CN101346151A - 纯化和去除内毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于纯化水性组合物的方法，所述水性组合物包含有脂质基团的水溶性污染物，例如内毒素，所述方法包含：将所述组合物与一种亲脂组分相接触，所述亲脂组分与所述污染物形成复合物；去除比所述复合物的大小更大的物质的第一去除步骤；以及去除所述复合物的第二去除步骤。

Description

纯化和去除内毒素的方法
技术领域
本发明涉及纯化方法，具体而言涉及从植物提取物中去除内毒素的方法。
背景技术
近千年来，已经知道植物提取物的治疗用途和其他用途。不断发展的高新技术已经被应用于从草本和其他植物中提取有价值的物质，特别是油。其产品一般是用于口服。
当然希望从植物提取物中去除污染物。US6024998描述了一种用于去除在饮料和植物制品中存在的不需要的亲脂性污染物的方法。这些污染物包括杀虫剂和其他毒性物质，这些毒性物质一般在植物生长过程中被施用，而且可以在土壤中积累并在植物部分中残留。
US6024998中描述的方法包含：把所述植物制品与亲脂相混合，污染物溶解于所述亲脂相中并由此被浓缩，然后例如通过过滤去除该亲脂相。以这种方式，可以保留整个的植物提取物而去除外源的物质。
WO03/101479描述了一种可含有甘菊提取物的治疗产品。已表明，当通过注射(优选的方式)给予该产品的时候，该提取物可能具有可用于减少炎症的抗炎性质。
在细胞壁中发现的内毒素类型是致热原，所述致热原是注射制剂的不良的组分。最大调节极限一般为75EU/ml，小于100EU/ml的初始目标是合适的。
发明内容
现在已经知道，内毒素一般是不能被选择性除去的水溶性物质，如果能被除去的话，也不能通过US6024998中描述的方法将它们选择地除去。然而，现在已经知道，内毒素具有能与亲脂物质形成复合物的脂质基团，并且可以通过类似的方法被去除。
根据本发明，在一种用于纯化水性组合物(包含具有脂质基团的水溶性污染物)的方法中，所述组合物与一种亲脂组分接触，所述亲脂组分与所述污染物形成复合物；然后是去除比所述复合物的大小更大的物质的第一去除步骤，以及去除所述复合物的第二去除步骤。
在所述新方法中，所述第二去除步骤一般是超滤，除去与所述亲脂组分复合的内毒素。所述第一过滤步骤或其他的去除步骤是除去将阻碍所述超滤过程的较大组分所必须的。
附图说明
图1A和1B都是流程图，表示本发明的实施方案所涉及的步骤。
具体实施方式
在本发明中使用的亲脂组分可以与US6024998中描述的相同。鉴于这样的组分可以形成亲脂相的相对较大的液滴(其中溶解了亲脂污染物)，本发明的一个特征在于这样的物质还可以与通常水溶的分子(例如内毒素)中的脂质基团复合；所述复合物的大小可以通过超滤除去，而不能通过足以除去所述液滴的微孔过滤除去。因此，虽然本发明中使用的物质可能与现有技术中的那些相同，但是方法显然是不同的。
内毒素以及抗原主要是具有侧链的蛋白质和脂质基团的碳水化合物；所述脂质基团的存在使其足以与合适的亲脂物质形成复合物，而不损害所述碳水化合物分子的通常的水溶性质。这些致热的分子在注射时可能具有炎症效应，因此最好尽可能地把它们从注射药剂中除去。
本发明特别适合于从甘菊中去除不需要的组分，用于制备WO03/101479中描述的药剂。甘菊植物(西洋甘菊(Matricaria recutita)的花头(头状花序(capitulum))由两部分构成，即黄色盘状或管状花或小花(flores tubiformis或tubiflorum)和白色的放射花或小花(flores ligutatea)。前者特别值得注意。通过本发明，可以通过以下方式获得有用的产品：把管状花与甘菊头/植株的其他部分分离，在水中提取所述分离的黄色部分，并且分离所述提取物/去除内毒素。然而，本发明适用于任何草本或其他的植物制品；这些植物的实例在US6024998中给出，其内容通过引用的方式纳入本文。
