BRPI0615218A2 - anticorpos isolados, composiÇÕes, mÉtodo de produÇço de anticorpos e uso de quantidade terapeuticamente efetiva de anticorpos - Google Patents

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Abstract

Anticorpos Isolados, Composições, Métodos de Produção de Anticorpos e Uso de Quantidade Terapeuticamente Efetiva de Anticorpos. São providos polipeptídeos. São providos domínios de ligação de anticorpo ou antígeno que se ligam a esses polipeptídeos.Também são providos métodos de obtenção de anticorpo que liga o Receptor-2 (TR-2) ao ligante de indução da apoptose relacionado com o fator de necrose de tumor (TNF) (TRAIL) que compreendem administrar pelo menos um desses polipeptídios a um animal e obter um anticorpo que se liga ao TR-2 a partir do animal. São providos anticorpos reativos com TR-2. Também são providas células que produzem anticorpos reativos com TR-2, composições farmacêuticas que compreendem anticorpos reativos com TR-2, métodos que usam anticorpos reativos com TR-2 e kits que compreendem anticorpos reativos com TR-2. Também são providos métodos de diminuição ou prevenção da ligação de um anticorpo a TR-2, administrando esse polipeptídio.

Description

"Anticorpos Isolados, Composições, Métodos de Produção de Anticorpos e Uso de Quantidade Terapeuticamente Efetiva de Anticorpos" Relatório Descritivo
Este Pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório US 60/713.433, depositada em 31 de agosto de 2005, e o Pedido Provisório US 60/713.478, depositado em 31 de agosto de 2005. Os Pedidos Provisórios US 60/713.433 e 60/713.478 são aqui incorporados por referência em suas totalidades para qualquer propósito.
Campo
São proporcionados polipeptídios. São proporcionados anticorpos ou antígeno de ligação de domínios que se ligam a esses polipeptídios. Também são providos métodos de obtenção de um anti- corpo que se liga ao fator de necrose de tumor (TNF) relacionado ao ligante de indução de apoptose ("TRAIL") Receptor-2 (TR-2) que compre- ende a administração de pelo menos um desses polipeptídios a um animal e a obtenção de um anticorpo que se liga ao TR-2 a partir do animal. São proporcionados anticorpos reativos com TR-2. Também são providas células que produzem anticorpos reativos com TR-2, composições farmacêuticas que compreendem anticorpos reativos com TR-2, métodos de uso dos anticorpos reativos com TR-2 e kits que compreende anticorpos reativos com TR-2. Também são proporciona- dos métodos de diminuição ou prevenção da ligação de um anticorpo ao TR-2 pela administração desse polipeptídio.
Antecedentes
A interação entre o TR-2 e seu ligante, TRIAL, tem um papel na indução da apoptose (ver, por exemplo, Almasan e colaboradores, Cytokine & Growth Factor Reviews 14: 337-348 (2003)). O TRAIL, também conhecido como ligante Apo2, é um ligante homomérico que interage com quatro membros da super-família receptores TNF (Recepto- res TRAIL (aTR") 1 a 4), bem como com o receptor solúvel, relacionado opsteoprotegerina (iOPGw). A ligação do TRAIL ao TR-I ou TR-2 na superfície de uma célula dispara a apoptose daquela célula. Após a ligação inicial do TRAIL ao TR-I ou TR-2, proteínas intracelulares são recrutadas para o domínio de morte intracelular do receptor, formando um complexo de sinalização. Certas caspases intracelulares são recru- tadas para o complexo, aem que elas se auto-ativam e por sua vez ativam caspases adicionais e a cascata da apoptose intracelular. O TR-3 e TR-4 e o OPG não possuem o domínio intracelular responsável pela transmissão do sinal de apoptose. Então, a ligação do TRAIL ao TR-3, TR-4 ou OPG não dispara a apoptose. O TR-3 e TR-4 são também referidos como receptores "chamarizes" e suas superexpressões têm sido mostradas proteger células da indução de apoptose pelo TRAIL. O TR-2 é expresso em uma variedade de células, incluindo fígado, cérebro, seio, rim, cólon, pulmão, baço, timo, linfócitos do sangue periféricos, prósta- ta, testículo, ovário, útero e vários tecidos ao longo do trato gastrointes- tinal (ver, por exemplo, Walczak e colaboradores, EMBO J. 16: 5386- 5397 (1997); Spierings e colaboradores, J. Histochem. Cytochem. 52: 821-831 (2004)). Embora o TRAIL e receptores TRAIL sejam amplamente expressos, eles são mais ativos na indução de apoptose em células transformadas (ver, por exemplo, Daigle e colaboradores, Swiss Med. Wkly. 131: 231-237 (2001)).
Sumário
Em certas modalidades, um polipeptídio isolado é fornecido que compreende pelo menos uma região determinante de complementa- ridade (CDR) selecionada dentre CDR la, CDR2a e CDR3a: em que a CDRla compreende a seqüência de aminoá cido a b c d e f g h i j k 1, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoácido d é selecionado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecio- nado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalanina; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente;
em que a CDR2a compreende a seqüência de aminoá- cido mnopqrstuvwxyza' b'c', em que o aminoácido m é selecio- nado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofa- no ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina, arginina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é selecionado dentre lisina, 4/18 δ leucina ou serina; o aminoãcido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente;
em que a CDR3a compreende a seqüência de aminoá- cido d' e' f g> h> i'j' k' Y m' n' o> p> q' r' s' t' u' v> w', em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagi- na, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspárti- co, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmi- co, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido Oi é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido r> é tirosina ou não está presente; o aminoácido s' é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w' é valina ou não está presente; e
em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um receptor-2 uTRAILn (TR-2).
Em certas modalidades, é proporcionado um polipeptídio i- solado que compreende pelo menos uma região determinante de com- plementaridade (CDR) selecionada dentre:
aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 98 a 111 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 99 a 105 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID N0:20; aminoácidos 99 a 118 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 98 a 118 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 98 a 108 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 98 a 117 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 34; e JJo
aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 34; em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polipeptídio isolado é fornecido que compreende pelo menos uma região determinante de complementa- ridade (CDR) selecionada dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b:
em que a CDRlb compreende a seqüência de aminoá- cido al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleuci- na, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoá- cido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspárti- co ou serina; o aminoácido j 1 é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é selecionado dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presen- te;
em que a CDR2b compreende a seqüência de aminoá- cido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoá- cido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutami- na, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre serina, arginina ou treonina;
em que a CDR3b compreende a seqüência de aminoá- cido yl zl aT bl' cV dl' ei' fl' gl', em que o aminoácido yl é seleciona- do dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o aminoácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido ai' é selecionado dentre serina, treonina, alanina histidina tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleu- cina ou lisina; o aminoácido dl' é selecionado dentre treonina, fenilala- nina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido ei* é prolina; o aminoá- cido fl' é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre treonina ou serina; e
em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polipeptídio isolado é fornecido
que compreende pelo menos uma região determinante de complementa- ridade (CDR) selecionada dentre:
aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 36;
aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 40; &
aminoácidos 00 a 97 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 46; LO aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 24 a 39 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 55 a 61 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 94 a 102 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO:58; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 60; jJ2>
r
aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 24 a 35 de SEQ ID NO: 64;
aminoácidos 51 a 57 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 90 a 88 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 50 a 57 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 66;
aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 68; em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo isolado é forne- cido que compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementarida- de (CDR) selecionada dentre CDR la, CDR2a e CDR3a: em que a CDRla compreende a seqüência de aminoá-
cido abcdefghijkl, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoácido d é selecionado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecio- jâ»
nado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalanina; o aminoãcido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente;
em que a CDR2a compreende a seqüência de aminoá- cido mnopqrstuvwxyza'b'c', em que o aminoácido m é selecio- nado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofa- no ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecio- nado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoá- cido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspárti- co; o aminoácido ζ é selecionado dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente;
em que a CDR3a compreende a seqüência de aminoá- cido d' e' f g' h' Γ j' k' Γ m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' w\ em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagi- na, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, β6
serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspárti- co, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmi- co, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido o' é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido Si é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v} é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w' é valina ou não está presente; e
em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, é provido um polinucleotídeo isola- do que compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementarida de (CDR) selecionada dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b:
em que a CDRlb compreende a seqüência de aminoá- cído al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleuci- na, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoá- cido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspárti- co ou serina; o aminoácido j 1 é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é selecionado dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presen- te;
em que a CDR2b compreende a seqüência de aminoá- cido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoá- cido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutami- na, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre
serina, arginina ou treonina;
em que a CDR3b compreende a seqüência de aminoá- cido yl zl ai1 bl' cl' dl' ei' fl' gl', em que o aminoácido yl é seleciona- do dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o aminoácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido ai' é selecionado dentre serina, treonina, alanina, histidina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleu- cina ou lisina; o aminoácido dl'é selecionado dentre treonina, fenilala- nina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido ei' é prolina; o aminoá- cido fl' é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre treonina ou serina; e
em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia
pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, é proporcionado um anticorpo anti- TR-2 isolado, que compreende uma região variável e uma região cons- tante, em que o anticorpo compreende:
(i) um primeiro polipeptídio que compreende pelo me- nos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada
dentre CDRla, CDR2a e CDR3a,
em que a CDRla compreende a seqüência de
aminoácido abcdefghijkl, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoácido d é selecionado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecio- nado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é seleciona- do dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecionado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalani- na; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é
serina ou não está presente;
em que a CDR2a compreende a seqüência de
aminoácido m η o ρ q r s t u ν w χ y ζ a' b' c', em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina, arginina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é seleciona- do dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente;
em que a CDR3a compreende a seqüência de aminoácido d' e' f g' h' i' j' k' Y m> n' o' p' q' r' s' t' u' v> w', em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre aspara- gina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagina, glicina ou treonina; o aminoácido g? é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i> é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoá- cido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofa- no, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutãmico, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido η' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido o' é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido s' é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w' é
valina ou não está presente; e
em que primeiro polipeptídio, em associação
com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2; e JSO
Ψ
(ii) um segundo polipeptídio que compreende pe- lo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b
em que a CDRlb compreende a se- qüência de aminoácido al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleucina, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoácido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspártico ou serina; o aminoácido jl é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é seleciona- do dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido η 1 é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoá- cido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presente; em que a CDR2b compreende a se-
qüência de aminoácido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutamina, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre serina, arginina ou treonina;
em que a CDR3b compreende a se- qüência de aminoácido yl zl al' bl' cl' dl' ei' fl' gl', em que o aminoá- cido yl é selecionado dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o aminoácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido ai' é selecionado dentre serina, treonina, alanina histidina tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleucina ou lisina; o aminoácido dl* é selecionado dentre treonina, fenilalanina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido ei' é prolina; o aminoácido fl' é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre treonina ou serina; e
em que o segundo polipeptídio, em as- sociação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, é proporcionado um anticorpo anti- TR-2 isolado, que compreende uma região variável e uma região cons- tante, em que o anticorpo compreende:
um primeiro polipeptídio que compreende regiões de- terminantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 2 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 36; um primeiro polipeptídio que compre- ende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabe- lecidas na SEQ ID NO: 4 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 38; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 6 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 40; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementari- dade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 8 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 42; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 10 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 44; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 12 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabe- lecidas na SEQ ID NO: 46; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 14 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 48; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 16 e um segundo polipeptídio que compre- ende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 50; um primeiro polipep- tídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 18 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 52; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de com- plementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 20 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 54; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 22 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabe- lecidas na SEQ ID NO: 56; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 24 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 58; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 26 e um segundo polipeptídio que compre- ende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 60; um primeiro polipep- tídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 28 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 62; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de com- plementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 30 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 64; um primeiro polipeptídio que compreende regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 32 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabe- lecidas na SEQ ID NO: 66; ou um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 34 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 68.
Em certas modalidades, uma célula é fornecida, compreen- dendo:
(a) um primeiro polinucleotídeo que compreende uma se- qüência que codifica um primeiro polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre CDRla, CDR2a e CDR3a
em que a CDRla compreende a seqüência de ami- noácido abcdefghijkl, em que o aminoácido a é glicina; o aminoá- cido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilalanina; o aminoáci- do c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoácido d é selecio- nado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tiro sina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecio- nado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalanina; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente;
em que a CDR2a compreende a seqüência de ami- noácido mnopqrstuvwxyza'b'c', em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é selecionado dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente;
em que a CDR3a compreende a seqüência de ami- noácido d' e' f g' h' i'j' k' Γ m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' w', em que o aminoá- cido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é
selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagi- na, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspárti- co, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmi- co, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido oJ é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido s' é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido Ui é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w' é valina ou não está presente; em que o primeiro polipeptídio, em associa- ção com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2; e
(b) um segundo polinucleotídeo que compreende uma se- qüência que codifica um segundo polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b
em que a CDRlb compreende a seqüência de
aminoácido al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleuci- na, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoá- cido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspárti- co ou serina; o aminoácido jl é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é selecionado dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presen- te;
em que a CDR2b compreende a seqüência de ami- noácido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutami- na, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre serina, arginina ou treonina;
em que a CDR3b compreende a seqüência de ami- noácido yl zl ai' bl' cl' dl' ei' fl? gl', em que o aminoácido yl é selecionado dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o amino- ácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido ai' é selecionado dentre serina, treonina, alanina, histidina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleucina ou lisina; o aminoácido dl' é selecionado dentre treonina, fenilalanina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido ei' é prolina; o aminoácido fl* é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre treonina ou serina; em que o segundo polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, é proporcionado um anticorpo iso- lado que especificamente se liga a um epítope que é especificamente ligado por pelo menos um anticorpo selecionado de: Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H, Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab M, Ab N, Ab O, Ab P e Ab Q.
Em certas modalidades, é proporcionado um polipeptídio que compreende pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96.
Em certas modalidades, é proporcionado um polipeptídio consistindo essencialmente de pelo menos uma seqüência de aminoáci- do selecionada da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96.
Em certas modalidades, é proporcionado um domínio de li- gação de anticorpo ou antígeno que se liga a pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96. J38
φ-
Em certas modalidades, é proporcionado um método de ob- ter um anticorpo que se liga a TR-2 que compreende a administração de pelo menos um polipeptídio selecionado da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96 a um animal e obtenção de um anticorpo que se liga ao TR-2 a partir do animal.
Em certas modalidades, é proporcionado um método de di- minuir ou prevenir a ligação de um anticorpo ao TR-2 pela administra- ção de um polipeptídio que compreende pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96.
Em certas modalidades, é proporcionado um método de di- minuir ou prevenir a ligação de um anticorpo ao TR-2 pela administra- ção de um polipeptídio consistindo de pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada da SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 96.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra o cronograma de imunização usado no Exemplo 1 para um TR-2-His construído em camundongos transgênicos expressando genes de imunoglobulina humanos, ou por via de inocula- ção no coxim plantar (grupos 1, 2 e 3) ou por via injeção intraperitoneal (grupos 4 e 5).
A Figura 2 mostra os resultados de um teste ELISA para medir a reatividade de certas amostras de sangue de camundongos selecionados descritos na Figura 1 para o antígeno TR-2, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 1.
A Figura 3 mostra seqüências de nucleotídeo que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e cadeia leve (SEQ ID NO: 35) do anticorpo anti-TR-2 A e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 2) e cadeia leve (SEQ ID NO: 36) daquele anticorpo. A Figura 4 mostra as seqüências de nucleotídeo que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) e cadeia leve (SEQ ID NO: 37) do anticorpo anti-TR-2 B e as seqüências de aminoáci- do das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 4) e cadeia leve (SEQ ID NO: 38) daquele anticorpo.
A Figura 5 mostra as seqüências de nucleotídeo que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) e cadeia leve (SEQ ID NO: 39) do anticorpo anti-TR-2 C e as seqüências de aminoáci- do das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 6) e cadeia leve (SEQ ID NO: 40) daquele anticorpo.
A Figura 6 mostra as seqüências de nucleotídeo que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e cadeia leve (SEQ ID NO: 41) do anticorpo anti-TR-2 D e as seqüências de aminoáci- do das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 8) e cadeia leve (SEQ ID NO: 42) daquele anticorpo.
A Figura 7 mostra as seqüências de nucleotídeo que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 9) e cadeia leve (SEQ ID NO: 43) do anticorpo anti-TR-2 E e as seqüências de aminoáci- do das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 10) e cadeia leve (SEQ ID NO: 44) daquele anticorpo.
A Figura 8 mostra as seqüências de nucleotídeo que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 11) e cadeia leve (SEQ ID NO: 45) do anticorpo anti-TR-2 F e as seqüências de aminoáci- do das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 12) e cadeia leve (SEQ ID NO: 46) daquele anticorpo.
A Figura 9 mostra as seqüências de nucleotídeo que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 13) e cadeia leve (SEQ ID NO: 47) do anticorpo anti-TR-2 G e as seqüências de aminoáci- do das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 14) e cadeia leve (SEQ ID NO: 48) daquele anticorpo. jâp
A Figura 10 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 15) e cadeia leve (SEQ ID NO: 49) do anticorpo anti-TR-2 H e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 16) e cadeia leve (SEQ ID NO: 50) daquele anticorpo.
A Figura 11 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 17) e cadeia leve (SEQ ID NO: 51) do anticorpo anti-TR-2 I e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 18) e cadeia leve (SEQ ID NO: 52) daquele anticorpo.
A Figura 12 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 19) e cadeia leve (SEQ ID NO: 53) do anticorpo anti-TR-2 J e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 20) e cadeia leve (SEQ ID NO: 54) daquele anticorpo.
A Figura 13 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 21) e cadeia leve (SEQ ID NO: 55) do anticorpo anti-TR-2 K e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 22) e cadeia leve (SEQ ID NO: 56) daquele anticorpo.
A Figura 14 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 23) e cadeia leve (SEQ ID NO: 57) do anticorpo anti-TR-2 L e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 24) e cadeia leve (SEQ ID NO: 58) daquele anticorpo.
A Figura 15 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 25) e cadeia leve (SEQ ID NO: 59) do anticorpo anti-TR-2 M e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 26) e cadeia leve (SEQ ID NO: 60) daquele anticorpo. J3J #
A Figura 16 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 27) e cadeia leve (SEQ ID NO: 61) do anticorpo anti-TR-2 N e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 28) e cadeia leve (SEQ ID NO: 62) daquele anticorpo.
A Figura 17 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 29) e cadeia leve (SEQ ID NO: 63) do anticorpo anti-TR-2 O e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 30) e cadeia leve (SEQ ID NO: 64) daquele anticorpo.
A Figura 18 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 31) e cadeia leve (SEQ ID NO: 65) do anticorpo anti-TR-2 P e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 32) e cadeia leve (SEQ ID NO: 66) daquele anticorpo.
A Figura 19 mostra as seqüências de nucleotídeo que codi- ficam as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 33) e cadeia leve (SEQ ID NO: 67) do anticorpo anti-TR-2 Q e as seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 34) e cadeia leve (SEQ ID NO: 68) daquele anticorpo.
A Figura 20 é um alinhamento das seqüências de aminoá- cido das regiões variáveis de cadeia pesada para os anticorpos anti-TR-2 AaQ (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 e 34). As regiões da estrutura 1 até 3 (FR1, FR2 e FR3) e as regiões determinantes de complementaridade 1 até 3 (CDR1, CDR2 e CDR3) para cada seqüência são mostradas.
A Figura 21 é um alinhamento das seqüências das regiões variáveis de cadeia leve para os anticorpos anti-TR-2 AaQ (SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 e 68). As regiões da estrutura 1 até 3 (FR1, FR2 e FR3) e as regiões determi-
nantes de complementaridade 1 até 3 (CDR1, CDR2 e CDR3) para cada seqüência são mostradas.
A Figura 22 é uma tabela que mostra a classificação de cer- tos anticorpos anti-TR-2 humanos em um de quatro grupos de reativi- dade de acordo com a habilidade de cada um de se ligar às proteínas N- avidina TR-2 truncadas e quiméricas, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 5.
A Figura 23 mostra representações esquemãticas dos treze truncamentos de N-avidina TR-2 humana usada no mapeamento epítope, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 6.
A Figura 24 é um gráfico de barras que mostra a ligação de certos anticorpos anti-TR-2 humanos aos truncamentos N-avidina-TR-2 de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 6.
A Figura 25 mostra representações esquemáticas de trun- camentos N-avidina-cino TR-2 e quiméricos N-avidina-cino/humano usados no mapeamento epítope, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 6.
A Figura 26 é um alinhamento do TR-2 humano, TR-2 cino (forma curta) e seqüências TR-2 de camundongos, de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 6.
A Figura 27 é um gráfico de barras mostrando a ligação de certos anticorpos anti-TR-2 humanos aos truncamentos, quimeras e substituições de domínio de acordo com o trabalho descrito no Exemplo 6.
Descrição Detalhada
de Certas Modalidades
O título da seção usado aqui tem o propósito organizacional apenas e não é para ser entendido como limitante da matéria descrita. Todos os documentos ou porções de documentos citados nesta aplica- ção, incluindo, mas sem limitação Patentes, aplicações de Patentes, artigos, livros e tratados, são expressamente incorporados por referência aqui neste documento em suas totalidades para qualquer propósito.
Definições
Podem ser usadas Técnicas padrões para DNA recombinan- te, síntese de oligonucleotídeo e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Podem ser realizadas reações enzimáticas e técnicas de purificação de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente efetuadas na técnica ou como aqui descritas. As técnicas e procedimentos precedentes podem ser geralmen- te efetuados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritas em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas através da presente especificação (ver, por exemplo, Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y. (1989))). A menos que sejam fornecidas definições específi- cas, as nomenclaturas utilizadas em conexão e os procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritas são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Podem ser usadas técnicas padrões para sínteses químicas, análises químicas, preparações farma- cêuticas, formulações, entregas e tratamentos de pacientes.
Nesta aplicação, o uso do singular inclui o plural a menos que especificamente colocado de outra maneira. Nesta aplicação, o uso de "ou" significa "e/ou" a menos que colocado de outra maneira. Além disso, o uso do termo "incluindo", bem como outras formas, tais como "inclui" e "incluídas", não é limitante. Também, termos tais como "elemento" ou "componente" englobam tanto os elementos e componen- tes que compreendem uma unidade como elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade a menos que colocado de outra maneira. Como utilizado de acordo com a presente revelação, os se- guintes termos, a menos que indicados de outra maneira, devem ser entendidos terem os seguintes significados:
O termo "polinucleotídeo isolado" como aqui usado deve sig- nificar um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, o qual por virtude de sua origem o "polinucleotídeo isolado" (1) não é associado com todo ou uma parte de um polinucleotídeo do qual o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) é ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.
Os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são usados intercambiavelmente e são aqui referidos significar uma forma poliméri- ca de nucleotídeos com pelo menos 10 bases de comprimento. Em certas modalidades, as bases podem compreender pelo menos um de ribonu- cleotídeos, deoxiribonucleotídeos e uma forma modificada de qualquer dos dois tipos de nucleotídeo. O termo inclui formas de DNA de fita simples e dupla. O termo "polinucleotídeo" também engloba seqüências que compreendem uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 e 67. Em certas modalidades, polinucleotídeos tem seqüências de nucleotídeos que são cerca de 90 por cento, ou cerca de 95 por cento, ou cerca de 96 por cento, ou cerca de 97 por cento, ou cerca de 98 por cento, ou cerca de 99 por cento idênticas às seqüências do nucleotídeo mostradas nas Figuras 3-19. Em certas modalidades, polinucleotídeos complementares a polinucleotídeos específicos que codificam certos polipeptídios descritos aqui são fornecidos.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre CDR la, CDR2a e CDR3a, em que a CDRla compreende a seqüência de aminoácido abcdefghijkl, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilala- nina; o aminoácido c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoá- cido d é selecionado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecionado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalani- na; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente; em que a CDR2a compreende a seqüência de aminoácido mnopqrstuvwxyza' b'c', em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâ- mico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina, arginina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é seleciona- J36 33/188
do dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente; em que a CDR3a compreende a seqüência de aminoácido d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' η' o' p' q' r' s' t' u' Vi w', em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagi- na, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspárti- co, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmi- co, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido oJ é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido rf é tirosina ou não está presente; o aminoácido s' é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w' é valina ou não está presente; e em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica uma CDR2a, em que a CDR2a compreende a seqüência de aminoácido mnopqrstuvwxyza'b'c' em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metioni- na ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina ou ácido aspárti- co; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é seleciona- do dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica uma CDR3a que compreende a seqüência J 32 de aminoãcido d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' n' o' p' q' r' s' t' Ui v' w', em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspãrtico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre aspara- gina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagina, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i* é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoá- cido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofa- no, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmico, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido o' é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido qJ é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoãcido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido sJ é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido V é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido ν' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w* é m
r
valina ou não está presente.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos duas regiões determinantes de complementaridade (CDR) selecionadas de CDRla, CDR2a e CDR3a, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende CDR la, CDR2a e CDR3a, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região constante de cadeia pesada. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreen- de uma região constante de cadeia pesada de um humano. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma seqüência de aminoácido como estabelecida na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região constante de cadeia pesada de um não humano. Em certas modalida- des, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um JW
Ψ
polipeptídio que compreende uma região constante de cadeia pesada de uma espécie diferente da humana.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2; aminoáci- dos 26 a 37 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 98 a 111 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 16; aminoá- cidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 99 a 105 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID N0:20; aminoácidos 99 a 118 de SEQ ID N0:20; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 98 a 118 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 98 a 108 de SEQ ID NO: 24; aminoáci- dos 26 a 35 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 98 a 117 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 30; amino- ácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 34; e aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 34, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de anticorpo se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos duas CDRs de SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende três das CDRs de SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 26 a 35 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compre- ende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 8. Em certas modalida- des, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende 39/188
uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 26 a 35 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 98 a 111 de SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, um polinucleotí- deo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 99 a 105 de SEQ ID NO: 18. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 99 a 118 de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreen- de aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 98 a 118 de SEQ ID NO: 22. Em certas modali- dades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 98 a 108 de SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 26 a 35 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 98 a 117 de SEQ ID NO: 28. Jk 3 Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídío que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 30. Em certas modalidades, um polinucleotí- deo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídío que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 32. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídío que compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 34; e aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 34.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo que compreende uma seqüência que codifica um polipeptídío que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b, em que a CDRlb compreende a seqüência de aminoácido al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleucina, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosína; o aminoácido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspártico ou serina; o aminoácido jl é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é seleciona- do dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, m
asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoá- cido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presente; em que a CDR2b compreende a seqüên- cia de aminoácido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutamina, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre serina, arginina ou treonina; em que a CDR3b compreende a seqüência de aminoácido yl zl ai' bl' cl' dl' ei' fl' gl', em que o aminoácido yl é selecionado dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o aminoácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido al' é selecionado dentre serina, treonina, alanina, histidina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleucina ou lisina; o aminoácido dl' é selecionado dentre treonina, fenilalanina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido el' é prolina; o aminoácido fΓ é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecio- nado dentre treonina ou serina; e em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos duas regiões determinantes de complementaridade (CDR) selecionadas de CDR lb, CDR2b e CDR3b, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende CDR lb, CDR2b e CDR3b, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende
uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região variável de cadeia leve de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região constante de cadeia leve. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreen- de uma região constante de cadeia leve de um humano. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma seqüência de aminoácido como estabelecida na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 ou SEQ ID NO: 68. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende uma região constante de cadeia leve de um não humano. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipep- tídio que compreende uma região constante de cadeia leve de uma espécie diferente da humana.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 50 a J%
56 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 36; aminoá- cidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 24 a 39 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 55 a 61 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 94 a 102 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 24 a 35 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 51 a 57 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 90 a 88 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 50 a 57 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 68; em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos duas CDRs de SEQ ID NOs. 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 ou 68. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende três das CDRs de SEQ ID NOs. 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 ou 68.
Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 24 a 34 de SEQ ID NO: 36; aminoãcidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 36 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 36. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 38 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 38. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 40 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 40. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreen- de aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 42 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 42. Em certas modali- dades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 44 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 44. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 24 a 34 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 46 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 46. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos Ψ
56 a 62 de SEQ ID NO: 48 e aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 48. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 39 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 55 a 61 de SEQ ID NO: 50 e aminoácidos 94 a 102 de SEQ ID NO: 50. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreen- de aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 52 e aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 52. Em certas moda- lidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 54 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 54. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 24 a 34 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 56 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 56. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 58 e aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 58. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 60 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 60. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreen- de aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 62 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 62. Em certas modali- dades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 35 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 51 a 57 de SEQ ID NO: 64 e aminoácidos 90 a 88 de SEQ ID NO: 64. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoáci- jW
Ψ
dos 24 a 34 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 50 a 57 de SEQ ID NO: 66 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 66. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídio que compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 68 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 68.
Em certas modalidades, esta aplicação discute certos poli- nucleotídeos que codificam cadeias leves e pesadas de um anticorpo. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinu- cleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia leve de um anticor- po. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotí- deos que codificam uma região variável de cadeia leve de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam uma região constante de cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie diferente da humana. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam regiões constantes de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam uma região constante de cadeia leve de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinu- cleotídeos que codificam uma região constante de cadeia leve de um anticorpo de uma espécie diferente da humana. Em certas modalidades, esta aplicação discute certos polinucleotídeos que codificam um anticor po de cadeia única.
Em certas modalidades, estes polinucleotídeos e polipeptí- dios de cadeia leve e pesada de um anticorpo são polinucleotídeos e polipeptídios de cadeia leve e pesada de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeo como estabelecido nas SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 ou 67. Em certas modalidades, um polinucleotí- deo compreende uma seqüencia de nucleotídeo que tem uma ou mais deleções, adições e/ou substituições de um ou mais nucleotídeos daquelas seqüências. Em certas modalidades, um polinucleotídeo compreende uma seqüencia de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido que compreende uma seqüência de aminoácido como estabelecida na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 ou 68. Em certas modalidades, seqüências de regiões variáveis que compreende regiões determinante de complementaridade (CDRs), por exemplo, CDRl até CDR3, são fornecidas. Em certas modalidades, polinucleotídeos e polipeptídios de regiões variáveis são polinucleotídeos e polipeptídios de regiões variáveis de humanos.
O termo "nucleotídeos ocorrendo naturalmente" inclui deo- xiribonucleotídeos e ribonucleotídeos. Deoxiribonucleotídeos incluem, mas, sem limitação, a adenosina, guanina, citosina e timidina. Ribonu- cleotídeos incluem, mas, sem limitação, a adenosina, citosina, timidina e uracila. O termo "nucleotídeos modificados" inclui, mas, sem limita- ção, a nucleotídeos com grupos açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. O termo "ligação polinucleotídeo" inclui, mas, sem limita- ção, a ligações polinucleotídeo tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Ver, por exemplo, LaPlanche e colabora- dores, Nuel Acids Res. 14: 9081 (1986); Sec e colaboradores, J. Am. Chem. Soe. 106: 6077 (1984); Stein e colaboradores, Nucl Aeids Res. 16: 3209 (1988); Zon e colaboradores, Anti-Caneer Drug Design 6: 539 (1991); Zon e colaboradores, Oligonucleotides and Analogues: A Praetieal Approaehi pg 87-108 (F. Eckstein, Ed. Oxford University Press, Oxford Wngland (1991)); Stec e colaboradores, Patente US 5.151.510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990). Em certas modalidades, um polinucleotídeo pode incluir um rótulo para detecção.
O termo "polipeptídio isolado" refere-se a qualquer polipep- tídio que (1) é livre de pelo menos algumas proteínas com as quais ele normalmente seria encontrado, (2) é essencialmente isento de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expres- sa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.
Os termos "polipeptídio", "peptídeo" e "proteína" são usados
aqui de forma intercambiável e referem-se a um polímero de dois ou mais aminoãcidos ligados um ao outro por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isósteres de peptídeo. Os termos se aplicam a polímero de aminoácidos contendo aminoácidos ocorrendo naturalmente bem como polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido ocorrendo não naturalmente ou um análogo químico de um aminoácido ocorrendo naturalmente. Um polímero de aminoácido pode conter um ou mais resíduos de aminoáci- dos que tenham sido modificados por um ou mais processos naturais, tal como processamento pós-translacional e/ou um ou mais resíduos de aminoácidos que tenham sido modificados por uma ou mais técnicas de modificação química conhecidas na técnica.
