel6A)是该真菌分泌的两种主要的纤维二糖水解酶之一，并已显示在结晶纤维素的酶促水解中是高效的。TrCel6A是糖苷水解酶家族6的成员，该家族包括通过倒转端基构型(anomericconfiguration)而水解β-1，4糖苷键的酶，并包括纤维二糖水解酶以及内切-β-1，4-葡聚糖酶。TrCel6A(Rouvinen.J.等1990.Science249：380-386.Erratum：Science 1990 249：1359)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内β-1，4-葡聚糖酶Cel6A(TfCel6A，Spezio.M.等1993.Biochemistry.32：9906-9916)、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维二糖水解酶Cel6A(HiCel6A，Varrot.A.等.1999 Biochem.J.337：297-304)、特异腐质霉内切-β-1，4-葡聚糖酶Cel6B(HiCel6B，Davies.G.J.等2000.Biochem.J.348：201-207)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Rv Cel6A(MtCel6A，Varrot.A.等.2005.J.Biol.Chem.280：20181-20184)的三维结构是已知的。
纤维素酶在工业过程中有多种应用，并已证明在以下用途中可商业应用：在纺织工业中用于牛仔布整理(denim finishing)和棉花软化；在家用和工业去污剂中用于色彩增亮、软化和污渍去除；在纸浆和造纸工业中用于平滑纤维、增强排水和脱墨(de-inking)；在食品工业中用于从水果和蔬菜中提取和澄清果汁，和用于糖化(mashing)；在动物饲料工业中用于改善其营养品质；以及用于将植物纤维转化为葡萄糖，所述葡萄糖被发酵和蒸馏用于制造低CO2纤维素乙醇，从而降低化石燃料消耗，这是世界范围内的一种新兴工业(例如Gray，K.A.等.2006.Curr.Opin. Chem.Biol.10：141-146)。
为了获得具有提高的稳定性特性的酶变体，在本领域中一般使用三种策略：1)从生存于极端环境如极热或极冷、高盐浓度或高或低pH条件下的嗜极生物(extremophile)中分离嗜热酶(例如美国专利No.5,677,151，美国专利申请No.20060053514)；2)通过推理性设计或定点诱变进行蛋白质工程，其使用本领域已知的蛋白质稳定性原理，依赖于蛋白质家族内的序列同一性和结构比对来鉴定可能有益的突变(在Eijsink.V.G.等2004.J.Biotechnol.113：105-20.中综述)；和3)定向进化，包括构建突变体文库并进行选择或筛选以鉴定改进的变体，并包括反复循环产生具有期望特性的变体的过程(近期在Eijsink VG等.2005.Biomol.Eng.22：21-30中综述)。这种方法不需要结构或机理信息，并可揭示意外的有益突变。已证明将上述策略组合在一起是鉴定改进酶的有效方法(Chica.R.A.等.2005.Curr.Opin.Biotechnol.16：378-384)。
使用推理性设计，Zhang等(Zhang S等，2000.Eur.J.Biochem.267：3101-15)使用两个双突变在TfCel6B的N端和C端环之间引入了新的二硫键，并选择四个甘氨酸残基突变来改进热稳定性。这些突变均未提高该纤维二糖水解酶的热稳定性，并且大部分突变将热稳定性降低5-10℃。让人惊讶的是，双突变N233C-D506C显示T50降低10℃(ZhangS等，2000.Eur.J.Biochem.267：3101-15)，或T50稍提高约2℃(Ai，Y.C.and Wilson，D.B.2002.Enzyme Microb.Technol.30：804-808)。Wohlfahrt(Wohlfahrt.G.等2003.Biochemistry.42：10095-10103)公开了通过将羧基-羧酸对替换为酰胺-羧酸对而提高TrCel6A在碱性pH范围内的热稳定性。单突变体E107Q和三重突变体E107Q/D170N/D366N在pH 7以上具有提高的Tm，但是在野生型TrCel6A的最适pH--pH5下具有更低的Tm。这些突变存在于N端和C端环中或其附近。Hughes等(Hughes.S.R.等2006.Proteome Sci.4：10-23)公开了一种定向进化策略，以在最后四个密码子中具有定向变异的Orpinomyces PC-2纤维素酶F(OPC2Cel6F)突变克隆中筛选在较低pH下提高的活性，并鉴定了具有提高的热稳定性并在较低pH下具有提高的活性的两种突变体。
描述家族6纤维素酶推理性设计的上述报道提示，向C端环中引入氢键或二硫键不是提高最佳水解条件下热稳定性的良好策略。另外，通 过用突变D241C/D249C引入二硫键来稳定里氏木霉7家族纤维二糖水解酶Cel7 A的外环(其形成活性位点通道的顶部)显示对热稳定性没有改进(von Ossowski.I.等.2003.J.MoI.Biol.333：817-829)。
具有提高热稳定性的TrCel6A变体描述于美国专利公开No.20060205042中。使用结构信息和建模程序，基于TrCel6A氨基酸序列与八个家族6成员序列的比对鉴定了突变。这种比对作为确定所谓的共有序列的基础。选择TrCel6A的3D-结构模型匹配该结构而无扰动并且很可能改进酶的热稳定性的突变作为用于改进TrCel6A热稳定性的替换。413位上丝氨酸到酪氨酸的突变(S413Y)包括在被鉴定为改进TrCel6A热稳定性的突变之中。该突变将在61℃下预孵育1小时后保留的酶活性从母体TrCel6A的20-23％提高至TrCel6A-S413Y的39-43％；然而，在65℃预孵育1小时后，母体TrCel6A保留其活性的5-9％，而TrCel6A-S413Y保留其活性的6-8％。熔解温度(或Tm)提高了0.2-0.3℃，从母体TrCel6A的66.5℃提高至TrCel6A-S413Y的66.7-66.8℃。
尽管在上文和相关的工业应用中已知纤维素酶的机制和令人期望的属性，但是开发具有提高的稳定性、催化特性或者同时具有提高的稳定性和催化特性的耐热纤维素酶会是有利的。尽管可以在自然界中发现嗜热和耐热的酶，但是有成本效益地大规模生产这些酶中的困难限制了它们进入市场用于工业用途。因此，需要可以通过工业微生物如里氏木霉以高表达水平经济地生产的稳定性提高的纤维素酶。
发明概述
本发明涉及经修饰的家族6纤维素酶。更具体地，本发明涉及显示增强的热稳定性、嗜碱性和/或嗜热性的经修饰的家族6纤维素酶。本发明还涉及包含编码经修饰的家族6纤维素酶的核苷酸序列的遗传构建体，用于从宿主菌株中生产经修饰的家族6纤维素酶的方法，以及经修饰的家族6纤维素酶在纤维素水解中的用途。
提供具有提高的热稳定性、嗜热性和嗜碱性的改进的纤维素酶是本发明的一个目的。
本发明涉及通过用脯氨酸替换413位的氨基酸来生产经修饰的家族 6纤维素酶的方法。氨基酸替换的位置通过所述经修饰的纤维素酶与SEQ ID NO：1中定义的里氏木霉Cel6A氨基酸序列的序列比对来确定。所述经修饰的家族6纤维素酶与产生该家族6纤维素酶的母体家族6纤维素酶相比显示出增强的热稳定性、嗜碱性、嗜热性或其组合。
所述经修饰的家族6纤维素酶可来自丝状真菌，如里氏木霉。在本发明的一个实施方案中，所述经修饰的纤维素酶并不来自于413位(TrCel6A编号)上具有天然存在的脯氨酸残基的纤维素酶，例如413位上含有脯氨酸残基的天然家族6纤维素酶(来自Orpinomyces物种PC-2的CeIF)。
本发明还包括这样的经修饰家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸残基，并且还在选自231、305、410或其组合的位置上包含极性氨基酸。
本发明还涉及这样的经修饰的家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸，并且还在231位上包含选自丝氨酸或苏氨酸的替换氨基酸。231位上的替换氨基酸可以是丝氨酸。
本发明还涉及这样的经修饰的家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸，并且还在305位上包含选自丝氨酸和苏氨酸的替换氨基酸。
本发明还涉及这样的经修饰的家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸，并且还在410位上包含选自谷氨酰胺和天冬酰胺的替换氨基酸。
本发明还包括这样的家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸残基，并且还包括用丝氨酸残基替换231和305位上的氨基酸(即231S、305S)，并将410位氨基酸替换为谷氨酰胺。包含这些突变的经修饰的家族6纤维素酶可来自丝状真菌，例如里氏木霉。
本发明还涉及这样的经修饰的家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸残基，并且相对于母体纤维素酶具有提高的热稳定性，通过“T50”来衡量，比相应的母体纤维素酶高约5℃到约30℃，或高约9℃到约20℃。
本发明还涉及这样的经修饰的家族6纤维素酶，其在413位上包含替换的脯氨酸残基，并且最高活性温度(Topt)比母体家族6纤维素酶的Topt提高约1.5℃到约30℃，或高约2.5℃到约20℃。本发明还涉及这样的经修饰的家族6纤维素酶，其在413位上包含脯氨酸残基，并且其最高活性pH(pHopt)相对于母体纤维素酶提高约0.5单位到约6.0单位。
本发明还涉及选自下组的经修饰的家族6纤维素酶：
TrCel6A-S413P(SEQ ID NO：12)；
TrCel6A-G82E-G231S-N305S-R410Q-S413P(SEQ ID NO：13)；
TrCel6A-G231S-S413P(SEQ ID NO：14)；
TrCel6A-N305S-S413P(SEQ ID NO：15)；
TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO：16)；
TrCel6A-G231S-N305S-S413P(SEQ ID NO：17)；
TrCel6A-G231S-R410Q-S413P(SEQ ID NO：18)；
TrCel6A-N305S-R410Q-S413P(SEQ ID NO：19)；
TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(SEQ ID NO：20)；
HiCel6A-Y420P(SEQ ID NO：21)；和
PcCel6A-S407P(SEQ ID NO：22)。
本发明还涉及用于指导经修饰的家族6纤维素酶从宿主微生物中表达和分泌的遗传构建体，所述宿主微生物包括但不限于里氏木霉菌株。
本发明还涉及包含下述DNA序列的遗传构建体，所述DNA序列编码在413位上包含替换的脯氨酸残基的经修饰的家族6纤维素酶，所述DNA序列与调节其从宿主微生物中表达和分泌的DNA序列有效连接。优选地，调节经修饰的家族6纤维素酶表达和分泌的DNA序列来自用于表达该经修饰的纤维素酶的宿主微生物。宿主微生物可以是酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者丝状真菌如里氏木霉。
本发明还涉及包含编码经修饰家族6纤维素酶之DNA序列的遗传构建体，所述经修饰的家族6纤维素酶在413位上包含替换的脯氨酸残基，并且还包含用丝氨酸替换231和305位上的氨基酸以及用谷氨酰胺替换410位上的氨基酸。该DNA序列与调节其从宿主微生物中表达和分泌的DNA序列有效连接。优选地，所述调节经修饰的家族6纤维素酶表达和分泌的DNA序列来自丝状真菌，包括但不仅限于里氏木霉。
本发明还涉及经遗传修饰的微生物，其能够表达和分泌在413位上包含替换的脯氨酸残基的经修饰的家族6纤维素酶，并且包含编码经修饰的家族6纤维素酶的遗传构建体。在一个实施方案中，所述经修饰的家族6纤维素酶还在231位和305位上包含丝氨酸残基，并在410位上包含谷氨酰胺残基。优选地，所述经遗传修饰的微生物是酵母或丝状真菌。所述经遗传修饰的微生物可以是酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)或原毛平革菌属(Phanerochaete)的物种。
本发明还涉及413位上包含脯氨酸残基的经修饰的家族6纤维素酶用于处理纤维素底物的用途。
本发明还涉及生产经修饰的家族6纤维素酶的方法，包括转化酵母或真菌宿主，选择表达所述经修饰的家族6纤维素酶的重组酵母或真菌菌株，并在诱导经修饰的家族6纤维素酶表达的条件下在深层液体发酵(submerged liquid fermentation)中培养所选择的重组菌株。
413位上包含替换的脯氨酸残基的本发明家族6纤维素酶相对于野生型家族6纤维素酶显示出提高的热稳定性以及嗜热性或嗜碱性。不希望受理论的束缚，经修饰的家族6纤维素酶的热稳定性提高是由于通过提高小α-螺旋的稳定性而稳定家族6纤维二糖水解酶中C端环的氨基酸替换。
这类纤维素酶可用于需要在高于天然酶的温度和/或pH值下的酶稳定性及活性的多种工业应用中。例如，如本文所述的经修饰的家族6纤维素酶可用于以下目的：使木质纤维原料糖化，以生产可发酵糖和燃料醇，改进饲料在反刍和非反刍动物中的可消化性，制纸浆和造纸，从牛仔布中释放染料并使其软化。
本发明概述不一定描述了本发明的所有特征。
附图说明
从以下的描述可更加明确本发明的这些特征和其他特征，其中参考以下附图，其中：
图1显示家族6纤维素酶之间的氨基酸序列比对。将各个纤维素酶的氨基酸编号与里氏木霉Cel6A(TrCel6A；SEQ ID NO：1)的编号相比，如各序列左侧和右侧所指示的。213、305、410和413位(相对于TrCel6A)上的残基用星号标出。与TrCel6A中相应氨基酸相同的残基为黑体。对具有纤维素酶结合结构域的纤维素酶而言，只展示了其催化核心序列。CfCel6B(SEQ ID NO：2)；HiCel6A(SEQ ID NO：4)；HiCel6B(SEQ IDNO：11)；MtCel6A(SEQ ID NO：9)；NpCel6A(SEQ ID NO：5)；OpC2Cel6F(SEQ ID NO：6)；PE2Cel6A(SEQ ID NO：8)；TfCel6A(SEQID NO：10)；TfCel6B(SEQ ID NO：3)。
图2描绘了质粒载体a)YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体，b)YEpFLAGΔKpn10-cbh2，其指导天然和经修饰的TrCel6A从重组酿酒酵母中表达和分泌(如果发现针对克隆进相同载体的TrCel6变体则具有相同的结构)，c)YEpFLAGΔKpn10-PcCel6A，其指导天然和经修饰的PcCel6A从重组酿酒酵母中表达和分泌(如果发现针对克隆进相同载体的PcCel6变体则具有相同的组织)，d)YEpFLAGΔKpn10-HiCel6A，其指导天然和经修饰的HiCel6A从重组酿酒酵母中表达和分泌(如果发现针对克隆进相同载体的HiCel6变体则具有相同的组织)。
图3描述了用于转化和指导经修饰的TrCel6A从重组的里氏木霉中表达和分泌的载体pC/X-S413P-TV。如所示，TrCel6A-S413P基因与cbh1(TrCel7A)基因的启动子、Trxyl11B(TrXyl11B)基因的分泌信号肽和天然cbh2(TrCel6A)基因的转录终止子有效连接。选择标记是粗糙链孢霉(Neurospora crassa)pyr4基因。