适合于在本发明中使用的亲脂组分也在US6024998中有所记载。该组分可以源自于动物、植物、矿物或是合成的。它优选是无毒的。合适的物质的实例包括可可脂(cocoa butter)和椰子脂等脂肪；天然油、葵花油和分馏椰子油等油；硬脂(stearin)、希蒙得木油(jojoba oil)、蜂蜡、鲸蜡(spermaceti)和棕榈蜡(camauba wax)等蜡；石蜡，包括凡士林；脂质；以及固醇类(sterols)。所有这些化合物(不管是单独使用还是作为混合物使用)优选符合以下的要求：德国药典(Deutsches Arzneibuch)、英国药典(BritishPharmacopoeia)、欧洲药典(European Pharmacopeia)或美国食用化学品集(USFood Chemical Codex)。特别优选的物质是miglyol、甘油二酯、甘油三酯和蓖麻油。所述最后一种物质包括蓖麻油酸，它是一种含极性基团的长链脂肪酸的实例。
可以被本发明的纯化方法处理的所述水性提取物一般包含多种水溶组分的多组分混合物。它可以通过以下方式获得：在所述合适的植物部分中加入水以获得悬浮液，所述悬浮液然后通常被加热至低于水的沸点的温度(例如90-94℃)，然后冷却至室温。
然后，所述水性提取物经过所述两个过滤步骤。仅仅作为示例的目的，下文将分别对微孔过滤和超滤进行描述。其他的技术例如亲脂屏障的使用也可能是合适的。如果需要，每个过滤步骤可以分一个、两个或多于两个阶段进行。
如上文所述，使用微孔过滤的目的是为了去除那些会损害所述超滤步骤的效果的物质。微孔过滤确实可以去除污染物，如US6024998中描述的那样。这通常涉及使用具有至少0.1μm的孔径的滤器。在随后的超滤步骤所使用的孔径一般是0.001-0.01μm，例如最多至0.1μm。
每个过滤步骤优选通过膜分离进行，使用玻璃、金属、陶瓷或合成塑料等材料制造的合成膜。适用于微孔过滤的材料包括聚丙烯和聚四氟乙烯(polytetrafluorethyene)。适用于超滤的材料包括聚醚砜(polyether sulfone)和再生纤维素。
当分离两种液相的时候，优选通过膜技术的方法进行。为了该目的，优选使用管状膜或被称为“错流(cross-flow)”膜的膜。
所述产品拟用于治疗中。然后应该把它灭菌，并且其合适的生产步骤需要在无菌的条件下进行。这些步骤在附图的图1B中显示为19、21、23和26。这种方法示于下文的实施例1至实施例5中。实施例6使用经改进的方案也对本发明进行了阐述。实施例7至实施例11作为对比。
下文报道的实验工作表明，过滤级联和加入植物油的联合使得完全或者几乎完全去除了细菌细胞壁碎片，它被本领域技术人员当作细菌性内毒素或致热原。这些脂多糖或大分子由附着于多糖链的脂质A部分构成，并且是革兰氏阴性细菌的细胞壁的主要组成部分。这些复合大分子是水溶性的，但是意外地可与植物油形成高分子复合物而产生悬浮液，并且可以通过分子量排除技术(优选地通过使用超滤装置)被阻留。分子量过滤的微孔过滤适宜于除去大片的细胞壁碎片以及植物材料的粘液细胞壁片段，否则它们会堵塞超滤装置的孔。
在所述实施例中获得的样品中的细菌内毒素用Cambrex PyroGene测定进行分析，使用1∶10.000的稀释倍数。
实施例1和2
将45g的黄色管状甘菊花(Chamomilla recutita)与900g的水(Aquapurificata，Ph.Helv.)混合。将该混合液加热到90℃-94℃的温度保持20-30分钟。之后将所述混合液置于室温下(15℃-25℃)直至达到30℃-35℃的温度。
通过深层过滤去除药物残留。把获得的粗滤液通过0.22μm的膜过滤使之澄清。
在所述澄清的滤液中，根据提取物的量加入0.3％(实施例1)或0.1％(实施例2)的蓖麻油(Ph.Eur.Grade)。所述全混合液经过匀浆化处理5分钟。该制备的提取物经过0.22μm的膜进行渗余物回收过滤(以切线流过滤模式(tangential flow mode))。
所述获得的渗透物经过0.1μm的膜进行渗余物回收过滤(以切线流过滤模式)。最后，所述获得的渗透物经过1000kDa的膜进行渗余物回收过滤(以切线流过滤模式)。
在每种终滤液中的残余细菌内毒素：＜100EU/ml。
实施例3-5
