BRPI0618576A2

BRPI0618576A2 - processo para purificação e remoção de endotoxina

Info

Publication number: BRPI0618576A2
Application number: BRPI0618576-2A
Authority: BR
Inventors: Mathias-Heinrich Kreuter
Original assignee: Veritron Ltd
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2011-09-06
Also published as: CA2629934A1; CN101346151A; JP2009515938A; TW200735883A; EA013618B1; EA200801284A1; WO2007057651A1; US20090169659A1; EP1948209A1; GB0523257D0

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAçãO E REMOçãO DE ENDOTOXINA. Processo para purificação de uma composição aquosa incluindo um concaminante solúvel em água possuindo grupos lipídicos, por exemplo, uma endocoxina, compreendendo contatar a composição com um componente lipofílico gue forma um complexo com o contaminante; uma primeira etapa de remoção do material tendo um camanho maior que o do complexo e uma segunda etapa de remoção do complexo.

Description

"PROCESSO PARA. PURIFICAÇÃO E REMOÇÃO DE ENDOTOXINA"

Campo da Invenção

Essa invenção se refere a um processo de purificação e especificamente a um processo para remoção de endotoxinas, a partir de extratos de plantas.

Antecedentes da Invenção

O uso terapêutico e outros dos extratos de plantas vem sendo entendido há milênios. Técnicas sofisticadas vem sendo empregadas de forma crescente para extrair os materiais valiosos, especialmente óleos, das ervas e outras plantas. Os produtos se destinam a ingestão, em geral, pela boca.

Naturalmente é desejável remover os contaminantes dos extratos de plantas. O US 6024998 descreve um processo para remoção de contaminantes lipofilicos indesejáveis encontrados nas bebidas e preparações vegetais. Tais contaminantes incluem pesticidas e outros materiais tóxicos que são tipicamente aplicados durante o crescimento da planta, e que podem se acumular no solo e ser retidos nas partes da planta.

O processo descrito no US 6024998 compreende a mistura da preparação vegetal com uma fase lipófila, onde os contaminantes são dissolvidos e assim concentrados, seguido por remoção dessa fase lipófila, por exemplo, por filtração. Dessa forma, o extrato da planta integral pode ser retido e os materiais estranhos removidos.

O WO 03/101479 descreve um produto terapêutico que pode conter um extrato de camomila. Sugere-se que esse extrato possa ter propriedades antiinflamatórias que são úteis na redução da inflamação, quando, como é preferido, o produto é fornecido por injeção. As endotoxinas do tipo encontrado nas paredes celulares são pirogênios que são componentes indesejáveis de uma formulação injetável. Um limite regulador máximo típico é de 75 EU/mL; um alvo inicial de < 100 EU/mL sendo desejável.

Sumário da Invenção

Atualmente vem sendo apreciado que as endotoxinas são materiais geralmente solúveis em água que não serão removidos seletivamente, de modo geral, pelo procedimento descrito na US 6024998. Contudo, vem sendo apreciado que as endotoxinas possuem grupos lipidicos que formam complexos com materiais lipofílicos e podem ser removidos por um procedimento análogo.

De acordo com a presente invenção, em um processo para purificação de uma composição aquosa compreendendo um contaminante solúvel em água possuindo grupos lipidicos, a composição é contatada com um componente lipofilico que forma um complexo com o contaminante; então, em seguida, uma primeira etapa de remoção do material possuindo um tamanho maior que o do complexo, e uma segunda etapa de remoção do complexo.

No novo processo, a segunda etapa de remoção é tipicamente ultrafiltração e a mesma remove as endotoxinas que complexam com o componente lipofilico. A primeira filtração ou outra etapa de remoção é necessária, de modo a remover os componentes maiores que bloquearão o processo de ultrafiltração.

Breve Descrição dos Desenhos

As figuras IA e IB são cada uma fluxogramas representando as etapas envolvidas em uma concretização da invenção.