Um "fragmento" de um polipeptídio de referência refere-se a uma tira contígua de aminoácidos de qualquer parte do polipeptídio de referência. Um fragmento pode ser de qualquer comprimento que seja menor do que o comprimento do polipeptídio de referência.
Uma "variante" de um polipeptídio de referência refere-se a um polipeptídio tendo um ou mais substituições aminoácidos, deleções ou inserções relativas ao polipeptídio de referência. Em certas modali- dades, uma variante de um polipeptídio de referência tem um local de modificação pós-translacional alterado (isto é, um local de glicosilação). Em certas modalidades, ambos um polipeptídio de referência e uma variante de um polipeptídio de referência são agentes ligantes específi- cos. Em certas modalidades, ambos o polipeptídio de referência e uma variante de um polipeptídio de referência são anticorpos.
As variantes de um polipeptídio de referência incluem, mas, sem limitação, a variantes de glicosilação. As variantes de glicosilação incluem variantes nas quais o número e/ou tipo de locais de glicosilação tenham sido alterados quando comparados com o polipeptídio de referência. Em certas modalidades, as variantes de glicosilação de um polipeptídio de referência compreendem um número maior ou menor de locais de glicosilação N-Iigados do que o polipeptídio de referência. Em certas modalidades, um local de glicosilação N-Iigado é caracterizado pela seqüência Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoáci- do designado como X pode ser um resíduo de aminoácido exceto prolina. Em certas modalidades, as variantes de glicosilação de um polipeptídio de referência compreendem um rearranjo de cadeias de carboidrato N- ligadas em que um ou mais locais de glicosilação N-Iigados (tipicamente aquele que são de ocorrência natural) são eliminados e um ou mais de locais N-Iigados novos são criados.
As variantes de um polipeptídio de referência incluem, mas, sem limitação, a variantes de cisteína. Em certas modalidades, variantes de cisteínas incluem variantes nas quais um ou mais resíduos de cisteína do polipeptídio de referência são substituídos por um ou mais resíduos de não cisteínas; e/ou um ou mais de resíduos de não cisteínas J
do polipeptídio de referência são substituídos por um ou mais resíduos de cisteínas. As variantes de cisteína podem ser úteis, em certas moda- lidades, quando um polipeptídio particular deve ser reconformado em uma conformação ativa biologicamente, por exemplo, após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. Em certas modalidades, as variantes de cisteína de um polipeptídio de referência têm menos resíduos de cisteína do que o polipeptídio de referência. Em certas modalidades, variantes de cisteína de um polipeptídio de referência têm um número par de cisteínas para minimizar interações resultantes de cisteínas ímpares. Em certas modalidades, as variantes de cisteína têm mais resíduos de cisteína do que a proteína nativa.
Um "derivado" de um polipeptídio de referência refere-se a: um polipeptídio: (1) tendo uma ou mais modificações de um ou mais resíduos de aminoácidos do polipeptídio de referência; e/ou (2) na qual uma ou mais ligações peptidil tenham sido substituídas com um ou mais ligações não peptidil; e/ou (3) na qual o término-N e/ou o término- C tenham sidos modificados. Certas modificações exemplificativas incluem, mas, sem limitação, a acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, biotinilação, ligação covalente de ílavina, ligação covalente de um segmento heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação disulfeto, demetilação, formação de ligações cruza- das covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formi- lação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxi- lação, iodinação, mediação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos a proteínas tais como arginilação e ubiquitinação. Em certas modalidades, ambos um polipeptídio de referência e um derivado de um polipeptídio de JSM
Ψ
referência são agentes ligantes específicos. Em certas modalidades, ambos um polipeptídio de referência e um derivado de um polipeptídio de referência são anticorpos.
Os polipeptídios incluem, mas, sem limitação, a seqüências de aminoácidos modificadas seja por processos naturais, tal como processamento pós-translacional, como por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Em certas modalidades, modificações podem ocorrer em qualquer parte em um polipeptídio, incluindo a cadeia principal do peptídio, as cadeias laterais de aminoá- cido e as terminações amino e carboxil. Em certas modalidades, as modificações podem estar presentes no mesmo grau ou graus variáveis em diversos locais em um dado polipeptídio. Em certas modalidades, um dado polipeptídio contém muitos tipos de modificações tais como deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de seqüência nativa. Em certas modalidades, os polipeptídios podem ser ramificados e/ou cíclicos. Os polipeptídios cíclicos, ramificados e ramificados cíclicos podem resultar de processos naturais pós- translacionais (incluindo, mas não limitado, a ubiquitinação) ou podem ser feitos por métodos sintéticos. O termo "polipeptídio" também engloba seqüências que compreendem as seqüências de aminoácidos de cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo selecionado dentre Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H, Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab M, Ab N, Ab O, Ab P e Ab Q, como descrito abaixo (ver SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 e 68). O termo "polipeptídio" também engloba seqüências que tem um ou mais deleções, adições e/ou substi- tuições de um ou mais aminoácidos daquelas seqüências. Em certas modalidades, certas seqüências de polipeptídio compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR). Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre CDRla, CDR2a e CDR3a em que a CDRla compreende a seqüência de aminoácido abcdefghijkl, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é selecionado dentre glicina, tiro sina ou fenilala- nina; o aminoácido c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoá- cido d é selecionado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecionado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalani- na; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente; em que a CDR2a compreende a seqüência de aminoácido mnopqrstuvwxyza'b'c', em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâ- mico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina, arginina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é seleciona- do dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente; em que a CDR3a compreende a seqüência de aminoácido d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' w', em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagi- na, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspárti- co, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido Γ é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmi- co, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido o' é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido JôS
s' é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoãcido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w' é valina ou não está presente; e em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos duas regiões determinantes de complementaridade (CDR) selecionadas de CDRla, CDR2a e CDR3a, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende CDRla, CDR2a e CDR3a, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma
região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia pesada. Em certas modali- dades, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia pesada de um humano. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma seqüência de aminoácido como estabelecida na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia pesada de um não humano. Em certas modalidades, um polipep- tídio compreende uma região constante de cadeia pesada de uma espécie diferente da humana. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2; aminoáci- dos 26 a 37 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 98 a 111 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 16; aminoá- cidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 99 a 105 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 99 a 118 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 98 a 118 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 98 a 108 de SEQ ID NO: 24; aminoáci- dos 26 a 35 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 98 a 117 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 30; amino- ácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 34; e aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 34, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de anticorpo se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos duas das CDRs de SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos três das CDRs de SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ou 34.
Em certas modalidades, um polipeptídio compreende ami- noácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 2; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 4; amino- ácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 4; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 4. Em certas modalidades, um polipeptídio que compreende aminoáci- dos 26 a 37 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 6; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 8; amino- ácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 12; aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende amino- ácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 14; aminoácidos 98 a 111 de SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 16; aminoácidos 100 a 109 de SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 18; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID JW
NO: 18; aminoácidos 99 a 105 de SEQ ID NO: 18. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 20; aminoácidos 99 a 118 de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 22; aminoácidos 98 a 118 de SEQ ID NO: 22. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 50 a 65 de SEQ ID NO: 24; aminoácidos 98 a 108 de SEQ ID NO: 24. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 26; aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 26. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 35 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 50 a 66 de SEQ ID NO: 28; aminoácidos 98 a 117 de SEQ ID NO: 28. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 30; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 30. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 32; aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 32. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 26 a 37 de SEQ ID NO: 34; aminoácidos 52 a 67 de SEQ ID NO: 34; e aminoácidos 100 a 111 de SEQ ID NO: 34.
Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecio- nada dentre CDR lb, CDR2b e CDR3b, em que a CDRlb compreende al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é seleciona- do dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; ò aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleucina, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoácido il é seleciona- do dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspártico ou serina; o aminoácido jl é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é selecionado dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presente; em que a CDR2b compreende o aminoácido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoá- cido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoá- cido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoá- cido wl é selecionado dentre glutamina, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre serina, arginina ou treonina; em que a CDR3b compreende a seqüência de aminoácido ylzlarbTcl' dl' ei' ÍV gr, em que o aminoácido yl é selecionado dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o aminoácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido ai' é selecionado dentre serina, treonina, alanina, histidina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleucina ou lisina; o aminoácido dl' é selecionado dentre treonina, fenilalanina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido ei' é prolina; o aminoácido fl' é sele- cionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre treonina ou serina; e em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos duas regiões determinantes de complementaridade (CDR) selecionadas de CDRlb, CDR2b e CDR3b, em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende CDRlb, CDR2b e CDR3b, caso em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma região variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um polipeptídio que compreende uma região variável de cadeia leve de um anticorpo de humano. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia leve. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia leve de um humano. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma seqüência de aminoácido como estabelecida na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 ou SEQ ID NO: 68. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia leve de um não humano. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende uma região constante de cadeia leve de uma espécie diferente da humana.
Em certas modalidades, um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada dentre aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 36; aminoáci- dos 50 a 56 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 24 a 39 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 55 a 61 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 94 a 102 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 56; aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO:58; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 24 a 35 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 51 a 57 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 90 a 88 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 50 a 57 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 68; caso em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos duas das CDRs de SEQ ID NOs. 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 ou 68. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende pelo menos três das CDRs de SEQ ID NOs. 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52,
54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 ou 68. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende ami-
noácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 36; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 36 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 36. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 38; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 38 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 38. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 40; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 40 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 40. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 42; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 42 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 42. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 44; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 44 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 44. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 46; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 46 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 46. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 48; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 48 e aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 48. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 39 de SEQ ID NO: 50; aminoácidos 55 a 61 de SEQ ID NO: 50 e aminoácidos 94 a 102 de SEQ ID NO: 50. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 52; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 52 e aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO: 52. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 54; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 54 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 54. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 56; aminoãcidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 56 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 56. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 40 de SEQ ID NO: 58; aminoácidos 56 a 62 de SEQ ID NO: 58 e aminoácidos 95 a 103 de SEQ ID NO:58. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 60; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 60 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 60. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 62; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 62 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 62. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 35 de SEQ ID NO: 64; aminoácidos 51 a 57 de SEQ ID NO: 64 e aminoácidos 90 a 88 de SEQ ID NO: 64. Em certas modalida- des, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 66; aminoácidos 50 a 57 de SEQ ID NO: 66 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 66. Em certas modalidades, um polipeptídio compreende aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 68; aminoácidos 50 a 56 de SEQ ID NO: 68 e aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 68.
O termo "ocorrendo naturalmente" como aplicado a um ob- jeto significa que um objeto pode ser achado na natureza. Por exemplo, um polipeptídio ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e o qual não tenha sido intencionalmente modificado pelo homem no laboratório
ou de outra forma é de ocorrência natural.
O termo "ligado operacionalmente" como aqui usado refere- se a componentes que estão em uma relação permitindo-os funcionar de suas maneiras pretendidas. Por exemplo, no contexto de uma seqüência de polinucleotídeo, uma seqüência de controle pode ser "ligada opera- cionalmente" a uma seqüência codificante quando a seqüência de controle e a seqüência codificante estão em associação uma com a outra de tal maneira que a expressão da seqüência codificante é alcançada sob M
condições compatíveis com o funcionamento da seqüência de controle.
O termo "seqüência de controle" refere-se a seqüências de polinucleotídeos as quais podem efetuar a expressão e processamento das seqüências codificantes com as quais elas estão em associação. A natureza dessas seqüências de controle pode diferir dependendo do organismo hospedeiro. Certas seqüências de controle exempliflcativas para procariotes incluem, mas, sem limitação, a promotores, sítios ligantes ribossomais e seqüências de terminação de transcrição. Certas seqüências de controle exemplificativas para eucariotes incluem, mas, sem limitação, a promotores, aumentadores e seqüências de terminação de transcrição. Em certas modalidades, as "seqüências de controle" podem incluir seqüências líderes e/ou seqüências de parceria de fusão.
Em certas modalidades, uma primeira seqüência codificante de polinucleotídeo é ligada operacionalmente a uma segunda seqüência codiílcante de polinucleotídeo quando a primeira e segunda seqüências codificante de polinucleotídeo são transcritas em um mRNA contíguo único que pode ser traduzido em um polipeptídio contíguo único.
No contexto de polipeptídios, dois ou mais polipeptídios es- tão "ligados operacionalmente" se cada polipeptídio ligado é capaz de funcionar de sua maneira pretendida. Um polipeptídio que é capaz de funcionar de sua maneira pretendida quando ligado operacionalmente a outro polipeptídio pode ser capaz ou não de funcionar de sua maneira pretendida quando não ligado operacionalmente a outro polipeptídio. Por exemplo, em certas modalidades, um primeiro polipeptídio pode ser incapaz de funcionar de sua maneira pretendida quando não ligado, mas pode ser estabilizado ao ser ligado a um segundo polipeptídio de forma que ele se torna capaz de funcionar de sua maneira pretendida. Alternativamente, em certas modalidades, um primeiro polipeptídio pode ser capaz de funcionar de sua maneira pretendida quando não ligado, e pode reter a habilidade quando ligado operacionalmente a um segundo polipeptídio.
Como aqui usado, dois ou mais polipeptídios são "fundidos" quando os dois ou mais polipeptídios são ligados ao traduzi-los como uma seqüência de polipeptídio contígua única ou ao sintetizá-los como uma seqüência de polipeptídio contígua única. Em certas modalidades, dois ou mais polipeptídios fundidos podem ter sido traduzidos in vivo a partir de duas ou mais seqüências codificantes de polinucleotídeo ligadas operacionalmente. Em certas modalidades, dois ou mais polipep- tídios fundidos podem ter sido traduzidos in vitro a partir de duas ou mais seqüências codificantes de polinucleotídeo ligadas operacionalmen- te.
Conforme aqui usado neste documento, dois ou mais poli- peptídios são "fundidos operacionalmente" se cada polipeptídio ligado é capaz de funcionar de sua maneira pretendida.
Em certas modalidades, um primeiro polipeptídio que con- tem duas ou mais unidades de polipeptídio distintas é considerado estar ligado a um segundo polipeptídio desde que pelo menos uma das unidades distintas do polipeptídio do primeiro polipeptídio é ligada ao segundo polipeptídio. Como exemplo não limitativo, em certas modali- dades, um anticorpo é considerado como ligado a um segundo polipeptí- dio em todas as seguintes instâncias: (a) o segundo polipeptídio está ligado a um dos polipeptídios de cadeia pesada do anticorpo; (b) o segundo polipeptídio está ligado a um dos polipeptídios de cadeia leve do anticorpo; (c) uma primeira molécula de um segundo polipeptídio está ligada a um dos polipeptídios de cadeia pesada do anticorpo e uma segunda molécula do segundo polipeptídio está ligada a um dos polipep- tídios de cadeia leve do anticorpo; e (d) primeira e segunda moléculas do segundo polipeptídio estão ligadas ao primeiro e segundo polipeptídios de cadeia pesada do anticorpo e terceira e quarta moléculas do segundo polipeptídio estão ligadas ao primeiro e segundo polipeptídios de cadeia
leve do anticorpo.
Em certas modalidades, a linguagem "um primeiro polipep- tídio ligado a um segundo polipeptídio" engloba situações em que: (a) apenas uma molécula de um primeiro polipeptídio está ligado a apenas uma molécula de um segundo polipeptídio; (b) apenas uma molécula de um primeiro polipeptídio está ligada a mais do que uma molécula de um segundo polipeptídio; (c) mais do que uma molécula de um primeiro polipeptídio está ligada a apenas uma molécula de um segundo polipep- tídio; e (d) mais do que uma molécula de um primeiro polipeptídio está ligada a mais do que uma molécula de um segundo polipeptídio. Em certas modalidades, quando uma molécula ligada compreende mais do que uma molécula de um primeiro polipeptídio e apenas uma molécula de um segundo polipeptídio, todas ou pouco menos do que todas as moléculas de um primeiro polipeptídio podem ser covalentemente ou não covalentemente ligadas ao segundo polipeptídio. Em certas modali- dades, quando a molécula ligada compreende mais do que uma molécu- la de um primeiro polipeptídio, uma ou mais moléculas do primeiro polipeptídio pode estar covalentemente ou não covalentemente ligadas a
outras moléculas do primeiro polipeptídio.
Como aqui usado neste documento, um "ligante flexível" re- fere-se a qualquer ligante que não é predito, de acordo com sua estrutu- ra química, de ser fixado no espaço tridimensional. Uma pessoa versada na técnica pode predizer quando um ligante particular é flexível no seu contexto pretendido. Em certas modalidades, um ligante peptídeo que compreende 3 ou mais aminoácidos é um ligante flexível.
Como aqui usado neste documento, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a edição, E.S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Em certas modalidades, um ou mais aminoácidos não convencionais podem ser incorporados em um polipeptídio. O termo "aminoácido não convencional" refere-se a qualquer aminoácido que não é um dos vinte aminoácidos convencio- nais. O termo "aminoácidos de ocorrência não natural" refere-se a aminoácidos que não são encontrados na natureza. Aminoácidos de ocorrência não natural são um subconjunto de aminoácidos não convencionais. Aminoácidos não convencionais incluem, mas, sem limitação, estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a-, oc-dissubstituídos, aminoácidos N-alquila, ácido lático, homoserina, homocisteína, 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν, Ν, Ν, trimetillisina, ε-Ν-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxil lisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxi- prolina) conhecidos na técnica. Na notação de polipeptídio usada neste documento, a direção da mão esquerda é a direção terminal amino e a direção da mão direita é a direção terminal carbóxi, de acordo com o uso
e convenção padrões.
Em certas modalidades, substituições aminoácidos conser-
vativas incluem a substituição com um ou mais resíduos de aminoáci- dos não convencionais. Em certas modalidades, resíduos de aminoáci- dos não convencionais são incorporados por síntese de peptídeo química ao invés de por síntese em sistemas biológicos.
O termo "resíduo ácido" refere-se a um resíduo de aminoá- cido na forma D- ou L- que compreende pelo menos um grupo ácido quando incorporado em um polipeptídio entre dois outros resíduos aminoácidos que são os mesmos ou diferentes. Em certas modalidades, um resíduo ácido compreende uma cadeia lateral que compreende pelo menos um grupo ácido. Resíduos ácidos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, a ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E). Em certas modalidades, um resíduo ácido pode ser um aminoácido não convencio- nal.
O termo "resíduo aromático" refere-se a um resíduo de ami- noácido na forma D- ou L- que compreende pelo menos um grupo aromático. Em certas modalidades, um resíduo aromático compreende uma cadeia lateral que compreende pelo menos um grupo aromático. Resíduos aromáticos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W). Em certas modalidades, um resíduo aromático pode ser um aminoácido não convencional.
O termo "resíduo básico" refere-se a um resíduo de aminoá- cido na forma F- ou L- que pode compreender pelo menos um grupo básico quando incorporado em um polipeptídio próximo de um ou mais resíduos de aminoácidos que são os mesmos ou são diferentes. Em certas modalidades, um resíduo básico compreende uma cadeia lateral que compreende pelo menos um grupo básico. Resíduos básicos exem- plificativos incluem, mas, sem limitação, histidina (H), lisina (K) e arginina (R). Em certas modalidades, um resíduo básico pode ser um
aminoácido não convencional.
O termo "resíduo hidrofílico neutro" refere-se a um resíduo de aminoácido na forma D- ou L- que compreende pelo menos um grupo hidrofílico e/ou polar, mas não compreende um grupo ácido ou básico quando incorporado em um polipeptídio próximo de um ou mais resí- duos de aminoácidos que são os mesmos ou são diferentes. Resíduos hidrofílicos neutros incluem, mas, sem limitação, alanina (A), cisteína (C), serina (S), treonina (T), asparagina (N) e glutamina (Q). Em certas modalidades, um resíduo hidrofílico neutro pode ser um aminoácido não convencional.
Os termos "resíduo lipofílico" e "Laaw referem-se a um resí- duo de aminoácido na forma D- ou L- tendo pelo menos um grupo aromático e/ou alifático, sem carga. Em certas modalidades, um resíduo lipofílico compreende uma cadeia lateral que compreende pelo menos um grupo aromático e/ou alifático, sem carga. Cadeias laterais lipofíli- cas exemplificativas incluem, mas, sem limitação, alanina (A), fenilala- nina (F), isoleucina (I), leucina (L), norleucina (Nle), metionina (M), valina (V), triptofano (W) e tirosina (Y). Em certas modalidades, um resíduo lipofílico pode ser um aminoãcido não convencional.
O termo "resíduo anfifílico" refere-se a um resíduo de ami- noãcido na forma D- ou L- que é capaz de ser tanto um resíduo hidrofili- co ou lipofílico. Resíduos anfifílicos exemplifícativos incluem, mas, sem limitação, alanina (A). Em certas modalidades, um resíduo anfifílico pode ser um aminoácido não convencional.
O termo "resíduo não funcional" refere-se a um resíduo a- minoãcido na forma D- ou L- que não possui grupos ácidos, básicos e aromáticos quando incorporados em um polipeptídio próximo de um ou mais resíduos de aminoácidos que são os mesmos ou são diferentes. Resíduos de aminoácidos não funcionais exemplifícativos incluem, mas, sem limitação, metionina (M), glicina (G), alanina (A), valina (V), isoleu- cina (I), leucina (L) e norleucina (Nle). Em certas modalidades, um resíduo não funcional pode ser um aminoácido não convencional.
Em certas modalidades, glicina (G) e prolina (P) são conside- rados resíduos de aminoácidos que podem influenciar a orientação da
cadeia de polipeptídio.
Em certas modalidades, uma substituição conservativa pode envolver a substituição de um membro de um tipo de resíduo com um membro do mesmo tipo de resíduo. Como exemplo não limitativo, em certas modalidades, uma substituição conservativa pode envolver a substituição de um resíduo ácido, tal como D, por um resíduo ácido diferente, tal como o E. Em certas modalidades, uma substituição não conservativa pode envolver a substituição de um membro de um tipo de resíduo por um membro de um tipo diferente de resíduo. Como exemplo não limitativo, em certas modalidades, uma substituição não conserva- tiva pode envolver a substituição de um resíduo ácido, tal como D, por um resíduo básico, tal como o K. Em certas modalidades, um resíduo de cisteína é substituído por outro resíduo de aminoácido para prevenir a formação de ligação de dissulfeto com aquela posição no polipeptídio.
Ao fazer substituições conservativas e não conservativas, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido tem sido atribuído um índice hidropático com base na suas características de hidrofobicidade e carga. Os índices hidropáticos dos vinte aminoácidos de ocorrência natural são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); Ieucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (- 1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5);
asparagina (-3,5); Iisina (-3,9) e arginina (-4,5).
A importância do índice de aminoácido hidropático na con- ferência de função biológica interativa de uma proteína é compreendida na técnica. Kyte e colaboradores, J. MoL Bioli 157:105-131 (1982). É conhecido em certas instâncias que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou escore hidropá- tico similar e ainda reter uma atividade biológica similar. Ao fazer mudanças baseadas no índice hidropático, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 está incluída. Em certas modalidades, aqueles que estão dentro de ± 1 estão incluídos e, em certas modalidades, aqueles dentro de ± 0,5
estão incluídos.
Deve ser compreendido na técnica que a substituição de a-
minoácidos semelhantes pode ser tornada efetivamente com base na
hidrofilicidade, particularmente no caso em que a proteína ou peptídeo
funcional biologicamente desta forma criado é pretendido para uso em m %
modalidades imunológicas, como no presente caso. Em certas modali- dades, a hidrofilicidade média local maior de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com
uma propriedade biológica do polipeptídio.
Os seguintes valores de hidrofilicidade têm sido atribuídos a
estes resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); Iisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); gluta- mina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5);
histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); Ieucina (- 1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (- 3,4). Ao fazer mudanças baseadas nos valores de hidrofilicidade simila- res, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está incluída, em certas modalida-
des, aquelas que estão dentro de + 1 estão incluídas, e em certas modalidades, aquelas dentro de ± 0,5 estão incluídas. Em certas instân- cias, podem ser identificados epítopes de seqüências de aminoácido primárias com base na hidrofilicidade. Estas regiões são também
referidas como "regiões de núcleo epitômico".
Substituições de aminoácido exemplificativos são estabele-
cidas na Tabela 1. Tabela 1 Substituições de Aminoácidos
Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Exemplifi- cativas Mais Específicas Ala Vai, Leu, Ile Val Arg Lis, Gln5 Asn Lis Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cis Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gli Pro,Ala Ala His Asn, Glnj Lis, Arg Arg Ile Leu, Vai, Met, Ala, Fen, Norleucina Leu Leu Norleucina, lie, Vai, Met, Ala, Fen Ile Lis Arg, Ácido diamino-butírico, Gln, Asn Arg Met Leu, Fen, Ile Leu Fen Leu, Vai, lie, Ala, Tir Leu Pro Ala Gli Ser Tro, Ala, Cis Tro Tro Ser Ser Trp Tirj Fen Tir Tir Trpj Fen, Tro, Ser Fen Val lie, Met, Leu, Fenj Ala, Norleucina Leu De modo similar, como aqui usado neste documento, a me- nos que de outra forma especificado, a extremidade da mão esquerda das seqüências de polinucleotídeo de fita única é a extremidade 5'; a direção da mão esquerda das seqüências de polinucleotídeo de fita dupla é referida como a direção 5'. A direção 5' a 3' de adição de transcrição de RNA nascente é referida aqui neste documento como a direção de transcrição; regiões de seqüência na fita do DNA tendo a mesma se- qüência que o RNA e as quais são 5' para a extremidade 5' do RNA transcrito são referidas aqui neste documento como "seqüências a montante"; regiões de seqüência na fita do DNA tendo a mesma seqüên- cia que o RNA e as quais são 3' para a extremidade 3' do RNA transcrito são referidas aqui neste documento como "seqüências a jusante".
Em certas modalidades, substituições de aminoácidos con- servativos englobam resíduos de aminoácidos ocorrendo não natural- mente, as quais são tipicamente incorporadas por síntese de peptídeo química ao invés de síntese em sistemas biológicos. Aqueles resíduos de aminoácidos ocorrendo não naturalmente incluem, mas, sem limitação, peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de segmentos
de aminoácidos.
Uma pessoa versada será capaz de determinar variantes de
substituição apropriadas de um polipeptídio de referência como estabe- lecido aqui neste documento usando técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica pode identificar áreas apropriadas da molécula que podem ser mudadas sem destruir a atividade por regiões alvo não acreditadas de serem importante para a atividade. Em certas modalidades, podem-se identificar resíduos e porções de moléculas que são conservadas entre polipeptídios similares. Em certas modalidades, mesmo áreas que podem ser importante para a atividade biológica, incluindo, mas, sem limitação, CDRs de um anticor- po ou que podem ser importantes para a estrutura podem ser sujeitas a substituições de aminoácido conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem adversamente afetar a estrutura do polipeptídio.
Além disso,em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica pode rever os estudos de estrutura-função identificando resíduos em polipeptídios similares que são importantes para a atividade e/ou estrutura. Em vista dessa comparação, em certas modalidades, pode-se prever a importância de resíduos de aminoácidos em um polipeptídio que corresponda a resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade ou estrutura em polipeptídios similares. Em certas modalida- des, uma pessoa versada na técnica pode optar por substituições de aminoácidos similares quimicamente para tais resíduos de aminoácidos
importantes previstos.
O termo "resíduo básico" refere-se a um resíduo de aminoá- cido na forma F- ou L- que pode compreender pelo menos um grupo básico quando incorporado em um polipeptídio próximo de um ou mais resíduos de aminoácidos que são os mesmos ou são diferentes. Em certas modalidades, um resíduo básico compreende uma cadeia lateral que compreende pelo menos um grupo básico. Resíduos básicos exem- plificativos incluem, mas, sem limitação, histidina (H), lisina (K) e arginina (R). Em certas modalidades, um resíduo básico pode ser um
aminoácido não convencional.
O termo "resíduo hidrofílico neutro" refere-se a um resíduo
de aminoácido na forma D- ou L- que compreende pelo menos um grupo hidrofílico e/ou polar, mas não compreende um grupo ácido ou básico quando incorporado em um polipeptídio próximo de um ou mais resí- duos de aminoácidos que são os mesmos ou são diferentes. Resíduos hidrofílicos neutros incluem, mas, sem limitação, alanina (A)i cisteína (C), serina (S), treonina (T), asparagina (N) e glutamina (Q). Em certas modalidades, um resíduo hidrofílico neutro pode ser um aminoácido não
convencional. 10
15
Os termos "resíduo lipofflico" e "Laa" referem-se a um resí- duo de aminoácido na forma D- ou L- tendo pelo menos um grupo aromãtico e/ou alifático, sem carga. Em certas modalidades, um resíduo lipofflico compreende uma cadeia lateral que compreende pelo menos um grupo aromático e/ou alifático, sem carga. Cadeias laterais lipoffli- cas exemplificativas incluem, mas, sem limitação, alanina (A), fenilala- nina (F), isoleucina (I), leucina (L), norleucina (Nle), metionina (M), valina (V), triptofano (W) e tirosina (Y). Em certas modalidades, um resíduo lipofflico pode ser um aminoácido não convencional.
O termo "resíduo anfifílico" refere-se a um resíduo de ami- noácido na forma D- ou L- que é capaz de ser tanto um resíduo hidrofíli- CO ou lipofílico. Resíduos anfifflicos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, alanina (A). Em certas modalidades, um resíduo anfifílico
pode ser um aminoácido não convencional.
O termo "resíduo não funcional" refere-se a um resíduo a- minoácido na forma D- ou L- que não possui grupos ácidos, básicos e aromáticos quando incorporados em um polipeptídio próximo de um ou mais resíduos de aminoácidos que são os mesmos ou são diferentes. Resíduos de aminoácidos não funcionais exemplifxcativos incluem, mas, sem limitação, metionina (M), glicina (G), alanina (A)5 valina (V), isoleu- cina (I), leucina (L) e norleucina (Nle). Em certas modalidades, um resíduo não funcional pode ser um aminoácido não convencional.
Em certas modalidades, glicina (G) e prolina (P) são conside- rados resíduos de aminoácidos que podem influenciar a orientação da
cadeia de polipeptídio.
Em certas modalidades, uma substituição conservativa pode
envolver a substituição de um membro de um tipo de resíduo com um membro do mesmo tipo de resíduo. Como exemplo não limitativo, em certas modalidades, uma substituição conservativa pode envolver a substituição de um resíduo ácido, tal como D, por um resíduo ácido diferente, tal como o E. Em certas modalidades, uma substituição não conservativa pode envolver a substituição de um membro de um tipo de resíduo por um membro de um tipo diferente de resíduo. Como exemplo não limitativo, em certas modalidades, uma substituição não conserva- tiva pode envolver a substituição de um resíduo ácido, tal como D, por um resíduo básico, tal como o K. Em certas modalidades, um resíduo de cisteína é substituído por outro resíduo de aminoácido para prevenir a formação de ligação de dissulfeto com aquela posição no polipeptídio.
Ao fazer substituições conservativas e não conservativas, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido tem sido atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. Os índices hidropáticos dos vinte aminoácidos de ocorrência natural são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); Ieucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspar- tato (-3,5); asparagina (-3,5); Iisina (-3,9) e arginina (-4,5).
A importância do índice de aminoácido hidropático na con- ferência de função biológica interativa de uma proteína é compreendida na técnica. Kyte e colaboradores, J. Mol Biolf 157:105-131 (1982). É conhecido em certas instâncias que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou escore hidropá- tico similar e ainda reter uma atividade biológica similar. Ao fazer mudanças baseadas no índice hidropático, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 está incluída. Em certas modalidades, aqueles que estão dentro de ± 1 estão incluídos, e em certas modalidades, aqueles dentro de ± 0,5 estão incluídos. Deve ser compreendido na técnica que a substituição de a- minoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente com base na hidrofilicidade, particularmente no caso em que a proteína ou peptídeo funcional biologicamente desta forma criado é pretendido para uso em modalidades imunológicas, como no presente caso. Em certas modali- dades, a hidrofilicidade média local maior de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica do polipeptídio.
Os seguintes valores de hidrofilicidade têm sido atribuídos para estes resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); Iisina (+3,0); aspar- tato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (- 0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); Ieucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao fazer mudanças baseadas nos valores de hidrofilici- dade similares, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está incluída, em certas modalidades, aquelas que estão dentro de + 1 estão incluídas, e em certas modalidades, aquelas dentro de ± 0,5 estão incluídas. Em certas instâncias, podem ser identificados epítopes de seqüências de aminoácido primárias com base na hidrofilicidade. Estas regiões são também referidas como "regiões de núcleo epitômico".
