EA013618B1

EA013618B1 - Способ очистки водного экстракта растений

Info

Publication number: EA013618B1
Application number: EA200801284A
Authority: EA
Inventors: Матиас-Хайнрих Кройтер
Original assignee: Веритрон Лимитед
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2006-11-14
Publication date: 2010-06-30
Also published as: WO2007057651A1; CN101346151A; GB0523257D0; BRPI0618576A2; US20090169659A1; JP2009515938A; EA200801284A1; CA2629934A1; EP1948209A1; TW200735883A

Abstract

Предложен способ очистки водной композиции, содержащей водорастворимую примесь, имеющую липидные группы, например, эндотоксина, который включает приведение композиции в контакт с липофильным компонентом, образующим комплекс с примесью, первый этап удаления материала, имеющего размер, больший, чем у комплекса, и второй этап удаления комплекса.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу очистки и, в частности, к способу удаления эндотоксинов из растительных экстрактов.

Предшествующий уровень техники

Терапевтическое и другие применения растительных экстрактов известны в течение тысячелетий. Для выделения ценных веществ, особенно масел, из трав и других растений использовались все более изощренные технологии. Продукты в основном предназначены для приема через рот.

Несомненно, удаление примесей из растительных экстрактов является желательным. В патентном документе υδ 6024998 описан способ удаления нежелательных липофильных примесей, находящихся в напитках и растительных препаратах. Такие примеси включают пестициды и другие токсичные вещества, которые обычно применяются во время выращивания растений и могут накапливаться в почве, а также сохраняться в частях растений.

Способ, описанный в υδ 6024998, включает смешивание растительного препарата с липофильной фазой, в которой примеси растворяются и таким образом концентрируются, и последующее удаление этой липофильной фазы, например, фильтрацией. Таким способом весь растительный экстракт может быть сохранен, а чужеродные вещества удалены.

\νϋ 03/101479 описывает терапевтический продукт, который может содержать экстракт ромашки. Предполагается, что этот экстракт может иметь противовоспалительные свойства, полезные для ослабления воспаления, если продукт вводить предпочтительно путем инъекции.

Эндотоксины того типа, который находится в клеточных стенках, являются пирогенами - нежелательными компонентами в составе композиции для инъекций. Типичный верхний регулятивный предел составляет 75 единиц эндотоксина на 1 мл (Ед/мл), причем желательно первоначально сосредоточиться на уровне <100 Ед/мл.

Сущность изобретения

В настоящее время понятно, что эндотоксины в основном являются водорастворимыми веществами, которые нельзя удалить избирательно, если вообще можно удалить, способом, описанным в И8 6024998. Однако принимается во внимание то, что у эндотоксинов есть липидные группы, которые образуют комплексы с липофильными веществами и могут быть удалены аналогичным способом.

В соответствии с настоящим изобретением способ очистки водной композиции, содержащей водорастворимую примесь, имеющую липидные группы, включает приведение композиции в контакт с липофильным компонентом, который образует комплекс с примесью, за этим следует первый этап удаления материала, имеющего больший размер, чем комплекс, и второй этап удаления комплекса.

В этом новом способе второй этап удаления - это, как правило, ультрафильтрация, и при этом удаляются эндотоксины, образовавшие комплекс с липофильным компонентом. Первая фильтрация или первый этап удаления иным способом необходимы для того, чтобы удалить более крупные компоненты, которые будут блокировать процесс ультрафильтрации.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 и 2 являются блок-схемами, где представлены этапы осуществления изобретения.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Липофильный компонент, используемый в настоящем изобретении, может быть таким же, как описан в И8 6024998. Поскольку такой компонент может образовывать относительно большие капли липофильной фазы, в которой растворены липофильные примеси, характерной особенностью настоящего изобретения является то, что такой материал может также образовывать комплексы с липидными группами в водорастворимой в целом молекуле, такой как эндотоксин; комплекс имеет такой размер, что он может быть удалён ультрафильтрацией, но не микрофильтрацией, что достаточно для удаления капель. Таким образом, хотя используемые в настоящем изобретении материалы могут быть такими же, как и материалы в предшествующем уровне техники, процедура неизбежно будет другой.

Эндотоксины, а также антигены являются, главным образом, углеводами, имеющими боковые белковые и липидные группы; наличие липидных групп достаточно для образования комплекса с подходящим липофильным материалом, но оно не нарушает общую водорастворимую природу углеводной молекулы. Такие пирогенные молекулы могут при инъекции оказывать воспалительное действие и поэтому их следует удалять, насколько возможно, из подлежащего инъекции лекарственного средства.

Настоящее изобретение, в частности, пригодно для удаления нежелательных компонентов из ромашки, чтобы приготовить лекарственное средство, как описано в νθ 03/101479. Цветочная головка (сарйи1ит) растения ромашки (МаДгсапа гсси(11а) состоит из двух частей, т.е. из жёлтых дисковых или трубчатых цветков или цветочков (Догез Ιιιόίίοπηίδ или ШЫПогиш) и расходящихся лучами белых цветков или цветочков (Догез Нды1а1еа). Особенный интерес представляют первые из них. С помощью настоящего изобретения пригодный к использованию продукт может быть получен путём отделения трубчатых цветков от остальных частей головки/растения ромашки, экстракции отделённой жёлтой части водой и выделения экстракта/удаления эндотоксинов. Однако изобретение применимо к любому травянистому растению или иному растительному препарату; примеры таких растений представлены в патентном документе υδ 6024998, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки.