Descrição das Modalidades Preferidas O componente lipofílico usado na presente invenção pode ser o mesmo que aquele descrito no US 6024998. Considerando-se que tal componente pode formar gotas relativamente grandes de uma fase lipófila onde os contaminantes lipofilicos são dissolvidos, uma característica da presente invenção é que tal material também pode complexar com grupos lipidicos em uma molécula geralmente solúvel em água, tal como uma endotoxina; o complexo sendo de um tamanho que pode ser removido por ultrafiltração, porém não por microfiltração que é suficiente para remover as gotas. Portanto, embora os materiais usados nessa invenção possam ser os mesmos que os da técnica anterior, o procedimento é necessariamente diferente.

As endotoxinas e também os antígenos são primariamente carboidratos possuindo proteínas pendentes e grupos lipidicos; a presença de grupos lipidicos é suficiente para formar um complexo com um material lipofílico apropriado, porém não compromete a natureza geralmente solúvel em água da molécula de carboidrato. Tais moléculas pirogênicas podem ter um efeito inflamatório na injeção e elas, portanto, seriam removidas tão logo quanto possível de um medicamento injetável.

A presente invenção é especificamente apropriada para a remoção de componentes indesejáveis da camomila, para a preparação de um medicamento conforme descrito no WO 03/101479. A cabeça da flor (capitulum) da planta camomila (Matricaria recutita) é composta de duas partes, isto é, floretes ou flores tubulares em forma de disco amarelo (flores tubiformis ou tubiflorum) e as flores ou floretes radiantes brancos (flores ligutatea) . A primeira é de interesse específico. Por meio da invenção, um produto útil pode ser obtido por separação das flores tubulares das outras partes da cabeça da camomila/planta, extração da parte amarela separada em água e isolamento do extrato/remoção das endotoxinas. A invenção, não obstante, é aplicável a qualquer erva ou outra preparação de planta; exemplos de tais plantas são fornecidos no US 6024998, o conteúdo do qual é incorporado aqui como referência.

Os componentes lipofilicos apropriados para uso na invenção são também descritos no US 6024998. Esse componente pode ser de origem animal, vegetal, mineral ou sintética. Preferivelmente é não tóxico. Exemplos de materiais apropriados incluem gorduras, tais como, manteiga de cacau e gordura de coco; óleos tais como, óleo neutro, óleos de girassol e óleo de coco fracionado; ceras, tais como, estearinas, óleo de jojoba, cera de abelha, espermacete e cera de carnaúba; parafinas, incluindo vaselina; lipideos e esteróis. Todos esses compostos, se puros ou usados como misturas, preferivelmente satisfazem os requerimentos de Deutsches Arzneiburch, the Brittish Pharmacopoeia, the European Pharmacopeia ou the US Food Chemical Codex. Os materiais especificamente preferidos são migliol, diglicerideos, triglicerideos e óleo de ricino. Esse último material inclui ácido ricinoléico, um exemplo de um ácido graxo de cadeia longa contendo um grupo polar.

O extrato aquoso que pode ser submetido a um processo de purificação, de acordo com a presente invenção, compreende, tipicamente, uma mistura multicomponente de componentes solúveis em água. Esta pode ser obtida por adição de água à parte apropriada da planta, de modo a obter uma suspensão que é, em seguida, geralmente aquecida a uma temperatura abaixo do ponto de ebulição da água, por exemplo, 90-94°C, e então resfriada à temperatura ambiente.

O extrato aquoso é então submetido à duas etapas de filtração. Apenas com a finalidade de ilustração, essas serão descritas abaixo como microfiltração e ultrafiltração, respectivamente. Outras técnicas, tais como, o uso de uma barreira lipófila podem ser apropriadas. Cada etapa de filtração pode ser conduzida em um, dois ou mais de dois estágios, caso desejado.