Substituições de aminoácido exemplificativas são estabele- cidas na Tabela 1. Tabela 1 Substituições de Aminoácido
Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Exemplifi- cativas Mais Específicas Ala Vai, Leu, Ile Val Arg Lis, Gln, Asn Lis Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cis Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gli Pro,Ala Ala His Asn, Gln, Lis, Arg Arg Ile Leu, Vai, Met, Ala, Fen, Norleucina Leu Leu Norleucina, lie, Vai, Met, Ala, Fen Ile Lis Arg, Ácido diamino-butírico, Gln, Asn Arg Met Leu, Fen, Ile Leu Fen Leu, Vai, lie, Ala, Tir Leu Pro Ala Gli Ser Tro, Ala, Cis Tro Tro Ser Ser Trp Tir, Fen Tir Tir Trp, Fen, Tro, Ser Fen Val Ile, Met, Leu, Fen, Ala, Norleu- cina Leu De modo similar, como aqui usado neste documento, a me- nos que de outra forma especificado, a extremidade da mão esquerda das seqüências de polinucleotídeo de fita única é a extremidade 5'; a direção da mão esquerda das seqüências de polinucleotídeo de fita dupla é referida como a direção 5'. A direção 5' a 3' de adição de transcrição de RNA nascente é referida aqui neste documento como a direção de transcrição; regiões de seqüência na fita do DNA tendo a mesma se- qüência que o RNA e as quais são 5' para a extremidade 5' do RNA transcrito são referidas aqui neste documento como «seqüências a montante»; regiões de seqüência na fita do DNA tendo a mesma seqüên- cia que o RNA e as quais são 3' para a extremidade 3' do RNA transcrito são referidas aqui neste documento como "seqüências a jusante".
Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos conservativos englobam resíduos de aminoácidos ocorrendo não natu- ralmente, as quais são tipicamente incorporadas por síntese de peptídeo química ao invés de síntese em sistemas biológicos. Aqueles resíduos de aminoácidos ocorrendo não naturalmente incluem, mas, sem limitação, peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de segmentos
de aminoácidos.
uma pessoa versada será capaz de determinar variantes de
substituição apropriadas de um polipeptídio de referência como estabe- lecido aqui neste documento usando técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica pode identificar áreas apropriadas da molécula que podem ser mudadas sem destruir a atividade por regiões alvo não acreditadas de serem importante para a atividade. Em certas modalidades, podem-se identificar resíduos e porções de moléculas que são conservadas entre polipeptídios similares. Em certas modalidades, mesmo áreas que podem ser importante para a atividade biológica, incluindo, mas, sem limitação, CDRs de um anticor- po ou que podem ser importantes para a estrutura podem ser sujeitas a substituições de aminoácido conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem adversamente afetar a estrutura do polipeptídio.
Além disso, em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica pode rever os estudos de estrutura-função identificando resíduos em polipeptídios similares que são importantes para a atividade e/ou estrutura. Em vista dessa comparação, em certas modalidades, pode-se prever a importância de resíduos de aminoácidos em um polipeptídio que corresponda a resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade ou estrutura em polipeptídios similares. Em certas modalida- des, uma pessoa versada na técnica pode optar por substituições de aminoácidos similares quimicamente para esses resíduos de aminoáci- dos importantes previstos.
Em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica po- de também analisar a estrutura tridimensional e seqüência de aminoá- cido em relação àquela estrutura em polipeptídios similares. Em vista dessa informação, uma pessoa versada na técnica pode prever o ali- nhamento dos resíduos de aminoácidos de um anticorpo com relação à sua estrutura tridimensional. Em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica pode escolher não fazer mudanças radicais nos resíduos de aminoácidos previstos para ser na superfície da proteína, desde que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importan- tes com outras moléculas. Além disso, em certas modalidades, uma pessoa versada na técnica pode gerar variantes de teste contendo uma substituição de aminoácido única em cada resíduo aminoácido deseja- do. Em certas modalidades, as variantes podem então ser tríadas usando testes de atividade conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, em certas modalidades, as variantes podem ser tríadas por suas habilidades de se ligar ao TR-2. Em certas modalidades, tais variantes poderiam ser usadas para obter informação acerca das variantes apropriadas. Por exemplo, em certas modalidades, se se descobriu que uma mudança para um resíduo de aminoãcido particular resultou numa atividade destruída, indesejavelmente reduzida ou atividade inapropriada, variantes com tais mudanças podem ser evita- das. Em outras palavras, baseado na informação obtida desses experi- mentos de rotina, uma pessoa versada na técnica pode prontamente determinar os aminoácidos em que substituições adicionais deveriam ser evitadas, sejam sozinhas ou em combinação com outras mutações.
Um certo número de publicações científicas tem sido devo- tado para a previsão de estrutura secundária. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou e colaboradores, Biochemistryy 13(2): 222-245 (1974); Chou e colaboradores, Biochemistryi 1X3(2): 211- 222 (1974); Chou e colaboradores, Adv. Ervzymol Relat Areas Mol Bioli 47:45-148 (1978); Chou e colaboradores, Ann. Ver. Biochem., 47: 251- 276 e Chou e colaboradores, Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Além disso, programas de computador estão atualmente disponíveis para ajudar com a previsão de estrutura secundária. Um método de prever a estrutura secundária é baseado no modelo de homologia. Por exemplo, dois polipeptídios ou proteínas os quais tem uma identidade de seqüên- cia maior do que 30% ou similaridade maior do que 40% freqüentemente tem topologias estruturais similares. O recente crescimento do banco de dados estrutural d proteínas (PDB) tem fornecido uma previsão aumen- tada da estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras em um dado polipeptídio ou proteína e que uma vez que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural se tornará dramaticamente mais exata. Ver, por exemplo, Brenner e colaboradores, Curr. Op. Struet Biol, 7(3): 369-376 (1997).
Métodos exemplificativos adicionais de previsão de estrutura
secundária incluem, mas, sem limitação, «encadeamento» (Jones, D., Curr. Opin. Struet Biol.} 7(3): 377-87 (1997); Sippl e colaboradores, Strueturef 4(1): 15-19 (1996)), "análise de perfil" (Bowie e colaboradores, Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov e colaboradores, Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gibskov e colaboradores, Proc. Nat. Acad. Scli 84(13): 4355-4358 (1987)) e "ligação evolucionária" (ver Holm, supra
(1999) e Brenner, supra (1997)). Em certas modalidades, a identidade e a similaridade de po-
lipeptídios relacionados podem ser prontamente calculadas por métodos
conhecidos. Esses métodos incluem, mas, sem limitação, aqueles
descritos em Computacional Molecular Biology, Lesk5 A. M., edit. Oxford
University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics e Genome
LO Projectsi Smith D.W., ed. Academic Press, New York (1993); Computer
Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., e Griffm, H.G., eds.,
Humana Press, New Jersey (1994); Sequenee Analysis in Molecular
Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis
Pnmer, Gribskov, M. e Devereux, J. eds, M. Stockton Press, New York
(1991); e Carillo e colaboradores, SIAM J. Applied MatK, 48: 1073
(1988). Em certas modalidades, polipeptídios tendo seqüências de
aminoácidos que são cerca de 90 por cento, ou cerca de 95 por cento, ou
cerca de 96 por cento, ou cerca de 97 por cento, ou cerca de 98 por
cento ou cerca de 99 por cento idênticas às seqüências de aminoácidos
mostradas nas Figuras 3-19.
Em certas modalidades, métodos para determinar a identi- dade são projetados para dar o maior ajuste entre as seqüências testa- das. Em certas modalidades, certos métodos para determinar a identi- dade são descritos em programas de computadores disponíveis ao público. Certos métodos de programa de computador para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, mas, sem limitação, o pacote do programa GCG, incluindo GAP (Devereux, e colaboradores, Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madíson, WI, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul e colabo- radores, J. Mol Biol, 215: 403-410 (1990)). O programa BLASTX está 10
15
20
25
30
disponível publicamente a partir do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) e outras fontes (Manual do BLAST, Altschul e colaboradores, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul e colabo- radores, supra (1990)). Em certas modalidades, o algoritmo de Smith Waterman, que é conhecido na técnica, pode também ser usado para
determinar a identidade.
Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas seqüên- cias de aminoácidos podem resultar no ajuste de apenas uma região pequena das duas seqüências e esta região pequena alinhada pode ter uma identidade de seqüência muito alta embora não exista relação significante entre os dois comprimentos totais das seqüências. De acordo, em certas modalidades, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) resultará em um alinhamento que varre pelo menos 50
aminoácidos contíguos do polipeptídio alvo.
Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Gene-
tics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipeptídios para os quais a percentagem da identidade de seqüência é para ser determinada são alinhados para ajuste ótimo de seus aminoá- cidos respectivos (a «varredura de ajuste», como determinado pelo algoritmo). Em certas modalidades, uma penalidade de abertura de fenda (a qual é calculada como 3X a diagonal média; a «diagonal média» é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a "diago- nal» é a contagem ou número atribuído para cada ajuste perfeito de aminoácido pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de fenda (a qual é usualmente 1/10 de vezes da penalidade de abertura de fenda), bem como uma matriz de comparação tal como a PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunto com o algoritmo. Em certas modalidades, uma matriz de comparação padrão é também usada como algoritmo. Ver, por exemplo, Dayhoff e colaboradores, Atlas of Protein Sequence and Stmcture, 5(3) (1978) para a matriz de comparação 10
15
PAM 250; Henokoff e colaboradores, Proc. Natl Acad. Scl USAy 89:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62.
Em certas modalidades, os parâmetros para uma compara- ção de seqüência de polipeptídio incluem o seguinte:
Algoritmo: Needleman e colaboradores, J. Mol Biol,
48: 443-453 (1970);
Matriz de Comparação: BLOSUM 62 de Henokoff e co- laboradores, supra (1992);
Penalidade de Fenda: 12 Penalidade do Comprimento de Fenda: 4 Limiar de similaridade: 0 Em certas modalidades, o programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em certas modalidades, os parâmetros menciona- dos acima são os parâmetros default para comparações de polipeptídios (junto com sem penalidade para fendas de extremidade) usando o
algoritmo GAP.
De acordo com certas modalidades, substituições de amino- ácidos são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade para proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade para oxidação, (3) alteram a afinidade e ligação para formar complexos de proteína, (4) alteram as afinidades de ligação e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico- químicas ou funcionais em tais polipeptídios. De acordo com certas modalidades, substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas (em certas modalidades, substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na seqüência de ocorrência natural (em certas modalidades, na parte do polipeptídio fora dos contatos intermoleculares de formação
do(s) domínio(s)).
Em certas modalidades, uma substituição de aminoácido
conservativa tipicamente pode não mudar substancialmente as caracte-
rísticas estruturais da seqüência mãe (por exemplo, uma substituição de
20
25 aminoácido não tenderia a quebrar a hélice que ocorre na seqüência mãe ou romper outros tipos de estruturas secundárias que caracterizam a seqüência mãe). São descritos exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídios reconhecidas na técnica, por exemplo, em Proteinsj Structures and Molecular Prínciples (Creighton, Ed. W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Strue- ture (C. Branden e J. Tooze, eds. Garland Publishing, New York, Ν. Y. (1991)); e Thomton e colaboradores, Nature 354:105 (1991).
O termo "fragmento de polipeptídio" como aqui usado neste LO documento refere-se a um polipeptídio que tem uma deleção amino- terminal e/ou carbóxi-terminal. Em certas modalidades fragmentos são pelo menos 5 a 500 comprimentos de aminoácidos. Será apreciado que em certas modalidades, fragmentos são pelo menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 500 comprimentos de
aminoácidos.
Análogos de peptídeos são comumente usados na indústria
farmacêutica como drogas não peptídicas com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Estes tipos de compostos não peptídicos são denominados "peptídeos miméticos" ou «peptidomiméticos". Fauche- re, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber e Freidinger TINS p. 392 (1985); e Evans e colaboradores, J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Tais compostos são freqüentemente desenvolvidos com a ajuda de modela- gem molecular computadorizada. Podem ser usados peptídeos miméti- cos que são estruturalmente similares aos peptídeos úteis terapeutica- mente para produzir um efeito terapêutico ou profilático similar. Geral- mente, peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptí- dio padrão (isto é, um polipeptídio que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica), tal como um anticorpo de humano, mas tem uma ou mais ligações do peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada dentre: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (eis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência de consenso com aminoácido-D do mesmo tipo (por exemplo, D-Iisina no lugar de L-Lisina) pode ser usada em certas modalidades para gerar peptídeos mais estáveis. Em adição, peptídeos restritos que compreende uma seqüência de consenso ou uma variação de seqüência de consenso idêntica substancialmente podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)); por exemplo, e não limitação, pela adição de resíduos de cisteína internas capazes de formar pontes de disulfeto intramoleculares as quais ciclizam o peptídeo.
O termo "agente de ligação específico" refere-se a uma molé- cula natural ou não natural que especificamente se liga ao alvo. Exem- plos de agentes de ligação específicos incluem, mas, sem limitação* proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, carboidrato, lipídios e compostos de moléculas pequenas. Em certas modalidades, um agente de ligação específico é um anticorpo. Em certas modalidades, um agente de ligação específico é uma região de ligação de antígeno.
O termo "se liga especificamente" refere-se à habilidade de um agente de ligação específico de se ligar a um alvo com maior afinida- de do que ele se ligaria a um não alvo. Em certas modalidades, ligação específica refere-se à ligação a um alvo com uma afinidade que é de pelo menos 10, 50, 100, 250, 500 ou 1.000 vezes maior do que a afinidade por um não alvo. Em certas modalidades, a afinidade é determinada por uma afinidade no teste ELISA. Em certas modalidades, a afinidade é determinada por um teste BIAcore. Em certas modalidades, a afinidade é determinada por um método cinético. Em certas modalidades, a afinidade é determinada por um método de equilíbrio/solução.
O termo "agente de ligação específico a um TR-2" refere-se a um agente de ligação específico que especificamente se liga a qualquer parte de um TR-2. Em certas modalidades, um agente de ligação específico a um TR-2 é um anticorpo a um TR-2. Em certas modalida- des, um agente de ligação específico é uma região de ligação de antíge- no.
"Anticorpo" ou "peptídeo(s) de anticorpo(s)" ambos referem-
se a um anticorpo intacto ou um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, o fragmento do anticorpo pode ser um fragmento ligante que compete com o anticorpo intacto por uma ligação específica. O termo "anticorpo" também engloba anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais. Em certas modalidades, fragmentos ligantes são produzi- dos por técnicas de DNA recombinante. Em certas modalidades, frag- mentos ligantes são produzidos por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Em certas modalidades, fragmentos ligantes são produzidos por são produzidos por técnicas de DNA recombinante. Fragmentos ligantes incluem, mas, sem limitação* Fab, Fab', F(abi2, Fv e anticorpos de cadeia única. Fragmentos ligantes de não antígeno incluem, mas, sem limitação, fragmentos Fe. Em certas modalidades, um anticorpo se liga especificamente a um epítope que é especificamen- te ligado por pelo menos um anticorpo selecionado dentre Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H, Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab M, Ab N, Ab O, Ab P e Ab Q. O termo "anticorpo" também engloba anticorpos anti-idiotípicos que especificamente se ligam a uma região variável de um outro anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo anti- idiotípico especificamente se liga a uma região variável de um anticorpo anti-TR-2. Em certas modalidades, anticorpos anti-idiotípicos podem ser usados para detectar a presença de um anticorpo anti-TR-2 particular em uma amostra ou para bloquear a atividade de um anticorpo anti-TR- 2.
O termo "anticorpo anti-TR-2" como aqui usado neste do- cumento significa um anticorpo que especificamente se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 se liga a um epítope TR-2 ao qual pelo menos um anticorpo selecionado dentre Ab A a Q se liga. Em várias modalidades, um TR-2 pode ser um TR-2 de qualquer espécie, incluindo, mas, sem limitação,, humanos, macacos cinomolgus, camundongos e coelhos. Certos testes para determinar a especificidade de um anticorpo são bem conhecidos ao técnico no assunto e incluem, mas, sem limitação, ELISA, ELISPOT, western blots, testes BIAcore, testes de ligação de afinidade em solução, testes de co-estimulação de
células T e testes de migração de células T.
O termo «anticorpo isolado" como aqui usado neste docu- mento significa um anticorpo que (1) é livre de pelo menos algumas proteínas com as quais ele seria normalmente achado, (2) é essencial- mente livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, ou (4)
não ocorre na natureza.
O termo "anticorpo policlonal" refere-se a uma mistura hete- rogênea de anticorpos que se liga a diferentes epítopes do mesmo
antígeno.
O termo «anticorpos monoclonais" refere-se a uma coleção de anticorpos codificados pela mesma molécula de ácido nucléico. Em certas modalidades, anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma único ou outra linha de célula ou por mamífero transgênico. Anticorpos monoclonais tipicamente reconhecem o mesmo epítope. O termo «monoclonal» não é limitado a qualquer método particular para
produzir um anticorpo.
O termo "anticorpo enxertado com CDR" refere-se a um an- ticorpo no qual a CDR de um anticorpo é inserida na estrutura de outro anticorpo. Em certas modalidades, o anticorpo do qual a CDR é derivada e o anticorpo a partir do qual a estrutura é derivada são espécies diferentes. Em certas modalidades, o anticorpo a partir do qual a CDR é derivada e o anticorpo a partir do qual a estrutura é derivada são de
isotipos diferentes.
O termo "anticorpo multi-específlco" refere-se a um anticor- po em que duas ou mais regiões variáveis se ligam a epítopes diferentes. Os epítopes podem ser nos mesmos alvos ou diferentes. Em certas modalidades, um anticorpo multi-específico é um "anticorpo bi- específico", que reconhece dois epítopes diferentes nos mesmos antíge-
nos ou em antígenos diferentes.
O termo "anticorpo catalítico" refere-se a um anticorpo no
qual um ou mais segmentos catalíticos estão ligados. Em certas modali- dades, um anticorpo catalítico é um anticorpo citotóxico, o qual compre- ende um segmento citotóxico.
O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo
no qual toda ou parte de uma região de estrutura do anticorpo é deriva- da de um humano, mas toda ou parte de uma ou mais regiões CDR são derivadas de outras espécies, por exemplo, um camundongo.
Os termos "anticorpo humano" e "anticorpo totalmente hu- mano" são usados de forma intercambiável e referem-se a um anticorpo no qual ambas a CDR e a estrutura compreendem substancialmente seqüências humanas. Em certas modalidades, anticorpos totalmente humanos são produzidos em mamíferos não humanos, incluindo, mas, sem limitação, camundongos, ratos e lagomorfos. Em certas modalida- des, anticorpos totalmente humanos são produzidos em células de hibridomas. Em certas modalidades, anticorpos totalmente humanos
são produzidos de forma recombinante.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de:
(i) um primeiro polipeptídio que compreende pelo me- nos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada dentre CDR la, CDR2a e CDR3a, em que a CDRla compreende a seqüência de ami- noácido a b c d e f g h i j k 1, em que o aminoácido a é glicina; o aminoá- cido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilalanina; o aminoáci- do c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoácido d é selecio- nado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecio- nado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalanina; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente;
em que a CDR2a compreende a seqüência de ami- noácido m η o ρ q r s t u ν w χ y ζ a' b' c', em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina, arginina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido X é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado 10
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dentre glutamina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é seleciona- do dentre Iisinai leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está
presente;
em que a CDR3a compreende a seqüência de ami- noácido d' e' f g' h' i' j' k' Γ m' n' o' p' q' r' s' t' u' v' Wi, em que o aminoá- cido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoácido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, arginina, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagi- na, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofano, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspárti- co, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido Y é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmi- co, prolina, ácido aspártico, cisteína, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alanina, leucina ou serina ou não está presente; o aminoá- cido oJ é selecionado dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalani- na, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é seleciona- do dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q' é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está 10
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presente; o aminoácido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido s? é selecionado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoácido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido w> é
valina ou não está presente; e
em que primeiro polipeptídio, em associação com
uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2; e
(ii) um segundo polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada
dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b
em que a CDRlb compreende a seqüência de ami- noácido al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleuci- na, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoá- cido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspárti- co ou serina; o aminoácido jl é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é selecionado dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido pl é selecionado
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dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presen- te;
em que a CDR2b compreende a seqüência de ami- noácido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutami- na, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre
serina, arginina ou treonina;
em que a CDR3b compreende a seqüência de ami- noácido yl zl al' bl' cl' dl' el' fl' gl', em que o aminoácido yl é selecionado dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o amino- ácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido al' é selecionado dentre serina, treonina, alanina histidina tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleucina ou lisina; o aminoácido dl' é selecionado dentre treonina, fenilalanina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido el' é prolina; o aminoácido fl' é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre
treonina ou serina; e
em que o segundo polipeptídio, em associação com
uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 2 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 36. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 4 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 38. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 6 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 40. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 8 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 42. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 10 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 44. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 12 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 46. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 14 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 48. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 16 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 50. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 18 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 52. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 20 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 54. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 22 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 56. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 24 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 58. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 26 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 60. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 28 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 62. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 30 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 64. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 32 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 66. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreen- de: um primeiro polipeptídio que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) como estabelecidas na SEQ ID NO: 34 e um segundo polipeptídio que compreende CDRs como estabelecidas na SEQ ID NO: 68. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreende um primeiro polipeptídio como estabelecido na parágrafo [079] acima e um segundo polipeptídio como estabelecido no parágrafo [084] acima. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreende um primeiro polipeptídio como estabelecido no parágrafo [080] acima e um segundo polipeptídio como estabelecido no parágrafo [085] acima. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é um anticorpo humano. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 compreende um rótulo detectável. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é um
anticorpo quimérico. «Anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo que tem uma
região variável de anticorpo de uma primeira espécie fundida a outra
molécula, por exemplo, uma região constante de anticorpo de outra
segunda espécie. Ver, por exemplo, a Patente US 4.816.567 e Morrison e
colaboradores, Proc. Natl Acad. Sei. (USA), 81: 6851-6855 (1985). Em
certas modalidades, a primeira espécie pode ser diferente da segunda
espécie. Em certas modalidades, a primeira espécie pode ser a mesma
da segunda espécie. Em certas modalidades, anticorpos quiméricos
podem ser feitos através de mutagênese ou enxerto de CDR para ajustar
uma parte da seqüência conhecida das regiões variáveis do anticorpo
anti-TR-2. Enxerto de CDR tipicamente envolve o enxerto de CDRs de
um anticorpo com especificidade desejada em regiões da estrutura (FRs)
de outro anticorpo.
Um anticorpo bivalente outro que um anticorpo "multi-
específico" ou "multifuncional", em certas modalidades, tipicamente é
compreendido ter cada um de seus sítios ligantes idênticos. Um anticorpo substancialmente inibe a adesão de um ligan- te a um receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao ligante por pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou mais (como medido em um teste in vitro de ligação compe- titiva).
O termo "epítope" refere-se a uma parte de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação específico. Epítopes exemplificativos podem compreender qualquer polipeptídio determinante capaz de ligação específica a uma imunoglobulina e/ou um receptor de célula T. Epítopes determinantes exemplificativos incluem, mas, sem limitação, grupamentos de moléculas de superfície ativa quimicamente, por exemplo, mas, sem limitação, aminoãcidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil e grupos sulfonil. Em certas modalidades, epítopes determinantes podem ter características estruturais tridimen- sionais específicas e/ou características de carga específica. Em certas modalidades, um epítope é uma região de um antígeno que é ligada pro um anticorpo. Os epítopes podem ser contíguos ou não contíguos. Em certas modalidades, os epítopes podem ser miméticos no sentido de que eles compreendem uma estrutura tridimensional que é similar a um epítope usado para gerar um anticorpo, embora não compreenda nenhum ou apenas algum dos resíduos de aminoãcidos encontrados
naquele epítope usado para gerar o anticorpo.
O termo "epítope de inibição e/ou neutralização" refere-se a um epítope, o qual quando ligado por um agente de ligação específico resulta em uma diminuição em uma atividade biológica in vivo, in vitro e/ou in situ. Em certas modalidades, um epítope de neutralização está localizado ou está associado com uma região ativa biologicamente de um
alvo.
O termo "epítope de ativação" refere-se a um epítope, o qual quando ligado por um agente de ligação específico resulta na ativação ou manutenção de uma atividade biológica in vivo, in vitro e/ou in situ. Em certas modalidades, um epítope de ativação está localizado ou está associado com uma região ativa biologicamente de um alvo.
Em certas modalidades, um epítope está especificamente li- gado por pelo menos um anticorpo selecionado dentre Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H5 Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab Mf Ab Nf Ab O, Ab P e Ab Q. Em certas tais modalidades, o epítope é substancialmente puro. Em certas tais modalidades, o epítope está em uma concentração de pelo menos 1 nM. Em certas tais modalidades, o epítope está em uma concentração entre 1 nM e 5 nM. Em certas tais modalidades, o epítope está em uma concentração entre 5 nM e 10 nM. Em certas tais modali- dades, o epítope está em uma concentração entre 10 nM e 15 nM.
Em certas modalidades, um anticorpo especificamente se li- ga a um epítope que é especificamente ligado por pelo menos um anticorpo selecionado dentre Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H, Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab M, Ab N, Ab O, Ab P e Ab Q e é subs- tancialmente puro. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração de pelo menos 1 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 1 nM e 5 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 5 nM e 10 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração
entre 10 nM e 15 nM.
Em certas modalidades, um anticorpo especificamente se li- ga a aminoácidos 1 a 85 de um TR-2 humano maduro e está substanci- almente puro. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração de pelo menos 1 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 1 nM e 5 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 5 nM e 10 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração
entre 10 nM e 15 nM.
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Em certas modalidades, um anticorpo compete pela ligação a um epítope com pelo menos um anticorpo selecionado dentre Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H, Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab M1 Ab N, Ab O, Ab P e Ab Q. Em certas modalidades, o anticorpo é substanci- almente puro. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração de pelo menos 1 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 1 nM e 5 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 5 nM e 10 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração
entre 10 nM e 15 nM.
Em certas modalidades, um anticorpo compete pela ligação
a aminoácidos 1 a 85 de um TR-2 humano maduro com pelo menos um anticorpo selecionado dentre Ab A, Ab B, Ab C, Ab D, Ab E, Ab F, Ab G, Ab H, Ab I, Ab J, Ab K, Ab L, Ab M, Ab N, Ab O, Ab P e Ab Q. Em certas modalidades, o anticorpo é substancialmente puro. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração de pelo menos 1 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 1 nM e 5 nM. Em certas tais modalidades, o anticorpo está em uma concentração entre 5 nM e 10 nM. Em certas tais modalidades, o
anticorpo está em uma concentração entre 10 nM e 15 nM.
O termo "agente" é usado aqui neste documento para deno- tar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica o um extrato feito de materiais biológicos.
Como aqui usado neste documento, o termo «rótulo" refere- se a qualquer molécula que pode ser detectada. Em certa realização, um anticorpo pode ser rotulado pela incorporação de um aminoácido radio- rotulado. Em certa realização, segmentos de biotina que podem ser detectados por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detec- tada por métodos óticos ou colorimétricos) podem estar ligados ao anticorpo. Em certas modalidades, um rótulo pode ser incorporado ou ligado a outro reagente o qual por sua vez se liga ao anticorpo de interesse. Em certas modalidades, um rótulo pode ser incorporado ou ligado a um anticorpo que por sua vez especificamente se liga ao anticorpo de interesse. Em certas modalidades, o rótulo ou o marcador pode também ser terapêutico. Vários métodos de rotular polipeptídios e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Certas classes gerais de rótulos incluem, mas, sem limitação, rótulos enzimáti- cos, fluorescentes, quimioluminescentes e radioativos. Certos exemplos, de rótulos para polipeptídios incluem, mas, sem limitação, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, sH, "C, 15N, ^S, *>Y, 99TCj IiiInj 125I, 131I), rótulos fluorescentes (por exemplo, fluoresceína isotioci- anato (FITC), rodamina, lantanídeo fósforos, ficoeritrina (PE)), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rãbano silvestre, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glucose oxidase, glucose-6- fosfato dehidrogenase, álcool dehidrogenase, malato dehidrogenase, penicilinase, luciferase), rótulos quimioluminescentes, grupos biotinil e epítopes de polipeptídios pré-determinados reconhecidos pro um relator secundário (por exemplo, seqüências em par zíper leucina, sítios ligantes para anticorpos secundários, domínios de ligantes metálicos, etiquetas epítopes). Em certas modalidades, rótulos são ligados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento
estérico potencial.
O termo "amostra" como aqui usado neste documento in~
clui, mas não está limitado a, qualquer quantidade de uma substância de uma coisa viva ou coisa viva primeira. Tais coisas vivas incluem, mas, sem limitação., humanos, camundongos, macacos, ratos, coelhos e outros animais. Tais substâncias incluem, mas, sem limitação^ sangue, soro, urina, células, órgãos, tecidos, osso, medula óssea, nódulos
linfáticos e pele. O termo "agente farmacêutico ou droga" como aqui usado neste documento refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando apropriadamente
administrado a um paciente.
O termo "modulador" como aqui usado é um composto que
muda ou altera a atividade ou função de uma molécula. Por exemplo, um modulador pode causar um aumento ou diminuição na magnitude de certa atividade ou função de uma molécula comparada com a magni- tude da atividade ou função observada na ausência do modulador. Em certas modalidades, um modulador é um inibidor, que diminui a magnitude de pelo menos uma atividade ou função de uma molécula. Certas atividades e funções exemplificativas de uma molécula incluem, mas, sem limitação, afinidade de ligação, atividade enzimática e trans- dução de sinal. Certos inibidores exemplifícativos incluem, mas, sem limitação, proteínas, peptídeos, anticorpos, pepticorpos, carboidratos e moléculas orgânicas pequenas. São descritos pepticorpos exemplifícati- vos, por exemplo, no WO 01/83525.
Como aqui usado, "substancialmente puro" significa que
uma espécie objeto e a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar ela é mais abundante do que qualquer outra espécie indivi- dual na composição). Em certas modalidades, uma fração substancial- mente purificada é uma composição em que a espécie objeto compreen- de pelo menos cerca de 50 por cento (em base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em certas modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presen- tes na composição. Em certas modalidades, a espécie objeto é purificada à homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição pelos métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular.
O termo "paciente" inclui sujeitos humanos e animais. De acordo com certas modalidades, é proporcionada uma li- nhagem de célula que expressa anticorpos anti-TR-2.
Em certas modalidades, anticorpos quiméricos que compre- endem pelo menos uma parte de uma seqüência humana e seqüência de outra espécie são fornecidos. Em certas modalidades, esse anticorpo quimérico pode resultar em uma resposta imune reduzida em um hospedeiro do que um anticorpo sem aquelas seqüências do anticorpo do hospedeiro. Por exemplo, em certas circunstâncias, pode ser usado um animal de interesse como modelo para uma doença humana parti- cular. Para estudar o efeito de um anticorpo daquela doença no animal hospedeiro, pode-se usar um anticorpo de uma espécie diferente. Mas, em certas circunstâncias, esses anticorpos de outras espécies, podem > induzir uma resposta imune para os próprios anticorpos no animal hospedeiro, assim impedindo a avaliação destes anticorpos. Em certas modalidades, a substituição de parte da seqüência de aminoácido de um anticorpo anti-TR-2 com seqüência de aminoácido de anticorpo a partir de um animal hospedeiro pode diminuir a magnitude da resposta anti-
0 anticorpo do animal hospedeiro.
Em certas modalidades, um anticorpo quimérico compreen- de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada são de uma primeira espécie e as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada são da segunda espécie. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada do anticor- po é uma região constante de cadeia pesada do anticorpo de uma espécie diferente da humana. Em certas modalidades, a região constan- te de cadeia leve do anticorpo é uma região constante de cadeia leve de um anticorpo de uma espécie outra que humana. Em certas modalida- des, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é uma região constante de cadeia pesada de humano e a região variável de cadeia pesada do anticorpo é uma região variável de cadeia pesada do anticor- po outro que o humano. Em certas modalidades, a região constante de cadeia leve do anticorpo é uma região constante de cadeia leve do anticorpo de um humano e a região variável de cadeia leve do anticorpo é uma região variável de cadeia leve de uma espécie diferente da huma- na. Regiões constantes do anticorpo exemplificativas incluem, mas, sem limitação, região constante do anticorpo humano, região constante do anticorpo de macaco cinomolgus, região constante do anticorpo de camundongo e uma região constante do anticorpo de um coelho. Regiões variáveis do anticorpo exempliücativas incluem, mas, sem limitação, região variável do anticorpo humano, região variável do anticorpo de camundongo, região variável do anticorpo de porco, região variável do anticorpo de um porquinho da índia, região variável do anticorpo do maçado cinomolgus e uma região variável do anticorpo de um coelho. Em certas modalidades, as regiões estruturadas da região variável na cadeia pesada e cadeia leve podem ser substituídas por regiões estrutu- radas derivadas de outras seqüências de anticorpo.