- 1 013618

Липофильные компоненты, пригодные для использования в настоящем изобретении, также описаны в И8 6024998. Этот компонент может быть животного, растительного, минерального или синтетического происхождения. Предпочтительно он не должен быть токсичным. Примеры подходящих материалов включают жиры, такие как масло какао или кокосовое масло; масла, такие как нейтральные масла, масло подсолнечника и фракционированное кокосовое; воски, такие как стеарины, масло жожобы, пчелиный воск, спермацет и воск карнаубы; парафины, в том числе вазелин, липиды и стерины. Все такие соединения, в чистом виде или в виде смесей, предпочтительно удовлетворяют требованиям Немецкого лекарственного справочника (Эеи18сйе8 Аг/пс|Ьис11). Британской фармакопеи (ВгШкй Рйагтасоре1а), Европейской фармакопеи (Еигореап Рйагтасоре1а) или Кодекса пищевых и химических веществ США (ИЗ Еооб Сйет1са1 Собех). Особенно предпочтительными материалами являются миглиол, диглицериды, триглицериды и рициновое масло. Этот последний материал включает рицинолеиновую кислоту - пример длинноцепной жирной кислоты, содержащей полярную группу.

Водный экстракт, который может быть подвергнут способу очистки согласно настоящему изобретению, обычно представляет собой многокомпонентную смесь водорастворимых компонентов. Он может быть получен добавлением воды к соответствующей части растения, чтобы получить суспензию, которую затем обычно нагревают до температуры ниже точки кипения воды, например до 90-94°С, а затем охлаждают до комнатной температуры.

Затем водный экстракт подвергают двум этапам фильтрации. Исключительно в целях иллюстрации эти этапы будут описаны далее соответственно как микрофильтрация и ультрафильтрация. Могут быть пригодны также другие методы, такие как использование липофильного барьера. Каждый этап может быть при необходимости осуществлён в одну, две или более стадий.

Как указано выше, микрофильтрацию применяют, чтобы удалить материал, который иначе будет снижать эффективность этапа ультрафильтрации. Конечно, микрофильтрация может удалять примеси, как описано в ИЗ 6024998. Она обычно включает использование фильтра с размером пор, равным по меньшей мере 0,1 мкм. В последующем этапе ультрафильтрации размер пор обычно составляет от 0,001 до 0,01 мкм, например вплоть до 0,1 мкм.

Каждый этап фильтрации предпочтительно осуществляют с помощью мембранного разделения, используя синтетические мембраны или материалы, такие как стекло, металл, керамика или синтетические пластики. Пригодные для микрофильтрации материалы включают полипропилен и политетрафторэтилен. Пригодные для ультрафильтрации материалы включают полиэфирсульфоны и регенерированную целлюлозу.

Разделение двух жидких фаз обычно осуществляют с помощью мембранной технологии. Для этой цели предпочтительны трубчатые мембраны или так называемые мембраны поперечного потока (сго55-Г1о\\· тетЬгапек).

Продукт может предназначаться для использования в терапии. В этом случае он должен быть стерильным, и желательно, чтобы соответствующие этапы его получения проводились в стерильных условиях. Такие этапы представлены позициями 19, 21, 23 и 26 на фиг. 2. Такая процедура проиллюстрирована в следующих далее примерах 1-5. Пример 6 также иллюстрирует изобретение с использованием изменённого протокола. Примеры 7-11 являются сравнительными.

Описанная далее экспериментальная работа показывает, что комбинация фильтрационного каскада с добавлением растительного масла приводит к полному или почти полному удалению дебриса клеточных стенок бактерий, известных специалистам в данной области как бактериальные эндотоксины или пирогены. Эти липополисахариды или макромолекулы образованы остатком молекулы липида А, присоединенным к полисахаридной цепи, и являются основной составляющей клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Эти сложные макромолекулы водорастворимы, но неожиданно образуют высокомолекулярные комплексы с растительными маслами, что приводит к появлению суспензии, которую можно отделить с помощью техники разделения по принципу молекулярных сит, предпочтительно с использованием оборудования для ультрафильтрации. Микрофильтрация с фильтрационным разделением по молекулярной массе удобна, так как позволяет удалить значительную часть дебриса клеточных стенок, содержащих муцин фрагментов клеточных стенок из растительных материалов, которые иначе блокировали бы поры ультрафильтрационного оборудования.

Анализ бактериальных эндотосинов в образцах, полученных в примерах, проводили стандартным методом анализа СатЬгех РугоОепе аккау при разбавлении 1:10000.

Примеры 1 и 2.