Conforme indicado acima, a microfiltração é aplicada de modo a remover o material que, de outra forma, comprometeria a efetividade da etapa de ultrafiltração. A microfiltração pode, na realidade, remover os contaminantes, conforme descrito na US6024998. Isso envolve, tipicamente, o emprego de um filtro possuindo um tamanho de poro de pelo menos 0,1 μm. O tamanho do poro usado na etapa de ultrafiltração subsequente, é tipicamente de 0,001 a 0,01, por exemplo, até 0,1 μm.

Cada etapa de filtração é conduzida, preferivelmente, por separação de membrana usando membranas sintéticas de materiais, tais como, vidro, metal, plásticos cerâmicos ou sintéticos. Os materiais apropriados para microfiltração incluem polipropileno e politetrafluoretileno. Os materiais apropriados para ultrafiltração incluem poliéter sulfonas e celulose regenerada.

Quando duas fases líquidas são separadas, isso é preferivelmente conduzido por meio de tecnologia de membrana. Para essa finalidade, as membranas tubulares ou assim denominadas "fluxo cruzado" são preferidas.

0 produto pode ser destinado ao uso em terapia. 0 mesmo deve, então, ser estéril e é desejável que etapas apropriadas de sua produção sejam conduzidas sob condições estéreis. Tais etapas são aquelas mostradas como 19, 21, 23 e 26 na figura IB dos desenhos anexos. Tal procedimento é ilustrado nos Exemplos 1 a 5 que se seguem. 0 exemplo 6 também ilustra a invenção, usando um protocolo revisado. Os exemplos 7 a 11 são comparativos.

O trabalho experimental reportado a seguir mostra que a combinação de uma cascata de filtração e a adição de um óleo de planta conduz a uma eliminação completa ou quase completa dos fragmentos de parede celular bacteriana, conhecidos por um versado na técnica como endotoxinas bacterianas ou pirogênios. Esses lipopolissacarideos ou macromoléculas são compostos de uma fração de Lipideo A anexada a uma cadeia de polissacarideo e são um constituinte principal da parede celular da bactéria gram- negativa. Essas macromoléculas complexas são solúveis em água, porém formam, surpreendentemente, complexos moleculares grandes com os óleos de plantas resultando em uma suspensão e podem ser retidos por técnicas de exclusão de peso molecular, preferivelmente por uso de equipamento de ultrafiltração. A microfiltração na filtração por peso molecular é vantajosa para se obter um pedaço grande de fragmentos de parede celular, fragmentos de parede celular mucilaginosos de materiais de planta que, de outra forma, bloqueariam os poros do equipamento de ultrafiltração.

A análise das endotoxinas bacterianas das amostras obtidas nos Exemplos foi realizada com o ensaio Cambrex PyroGene empregando um fator de diluição de 1:10.000.

EXEMPLOS 1 E 2

Quarenta e cinco gramas (45 g) de flores de camomila tubulares amarelas (Chamomilla recutita) foram misturados com 900 g de água (Aqua purificata, Ph. Helv.). Essa mistura foi aquecida a uma temperatura entre 90°C e 94 ºC dentro de 20 a 30 minutos. Após isso, a mistura foi armazenada á temperatura ambiente (15°C a 25°C) até que uma temperatura entre 30°C e 35°C foi alcançada. O resíduo de droga foi removido por filtração de camada profunda. O filtrado bruto obtido foi clarificado por filtração através de uma membrana de 0,22 μm.

Foi adicionado, ao filtrado clarificado, 0,3% (Exemplo 1) ou 0,1% (Exemplo 2), com relação à massa do extrato, de óleo de rícino (Ph. Eur. Grade). A mistura total foi homogeneizada por 5 minutos. Esse extrato preparado foi filtrado (no modo de fluxo tangencial) com recuperação do retentato através de uma membrana de 0,22 μm.

O permeado obtido foi filtrado (no modo de fluxo tangencial) com recuperação do retentato através de uma membrana de 0,1 μm. Finalmente, o permeado obtido foi filtrado (no modo de fluxo tangencial) com recuperação do retentato através de uma membrana de 1.000 kDa. Resíduo das endotoxinas bacterianas em cada filtrado final: < 100 EU/mL.