Certos anticorpos quiméricos podem ser produzidos por mé- todos bem conhecidos por aqueles versados comumente na técnica. Em certas modalidades, o polinucleotídeo da primeira espécie que codifica uma região variável de cadeia pesada e o polinucleotídeo da segunda espécie que codifica a região constante de cadeia pesada podem ser fundidos. Em certas modalidades, o polinucleotídeo da primeira espécie que codifica uma região variável de cadeia leve e a seqüência de nucleo- tídeo da segunda espécie que codifica a região constante de cadeia leve podem ser fundidos. Em certas modalidades, estas seqüências de nucleotídeos fundidas podem ser introduzidas em uma célula seja como um vetor de expressão único (por exemplo, um plasmídeo) ou vetores de expressão múltiplas. Em certas modalidades, pode ser usada uma célula Mb ψ
que compreende pelo menos um vetor de expressão para produzir o polipeptídio. Em certas modalidades, estas seqüências de nucleotídeos fundidas podem ser introduzidas em uma célula sejam em vetores de expressão separados ou em um vetor de expressão único. Em certas modalidades, a célula hospedeira expressa ambas a cadeia pesada e a cadeia leve, as quais se combinam para produzir um anticorpo. Em certas modalidades, uma célula que compreende pelo menos um vetor de expressão pode ser usada para produzir um anticorpo. Métodos exemplificativos para produzir e expressar anticorpos são discutidos
abaixo.
Em certas modalidades, modificações conservativas nas ca- deias pesada e leve de um anticorpo anti-TR-2 (e correspondentes modificações aos nucleotídeos codificantes) produzirão anticorpos tendo características funcionais e químicas similares àquelas do anticorpo original. Em contraste, em certas modalidades, modificações substanci- ais nas características funcionais e/ou químicas de um anticorpo anti- TR-2 podem ser efetuadas selecionando substituições na seqüência de aminoãcido das cadeias pesada e leve que diferem significativamente em seus efeitos de manutenção (a) da estrutura principal molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c)
a magnitude da cadeia lateral.
Certas substituições de aminoácidos desejadas (sejam con- servativas ou não conservativas) podem ser determinadas por aqueles versados na técnica quando são desejadas essas substituições. Em certas modalidades, podem ser usadas substituições de aminoácidos para identificar importantes resíduos dos anticorpos anti-TR-2, tais como aquelas que podem aumentar ou diminuir a afinidade dos anti- corpos ao TR-2 ou a função do agente causador dos efeitos nos anticor-
pOS. 10
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Em certas modalidades, os efeitos de um anticorpo anti-TR- 2 pode ser avaliado pela medida da redução da quantidade de sintomas da doença. Em certas modalidades, a doença de interesse pode ser causada por um patógeno. Em certas modalidades, uma doença pode ser estabelecida em um animal hospedeiro por outros métodos incluindo a introdução de uma substância (tal como um carcinógeno) e manipula- ção genética. Em certas modalidades, os efeitos podem ser avaliados pela detecção de um ou mais eventos adversos no animal hospedeiro. O termo «evento adverso" inclui, mas não está limitado a, uma reação adversa em um animal hospedeiro que recebe um anticorpo que não está presente no animal hospedeiro que não recebe o anticorpo. Em certas modalidades, eventos adversos incluem, mas, sem limitação, uma febre, ma resposta imune a um anticorpo, inflamação e/ou morte do
animal hospedeiro.
Vários anticorpos específicos para um antígeno podem ser
produzidos de várias maneiras. Em certas modalidades, um antígeno contendo um epítope de interesse pode ser introduzido em um animal hospedeiro (por exemplo, um camundongo), assim produzindo anticor- pos específicos para aquele epítope. Algumas vezes, anticorpos específi- cos para um epítope de interesse podem ser obtidos de amostras biológicas tomadas de hospedeiros que foram naturalmente expostos ao epítope. Algumas vezes, a introdução de imunoglobulina humana (Ig) Ioci em camundongos nos quais os genes Ig endógenos tenham sido desati- vados oferece a oportunidade para obter anticorpos monoclonais
humanos (MAbs).
Estrutura de Anticorpos de Ocorrência Natural
As unidades estruturais de anticorpo de ocorrência natural tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada um desses tetrâmeros tipicamente é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptí-
20 dios, cada par tendo uma cadeia "leve" com comprimento total (em certas modalidades, cerca de 25 KDa) e uma cadeia «pesada» de com- primento total (em certas modalidades, cerca de 50-70 KDa). O termo "cadeia pesada" inclui qualquer polipeptídio tendo seqüência de região variável suficiente para conferir especificidade para um antígeno parti- cular. Uma cadeia pesada de comprimento total inclui um domínio de região variável, Vh, e três domínios de região constante, CH1, Ch2 e CH3. O domínio Vh está na terminação amino do polipeptídio e o domínio Ch3 está na terminação carbóxi. O termo "cadeia pesada", como aqui usado neste documento, engloba uma cadeia pesada de anticorpo de compri- mento total e fragmentos da mesma.
O termo "cadeia leve" inclui qualquer polipeptídio tendo se- qüência de região variável suficiente para conferir especificidade para um antígeno particular. Uma cadeia leve de comprimento total inclui um domínio de região variável, Vl, e um domínio de região constante, Cl. Como na cadeia pesada, o domínio de região variável está na terminação amino do polipeptídio. O termo "cadeia leve", como aqui usado neste documento, engloba uma cadeia leve de comprimento total e fragmentos
da mesma.
A parte terminal amino de cada cadeia tipicamente inclui uma região variável (Vh na cadeia pesada e Vl na cadeia leve) de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que tipicamente é responsável pelo reconhecimento do antígeno. A parte terminal carbóxi de cada cadeia tipicamente define uma região constante (domínios CH na cadeia pesada e CL na cadeia leve) que pode ser responsável pela função do agente causador do efeito. As funções dos agentes causadores dos efeitos do anticorpo incluem a ativação de complemento e estimulação de opsono- fagocitose. As cadeias leves de humanos são tipicamente classificadas como cadeias leves kapa e lambda. As cadeias pesadas são tipicamente classificadas como um, delta, gama, alfa ou epsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. O IgG tem diversas subclasses, incluindo, mas, sem limitação, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. O IgM tem subclasses incluindo, mas, sem limitação, IgMl e IgM2. O IgA está similarmente subdividido em subclasses incluindo, mas, sem limitação, IgAl e IgA2. Dentro das cadeias pesadas e leves de compri- mento total, tipicamente, as regiões constantes e variáveis estão ligadas por uma região \T de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a ed., Raven Press, N.Y. (1989)). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada tipicamente formam ρ sítio de ligação do
antígeno.
As regiões variáveis tipicamente exibem a mesma estrutura geral de regiões de estrutura relativamente conservadas (FR) ligadas por três regiões hiper-variáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs de cadeia pesada e leve de cada par tipicamente são alinhadas pelas regiões da estrutura, as quais podem permitir a ligação a um epítope específico. A partir da terminação N e terminação C, ambas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada tipicamente compreendem os domínios FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As designações dos aminoácidos para cada domínio estão tipicamente de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)) ou Chothia & Lesk, J. Mol Biol 196: 901-917 (1987);
Chothia e colaboradores, Nature 342: 878-883 (1989).
Como discutido acima, existem diversos tipos de fragmentos de anticorpos. Um fragmento Fab é compreendido por uma cadeia leve e o ChI e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra molé- cuia de cadeia pesada. Um fragmento Fab' contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contem mais de uma região constante, entre os domínios ChI e Ch2, de forma que uma ligação dissulfeto inter-cadeias pode ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab*)2. Um fragmento Fab é similar a uma molécula Ffab^, exceto que a região constante das cadeias pesadas da molécula se estende para a extremidade do domínio Ch2. A região Fv compreende as regiões variá- veis de ambas as cadeias leve e pesada, mas não possui as regiões constantes. Anticorpos de cadeia única são moléculas Fv nas quais as regiões variáveis de cadeia leve e pesada tem sido conectadas por um ligante flexível para formar uma cadeia única de polipeptídio a qual forma uma região de ligação do antígeno. Anticorpos de cadeia única exemplificativos são discutidos em detalhes, por exemplo, em WO 88/01649 e Patente US 4.946.778 e US 5.260.203. Um fragmento Fc contém os domínios Ch2 e Ch3 da cadeia pesada e contém mais da região constante, ente os domínios ChI e Ch2, de forma que uma ligação dissulfeto inter-cadeias pode ser formada entre duas cadeias pesadas.
Em certas modalidades, domínios funcionais, Ch 1, Ch2 Ch3 e seqüências que ficam no meio podem ser misturados para criar uma região constante diferente no anticorpo. Por exemplo, em certas modali- dades, tais regiões constantes híbridas podem ser otimizadas para a meia-vida no soro, para montagem e dobramento {folding) do tetrâmero do anticorpo e/ou para melhorar a função do effector. Em certas moda- lidades, regiões constantes do anticorpo modificadas podem ser produ- zidas pela introdução de pontos únicos de mutação na seqüência do aminoácido da região constante e teste do anticorpo resultante com relação às qualidades melhoradas, por exemplo, um ou mais daqueles listados acima.
Em certas modalidades, um anticorpo é de um isotipo é convertido em um isotipo diferente pela mudança sem perda de sua especificidade com relação a uma molécula alvo particular. Métodos de mudança de isotipo incluem, mas, sem limitação, a técnicas recombi- nantes diretas (ver, por exemplo, a Patente US 4.816.397) e técnicas de fusão célula-a-célula (ver, por exemplo, a Patente US 5.916.771), entre outras. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser convertido de uma subclasse a outra subclasse usando técnicas descritas acima ou de outra forma conhecidas na técnica sem perder sua especificidade para uma molécula alvo particular, incluindo, mas não limitada a, conversão de uma subclasse IgG2 para uma subclasse IgGl, IgG3 ou IgG4.
Anticorpos Bi-Especificos ou Bi-Funcionais Um anticorpo bi-específico ou bi-funcional tipicamente é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo, mas, sem limitação, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol 79: 315-321 (1990), Kostelnye colaboradores, J. Immunol 148: 1547-1553 (1992).
Certas Preparações de Anticorpos Em certas modalidades, anticorpos podem ser expressos em linhagens de células outras que linhagens de células de hibridoma. Em certas modalidades, seqüências que codificam anticorpos particulares, incluindo anticorpos quiméricos, podem ser usadas para transformação de uma célula hospedeira de um mamífero apropriado. De acordo com certas modalidades, a transformação pode ser por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídeos em uma célula hospe- deira, incluindo, por exemplo, empacotamento do polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e transdução de uma célula hospedeira com o vírus ou pela transferência de um vetor usando procedimentos conhe- cidos na técnica, como exemplificado nas Patentes US 4.399.216, US
4.912.040, US 4.740.461 e US 4.959.455.
Em certas modalidades, um vetor de expressão compreende qualquer das seqüências de polinucleotídeo discutidas aqui neste documento. Em certas modalidades, é proporcionado um método de produzir um polipeptídio que compreende a produção do polipeptídio em uma célula que compreende qualquer dos vetores de expressão acima nas condições apropriadas para expressar o polinucleotídeo contido na
mesma para produzir o polipeptídio.
Em certas modalidades, é proporcionado um vetor de ex- pressão compreende um polinucleotídeo que compreende uma seqüên- cia que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada dentre CDRla, CDR2a e CDR3a, em que a CDRla compreende a seqüência de aminoá- cido a b c d e f g h i j k 1, em que o aminoácido a é glicina; o aminoácido b é selecionado dentre glicina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido c é selecionado dentre serina ou treonina; o aminoácido d é selecionado dentre isoleucina ou fenilalanina; o aminoácido e é selecionado dentre serina, treonina ou asparagina; o aminoácido f é selecionado dentre serina, ácido aspártico, tirosina, asparagina, treonina ou glicina; o aminoácido g é selecionado dentre glicina, ácido aspártico ou tirosina; o aminoácido h é selecionado dentre glicina, ácido aspártico, tirosina, asparagina ou serina; o aminoácido i é selecionado dentre tirosina, isoleucina, histidina, metionina ou triptofano; o aminoácido j é selecio- nado dentre asparagina, tirosina, histidina, serina ou fenilalanina; o aminoácido k é triptofano ou não está presente e o aminoácido 1 é serina ou não está presente; em que a CDR2a compreende a seqüência de aminoácido m η o ρ q r s t u ν w χ y ζ a' b' c>, em que o aminoácido m é selecionado dentre triptofano, tirosina, histidina, valina, ácido glutâmico ou serina; o aminoácido η é selecionado dentre metionina ou isoleucina; o aminoácido o é selecionado dentre asparagina, tirosina, serina, triptofano ou histidina; o aminoácido ρ é selecionado dentre prolina, tirosina, serina, arginina, histidina ou asparagina; o aminoácido q é selecionado dentre asparagina, serina ou ácido aspártico; o aminoácido r é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido s é selecionado dentre ácido aspártico, serina, treonina ou arginina; o aminoácido t é selecionado dentre asparagina, treonina, alanina, isoleucina ou tirosina; 3 o aminoácido u é selecionado dentre treonina, tirosina, leucina, lisina, asparagina ou isoleucina; o aminoácido ν é selecionado dentre glicina, tirosina, ácido aspártico ou cisteína; o aminoácido w é selecionado dentre tirosina ou asparagina; o aminoácido χ é selecionado dentre alanina ou prolina; o aminoácido y é selecionado dentre glutamina, o serina ou ácido aspártico; o aminoácido ζ é selecionado dentre lisina, leucina ou serina; o aminoácido a' é selecionado dentre fenilalanina, lisina ou valina; o aminoácido b' é selecionado dentre glutamina, serina ou lisina e o aminoácido c' é glicina ou não está presente; em que a CDR3a compreende a seqüência de aminoácido d' e' f g' h' i' j' k' Y m' n' Oi p' q' r' s9 t' u* v' w', em que o aminoácido d' é selecionado dentre triptofano, ácido aspártico, glicina, serina ou ácido glutâmico; o aminoá- cido e' é selecionado dentre asparagina, ácido aspártico, glicina, argini- na, serina, valina ou leucina; o aminoácido f é selecionado dentre histidina, serina, alanina, tirosina, prolina, asparagina, glicina ou treonina; o aminoácido g' é selecionado dentre tirosina, serina, alanina, arginina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido h' é selecionado dentre glicina, alanina, serina, asparagina, metionina, tirosina, triptofa- no, cisteína ou ácido aspártico; o aminoácido i' é selecionado dentre serina, triptofano, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, tirosina ou treonina; o aminoácido j' é selecionado dentre glicina, treonina, serina, leucina, valina, asparagina, triptofano ou tirosina; o aminoácido k é selecionado dentre serina, fenilalanina, ácido aspártico, triptofano, glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido V é selecionado dentre histidina, ácido aspártico, alanina, triptofano, tirosina, serina, fenilalanina, valina ou glicina ou não está presente; o aminoácido m' é selecionado dentre fenilalanina, tirosina, ácido glutâmico, prolina, ácido aspártico, cisterna, isoleucina ou metionina ou não está presente; o aminoácido n' é selecionado dentre ácido aspártico, fenilalanina, alani- na, leucina ou serina ou não está presente; o aminoácido o' é seleciona- do dentre tirosina, leucina, ácido aspártico, fenilalanina, prolina ou valina ou não está presente; o aminoácido p' é selecionado dentre leucina, ácido aspártico ou tirosina ou não está presente; o aminoácido q> é selecionado dentre serina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido r' é tirosina ou não está presente; o aminoácido s' é selecio- nado dentre glicina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido t' é selecionado dentre glicina ou metionina ou não está presente; o aminoá- cido u' é selecionado dentre metionina ou ácido aspártico ou não está presente; o aminoácido v' é selecionado dentre ácido aspártico ou valina ou não está presente e o aminoácido Wi é valina ou não está presente; e em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia leve de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um método de produzir um polipeptídio que compreende a produção do polipeptídio em uma célula que compreende o vetor de expressão acima nas condições apropriadas para expressar o polinucleotídeo contido na mesma para
produzir o polipeptídio.
Em certas modalidades, é proporcionado um vetor de ex- pressão compreende um polinucleotídeo que compreende uma seqüên- cia que codifica um polipeptídio que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) selecionada dentre CDRlb, CDR2b e CDR3b, em que a CDRlb compreende a seqüência de aminoá- cido al bl cl dl el fl gl hl il jl kl 11 ml nl ol pl ql, em que o aminoácido al é selecionado dentre arginina ou lisina; o aminoácido bl é selecionado dentre treonina, alanina ou serina; o aminoácido cl é serina; o aminoácido dl é glutamina; o aminoácido el é selecionado dentre serina ou glicina; o aminoácido fl é selecionado dentre isoleuci- na, leucina ou valina; o aminoácido gl é selecionado dentre serina, leucina ou arginina; o aminoácido hl é selecionado dentre treonina, serina, isoleucina, asparagina, arginina, histidina ou tirosina; o aminoá- cido il é selecionado dentre tirosina, arginina, triptofano, ácido aspárti- > co ou serina; o aminoácido jl é selecionado dentre leucina, isoleucina, asparagina, tirosina ou serina; o aminoácido kl é selecionado dentre asparagina, glicina, valina, alanina ou leucina; o aminoácido 11 é selecionado dentre tirosina, alanina ou asparagina ou não está presente; o aminoácido ml é selecionado dentre asparagina ou lisina ou não está O presente; o aminoácido nl é selecionado dentre tirosina, asparagina ou isoleucina ou não está presente; o aminoácido ol é selecionado dentre leucina ou tirosina ou não está presente; o aminoácido pl é selecionado dentre ácido aspártico ou leucina ou não está presente e o aminoácido ql é selecionado dentre valina, alanina ou treonina ou não está presen- .5 te; em que a CDR2b compreende a seqüência de aminoácido rl sl tl ul vl wl xl, em que o aminoácido rl é selecionado dentre alanina, ácido aspártico, leucina, triptofano, glicina ou valina; o aminoácido sl é selecionado dentre treonina, valina, glicina ou alanina; o aminoácido tl é serina; o aminoácido ul é selecionado dentre serina, asparagina ou treonina; o aminoácido vl é selecionado dentre leucina, fenilalanina ou arginina; o aminoácido wl é selecionado dentre glutamina, alanina ou ácido glutâmico; e o aminoácido xl é selecionado dentre serina, arginina ou treonina; em que a CDR3b compreende a seqüência de aminoácido yl zl al' bV cV dl' ei' fl* gl', em que o aminoácido yl é selecionado dentre glutamina, metionina, leucina ou histidina; o aminoácido zl é selecionado dentre glutamina ou lisina; o aminoácido al' é selecionado dentre serina, treonina, alanina, histidina, tirosina ou fenilalanina; o aminoácido bl' é selecionado dentre tirosina, leucina, asparagina ou glicina; o aminoácido cl' é selecionado dentre serina, glutamina, isoleu- cina ou lisina; o aminoácido dl' é selecionado dentre treonina, fenilala- nina, tirosina, alanina ou serina; o aminoácido el' é prolina; o aminoá- cido fl' é selecionado dentre leucina, fenilalanina, triptofano, serina ou arginina; e o aminoácido gl' é selecionado dentre treonina ou serina; e em que o polipeptídio, em associação com uma cadeia pesada de um anticorpo, se liga a um TR-2. Em certas modalidades, um método de produzir um polipeptídio que compreende a produção do polipeptídio em uma célula que compreende o vetor de expressão acima nas condições apropriadas para expressar o polinucleotídeo contido na mesma para produzir o polipeptídio é fornecido. Em certas modalidades, uma célula LO que compreende pelo menos uma dos vetores de expressão acima é fornecida. Em certas modalidades, um método de produzir um polipep- tídio que compreende a produção do polipeptídio em uma célula que compreende o vetor de expressão acima nas condições apropriadas para expressar o polinucleotídeo contido na mesma para produzir o polipeptí-
dio.
Em certas modalidades, um vetor de expressão expressa uma cadeia pesada de um anticorpo anti-TR-2. Em certas modalidades, um vetor de expressão expressa uma cadeia leve de um anticorpo anti- TR-2. Em certas modalidades, é proporcionado um vetor de expressão expressa ambas uma cadeia pesada de um anticorpo anti-TR-2 e uma cadeia leve de um anticorpo anti-TR-2. Em certas modalidades, um método de produzir um anticorpo anti-TR-2 que compreende a produção do anticorpo em uma célula que compreende pelo menos os vetores de expressão descritos acima nas condições apropriadas para expressar os polinucleotídeos contidos na mesma para produzir o anticorpo.
Em certas modalidades, o procedimento de transfecção usa- do pode depender do hospedeiro a ser transformado. Certos métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífe- ros são conhecidos na técnica e incluem, mas, sem limitação, transfec- ção mediada por dextrana, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção 10
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mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsula- mento de polinucleotídeo(s) em lipossomas e micro-injeção direta de
DNA no núcleo.
Certas linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiras para expressão são conhecidas na técnica e incluem, mas, sem limitação, muitas linhagens de células imortalizadas disponí- veis da American TYpe Culture Collection (ATCC), incluindo, mas, sem limitação, células do ovário do hamster chinês (CHO), células E5, células HeLa, células do fígado de filhote de hamster (BHK), células do fígado de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas (por exemplo, Hep G2), células NOS, células SP20, células Per C6, células 293 e um número de outras linhagens de células. Em certas modalidades, linhagens de células podem ser selecionadas através da determinação de quais linhagens de células tem altos níveis de expres- são e produzem anticorpos com propriedades ligantes do antígeno
constitutivas.
Em certas modalidades, os vetores que podem ser transfec- tados em uma célula hospedeira compreendem seqüências de controle que são operavelmente ligadas a um polinucleotídeo que codifica um anticorpo anti-TR-2. Em certas modalidades, seqüências de controle facilitam a expressão do polinucleotídeo ligado, assim resultando na produção do polipeptídio codificado pelo polinucleotídeo ligado. Em certas modalidades, o vetor também compreende seqüências de polinu- cleotídeo que permitem a replicação cromossomo independente na célula hospedeira. Vetores exemplificativos incluem, mas, sem limitação, plasmídeos (por exemplo, BlueScript, puc, etc.), cosmídeos e YACS.
Certos Usos dos Anticorpos De acordo com certas modalidades, os anticorpos são úteis para a detecção de um antígeno particular em uma amostra. Em certas modalidades, isto permite a identificação de células ou tecidos que produzem a proteína. Por exemplo, em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser usados para detectar a presença de TR-2 em uma amostra. Em certas modalidades, um método para detectar a presença ou ausência de TR-2 em uma amostra compreende (a) combinar um anticorpo anti-TR-2 e a amostra; (b) separar anticorpos ligados a um antígeno de anticorpos não ligados; e (c) detectar a presença ou ausên- cia de anticorpos ligados ao antígeno.
Testes em que pode ser usado um anticorpo para detectar a
presença ou ausência de um antígeno incluem, mas, sem limitação, um teste ELISA e um western blot. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 pode ser rotulado. Em certas modalidades, um anticorpo anti- TR-2 pode ser detectado por um anticorpo rotulado que se liga ao anticorpo anti-TR-2. Em certas modalidades, um kit para detectar a presença ou ausência de TR-2 em uma amostra é fornecido. Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo anti-TR-2 e reagentes para
detecção do anticorpo.
Em certas modalidades, podem ser usados anticorpos para
substancialmente isolar um segmento químico tal como, mas, sem limitação,, uma proteína. Em certas modalidades, o anticorpo é ligado a um «substrato", o qual é um material de suporte usado para imobilizar o anticorpo. Substratos incluem, mas, sem limitação, tubos, placas (isto é, placas multi-poços), contas tais como micro-contas, filtros, bolas e membranas. Em certas modalidades, um substrato pode ser feito de materiais insolúveis em água tais como, mas, sem limitação, resina de policarbonato, resina de silicone ou resina de náilon. Substratos exem- plificativos para uso em cromatografia por afinidade incluem, mas, sem limitação, celulose, agarose, poliacrilamida, dextrana, poliestireno, álcool polivinílico e sílica porosa. Existem muitos substratos cromato- gráficos disponíveis comercialmente que incluem, mas, sem limitação, Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B e outras formas de Sepha- rose (Pharmacia); Bio-Gel (e várias formas de Bio-Gel tal como Biogel A, P ou CM), Cellex (e várias formas de Cellex tal como Cellex AE ou Cellex- CM), Chromagel A, Chromagel P e Enzafix (Wako Chemical Indus.). O uso de colunas de afinidade de anticorpos é conhecido a uma pessoa de conhecimento comum na técnica. Em certas modalidades, um método para isolar o TR-2 compreende (a) ligar um anticorpo TR-2 a um subs- trato; (b) expor uma amostra contendo TR-2 ao anticorpo da parte (a); e (c) isolar o TR-2. Em certas modalidades, um kit para isolar o TR-2 é fornecido. Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo anti- TR-2 ligado a um substrato e reagentes para isolar o TR-2.
O termo "cromatografia de afinidade" como aqui usado neste documento significa um método de separar e purificar os materiais de interesse em uma amostra pela utilização da interação (por exemplo, a afinidade) entre um par de materiais, tais como um antígeno e um anticorpo, uma enzima e um substrato ou um receptor e um ligante.
Em certas modalidades, anticorpos os quais se ligam a uma proteína em particular e interação de bloqueio com outros compostos ligantes podem ter uso terapêutico. Neste pedido, quando discutindo o uso de anticorpos anti-TR-2 para tratar doenças e condições, tal uso pode incluir o uso dos próprios anticorpos anti-TR-2; composições que compreende anticorpos anti-TR-2 e/ou terapias combinadas que compreende anticorpos anti-TR-2 e um ou mais ingredientes ativos adicionais. Quando são usados anticorpos anti-TR-2 para "tratar" uma doença ou condição, tal tratamento pode incluir ou não a prevenção da doença ou condição. Em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem bloquear a interação do receptor TR-2 com seu ligante, TRAIL. Em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ativar o receptor TR-2. Em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem constituti- vamente ativar o receptor TR-2. Por que o TR-2 é associado com a apoptose, em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser ter uso terapêutico no tratamento de doenças em que a morte da célula ou prevenção da morte da célula é desejado. Essas doenças incluem, mas, sem limitação, o câncer associado com qualquer tecido que expresse TR-
2, inflamação e infecções virais.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é adminis- trado sozinho. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é administrado antes da administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é adminis- trado concorrentemente com a administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é administrado subseqüente à administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Agentes terapêuticos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, pelo menos um outro agente de terapia de câncer. Agentes de terapia de câncer exemplificativos incluem, mas, sem
limitação, terapia de radiação e quimioterapia.
Em certas modalidades, podem ser administradas composi- ções farmacêuticas de anticorpo anti-TR-2 na terapia combinada, isto é, combinadas com outros agentes. Em certas modalidades, a terapia combinada compreende um anticorpo anti-TR-2, em combinação com pelo menos um agente anti-angiogênico. Agentes exemplificativos incluem, mas, sem limitação, composições químicas preparadas sinteti- camente in vitro, anticorpos, regiões de ligação de antígenos, radionuclí- deos e combinações e conjugados das mesmas. Em certas modalidades, um agente pode atuar como um agonista, antagonista, modulador alostérico ou toxina. Em certas modalidades, um agente pode atuar para inibir ou estimular seu alvo (por exemplo, ativação ou inibição do receptor ou enzima) e desta forma promover a morte da célula ou deter o
crescimento da célula.
Tratamentos de quimioterapia adequados incluem, mas,
sem limitação, agentes anti-neoplãsticos incluindo, mas, sem limitação, agentes de alquilação incluindo, mas sem limitação: nitrogênio mostar- das, incluindo, mas, sem limitação, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan e clorambucil; nitrosoureas, incluindo, mas, sem limitação, carmustina BCNU, lomustina, CCNU e semustina, metil CCNU; Temodal®, temozolamida; etileniminas/metilmelamina, incluin- do, mas, sem limitação, trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosfora- mida, tiotepa, hexametilmelamina (HMM) e altretamina; alquil sulfona- tos, incluindo, mas, sem limitação, busulfan; triazinas, incluindo, mas, sem limitação, dacarbazina (DTIC); anti-metabólitos, incluindo, mas, sem limitação, análogos do ácido fólico tais como metotrexato e trime- trexato; análogos da pirimidina, incluindo, mas, sem limitação, 5- fluorracil (5FU), fluordeoxiuridina, gencitabina, citosina arabinosida (AraC, citarabina), 5-azacitidina e 2,2'-difluordeoxicitidina; análogos da purina, incluindo, mas, sem limitação, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-deoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladeni- na (EHNA), fosfato de fludarabina, cladribina e 2-clorodeoxiadenosina (2-CdA); produtos naturais, incluindo, mas, sem limitação, drogas anti- mitóticas tal como paclitaxel; alcalóides vinca, incluindo, mas, sem limitação, vinblastina (VLB), vincreistina e vinorelbina; taxotere; estra- mustina e fosfato de estramustina, pipodofilotoxinas, incluindo, mas, sem limitação, etoposida e teniposida; antibióticos, incluindo, mas, sem limitação, actinomicina D, daunomicina, rubidomicina, doxorubicina, mitoxantrona, idarubicina, bleomicinas, plicamicina, mitramicina, mitomicina C e actinomicina; enzimas, incluindo, mas, sem limitação, alfa-interferona, IL-2, G-CSF e GM-CSF; doxiciclina; hidrocloreto de irinotecana; agentes variados, incluindo, mas, sem limitação, complexos de coordenação de platina tais como cisplatina e carboplatina; antrace- nodionas, incluindo, mas, sem limitação, mitoxiantrona; uréia substitu- ída, incluindo, mas não limitada a, hidroxiuréia; derivados de metilhi- drazina. incluindo, mas, sem limitação, N-metilhidrazina (MIH) e
procarbazina; supressores adrenocorticais, incluindo, mas, sem limita- ção, mitotano (ο,ρ'-DDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas, incluindo, mas, sem limitação, antagonistas adrenocorticosteróides tais como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; Gemzar®, gemcitabina; progestina, incluindo, mas não limitada a, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrogénio, incluindo, mas, sem limitação,, equivalentes de dietilstilbestrol e etinil estradiol; anti-estrogênio, inclu- indo, mas, sem limitação, tamoxifeno; androgênios, incluindo, mas, sem limitação, equivalentes de propionato de testosterona e fluoximesterona; anti-androgênios, incluindo, mas, sem limitação, flutamida, análogos do hormônio de liberação da gonadotrofina e leuprolida e anti-androgênios não esteroidais, incluindo, mas, sem limitação, flutamida.
Terapias de câncer exemplificativas, que podem ser adminis- tradas com um anticorpo anti-TR-2, incluem, mas, sem limitação, terapias de alvo. Exemplos de terapias de alvo incluem, mas, sem limitação, uso dos anticorpos terapêuticos. Anticorpos terapêuticos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, anticorpos de camundon- gos, quiméricos camundongos-humanos, CDR enxertado, humanizados e humanos e anticorpos sintéticos, incluindo, mas, sem limitação, aqueles selecionados pela triagem das bibliotecas de anticorpos. Anti- corpos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, aqueles que se ligam às proteínas da superfície da célula Her2, CDC20, CDC33, glicoproteína semelhante à mucina e receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFr) presente nas células tumorais e opcionalmente induz o efeito citostático e/ou citotóxico nas células tumorais mostrando essas proteínas. Anticorpos exemplificativos também incluem, mas, sem limitação, HERCEPTIN®, trastuzumab, o qual pode ser usado para tratar câncer de seio e outras formas de câncer; RITUXAN®, rituximab, ZEVA- LIN®, ibritumomab tiuxetan e LYMPHOCIDE®, epratuzumab, que podem tT
ser usados para tratar linfoma de não Hodgkin e outras formas de câncer; GLEEVEC®, mesilato de imatinib, que podem ser usados para tratar leucemia mielóide crônica e tumores do estroma gastrointestinais e BEXXAR®, iodo 131 tositumomab, os quais podem ser usados para o tratamento de linfoma de não Hodgkin. Certos anticorpos exemplificati- vos também incluem ERBITUX®, IMC-C225, Iressa®, gefitinib, TARCE- VA®, ertinolib, inibidores KDR (receptor de domínio da quinase), anticor- pos receptores anti-VEGF e regiões de ligação do antígeno, anticorpos anti-Ang-1 e Ang-2 e regiões de ligação do antígeno, anticorpos para Tie- 2 e outros receptores Ang-I e Ang-2, ligantes Tie-2, anticorpos contra inibidores de quinase Tie-2 e Campath®, alemtuzumab. Em certas modalidades, agentes de terapia de câncer são outros polipeptídios os quais seletivamente induzem apoptose em células tumorais incluindo, mas, sem limitação, polipeptídios relacionados ao TNF tal como o eTRAIL".