图4显示预孵育温度对相对残余活性(％)的影响，其通过在45℃和75℃之间的温度下孵育15分钟后在以下温度下在30分钟的测定中从β-葡聚糖释放的还原糖来测量，a)65℃，天然TrCel6A和经修饰的家族6
图4显示预孵育温度对相对残余活性(％)的影响，其通过在45℃和75℃之间的温度下孵育15分钟后在以下温度下在30分钟的测定中从β-葡聚糖释放的还原糖来测量，a)65℃，天然TrCel6A和经修饰的家族6纤维素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A-R410Q-S413P、TrCel6A-G231S-N305S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A-N305S-R410Q-S413P和TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P；b)60℃，天然PcCel6A和经修饰的家族6纤维素酶PcCel6A-S407P；c)65℃，天然HiCel6A和经修饰的家族6纤维素酶HiCel6A-Y420P。
图5显示了增加预孵育时间对相对残余活性(％)的影响，其通过30分钟测定中从β-葡聚糖底物释放的还原糖来测量，a)在60℃下孵育0-120分钟后，65℃下天然TrCel6A和经修饰的家族6纤维素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A-R410Q-S413P、TrCel6A-G231S-N305S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A-N305S-R410Q-S413P和TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P和b)在55℃孵育0-120分钟后，60℃下天然PcCel6A和经修饰的家族6纤维素酶PcCel6A-S407P。
图6显示在pH 5.0下孵育30分钟期间温度对酶活性的影响，a)天然TrCel6A和经修饰的家族6纤维素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A-G82E-G231S-N305S-R410Q-S413P、TrCel6A-R410Q-S413P，TrCel6A-G231S-N305S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A-N305S-R410Q-S413P和TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P、b)天然PcCel6A和经修饰的家族6纤维素酶PcCel6A-S407P和c)天然HiCel6A和经修饰的家族6纤维素酶HiCel6A-Y420P的酶活性。将数据针对在对各酶的最适温度下所观察到的活性进行归一化。
图7显示在pH 3.95-7.45下孵育30分钟期间pH对酶活性的影响，a)天然TrCel6A和经修饰的家族6纤维素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A-G82E-G231S-N305S-R410Q-S413P、TrCel6A-R410Q-S413P、TrCel6A-G231S-N305S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A-N305S-R410Q-S413P和TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P、b)天然PcCel6A和经修饰的家族6纤维素酶PcCel6A-S407P和c)天然HiCel6A和经修饰的家族6纤维素酶HiCel6A-Y420P的酶活性。将数据针对各酶在最适pH下所观察到的活 性进行归一化。
图8显示50℃下在50mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中不存在底物时预孵育0、4、20.5、28、40.5、52、68、76和96小时后，包含TrCel6A或TrCel6A-S413P(以及所有其余的天然里氏木霉纤维素酶组分)的完整木霉属纤维素酶在经预处理的木质纤维素底物的酶促水解中的相对活性。
优选的实施方案描述
本发明涉及经修饰的纤维素酶。更具体地，本发明涉及具有增强的热稳定性、嗜碱性和/或嗜热性的经修饰的家族6纤维素酶。本发明还涉及包含编码经修饰的家族6纤维素酶的核苷酸序列的遗传构建体，用于从宿主菌株中生产经修饰的家族6纤维素酶的方法，以及经修饰的家族6纤维素酶在纤维素水解中的用途。
以下的描述是一个优选的实施方案，其仅用于举例，而不限制实践本发明所必需特征的组合。
经修饰的家族6纤维素酶
家族6(先前称作B家族)纤维素酶是通过倒转化端基异构碳的构型来水解纤维素中β-1，4糖苷键的一组酶(Claeyssens，M.and Henrissat，B.1992，Protein Science 1：1293-1297)。家族6纤维素酶共享广泛的氨基酸序列相似性(图1)。如果一种纤维素酶包含其他家族6纤维素酶共有的氨基酸(包括可作为催化残基的两个天冬氨酸(D)残基)，则其被分类为家族6纤维素酶。这些天冬氨酸残基存在于175和221位(见图1；基于TrCel6A(里氏木霉Cel6A酶)氨基酸编号)上。迄今为止鉴定的大部分家族6纤维素酶是嗜温的。然而，该家族也包含来自褐色嗜热裂孢菌的热稳定纤维素酶(TfCel6A和TfCel6B)和来自特异腐质霉的嗜碱纤维素酶(HiCel6A和HiCel6B)。
家族6催化结构域的拓扑结构是带有中心β桶的α/β桶，含有通过五个α螺旋连接的七条平行的β链。家族6纤维二糖水解酶与内β-1，4-葡聚糖酶之间一个重要的差异是N端和C端环的长度，所述N端和C端环存在于活性位点两侧并且负责它们对纤维素的功能性作用。在纤维二糖水解酶中，广阔的C端环与带有活性位点的N端环形成通道。这赋予了纤维二糖水解酶攻击结晶纤维素末端的独特特性，其中N端和C端环将单个纤维素链保持在活性位点中，并有利于底物的连续降解。在内切-β-1，4-葡聚糖酶中，C端环长度减少，N端环将其拉离活性位点，并且也可以更短，导致更开放的活性位点，允许接近纤维素的内部β-1，4糖苷键进行水解。通过缺失Cellitlomonas fimi纤维二糖水解酶Cel6B C端环的十五个氨基酸来模拟内切-β-1，4-葡聚糖酶的性质，从而证实了这些环在6家族酶对纤维素的功能性作用中的功能(Meinke.A.等.1995.J.Biol.Chem.270：4383-4386)。该突变增强了酶对可溶纤维素(例如羧甲基纤维素)的内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，并改变了其对不溶性纤维素的纤维二糖水解酶活性。
[47]可按照本文列出的一般策略和方法修饰的家族6纤维素酶的非限制性实例在下表1中描述。
表1：家族6纤维素酶
[0066][48]优选的家族6纤维素酶的实例(其并非旨在限制)包括里氏木霉Cel6A、特异腐质霉Cel6A、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)Cel6A、粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)Cel6B、褐色嗜热裂孢菌Cel6B。更优选地，本发明的经修饰纤维素酶包括经修饰的里氏木霉Cel6A酶。
“经修饰的家族6纤维素酶”或“经修饰的纤维素酶”指这样的家族6纤维素酶，其中使用本领域技术人员已知的技术将413位上的氨基酸(所述位置根据所述经修饰纤维素酶与SEQ ID NO：1中定义的里氏木霉Cel6A氨基酸序列之间的序列比对来确定)替换为脯氨酸，并且所述酶显示超过相应未修饰家族6纤维素酶的热稳定性、嗜热性、嗜碱性或其组合的改进。用于引入氨基酸替换的技术包括但不限于定点诱变、盒诱变、随机诱变、合成寡核苷酸构建、克隆和其他遗传工程技术(Eijsink VG等.2005.Biomol.Eng.22：21-30)。应当理解，经修饰的纤维素酶可衍生自任何家族6纤维素酶。经修饰的纤维素酶可衍生自野生型纤维素酶，或者衍生自已含有其他氨基酸替换的纤维素酶。
就本发明目的而言，母体纤维素酶是这样的纤维素酶，其原始氨基酸中413位上不含有脯氨酸替换(所述位置根据所述经修饰纤维素酶与SEQ ID NO：1中定义的里氏木霉Cel6A氨基酸序列的序列比对来确定)，并且在其他方面与该经修饰的纤维素酶相同。因此，母体纤维素酶可以是这样的纤维素酶，其在其他位置上含有通过遗传工程或其他技术引入的氨基酸替换。然而，母体纤维素酶不包括其中413位上天然存在的氨基酸是脯氨酸的那些纤维素酶。
“TrCel6A编号”表示以TrCel6A的氨基酸序列(表1；图1；SEQID NO：1)为基础，对应于氨基酸位置的编号。如下文所公开并如图1所示的，家族6纤维素酶显示显著的序列相似性程度。因此，通过将氨基酸比对以优化纤维素酶之间的序列相似性和通过使用TrCel6A的氨基酸编号作为编号的基础，可以相对于TrCel6A来确定其他纤维素酶中氨基酸的位置。
酶的热稳定性可以通过其熔解温度(melting temperature，Tm)、在确定温度下的半衰期(t1/2)和孵育确定的时间后丧失50％原始酶活性的温度(T50)来定义。与其嗜温对应物相比，嗜热酶一般显示被鉴定为对酶热稳定性的贡献因子(contributing factor)的共有结构元件(参阅如Sadeghi，M.等.2006.Biophvs.Chem.119：256-270)。这些结构元件包括更高的疏水性、更好的包装(packing)、增加的极性表面积、环的缺失或减短、相互作用、更小并且更少量的空腔、α螺旋稳定性、芳族相互作用的提高、额外的二硫键或金属结合位点和糖基化位点、降低的甘氨酸含量和提高的脯氨酸含量、增加的氢键和盐桥、改善的静电相互作用、减少的不耐热残基以及构象应变的释放。
就本发明的目的而言，如果纤维素酶具有与母体纤维素酶的T50相比至少高约4℃或至少高约9℃的T50，或例如纤维素酶具有与母体纤维素酶的T50相比高约4℃到约30℃或其间任意量，或高约9℃到约30℃或其间任意量，则所述纤维素酶关于相应的母体纤维素酶显示提高的热稳定性。T50是所述经修饰酶或天然酶在预孵育15分钟后保留50％残余活性的温度，并可通过实施例10.4中详述的测定法测定。如实施例10.4中所公开的，将65℃下30分钟测定中β-葡聚糖的残余活性归一化为100％。
所述经修饰的家族6纤维素酶可具有这样的T50，其比相应母体纤维素酶的T50高约4℃到约30℃或其间任何范围，高约5℃到约20℃或其间任何范围，高约8℃到约15℃或其间任何范围，或高约9℃到约15℃或其间任何范围。例如，所述经修饰的纤维素酶可具有比相应母体纤维素酶至少高约4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30℃的T50。
经修饰的家族6纤维素酶也可以被表征为具有高于65℃(或比相应母体家族6纤维素酶高至少5℃)的T50，例如，经修饰的纤维素酶可具有从约65℃到约90℃或其间任意量的T50。经修饰的家族6纤维素酶可具有高于70℃(或比母体家族6纤维素酶高至少9℃)的T50，例如经修饰的纤维素酶可具有从约70℃到约90℃或其间任意量的T50。家族6纤维素酶可具有50、55、60、65、70、75、80、85或90℃或其间任意量的T50。
就本说明书的目的而言，如果纤维素酶显示比相应母体纤维素酶的最适温度(Topt)至少高约1.5℃的Topt，则该纤维素酶相对于相应母体纤 维素酶显示提高的嗜热性。例如，如果纤维素酶显示比相应母体纤维素酶的Topt高约1.5℃到约30℃或其间任意量的最适温度(Topt)，则该纤维素酶具有提高的嗜热性。最适温度或Topt表示纤维素酶显示其最高活性的最高温度。就本说明书的目的而言，如实施例10.1中所详述的，通过测量针对β-葡聚糖底物之活性的温度曲线来测定家族6纤维素酶的Topt。纤维素酶活性的温度曲线在其最适pH下测量。
经修饰的家族6纤维素酶可具有比相应母体家族6纤维素酶的Topt至少高约1.5℃到约30℃的Topt。在一个优选的实施方案中，经修饰的家族6纤维素酶的Topt比母体家族6纤维素酶的Topt至少高约2.5℃到约20℃。例如，经修饰的家族6纤维素酶可具有比相应母体纤维素酶的Topt至少高约1.5、2.5、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0或30℃的Topt。
术语“热稳定性”和“嗜热性”在文献中可相互交换使用。然而，本文所定义术语的使用是与本领域中这些术语的用法一致的(Mathrani，I和Ahring，B.K.1992 Appl.Microbiol.Biotechnol.38：23-27)。
就本发明的目的而言，如果纤维素酶显示比母体纤维素酶的pHopt至少高约0.5个单位的pHopt，则该纤维素酶相对于相应母体纤维素酶显示提高的嗜碱性。pHopt表示纤维素酶展示其最高活性的最高pH。就本说明书的目的而言，如实施例10.2中所公开的，通过测量家族6纤维素酶的pH曲线来测定pHopt。
经修饰的家族6纤维素酶可具有比母体家族6纤维素酶的pHopt至少高约0.5单位到约6.0单位或其间任意量的pHopt。在一个优选的实施方案中，经修饰的家族6纤维素酶的pHopt比母体家族6纤维素酶的pHopt至少高约0.8单位到约5.0单位或其间任意量。例如，纤维素酶的pHopt可比母体纤维素酶的pHopt高约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0个单位。
如本文进一步详述的，已制备了显示增强的热稳定性、嗜热性、嗜碱性或其组合的若干突变体家族6纤维素酶。表2中展示了若干突变体的列表，这不应以任何方式被认为是限制性的。
表2：经修饰的家族6纤维素酶
| 新的突变体TrCel6A | SEQ ID NO： |
| TrCel6A-S413P | 12 |
| TrCel6A-G82E-G231S-N305S-R410Q-S413P | 13 |
| TrCel6A-G231S-S413P | 14 |
| TrCel6A-N305S-S413P | 15 |
| TrCel6A-R410Q-S413P | 16 |
| TrCel6A-G231S-N305S-S413P | 17 |
| TrCel6A-G231S-R410Q-S413P | 18 |
| TrCel6A-N305S-R410Q-S413P | 19 |
| TrCel6A-G23lS-N305S-R410Q-S413P | 20 |
| HiCel6A-Y420P | 21 |
| PcCel6A-S407P | 22 |
包含经修饰的家族6纤维素酶的遗传构建体
本发明还涉及遗传构建体，其包含编码经修饰的家族6纤维素酶的DNA序列，所述DNA序列与指导该经修饰的家族6纤维素酶从宿主微生物中表达和分泌的调节DNA序列有效连接。调节序列优选地在真菌宿主中发挥功能。调节序列可来自在工业发酵条件下在宿主微生物中高度表达和分泌的基因。在一个优选的实施方案中，调节序列来自任何一个或多个里氏木霉纤维素酶或半纤维素酶基因。
如本领域所公知的，遗传构建体可进一步包含选择标记，使得能够分离用所述构建体转化的经遗传修饰的微生物。选择标记可赋予宿主生物对抗生素的抗性或在缺乏特定营养素的培养基上生长的能力，否则所述宿主生物不能够在这些条件下生长。本发明不受限于对选择标记的选择，技术人员可容易地确定合适的标记。在一个优选的实施方案中，选择标记赋予对潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、遗传霉素或G418的抗性，补回宿主微生物在trp、arg、leu、pyr4、pyr2、ura3、ura5、his或ade基因之一中的缺陷，或赋予在乙酰胺作为唯一氮源时生长的能力。在一个更优选的实施方案中，选择标记是编码乳清苷-5’-脱羧酶的粗糙链孢霉pyr4基因。