除以下改变之外重复实施例1：根据提取物的质量用0.3％(实施例3)、1.0％(实施例4)和3.0％(实施例5)的mygliol(Ph.Eur.)替代蓖麻油加入到澄清后的滤液中。
在每种终滤液中的残余细菌内毒素：＜100EU/ml。
实施例6
该实施例使用经改进的方案，其中加热和冷却步骤不是在高压灭菌器中而是在搅拌下的10L双层容器中进行(热器的最高温度是140℃)。
加入miglyol替代蓖麻油。miglyol是来自
Figure A20068004918300071
的“非肠胃用的Miglyol812”。所述混合液在室温下搅拌10分钟代替匀浆化。
前人的微孔过滤方法都是用Millipore Pellicon 2系统进行的。为了更好地实施并且为了避免费时的清洗程序，本实施例中的微孔过滤用以下设备进行：
  过滤   滤器系统   Cartouche
  0.2μm过滤   Millipore Pellicon 2   Durapore 0.2μ，C-screen
  0.1μm过滤   单向滤器   Millipack 200，0.1μm
  1000kDa过滤   Millipore Pellicon 2   Biomax 1000kDa，V-Screen
  0.2μm过滤   单向滤器   Millipack 200，0.2μm
另外，加入苯酚以稳定所述提取物。加入苯酚的量是6.0-8.0mg/ml。在1000kDa过滤之后加入它。在加入之后，搅拌所述悬浮液约10分钟，直至所有的苯酚都溶解。
在每个实例中所述内毒素的水平都是很低的。
实施例7(对比实施例)
除以下改变之外重复实施例1：省略最后两步过滤步骤。
在所述终滤液中的残余细菌内毒素：1917EU/ml。
实施例8(对比实施例)
除以下改变之外重复实施例1：省略最后一步过滤步骤。
在所述终滤液中的残余细菌内毒素：1556EU/ml。
实施例9(对比实施例)
除以下改变之外重复实施例1：不加入蓖麻油并且省略最后两步过滤步骤。
在所述终滤液中的残余细菌内毒素：3095EU/ml。
实施例10(对比实施例)
除以下改变之外重复实施例1：不加入蓖麻油并且省略最后一步过滤步骤。
在所述终滤液中的残余细菌内毒素：4839EU/ml。
实施例11(对比实施例)
除以下改变之外重复实施例1：不加入蓖麻油。
在所述终滤液中的残余细菌内毒素：2068EU/ml。

Claims (11)

1.一种用于纯化水性组合物的方法，所述水性组合物包含含有脂质基团的水溶性污染物，所述方法包含：把所述组合物与一种亲脂组分相接触，所述亲脂组分与所述污染物形成复合物；去除比所述复合物的大小更大的物质的第一去除步骤；以及去除所述复合物的第二去除步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述组合物为植物提取物。
3.根据权利要求2的方法，其中所述植物提取物为水性提取物。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述植物为甘菊。
5.根据权利要求4的方法，其中所述提取物为flores tubiformis的提取物。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述水溶性污染物为还含有蛋白基团的碳水化合物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述污染物为内毒素。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述亲脂组分为油。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述第一去除步骤包括微孔过滤。
10.根据权利要求9的方法，其中所述微孔过滤使用孔径为至少0.1μm的过滤器。
11.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述第二去除步骤包括超滤。
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