Em certas modalidades, agentes de ligação específicos (in- cluindo, mas, sem limitação, anticorpos anti-IGF-Rl) que antagonizam a ligação dos ligantes IGF-I e/ou IGF-2 para o receptor fator-1 de cresci- mento tipo insulina ("IGF-IR") e promovem apoptose das células expres- sando IGF-IR são formulados ou administrados em combinação com agentes de ligação específicos (incluindo, mas, sem limitação, "TRAIL" e anticorpos anti-TR-2) que agonizam e desta forma promovem a apoptose das células expressando "TRAIL"-R2. Anticorpos anti-IGF-lR são conhecidos na técnica e são revelados, por exemplo, no WO 2006/069202, depositado em 20 de dezembro de 2005, o qual é incor- porado por referência aqui neste documento para qualquer propósito.
Em certas modalidades, agentes de terapia de câncer são agentes anti-angiogênicos que diminuem a angiogênesis. Certos desses agentes incluem, mas, sem limitação, ERBITUX®, IMC-C225, agentes inibidores KDR (receptor de domínio de quinase) (por exemplo, regiões Ψ
de ligação de anticorpos e antígenos que especificamente se ligam ao receptor de domínio de quinase), agentes anti-VEGF (por exemplo, regiões de ligação de anticorpos ou antígenos que especificamente se ligam a receptores VEGF ou VEGF solúveis ou uma região de ligação do ligante dos mesmos) tal como AVASTIN® ou VEGF-TRAP®, agentes receptores anti-VEGF (por exemplo, regiões de ligação dos anticorpos ou antígenos que especificamente se ligam aos mesmos), agentes inibidores EGFR (por exemplo, regiões de ligação dos anticorpos ou antígenos que especificamente se ligam aos mesmos) tais como ABX_EGF, panitumu- mab, Iressa®, gefitinib, TARCEVA®, erlotinib, agentes anti-Angl e anti- Ang2 (por exemplo, regiões de ligação dos anticorpos ou antígenos especificamente se ligam aos mesmos ou a seus receptores, por exem- plo, agentes inibidores de quinase Tie2/Tek e anti-Tie-2 (por exemplo, regiões de ligação dos anticorpos ou antígenos especificamente se ligam aos mesmos, por exemplo, regiões de ligação dos anticorpos ou antíge- nos especificamente se ligam aos mesmos). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem também incluir um ou mais agentes (por exemplo, anticorpos, regiões de ligação do antígeno ou receptores solúveis) que especificamente se ligam e inibem a atividade dos fatores de crescimento, tais como antagonistas do fator de crescimento de hepatócito (HGF, também conhecido com Fator de Dispersão) e regiões de ligação dos anticorpos ou antígenos que especificamente se ligam ao
seu receptor "c-met".
Agentes anti-angiogênicos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, Campath, IL-8, B-FGF, antagonistas Tek (Ceretti e colaboradores, Pedido de Patente de Publicação 2003/0162712, Patente US 6.413.932), agentes anti-TWEAK (por exemplo, especificamente anticorpos ligantes ou regiões de ligação de antígeno ou antagonistas receptores TWEAK solúveis; Ver, por exemplo, Wiley, Patente US 6.727.225); domínio de disintegrin ADAM para antagonizar a ligação do integrin a seus ligantes (Fanslow e colaboradores, Depósito de Patente Americana Publicação US 2002/0042368); especificamente receptor anti-eph de ligação e/ou anticorpos anti-ephrin ou regiões de ligação de antígeno (Patentes US 5.981.245; US 5.728.813; US 5.969.110; US 6.596.852; US 6.232.447, US 6.057.124 e membros da família de Patentes dos mesmos); antagonistas anti-PDGF-BB (por exemplo, especificamente anticorpos de ligação ou regiões de ligação de antígeno) bem como regiões de ligação de anticorpos ou antígenos especificamente ligando ligantes PDGF-BB e agentes inibidores de quinase PDGFR (por exemplo, regiões de ligação de anticorpos ou antígenos que especifica- mente se ligam aos mesmos).
Agentes anti-angiogênicos/anti-tumor exemplificativos in- cluem, mas, sem limitação,, SF-7784 (Pfizer, EUA); cilengitide (Merck KgaA, Alemanha, EPO 770622); pegaptanib ocatsódio (Gilead Sciences, EUA); Alfastatina (BioActa, Reino Unido); M-PGA (Celgene, EUA, Patente US 5.712.291); ilomastat (Arriva, EUA, Patente US 5.892.112); emaxa- nib (Pfizer, EUA, Patente US 5.792.783); vatalanib (Novartis, Suíça); 2- metóxiestradiol (EntreMed, EUA); TLC ELL-12 (Elan, Irlanda); acetato de anecortave (Alcon, EUA); alfa-D148 Mab (Amgen, EUA); CEP-7055 (Cephalon, EUA); anti-Vn Mab(Crucell, Holanda); DAC:anti-angiogênico (ConjuChem, Canadá); Angiodicina (InKine Pharmaceutical, EUA); KM- 2550 (Kyowa Hakko, Japão); SU-0879 (Pfizer, EUA); CGP-79787 (Novar- tis, Suíça, EP 970070); tecnologia ARGENT (Ariad, EUA); YIGSR-Strealth (Johnson & Johnson, EUA); fragmento fibrinogênio-E (BioActa, Reino Unido); inibidor de angiogênese (Trigen, Reino Unido); TBC-1635 (Encysive Pharmaceuticals, EUA); SC-236 (Pfizer, EUA); ABT-567 (Abbott, EUA); Metastatina (EntreMed, EUA); inibidor de angiogênese (Tripep, Suécia); maspin (Sosei, Japão); 2-metoxiestradiol (Oncology Science Corporation, EUA); ER-68203-00 (IVAX, EUA); Benefin (Lane Labs, EUA); Tz-93 (Tsumura, Japão); TAN-1120 (Takeda, Japão); FR- âJX> ψ
111142 (Fujisaws, Japão, JP 022233610); fator de plaquetas 4 (Repli- Gen5 EUA, EP 407122); antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (Borean, Dinamarca); temsirolimus (CCI-779)(University of South Carolina, EUA); bevacizumab (pINN)(Genentech, EUA); inibidores de angiogênese (SUGEN, EUA); XL 784 (Exelixis, EUA); XL 647 (Exelixis, EUA); Mab, alfa 5 beta 3 integrin, Vitaxin e segunda geração do Vitaxin (Applied Molecular Evolution, EUA e MedImmune EUA); terapia de gene Retonostat® (Oxford Biomédica, UK); hidrocloreto de enzastaurina (USAN)(Lilly, EUA); CEP 7055 (Cephalon, EUA e Sanofi-Synthelabo, França); BC 1 (Genoa Institute of Câncer Research, Itália); inibidor de angiogênese (Alchemia, Austrália); antagonista VEGF (Regeneron, EUA); antiangiogênico derivado de rBPI 21 e BPI (XOMA, EUA); PI 88 (Progen, Austrália); cilengitide (pINN) (Merck KgaA, Alemanha; Munich Technical University, Alemanha; Scripps Clinic e Research Foundation, EUA); cetuximab (INN) (Aventis, França); AVE 8062 (Ajinomoto, Japão); AS 1404 (Câncer REsearch Laboratoiyj Nova Zelândia); SG 292 (Telios, EUA); Endostatina (Boston Children's Hospital, EUA); 2-metoxiestradiol (Boston Children's Hospital, EUA); ZD 6474 (AstraZeneca, Reino Unido); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, Reino Unido); PPI 2458 (Praecis, EUA); AZD 9935 (AstraZeneca, Reino Unido); AZD 2171 (AstraZeneca, Reino Unido); vatalanib (pINN) (Novartis, Suíça e Shering AG, Alema- nha); inibidores de caminho de fator de tecido (EntraMed, EUA); pegap- tanib (Pinn) (Gilead Sciences, EUA); xanthorrrhizol (Yonsei University, Coréia do Sul); vacina, baseada em gene, VEGF-2 (Scripps Clinic e Research Foundation, EUA); SPV5.2 (Supratek, Canadá), SDX 103 (University of Califórnia em San Diego, EUA); PX 478 (ProlX, EUA); Metastatina (EntreMed, EUA); troponin I (Havard University, EUA); SU 6668 (SUGEN, EUA); OXI 4503 (OXiGENE, EUA); o-guanidinas (Dimen- sional Pharmaceuticals, EUA); motuporamina C (British Columbia University, Canadá); CDP 791 (Celltech Group, Reino Unido): atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKline, Reino Unido); E 7820 (Eisai, Japão); CYC 381 (Havard University, EUA); AE 941 (Aeterna, Canadá); vacina de câncer FGF2 (EntreMed, EUA); inibidor ativador de plasminogênio de uroquina- se (Dendreon, EUA); oglufanida (pINN) (Melmotte, EUA); inibidores de alfa HIF-I (Xenova, Reino Unido); CEP 5214 (Cephalon, EUA); BAY RES 2622 (Bayer, Alemanha); ANgiocidina (InKine, EUA); A6 (Angstrom, EUA); KR 31372 (Korean Research Institute of Chemical Technology, Coréia do Sul); GW 2286 (GlaxoSmithKline, Reino Unido); EHT OlOl (ExonHit, França); CP 868596 (Pfizer, EUA); CP 564959 (OSI, EUA); CP 547632 (Pfizer, EUA); 786034 (GlaxoSmithKline, Reino Unido); KRN 633 (Kirin Brewery, Japão); sistema de entrega de droga, intra-ocular, 2- metoxie stradiol (EntreMed, EUA); anginex (Maastricht University, Holanda e Minnesota University, EUA); ABT 510 (Abbott, EUA); AAL 993 (Novartis, Suíça); VEGI (ProteomTech, EUA); inibidor do fator alfa de necrose de tumor (National Institute on Aging, EUA); SU 11248 (Pfizer, EUA e SUGEN EUA); ABT 518 (Abbott, EUA); YH16 (Yantai Rongchang, China); S-3APG (Boston ChildreniS Hospital, EUA e EntreMed, EUA); Mab, KDR (ImClone Systems, EUA); Mab, alfa 5 beta 1 (Protein Design, EUA); inibidor de quinase KDR (CellTech Group, Reino Unido e Johnson & Johnson, EUA); GFB 116 (South Florida University, EUA e Yale University, EUA): CS 706 (Sankyo, Japão); pró-droga de combretastina A4 (Arizona State University, EUA); chondroitinase AC (IBEX,Canadá); BAY RES 2690 (Bayer, Alemanha); AGM 1470 (Haverd University, EUA e Takeda, Japão e TAP, EUA); AG 13925 (Agouron, EUA); Tetratiomolibda- to (University of Michigan, EUA); GCS 100 (Waine State University, EUA); CV 247 (Ivy Medicai, Reino Unido); CKD 732 (Chong Kun Dang, Coréia do Sul); Mab, fator de crescimento de endotélio vascular (Xenova, Reino Unido); irsogladine (INN) (Nippon Shinyaku, Japão); RG 13577 (Aventis, França); WX 360 (Wilex, Alemanha); esqualamina (pINN) (Genaera, EUA); RPI 4610 (Sirna, EUA); sulfato de fucano galacto (Marinova, Austrália); inibidores de heparanase (InSight, Israel); KL 3106 (Kolon, Coréia do Sul); Honokiol (Emory University, EUA); ZK CDK (Shering AG, Alemanha); ZK Angio (Schering AG5 Alemanha); ZK 229561 (Novartis, Suíça e Schering AG, Alemanha); XMP 300 (XOMAj EUA); VGA 1102 (Taisho, Japão); moduladores de receptor VEGF (Pharmacopeia, EUA); antagonistas VE-cadherin-2 (ImClone Systems, EUA); Vasostatina (National Institutes of Health, EUA); vacina, Flk-I (ImClone Systems, EUA); TZ 93 (Tsumura, Japão); TumStatina (Beth Israel Hospital, EUA); FLT 1 solúvel truncado (receptor 1 do fator de crescimento endotelial vascular) Merck & Co, EUA); ligantes Tie-2 (Regeneron, EUA) e inibidor de thrombospondin 1 (Allegheny Health, Education and Research Foundation, EUA).
Certos agentes de terapia de câncer incluem, mas, sem limitação, talidomida e análogos da talidomida (N-(2,6~dioxo-3- piperidil)ftalimida); sódio tecogalan (peptidoglicano polissacarídeo sul- fatado); Velcade®; bortezomib; rapamica; TAN 1120 (8-acetil-7,8,9,10-te-
trahidro-6,8,1 l-trihidroxi-l-metoxi-10-[[octahidro-5-hidroxi-2-(2-hidro-
xiρropil)-4,10-dimetilpirano[3,4-d]-l,3,6-dioxa2;ocin-8-il]oxi]-5)12-nafta- cenodiona); suradista (sal tetrasódio do ácido 7,7'-[carbonilbis[imino(l- metü-lH-pirrol-4,2-diü)carbonilimino(l-metil-lH-pirrol-
imino]]bis-1,3-naftalenodisulfonico); SU 302, SU 301, SU 1498 ((E)-2- ciano-3-[4-hidroxi-3,5-bis(l-metiletil)fenil]-N-(3-fenilpropil)-2-propem mida); SU 1433 (4-(6,7-dimetil-2-quinoxalinil)-l,2-benzenodiol); ST 1514; SR 25989; Tie-2 solúvel; derivados de SERM; Pharmos; semaxa- nib (pINN) (3-[(3,5-dimetil-lH-pirrol-2-il)metileno]-l,3-dihidro-2H-indol- 2-ona); S 836; RG 8803; RESTIN; R 440 (3-(l-metil-lH-indol-3-il)-4-(r- metil-6-nitro-lH-indol-3-il)-lH-pirrol"2,5-diona); R 123942 (l-[6-(l,2,4- tiadiazol-5-il)-3-piridazinil]-N-[3-(trifluormetil)fenil]-4-piperidinami inibidor de hidroxilase prolil; genes de elevada progressão; prinomastat (INN) (ácido (S)~2,2-dimetil-4-[[p-(4-piridiloxi)fenil]sulfonil]-3-tiomorfoli- nacarbohidroxamico); NV 1030; NM 3 (ácido 8-hidroxi-6-metoxi-alfa- metil-1 -oxo-1 H-2-benzopirano-3-acético); NF 681; NF 050; MIG; METH 2; METH 1; manassantin B (alfa-[l-[4-[5-[4-[2-(3,4-dimetoxifenil)-2-hi- droxi-l-metiletoxi]-3-metoxifenil]tetrata toxifenoxi] etil]-1,3-benzodioxol-5-metanol); anticorpo monoclonal KDR; anticorpo monoclonal alfa 5 beta 3 integrina; LY 290293 (2-amino-4-(3- piridinil)-4H-naftol[l,2-b]pirano-3-carbonitrila); KP 0201448; KM 2550; peptídeos integrina específicos; INGN 401; GYKI 66475; GYKI 66462; greenstatin (101-354-plasminogênio (humano)); terapia de gene para artrite reumatóide, câncer de próstata, câncer de o vário, glioma, endos- tatina, câncer colo-retal, ATF BTPI, genes anti-angiogênese, inibidor de angiogênese ou angiogênese; inibidor de gelatinase, FR 111142 (éster 4,5-dihidroxi-2-ácido hexenoico-5-metoxi-4-[2-metil-3-(3-metil-2-bute- nil)oxiranil]-l-oxaespiro[2.5]oct-6-il); forfenimex (pINN) ácido (S)-alfa- amino-3-hidroxi-4-(hxdróximetil)benzenoacétÍco); antagonista íibronecti- na (1 -acetil-L-prolil-L-histidil-L-seril-L-cisteinil-L-aspartamida); inibidor de receptor de fator de crescimento de fibroblasto; antagonista do fator de crescimento de fibroblasto; FCE 27164 (sal hexasódio do ácido 7,7'- [carbonilbis[imino( 1 -metil- lH~pirrol-4,2-diil)carbonilimino( 1 -metil-1H- pirrol-4í2-diil)carbonilimino]]bis-l,3,5-naftalenotrisulfonico); FCE 26752 (ácido 8,8-[carbonilbis[imino(l-metil-lH-pirrol-4,2-diil)carbonilimino(l- metil-lH-pirrol-4,2-diil)carbonilim^
polipeptídio de ativação de monócito endotelial II; oligonucleotídeo antisenso VEGFR; fatores anti-angiogênico e trófíco; agente angiostático ANCHOR; endostatina; proteína angiogênica Del-1; CT 3577; contortros- tatina; CM 101; condroitinase AC; CDP 845; CanStatin; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1.000; ARRESTIN; apomigren (colágeno XV tipo 1304-1388 (precursor de cadeia alfa 1 COL 15A1 de gene humano)); angioinibina; aaATIII; A 36; acetato de 9-alfa-fluormedroxiprogesterona ((6-alfa)-17-(acetiloxi)-9-fluor-6-metil-pregn-4-eno-3,20-diona); ácido 2- metil-2-ftalimidino-glutárico (ácido 2-( 1,3-dihidro- l-oxo-2H-isoindol-2- il)-2-metilpentanodioico); anticorpo monoclonal rotulado ítrio 90 BC-1; Semaxanib (3-(4,5-dimetilpirrol-2-imetileno)indolin-2-ona)(C15 H14 N2 O); PI 88 (sulfato de fosfomanopentaose); Alvocidib (4H-l-benzopiran-4- ona, 2~(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-(3-hidroxl·-1 -metil-4-piperidinil)-cis- (-)-) C21 H20 Cl N 05); E 7820; SU 11248 (5-[3-fluor-2-oxo-l,2-di- hidroindol-(3Z)-ilidenometil]2,4-dimetil-lH-pirrol-3-ãcido carboxílico (2- dietilaminoetil)amida) (C22 H27 F N4 02); Squalamina (Colestano-7,24- diol, 3-[[3-[(4-aminobutil)aminopropil]amÍno]-, 24-(hidrogênio sulfato), (3.beta., 5.alfa., 7.alfa.)-) (C34 H65 N3 05 S); Eriochrome Black T; AGM 1470 (ácido carbâmico, (cloroacetil)-, 5-metoxi-4-[2-metil-3-(3-metil-2- butenil)oxiranil]-l-oxaespiro[2,5] oct-6-il éster, [3R-[3 alfa, 4 alfa (2R,3R), 5 beta, 6 beta]]) (C19 H28 Cl N 06); AZD 9935; BIBF 1.000; AZD 2171; ABT 828; KS-interleucina-2; uteroglobina; A 6; NSC 639366 (l-[3-(dietilamino)-2-hidroxipropilamino]-4-(oxiran-2-ilmetilamino) an- traquinona fumerato) (C24 H29 N3 04. C4 H4 04); ISV 616; proteínas de fusão anti-ED-B; HUI 77; Troponina I; anticorpo monoclonal BC-1; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 (3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2(E)-ácido prope- noico (3R, 4S, 5S, 6R)-4-[2(R)-metil-3(R)-3(R)-(3-metil-2-butenil)oxiran- 2-il]-5-metoxi-1 -oxaespiro[2.5]oct-6-il éster) (C28 H38 08); IMC-ICl 1; aaATIII; SC 7; CM 101; Angiocol; Kringle 5; CKD 732 (ácido 3-[4-[2- (dimetilamino)etoxi]fenil]-2(E)-propenoico) (C29 H41 N 06); U 995; Canstatin; SQ 885; CT 2584 (1-[1 l-(dodecilamino)-10-hidroxiundecil]- 3,7-dimetilxantina) (C30 H55 N5 03); Salmosin; EMAP II; TX 1920 (l-(4- metilpiperazino)-2-(2-nitro-lH-l-imidazoil)-l-etanona) (CIO H15 N5 03); inibidor Alfa-v Beta-x; CHIR 11509 (N-(l-propinil)glicil-[N-(2-naftil)]glicil- [N-(carbamoilmetil)]glicina bis(4-metoxifenil)metilamida) (C36 H37 N5 06); BST 2002; BST 2001; B 0829; FR 111142; 4,5-dihidroxi-2(E)-ácido hexenoico (3R, 4S, 5S, 6R)-4-[l(R), 2(R)-epoxi-l,5-dimetil-4-hexenil]-5- metoxi-1 -oxaespiro[2.5]octan~6-il éster (C22 H34 07) e inibidores de quinase incluindo, mas, sem limitação, N-(4-clorofenil)-4-4(4-piridinil- metil)- 1-ftalazinamina; 4-[4-[[[[4-cloro-3-(trifluormetil)fenil]amino]car- bonil]amino]fenoxi]-N-metil-2-piridinacarboxamida; N-[2(dietilamino)etil] -5-[(5-fluor-l,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-ilideno)metU]-2,4-dimetil-lH- pirrol-3-carboxamida; 3-[(4-bromo-2,6-diíluorfenil)metoxi]-5~[[[[4-(l-pir- rolidinil)butil]amino]carbonil]amino]-4-isotiazol carboxamida; N-(4-bro- mo-2-fluorfenil)-6-metoxi-7-[(l-metil-4-piperidinil)metoxi]-4-quinazoli- amina; 3-[5,6,7,13-tetrahidro-9-[(l-metiletoxi)metil]-5-oxo-12H-indeno [2,l-a]pirrolo[3,4c]carbazol-12-il]propil éster Ν,Ν-dimetil-glicina; N-[5- [[[5-(l,l-dimetiletil)-2-oxazolil]metil]tio]-2-tÍazolil]-4-piperidinacarboxa- mida; N-[3-cloro-4-[(3-fluorfenil)metoxi]fenil]-6-[5-[[[2-(metilsulfonil)etil] amino]metil]-2-furanil]-4-quinazoliamina; 4-[(4-metil-l-piperazinil)me- til]-N-[4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2^ N-(3-
cloro-4-fluorfenil)-7-metoxi-6-[3-(4-morfolinil)propoxi]-4-quinazolinami- na; N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolinamina; N-(3~ ((((2R)~l-metil-2-pirrolidinil)m
zol-5-il)fenil)amino-3-piridinacarboxamida; 2-(((4-fluorfenil)metil)amino)- N-(3-((((2R)-l-metil-2-pirrolidM^
nacarboxamida; N-[3-(Azetidin-3-ilmetoxi)-5-trifluormetil-fenil]-2-(4- fluor-benzilamino)-nicotinamida; 6-fluor-N-(4-(l-metiletil)fenil)-2-((4-piri- dinilmetil)amino)-N-(3-(((2S)-2-pirrolidÍnilmetil)oxi)-5-(trifluormetil)fe 3-piridinacarboxamida; N-(3-(l,l-dimetiletil)-lH-pirazol-5-il)-2-((4-piri- dinilmetil)amino)-3-piridinacarboxamida; N-(3,3-dimetil-2,3dihidro-l- benzofuran-6-il)-2-((4-piridinilmetil)amino)-3-piridinacarboxamida; N-(3- ((((2S)-l-metil-2-pirrolidinil)oxi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((4-piridinilme amino)-; 2-((4-piridinilmetil)amino)-^
piridinacarboxamida; N-(3,3-dimetil-2,3-dihidro-lH~indol-6-iI); N-(4- (pentafluoretil)-3-(((2S)-2-pirrolidinilm
amino)-3-piridinacarboxamida; N-(3-((3-azetidinilmetoxi)oxi)-5-(triíluor- metil)fenil)-2-((4-piridinilmetÍl)amino)-3-piridinacarboxamida; N-(3-(4~ piperidiniloxi)-5-(trifluormetil)fenil)-2-((2-(3-piridinil)etiy nacarboxamida; N-(4,4-dimetil-l,2,3,4-tetrahidro-isoquinilin-7-il)--2-(lH- indazol-6-ilamino)-nicotinamida; 2-(lH-indazol-6-ilamina)-N-[3-(l-metil· pirrolidin-2-ilmetoxi)-5-trifluormetil-fenil]-nicotinamida; N-[l-(2-dimetil- ajnino-acetil)-3,3-dimetil-2,3-diMdro-lH^
amina)-nicotinamida; 2-(lH-indazol-6-ilamina)-N-[3-(pirrolidin-2-ilmeto- xi)-5-triíluormetil-fenÍl]-nicotinamida; N-(l-acetil-3,3-dimetil-2,3-dihi- dro-lH-indol-6-U)-2-(lH-indazol-6-ilamina)-nicotínamida; N-(4,4-dimetil- 1-oxo-1,2,3,4-tetrahidro-isoqmnolm^
tinamida; N-[4-(terc-butíl)-3-(3-piperidilpropil)fenil][2-(lH-inda2»l-6-ila- mina)(3-piridil)]carboxamida; N-[5-(terc-butil)isoxazol-3-il][ 2-(lH-inda- zol-6-ilamina)(3-pirid.il)]carboxamida e N-[4-(terc-butil)fenil][ 2-(lH-in- dazol-6-ilamina)(3-piridil)]carboxamida e inibidores de quinase revelados nas Patentes US 6.258.812; US 6.235.764; US 6.630.500; US 6.515.004; US 6.713.485; US 5.521.184; US 5.770.599; US 5.747.498; US 5.990.141; Aplicação de Patente Americana US2003/0105091 e publicação PCT W001/37820; WOOl/32651; W002/68406; W002/66470; W002/55501; W004/05279; W004/07481; W004/07458; W004/09784; W002/59110; W099/45009; W098/35958; W000/59509; W099/61422; WOOO/12089 e WO00/02871, cada uma das publicações são aqui incorporadas por
referência para quaisquer propósitos.
A TR-2 é expressa em uma variedade de células, incluindo fígado, cérebro, rim, cólon, seio, pulmão, baço, timo, linfócitos do sangue periférico, pâncreas, próstata, testículos, ovário, útero e vários tecidos ao longo do trato gastrointestinal. Cânceres relacionados ao TR- 2 exemplificativos incluem, mas, sem limitação, câncer do fígado, câncer do cérebro, câncer renal, câncer do seio, câncer do pâncreas, câncer colo-retal, câncer do pulmão (câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas), câncer de baço, câncer do &2Ά timo ou células do sangue (por exemplo, leucemia), câncer de próstata, câncer testicular, câncer do ovário, câncer do útero, carcinoma gástrico, carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, melanoma e linfo- ma.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 pode ser
usado sozinho ou com pelo menos um agente terapêutico adicional para o tratamento do câncer. Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 é usado em conjunto com uma quantidade efetiva terapeuticamente de um agente terapêutico adicional. Agentes terapêuticos exemplificativos que podem ser administrados com um anticorpo anti-TR-2 incluem, mas, sem limitação, um membro da família das geldanamicina de antibióticos anisamicina; um Pro-HGF; NK-2; um inibidor de peptídeo c- Met; um antagonista de Grb2 Src homologia 2; um modulador Gab 1; Src dominante-negativo; um inibidor de von-Hippel-Landau; incluindo, mas, sem limitação,, wortmannin; inibidores de quinase P13, outras terapias anti-receptor; anti-EGFr; um inibidor de COX-2; Celebrex®, celecoxib, Vioxx®, rofecoxib; um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um modulador VEGF. um fator de crescimento de fibroblasto (FGF), um modulador FGF, um fator de crescimento epidérmico (EGF); um modulador EGF; um fator de crescimento de queratinócito (KGF), um molécula relacionada ao KGF, um modulador KGF e uma matriz de modulador de metaloproteinase (MMP).
Em certas modalidades, o anticorpo anti-TR-2 é usado com agentes terapêuticos particulares para tratar vários cânceres. Em certas modalidades, em vista das condições e do nível desejado de tratamento, dois, três ou mais agentes podem ser administrados, em que os compos- tos são usado juntos com um ou mais outros componentes, o composto e o um ou outros componentes podem ser administrados juntos, separadamente ou seqüencialmente (por exemplo, em uma forma farmacêutica). Em certas modalidades, tais agentes podem ser forneci- 131/1S8 dos juntos por inclusão na mesma formulação. Em certas modalidades, tais agentes e um anticorpo anti-TR-2 podem ser fornecidos juntos por inclusão na mesma formulação. Em certas modalidades, tais agentes podem ser formulados e fornecidos juntos por inclusão em um kit de tratamento. Em certas modalidades, tais agentes e um anticorpo anti- TR-2 podem ser formulados separadamente e fornecidos juntos por inclusão em um kit de tratamento. Em certas modalidades, tais agentes podem ser fornecidos separadamente.
Em certas modalidades, quando administrados por terapia de gene, os genes que codificam agentes de proteína e/ou um anticorpo anti-TR-2 podem ser incluído no mesmo vetor. Em certas modalidades, os genes que codificam agentes de proteína e/ou um anticorpo anti-TR- 2 podem estar sob o controle da mesma região promotora. Em certas modalidades, os genes que codificam agentes de proteína e/ou um anticorpo anti-TR-2 podem estar em vetores separados.
Em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser u- sados no tratamento de animais não humanos, tais como animais de estimação (cães, gatos, pássaros, primatas, etc.) e animais domésticos de fazenda (cavalos, gado, ovelhas, porcos, pássaros, etc.). Em certas tais situações, uma dose apropriada pode ser determinada de acordo com o peso do corpo do animal. Por exemplo, em certas modalidades, uma dose de 0,2-1 mg/kg pode ser usada. Em certas modalidades, a dose pode ser determinada de acordo com a área superficial do animal, uma dose exemplar variando de 0,1 a 20 mg/in2 ou de 5 a 12 mg/m2. Para pequenos animais, tais como cachorros ou gatos, em certas modalidades, uma dose apropriada é 0,4 mg/kg. Em certas modalida- des, anticorpos anti-TR-2 são administrados por injeção ou outra rota apropriada uma ou mais vezes por semana até que a condição do animal seja melhorada ou eles pode ser administrados indefinidamente.
Fica compreendido que a resposta para pacientes individu 132/188
ais para as medicações anteriormente citadas ou terapias de combina- ção podem variar e uma combinação eficaz apropriada das drogas para cada paciente pode ser determinada por seu médico dele ou dela.
O macaco cinomolgus fornece um modelo útil para certas doenças. Doenças exemplificativas incluem, mas, sem limitação, sín- drome de rejeição em transplantes e doença como doença do intestino inflamado. Quando testando a eficácia de um Mab humano em modelo de doença humano de macaco cinomolgus, em certas modalidades, é útil determinar se o Mab anti-TR-2 se liga ao TR-2 em humanos e macacos cinomolgus em um nível comparável.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 pode ser parte de uma molécula conjugada que compreende todo ou parte do anticorpo anti-TR-2 e um agente citotóxico. O termo "agente citotóxico" refere-se a uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou causas da morte ou destruição das células. O termo inclui, mas não está limitado a, isótopos radioativos (por exemplo, I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas ativas enzimatica- mente de origem de bactérias, fungos, plantas e animais ou fragmentos das mesmas. Agentes citotóxicos exemplificativos incluem, mas, sem limitação, Adriamicina, Doxorubicina, 5-Fluor uracila, Arabinose citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busul- fan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposida, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vin- creistina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposida, Daunomicina, Carmi- nomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas, Malfalan e outros nitrogênios mostarda relacionados.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-TR-2 pode ser parte de uma molécula conjugada que compreende todo ou parte do anticorpo anti-TR-2 e uma pró-droga. Em certas modalidades, o termo "pró-droga" refere-se a um precursor ou forma derivada de uma subs- tância ativa farmaceuticamente. Em certas modalidades, uma pró-droga é menos citotóxica às células comparada à droga mãe e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida em na forma mãe citotóxica mais ativa. Pró-drogas exemplificativas incluem, mas, sem limitação, pró- drogas contendo fosfato, pró-drogas contendo tiofosfato, pró-drogas contendo sulfato, pró-drogas contendo peptídeos, pró-drogas modifica- das D-aminoácidos, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas contendo beta- lactama, pró-drogas contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituí- das e pró-drogas contendo fenilacetamida substituídas, pró-drogas 5- fluorcitosinas e outras 5-fluoruridinas as quais podem ser convertidas em uma droga livre citotóxica mais ativa. Exemplos de drogas citotóxi- cas que podem ser derivadas em uma forma de pró-droga incluem, mas, sem limitação, aqueles agentes citotóxicos descritos acima. Ver, por exemplo, a Patente US 6.702.705.