900 г воды (Асща рштГюа1а - деминерализованная очищенная вода, квалификация по фармакопее Рй. Не1у.) смешивали с 45 г жёлтых трубчатых цветков ромашки (СйатотШа гесиШа). Эту смесь нагревали до температуры между 90 и 94°С в течение 20-30 мин. После этого смесь выдерживали при комнатной температуре (от 15 до 25°С) до тех пор, пока её температура не достигала значения между 30 и 35°С.

Лекарственный остаток удаляли фильтрацией глубинного слоя. Полученный неочищенный фильтрат осветляли фильтрованием через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.

- 2 013618

К осветлённому фильтрату добавляли 0,3% (пример 1) или 0,1% (пример 2), относительно массы экстракта, рицинового масла (квалификация по фармакопее РЬ. Еиг.). Всю смесь гомогенизировали в течение 5 мин. Полученный экстракт фильтровали (в установке с тангенциальным потоком) через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм с возвратом ретентата.

Полученный фильтрат фильтровали (в установке с тангенциальным потоком) через мембрану с диаметром пор 0,1 мкм с возвратом ретентата. Наконец, полученный фильтрат фильтровали (в установке с тангенциальным потоком) через 1000 кДа мембрану с возвратом ретентата. В каждом окончательном фильтрате содержание бактериального эндотоксина было <100 Ед/мл.

Примеры 3-5.

Пример 1 повторяли с тем исключением, что вместо рицинового масла к осветлённому фильтрату добавляли, относительно массы экстракта, 0,3% (пример 3), 1,0% (пример 4) и 3,0% (пример 5) миглиола (квалификация по фармакопее РЬ. Еиг.). В каждом окончательном фильтрате содержание бактериального эндотоксина было <100 Ед/мл.

Пример 6.

В этом примере был использован изменённый протокол, в котором нагревание и охлаждение осуществляли не в автоклаве, а в двуслойном сосуде объёмом 10 л при перемешивании (максимальная температура нагревателя составляла 140°С).

Вместо рицинового масла добавляли миглиол. Это был миглиол для парентерального введения М1д1уо1 812 Гог ратеп1ета1 Н5с фирмы Нап8е1ет. Смесь вместо гомогенизации перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин.

Все этапы микрофильтрации в соответствии с предыдущим способом осуществляли с помощью систем МйЬроте РеШеоп 2. Для большего практического удобства и сокращения времени на процедуры осветления микрофильтрации в этом примере проводили с использованием следующего оборудования.

Фильтрация	Система фильтрования	Фильтрующий патрон
фильтрация 0,2 мкм	МНПроге РеШеоп 2	Эигароге 0.2 μ, С-зсгееп
фильтрация 0,1 мкм	однопроходный фильтр	МННраск 200, 0.1 μ
фильтрация 1000 кДа	МШфоге РеШеоп 2	Вютах 1000 кОа, ν-зсгееп
фильтрация 0,2 мкм	однопроходный фильтр	МНйраск 200, 0.2 μ

Кроме того, для стабилизации экстракта добавляли фенол. Количество добавленного фенола составляло 6,0-8,0 мг/мл. Его добавляли после этапа фильтрации 1000 кДа. После добавления суспензию перемешивали в течение приблизительно 10 мин, пока весь фенол не растворялся.

В каждом случае содержание эндотоксина было низким.

Пример 7 (сравнительный пример).

Повторяли пример 1, но исключали два последних этапа фильтрации. В конечном фильтрате остаток бактериальных эндотоксинов составлял 1917 Ед/мл.

Пример 8 (сравнительный пример).

Повторяли пример 1, но исключали последний этап фильтрации. В конечном фильтрате остаток бактериальных эндотоксинов составлял 1556 Ед/мл.

Пример 9 (сравнительный пример).

Повторяли пример 1, но не добавляли рициновое масло и исключали два последних этапа фильтрации. В конечном фильтрате остаток бактериальных эндотоксинов составлял 3095 Ед/мл.

Пример 10 (сравнительный пример).

Повторяли пример 1, но не добавляли рициновое масло и исключали последний этап фильтрации. В конечном фильтрате остаток бактериальных эндотоксинов составлял 4839 Ед/мл.

Пример 11 (сравнительный пример).

Повторяли пример 1, но не добавляли рициновое масло. В конечном фильтрате остаток бактериальных эндотоксинов составлял 2068 Ед/мл.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки водного экстракта растений, содержащего водорастворимый углевод, имеющий липидные группы, включающий приведение экстракта в контакт с липофильным компонентом, образующим комплекс с углеводом, удаление материала, имеющего размер, больший, чем у комплекса, путем микрофильтрации и далее удаление комплекса путем ультрафильтрации.
2. Способ по п.1, где растение представляет собой ромашку.
3. Способ по п.2, где экстракт представляет собой экстракт трубчатых цветков (Г1оге5 ШЫГотшщ).
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где углевод содержит также белковые группы.
5. Способ по п.4, где углевод представляет собой эндотоксин.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где липофильным компонентом является масло.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где при микрофильтрации используют фильтр,

- 3 013618 имеющий размер пор по меньшей мере 0,1 мкм.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где при ультрафильтрации используют фильтр, имеющий размер пор в пределах от 0,001 до 0,01 мкм, например 0,1 мкм.