EXEMPLOS 3 A 5

O Exemplo 1 foi repetido, exceto que, ao invés de óleo de rícino, 0,3% (Exemplo 3), 1,0% (Exemplo 4) e 3,0% (Exemplo 5) com relação à massa do extrato, de migliol (Ph. Eur.) foram adicionados ao filtrado clarificado. Resíduo das endotoxinas bacterianas em cada filtrado final: < 100 EU/mL.

EXEMPLO 6

Esse exemplo utiliza um protocolo revisado, no qual o aquecimento e resfriamento foram realizados, não em uma autoclave, porém em um recipiente de camada dupla de 10 L sob agitação (temperatura máxima do dispositivo de aquecimento é de 140°C).

Migliol foi adicionado ao invés de óleo de rícino. O migliol foi o "Miglyol 812 para uso parenteral" da Hánseler. A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 10 minutos, ao invés de ser homogeneizada.

As microfiltrações de acordo com o processo anterior foram todas realizadas com sistemas Millipore Pellicon 2. Para melhor praticabilidade e de modo a evitar os procedimentos de limpeza que consomem tempo, as microfiltrações nesse Exemplo foram realizadas com o seguinte equipamento.

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Além disso, fenol foi adicionado para estabilização do extrato. A quantidade de fenol adicionado foi de 6,0-8,0 mg/mL. 0 mesmo foi adicionado após a filtração de 1.000 kDa. Após a adição, a suspensão foi agitada por aproximadamente 10 minutos, até que todo o fenol foi dissolvido.

0 nivel de endotoxina foi baixo em cada caso.

EXEMPLO 7 (Exemplo Comparativo)

0 Exemplo 1 foi repetido, exceto que as duas últimas etapas de filtração foram omitidas. Resíduo de endotoxinas bacterianas no filtrado final: 1.917 EU/mL.

EXEMPLO 8 (Exemplo Comparativo)

0 Exemplo 1 foi repetido, exceto que a última etapa de filtração foi omitida. Resíduo de endotoxinas bacterianas no filtrado final: 1.556 EU/mL.

EXEMPLO 9 (Exemplo Comparativo) O Exemplo 1 foi repetido, exceto que nenhum óleo de ricino foi adicionado, e as duas últimas etapas de filtração foram omitidas. Resíduo de endotoxinas bacterianas no filtrado final: 3.095 EU/mL.

EXEMPLO 10 (Exemplo Comparativo)

O Exemplo 1 foi repetido, exceto que nenhum óleo de ricino foi adicionado, e a última etapa de filtração foi omitida. Resíduo de endotoxinas bacterianas no filtrado final: 4.839 EU/mL.

EXEMPLO 11 (Exemplo Comparativo)

O Exemplo 1 foi repetido, exceto que nenhum óleo de ricino foi adicionado. Resíduo de endotoxinas bacterianas no filtrado final: 2.068 EU/mL.

Claims

1. Processo para purificar uma composição aquosa incluindo um contaminante solúvel em água tendo grupos lipidicos, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a composição com um componente lipofilico que forma um complexo com o contaminante; uma primeira etapa de remoção do material possuindo um tamanho maior que o do complexo; e uma segunda etapa de remoção do complexo.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é um extrato de planta.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o extrato de planta é um extrato aquoso.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2 ou -3, caracterizado pelo fato de que a planta é camomila.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o extrato é de flores tubiformis.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o contaminante solúvel em água é um carboidrato tendo também grupos protéicos.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o contaminante é uma endotoxina. ;

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 caracterizado pelo fato de que o componente lipofilico é um óleo.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a primeira etapa de remoção compreende microfiltração.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a microfiltração utiliza um filtro possuindo um tamanho de poro de pelo menos 0,1 μπι.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de remoção compreende ultrafiltração.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o contaminante é uma endotoxina.

13. Processo, de acordo com' a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a planta é como definida na reivindicação 4 ou 5.