Em certas modalidades, conjugados de anticorpos funcio- nam por ter a parte anticorpo da molécula alvo da parte citotóxica ou parte pró-droga da molécula para uma população específica de células no paciente. No caso de anticorpos anti-TR-2, tais moléculas conjugadas podem ser usadas, por exemplo, em certas modalidades, para destruir células se proliferando anormalmente, tais como células cancerígenas.
Em certas modalidades, métodos de tratar um paciente que compreende a administração de uma quantidade efetiva terapeutica- mente de um anticorpo anti-TR-2 são fornecidos. Em certas modalida- des, métodos de tratar um paciente que compreende a administração de uma quantidade efetiva terapeuticamente de um conjugado de anticorpo são fornecidos. Em certas modalidades, um anticorpo é utilizado em conjunto com uma quantidade efetiva terapeuticamente de pelo menos um agente terapêutico adicional, como discutido acima.
Como discutido acima, em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser administrados concorrentemente com uma ou mais outras drogas que são administradas ao mesmo paciente, cada droga sendo administrada de acordo com um regime apropriado para aquele medicamento. Esse tratamento engloba pré-tratamento, tratamento simultâneo, tratamento seqüencial e regimes alternativos. Exemplos adicionais dessas drogas incluem, mas, sem limitação, antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteróides, antagonistas de citocinas inflamatórias, DMARDs, anti-inflamatórios não esteroidais, quimiotera- pêuticos, inibidores de angiogênese e estimuladores de angiogênese.
Em certas modalidades, várias desordens médicas são tra- tadas com anticorpos anti-TR-2 em combinação com outro estimulador de apoptose. Por exemplo, em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser administrados em uma composição que também contém um composto que estimula apoptose de uma ou mais células. Em certas modalidades, o anticorpo anti-TR-2 e estimuladores de apoptose podem ser administrados como composições separadas e estas podem ser administradas pela mesma rota ou rota diferente.
Em certas modalidades, composições farmacêuticas são for- necidas que compreende uma quantidade efetiva farmaceuticamente de um anticorpo junto com um diluente, veículo, solubilizante, emulsifican- te, preservativo e/ou adjuvante aceitável farmaceuticamente.
Em certas modalidades, composições farmacêuticas são for- necidas que compreende uma quantidade efetiva farmaceuticamente de um anticorpo e uma quantidade efetiva terapeuticamente de pelo menos um agente terapêutico adicional, junto com um diluente, veículo, solubilizante, emulsificante, preservativo e/ou adjuvante aceitável farmaceuticamente.
Em certas modalidades, materiais de formulação aceitáveis preferivelmente são não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas. Em certas modalidades, anticorpos da presente invenção são fornecidos em uma formulação não tampão como revelado no PCT/US06/22599 depositado em 8 de junho de 2006, o qual é incorporado por referência aqui neste documento para qualquer propósito.
Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsor- ção ou penetração da composição. Em certas modalidades, materiais de formulação apropriados incluem, mas, sem limitação, aminoãcidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); anti-microbiais; anti-oxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou sulfito de hidrogênio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes espessantes (tais como manitol e glicina); agentes quelantes (tal como ácido etilenodiamina tetra acético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirro- lidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-cliclodextrina); enchi- mentos; monossacarídeos; dissacarídeos e outros carboidratos (tais como glucose, manose e dextrinas); proteínas (tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsificantes; polímeros hidrofilicos (tal como polivinilpirrolidona); polipeptídios de baixo peso molecular; contra-íons de formação de sal (tal como sódio); preservativos (tal como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetil, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propileno glicol ou polieti- Ieno glicol); álcool de açúcares (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; agentes surfactantes ou umidificantes (tais como pluroni- cos, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tais como polisorbato 20, polisorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes aumentadores de estabilidade (tais como sucrose ou sorbitol); agentes aumentadores de tonicidade (tais como haletos de metal alcali- no, preferivelmente cloreto de sódio ou potássio, manitol, sorbitol); veículos carreadores; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuti- cos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed, A.R. Gennaro, ed. Mack Publishing Company (1990).
Em certas modalidades, um anticorpo e/ou uma molécula terapêutica adicional é ligada a um veículo de extensão de meia-vida conhecido na técnica. Esses veículos incluem, mas, sem limitação, o domínio Fe, polietileno glicol e dextrana. Tais veículos estão descritos, por exemplo, na Patente US 6.660.843 e Aplicação PCT publicada W099/25044.
Em certas modalidades, a composição farmacêutica ótima será determinada por um técnico no assunto dependendo, por exemplo, da rota de administração pretendida, tipo de entrega e dosagem deseja- da. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Em certas modalidades, tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa in vivo de liberação e taxa in vivo de "clearana? dos anticorpos.
Em certas modalidades, o veículo ou carreador primário em uma composição farmacêutica pode ser tanto aquoso quanto não aquoso na natureza. Por exemplo, em certas modalidades, um veículo ou carreador apropriado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Em certas modalidades, solução salina tampão neutra ou salina misturada com albumina do soro são ainda veículos exemplifica- tivos. Em certas modalidades, composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de cerca de pH de 7,0-8,5 ou tampão de acetato de cerca de pH de 4,0-5,5, as quais podem ainda incluir sorbitol ou um substituto apropriado do mesmo. Em certas modalidades, uma composição farma- áMo
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cêutica é uma formulação aquosa ou líquida que compreende um tampão de acetato de cerca de pH de 4,0-5,5, um poliol (poliálcool) e opcionalmente um surfactante, em que a composição não compreende um sal, por exemplo, cloreto de sódio e em que a composição é isotônica para o paciente. Poliois exemplificativos incluem, mas, sem limitação, sucrose, glucose, sorbitol e manitol. Um surfactante exemplar inclui, mas não está limitado a, polisorbato. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica é uma formulação aquosa ou líquida que compreende um tampão de acetato de cerca de pH de 5,0, sorbitol e um polisorbato, em que a composição não compreende um sal, por exemplo, cloreto de sódio, e em que a composição é isotônica para o paciente. Certas composições exemplifícativas são encontradas, por exemplo, na Patente US 6.171.586. Carreadores farmacêuticos adicionais incluem, mas, sem limitação, óleos, incluindo óleos de petróleo, óleo animal, óleo vegetal, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de girassol e semelhantes. Em certas modalidades, soluções de dextrose e glicerol aquosas podem também ser empregadas como veículos líquidos, parti- cularmente para soluções injetáveis. Em certas modalidades, uma composição que compreende um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser preparada para armazenagem pela mistura da composição selecionada tendo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceuti- cal Sciences3 supra) na forma de uma torta liofilizada ou uma solução aquosa. Ainda, em certas modalidades, uma composição que compreen- de um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulada como um Hofilizado usando soluções excipientes apropriadas (por exemplo, sucrose) como diluentes.
Em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 são adminis- trados na forma de uma composição aceitável fisiologicamente que compreende proteína recombinante purificada em conjunto com veícu- los, excipientes ou diluentes aceitáveis fisiologicamente. Em certas modalidades, tais veículos são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas. Em certas modalidades, o preparo dessas composições pode envolver a combinação de anticorpos anti-TR-2 com tampões, antioxidantes tais como o ácido ascórbico, polipeptídios de baixo peso molecular (tais como aqueles tendo menos que 10 aminoáci- dos), proteínas, aminoácidos, carboidratos tais como glucose, sucrose ou dextrinas, agentes quelantes tais como o EDTA, glutationa e/ou outros estabilizadores e excipientes. Em certas modalidades, dosagens apropriadas são determinadas em testes de dosagem padrões e podem variar de acordo com a rota de administração escolhida. Em certas modalidades, de acordo com os padrões apropriados da indústria, preservativos podem também ser adicionados, os quais incluem, mas, sem limitação, álcool benzílico. Em certas modalidades, a quantidade e freqüência da administração podem ser determinadas baseadas em tais fatores tais como a natureza e severidade da doença sendo tratada, a resposta desejada, a idade e condição do paciente e assim por diante.
Em certas modalidades, composições farmacêuticas podem ser selecionadas para entrega parenteral. A preparação de certas tais composições aceitáveis farmaceuticamente está dentro do estado da técnica.
Em certas modalidades, os componentes da formulação es- tão presentes em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Em certas modalidades, tampões são usados para manter a composição no pH fisiológico ou pH levemente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.
Em certas modalidades, quando a administração parenteral é contemplada, uma composição terapêutica pode estar na forma de uma solução aquosa aceitável parenteralmente, livre de pirogênio que compreende o anticorpo desejado, com ou sem agentes terapêuticos ψ
adicionais, em um veículo aceitável farmaceuticamente. Em certas modalidades, um veículo para injeção parenteral é água destilada esterilizada na qual o anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, é formulado como uma solução isotônica, esterili- zada, propriamente preservada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como micro-esferas injetáveis, partículas que sofrem bio-erosão, com- postos poliméricos (tais como um ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), contas ou lipossomas, que podem fornecer a liberação controlada ou sustentada do produto o qual pode então ser entregue via uma injeção como depósito. Em certas modalidades, ácido hialurônico pode também ser usado e pode ter o efeito de promover duração sustentada na circulação. Em certas modalidades, dispositivos de entrega de droga implantáveis podem ser usados para introduzir a molécula desejada. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode
se formulada para inalação. Em certas modalidades, um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulado como um pó seco para inalação. Em certas modalidades, um solução de inalação que compreende um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulada com um propelente para entrega por aerosol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é ainda descrita na publicação PCT W094/20069, a qual descreve a entrega pulmonar de proteínas modificadas quimicamente. Em certas modalidades, é contemplado que as formulações
podem ser administradas oralmente. Em certas modalidades, um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, que é administrado deste modo pode ser formulado com ou sem aqueles veículos usualmente utilizados na composição das formas de dosagens sólidas tais como tabletes e cápsulas. Em certas modalidades, pode ser CW2> projetada para liberar a parte ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degrada- ção pré-sistêmica é minimizada. Em certas modalidades, pelo menos um agente adicional pode ser incluído para facilitar a absorção do anticorpo e/ou agentes terapêuticos adicionais. Em certas modalidades, diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrifican- tes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de tabletes e/ou ligantes podem também ser empregados.
Em certas modalidades, uma composição farmacêutica pode envolver uma quantidade efetiva de anticorpos, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, em uma mistura com excipientes não tóxicos os quais são apropriados para a manufatura de tabletes. Em certas modalidades, pela dissolução dos tabletes em água esterilizada ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas em uma forma de dosagem única. Excipientes apropriados incluem, mas, sem limitação, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; e agentes ligantes, tais como amido, gelatina e goma arábica; e agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico e talco. Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para
aqueles versados na técnica, incluindo formulações envolvendo anticor- pos, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, em formulações de liberação sustentadas ou controladas. Em certas formulações de liberação sustentadas ou controladas exemplificativas estão incluídas, mas, sem limitação, lipossomas como veículo, micro- partículas que sofrem bio-erosão, contas porosas e injeções como depósitos. Certas técnicas exemplificativas para preparar certas formu- lações são conhecidas por aqueles versados na técnica. Ver por exemplo, a publicação PCT W093/15722, a qual descreve a liberação controlada de micro-partículas poliméricas porosas para a entrega de composições Φ
farmacêuticas. Em certas modalidades, preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semi-permeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou micro-cãpsulas. Matrizes de liberação sustentada incluem, mas, sem limitação, poliéste- res, hidrogéis, polilactídeos (Patentes US 3.773.919 e EP 058.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman e colaboradores, Biopolymersi 22: 547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil- metacrilato) (Langer e colaboradores, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167- 277 (1981) e Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etileno vinila (Langer e colaboradores, supra) e ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). Em certas modalidades, composições de liberação susten- tadas podem também incluir lipossomas, as quais podem ser prepara- das, em certas modalidades, por qualquer dos diversos métodos conhe- cidos na técnica. Ver, por exemplo, Eppstein e colaboradores, Proc. NatL Acad. Sci. USA7 82: 3688-3692 (1985); EP 036.676; EP 088.046 e EP 143.949.
Em certas modalidades, a composição farmacêutica para ser usada para administração in vivo é estéril. Em certas modalidades, a composição farmacêutica para ser usada para administração in vivo é tornada estéril pela filtração através de membranas de filtração estéreis. Em certas modalidades, em que a composição é liofilizada, a esteriliza- ção usando membranas de filtração estéreis pode ser efetuada antes ou depois da liofilização e reconstituição. Em certas modalidades, a compo- sição para administração parenteral pode ser armazenada na forma liofilizada ou em uma solução. Em certas modalidades, composições parenterais geralmente são colocadas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intrave- nosa tendo um lacre que pode ser rompido por uma agulha de injeção hipodérmica.
Em certas modalidades, após a composição farmacêutica ter «á/tó Φ
sido formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofxlizado. Em certas modalidades, tais formulações podem ser armaze- nadas seja na forma pronta para o uso ou em uma forma (por exemplo, uma forma liofilizada) que é reconstituída antes da administração.
Em certas modalidades, kits para a produção de uma uni- dade de administração de dose única são fornecidos. Em certas modali- dades, cada um dos kits pode conter um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Em certas modalidades, kits contendo seringas previamente enchidas de câmara única ou multi-câmaras (por exemplo, seringas líquidas e Iio- seringas) estão incluídas.
Em certas modalidades, a quantidade efetiva de uma com- posição farmacêutica que compreende um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, para ser empregada terapeuti- camente dependerá, por exemplo, do contexto terapêutico e objetivos. Uma pessoa versada na técnica apreciará que os níveis de dosagem apropriados para tratamento, de acordo com certas modalidades, variarão assim dependendo, em parte, da molécula sendo entregue, a indicação para qual o anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, está sendo usado, a rota de administração e o tamanho (peso do corpo, superfície do corpo ou tamanho do órgão) e/ou condição (a idade e saúde geral) do paciente. Em certas modalidades, o médico pode titular a dosagem e modificar a rota de administração para obter o efeito terapêutico ótimo. Em certas modalidades, a dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 ug/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em certas modalida- des, a dosagem pode variar de 0,1 μg/kg até cerca de 100 mg/kg ou 1 Mg/kg até cerca de 100 mg/kg ou 5 Mg/kg até cerca de 100 mg/kg ou 0,1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg. SM(p ψ
Em certas modalidades, a freqüência da dosagem levará em consideração os parâmetros farmacocinéticos do anticorpo e/ou quais- quer agentes terapêuticos adicionais na formulação usada. Em certas modalidades, um médico administrará a composição até uma dosagem seja atingida que alcance o efeito desejado. Em certas modalidades, a composição pode desta forma ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (as quais podem conter ou não a mesma quantidade da molécula desejada) durante o tempo ou como uma infusão contínua via um dispositivo de implantação ou cateter. Certos métodos de ainda refinar a dosagem apropriada estão dentro daqueles na técnica. Em certas modalidades, dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso apropriado dos dados de dose-resposta.
Em certas modalidades, a rota de administração da compo- sição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exem- pio, oralmente, através de injeção por rotas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscu- lar, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada ou por dispositivos de implantação.
Como discutido acima, em várias modalidades, qualquer ro- ta de administração eficaz pode ser usada para administrar anticorpos anti-TR-2. Se injetados, em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser administrados, por exemplo, via rota intra-articular, intrave- nosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal, intracranial, intra- nasal, inalação ou subcutânea por injeção em dose única de uma grande quantidade ou por infusão contínua. Métodos de administração exemplificativos incluem, mas, sem limitação, liberação sustentada para implantes, inalação por aerosol, colírios, preparações orais, incluindo pílulas, xaropes, pastilhas e goma de mascar e preparações tópicas tais como loções, géis, sprays, ungüentos e outras técnicas apropriadas. Em certas modalidades, a administração por inalação é be- Ψ
néfica quando tratando doenças associadas com desordens pulmonares. Em certas modalidades, anticorpos anti-TR-2 podem ser administrados pelo implante de células de cultura que expressam os anticorpos. Em certas modalidades, as próprias células do paciente são induzidas a produzir por transfecção in vivo ou ex vivo com um ou mais vetores que codificam um anticorpo anti-TR-2. Em certas modalidades, este vetor pode ser introduzido nas células do paciente, por exemplo, pela injeção de DNA descoberto ou DNA encapsulado por lipossoma que codifica um anticorpo anti-TR-2 ou por outros métodos de transfecção. Quando anticorpos anti-TR-2 são administrados em combinação com um ou mais outros compostos ativos biologicamente, em certas modalidades, eles podem ser administrados pela mesma rota ou rotas diferentes e podem ser administrados juntos, separadamente ou seqüencialmente.
Em certas modalidades, a composição pode ser administra- is da localmente via implante de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em certas modalidades, quando um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão apropriado e a entrega da molécula desejada pode ser via difusão, dose única em grande quantidade de liberação temporal ou administração contínua.
Em certas modalidades, pode ser desejável usar uma com- posição farmacêutica que compreende um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, de um modo ex vivo. Em tais modalidades, células, tecidos e/ou órgãos que tenham sido removidos do paciente são expostos a uma composição farmacêutica que compre- ende um anticorpo, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, após o que as células, tecidos e/ou órgãos são subseqüente- mente implantados de volta no paciente. Em certas modalidades, um anticorpo e quaisquer agentes terapêuticos adicionais podem ser entregues por implante de certas células que tenham sido geneticamente modificadas por engenharia, usando métodos tais como aqueles descritos aqui neste documento, para expressar e secretar os polipeptídios. Em certas modalidades, tais células podem ser células de animais ou humanos e podem ser autólo- gas, heterólogas ou xenogeneicas. Em certas modalidades, as células podem ser imortalizadas. Em certas modalidades, de forma a diminuir a chance de uma resposta imunológica, as células podem estar encapsu- ladas para evitar infiltração dos tecidos vizinhos. Em certas modalida- des, os materiais de encapsulamento são tipicamente recipientes ou membranas poliméricas semi-permeáveis, biocompatíveis, que permitem a liberação do(s) produto(s) da proteína, mas previnem a destruição das células pelo sistema imune do paciente ou por outros fatores detrimen- tais a partir dos tecidos vizinhos.
Exemplos Exemplo 1
Produção de Certos Anticorpos Monoclonais Humanos
Anticorpos anti-TR-2 humanos foram produzidos de um dos dois modos. Camundongos transgénicos expressando genes de imuno- globulina de humanos (Xenomouse®) foram expostos ao TR-2 de huma- nos. Certos anticorpos monoclonais anti-TR-2 de humanos foram produzidos a partir daqueles camundongos usando técnicas de hibrido- ma. Certos outros anticorpos monoclonais anti-TR-2 de humanos foram produzidos a partir daqueles camundongos usando tecnologia XenoMax, a qual incorpora a técnica do método do anticorpo do linfócito selecio- nado (eSLAMw) (ver, por exemplo, a Patente US 5.627.052 e Babcook e
colaboradores, Proc. Natl Acad. Sei. USA 93: 7843-7848 (1996)).
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A metodologia usada para produzir anticorpos monoclonais anti-TR-2 de humanos em camundongos transgénicos expressando genes de imunoglobulina de humanos foi como a seguir. Cinco grupos £Η4
de camundongos foram imunizados com TR-2 humano recombinante com um rótulo de hexahistidina C-terminal (TR-2-His) (seqüência de aminoácido madura
ALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYS THWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCR KCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGT PASRSGSSHHHHHH (SEQ ID NO: 140)) (Genbank Reference Number NM-003842), como mostrado na Figura 1. Os camundongos do grupo um, grupo três, grupo quatro e grupo cinco foram modificados por engenharia para produzir anticorpos do isotipo IgG2 (Figura 2). Os camundongos do grupo dois foram modificados por engenharia para produzir anticorpos do isotipo IgG4 (Figura 2). O grupo um incluiu 7 camundongos, o grupo dois incluiu 8 camundongos, o grupo três incluiu 8 camundongos, o grupo quatro incluiu 10 camundongos e o grupo cinco incluiu 5 camundongos. Os camundongos no grupo um, grupo dois e grupo três foram imunizados por injeção de TR-2-His nas almofadas dos pés (10 μg por injeção), enquanto os camundongos do grupo quatro e grupo cinco foram imunizados intraperitonealmente (10 μg por injeção) com TR-2-His. No dia 0, 10 μg de antígeno foi adminis- trada pela rota descrita. Em intervalos especificados, injeções de reforço foram administradas aos camundongos. O grupo um de camundongos teve nove injeções de reforço, nos dias 5, 11, 14, 18, 24, 28, 34, 42 e 46. O grupo dois e grupo três de camundongos tiveram 7 injeções de reforço; aquelas para o grupo 2 foram nos dias 3, 7, 10, 14, 17, 24 e 27 e aquelas para o grupo três foram nos dias 5, 8, 15, 21, 26, 30 e 33. O grupo quatro e grupo cinco de camundongos tiveram 5 injeções de reforço, nos dias 14, 28, 42, 56 e 72. Cada primeira injeção e cada injeção de reforço continha 10 μg de TR-2-His com um adjuvante, seja Titermax Gold (Grupos um, dois e três), alum gel (Grupos um, dois e três), Adjuvante de Freund Completo (CFA) (Grupos quatro e cinco),
Adjuvante de Freund Incompleto (IFA) (Grupos quatro e cinco) ou solução salina tampão de fosfato de Dulbecco (D-PBS) (Grupos um, dois, três, quatro e cinco) (ver Figura 1). Camundongos foram sangrados após três injeções (grupos quatro e cinco), após quatro injeções (grupos um, dois e três), após seis injeções (grupos um e dois) e após dez injeções (grupo um). A reatividade de cada amostra de sangue para o TR-2-His foi acessada pelo ELISA, como mostrado na Figura 2.
O teste ELISA foi efetuado como se segue. Foram revestidas placas multi-poços com TR-2-His solúvel (0,5 Mg/mL) por adsorção passiva durante a noite a 4°C. Os poços revestidos foram lavados e bloqueados por 30 minutos com leite. Dez μL de cada soro de camun- dongo foi combinado com 40 mL de leite e incubado nos poços de diferentes placas por 1 hora, 1,25 horas ou 2 horas. As placas foram lavadas cinco vezes com água. As placas foram, então, incubadas com um anticorpo peroxidase conjugado de rãbano silvestre Fc-específlco IgG anti-humano de bode (Pierce) a uma concentração final de 1 Mg/mL por 1 hora na temperatura ambiente. As placas foram lavadas cinco vezes com água. As placas foram incubadas com substrato azul K (Neogen) por 30 minutos. Controles negativos incluíram poços branco sem TR-2- His e poços incluindo TR-2-His, mas incubados com soros G2 não testados esperados não terem anticorpos anti-TR-2.
As metodologias usadas para produzir anticorpos monoclo- nais anti-TR-2 humanos foram como a seguir. Para a tecnologia Xeno- Max, células CD19+B foram isoladas a partir de camundongos transgê- nicos hiper-imunes que foram colhidos no dia 37 (camundongo M712-7 do grupo três) ou dia 76 (camundongo M564-1 do grupo quatro e camundongos M564-3, M564-5 e M563-5 do grupo cinco após o início da imunização. As células B foram postas em cultura por 1 semana para permitir a expansão delas e conseqüente diferenciação nas células do plasma. Os sobrenadantes contendo o anticorpo secretado foram ψ
guardados para análise posterior e as células do plasma em cada poço foram resfriadas a -80 graus Celsius em média contendo 10% DMSO e 90% FCS. Para a tecnologia hibridoma, as células dos camundongos transgênicos hiper-imunes restantes foram colhidas no dia 31, 37 ou 46 para análise posterior como mostrado na Figura 1.
Para a tecnologia XenoMax, sobrenadantes de culturas de célula B foram testadas pelo ELISA quanto à presença de anticorpos para TR-2. Foram detectados anticorpos anti-TR-2 ao acessar a ligação para TR-2-His usando um reagente de detecção de anticorpo IgG anti- Humano como a seguir. Placas foram revestidas com TR-2-His solúvel (0,5 μg/ml) por adsorção passiva durante a noite a 4°C. Após lavagem das placas cinco vezes com água e bloqueio dos poços nas placas com leite por 30 minutos, 10 μίν de sobrenadante da cultura de célula de cada hibridoma individual foi combinado com 40 μΐ, de leite e incubado nos poços de diferentes placa por 1 hora, 1,25 horas ou 2 horas. As placas foram lavadas cinco vezes com água e incubadas com anticorpo (Pierce)-conjugado peroxidase de rábano silvestre Fc-específico IgG anti- humano de bode a uma concentração final de 0,1 μg/mL pro 1 hora na temperatura ambiente. Após lavagem das placas cinco vezes com água, as placas foram incubadas com substrato azul K (Neogen) por 30 minutos. Controles negativos incluíram poços em branco sem TR-2-His e poços usando soros G2 não testados esperados não terem anticorpos anti-TR-2. Amostras positivas foram testadas pelo ELISA uma segunda vez contra TR-2-His para confirmar a identidade das células produzindo anticorpos específicos para TR-2.
Os anticorpos reativos com TR-2, identificados acima, foram testados por suas habilidades de induzir a apoptose de células de melanoma WM-266 (ATCC Cat. No. CRL-1676) usando um teste de apoptose. Células WM-266 foram postas em cultura em uma placa de micro-titulação a uma densidade de 4500 células/poço em meio de ψ
cultura normal como recomendado pelo ATCC durante a noite. Para a cultura de células B, 20 mL de sobrenadante de cultura de célula B antígeno específica ou sobrenadante de cultura de célula B de controle foi adicionado a 180 μΐ, de mistura de meio de apoptose (meio de cultura de célula contendo 1 μg/mL de ciclo heximida (CHX) e 0,5% de soro de bezerro fetal (aFCSw)). O meio de cultura a partir das células WM-266 foi removido e a mistura do meio de anticorpo-apoptose foi adicionada à células uma linha a cada tempo. As células foram incubadas com o meio anticorpo-apoptose por 20 horas para permitir a apoptose de ocorrer. Corantes fluorescentes de ligação do DNA iodeto de propídio (Sigma) e Hoechst 33342 (Molecular Probes) foram adicionados a cada poço a uma concentração final de 0,5 Mg/mL e 2,5 Mg/ml, respectivamente. O Hoechst 33342 é permeável à membrana e assim rotula ambas as células vivas e mortas; iodeto de propídio não é permeável à membrana e assim rotula apenas células mortas. Após uma hora a 37°C, imagens de cada poço foram capturadas e analisadas quanto ao número total de células (ao acessar a quantidade de rótulo Hoechst) e número total de células mortas (ao acessar a quantidade de rótulo iodeto de propídio). A percentagem de apoptose foi determinada como (células positivas a iodeto de propídio/ células positivas a Hoechst) χ 100.
Para a tecnologia XenoMax, os anticorpos de diversos poços que mostraram a melhor indução de apoptose foram selecionados para resgate usando um teste de placa hemolítica. O TR-2-His foi biotinilado e revestido em células do sangue vermelhas de ovelha revestida com streptavidina. Células do plasma correspondendo a poços antígeno específicos foram descongeladas e incubadas com as células do sangue vermelhas revestidas com antígeno na presença de complemento e soro aumentado IgG anti-humano de porquinho da índia. Células do plasma produzindo anticorpos contra TR-2-His causaram às células do sangue vermelhas de ovelhas ao redor delas de sofrerem Iise e assim permitiram
a identificação das células do plasma antígeno específicas na mistura. Aquelas células do plasma foram isoladas por micro-manipulação de células únicas da mistura.
Após isolar as células do plasma únicas desejadas, o mRNA foi extraído daquelas células. Os mRNAs que codificam as seqüências variáveis de cadeia pesada e leve foram convertidos a cDNA e amplifica- dos por transcriptase reversa PCR usando iniciadors anti-senso degene- rados específicos para seqüências líderes e as regiões constantes do IgG2 humano e mRNA kapa humano. As seqüências iniciador são fornecidas na Tabela 2 abaixo: OO
ιη
Λ 4)
ί
o t-H co o l—l O S Q Seqüência do iniciador GTA GGT GCT GTC CT 3' (SEQ ID NO: 97) TGA GTT CCA CGA CA 3' (SEQ ID NO: 98) CTT CCA AGC CAC T 3' (SEQ ID NO: 99) CA (GA) GC ACT GTC A 3' (SEQ ID NO: 100) GTA GGT GCT GTC CTT GCT 3' (SEQ ID NO: 101) CTC TGT GAC ACT CTC CTG GGA 3' (SEQ ID NO: 102) GCT CTA GAT TGG AGG GCG TTA TCC ACC TTC CAC T 3' (SEQ ID NO: C ω GQ co 1 < 0 H- 1 O O H O % 0 S= 1 < O 0 1 < O O £ O O £ O IO IO IO IO LO LO LO LO Nome do iniciador AS-Ck RT AS-yCHl RT AS-C Lambda RT AS-C Lambda RTY AS-Ck externo AS-Ck meio AS-Ck interno com Xba I AS-Ck interno com Nhe I OO OO
CN IO
^o LO τ-Η ' GCT CCC GGG TAG AAG TCA 3' (SEQ ID NO: 105) AC(CT) AGT GTG GCC TTG TTG GCT T 3' (SEQ ID NO: 106) GCT CTA GAG GG(CT) GGG AAC AGA GTG AC 3' (SEQ ID NO: 107) ACGACA CCG TCA CCG GTT 3' (SEQ ID NO: 108) AAG TAG TCC TTG ACC AGG CAG CCC A 3' (SEQ ID NO: 109) GCT CTA GAG GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT Si (SEQ ID NO: 110) GCT CTA GAG CAG GGC GCC AGG GGG AAG A 3' (SEQ ID NO: 111) ATG AGG (CG)TC CC(CT) GCT CAG CT 3' (SEQ ID NO: 112) ATG GAA (AG)CC CCA GC(GT) CAG CTT 3' (SEQ ID NO: 113) ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC T 3' (SEQ ID NO: 114) GAA GAT CTC ACC ATG AGG (CG)TC CC(CT) GCT CAG CT(CT) CT 3' (SEQ ID NO: 1: GAA GAT CTC ACC ATG GAA (AG)CC CCA GC(GT) CAG CTT CTC TT 3' (SEQ ID NO: IO IO LO IO IO LO IO IO LO LO Λ LO LO AS-CL externo AS-CL meio AS-CL interno ASy-CH 1 externo ASy-CHl meio ASy-CH 1 interno com Xba I (G1 específico) ASy-CH 1 interno com Xba I , (G2, G3 e G4 específico) S-Vk 1&2 Líder externo S-Vk3 Líder externo S-Vk4 Líder externo S-Vk 1062 Líder interno com BgI II S-Vk3 Líder interno com BgI II
Φ SM CO CO
CO LO CAC CAT GGA CAT ACT TTG (CT)TC CAC GCT C 3' (SEQ ID NO: 128) CAC CAT GGA (AG)TT (TG)GG (AG)CT (GCT)(ACT)G CT 3' (SEQ ID NO: 129) CAC CAT GAA (AG)CA (TC)CT GTG GTT CTT CCT (TC)CT 3' (SEQ ID NO: 130) CAC CAT GGG GTC AAC CG(CT) CAT CCT 3' (SEQ ID NO: 131) CAC CAT GTC TGT CTC CTT CCT CAT CTT C 3' (SEQ ID NO: 132) GAA GAT CTC ACC ATG GA(GC) TGG ACC TGG AG(GCA) (AGTC)TC C 3' (SEQ ID NO: 133) GAA GAT CTC ACC ATG GAC ATA CTT TG(CT) TCC ACG CTC C 3' (SEQ ID NO: 134) GAA GAT CTC ACC ATG GA(AG) TT(TG) GG(AG) CT(GCT) (ACT)GC TGG (GAC)TT TT(TC) CT (SEQ ID NO: 135) 5' GAA GAT CT C ACC ATG AA(AG) CA(TC) CTG TGG TTC TTC CT(TC) CTC 3' (SEQ ID NO: 136) GAA GAT CTC ACC ATG GGG TCA ACC G(CT)C ATC CT 3' (SEQ ID NO: 137) GAA GAT CTC ACC ATG TCT GTC TCC TTC CTC ATC TTC T 3' (SEQ ID NO: 138) 5' GAA GAT CTC ACC ATG GAC TGG ACG TGG AGG ATC CTC TTC TTG GT 3? (SEQ ID NO- 139) IO IO IO IO IO IO LO LO CO ίο LO h—H I-H I-H HH HH HH I-H HH HH HH HH HH HH HH S-VH2 Líder externo S-VH3 Líder externo S-VH4 Líder externo S-VH5 Líder externo S-VH6 Líder externo 3-VHl Líder externo com BgI 3-VH2 Líder externo com BgI 3-VH3 Líder externo com BgI 3-VH4 Líder externo com BgI 3-VH5 Líder externo com BgI 3-VH6 Líder externo com BgI 3-VH7 Líder externo com BgI Μ® 155/188
Os iniciadors introduziram os seguintes sítios de restrição na extremidade 5' (BgIII) e extremidade 3' (Xbal) do cDNA de cadeia pesada. De modo similar, os iniciadors introduziram os seguintes sítios de restrição na extremidade 5' (BgIII) e extremidade 3' (Nhel) do cDNA de cadeia kapa.