包含经修饰家族6纤维素酶的经遗传修饰的微生物
经修饰的家族6纤维素酶可由经遗传修饰的微生物表达和分泌，所述经遗传修饰的微生物通过用编码经修饰的家族6纤维素酶的遗传构建体转化宿主微生物来产生。宿主微生物优选是酵母或丝状真菌，包括但不限于酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、木霉属、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属、镰孢菌属、腐质霉属、脉孢菌属或原毛平革菌属的物种。宿主微生物一般是其中编码任何或所有家族6纤维素酶的基因都已被缺失的微生物。在一个最优选的实施方案中，宿主微生物是里氏木霉的工业菌株。
可通过任何微生物转化领域技术人员已知的多种方法将遗传构建体引入宿主微生物中，包括但不限于用CaCl2处理细胞、电穿孔、生物射弹、PEG介导的原生质体融合(例如White等，WO 2005/093072)。
在选择了表达经修饰家族6纤维素酶的重组真菌菌株后，可在诱导该经修饰家族6纤维素酶表达的条件下在深层液体发酵中培养所选择的重组菌株。
纤维素底物的水解
本发明还涉及本文描述的经修饰家族6纤维素酶用于水解纤维素底物的用途。术语“纤维素底物”表示来自植物生物量并包含纤维素的任何底物，包括但不限于用于生产乙醇或其他高价值产品的木质纤维素(lignocellulosic)原料、动物饲料、林业废物如纸浆和木片以及纺织品。
术语“木质纤维素原料”表示任何类型的植物生物量，例如但不限于非木本植物生物量；栽培作物，例如但不限于草，例如但不限于C4草，例如柳枝稷(switch grass)、大米草(cord grass)、黑麦草(rye grass)、芒草(miscanthus)、草芦(reed canary grass)或其组合；糖加工残余物，例如但不限于蔗渣、甜菜浆(beet pulp)或其组合；农业残余物，例如但不限于大豆秆、玉米秆、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米芯、麦秆、芸苔秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维或其组合；林业生物量，例如但不限于再循 环的木浆纤维、锯屑、硬木(例如白杨)、软木或其组合。
在用于生产乙醇或其他产品的木质纤维素原料的糖化中，本发明的纤维素酶可用于水解经预处理的原料，所述原料例如但不限于通过蒸汽暴破(steam explosion)产生(见Foody，美国专利No.4,461,648)。预处理可包括用蒸汽、酸、或通常用蒸汽和酸的组合来处理原料，从而当纤维原料被转化为浆状的结构时纤维素酶表面积大幅增加，期间几乎没有纤维素被转化为葡萄糖。然后本发明的纤维素酶可被用于在后续步骤中将纤维素酶水解为葡萄糖。随后葡萄糖可被转化为乙醇或其他产品。
可向木浆或木片中添加本发明的经修饰纤维素酶，以增强木浆的漂白或降低其精制(refining)能量。木浆可通过化学制浆过程或通过机械精制产生。
提高家族6纤维素酶的热稳定性
通过在不同的温度下在无底物时预孵育酶来比较突变体家族6纤维素酶的热稳定性。15分钟后，使用可溶性β-葡聚糖作为底物，通过标准测定法测定纤维素酶的残余活性。
通过对经修饰的TrCel6A-S413P与母体TrCel6A进行比较研究，测定了S413P突变(单独或与G231S、N305S和R410Q中一个或多个组合)对家族6纤维素酶热稳定性的影响。在更高的温度下预处理高达120分钟后，前者比后者保留更高的残余活性(图5a)。
测定使家族6纤维素酶保留50％残余活性的预处理温度T50。对经修饰的家族6纤维素酶TrCel6A-S413P而言，T50为64.1℃，相比之下，母体TrCel6A为59℃(图4a)。这代表通过引入S413P突变将热稳定性提高超过5℃。
其他TrCel6A变体的T50比野生型TrCel6A至少高3.2℃。PcCel6A-S407P和Hicel6A-Y420P与其各自的母体酶相比也显示了T50的提高(图4b和c)。
提高家族6纤维素酶的嗜热性
通过测量测定温度对β-葡聚糖水解的影响来测定经修饰家族6纤维素酶的嗜热性。
与其各自野生型相比，所有经修饰的家族6纤维素酶均显示对β-葡聚糖水解而言提高的Topt，只有变体TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，而在另一方面，该变体显示在广阔的温度范围内具有高于80％的最大活性(图6)。在所有的TrCel6A变体中，TrCel6A-S413P具有72.2℃的较高最适温度，与野生型TrCel6A相比嗜热性提高5.6℃(图6a)。PcCel6A-S407P和HiCel6A-Y420P与其各自的野生型相比也显示最适温度的提高(图6b和c)。
提高家族6纤维素酶的嗜碱性
还研究了S413P突变(单独或与G231S和R410Q中的一个或多个组合)对家族6纤维素酶pH/活性曲线的影响。
所有经修饰的家族6纤维素酶与其野生型相比均显示提高的嗜碱性。对TrCel6A而言，变体TrCel6A-G231S-R410Q-S413P观察到显著的迁移(+1.25pH单位)、然后是TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(+1.01pH单位)。
包含与非家族6纤维素酶组合的经修饰家族6纤维素酶的纤维素酶系显示提高的热稳定性。包含TrCel6A-S413P的木霉纤维素酶系在无底物时于50℃下孵育96小时后维持其最高活性的至少80％，而包含母体TrCel6A的相应纤维素酶系仅维持其最高活性的50％(图8)。
总而言之，本发明改进的热稳定、嗜碱和/或嗜热突变体家族6纤维素酶在413位上包含脯氨酸残基，并可进一步包含一个或多个以下的氨基酸替换：
(i)231位上的替换氨基酸，如极性氨基酸，包括但不仅限于丝氨酸；
(ii)305位上的替换氨基酸，如极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸；
(iii)410位上的替换氨基酸，例如极性氨基酸，包括但不限于谷氨酰胺；和
(iv)(i)到(iii)中所述的任何上述突变的组合。
优选的家族6纤维素酶突变体的非限制性实例在表2中给出，其包含与上文所列氨基酸替换组合的S413P。
另外，本发明的经修饰家族6纤维素酶可包含与S413P替换组合的上文未列出的氨基酸替换。
上文的描述不旨在以任何方式限制所要求保护的本发明。另外，对于本发明的方案而言，所讨论的特征组合可能不是绝对必需的。
实施例
本发明将在以下的实施例中进一步阐述。然而，应当理解这些实施例仅用于阐述的目的，并且不应被用于以任何方式限制本发明的范围。
实施例1描述了以下实施例中使用的菌株和载体。实施例2-5描述了TrCel6A基因的随机诱变、将随机诱变文库克隆进酵母载体以及用于鉴定具有提高的热稳定性的经修饰家族6纤维素酶的高通量筛选。实施例6-8描述了在替代酵母载体中克隆、重组和表达经修饰的和天然的家族6纤维素酶基因用于更高表达。实施例9描述了经修饰家族6纤维素酶的酶特征。实施例10描述了用于在丝状真菌中表达和分泌经修饰家族6纤维素酶的遗传构建体。实施例11描述了用表达经修饰的家族6纤维素酶的遗传构建体转化真菌原生质体。实施例12描述了在深层液体培养中由经修饰的微生物生产经修饰的家族6纤维素酶。实施例13描述了对完整木霉纤维素酶(包含经修饰的家族6纤维素酶与来自其他家族的纤维素酶的组合)的表征。
实施例1：菌株和载体
酿酒酵母菌株DBY747(his3-Δl leu2-3leu2-112ura3-52trp1-289(琥珀型突变)gal(s)CUP(r))得自ATCC。酿酒酵母菌株BJ3505(pep4::HIS3prb-Δ1.6R HIS3 lys2-208trp1-Δ101ura3-52gal2 can1)得自Sigma，并且是氨基端酵母FLAG表达试剂盒的一部分。
本文所述的实验中使用来源于RutC30(ATCC #56765；Montenecourt.B.and Eveleigh.D.1979.Adv.Chem.Ser.181：289-301)的包含已破坏的天然TrCel6A基因的里氏木霉菌株。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株HB101(F-thi-1 hsdS20(rB -，mB -)supE44 recA13 ara-14 leuB6 proA2 lacY1 galK2 rpsL20(strr)xyl-5mtl-1)和DH5α(F-φ80lacZΔM15Δ(lαcZYA-argF)U169 recA1 endA1hsdR17(rk -，mk +)phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ-)得自Invitrogen。
特异腐质霉和黄孢原毛平革菌菌株得自 
(分别为#22082TM和#201542TM)。
YEp352/PGK91-1载体得自国立卫生研究院。YEpFLAG-1载体作为氨基端酵母FLAG表达试剂盒的一部分得自Sigma。 
-1载体作为Altered 
II体外诱变系统的一部分得自Promega。 
II KS-载体得自Stratagene。
实施例2：将TrCel6A基因克隆进YEp352/PGK91-1中并转化酵母
2.1从里氏木霉中分离总RNA并产生总cDNA。
在如实施例13中所述的诱导条件下培养里氏木霉生物量，然后使用50mg生物量，用Absolutely 
小量制备试剂盒(Stratagene)根据制造商的方法提取总RNA。使用SuperScriptTMII逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的方法从总RNA产生总cDNA。
2.2克隆并转化酵母
为了便于使用NheI和KpnI限制性酶进行克隆，使用DNA聚合酶I大(Klenow)片段将YEp352/PGK91-1载体1936位上的单一NheI位点补平，得到YEp352/PGK91-1ΔNheI。
使用向编码序列上游引入StuI-NheI位点和向下游引入KpnI-BglII-StuI位点的引物C2STU5和C2STU3，通过PCR从总cDNA(如实施例2.1中所述产生)中扩增编码TrCel6A的cbh2基因。平行地，使用向扩增子5’端引入BglII并在3’端引入NheI位点的引物，通过PCR从TrXyl11B的基因组克隆(pXYN2K2，实施例11.3)中扩增 TrXyl11B基因的分泌信号肽，随后使用这些限制性位点将其克隆进 
II KS-(Stratagene)中，得到质粒pXYNSS-Nhe。然后将该扩增子克隆进pXYNSS-Nhe中单一NheI和BglII位点中。随后使用引物(BGL2XYF和C2STU3))通过PCR从其中间构建体中扩增片段，该片段包含与5’和3’端具有BglII位点的TrXyl11B分泌信号肽有效连接的TrCel6A基因。将该扩增子克隆进YEp352/PGK91-1ΔNheI载体的BglII位点中，得到YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体(图2a)，并使用Gietz，R.D.和Woods，R.A.(Gietz.R.D.和Woods，R.A.2002.Meth.Enzvm.350：87-96)所述方法转化酵母菌株DBY747并涂板到SC-Ura平板上。引物序列如下：
StuI NheI
C2STU5：5’GAT AGG CCT GCT AGC TGC TCA AGC GTC TGG GGC(SEQ ID NO：24)
StuI BglII KpnI
C2STU3：5’ATC AGG CCT AGA TCT GGT ACC TTA CAG GAA CGA TGG(SEQ IDNO：25)
BglII
BGL2XYF：5’GAT CAG ATC TAT GGT CTC CTT CAC CTC CCT C(SEQ ID NO：26)
SC-Ura平板含有：
组分 g/L
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源(BD) 1.7
(NH4)2SO4(Sigma) 5.0
不含尿苷的完全补充培养基(Clontech) 0.77
琼脂(BD) 17.0
葡萄糖(Fisher) 20.0
pH 5.6
实施例3：产生cbh2的易错PCR文库
使用两种方法产生随机诱变文库：Mn2+/dITP方法和偏向(biased)核苷酸方法。对Mn2+/dITP方法而言，使用上述C2STU3和BGL2XYF引物在两步式PCR法中从YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体中扩增TrCel6A基因。在第一步中，扩增在20μM MnCl2存在下进行20个循环。第二步用相同的引物进行，但是使用来自第一步的产物作为模板，并使用0、25、50、75或100μM dITP(0μM作为对照)。对偏向核苷酸方法而言，分别使用1∶3、1∶5或1∶10摩尔比的嘌呤碱基和嘧啶碱基进行PCR。
为主要得到酶核心中的突变，使用XhoI和KpnI限制性位点将两种情况下的最终扩增子克隆进YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体(XhoI恰好在编码酶连接子中S55密码子的序列后切割)中并转化酿酒酵母菌株DBY747。
实施例4：产生TrCel6A的定点半随机文库
甘氨酸残基不具有β-碳，因此具有显著更大的主链构象自由度。通过分析TrCel6A的三维结构，靶向了4个甘氨酸残基来降低该自由度，即G90、G85、G231和G384。将除G231以外的所有位置饱和，通过大引物PCR将G231随机突变为丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，所述PCR使用以下引物：
G90toXxx：5’CCA ACA AAA GGG TTN NNT GAA TAC GTA GCG G(SEQ ID NO：27)
G85toXxx：5’CCC AAG GAG TGA CNN NAA CAA AAG GGT TG(SEQ ID NO：28)
G231toA/P/S/T：5’GGT GAC CAA CCT CNC NAC TCC AAA GTG TG(SEQ ID NO：29)
G384toXxx：5’CCG CAA ACA CTN NNG ACT CGT TGC TG(SEQ ID NO：30)
将所有扩增子克隆在如实施例3中所述的YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体中。
实施例5：在TrCel6A基因文库中筛选具有提高的热稳定性的经修饰家族6纤维素酶
如下筛选按照实施例3和4产生的总计3371个TrCel6A变体：在 Vortemp设备(Labnet)中，于650rpm和30℃下将每个酵母菌落在96-深孔平板的孔中培养2天，所述孔含有1mL YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基和一个1.5mm玻璃珠。将平板以3,000×g离心5分钟，然后使用Bio-Dot设备(Bio-Rad)将300μL上清液各滤过两张Biodyne B带正电尼龙膜(Pall Gelman)。