O amplicon cDNA de cadeia pesada variável foi digerido com enzimas de restrição apropriadas para os sítios de enzima de restrição que foram adicionados durante a reação PCR. Os produtos daquela digestão foram clonados em cada um de um vetor de expressão IgGl, IgG2 e IgG4 com projeções compatíveis para clonagem. Os vetores de expressão IgG2 e IgG4 foram digeridos com BamHI e Xbal para gerar projeções compatíveis para sub-clonagem. O construto expressão IgGl foi digerido com BamHI e Nhel para gerar projeções compatíveis para sub-clonagem. Estes vetores foram gerados por clonagem do domínio constante do IgGl, IgG2 ou IgG4 humano em sítios de clonagem múltiplos do vetor pcDNA3,l+/Hygro (Invitrogen).
O amplicon cDNA de cadeia leve variável foi também digeri- do com enzimas de restrição apropriadas para os sítios de enzimas de restrição que foram adicionados durante a reação PCR. Os produtos daquela digestão foram clonados em um vetor de expressão IgK que tinha sido digerido com BamHi e Nhel para fornecer projeções compatí- veis para sub-clonagem. Aquele vetor foi gerado pela clonagem do domínio constante do gene IgK humano no sítio de clonagem múltiplo do vetor pcDNA4,l+/Neo (Invitrogen). Os vetores de expressão de cadeia pesada e cadeia leve fo-
ram então co-lipofectados em um prato de 60 mm de 70% de células 293 de fígado embrionário humano confluente (ATCC, Cat. No CRL- 1573). Por 24 horas, as células transfectadas foram permitidas secretar um anticorpo recombinante com especificidade idêntica à da célula do
plasma original. O sobrenadante (3 mL) foi colhido de células HEK 293 e a secreção de um anticorpo intacto foi demonstrado com um sanduí- che ELISA para especificamente detectar IgG humano. Placas de controle foram revestidas com 2mg/mL de IgG anti-humano de bode H+L O/N como para placas de ligação. As placas foram lavadas cinco vezes com água. Os anticorpos recombinantes foram titulados 1:2 para 7 poços a partir do sobrenadante de lipofecção não diluído. As placas foram lavadas cinco vezes com dH20. Um anticorpo conjugado HRP Fc específico de IgG de bode anti-humano foi adicionado a uma concentra- ção final de 1 ug/mL por 1 hora à temperatura ambiente para a secre- ção e os dois testes de ligação. As placas foram então lavadas cinco vezes com dH20. As placas foram desenvolvidas com a adição de tetrametilbenzidina (TMB) por 30 minutos e o ELISA foi parado pela adição de ácido fosfórico 1 M. Além da metodologia XenoMax descrita acima, foram obti-
dos certos anticorpos usando a tecnologia de hibridoma. Camundongos imunizados foram sacrificados por deslocamento cervical e os nódulos de linfa de drenagem foram colhidos e juntados para cada grupo. As células linfõides foram dissociadas por moagem em um Dulbecco's Modified Eagle's Médium ("DMEM") para liberar as células dos tecidos. As células recuperadas foram suspensas em DMEM. As células foram contadas e foram adicionados 0,9 mL de DMEM por 100 milhões de linfócitos à pelota da célula para re-suspender as células gentil, mas completamente. As células re-suspensas foram incubadas com 100 μL de contas magnéticas CD90+ por 100 milhões de células a 4°C por 15 minutos. A suspensão de células rotuladas magneticamente (contendo até IO8 de células positivas (ou até 2 χ IO9 de células totais)) foi carre- gada em uma coluna LS+. A coluna foi lavada com DMEM. O efluente total foi coletado como a fração negativa de CD90", a qual foi esperado MD
Ψ
conter em sua maioria células B.
A fusão foi efetuada pela mistura de células B enriquecidas lavadas de cima e células P3X63Ag*.653 de mieloma não secretório (ATCC CRL 1580, Ver, por exemplo, Kearney e colaboradores, J. Immu- nol 123, 1979, 1548-1550)) a uma razão de 1:1. A mistura de células foi gentilmente empelotada por centrifugação em 800 χ g. Após remoção completa do sobrenadante das células, as células foram tratadas com 2 a 4 ml de solução de Pronase (CalBiochem; 0,5 mg/mL em solução salina tampão de fosfato ("PBS")) por não mais do que 2 minutos. Três a cinco mL de soro bovino fetal ("FBS") foi adicionado para parar a atividade da enzima e a suspensão foi ajustada para um volume total de 40 mL usando solução de fusão de eletro célula ("EFCS") (0,3 sucrose, 0,1 mM de acetato de magnésio, 0,1 mM de acetato de cálcio). O sobrenadante foi removido após centrifugação e as células foram re- suspensas em 40 mL ECFS. Esta etapa de lavagem foi repetida e as células novamente foram re-suspensas em 40 mL de ECFS para uma concentração de 2 χ IO6 células/mL.
A fusão de eletro-célula foi efetuada usando um gerador de fusão (modelo ECM2001, Genetronic, Inc.). O tamanho da câmara de fusão usada foi de 2,0 mL, usando os seguintes valores para o instru- mento: condição de alinhamento 50 V, 50 segundos; quebra de mem- brana a 3000 V, 30 microssegundos; tempo de manutenção da pós- fusão: 3 segundos.
Após a fusão eletro célula ter tido lugar, as suspensões da célula foram cuidadosamente removidas da câmara de fusão sob condições estéreis e transferidas para dentro de um tubo estéril conten- do o mesmo volume do meio de cultura do hibridoma, contendo DMEM, (JRH Biosciences), 15% FBS (Hyclone), suplementado com L-glutamina, penicilina/estreptomicina, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) e IL-6 (Boehringer Mannheim). As células foram incubadas por 15 a 30 minutos a 37°C e, então, centrifugadas a 400 χ g (1.000 rpm) por 5 minutos. As células foram gentilmente re-suspensas e um pequeno volume de meio de seleção de hibridoma (meio de cultura de hibridoma suplementado com 0,5x de ácido hialurônico (Sigma)). O volume total foi ajustado apropriadamente com mais meio de seleção de hibridoma baseado em um volume de banho final de 5 χ IO6 células B no total por 96 placas de poço e 200 μΐ, por poço. As células foram misturadas gentilmente, pipetadas em 96 placas de poços e permitidas crescerem. No dia 7 ou 10, metade do meio foi removida e as células foram alimen- tadas de novo com meio de seleção de hibridoma fresco.
Após 14 dias de cultura, sobrenadantes do hibridoma foram selecionados par anticorpos monoclonais TR-2 específicos pelo ELISA. Na peneira primária, as placas ELISA (Fisher, Cat. No. 12-565-136) foram revestidas com 50 μL/poço de proteína TR-2 ^g/mL) em tampão de revestimento (0,1 M de tampão Carbonato5 pH 9,6, NaHC03 8,4 g/L), então incubadas a 4°C durante a noite. Após incubação, as placas foram lavadas com tampão de lavagem (0,05% Tween 20 em PBS) uma vez. 200 μL/Tampão de Bloqueio de poço (0,5% BSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Thimerosal em 1 χ PBS) foram adicionados e as placas foram incubadas na temperatura ambiente por 1 hora. Após incubação, as placas foram lavadas com Tampão de Lavagem uma vez. Alíquotas (50 μL/poço) de sobrenadante de hibridoma e controles negativos e positi- vos foram adicionados e as placas foram incubadas na temperatura ambiente por 2 horas. O controle positivo usado o tempo todo foi soro de um animal XenoCamundongo hiper-imune e o controle negativo foi soro do animal XenoCamundongo KLH imunizado. Após incubação, as placas foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem. 100 μL/poço de anticorpo de detecção anti-hulgGFc-HRP de bode (Caltag Inc., Cat. No. H10507, concentração usada foi de diluição 1:2.000) foram adicio- nados e as placas foram incubadas na temperatura ambiente por 1 hora. Após incubação, as placas foram lavadas três vezes com Tampão de Lavagem. 100 μΐ,/ροςο de TMB (BioFX Lab. Cat No. TMSK-0100-01) foram adicionados e as placas foram permitidas desenvolver por cerca de 10 minutos (até que os poços de controle negativo dificilmente começassem a mostrar cor). 50 uL/poço de solução de parada (Solução de Parada TMB (BioFX Lab. Cat. No. STPR-0100-01) foram então adicionados e as placas foram lidas em um leitor de placa ELISA em um
comprimento de onda de 450 nm.
Os anticorpos produzidos pelos hibridomas foram analisa- dos usando o mesmo teste de apoptose descrito acima. Células WM-266 foram colocadas em cultura a uma densidade de 4500 células/poço em um meio de cultura normal durante a noite em uma placa de micro- titulação. Um meio de apoptose de 2x foi preparado usando um meio de cultura de célula sem FCS e adicionalmente incluindo 1,8 ng/mh de cicloheximida e 0,9% de FCS. Placas de micro-titulação separadas foram usadas para titular o sobrenadante de hibridoma 1:2 (na mistura do meio de apoptose 2x) em paralelo com um anticorpo anti-KLH de controle negativo isotipo ajustado. O meio de cultura foi removido das células WM-266 e 100 μL da mistura do meio anticorpo-apoptose foram adicionados a cada poço contendo célula, uma linha por vez. As placas de micro-titulação foram incubadas por 20 horas para permitir que a apoptose ocorresse. Os corantes fluorescentes de ligação do DNA iodeto de propídio e Hoechst 33342 (Molecular Probes) foram adicionados a cada poço a uma concentração final de 0,5 μg/mL e 2,5 respec-
tivamente. Após 1 hora a 37°C, imagens fluorescentes de cada poço foram capturadas e analisadas quanto ao número total de células mortas (PI) e número total de células (Hoechst). A percentagem de apoptose foi determinada como (células positivas a PI/células positivas
a Hoechst) χ 100.
Foram obtidos dezessete diferentes anticorpos anti-TR-2 (Anticorpos A-Q) usando tanto a metodologia XenoMax quanto a hibridoma. Todos os anticorpos foram seqüenciados e as seqüências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada identificadas (ver Figuras 3-19). Alinhamentos das cadeias pesadas e cadeias leves dos dezessete
anticorpos são mostrados e 21.
Certos anticorpos foram examinados quanto às suas capa- cidades de induzir a apoptose em células, usando um teste de apoptose similar para aquele descrito acima. Foram postas em cultura células melanoma WM-266 em uma placa de micro-titulação a uma densidade de 4500 células/poços em um meio de cultura normal durante a noite. Em uma placa de micro-titulação separada, os anticorpos recombinan- tes a serem testados, um controle positivo apropriado (M413, um anticorpo anti-TR-2 IgGl de camundongo) tendo uma seqüência variável de cadeia pesada de: MEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAA SGFTFSTYGMSWVRQTPDKRLELVALINSQGGSTYNSDSVKGRFTISRDNA RNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARRDYESLDSWGQGTSVTVSSG (SEQ ID NO: 141) e uma seqüência de variável de cadeia leve de: DIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRASESVEYSGTSLIQWYRQKPGQPPKLUY AASNVDSEVPARFSGSGSGTDFSLYIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFG GGTKLEIKRTDAAPGLEAA (SEQ ID N0 142)) e anticorpos de controle negativo isotipo ajustado (um anticorpo anti-TR-2 potencial que falhou em mostrar atividade) foram titulados de forma que a concentração final do anticorpo cobriria uma faixa de 0,0001 μg/mL a 5 Mg/mL. Os anticorpos foram misturados em meio de apoptose contendo uma concentração final de 0,9 Mg/mL de CHX e 0,45% de FCS. O meio de cultura foi removido das células WM-266 e a mistura anticorpo-meio de ψ
apoptose foi adicionada às células. Após 20 horas de cultura, as células foram tingidas com iodeto de propídio (Sigma) e Hoechst 33342 (Mole- cular Probe). Após 1 hora a 37°C uma imagem de cada poço foi captu- rada e analisada em relação ao número total de células mortas (PI) e o número total de células (Hoechst). A percentagem de apoptose foi determinada como (células PI positivas/células Hoechst positivas) χ 100. Morte sigmficante de células foi observada em células tratadas com M413 ou com certos anticorpos anti-Tr-2 descritos acima.
Exemplo 2
Análise Cinética de Anticorpo Anti-TR-2
Ligando a TR-2
A cinética da ligação de anticorpos anti-TR-2 A a Q ao TR-2 foi analisada usando um instrumento Biacore® 2.000. Superfícies de anticorpo anti-humano de bode de alta densidade foram preparadas em lâminas CM-5 Biacore® usando acoplamento de amina de rotina. Cada anticorpo anti-TR-2 purificado foi diluído a aproximadamente 1 μg/mL em tampão de corrida HBS-P contendo 100 μg/mL de BSA. Cada anticorpo anti-TR-2 foi capturado em uma superfície separada usando um tempo de contato de dois minutos e uma lavagem de cinco minutos para estabilizar a superfície do anticorpo anti-TR-2 na lâmina.
Para analisar a cinética da ligação do TR-2 a cada anticorpo anti-TR-2 individual, 226 nM de TR-2-His humano recombinante (descrito no Exemplo 1) foi cineticamente injetado sobre cada superfície anti-TR-2 por um minuto (usando kinject) a 25°C, seguido por um período de dissociação de cinco minutos. O desvio da linha de base resultando de uma injeção tampão sem TR-2 sobre a superfície do anticorpo anti-TR-2 foi subtraído da ligação observada em cada uma das outras superfícies. Além disso, os dados para a ligação do TR-2 ao anticorpo anti-Tr-2 foram normalizados quanto à quantidade de anti- corpo monoclonal capturado em cada superfície. Cada conjunto de dados foi ajustado globalmente para um modelo de interação de 1:1 para determinar as cinéticas de ligação. Os valores de ka, kd Kd obtidos para cada anticorpo são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3 Cinética de Ligação do TR-2 ao Anticorpo Anti-TR-2 a 25°C
Anticorpo Ka (M-1S 1I Kd (s-1) Kd (nM) A 5,3 X 105 3,7 χ IO-3 6,9 B 5,3 X 105 1,1 χ 10-2 19 C 5,3 X IO5 2,6 χ IO-3 3,9 D 5,3 X IO5 2,7 χ 10-3 4,5 E 5,3 X 105 1,8 χ IO'3 2,1 F 5,3 X 105 5,0 χ IO-3 13 G 5,3 X IO5 1,9 χ 10-2 31 H 5,3 X 105 8,4 χ IO"3 9,8 I 5,3 X 105 1,3 χ IO"3 4,4 J 5,3 X 105 7,1 χ 10-3 12 K 5,3 X 105 1,2 χ IO"2 18 L 5,3 X IO5 1,1 χ IO"2 18 M 5,3 X 105 1,2 χ IO'2 37 N 5,3 X 105 5,5 χ IO-2 68* O 5,3 X IO5 8,4 χ 10-3 19 P 5,3 X IO5 2,7 χ IO-2 33* Q 5,3 X 105 1,6 χ IO-2 13*
* Os dados para aquela amostra exibiram heterogeneidade e ajustaram-se deficientemente a um modelo de 1:1
Exemplo 3 Testes de Morte Celular Foram efetuados Testes de Morte Celular com certos anti- corpos anti-TR-2 humanos descritos no Exemplo 2 para determinar o grau ao qual cada anticorpo dispara a apoptose e morte da célula. Certos anticorpos anti-TR-2, bem como anticorpos M412 e M413 anti- TR-2 de camundongos foram imobilizados em poços separados de placas revestidas de Proteína G de 96 poços (placas revestidas de Proteína G ligando a reactina, Pierce Cat. No. 15131). O M412 é um anticorpo anti-TR-2 IgGl tendo uma seqüência variável de cadeia
pesada:
KVQLQQSGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTEYIIHWKQRSGQGLEWIGWF YPGSGYIKYNEKFKDKATMTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCTRHEED
GYYAAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 143) e uma seqüência variável de cadeia leve:
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYW ASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPYTFGGG
TKLEIKR (SEQ ID NO: 144). O M413 é um anticorpo anti-TR-2 IgGl de camundongo como descrito no Exemplo 1. Cada anticorpo foi adiciona- do a uma concentração de 50 Mg/mL em um primeiro poço e diluído em série l:3x em cada de sete poços adicionais. Cada diluição do anticorpo foi efetuada em triplicata. As placas foram incubadas por 24 horas a 4°C antes do uso. Seguindo a lavagem de cada poço com o meio de cultura (RPMI mais 10% de FBS), uma das quatro diferentes linhagens de células foi incrustada em cada anticorpo imobilizado, numa densi- dade de 50.000 células por poço em um volume total de 200 μΐ,. As linhagens de células testadas foram células COLO 205 (adenocarcinoma de cólon humano), células MDA-231 (câncer de seio humano), células WM35 (melanoma humano) e células WM793 (melanoma humano). As células foram incubadas a 37°C/6% de CO2 por 24 horas, seguido pro uma incubação de 6 horas com 3H-timidina. A percentagem de células
viáveis foi acessada pro determinação do nível de incorporação de 3H- timidina em células não tratadas. O ED5O de cada anticorpo foi derivado da curva de titulação de viabilidade de célula por determinação da concentração do anticorpo que reduziu a viabilidade de células tratadas em 50% com relação às células não tratadas. O ED5O dos anticorpos humanos para células COLO 205 variou de 0 μβ/ΓηΙν a 3,25 μg/mL. Os anticorpos M412 e M413 de camundongo tinham EDsos de 1,85 Mg/mL e 0,07 μg/mL, respectivamente para aquelas células. O EDso dos anticorpos humanos para as células MDA-231 variou de 0,05 ug/mL a 0,5 μg/mL. Os anticorpos M412 e M413 de camundongo tinham ED50S de 0,6 μg/mL e 0,07 μg/mL, respectivamente para aquelas células. Os anticorpos M412 e M413 de camundongo tinham EDsos de 1,85 μg/mL e 0,07 μg/mL, respectivamente para aquelas células. O EDso dos anticorpos humanos para as células WM35 variou de 0,1 μΒ/ιηΙ, a 0,6 μg/mL. Os anticorpos M412 e M413 de camundongo tinham ED50S de 1,85 μg/mL e 0,07 μg/mL, respectivamente para aquelas células. O ED50 dos anticorpos humanos para as células WM793 variou de 0,02 μg/mL a 0,2 μg/mL. Os anticorpos M412 e M413 de camundongo tinham ED50S de 1,85 μg/mL e 0,05 μg/mL, respectivamente para aquelas células.
Exemplo 4 Expressão do TR-2 Humano em Linhagens de Células de Tumores
Linhagens de células de tumores humanos foram tríadas quanto à expressão de TR-2. As linhagens de células usadas incluíram aquelas de cânceres do seio, sistema nervoso central, cólon, fígado, pulmão, colo do útero, útero, ovário, pâncreas, próstata e renal, bem
como leucemia e melanoma.
A expressão do TR-2 em células de tumor humano foi de terminada usando um teste baseado em célula. De forma breve, 4 χ 105 células em tampão 100 MI CBA (PBSi 3% FBS, 0,02% Azida) foram distribuídas em cada um dos poços de 20 placas de 96 poços de fundo em V. Tampão CBA (150 μΐ,) foi adicionado a cada poço e as placas foram centrifugadas para depositar as células. O meio foi descartado e 100 μΐ. da solução de anticorpo (um dos anticorpos de A a Q) a 10 μg/mL foi adicionada à pelota de célula re-suspensa em PBS contendo 2% de PBS ("tampão de teste"). Após uma incubação de 25 minutos em gelo, as células foram lavadas uma vez em tampão de teste. 100 μΙ, de uma peroxidase de rábano silvestre Fc específica de IgG anti-humano de bode (HRP, Pierce) foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas em gelo por 20 minutos. As placas foram lavadas duas vezes com tampão de teste e 100 μΐ. do substrato TMB (ZYMED) foi adiciona- do por 10 minutos à temperatura ambiente. As placas foram centrifu- gadas e 50 μL de cada sobrenadante foi transferido para uma placa limpa contendo 50 μΐ. de solução de parada (BioFX Laboratories). Leituras de densidade ótica foram efetuadas a 450 nm usando o leitor SpectraMax/plus (Molecular Devices). Os dados foram normalizados pela subtração dos valores de densidade ótica obtido de um anticorpo
de controle isotipo.
Diversas linhagens de células tinham uma DO450 maior do que 0,lno teste, incluindo linhagens de célula de câncer do seio HS 578.T (DO de 0,122) e T-47D (DO de 0,112), linhagens de células de câncer de cólon TE 671(u) (DO de 0,109), HT-29 (DO de 0,193), SW-948 (DO de 0,122), KM-12 (DO de 0,354) e HCC-2998 (DO de 0,133), linhagens de células de câncer no fígado NCI-N87 (DO de 0,154) e NCI- SNU-5 (DO de 0,137), linhagens de células de leucemia HL-60 (DO de 0,233) e hPBMC (DO de 0,131), linhagem de célula de câncer de pulmão de células não pequenas JY (DO de 0,118), CCRF-CEM (DO de 0,106), NC1-H2126 (DO de 0,108) e NC1-H460 (DO de 0,122), linhagens de células de melanoma SK-mel-5 (DO de 0,131), LOX IMVI (DO de 0,102), RPMI 7951 (DO de 0,101) e UACC-62 (DO de 0,127), linhagens de células de câncer de pâncreas HPAF II (DO de 0,117) e CAPAN-I (DO de 0,101), linhagem de célula de câncer de próstata LNCaP (DO de 0,174) e linhagens de células de carcinoma renal Caki-I (DO de 0,148) e UO-31 (DO de 0,104). A maior expressão do TR-2 entre as linhagens de células de tumor estudadas foi encontrada em linhagens de células de câncer de cólon KM-12 e HT-29 e em linhagem de célula de leucemia HL-60. Nenhuma das linhagens de células de câncer do sistema nervoso central, células pequenas do fígado, cervical, útero ou ovário estudadas
tinha um D0450 maior do que anteriormente.
Para determinar o perfil da expressão do TR-2 em linhagens de células de tumor humano, as linhagens de célula de tumor humano foram testadas com o anticorpo M412 anti-TR-2 do camundongo. A expressão do TR-2 em células de tumor humano foi determinada usando um teste baseado em célula. De forma breve, 4 χ 10* células em tampão 100 MI CBA (PBS, 3% FBS, 0,02% Azida) foram distribuídas em cada um dos poços de 20 placas de 96 poços de fundo em V. Tampão CBA (150 uL) foi adicionado a cada poço e as placas foram centrifuga- das para depositar as células. O meio foi descartado e 100 μL da solução de anticorpo monoclonal anti-TR-2 de camundongo M412 a 10 μg/mL foi adicionada à pelota de célula re-suspensa em PBS contendo 2% de PBS ("tampão de teste"). Após uma incubação de 25 minutos em gelo, as células foram lavadas uma vez em tampão de teste. 100 μL de uma peroxidase de rábano silvestre Fc específica de IgG anti-humano de bode (HRP, Pierce) foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas em gelo por 20 minutos. As placas foram lavadas duas vezes com tampão de teste e 100 UL do substrato TMB (ZYMED) foi adiciona- 10
do por 10 minutos à temperatura ambiente. As placas foram centrifu- gadas e 50 μΐ, de cada sobrenadante foi transferido para uma placa limpa contendo 50 uL de solução de parada (BioFX Laboratories). Leituras de densidade ótica foram efetuadas a 450 nm usando o leitor SpectraMax/plus (Molecular Devices). Os dados foram normalizados pela subtração dos valores de densidade ótica obtido de um anticorpo
de controle isotipo.
Muitas das linhagens de células tinham expressão TR-2. Os
expressores mais altos (aqueles com um D0450 nm maior do que 0,3) incluíram linhagens de células de câncer do seio HS 578.T (DO de 0,403), MDA-MB-231 (DO de 0,408) e T-47D (DO de 0,366), linhagens de células de câncer do SNC SF-295 (DO de 0,354) e U251 (DO de 0,323), linhagens de células de câncer de cólon HCT-116 (DO de 0,41), HT-29 (DO de 0,869), SW-707 (DO de 0,323), SW-948 (DO de 0,423), KM-12 (DO de 0,77) e HCC-2998 (DO de 0,635), linhagem de células de câncer de fígado NCI-SNU-I (DO de 0,354), linhagem de células de leucemia A 673 (DO de 0,347), linhagens de células de câncer de pulmão de células não pequenas HOP-62 (DO de 0,313), HOP-62 (DO de 0,47), NC1-H2126 (DO de 0,501), NCI-H460 (DO de 0,326), linhagem de células de pulmão de células pequenas A549 (DO de 0,381), linha- gens de células de melanoma LOX IMVI (DO de 0,573), RPMI 7951 (DO de 0,322) e UACC-62 (DO de 0,319), linhagem de células de câncer de ovário IGROVl (DO de 0,312), linhagens de células de câncer de próstata DU 145 (DO de 0,372), 22Rvl (DO de 0,301) e LNCaP (DO de 0,63) e linhagens de células de carcinoma renal Caki-I e linhagens de
células de câncer no cólon HT-29 e KM-12.
Exemplo 5 Reatividade Cruzada de Anticorpos
A habilidade de certos anticorpos anti-TR-2 humanos de ψ 168/188
10
bloquear a ligação de outros ao TR-2 foi acessada, como descrito em Jia e colaboradores, J. Immunol Methods 288: 91-98 (2004). As contas foram conjugadas com anticorpos IgG anti-humano usando o procedi- mento de acoplamento tirado diretamente do Luminex 100 User's Manual, versão 1.7. Após as contas serem ativadas, elas foram acopla- das a um mAb anti-hlgG de camundongo Pharmigen, seguindo as instruções do fabricante. Foram realizados dois experimentos. Em um primeiro experimento, as contas revestidas foram incubadas por duas horas à temperatura ambiente. Em um segundo experimento, as contas revestidas foram incubadas durante a noite a 4°C. Ao final da incuba- ção, as contas revestidas foram bloqueadas e então contadas usando um contador de células Coulter. Foram usadas contas conjugadas imediatamente ou foram armazenadas a 4°C no escuro para uso futuro.
A classificação dos anticorpos anti-TR-2 baseada na reativi- .5 dade cruzada do epítope foi efetuada através das seguintes etapas. Primeiro, cada conjunto de complexos anti-hlgG conta-camundongo como acima foi separadamente incubado com um anticorpo de referên- cia ("anticorpo de referência") em uma rotatória durante a noite a 4°C. O anticorpo de referência foi selecionado dentre anticorpos anti-TR-2 A-Q, descritos acima. Após a captura do anticorpo, 2.000 de cada complexo Ab de referência anti-hlgG conta-camundongo foram combinados juntos em um tubo e então imediatamente adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços e aspirados. TR-2 (50 ng) foi adicionado a cada poço e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem dos poços, 100-500 ng/mL de outros anticorpos anti-TR-2 humano (o "anticorpo de prova") foi adicionado a cada poço e incubado por 2 horas à tempera- tura ambiente. Após lavagem dos poços, o anticorpo de prova ligado foi detectado usando 1 μg/mh de uma versão biotinilada do mesmo anti- hlgG de camundongo monoclonal usado para capturar o anticorpo de
referência. A seguir à incubação e lavagem dos poços, foram adiciona- dos 0,5 μg/mL de estreptavidina-ficoeritrina. A mistura foi incubada por minutos à temperatura ambiente e então o sinal da ficoeritrina foi detectado usando o Luminex 100. Um conjunto adicional de poços sem antígeno foi usado como controle negativo para ajudar na análise dos dados.
O dado foi analisado em um processo de duas etapas. Pri- meiro, o dado foi normalizado usando valores de controle negativo. Segundo, os anticorpos anti-TR-2 foram agrupados de acordo com a habilidade deles de impedir a ligação de um ou mais outros anticorpos anti-TR-2. Para a análise do agrupamento, uma matriz de dissimilari- dade foi gerada a partir da matriz de intensidade normalizada. Os anticorpos foram agrupados baseado nos valores na matriz de dissimi- laridade média usando a sub-rotina de agrupamento hierárquico de ninho de aglomeração SPLUS 2.000 com o métrico Manhattan, usando uma matriz de dissimilaridade de entrada para a matriz de dissimilari- dade média presente.
Baseado nas descobertas, os anticorpos foram colocados em quatro diferentes grupos de epítope. Dentro de qualquer um dos grupos, a ligação de um dos membros do grupo ao TR-2 bloqueia a ligação de outro membro do mesmo grupo ao TR-2. Todavia, a ligação de um dos membros do grupo 1 ao TR-2, por exemplo, não bloqueia a ligação de um dos membros do grupo 2, 3 ou 4 ao TR-2. Aqueles grupos são mostrados na Figura 22. Exemplo 6
Mapeamento do Epítope
Para identificar a região específica do TR-2 importante para ligação a certos anticorpos anti-TR-2 descritos, um estudo de mapea- mento do epítope foi efetuado. Uma construção N-avidina-TR-2 foi feita W
por amplificação PCR da seqüência de código para TR-2 maduro (MacFarlane, 1997) a partir de uma fonte modelo e clonando-a em um vetor pCEP4 (Invitrogen) contendo a seqüência de avidina de frango em uma orientação tal que sob a inserção em um sítio HindIII, a seqüência TR-2 foi ligada à terminação C da seqüência da avidina. O iniciador direto para seqüência de código de TR-2 maduro foi GTAAGCA- AGCTTGGCTCTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso foi GATTAGGGATCCAGAGGCAGGAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 146). A seqüência de aminoácido da proteína de fusão avidina-TR-2 resultante foi MVHATSPLLLLLL
LSLALVAPGLSARKCSLTGKWTDLGSNMTIGAVNSKGEFTGTYTTAVTATS NEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEV LKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQLLASLALITQQDLAP QQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFC LRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRG MVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPAS (SEQ ID NO: 69).