将膜置于含50mM柠檬酸钠、pH 4.8的潮湿(不滴水的)Whatman纸上。将一张在62℃下孵育12分钟，另一张在室温下孵育(对照)。然后将膜置于含β-葡聚糖底物的琼脂平板上，并在潮湿培养箱中于50℃下孵育过夜：
组分 g/L
(NH4)2SO4(Sigma) 5.0
β-葡聚糖(Barley，Medium Viscosity；Megazyme) 2.0
琼脂(BD) 17.0
葡萄糖(Fisher) 20.0
pH 5.6
然后通过用0.1％(w/v)刚果红溶液覆盖琼脂平板来染色30-60分钟，然后用软化水漂洗2-3次以去除未结合的染料，并用1M NaCl覆盖10-15分钟。可以观察亮区，并在对照和用热处理膜覆盖的平板之间进行比较。每块平板至少由两个人仔细察看，与野生型TrCel6A对照相比，每个在62℃下孵育12分钟后显示维持其活性的阳性变体都被认为可能是阳性的。在微量培养物中再次产生每个可能的阳性克隆，以允许在另外的情况下观察表型并降低假阴性的可能性。
将来自该筛选的五个阳性克隆测序，以鉴定其含有的突变。克隆E6含有S413P突变，克隆G3和F7均含有G231S突变，克隆A3含有N305S突变，克隆7含有连接肽末端的G82E突变以及R410Q突变。
实施例6：将经修饰的TrCel6A基因克隆进YEpFLAG-1载体中，以用 于由酿酒酵母更高地表达
为了便于将实施例5中鉴定的经修饰TrCel6A基因克隆进YEpPLAG-1载体中从而将这些基因与α接合因子分泌信号肽有效连接，两种修饰是必需的。首先，去除YEpFLAG-1载体的分泌信号肽序列(bp 1457)中存在的单一KpnI位点。这使用两个互补的诱变引物(5′-FLAGΔKpnI和3′-FLAGΔKpnI)通过PCR完成。然后用DpnI将诱变反应物在37℃下消化1小时，通过将管置于沸水中并允许其缓慢冷却至室温而使质粒重新环化。将该反应物直接转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞。对仅用KpnI消化一次的克隆进行测序，以验证想要的突变，将其用于进一步工作并命名为YEpFLAGΔKpnI。引物序列如下：
ΔKpnI
5’-FLAGΔKpnI：5′CTA AAG AAG AAG GGG TAC ATT TGG ATA AAA GAG AC(SEQ IDNO：31)
ΔKpnI
3’-FLAGΔKpnI：5′GTC TCT TTT ATC CAA ATG TAC CCC TTC TTC TIT AG(SEQ ID NO：32)
其次，使用在扩增片段的5′端引入XhoI-NheI位点和在3′端引入KpnI-ApaI位点的引物，通过PCR从pCOR132(实施例11.2)中扩增里氏木霉cbh1基因。然后将该片段作为XhoI/ApaI片段插入经XhoI/ApaI线性化的YEpFLAG-1表达载体中。得到的载体YEpFLAGΔKpn10允许将实施例5中鉴定的经修饰TrCel6A基因作为NheI/KpnI片段插入，从而使编码区与α分泌信号肽有效连接。
使用从Hoffman和Winston(Hoffman，C.S.和Winston，F.1987.Gene 57：267-272)的方法修改而来的方法，从酵母菌株DBY747的转化体中分离含有天然或经修饰的TrCel6A基因的YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体，并将其转化进大肠杆菌HB101化学感受态细胞中。通过用NheI和KpnI消化，从YEp352/PGK91-1ΔNheI-xylss-cbh2载体中移出经修饰的TrCel6A基因，并使用相同的限制性酶克隆进YEpFLAGΔKpn10中。使用Gietz和woods(Gietz，R.D.和Woods，R.A.2002.Meth.Enzym.350：87-96)所述的方法将最终的构建体YEpFLAGΔKpn10-cbh2、YEpFLAGΔKpn10-G82E-R410Q、 YEpFLAGΔKpn10-N305S、YEpFLAGΔKpn10-S413P和YEpFLAGΔKpn10-G231S(图2b)转化进酵母菌株BJ3505中，并在SC-trp平板上涂板。通过DNA序列分析来验证所有变体的克隆区域的完整性。该酵母载体所产生的母体TrCel6A的氨基酸序列(SEQ ID NO.23)显示出含有FLAG肽的C端延伸。然而，通过实验确定，该小肽延伸不以任何方式促进母体或经修饰的TrCel6A纤维素酶的热稳定性、嗜热性或嗜碱性。
SC-trp平板含有：
组分 g/L
不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源(BD) 1.7
(NH4)2SO4(Sigma) 5.0
无色氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂(Yeast Synthetic 1Drop-Out Media Supplement without Tryptophan)(Sigma)
琼脂(BD) 20
葡萄糖(Fisher) 20
实施例7：产生其他TrCel6A变体PcCel6A、PcCel6A-S407P、HiCel6A和HiCel6A-Y420P并将其克隆进YEpFLAG-1载体中
7.1产生其他TrCel6A变体。
通过TrCel6A-S413P变体的易错PCR获得TrCel6A变体R410Q-S413P，使用 II DNA聚合酶(Stratagene)克隆进YEp352/PGK91-1ΔNheI中。然后使用引物5′FLAG-Cel6A-GR和3′FLAG-Cel6A-GR将其从该来源中扩增，所述引物分别在NheI位点上游和ApaI位点下游引入与YEpFLAG-1载体同源的序列。
使用诱变引物与引物3′FLAG-Cel6A-GR的组合产生以下TrCel6A突变组合的大引物PCR：G231S-S413P、N305S-S413P、 G231S-N305S-S413P、G231S-R410Q-S413P、N305S-R410Q-S413P和G231S-N305S-R410Q-S413P。分离得到的PCR产物，并将其作为反向引物与正向引物5′FLAG-Cel6A-GR组合，产生最终的构建体。引物序列如下：
5’G231SCBH2 5’GGT GAC CAA CCT CTC TAC TCC AAA GTG TG(SEQ ID NO：35)
5’N305SCBH2 5’CAA TGT CGC CAG CTA CAA CGG G(SEQ ID NO：36)
5’Cel6A-E82G 5’GTA CCT CCA GTC GGA TCG GGA ACC GCT(SEQ ID NO：38)
5’FLAG-Cel6A-GR 5’AGA GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG GAA TTC CTC
GAG GCT AGC TGC TCA AGC G(SEQ ID NO：39)
3’FLAG-Cel6A-GR 5’GAC GGA TCA GCG GCC GCT TAC CGC GGG TCG ACG GGC
CCG GTA CCT TAC AGG AAC G(SEQ ID NO：40)
7.2产生PcCel6A和PcCel6A-S407P。
将冻干的黄孢原毛平革菌重悬于300μL无菌水中，并将50μL涂布在PDA平板上。将平板在24℃孵育4天。用玻璃纸环(cellophane circle)将黄孢原毛平革菌的孢子接种在PDA平板上，并在24℃培养4-6天后收集生物量。然后使用50mg生物量，用Absolutely 小量制备试剂盒(Stratagene)根据制造商的方法分离总RNA。使用SuperscriptTM II逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的方法从总RNA产生总cDNA。使用以下的引物从cDNA中扩增编码PcCel6A的基因：
5’PcCel6A-cDNA 5’CTA TTG CTA GCT CGG AGT GGG GAC AGT GCG GTG GC
(SEQ IDNO：41)
3’PcCel6A-cDNA 5’CTA TTG AAT TCG GTA CCC TAC AGC GGC GGG TTG GCA GCA
GAA AC(SEQ ID NO：42)
通过TA-克隆，根据制造商的建议将PCR扩增子克隆进 
-TEasy载体中。然后使用引物5′FLAG-PcCel6A-GR和3′FLAG-PcCel6A-GR从该来源扩增编码PcCel6A的基因，所述引物分别在NheI位点的上游和SstII位点的下游引入与YEpFLAG-1载体同源的序列。
使用诱变引物5′PcCel6A-S407P与引物3′FLAG-PcCel6A-GR的 组合来产生大引物PCR。分离得到的PCR产物，并作为反向引物与正向引物5′FLAG-PcCel6A-GR组合，产生最终的构建体。引物序列如下：
5’FLAG-PcCel6A-GR
5’AAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTC
GGAGTG GGGACAGTGC(SEQ ID NO：43)
3’FLAG-PcCel6A-GR
5’TGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTACCGCGGCT
ACAGCG GCGGGTTGGC(SEQ ID NO：44)
5’PcCel6A-S407P 5’CCCCGCTACGACCCTACTTGTTCTCTG(SEQ ID NO：45)
7.3产生HiCel6A和HiCel6A-Y420P。
将冻干的特异腐质酶重悬于300μL无菌水中，并将50μL涂布在Emerson YPSS pH 7琼脂平板(0.4％酵母提取物，0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O、1.5％葡萄糖、1.5％琼脂)上。将真菌在45℃孵育6天，然后将孢子接种在Novo培养基(按照Barbesgaard USP#4,435,307)中：在100mL生长期培养基(2.4％CSL，2.4％葡萄糖，0.5％大豆油，pH调节至5.5，0.5％CaCO3)中于37℃下孵育48小时，然后将6mL预培养物转移进100mL生产期培养基(0.25％ NH4NO3、0.56％ KH2PO4、0.44％ K2HPO4、0.075％ MgSO4·7H2O、2％Sigmacell，pH调节至7，0.25％ CaCO3)，将培养物孵育多达4天之后收集生物量。然后使用50mg生物量，用Absolutely 
小量制备试剂盒(Stratagene)根据制造商的方法分离总RNA。使用SuperscriptTM II逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的方法从总RNA产生总cDNA。使用以下的引物从cDNA中扩增编码HiCel6A的基因：
5’HiCel6A-cDNA 5’CTA TTG CTA GCT GTG CCC CGA CTT GGG GCC AGT GC
(SEQ IDNO：46)
3’HiCel6A-cDNA 5’CTA TTG AAT TCG GTA CCT CAG AAC GGC GGA TTG GCA TTA
CGA AG(SEQ ID NO：47)
通过TA-克隆，根据制造商的建议将PCR扩增子克隆进 
-TEasy载体中。然后使用引物5′FLAG-HiCel6A-GR和 3′FLAG-HiCel6A-GR从该来源扩增编码HiCel6A的基因，所述引物分别在NheI位点的上游和ApaI位点的下游引入与YEpFLAG-1载体同源的序列。
使用诱变引物5′HiCel6A-Y420P与引物3′FLAG-HiCel6A-GR的组合来产生大引物PCR。分离得到的PCR产物，并作为反向引物与正向引物5′FLAG-HiCel6A-GR组合，产生最终的构建体。引物序列如下：
5’FLAG-HiCel6A-GR
5’AAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTG
TGCCCC GACTTGGGGC(SEQ ID NO：48)
3’FLAG-HiCel6A-GR
5’AGCGGCCGCTTACCGCGGGTCGACGGGCCCGGTACCTC
AGAACG GCGGATTGGC(SEQ ID NO：49)
5’HiCel6A-Y420P 5’GCCCGCTACGACCCTCACTGCGGTCTC(SEQ ID NO：50)
7.4将其它TrCel6A变体PcCel6A、PcCel6A-S407P、HiCel6A和HiCel6-Y420P克隆进YEpFLAG-1，并转化BJ3505。
用NheI和ApaI消化YEpFLAGΔKpn10载体(实施例6)，并分离空载体片段。克隆该线性片段和实施例8.1和8.3中产生的最终PCR产物，并通过体内重组同时转化(Butler，T.和Alcalde，M.2003.Methodsin Molecular Biology，第231卷：(F.H.Arnold和G.Georgiou编辑)，Humana Press Inc.Totowa(New Jersey)，17-22页)。
用NheI和SstII消化YEpFLAGΔKpn10载体(实施例6)并分离空载体片段。克隆该线性片段和实施例8.2中产生的最终PCR产物，并通过体内重组同时转化。
实施例8：在酵母中以中等规模表达天然和经修饰的家族6纤维素酶
将含有YEpFLAG-ΔKpn10-cbh2的一个分离的BJ3505酵母菌落用于接种20mL试管中的5mL液体SC-trp。在30℃和250rpm过夜孵育后，测量600nm处的吸光度，并用最终OD600达到0.045所需的酵母量接种250mL锥形瓶中的50mL YPEM液体培养基。在30℃和250rpm孵育72小时后，通过3,000×g离心5分钟的步骤收集上清液。以同样方式培养表达TrCel6A变体、野生型HiCel6A和变体、野生型PcCel6A和变体以及空YEpFLAG-1载体的BJ3505菌株。
SC-trp液体培养基含有与实施例7中提到的SC-trp板相同的组分，但是不含琼脂。YPEM液体培养基含有：
实施例9：表征来自酵母培养物上清液的经修饰家族6纤维素酶
9.1比较经修饰的与天然的TrCel6A、HiCel6A和PcCel6A的嗜热性。
通过测量不同的温度下从可溶性β-葡聚糖底物中释放的还原糖来测定每种酶的嗜热性。具体地，在300μL PCR板中，将根据实施例9获得的50μL粗制上清液与预热的50μL 55mM柠檬酸钠pH 5.0中1％(w/v)β-葡聚糖(Barley，Medium Viscosity；Megazyme)在96孔PCR板中不同的10列中混合。将混合物在成梯度的10个不同温度(56℃、58.1℃、59.8℃、62.6℃、66℃、70℃、73.4℃、76.2℃、78.1℃和80℃)下孵育30分钟，然后如下测量所释放的还原糖：向每孔中添加100μLDNS试剂并将平板在95℃下孵育20分钟。
DNS试剂含有：
一旦温度降低至低于40℃，将135μL每种反应混合物转移至96孔微孔板的各个孔中，每孔含有65μL Rochelle盐(40％酒石酸钠钾)，并使用装配有560nm滤光片的Fluostar Galaxy微量培养板读数器测量OD560。通过用相同的方式处理来自带有空载体的菌株的上清液来测量空白值，并从各数值中减去。然后针对每个变体将活性表述为相对于四参数多项式拟合最高值的百分比，只有变体TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，针对其使用四参数对数正态拟合(图6)。