Doze moléculas que compreendem N-avidina e truncamen- tos de TR-2 humano foram sintetizados como descrito abaixo. Três moléculas tinham truncamentos apenas na terminação C de TR-2 humano (TR-2-1 até TR-2-3) e nove moléculas tiveram truncamentos em ambas as terminações N e C de TR-2 humano (TR-2-4 até TR-2-13) (mostrado esquematicamente na Figura 23). Polinucleotídeos que codificam truncamentos de TR-2 humano foram preparados por ampli- ficação de PCR usando os iniciadores descritos abaixo. Para formar cada um das doze moléculas, foi inserido o TR-2 humano truncado resultante da amplificação em um vetor pCEP4 (Invitrogen) contendo a seqüência de avidina de frango que é descrita acima. O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1-43 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAAGCAAGCTTGGCTCTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso TAGTTGGGATCCTCAGGAGATGCA- ATCTCTACCGT (SEQ ID NO: 147). A seqüência de aminoácido do TR-2 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCIS (SEQ ID NO: 70).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1-85 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAAGCA- AGCTTGGCT CTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso GGTAGTGGATCCTCACTGACACACTGTGTTTCTGG (SEQ ID NO:
148). A seqüência de aminoácido do TR-2-2 foi MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATS NEIKES PLH GTQ NTIN KRTQ PTFGFTVN WKFS ESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYG QDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQ (SEQ ID NO: 71).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1-126 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAAGCA- AGCTTGGCT CTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso GTAATGGGATCCTCAGACACATTCGATGTCACTCC (SEQ ID NO:
149). A seqüência de aminoácido do TR-2-2 foi MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYG QDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSP EMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECV (SEQ ID NO: 72).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 16-43 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAATGAAGCTTG- CACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 150) e o iniciador reverso TAGTTGGGATCCTCAGGAGATGCAATCTCTACCGT (SEQ ID NO: 147). A seqüência de aminoácido do TR-2-4 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKE SPLH GTQ NTINKRTQ PTFGFTVN WKFSE STTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL
LASLPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCIS (SEQ ID NO: 73).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 16-85 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAATGAAGCTTG- CACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 150) e o iniciador reverso GGTAGTGGATCCTCACTGACACACTGTGTTTCTGG (SEQ ID NO: 148). A seqüência de aminoácido do TR-2-5 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATS N EIKE SPLH GTQ NTINKRTQ PTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCL
RCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQ (SEQ ID NO: 74).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 16-126 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAATGAAGCTTG- CACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 150) e o iniciador reverso GTAATGGGATCCTCAGACACATTCGATGTCACTCC (SEQ ID NO: 149). A seqüência de aminoácido do TR-2-6 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATS N EIKES PLH GTQ NTINKRTQ PTFGFTVN WKFSE STTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCL RCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRG
MVKVGDCTPWSDIECV (SEQ ID NO: 75).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 42-85 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GATTGAAAGCTT- GATCTCCTGCAAATATGGACAG (SEQ ID NO: 151) e o iniciador reverso GGTAGTGGATCCTCACTGACACACTGTGTTTCTGG (SEQ ID NO: 148). A seqüência de aminoácido do TR-2-7 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKES PLH GTQ NTINKRTQ PTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQ
(SEQ ID NO: 76).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 42-126 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GATTGAAAGCTT- GATCTCCTGCAAATATGGACAG (SEQ ID NO: 151) e o iniciador reverso GTAATGGGATCCTCAGACACATTCGATGTCACTCC (SEQ ID NO: 149). A seqüência de aminoácido do TR-2-9 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEI KE S PLH GTQ NTINKRTQ PTFG FTVN WKFS ESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEE GTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECV (SEQ ID NO:
77).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 85-154 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTTAATGAAGCTTG- CAGTGCGAAGAAGGCACCT (SEQ ID NO: 152) e o iniciador reverso GATTAGGGATCCAGAGGCAGGAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 146). A seqüência de aminoácido do TR-2-10 foi MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCCTPWSDIECVHK ESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPAS (SEQ ID NO: 78).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 42-154 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GATTGAAAGCTT- GATCTCCTGCAAATATGGACAG (SEQ ID NO: 151) e o iniciador reverso GATTAGGGATCCAGAGGCAGGAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 146). A seqüência de aminoácido do TR-2-11 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEE GTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSG EAPAVEETVTSSPGTPAS (SEQ ID NO: 79).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 16-66 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto TGATTGAAGCTTGC- CACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 150) e o iniciador reverso GATGGAGGATCCTCAACACCTGGTGCAGCGCAAG (SEQ ID NO: 153). A seqüência de aminoácido do TR-2-12 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCL
RCTRC (SEQ ID NO: 80).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 16-74 de TR-2 maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTAATGAAGCTTG- CACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 150) TGATTGAAGCTTGCCA- CAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 150) e o iniciador reverso GATG- GAGGATCCTCAACACCTGGTGCAGCGCAAG (SEQ ID NO: 153). A seqüência de aminoácido do TR-2-12 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCL RCTRCTRCDSGEVELS (SEQ ID NO: 81). Quatro moléculas que com- preende N-avidina e truncamentos de TR-2 de macaco cinomolgus foram sintetizadas como descrito abaixo. O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1 a 132 de TR-2 cino madura foi amplificada usando o iniciador direto GTTAGTAAGCTTGGCTCCAATCACCCGAC (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso GTTGATGGATCCTTCTTTGTGGACACTCGAT (SEQ ID NO: 156). A seqüência de aminoácido de TR-2 cino (curta) foi MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL
LASLAPITR
QSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYG QDYSTHWNDFLFCLRCTKCDSGEVEVSSCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSP EICRKCRTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECPQRRIQT (SEQ ID NO: 82).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1 a 154 de TR-2 cino maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTTAGTA- AGCTTGGCTCCAATCACCCGAC (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso GTAGTTGGATCCTCAAGAAGCAGGAGTCCCAGGG (SEQ ID NO: 157). A seqüência de aminoácido do TR-2 cino (longa) foi MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKE QLLASLMVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGA
VNSKGEFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSE
STTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRT
QKEQLLASLAPITRQSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRDCIS
CKYGQDYSTHWNDFLFCLRCTKCDSGEVEVSSCTTTRNTVCQCEEGTFR
EEDSPEICRKCRTGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGTKHTGEVPAVE
KTVTTSPGTPAS (SEQ ID NO: 83).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1 a 85 de TR-2 cino maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTTAGTA- AGCTTGGCTCCAATCACCCGAC (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso GTATGAGGGATCCTCACTGACACACCGTGTTTCTGG (SEQ ID NO: 158). A seqüência de aminoácido 1-85 cino foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG
EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF
TGQCCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKE
QLLASLAPITRQSLDPQRRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRDCISCKY
GQDYSTHWNDFLFCLRCTKCDSGEVEVSSCTTTRNTVCQ (SEQ ID NO:
84).
O polinucleotídeo que codifica aminoácidos 16 a 85 de TR-2 cino maduro foi amplificado usando o iniciador direto GTATGGA- AGCTTGCCACAACAAAAGAGATCCAGC (SEQ ID NO: 159) e o iniciador reverso GTATGAGGGATCCTCACTGACACACCGTGTTTCTGG (SEQ ID NO: 158). A seqüência de aminoácido 16-85 cino foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKE QLLASLPQQKRSSPIEGLCPPGHHISEDSRDCISCKYGQDYSTHWNDFLFC
LRCTKCDSGEVEVSSCTTTRNTVCQ (SEQ ID NO: 84).
Quatro quimeras N-avidina fundidas foram também feitas usando diferentes porções de TR-2 humano e TR-2 cino, como mostrado na Figura 25. Cada quimera foi construída preparando dois produtos PCR com extremidades em superposição que foram, então, amplificadas juntas usando os mesmos iniciadores 5' e 3'. Para formar cada uma das quimeras, o polinucleotídeo amplificado foi então sub-clonado no vetor pCEP4 (Invitrogen) contendo a seqüência de avidina do frango que é descrita acima. É mostrado um alinhamento das seqüências TR-2 do
humano, cino (curta) e camundongo na Figura 26.
A quimera de n° 1 cino /humano foi preparada pela amplifi- cação de uma região de TR-2 cino madura correspondendo aos aminoá- cidos 1-16 usando o iniciador direto GTTAGTAAGCTTGGCTCCAAT- CACCCGAC (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso GGACCTCTTTTGTTGTGGAGCCGCTCTTCGCTGG (SEQ ID NO: 159) e amplificação de uma região do TR-2 humano madura correspondendo aos aminoácidos 17-85 usando o iniciador direto CAGCGAAA- GAGCGGCTCCACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 160) e o inicia- dor reverso GGTAGTGGATCCTCACTGACACACTGTGTTTCTGG (SEQ ID NO: 148). A sobreposição PCR dos fragmentos TR-2 cino e humano foi efetuada usando o iniciador direto para o fragmento 1-16 de aminoáci- dos TR-2 cino, acima (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso para o fragmento 17-85 de aminoácidos TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 148). A seqüência de aminoácido para a quimera de n° 1 cino/humano
foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKE QLLASLAPITRQSLDPQRRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCK
YGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQ (SEQ ID NO: 86). A quimera de n° 2 cino/humano foi preparada pela simplifi- cação de uma região de TR-2 cino madura correspondendo aos aminoá- cidos 1-16 usando o iniciador direto GTTAGTAAGCTTGGCTCCAAT- CACCCGAC (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso GGACCTCTTTTGTTGTGGAGCCGCTCTTCGCTGG (SEQ ID NO: 159) e amplificação de uma região do TR-2 humano madura correspondendo aos aminoãcidos 17-154 usando o iniciador direto CAGCGAAA- GAGCGGCTCCACAACAAAAGAGGTCCAG (SEQ ID NO: 160) e o inicia- dor reverso GATTAGGGATCCTCAAGAGGCAGGAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 146). A sobreposição PCR dos fragmentos TR-2 cino e humano foi efetuada usando o iniciador direto para os fragmentos 1-16 de aminoã- cidos TR-2 cino, acima (SEQ ID NO: 155) e o iniciador reverso para o fragmento 17-154 de aminoãcidos TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 146). A seqüência de aminoãcido para a quimera de n° 2 cino/humano foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG
EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF
TGQCCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKE
QLLASLAPITRQSLDPQRRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCK
YGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREED
SPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEET
VTTSSPGTPAS (SEQ ID NO: 87).
A quimera de n° 3 cino/humano foi preparada pela amplifí- cação de uma região de TR-2 humano madura correspondendo aos aminoãcidos 1-16 usando o iniciador direto GTAAGCAAGCTTGGCTCT- GATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso GGATCTCTTTTGTTGTGGGGCCGCTCTCTGCTGGG (SEQ ID NO: 161) e amplificação de uma região do TR-2 cino madura correspondendo aos aminoãcidos 17-85 usando o iniciador direto CAGCAGAGAGCGGCCC- CACAACAAAAGAGATCCAGC (SEQ ID NO: 162) e o iniciador reverso GTATGAGGGATCCTCACTGACACACCGTGTTTCTGG (SEQ ID NO: 158). A sobreposição PCR dos fragmentos TR-2 cino e humano foi efetuada usando o iniciador direto para os fragmentos 1-16 de aminoácidos TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso para o fragmento 17-85 de aminoácidos TR-2 cino, acima (SEQ ID NO: 158). A seqüência de aminoácido para a quimera de n° 3 cino/humano foi MVHATS- PLLLLLLL
SLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKGEFTGTYTTAVTATS NEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEV LKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQLLASLALITQQDLAP QQRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRDCISCKYGQDYSTTHWNDFLF CLRCTKCDSGEVEVSSCTTTRNTVCQ (SEQ ID NO: 88).
A quimera de n° 4 cino/humano foi preparada pela amplifi- cação de uma região de TR-2 humano madura correspondendo aos aminoácidos 1-16 usando o iniciador direto GTAAGCAAGCTTGGCTCT- GATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso GGATCTCTTTTGTTGTGGGGCCGCTCTCTGCTGGG (SEQ ID NO: 161) e amplificação de uma região do TR-2 cino madura correspondendo aos aminoácidos 17-154 usando o iniciador direto C AGCAGA- GAGCGGCCCCACAACAAAAGAGATCCAGC (SEQ ID NO: 162) e o iniciador reverso GTAGTTGGATCCTCAAGAAGCAGGAGTCCCAGGG (SEQ ID NO: 157). A sobreposição PCR dos fragmentos TR-2 cino e humano foi efetuada usando o iniciador direto para os fragmentos 1-16 de aminoácidos TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso para o fragmento 17-154 de aminoácidos TR-2 cino, acima (SEQ ID NO: 157). A seqüência de aminoácido para a quimera de n° 4 ci- no/humano foi MVHATSPLLLLLLL SLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKGEFTGTYTTAVTATS
NEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEV LKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQLLASLALITQQDLAP QQRAAPQQKRSSPTEGLCPPGHHISEDSRDCISCKYGQDYSTHWNDFLFC LRCTKCDSGEVEVSSCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEICRKCRTGCPRG MVKVKDCTPWSDIECVHKESGTKHTGEVPAVEKTVTTSPGTPAS (SEQ ID NO: 89). Quatro proteínas TR-2 modificadas adicionais foram construí- das pela substituição de regiões curtas de TR-2 humano com a seqüên- cia TR-2 do camundongo correspondente, no contexto de uma fusão N- avidina. A TR-2 humano/camundongo de n° 1 compreendeu a seqüên- cia TR-2 do camundongo de aminoácidos 1-22 e a seqüência TR-2 de humano de aminoácidos 23 a 150. A TR-2 humano/camundongo de n° 2 compreendeu a seqüência TR-2 de humano de aminoácidos 1-28 e 35-150 e a seqüência TR-2 de camundongo de aminoácidos 29-34. A TR-2 humano/camundongo de n° 3 compreendeu a seqüência TR-2 de humano de aminoácidos 1-53 e 60-150 e a seqüência TR-2 de camun- dongo de aminoácidos 54 a 59. A TR-2 humano/camundongo de n° 4 compreendeu a seqüência TR-2 de humano de aminoácidos 1-66 e 76- 150 e a seqüência TR-2 de camundongo de aminoácidos 67 a 75. Para formar cada uma das proteínas modificadas, o polinucleotídeo amplifi- cado foi então sub-clonado no vetor pCEP4 (Invitrogen) contendo a seqüência avidina de frango que é descrita acima.
A TR-2 de humano/camundongo de n° 1 foi preparada pela amplificação de uma região TR-2 de humano madura correspondendo aos aminoácidos 23-150 usando o iniciador direto CAGCGGCCGGAGGA GAGCCCCTCAGAGGGATTGT (SEQ ID NO: 163) e o iniciador reverso GATTGAGGATCCCTAAGAGGCAGGAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 164) e amplificação de uma região de TR-2 de camundongo madura corres- pondendo aos aminoácidos 1-22 usando o iniciador direto TGAATGA- AGCTTGGTTCCAGTAACAGCTAACCCA (SEQ ID NO: 165) e o iniciador reverso TCCCTCTGAGGGGCTCTCCTCCGGCCGCTGTAG (SEQ ID NO: 166). A sobreposição de PCR dos fragmentos humano e do camundongo foi efetuada usando o iniciador direto para o fragmento de aminoácidos 1-22 de TR-2 de camundongo, acima (SEQ ID NO: 165) e o iniciador reverso para o fragmento de aminoácidos 23-150 de TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 164). A seqüência de aminoácido para o TR-2 de humano/camundongo de n° 1 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLVPVTANPAHNRPAGLQRPEESPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQ DYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPE MCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHTGEAPAVEETVTS
SPGTPAS (SEQ ID NO: 90).
A TR-2 de humano/ camundongo de n° 2 foi preparada pela
amplificação de uma região TR-2 de humano madura correspondendo aos aminoácidos 1-28 usando o iniciador direto GTAAGCA- AGCTTGGCTCTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso CAGGTACTGGCCTGCTAGACACAATCCCTCTGAGGGG (SEQ ID NO: 167), amplificação de uma região de TR-2 de humano madura correspondendo aos aminoácidos 35-150 usando o iniciador direto CTAGCAGGCCAGTACCTGTCAGAAGACGGTAGAGATTGC (SEQ ID NO: 168) e o iniciador reverso GATTGAGGATCCCTAAGAGGCAG- GAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 164) e amplificação de uma região TR-2 de camundongo madura correspondendo aos aminoácidos 29-34 usando o iniciador direto CAGGTACTGGCCTGCTAGACACAATCCCTCTGAGGGG (SEQ ID NO: 169) e o iniciador reverso CTAGCAGGCCAGTACCTGTCA- GAAGACGG (SEQ ID NO: 170). A sobreposição de PCR dos fragmentos TR-2 humano e do camundongo foi efetuada usando o iniciador direto para o fragmento de aminoácidos 1-28 de TR-2 de humano, acima (SEQ
ID NO: 145) e o iniciador reverso para o fragmento de aminoácidos 35-
150 de TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 170). A seqüência de aminoá-
cido para o TR-2 de humano/camundongo de n° 2 foi
MVHATSPLLLLLLLSLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKG
EFTGTYTTAVTATSNEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVF
TGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL
LASLALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCLAQYLSEDGRDCISCKYGQ
DYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPE
MCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTS
SPGTPAS (SEQ ID NO: 91).
A TR-2 de humano / camundongo de n° 3 foi preparada pela amplificação de uma região TR-2 de humano madura correspondendo aos aminoácidos 1-53 usando o iniciador direto GTAAGCA- AGCTTGGCTCTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso TGAATCCAGAGAATGGTTGGAGTGAGTGCTATAGTCCTGTC (SEQ ID NO: 171) e amplificação de uma região de TR-2 de humano madura correspondendo aos aminoácidos 60-154 usando o iniciador direto TCCAACCATTCTCTGGATTCATGCTTGCGCTGCACCAGG (SEQ ID NO: 172) e o iniciador reverso GATTGAGGATCCCTAAGAGGCAG- GAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 173). Os iniciadores acima incluem nucleo- tídeos que codifica TR-2 de camundongo correspondendo aos aminoáci- dos 54-59. A sobreposição de PCR dos fragmentos TR-2 humano e do camundongo foi efetuada usando o iniciador para o fragmento de aminoácidos 1-53 de TR-2 de humano, acima (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso para o fragmento de aminoácidos 60-154 de TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 173). A seqüência de aminoácido para o TR-2 de humano/camundongo de n° 3 foi MVHATSPLLLLLLL SLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKGEFTGTYTTAVTATS NEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEV LKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQLLASLALITQQDLAP QQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFC LRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRG MVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPAS (SEQ ID NO: 92).
A quimera de humano/camundongo de n° 4 foi preparada pela amplificação de uma região TR-2 de humano madura correspon- dendo aos aminoácidos 1-66 usando o iniciador direto GTAAGCA- AGCTTGGCTCTGATCACCCAACAAGA (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso TCGGGTTTCTACGACTTTATCTTCCTTACACC TGGTGCAGCG- CAAG (SEQ ID NO: 174) e amplificação de uma região de TR-2 de humano madura correspondendo aos aminoácidos 76-154 usando o iniciador direto AAGGAAGATAAAGTCGTAGAAACCCGATGCACCAC- GACCAGAA ACAC (SEQ ID NO: 175) e o iniciador reverso GATTGAG- GATCCCTAAGAGGCAGGAGTCCCTGG (SEQ ID NO: 176). Os iniciado- res acima incluem nucleotídeos que codificam TR-2 de camundongo correspondendo aos aminoácidos 67-75. A sobreposição de PCR dos fragmentos TR-2 humano e do camundongo foi efetuada usando o iniciador direto para o fragmento de aminoácidos 1-66 de TR-2 de humano, acima (SEQ ID NO: 145) e o iniciador reverso para o fragmento de aminoácidos 76-154 de TR-2 humano, acima (SEQ ID NO: 176). A seqüência de aminoácido para o TR-2 de humano/camundongo de n° 4 foi MVHATSPLLLLLLL
SLALVAPGLSARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSKGEFTGTYTTAVTATS NEIKESPLHGTQNTINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEV LKTMWLLRSSVNDIGDDWKATRVGINIFTRLRTQKEQL LASLALITQQDLAP QQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHSNHSLDS CLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPR GMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEAPAVEETVTSSPGTPAS (SEQ ID NO: 93).
A expressão das proteínas de fusão da avidina foi efetuada por transfecção transiente de células aderentes 293T de humanos em frascos de cultura de tecido T75 ventilados. As células cresceram e foram mantidas em DMEM com 10% de FBS dializado e Ix glutamina "pen-step" a 37/C com 5% de CO2. Para preparar a transfecção, apro- ximadamente 3 χ IO6 células foram inoculadas em cada um dos frascos T75 limpos da série contendo 15 ml de meio de crescimento e todos os frascos foram deixados crescer durante a noite por aproximadamente horas. Cada um dos construtos pCEP4-Avidina(N)-TR-2 foram transfectados em diferentes células como a seguir. 15 Mg de DNA foi misturado com 75 μϊ, de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen) na presença do meio Opti-MEM (Invitrogen) para formar um complexo DNA- Lipofectamina. O complexo foi incubado por 20 minutos. Durante aquele período de incubação, o meio de crescimento foi aspirado dos frascos T75 e substituídos com 15 mL de Opti-MEM. Seguindo a incubação, cada complexo de transfecção foi inoculado em um frasco diferente e incubado a 37°C por 4 a 5 horas. Ao final do período de incubação, o meio Opti-MEM em cada frasco foi substituído com meio de crescimento fresco. Aproximadamente 48 horas pós transfecção, o meio condicionado foi colhido e transferido para tubos de 50 mL (Falcon). Os tubos foram centrifugados a 2.000 χ g por 10 minutos a 4°C para remover células e fragmentos e subseqüentemente transferi- das para um tubo de 50 mL limpo. Um frasco de controle sem DNA
Λ
transfectado foi também preparado seguindo o mesmo protocolo, produzindo um meio condicionado de controle negativo para experimen- tos de ligação.
A concentração de cada proteína de fusão N-avidina-TR-2 foi determinada usando um teste baseado em FACS quantitativo. As proteínas de fusão de avidina foram capturadas em contas de poliesti- reno de biotina de 6,7 Mm (Spherotech, Inc.). Duas amostras foram preparadas para cada proteína de fusão: 5 nL (aproximadamente 3,5 χ IO5) de suspensão de contas mais 20 μΐ de meio condicionado lx, e 5 ML de suspensão de contas mais 200 vL de meio condicionado lx. Todas as amostras foram incubadas por 1 hora na temperatura ambiente com rotação. O meio condicionado foi removido de cada amostra por centri- fugação e lavado com PBS contendo 0,5% BSA (BPBS). As contas de avidina foram tingidas com 200 μΐ, de uma solução de 0,5 Mg/mL de anticorpo anti-avidina rotulado FITC de bode (Vector Labs, Burlingame, CA) em BPBS. A reação foi permitida proceder na temperatura ambiente por 45 minutos com os tubos de reação cobertos com placa. Seguindo a incubação, as contas foram coletadas novamente por centrifugação e lavadas com BPBS e re-suspensas para análise em 0,5 mL de BPBS. A fluorescência do FITC foi detectada usando um FACScan (Becton Dickinson Bioscience). O sinal foi convertido em massa proteica usando uma curva padrão derivada com avidina recombinante.
A ligação de dois anticorpos anti-TR-2 humano a cada dos truncamentos TR-2 humano, ao TR-2 humano e ao TR-2 do macaco cinomolgus foi acessada. O teste de ligação foi efetuado com a seguir. Contas de biotina, descritas acima, foram carregadas com aproximada- mente 100 ng de uma das proteínas de fusão N-avidina TR-2 por 3,5 χ IO5 contas e trazidas para o volume com o meio de crescimento. As contas foram misturadas com 1 ug de anticorpo monoclonal anti-TR-2 humano conjugado FITC em 0,2 mL de BPBS. Após incubação por 1 hora na temperatura ambiente, 3 mL de BPBS foi adicionado e os complexos anticorpo-conta foram coletados por centrifugação por 5 minutos a 750 χ g. As pelotas foram lavadas em 3 mL de BPBS. O Ψ
anticorpo ligado aos complexos avidina-conta foi detectado por análise FACS. A intensidade de fluorescência média foi registrada para cada amostra. A ligação daqueles anticorpos ao meio condicionado sem TR-2 foi usada como um controle negativo ("Neg CM"). Os resultados são
mostrados na Figura 24.
Os padrões de ligação observados dos dois anticorpos foram similares. A ligação observada mais forte foi para o controle positivo, TR-2 humano, com uma intensidade de fluorescência média de 7349. A ligação observada dos anticorpos (como medido na intensidade de fluorescência) para o truncamento TR-2-2 foi 6561-6693, para os truncamentos TR-2-3 e TR-2-5 foi 3518-3866, para o truncamento TR- 2-6 foi 1959-2202 e para o truncamento TR-2-1 foi 662-759. A ligação dos anticorpos ao comprimento total do TR-2 do macaco cinomolgus (como medido na intensidade de fluorescência) foi 666-764. Os anticor- pos não se ligaram ao TR-2 do camundongo ou rato ou aos truncamen- tos TR-2-4, TR-2-7, TR-2-9, TR-2-10, TR-2-11, TR-2-12 ou TR-2-13, como determinado pelo fato de que a ligação foi similar à do fundo para o experimento.
O TR-2-1 é um truncamento de terminação C de TR-2 após o aminoãcido 43, a TR-2-2, -3, -5 e -6 todos incluem pelo menos aminoácidos 16 a 85. A ligação ocorreu quando a região inteira de aminoãcidos 1 a 85 estava presente (ver resultados para o TR-2-2). A adição de aminoácidos 86 a 126 diminuiu a ligação por aproximada- mente duas vezes (compare os resultados entre o TR-2-2 e TR-2-3). A ausência de aminoácidos 1 a 15 da terminação N do TR-2 no TR-2-2
Λ
diminuiu a ligação por aproximadamente duas vezes (compare os resultados entre TR-2-2 e TR-2-5). A ausência simultânea de aminoáci- dos 1 a 15 e a adição de aminoácidos 86 a 126 diminuiu a ligação por aproximadamente três vezes (compare os resultados entre o TR-2-2 e TR-2-6). A eliminação dos resíduos 44 a 85 (TR-2-1) reduziu a ligação de cerca de 11% daquela observada para o TR-2-2. Aqueles resultados indicam que um ou mais resíduos nas regiões de aminoácidos 1 a 15 (SEQ ID NO: 94; ALITQQDLAPQQRAA) e 44 a 85 (SEQ ID NO: 95;
CKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQ) são im- portantes para ligação daqueles dois anticorpos anti-TR-2 humanos e TR-2 humano.
A ligação de um anticorpo anti-TR-2 humano a cada um dos truncamentos TR-2 cino, às quimeras humano/cino e TR-2 huma- no que compreende certos domínios TR-2 de camundongo foi também acessada. O anticorpo anti-TR-2 se ligou fortemente ao TR-2 humano de comprimento total (intensidade de fluorescência ("Fr) de 5681). A ligação do anticorpo anti-TR-2 ao TR-2 cino de versão comprida de comprimento total foi cerca de cinco vezes reduzida (FI de 1573) com relação àquela do TR-2 humano de comprimento total. Apenas níveis de fundo de ligação foram observados para a versão curta do comprimento total do cino TR-2 (FI de 209) e doso truncamentos TR-2 cino 17-154 (FI
de 51), cino 1-85 (FI de 11) e cino 17-85 (FI de 8).
A ligação de certos anticorpos anti-TR-2 humanos às qui- meras TR-2 cino/humano foi também acessada (ver Figura 27). A ligação observada (FI) dos anticorpos para as quatro quimeras foi como se segue: quimera cino/humano n° 1: FI de 5977; quimera ci- no/humano n° 2: FI de 47; quimera cino/humano n° 3: FI de 12; quimera cino/humano n° 4: FI de 1507. Como acima, a ligação obser- vada dos anticorpos de TR-2 humano de comprimento total foi 5681, enquanto a ligação dos anticorpos de TR-2 cino de comprimento total
foi 1573 (forma comprida) e 209 (forma curta).
Como a ligação do anticorpo à quimera cino/humano de n° 1 foi similar àquela do truncamento TR-2-5, a substituição dos aminoá- cidos 1-16 pela correspondente seqüência cino aparentemente não afetou a ligação do anticorpo no contexto dos aminoácidos 17-85 humanos. Todavia, a substituição dos aminoácidos 1-16 pela seqüência cino correspondente no contexto do TR-2 humano de comprimento total (cino/humano de n° 2) liquidou significativamente com a ligação, confirmando que pelo menos um aminoácido na região de 1-16 forma parte de um epítope. A ligação às quimeras cino/humano de n° 3 e n° 4 foi significativamente atenuada daquela do TR-2 humano de compri- mento total, sugerindo que os aminoácidos 17-85 da seqüência humana são importantes para a ligação. Além de tudo, um ou mais dos aminoá- cidos da região 1-85 da seqüência humana (SEQ ID NO: 96, ALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYS THWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQ) estão envolvidos na ligação do epítope. De modo similar, a substituição de várias seqüências humanas na região dos aminoácidos 1-85 com a correspondente seqüência do camundongo significativamente atenua a ligação do anticorpo (ver a Figura 27), ainda confirmando que um ou mais amino- ácidos naquela região estão envolvidos na ligação do epítope.

Claims (27)

"Anticorpos Isolados, Composições, Métodos de Produção de Anticorpos e Uso de Quantidade Terapeuticamente Efetiva de Anticorpos" Reivindicações
1. - Anticorpo Isolado, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, caracterizado por que a cadeia pesada compreende CDR1, CDR2 e CDR3 da SEQ ID N0:30, em que o anticorpo liga o receptor TRAIL-2 (TR-2).
2. - Anticorpo Isolado, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a cadeia leve compreende CDRl, CDR2 e CDR3 da SEQ ID N0:64.
3. - Anticorpo Isolado, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, caracterizado por que a cadeia leve compreende CDR1, CDR2 e CDR3 da SEQ ID NO:64, em que o anticorpo liga o receptor TRAIL-2 (TR-2).
4. - Anticorpo Isolado, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, caracterizado por que a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:30, em que o anticorpo liga o receptor TRAIL-2 (TR-2).
5. - Anticorpo Isolado, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que a cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:64.
6. - Anticorpo Isolado, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, caracterizado por que a cadeia leve compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO:64, em que o anticorpo liga o receptor TRAIL-2 (TR-2).
7. - Anticorpo Isolado, de acordo com qualquer das Reivindicações de 1 a 6, caracterizado por que o anticorpo é um anticorpo inteiramente humano.
8. - Composição Farmacêutica, caracterizada por que compreende o anticorpo isolado de qualquer das Reivindicações de 1 a 6 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
9. - Composição, que compreende um primeiro polinucleotídio isolado que codifica uma cadeia pesada, caracterizada por que a cadeia pesada compreende CDR1, CDR2 e CDR3 da SEQ ID N0:30.
10. - Composição, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizada por que a composição compreende um segundo polinucleotídio isolado que codifica uma cadeia leve,em que a cadeia leve compreende CDR1, CDR2 e CDR3 da SEQ ID NO:64.
11. - Composição, que compreende um polinucleotídio isolado que codifica uma cadeia leve, caracterizada por que a cadeia leve compre- ende CDR1, CDR2 e CDR3 da SEQ ID NO:64.
12. - Composição, que compreende um primeiro polinucleotídio isolado que codifica uma cadeia pesada, caracterizada por que a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:30.
13. - Composição, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizada por que a composição compreende ainda um segundo polinucleotídio isolado que codifica uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:64.
14. - Composição, que compreende um polinucleotídio isolado que codifica uma cadeia leve, caracterizada por que a cadeia leve compre- ende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:64.
15. - Composição, de acordo com a Reivindicação 11 ou 14, caracteri- zada por que o polinucleotídio isolado é parte de um vetor de expressão.
16. - Composição, de acordo com a Reivindicação 10 ou 13, caracteri- zada por que o primeiro polinucleotídio isolado é parte de um primeiro vetor de expressão e o segundo polinucleotídio isolado é parte de um segundo vetor de expressão.
17. - Composição, de acordo com a Reivindicação 10 ou 13, caracteri- zada por que o primeiro polinucleotídio isolado e o segundo polinucleo- tídio isolado são partes do mesmo vetor de expressão.
18. - Composição, de acordo com a Reivindicação 9 ou 12, caracteri- zada por que o primeiro polinucleotídio isolado é parte de um vetor de expressão.
19. - Composição, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizada por que o vetor de expressão está numa célula hospedeira.
20. - Composição, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizada por que o primeiro vetor de expressão e o segundo vetor de expressão estão numa célula hospedeira.
21. - Composição, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizada por que o vetor de expressão está numa célula hospedeira.
22. - Composição, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizada por que o vetor de expressão está numa célula hospedeira.
23. - Método de Produção de Anticorpo, caracterizado por que compreende incubar a composição da Reivindicação 20 sob condições adequadas para expressão do vetor na célula hospedeira para produzir o anticorpo.
24. - Método de Produção de Anticorpo, caracterizado por que compreende incubar a composição da Reivindicação 21 sob condições adequadas para expressão do vetor na célula hospedeira para produzir o anticorpo.
25. - Anticorpo Isolado, caracterizado por que se liga especificamente a um epitopo sobre o receptor TRAIL-2 (TR-2) que é especificamente ligado por Ab O.
26. - Uso de Quantidade Terapeuticamente Efetiva de Anticorpo, segundo qualquer das Reivindicações de 1 a 6, caracterizado por que é no fabrico de medicamento para tratamento de câncer num paciente.
27. - Uso de Quantidade Terapeuticamente Efetiva de Anticorpo, segundo qualquer das Reivindicações de 1 a 6, de acordo com a Reivin- dicação 26, caracterizado por que o câncer é selecionado a partir de pelo menos um dentre câncer do fígado, câncer do cérebro, câncer de rim, câncer Coloretal5 câncer do pulmão, câncer do baço, câncer do timo ou das células vermelhas (isto é, leucemia), câncer da próstata, câncer do testículo, câncer do ovãrio, câncer do útero, câncer da mama, câncer do pâncreas, câncer do estômago, carcinoma da célula escamosa da cabeça e do pescoço e linfoma.
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