所有经修饰的家族6纤维素酶与其各自的野生型相比均显示提高的最适温度，变体TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，其显示在宽泛的温度范围内具有高于80％的最大活性(图6)。在所有TrCel6A变体中，TrCel6A-S413P具有较高的最适温度72.2℃，与野生型TrCel6A相比提高5.6℃(图6a)。PcCel6A-S407P和HiCel6A-Y420P与其各自野生型相比时也显示最适温度的提高(图6b和c)。
.2比较经修饰的与天然的TrCel6A、HiCel6A和PcCel6A的嗜碱性。
通过测量不同pH下从可溶性β-葡聚糖底物中释放的还原糖来测定每种酶的嗜碱性。具体地，在300μL PCR板中，将根据实施例9获得的50μL粗制上清液与预热的50μL 1％(w/v)55mM柠檬酸钠中的β-葡聚糖(Barley，Medium Viscosity；Megazyme)、55mM磷酸钠pH 3.0、4.0、5.0、5.75、6.25、6.75、7.25或8.5在平板不同8列中混合(一旦与上清液混合并在60-65℃下加热，pH分别为3.95、4.65、5.65、6.25、6.65、6.95、7.15和7.45)。将混合物在65℃(PcCel6A和变体为60℃)下孵育30分钟，然后根据实施例10.1测量所释放的还原糖。通过用相同的方式处理来自带有空载体的菌株的上清液来测量酵母宿主的背景活性，并从各变体的活性数值中减去该活性。然后针对每个变体将活性表述为相对于三参数机械拟合(mechanistic fit)最高值的百分比(图7)。
所有经修饰的家族6纤维素酶与其野生型相比均时显示提高的嗜碱性。对TrCel6A而言，用变体TrCel6A-G231S-R410Q-S413P观察到显著的迁移(+1.25pH单位)，然后是TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(+1.01pH单位)。
9.3比较经修饰的与天然的TrCel6A、HiCel6A和PcCel6A的热稳定性。
通过测量在60℃(对PcCel6A和变体为55℃)下将上清液预孵育不同时间后从可溶性β-葡聚糖底物释放的还原糖来测定每种酶的热稳定性。具体地，在300μL PCR平板中，将根据实施例9获得的50μL粗制上清液在60℃(对PcCel6A和变体为55℃)下孵育0、15、30、45、60、75、90和120分钟。然后添加50μL 55mM柠檬酸钠pH 5.0中的1％(w/v)β-葡聚糖(Barley，Medium Viscosity；Megazyme)，并将混合物在65℃(对PcCel6A和变体为60℃)下孵育30分钟。然后根据实施例10.1测量释放的还原糖。通过用相同的方式处理来自带有空载体的菌株的上清液来测量酵母宿主的背景活性，并从各变体的活性数值中减去该活性。最后，针对每个变体将活性表述为相对于三参数单指数式衰减拟合(single exponential decay fit)最高值的百分比(图5)。
所有TrCel6A变体与野生型TrCel6A相比均显示提高的热稳定性(图5a)。S413P突变导致TrCel6A的热稳定性显著提高。在60℃下60分钟后TrCel6A-S413P保留其活性的45％，而TrCel6A在60分钟后仅保留其活性的4％。这代表了与美国专利公开No.2006/0205042中公开的TrCel6A-S413Y变体相比更大的热稳定性提高，该TrCel6A-S413Y变体在类似的条件下平均保留其活性的41％。TrCel6A-R410Q-S413P和TrCel6A-G231S-R410Q-S413P观察到最高的提高，其在60℃下60分钟后分别保留其活性的58％和60％。与TrCel6A类似，PcCel6A-S407P在55℃下60分钟后保留其活性的38％，而PcCel6A在60分钟后仅保留其活性的6％(图5b)。这些结果证明，与TrCel6A中413位残基等同位置上的脯氨酸提高热稳定性。
9.4比较经修饰的与天然的TrCel6A、HiCel6A和PcCel6A的T50。
T50在本文中定义为粗制酵母上清液在无底物孵育15分钟后保留其β-葡聚糖水解活性之50％的温度。其通过测量在不同的温度下预孵育15分钟后从可溶性β-葡聚糖底物释放的还原糖来测定。具体地，在300μL PCR板中，将根据实施例9获得的50μL粗制上清液在45℃、49.2℃、53.9℃、57.7℃、59.5℃、60.4℃、62.5℃、64.2℃、66.4℃、68.9℃、72.7℃或75℃孵育15分钟。然后添加50μL 55mM柠檬酸钠pH 5.0中的1％(w/v)β-葡聚糖(Barley，Medium Viscosity；Megazyme)，并将 混合物在65℃(对PcCel6A和变体为60℃)下孵育30分钟。然后根据
实施例10.1测量释放的还原糖。通过用相同的方式处理来自带有空载体的菌株的上清液来测量酵母宿主的背景活性，并从各变体的活性数值中减去该活性。最后，针对每个变体将活性表述为相对于四参数S曲线拟合最高值的百分比(图4)。
TrCel6A-S413P的T50被测定为64.1℃，相比之下，母体TrCel6A为59℃(图4a)。这代表通过引入S413P突变将热稳定性提高超过5℃。这代表与美国专利公开No.2006/0205042的S413Y突变相比酶稳定性的显著提高，所述专利公开显示TrCel6A-S413Y的Tm比TrCel6A只是稍微提高0.2-0.3℃。尽管美国专利公开No.2006/0205042中公开的测定Tm的方法与本文公开的T50测定法不同，但是两种方法均试图测定蛋白质发生导致不可逆失活的显著的和结构上的改变的温度。其它TrCel6A变体的T50比野生型TrCel6A至少高3.2℃。
PcCel6A-S407P和Hicel6A-Y420P与其各自的母体酶相比也显示T50的提高(图4b和c)。这也支持了家族6纤维素酶中TrCel6A 413位残基的等同位置上的脯氨酸提高热稳定性的主张。
实施例10：制造包含经修饰的家族6纤维素酶DNA序列的遗传构建体
10.1分离里氏木霉基因组DNA并构建里氏木霉基因组文库
使用下述包含已破坏的天然TrCel6A基因的来自RutC30的里氏木霉菌株(ATCC#56765；Montenecourt.B.和Eveleigh.D.1979.Adv.Chem.Ser.181：289-301)。RutC30来自里氏木霉Qm6A(ATCC#13631；Mandels.M.和Reese.E.T.1957.J.Bacteriol.73：269-278)。本领域技术人员十分了解，本文所述的方法、来自这些菌株的遗传构建体以及遗传构建体在这些菌株中的表达适用于所有来自Qm6A的木霉菌株。
为了分离基因组DNA，用里氏木霉孢子接种50mL马铃薯葡萄糖培养液(Difco)，所述孢子通过无菌接种环从马铃薯葡萄糖琼脂平板上收集。将培养物于28℃下在200rpm摇动2-3天。将菌丝体过滤到GFA玻璃微纤维滤纸(Whatman)上并用冷的去离子水洗涤。将真菌饼冷冻在液氮中，用预冷的研钵和研杵碾成粉末；将0.5g粉碎的生物量重悬于5mL 100mM Tris、50mM EDTA，pH 7.5加上1％十二烷基硫酸钠(SDS)中。将裂解液离心(5000g 20分钟，4℃)以沉淀细胞碎片。用1倍体积缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)饱和的苯酚萃取上清液，然后用1倍体积缓冲液饱和的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)萃取，从而去除可溶的蛋白质。通过添加0.1倍体积的3M乙酸钠，pH 5.2和2.5倍体积的冷95％乙醇来沉淀DNA。在-20℃下孵育至少1小时后，通过离心沉淀DNA(5000g 20分钟，4℃)，用10mL 70％乙醇冲洗，晾干并重悬于1mL 10mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0中。通过添加核糖核酸酶A(Roche Diagnostics)至0.1mg/mL的终浓度并在37℃下孵育1小时来消化RNA。使用1倍体积缓冲液饱和的苯酚和1倍体积缓冲液饱和的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)先后萃取，从DNA溶液中去除核糖核酸酶。用0.1倍体积的3M乙酸钠，pH 5.2和2.5倍体积的冷95％乙醇再次沉淀DNA，离心沉淀，用70％乙醇冲洗，晾干并重悬于50μL 10mM Tris、1mM EDTA，pH 8.0中。通过测量溶液在260nm下的吸光度来测定DNA的浓度(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press 1989中第C1页，在下文中称作Sambrook等)。
使用从里氏木霉菌株M2C38分离的基因组DNA构建两种质粒文库和一种噬菌体文库。如下在载体pUC119(Viera和Messing，MethodsEnzymol.153：3，1987)中构建质粒文库：在37℃下用2单位/μg BamH1或EcoR1限制性酶将100μL体积中的10μg基因组DNA消化20小时。将经消化的DNA在0.75％琼脂糖凝胶上以0.04M Tris-乙酸盐、1mMEDTA电泳分离并用溴化乙锭染色。切下对应于目的基因大小(基于公开的信息和Southern印迹)的凝胶片，并进行电洗脱以回收DNA片段(Sambrook等，6.28-6.29页)。在含有20-50μg/mL DNA(以2∶1的载体：插入DNA比例)、1mM ATP和5单位T4DNA连接酶的总体积10-15μL的连接反应中，于4℃下16小时将这些富集的DNA级分连接进pUC119中，从而产生基因文库。使用Cell Porator System(Gibco/BRL)，根据制造商的方案用连接反应物对大肠杆菌菌株HB101进行电穿孔，并在含有70μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂上选择转化体。
如下在载体λDASH(Stratagene，Inc.)中构建噬菌体文库：用2、1、 0.5和0.5单位/μg BamHI将基因组DNA(3μg)在37℃消化1小时，产生大小9-23kB的片段。如下纯化来自每次消化的DNA：用1倍体积的Tris饱和的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)萃取，然后用10μL 3M乙酸钠，pH 5.2和250μl 95％乙醇(-20℃)沉淀。通过微量离心使经消化的DNA沉淀，用0.5mL的冷70％乙醇冲洗，晾干并重悬于10μL无菌的去离子水中。通过琼脂糖凝胶电泳验证大小为9-23kB的DNA片段的富集(0.04M Tris-乙酸盐，1mM EDTA中0.8％琼脂糖)。将经消化的DNA(0.4μg)与用BamHI(Stratagene)预消化的1μgλDASH臂在含有2单位T4DNA连接酶和1mM ATP的总体积为5μl的反应中于4℃下连接过夜。使用 
II Gold包装提取物(Stratagene)根据制造商的方案将连接混合物包装进噬菌体颗粒中。使用大肠杆菌宿主菌株XL1-BlueMRA(P2)滴定文库，发现其含有3×105个独立克隆。
10.2从pUC119文库中克隆纤维二糖水解酶I(cbh1)和纤维二糖水解酶II(cbh2)基因
通过菌落转移杂交(colony lift hybridization)鉴定带有来自重组pUC119-BamHI-EcoRI文库的cbh1或cbh2克隆的大肠杆菌HB101转化体：将1-3×104个菌落转移至HyBondTM尼龙膜(Amersham)上；菌落面向上将膜置于用0.5M NaOH、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟，以裂解细菌细胞并变性DNA；然后将膜菌落面向上置于用1.5MTris，pH 7.5加1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟以进行中和；将膜晾干30分钟，然后通过在80℃烘烤2小时而将DNA固定在膜上。
在含有10-50ng靶标DNA和0.2mM每种d(GCT)TP、0.5μMdATP、20-40μCi a-32P-dATP、10皮摩尔寡核苷酸引物和0.5单位Taq聚合酶的总体积20μL的标记反应中，对来自BamH1或EcoR1片段富集库中的cbh1和cbh2编码区的短片段(0.7-1.5kB)进行PCR扩增，从而制备32P标记的探针。对反应物进行6-7个循环的扩增(95℃，2分钟；56℃，1.5分钟；70℃，5分钟)。通过添加0.5mL 10％(w/v)三氟乙酸和0.5mg酵母tRNA来沉淀扩增的32P标记DNA。通过微量离心使DNA沉淀，用1mL 70％乙醇洗涤两次，晾干并重悬于1M Tris pH7.5、1mM EDTA中。
在热封的袋子中，将固定有重组pUC119质粒的尼龙膜于60-65℃ 下在1M NaCl、1％SDS、50mM Tris、1mM EDTA pH 7.5中与100μg/mL变性的断裂鲑精DNA预杂交1小时。杂交在热密封袋中在相同的缓冲液中于60-65℃下进行16-20小时，所述相同的缓冲液仅含有50μg/mL变性的断裂鲑精DNA和5×106-5×107cpm变性的cbh1或cbh2探针。将膜用1M NaCl、0.5％SDS在60℃下洗涤一次(15分钟)，用0.3M NaCl、0.5％SDS在60℃下洗涤两次(每次15分钟)，并用0.03MNaCl、0.5％SDS在55℃下洗涤一次(15分钟)。将膜再次置于热封的袋子中，并在-70℃下使Kodak RP X射线胶片曝光16-48小时。根据制造商的方案将X-射线胶片显影。挑出显示强或弱信号的菌落，并在补充有70μg/mL氨苄青霉素的2X YT培养基中培养。使用碱裂解方法(Sambrook等.，1.25-1.28页)从这些培养物中分离质粒DNA，并通过限制性消化、Southern杂交(Sambrook等.，9.38-9.44页)和PCR分析(Sambrook等.，14.18-14，19页)来分析。
通过pUC119-BamH1文库与使用下述寡核苷酸引物制备的0.7kbcbh1探针之间的菌落转移杂交来鉴定带有cbh1基因的克隆，所述寡核苷酸引物被设计成扩增已公开的cbh1序列的bp 597-1361(Shoemaker等，Bio/Technology 1：691-696，1983)。分离cbh1克隆pCOR132，该克隆含有对应于启动子(4.7kb)和1kb的cbh1结构基因(2.3kb)的5.7kbBamH1片段。从其中将含有cbh1启动子(2.1kb)和cbh1编码区5′末端(0.4kb)的2.5kb EcoR1片段亚克隆进pUC119中，得到pCB152。通过pUC119-EcoR1文库与使用下述寡核苷酸引物制备的1.5kb cbh2探针之间的菌落转移杂交来鉴定带有cbh2基因的克隆，所述寡核苷酸引物被设计用于扩增已公开cbh2序列的bp 580-2114(Chen等Bio/Technology 5：274-278，1987)。分离含有4.8kb EcoR1片段的cbh2克隆pZUK600，所述片段对应于启动子(600bp)、结构基因(2.3kb)和终止子(1.9kb)。
10.3从λDASH文库中克隆木聚糖酶II(Trxyl11B)基因
使用DIG标记和检测试剂盒(Roche Diagnostics)并按照制造商的方案，通过随机引物标记而从PCR扩增的Trxyl11B基因编码区中制备以地高辛-11-dUTP标记的探针。通过与λDASH文库的噬斑转移杂交来鉴定含有Trxyl11B基因的基因组克隆。对每个目的基因而言，将1×104 个克隆转移至 
(Schleicher and Schull)尼龙膜。将膜噬斑面向上置于用0.5M NaOH、1M NaCl饱和的印迹纸(VWR238)上5分钟，以裂解噬菌体颗粒并变性噬菌体DNA。然后通过将膜噬斑面向上置于用1.5M Tris，pH 7.5加1M NaCl饱和的印迹纸上5分钟来进行中和，随后将其晾干30分钟。然后通过在80℃烘烤2小时将DNA固定在膜上。在热封袋中，将膜在6×SSPE、5×Denhardt′s、1％SDS中加上100μg/mL变性的断裂鲑精DNA于65℃下预杂交2小时。然后将膜在热密封的袋中，在含有50μg/mL变性的断裂鲑精DNA和0.5μg地高辛-dUTP标记探针的相同溶液中，于65℃下杂交过夜。将膜在2×SSPE、0.1％SDS中于室温下15分钟洗涤两次，在0.2×SSPE、0.1％SDS中于65℃下15分钟洗涤两次，并在2×SSPE中5分钟洗涤一次。根据制造商的方案，通过与抗地高辛/碱性磷酸酶抗体缀合物、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和4-硝基氯化四唑蓝(Roche Diagnostics)反应来鉴定阳性杂交克隆。通过用以地高辛-dUTP标记的探针进行第二轮筛选来进一步纯化阳性杂交克隆。
如Sambrook等2.118-2.121页中所述分离个体克隆并纯化噬菌体DNA，只是将CsCl梯度步骤替换为用1倍体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取。用0.1倍体积的3M乙酸钠，pH 5.2和2.5倍体积的冷95％乙醇沉淀DNA。用0.5mL冷70％乙醇洗涤已沉淀的噬菌体DNA，晾干并重悬于50μL 10mM Tris，1mMEDTA pH 8.0中。通过对纯化的噬菌体DNA进行限制性消化和Southern印迹杂交(Sambrook等.，9.38-9.44页)来鉴定含有目的基因的限制性片段，所述Southern印迹杂交使用与筛选λDASH文库所用相同的以地高辛-dUTP标记的探针。将膜杂交并通过与噬斑转移中相同的方法使阳性杂交片段显影。一旦鉴定了来自各个λDASH克隆的期望的限制性片段，则重复限制性消化，将片段在TAE中的0.8％琼脂糖凝胶中分离并切下想要的条带。使用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia)根据制造商的方案将DNA从凝胶片上洗脱。
通过将λDASH文库与Trxyl11B探针进行菌落转移杂交(实施例7)来鉴定带有Trxyl11B基因的克隆，所述探针包含已公开Trxyl11B序列的bp 100-783(Saarelainen等，MoI.Gen.Genet.241：497-503，1993)。通过对从λDASH Trxyl11B克隆中纯化的噬菌体DNA进行限制性消化 来分离含有Trxyl11B基因的启动子(2.3kb)、编码区(0.8kb)和终止子(2.6kb)的5.7kb KpnI片段。将该片段亚克隆进pUC119的KpnI位点中，得到质粒pXYN2K-2。
10.4构建指导经修饰家族6纤维素酶在里氏木霉中表达的载体。
使用Trxyl11B特异性引物和pUC反向引物(目录号18432-013，Gibco/BRL)，用Pwo聚合酶从基因组Trxyl11B亚克隆pXYN2K-2(实施例7)中扩增含有Trxyl11B基因的启动子和分泌信号的2.3kb片段(bp-2150到+99，其中+1表示ATG起始密码子，+97-99代表TrXyl11分泌信号肽之后的第一个密码子)，所述Trxyl11B特异性引物在密码子33的Gln下游紧邻处含有NheI，所述pUC反向引物与Trxyl11B基因5′端的Kpn1位点下游退火。将该Trxyl11B PCR产物作为平末端片段以下述方向插入pUC119多聚接头(polylinker)的SmaI位点中，其取向使得该多聚接头的BamHI位点位于NheI位点的3′；这产生了质粒pUC/XynPSS(Nhe)。通过用EcoR1(其作为pUC119多聚接头的一部分从pXYN2K-2中扩增)和BamHI消化，从pUC/XynPSS(Nhe)中再分离相同的xln2 PCR产物，并插入也用EcoRI和BamHI消化的质粒pBR322L(pBR322的衍生物，在bp 565和650处的原始Sph1和Sal1位点之间含有Sph1-Not1-Sal1连接子(adaptor))中，得到质粒pBR322LXN。为了便于高水平表达经修饰的木聚糖酶，用通过HindIII消化pCOR132而分离的含有cbh1启动子bp-1399到-204的1.2kbHindIII片段来代替pBR322LXN中含有xln2启动子bp-1400到-121的1.3kb HindIII片段；这产生质粒pBR322LC/XN。最后，用Klenow将pBR322LXC的EcoR1位点补平，并添加SpeI接头(目录号1086，NewEngland Biolabs)，得到pBR322SpXC。
通过NheI和KpnI消化从YEpFLAGΔKpn10-cbh2载体(在上文实施例6中描述)中分离含有TrCel6A-S413P基因的片段，并插入用NheI和BamHI消化的pCB219N-N中，产生pS413P/C2ter。为了产生pCB219N-N，使用与已公开的cbh2基因(Chen等，1987)3′非翻译区bp2226-2242同源的引物以及pUC正向引物(目录号1224，New EnglandBiolabs)从pZUK600(上文实施例7中描述)中扩增cbh2终止子片段，所述同源引物含有在5′末端包含XbaI-NheI-BamHI-SmaI-KpnI位点的 短多聚接头，所述pUC正向引物在pZUK600中cbh23′末端EcoR1位点上游退火。将该片段在改造的XbaI和EcoR1位点处消化，并插入pUC119的相应位点中，产生pCB219。将EcoR1-Not1连接子(目录号35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219中的单一EcoR1位点中，产生pCB219N。通过用NheI和NotI消化，从pS413P/C2ter中分离包含TrCel6A基因和cbh2终止子的片段，并插入用NheI和NotI消化的pBR322SpXC中，产生表达盒pc/xS413P-EC。
含有选择盒的质粒pNCBglNSNB(r)来自含有粗糙链孢霉pyr4的质粒pFB6(Radford，A.，Buston，F.P.，Newbury，S.F.和Glazebrook，J.A.(1985)Regulation of pyrimidine metabolism in Neurospora.InMolecular Genetics of Filamentous Fungi(Timberlake，W.E.编辑)，AlanR.Liss(New York)，127-143页)。将来自pFB6的3.2kb BglII片段克隆进被修饰为在多聚接头中(EcoRI和SacI之间)含有NotI、SmaI、NheI和Bgm位点的pUC119的BamHI位点中，得到pNCBgl-NSNB(r)，所述BglII片段含有粗糙链孢霉的pyr4基因(GenBank登录号M 13448)及其启动子、终止子和一些5′UTR序列。从表达盒载体pc/xS413P-EC中分离SpeI/NotI片段并插入用NheI(SpeI和NheI具有兼容的5′突出端序列)和NotI消化的pNCBgl-NSNB(r)中，得到pc/x-S413P-TV，所述SpeI/NotI片段包含与cbh1启动子、xln2分泌信号肽和cbh2转录终止子有效连接的TrCel6A-S413P基因。在转化里氏木霉之前，用NotI将该最终构建体线性化。
实施例11：转化里氏木霉。
11.1分离pyr4营养缺陷型
为了使用粗糙链孢霉pyr4基因作为选择标记，如下分离自发的pyr4营养缺陷型：将1×106个里氏木霉的孢子涂布在如前述的含5mM尿苷和0.15％(w/v)尿苷类似物5-氟乳清酸(FOA)的基本培养基上，用于选择里氏木霉的pyr4营养缺陷型(Berges.T.和Barreau.C.1991 CurrGenet.19(5)：359-65)。在含FOA的培养基上生长的能力会允许选择在编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的pyr2基因或编码乳清苷5′-磷酸脱羧酶的pyr4基因中发生破坏的突变体。对自发的FOA抗性菌落在含和不含尿苷的基本培养基上进行第二轮选择。然后用pNCBglNSNB(r)(在实 施例11.4中描述)转化不能在基本培养基上生长的FOA抗性菌落的孢子，并针对在基本培养基上的生长进行选择。只有被pNCBglNSNB(r)中的粗糙链孢霉pyr4基因补回的菌株会在基本培养基上生长，并且是真正的pyr4营养缺陷型。使用这些方法获得了里氏木霉的稳定pyr4营养缺陷型。
11.2转化里氏木霉pyr4营养缺陷型的原生质体。
将5×106个里氏木霉的孢子涂布在补充有5mM尿苷的马铃薯葡萄糖琼脂上的无菌玻璃纸上，并在30℃孵育20小时以便于孢子萌发和菌丝体生长。将带有菌丝体的玻璃纸盘转移至10mL原生质体化溶液中，该溶液在含0.6M硫酸铵的50mM磷酸氢二钾缓冲液pH 6.5(缓冲液P)中含有7.5g/L崩溃酶(Driselase)和125单位的无蛋白酶β-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，目录号分别为0465-1和0410-3)。通过在60rpm摇动5小时消化菌丝体垫。通过以无菌No.30MIRACLOTHTM过滤将原生质体与未消化的菌丝体分离，收集在无菌的50mL圆底离心管中并通过在室温下1000-1500×g离心10分钟回收。用5mL缓冲液P洗涤原生质体，并在室温下1000-1500×g再次离心10分钟。将原生质体重悬于I mL STC缓冲液(1.2M山梨醇、10mMCaCl2、10mM Tris-HCL，pH 7.5)中。为进行转化，将0.1mL重悬的原生质体与10μg载体DNA和25μL PEG溶液(25％PEG 4000、50mMCaCl2、10mM Tris-HCl，pH 7.5)合并。在冰水浴中孵育30分钟后，添加1mL PEG溶液，并将混合物在室温下孵育5分钟。用2mL PEG溶液中1.2M山梨醇稀释转化混合物，将整个混合物添加进冷却至约47℃的25mL熔化的MMSS琼脂培养基(见下文)，并将原生质体悬液倒在MMSS琼脂上。将平板在30℃孵育直到菌落生长可见。将转化体转移至含有MM琼脂的个体平板并允许孢子形成。收集孢子并以高稀释度涂布在MM琼脂上，以分离同核体转化体，然后将同核体转化体涂布在PDA上，允许其生长并充分形成孢子，以如下文实施例13中所述接种筛选培养物。
基本培养基(MM)琼脂含有以下组分：
MMSS琼脂含有与MM琼脂相同的组分，再加上1.2M山梨醇、-1g/L YNB(来自DIFCO目录号291940的无氨基酸的酵母氮源)和0.12g/L氨基酸(来自BD Biosciences目录号630416的-Ura DO补充剂)。
实施例12：在液体培养物中生产经修饰的家族6纤维素酶
将木霉的个体菌落转移至PDA平板用于扩增每种培养物。孢子形成对于均匀接种微量培养物是必需的，所述微量培养物用于测试培养物产生具有提高的热稳定性的经修饰TrCelA变体的能力。培养基由以下组成：
*微量元素溶液含有5g/L FeSO4·7H2O；1.6g/L MnSO4·H2O；1.4g/LZnSO4·7H2O。
**葡萄糖、Solka floc、乳糖、纤维二糖、槐糖、玉米糖浆或Avicel。碳源可作为水溶液在pH 2到7下独立灭菌，并在最开始时添加到其余的培养基中，或在发酵过程中添加。
将个体转化体在上述培养基中于24孔微孔板中的1mL培养物中培养。初始pH为5.5，并在接种前将培养基于121℃下蒸汽高压灭菌30分钟。对天然的和经转化的细胞，都从PDA平板中分离孢子，悬浮于水中，并将每mL 104-105个孢子用于接种每份培养物。将培养物在30℃的温度下于500rpm摇动6天时间。通过在12,000rpm离心，从含有所分泌蛋白质的滤液中分离生物量。使用Bio-Rad蛋白质测定法(目录号500-0001)测定蛋白质浓度。如实施例14中所述测定TrCelA-S413P的表达。
实施例13：表征包含经修饰家族6纤维素酶的里氏木霉培养物滤液
通过SDS-PAGE凝胶的Western印迹杂交来测定里氏木霉转化体的培养滤液中的TrCel6A-S413P表达。具体地，将来自TrCel6A-S413P转化体、母体菌株P107B和表达天然的未修饰TrCel6A的菌株(菌株BTR213)的10-20μL培养物滤液中等量的总分泌蛋白质加入等体积的2×Laemmli缓冲液(0.4g SDS/2mL甘油/1mL 1M Tris-HCl，pH 6.8/0.3085g DTT/2mL 0.5％溴酚蓝/0.25mLβ-巯基乙醇/10mL总体积)中。在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离10μL每种制备的样品，使用24mM Tris、192mM甘氨酸pH 6.8、10mM SDS作为电泳缓冲液。在含20％甲醇的25mM Tris/192mM甘氨酸缓冲液中，将分离的蛋白质从丙烯酰胺凝胶上电转移至用甲醇预湿润的PVDF膜上。随后在30mLBLOTTO缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0中5％脱脂乳粉)中洗涤膜。用30mL TrCel6A特异性多克隆抗体的1∶20,000稀释液在BLOTTO中室温过夜标记该膜，在室温下用等体积的BLOTTO再洗涤两次，每次10分钟，然后在室温下用山羊抗兔/碱性磷酸酶缀合物的1∶3000稀释液在BLOTTO中标记1小时。最后，将该膜在室温下用过量的50mMTris-HCl，pH 8.0洗涤两次，每次15分钟。如下使含有TrCel6A的杂交复合物显影：室温下用10mL含有45μl 4-硝基氯化四唑蓝(Roche Diagnostics)和35μL 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(Roche Diagnostics)的100mM NaCl/100niM Tris-HCl，pH 9.5缓冲液处理膜，直到条带清晰可见。在来自多数转化体、阳性对照菌株BTR213的培养物上清液中观察到～60kDa的阳性杂交条带，但是来自菌株P107B的培养物上清液中则没有。转化体P474B表达和分泌了与对照菌株BTR213所表达和分泌的未经修饰TrCel6A量大致相同水平的TrCel6A-S413P。
如下评价含有TrCel6A或TrCel6A-S413P的木霉纤维素酶的稳定性：将纤维素酶在50mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8中于50℃下孵育多达96小时，然后通过浊度法测量纤维素酶的残余活性(Enari.T.M.和Niku-Paavola.ML.1988.Meth.Enzym.160：117-126)。
尽管未处理的TrCel6A和TrCel6A-S413P纤维素酶的纤维素水解速率是相同的，但是在无底物条件下孵育多达96小时后，TrCel6A-S413P纤维素酶比TrCel6A纤维素酶维持高得多的活性(图8)。因此，TrCel6A热稳定性的提高也提高了包含经修饰家族6纤维素酶和其它组分的整体木霉纤维素酶系的热稳定性。
已通过优选的实施方案描述了本发明。然而，本领域技术人员会明白，可进行大量变更和修改，而不偏离本文所述本发明的范围。
参考文献
Ai，Y.C.and Wilson，D.B.2002.Enzyme Microb.Technol.30：804-808.
Atomi，H.2005.Curr.Opin.Chem.Biol.9：166-173.
Berges，T.and Barreau，C.1991 Curr Genet.19(5)：359-65
Bhat，M.K.2000.Biotechnol.Adv.18：355-383.
Butler，T.and Alcalde，M.2003.In Methods in Molecular Biology，vol.231：(F.H.Arnoldand G.Georgiou，editors)，Humana Press Inc.Totowa(New Jersey)，pages 17-22.
Chica，R.A.，et al.2005.Curr.Opin.Biotechnol.16：378-384.
Claeyssens，M.and Henrissat，B.1992，Protein Science 1：1293-1297).
Claeyssens，M.，et al.1997.Eds.；The Royal Society of Chemistry，Cambridge.
Davies，G.J..et al.2000.Biochem.J.348：201-207.
Eijsink，V.G.，et al.2004.J Biotechnol.113：105-20.
Eijsink VG，et al.2005.Biomol.Eng.22：21-30.
Foreman，P.K.，et al.2003.J.Biol.Chem.278：31988-31997.
Gietz，R.D.and Woods，R.A.2002.Meth.Enzym.350：87-96.
Gray，K.A.，et al.2006.Curr.Opin.Chem.Biol.10：141-146.
Hoffman，C.S.，and Winston，F.1987.Gene 57：267-272.
Hughes，S.R.，et al.2006.Proteome Sci.4：10-23.
Lehtio，J.，et al.2003.Proc Natl Acad Sci U S A.100：484-489.
Li，W.F.，et al.2005 Biotechnol.Adv.23：271-281.
Lin，Y.and Tanaka，S.2006.APPl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642.
Mathrani，I and Ahring，B.K.1992 Appl.Microbiol.Biotechnol.38：23-27.
Meinke，A.，et al.1995.J.Biol.Chem.270：4383-4386.
Radford，A.，et al.1985.In Molecular Gernetics of Filamrentous Fungi(Timberlake，W.E.，editor)，Alan R.Liss(New York)，pages 127-143
Rouvinen，J.，et al.1990.Science 249：380-386.Erratum in：Science 1990 249：1359.
Saarelainen，R.，et al.1993.Mol.Gen.Genet.241：497-503.
Sadeghi，M.，et al.2006.Biophys.Chem.119：256-270.
Sambrook，et al.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Secoad Edition”，ColdSpring Harbor Press
Srisodsuk，M.，et al.1993.J.Biol.Chem.268：20756-20761.
Spezio，M.，et al.1993.Biochemistry.32：9906-9916.
Tomme，P.，et al.1988.Eur.J.Biochem 170：575-581.
Varrot，A.，et al.2005.J.Biol.Chem.280：20181-20184.
Varrot，A.，et al.1999.Biochem.J.337：297-304.
Vieille，C.and Zeikus，G.J.2001.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65：1-43.
Viera and Messing 1987.Methods Enzymol.153：3
von Ossowski，I.，et al.2003.J Mol Biol.333：817-829.
Wohlfahrt，G.，et al.2003.Biochenistry.42：10095-10103.
Zhang S，et al.2000.Eur.J.Biochem.267：3101-15.
序列表
<110>Iogen Corporation
St-Pierre，Patrick
Masri，Nabil
Fournier，Marie-Christine
White，Theresa
<120>具有提高的热稳定性、嗜热性和
嗜碱性的6家族纤维素酶
<130>V80717wo
<150>US 60/841,507
<151>2006-08-31
<150>US 60/846,970
<151>2006-09-25
<160>50
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>447
<212>PRT
<213>里氏木霉
<400>1
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1 5 10 15
Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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195 200 205
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225 230 235 240
Ala Tyr Leu Glu Cys Ile Asn Tyr Ala Val Thr Gln Leu Asn Leu Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala
290 295 300
Asn Tyr Asn Gly Trp Asn Ile Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gln Gly
305 310 315 320
Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lys Leu Tyr Ile His Ala Ile Gly Pro Leu
325 330 335
Leu Ala Asn His Gly Trp Ser Asn Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly
340 345 350
Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys
355 360 365
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370 375 380
Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys
385 390 395 400
Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser Ala Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
<210>2
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<212>PRT
<213>粪肥纤维单胞菌
<400>2
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1 5 10 15
Asn Pro Thr Trp Ala Ala Ser Val Asn Ala Ala Ala Gly Arg Gln Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ala Ala Gly Val Pro Leu Val Phe Asn Leu Val Ile Tyr Asp Leu Pro
85 90 95
Gly Arg Asp Cys Phe Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Leu Pro Ala Thr
100 105 110
Asp Ala Gly Leu Ala Arg Tyr Lys Ser Glu Tyr Ile Asp Pro Ile Ala
115 120 125
Asp Leu Leu Asp Asn Pro Glu Tyr Glu Ser Ile Arg Ile Ala Ala Thr
130 135 140
Ile Glu Pro Asp Ser Leu Pro Asn Leu Thr Thr Asn Ile Ser Glu Pro
145 150 155 160
Ala Cys Gln Gln Ala Ala Pro Tyr Tyr Arg Gln Gly Val Lys Tyr Ala
165 170 175
Leu Asp Lys Leu His Ala Ile Pro Asn Val Tyr Asn Tyr Ile Asp Ile
180 185 190
Gly His Ser Gly Trp Leu Gly Trp Asp Ser Asn Ala Gly Pro Ser Ala
195 200 205
Thr Leu Phe Ala Glu Val Ala Lys Ser Thr Thr Ala Gly Phe Ala Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Pro Leu Leu Ser Asp Ser Ser Leu Thr Ile Asn Asn Thr Pro Ile Arg
245 250 255
Ser Ser Lys Phe Tyr Glu Trp Asn Phe Asp Phe Asp Glu Ile Asp Tyr
260 265 270
Thr Ala His Met His Arg Leu Leu Val Ala Ala Gly Phe Pro Ser Ser
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ala Asn Arg Val Asp Arg Arg Val His Arg Gly Ala Trp Cys Asn Pro
325 330 335
Leu Gly Ala Gly Ile Gly Arg Phe Pro Glu Ala Thr Pro Ser Gly Tyr
340 345 350
Ala Ala Ser His Leu Asp Ala Phe Val Trp Ile Lys Pro Pro Gly Glu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Thr Ala Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ser Val Pro Leu Ser Trp Thr Ala
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Thr Asp Asn Ala Gly Gly Ser Gly Val Ala Gly Tyr Glu Val Leu Arg
565 570 575
Gly Thr Thr Val Val Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ser Tyr Thr Val Thr
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Leu Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Ser Ser Val Pro Leu Thr Trp Thr
645 650 655
Ala Ser Thr Asp Asn Ala Gly Gly Ser Gly Val Ala Gly Tyr Glu Val
660 665 670
Phe Asn Gly Thr Thr Arg Val Ala Thr Val Thr Ser Thr Ser Tyr Thr
675 680 685
Val Thr Gly Leu Ala Ala Asp Thr Ala Tyr Ser Phe Thr Val Lys Ala
690 695 700
Lys Asp Val Ala Gly Asn Val Ser Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser Ala
705 710 715 720
Arg Thr Gln Ala Ala Thr Ser Gly Gly Cys Thr Val Lys Tyr Ser Ala
725 730 735
Ser Ser Trp Asn Thr Gly Phe Thr Gly Thr Val Glu Val Lys Asn Asn
740 745 750
Gly Thr Ala Ala Leu Asn Gly Trp Thr Leu Gly Phe Ser Phe Ala Asp
755 760 765
Gly Gln Lys Val Ser Gln Gly Trp Ser Ala Glu Trp Ser Gln Ser Gly
770 775 780
Thr Ala Val Thr Ala Lys Asn Ala Pro Trp Asn Gly Thr Leu Ala Ala
785 790 795 800
Gly Ser Ser Val Ser Ile Gly Phe Asn Gly Thr His Asn Gly Thr Asn
805 810 815
Thr Ala Pro Thr Ala Phe Thr Leu Asn Gly Val Ala Cys Thr Leu Gly
820 825 830
<210>3
<211>558
<212>PRT
<213>褐色嗜热裂孢菌
<400>3
Ala Gly Cys Ser Val Asp Tyr Thr Val Asn Ser Trp Gly Thr Gly Phe
1 5 10 15
Thr Ala Asn Val Thr Ile Thr Asn Leu Gly Ser Ala Ile Asn Gly Trp
20 25 30
Thr Leu Glu Trp Asp Phe Pro Gly Asn Gln Gln Val Thr Asn Leu Trp
35 40 45
Asn Gly Thr Tyr Thr Gln Ser Gly Gln His Val Ser Val Ser Asn Ala
50 55 60
Pro Tyr Asn Ala Ser Ile Pro Ala Asn Gly Thr Val Glu Phe Gly Phe
65 70 75 80
Asn Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Asp Ile Pro Ser Ser Phe Lys Leu
85 90 95
Asn Gly Val Thr Cys Asp Gly Ser Asp Asp Pro Asp Pro Glu Pro Ser
100 105 110
Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr Asp Pro Asp Glu Pro Gly
115 120 125
Gly Pro Thr Asn Pro Pro Thr Asn Pro Gly Glu Lys Val Asp Asn Pro
130 135 140
Phe Glu Gly Ala Lys Leu Tyr Val Asn Pro Val Trp Ser Ala Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Glu Pro Gly Gly Ser Ala Val Ala Asn Glu Ser Thr Ala Val
165 170 175
Trp Leu Asp Arg Ile Gly Ala Ile Glu Gly Asn Asp Ser Pro Thr Thr
180 185 190
Gly Ser Met Gly Leu Arg Asp His Leu Glu Glu Ala Val Arg Gln Ser
195 200 205
Gly Gly Asp Pro Leu Thr Ile Gln Val Val Ile Tyr Asn Leu Pro Gly
210 215 220
Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Leu Gly Pro Asp Glu
225 230 235 240
Leu Asp Arg Tyr Lys Ser Glu Tyr Ile Asp Pro Ile Ala Asp Ile Met
245 250 255
Trp Asp Phe Ala Asp Tyr Glu Asn Leu Arg Ile Val Ala Ile Ile Glu
260 265 270
Ile Asp Ser Leu Pro Asn Leu Val Thr Asn Val Gly Gly Asn Gly Gly
275 280 285
Thr Glu Leu Cys Ala Tyr Met Lys Gln Asn Gly Gly Tyr Val Asn Gly
290 295 300
Val Gly Tyr Ala Leu Arg Lys Leu Gly Glu Ile Pro Asn Val Tyr Asn
305 310 315 320
Tyr Ile Asp Ala Ala His His Gly Trp Ile Gly Trp Asp Ser Asn Phe
325 330 335
Gly Pro Ser Val Asp Ile Phe Tyr Glu Ala Ala Asn Ala Ser Gly Ser
340 345 350
Thr Val Asp Tyr Val His Gly Phe Ile Ser Asn Thr Ala Asn Tyr Ser
355 360 365
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370 375 380
Leu Ile Arg Gln Ser Lys Trp Val Asp Trp Asn Gln Tyr Val Asp Glu
385 390 395 400
Leu Ser Phe Val Gln Asp Leu Arg Gln Ala Leu Ile Ala Lys Gly Phe
405 410 415
Arg Ser Asp Ile Gly Met Leu Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gly Trp Gly
420 425 430
Gly Pro Asn Arg Pro Thr Gly Pro Ser Ser Ser Thr Asp Leu Asn Thr
435 440 445
Tyr Val Asp Glu Ser Arg Ile Asp Arg Arg Ile His Pro Gly Asn Trp
450 455 460
Cys Asn Gln Ala Gly Ala Gly Leu Gly Glu Arg Pro Thr Val Asn Pro
465 470 475 480
Ala Pro Gly Val Asp Ala Tyr Val Trp Val Lys Pro Pro Gly Glu Ser
485 490 495
Asp Gly Ala Ser Glu Glu Ile Pro Asn Asp Glu Gly Lys Gly Phe Asp
500 505 510
Arg Met Cys Asp Pro Thr Tyr Gln Gly Asn Ala Arg Asn Gly Asn Asn
515 520 525
Pro Ser Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Ile Ser Gly His Trp Phe Ser
530 535 540
Ala Gln Phe Arg Glu Leu Leu Ala Asn Ala Tyr Pro Pro Leu
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<210>4
<211>453
<212>PRT
<213>特异腐质霉
<400>4
Ala Ser Cys Ala Pro Thr Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Asn
1 5 10 15
Gly Pro Thr Cys Cys Gln Ser Gly Ser Thr Cys Val Lys Gln Asn Asp
20 25 30
Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly Ser Gln Val Thr Thr Thr Ser Thr
35 40 45
Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Arg Ala Thr Ser Thr Thr
50 55 60
Ser Thr Gly Gly Val Thr Ser Ile Thr Thr Ala Pro Thr Arg Thr Val
65 70 75 80
Thr Ile Pro Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ser Tyr Asn Gly Asn Pro
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Phe Glu Gly Val Gln Leu Trp Ala Asn Asn Tyr Tyr Arg Ser Glu Val
100 105 110
His Thr Leu Ala Ile Pro Gln Ile Thr Asp Pro Ala Leu Arg Ala Ala
115 120 125
Ala Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn
130 135 140
Val Thr Val Asp Thr Leu Leu Val Glu Thr Leu Ser Glu Ile Arg Ala
145 150 155 160
Ala Asn Gln Ala Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Ala Gln Ile Val Val
165 170 175
Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu
180 185 190
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Gly Ala Asn Asn Tyr Lys Gly Tyr Ile Asn
195 200 205
Arg Ile Arg Glu Ile Leu Ile Ser Phe Ser Asp Val Arg Thr Ile Leu
210 215 220
Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val
225 230 235 240
Ala Lys Cys Ser Gly Ala Ala Ser Thr Tyr Arg Glu Leu Thr Ile Tyr
245 250 255
Ala Leu Lys Gln Leu Asp Leu Pro His Val Ala Met Tyr Met Asp Ala
260 265 270
Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala
275 280 285
Glu Leu Phe Ala Lys Ile Tyr Glu Asp Ala Gly Lys Pro Arg Ala Val
290 295 300
Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Ile Ser
305 310 315 320
Ser Pro Pro Pro Tyr Thr Ser Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His
325 330 335
Tyr Ile Glu Ala Phe Arg Pro Leu Leu Glu Ala Arg Gly Phe Pro Ala
340 345 350
Gln Phe Ile Val Asp Gln Gly Arg Ser Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln
355 360 365
Lys Glu Trp Gly His Trp Cys Asn Ala Ile Gly Thr Gly Phe Gly Met
370 375 380
Arg Pro Thr Ala Asn Thr Gly His Gln Tyr Val Asp Ala Phe Val Trp
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Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Thr Thr Ala Ala
405 410 415
Arg Tyr Asp Tyr His Cys Gly Leu Glu Asp Ala Leu Lys Pro Ala Pro
420 425 430
Glu Ala Gly Gln Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Arg Asn
435 440 445
Ala Asn Pro Pro Phe
450
<210>5
<211>408
<212>PRT
<213>Neocallimastix patriciarum
<400>5
Ala Cys Gly Gly Ala Trp Ala Gln Cys Gly Gly Glu Asn Phe His Gly
1 5 10 15
Asp Lys Cys Cys Val Ser Gly His Thr Cys Val Ser Ile Asn Gln Trp
20 25 30
Tyr Ser Gln Cys Gln Pro Gly Gly Ala Pro Ser Asn Asn Ala Ser Asn
35 40 45
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Thr Lys Asn Phe Phe Asp Asn Gln Ile Tyr Ala Asn
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Pro Lys Phe Ile Glu Glu Val Asn Ser Ser Ile Pro Arg Leu Ser Tyr
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115 120 125
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Ala Ala Gly Ser Lys Thr Val Val Phe Ile Met Tyr Met Ile Pro Thr
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Arg Asp Cys Asn Ala Asn Ala Ser Ala Gly Gly Ala Gly Asn Leu Asn
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180 185 190
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195 200 205
Leu Val Thr Ala Asn Ser Ala Asn Cys Gln Asn Val Arg Asn Leu His
210 215 220
Lys Asn Ala Leu Ser Tyr Gly Val Asn Val Phe Gly Ser Met Ser Asn
225 230 235 240
Val Ser Val Tyr Leu Asp Ala Ala His Gly Ala Trp Leu Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Asp Lys Val Ala Ser Val Val Lys Glu Ile Leu Asn Asn Ala Pro
260 265 270
Asn Gly Lys Ile Arg Gly Leu Ser Thr Asn Ile Ser Asn Tyr Gln Ser
275 280 285
Ile Ser Ser Glu Tyr Gln Tyr His Gln Lys Leu Ala Ser Ala Leu Ala
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Ser Gly Ser Arg Ala Asp Pro Asn Cys Ser Ser Asn Asp Ser Leu Arg
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Gly Ala Pro Asp Ala Gly Gln Trp Phe His Asp Tyr Phe Ala Gln Leu
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Val Arg Asn Ala Arg Pro Ser Phe
405
<210>6
<211>412
<212>PRT
<213>0rpinomyces物种PC-2
<400>6
Ala Cys Gly Gly Ala Tyr Ala Gln Cys Gly Gly Glu Asn Phe Tyr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Cys Cys Val Ser Gly Tyr Lys Cys Val Tyr Met Asn Gln Trp
20 25 30
Tyr Ser Gln Cys Gln Pro Gly Ala Ser Ser Ser Asn Pro Pro Ser Asn
35 40 45
Asn Ala Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
50 55 60
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Gly
65 70 75 80
Ser Gly Ser Thr Gln Asn Phe Phe Thr Asn Gln Ile Tyr Ala Asn Pro
85 90 95
Lys Phe Ile Glu Glu Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Leu Ser Trp Asp
100 105 110
Leu Gln Gln Lys Ala Gln Lys Val Lys Asp Val Pro Thr Ala Val Trp
115 120 125
Leu Ala Trp Glu Gly Ala Pro Gly Glu Val Glu Gln His Leu Lys Ala
130 135 140
Ala Gly Ser Lys Thr Val Val Phe Ile Leu Tyr Met Ile Pro Thr Arg
145 150 155 160
Asp Cys Asn Ser Asn Ala Ser Ala Gly Gly Ala Gly Ser Leu Asn Thr
165 170 175
Tyr Lys Gly Tyr Val Asp Asn Ile Ser Arg Thr Ile Arg Ser Tyr Pro
180 185 190
Asn Ser Lys Val Val Met Val Leu Glu Pro Asp Thr Leu Gly Asn Leu
195 200 205
Val Thr Gly Asn Ser Ala Asn Cys Gln Asn Val Arg Gln Leu His Lys
210 215 220
Asn Ala Leu Ser Tyr Ala Val Asn Val Tyr Gly Ala Met Asn Asn Val
225 230 235 240
Ser Val Tyr Leu Asp Ala Ala His Gly Lys Trp Leu Gly Gly Val Thr
245 250 255
Asp Lys Val Ala Ala Val Val Lys Glu Ile Leu Asn Asn Ala Pro Asn
260 265 270
Gly Lys Ile Arg Gly Leu Ser Thr Asn Val Ser Asn Tyr Gln Pro Ile
275 280 285
Ala Ser Glu Tyr Ser Tyr His Gln Lys Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ala
290 295 300
Val Gly Ile Pro Asn Met His Phe Ile Val Asp Thr Gly Arg Asn Gly
305 310 315 320
Val Asp Val Ser Ala Ala Phe Asn Thr Ser Glu Thr Trp Cys Asn Phe
325 330 335
Val Gly Thr Gly Phe Gly Glu Arg Pro Arg Gly Asn Pro Asn Ser Gly
340 345 350
Met Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Met Trp Leu Lys Thr Pro Arg Glu Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Ser Ser Gly Ser Arg Ala Asp Pro Val Cys Ser Arg Ser
370 375 380
Asp Ser Leu Arg Gly Ala Pro Asp Ala Gly Gln Trp Phe His Asp Tyr
385 390 395 400
Phe Val Gln Leu Leu Arg Asn Ala Arg Pro Gly Phe
405 410
<210>7
<211>440
<212>PRT
<213>黄孢原毛平革菌
<400>7
Ala Ser Ser Glu Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro
1 5 10 15
Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Val Leu Asn Pro Tyr Tyr
20 25 30
Ser Gln Cys Leu Pro Gly Ser Ala Val Thr Thr Thr Ser Val Ile Thr
35 40 45
Ser His Ser Ser Ser Val Ser Ser Val Ser Ser His Ser Gly Ser Ser
50 55 60
Thr Ser Thr Ser Ser Pro Thr Gly Pro Thr Gly Thr Asn Pro Pro Pro
65 70 75 80
Pro Pro Ser Ala Asn Asn Pro Trp Thr Gly Phe Gln Ile Phe Leu Ser
85 90 95
Pro Tyr Tyr Ala Asn Glu Val Ala Ala Ala Ala Lys Gln Ile Thr Asp
100 105 110
Pro Thr Leu Ser Ser Lys Ala Ala Ser Val Ala Asn Ile Pro Thr Phe
115 120 125
Thr Trp Leu Asp Ser Val Ala Lys Ile Pro Asp Leu Gly Thr Tyr Leu
130 135 140
Ala Ser Ala Ser Ala Leu Gly Lys Ser Thr Gly Thr Lys Gln Leu Val
145 150 155 160
Gln Ile Val Ile Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Lys Ala
165 170 175
Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile Ala Asn Asn Gly Gln Ala Asn Tyr Glu
180 185 190
Asn Tyr Ile Asp Gln Ile Val Ala Gln Ile Gln Gln Phe Pro Asp Val
195 200 205
Arg Val Val Ala Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr
210 215 220
Asn Leu Asn Val Gln Lys Cys Ala Asn Ala Lys Thr Thr Tyr Leu Ala
225 230 235 240
Cys Val Asn Tyr Ala Leu Thr Asn Leu Ala Lys Val Gly Val Tyr Met
245 250 255
Tyr Met Asp Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Leu
260 265 270
Ser Pro Ala Ala Gln Leu Phe Thr Gln Val Trp Gln Asn Ala Gly Lys
275 280 285
Ser Pro Phe Ile Lys Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala
290 295 300
Leu Gln Ala Ala Ser Pro Asp Pro Ile Thr Gln Gly Asn Pro Asn Tyr
305 310 315 320
Asp Glu Ile His Tyr Ile Asn Ala Leu Ala Pro Leu Leu Gln Gln Ala
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Gly Trp Asp Ala Thr Phe Ile Val Asp Gln Gly Arg Ser Gly Val Gln
340 345 350
Asn Ile Arg Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Ile Lys Gly Ala Gly
355 360 365
Phe Gly Thr Arg Pro Thr Thr Asn Thr Gly Ser Gln Phe Ile Asp Ser
370 375 380
Ile Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asn Ser
385 390 395 400
Ser Ser Pro Arg Tyr Asp Ser Thr Cys Ser Leu Pro Asp Ala Ala Gln
405 410 415
Pro Ala Pro Glu Ala Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Gln Thr Leu
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Val Ser Ala Ala Asn Pro Pro Leu
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<213>褐色嗜热裂孢菌
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Leu Ala Asn His Gly Trp Ser Asn Ala Phe Phe Ile Thr Asp Gln Gly
340 345 350
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Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly Ile Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly
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Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys
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Leu Pro Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Gln Ala Gly Ala Trp Phe Gln
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<213>黄孢原毛平革菌
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Pro Arg Ala Leu Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly
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<220>
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<220>
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<223>n为a、c、g或t
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<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
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<223>n为a、c、g或t
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gcccgctacg accctcactg cggtctc 27
Claims (18)
1.经修饰的家族6纤维素酶，其由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20组成，
其中所述经修饰的家族6纤维素酶与SEQ ID NO：1所编码的母体家族6纤维素酶相比显示出增强的热稳定性、嗜碱性、嗜热性或其组合。
2.经修饰的家族6纤维素酶，其由SEQ ID NO：21组成，
其中所述经修饰的家族6纤维素酶与SEQ ID NO：4所编码的母体家族6纤维素酶相比显示出增强的热稳定性、嗜碱性、嗜热性或其组合。
3.经修饰的家族6纤维素酶，其由SEQ ID NO：22组成，
其中所述经修饰的家族6纤维素酶与SEQ ID NO：7所编码的母体家族6纤维素酶相比显示出增强的热稳定性、嗜碱性、嗜热性或其组合。
4.权利要求1至3中任一项的经修饰的家族6纤维素酶，其中所述经修饰的家族6纤维素酶具有超出母体家族6纤维素酶的热稳定性提高，这通过其T50提高至少5℃来证明。
5.权利要求1至3中任一项的经修饰的家族6纤维素酶，其中所述经修饰的家族6纤维素酶具有超出母体家族6纤维素酶的热稳定性提高，这通过其T50提高至少9℃来证明。
6.权利要求1至3中任一项的经修饰的家族6纤维素酶，其中所述经修饰的家族6纤维素酶具有超出母体家族6纤维素酶的嗜热性提高，这通过其Topt提高至少1.5℃来证明。
7.权利要求1至3中任一项的经修饰的家族6纤维素酶，其中所述经修饰的家族6纤维素酶具有超出母体家族6纤维素酶的嗜热性提高，这通过其Topt提高至少2.5℃来证明。
8.权利要求1至3中任一项的经修饰的家族6纤维素酶，其中所述经修饰的家族6纤维素酶具有超出母体家族6纤维素酶的嗜碱性提高，这通过其pHopt提高至少0.5个单位来证明。
9.一种遗传构建体，其包含编码权利要求1至3中任一项中所定义的经修饰家族6纤维素酶的DNA序列，所述DNA序列与调节其从宿主微生物中表达和分泌的DNA序列有效连接。
10.权利要求9的遗传构建体，其中所述调节经修饰家族6纤维素酶表达和分泌的DNA序列来源于所述宿主微生物。
11.权利要求10的遗传构建体，其中所述调节经修饰的家族6纤维素酶表达和分泌的DNA序列来源于酵母或丝状真菌。
12.权利要求11的遗传构建体，其中所述调节经修饰的家族6纤维素酶表达和分泌的DNA序列来源于酵母属或木霉属的物种。
13.一种经遗传修饰的微生物，其能够表达和分泌权利要求1至3中任一项的经修饰的家族6纤维素酶，并包含权利要求9所定义的遗传构建体。
14.权利要求13的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌。
15.权利要求14的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)或原毛平革菌属(Phanerochaete)的物种。
16.权利要求15的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物是里氏木霉。
17.权利要求1至3中任一项的经修饰家族6纤维素酶用于处理纤维素底物的用途。
18.用于生产权利要求1至3中任一项所定义的经修饰家族6纤维素酶的方法，该方法包括：(i)用权利要求9所定义的遗传构建体转化真菌宿主细胞，产生重组的真菌菌株；(ii)选择表达经修饰家族6纤维素酶的重组真菌菌株；和(iii)在诱导所述经修饰家族6纤维素酶表达的条件下，在深层液体发酵中培养所选择的重组菌株。
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| US8778641B1 (en) * | 2013-02-12 | 2014-07-15 | Novozymes Inc. | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
| US8778640B1 (en) * | 2013-02-12 | 2014-07-15 | Novozymes Inc. | Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same |
| US9850512B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-26 | The Research Foundation For The State University Of New York | Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield |
| US9951363B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-04-24 | The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry | Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects |
| CN104293812B (zh) * | 2014-10-09 | 2016-09-14 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 耐热中性纤维素酶Cel6C及其编码基因和应用 |
| WO2016145527A1 (en) | 2015-03-16 | 2016-09-22 | Iogen Corporation | Process comprising acid pretreatment and enzymatic hydrolysis |
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| GB2567010A (en) | 2017-10-02 | 2019-04-03 | Univ Strathclyde | Apparatus for the rehabilitation, assistance and/or augmentation of arm strength in a user |
| CN114410669B (zh) * | 2022-03-28 | 2022-06-17 | 佛山市玉凰生态环境科技有限公司 | 重组腈水解酶的生产及固定化方法及其对乙腈的降解应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6114158A (en) * | 1998-07-17 | 2000-09-05 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Orpinomyces cellulase celf protein and coding sequences |
| US20060105914A1 (en) * | 2004-05-04 | 2006-05-18 | Taylor Larry E | Plant wall degradative compounds and systems |
| WO2006074005A2 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-13 | Genencor International, Inc. | Variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4461648A (en) | 1980-07-11 | 1984-07-24 | Patrick Foody | Method for increasing the accessibility of cellulose in lignocellulosic materials, particularly hardwoods agricultural residues and the like |
| US5677151A (en) * | 1994-06-24 | 1997-10-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Thermostable cellulase from a thermomonospora gene |
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US6114158A (en) * | 1998-07-17 | 2000-09-05 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Orpinomyces cellulase celf protein and coding sequences |
| US20060105914A1 (en) * | 2004-05-04 | 2006-05-18 | Taylor Larry E | Plant wall degradative compounds and systems |
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