BRPI0614646A2 - análise de impressão digital usando espectrometria de massa - Google Patents

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BRPI0614646A2
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Frederick John Rowell
Brendan John Theaker
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Univ Sunderland
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Abstract

ANáLISE DE IMPRESSãO DIGITAL USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSA. A presente invenção refere-se a um método para determinar a presença de um resíduo sobre ou dentro de uma impressão digital usando técnicas espectrométricas de massa. A técnica espectrométrica de massa pode ser selecionada a partir de MALDI-TOF-MS e SALDI-TOF-MS. Fazem parte também da invenção produtos para uso no método e aplicações do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANALISE DEIMPRESSÃO DIGITAL USANDO ESPECTROMETRIA DE MASSA".
Campo da Invenção
A invenção refere-se a um método para determinar a presençade um resíduo dentro de uma impressão digital usando as técnicas espec-trométricas de massa.
Antecedentes da Invenção
Impressões digitais latentes contêm numerosos compostos, taiscomo os compostos de ocorrência natural do corpo, por exemplo colesterol,esqualeno e ácidos graxos, [1-3] ou compostos que podem ficar na impres-são digital latente a partir de um contato, por exemplo, cocaína ou outrasdrogas. Dos estudos feitos até hoje com esse objetivo, tem-se feito uso daespectroscopia de Raman [4,5]. Nesses estudos, foi observada a dificuldadede localizar visualmente as drogas a fim de realizar uma análise, e o métodofoi também relativamente insensível e relativamente não específico. O méto-do mais comum para o exame de impressões digitais latentes é a Cromato-grafia Gasosa- Espectrometria de Massa (GC-MS). Anteriormente foi mos-trado que os resíduos de impressões digitais latentes podem ser extraídosem um solvente e analisados por GC-MS [2,3]. Tais compostos incluem es-qualeno e colesterol, entretanto, os níveis destes nas impressões digitaislatentes variam, não somente entre indivíduos, mas às vezes no mesmo in-divíduo [3]. A GC-MS tem também sido usada para detectar resíduos decontato, tais como cocaína de impressões digitais espetadas, com um limitede detecção de aproximadamente 300 μg [6] e para a detecção de drogas emetabólitos a partir de adesivos coletores de suor comerciais até ng por ní-veis de adesivo [7] e da saliva [8]. Entretanto, todos os métodos menciona-dos acima exigem procedimentos de extração complicados que devem serempreendidos antes da análise.
A espectrometria de massa por dessorção/ionização a laser portempo de vôo (MALDI-TOF-MS) foi desenvolvida no fim da década de 1980por Karas e Hillenkamp, e ficou estabelecida como uma técnica para a análi-se e determinação do peso molecular exato de grandes macromoléculas taiscomo proteínas, polissacarídeos, ácidos nucléicos e polímeros sintéticoscom alta precisão de massa, e sensibilidade extrema. MALDI é um processode ionização "suave" que produz fragmentação mínima, e em que a energiado laser é despendida na volatilização da matriz em vez de em degradar amacromolécula. A MALDI-TOF-MS não tem sido considerada no campo deidentificação dos resíduos presentes em impressões digitais latentes. AMALDI-TOF-MS é chamada superfície de dessorção/ionização auxiliada porlaser (SALDI) quando grafite, dióxido de titânio ou sílica são usados comomatrizes de suspensão para MALDI [9, 11].
Sumário da Invenção
A presente invenção descreve diversos materiais que podem serusados na detecção e/ou formação de imagem de impressões digitais. Es-ses materiais são tipicamente também capazes de atuar como agentes dematriz em várias técnicas espectrométricas de massa. Dessa maneira, essesmateriais têm determinadas propriedades que lhes permite desempenhar talpapel de "dupla finalidade".
Dessa forma, em um aspecto da presente invenção, é providoum método para determinar a presença de um resíduo em uma impressãodigital, o dito método compreendendo:
i) aplicar à impressão digital uma matéria particulada compreen-
dendo um material que (1) é capaz de atuar como um agente ou material dematriz em uma técnica espectrométrica de massa assistida por matriz; e (2)ajudar a deteção e/ou a criação de imagem de uma impressão digital, paraformar uma impressão digital aplicada à partícula; e depois;
ii) submeter o material de formação da impressão digital aplicadaao particulado à espectrometria de massa de modo a detectar a presença ouausência do resíduo.
Em uma modalidade, o método compreende o uso de materiais,por exemplo, metais, óxidos de metal, nitretos de metal e carbono, que po-dem ser usados (1) como agentes para visualizar impressões digitais, poreles mesmos ou combinados ou embutidos dentro de um veículo, por exem-plo, um veículo de sílica, e (2) como uma matriz para examinar (analizar)impressões usando uma técnica espectrométrica de massa auxiliada pormatriz. A técnica de espectrometria de massa é usada para identificar a pre-sença ou ausência de substâncias, tais como um ou mais metabólitos oucompostos endógenos, compostos ou metabólitos exógenos e/ou resíduosde contato que a impressão digital inclui. Em uma modalidade, a técnica es-pectrométrica de massa é selecionada a partir de (1) MALDI-TOF-MS e (2)SALDI-TOF-MS e (3) combinações das mesmas.
A impressão digital à qual o método é aplicado por ser uma im-pressão que foi submetida à "lifting" a partir de uma superfície usando umafita de "lifting".
Em uma modalidade, a matéria particulada é hidrofóbica a fim defacilitar a aplicação e o contacto da matéria particulada para a impressãodigital.
Deverá ser compreendido que o termo "impressão digital" incluiuma referência a uma impressão parcial e/ou impressões de outras partesdo corpo e que, por exemplo, uma porção de uma impressão digital à qual amatéria particulada foi aplicada pode ser subjmetida à espectrometria demassa. Tipicamente, uma impressão é submetida à "lifting" a partir de suasuperfície subjacente, antes da aplicação da espectrometria de massa, e otermo "impressão digital" por conseguinte inclui impressões digitais submeti-das à "lifting". Em modalidades, a impressão digital é submetida à "lifting"antes da aplicação da matéria particulada. É considerado que a invençãoinclui métodos em que a etapa ii) compreende submeter a matéria particula-da, que adquiriu o analisado da impressão, à espectrometria de massa. Éadicionalmente considerado que a invenção inclui métodos em que a etapa(ii) compreende submeter ambos, o material da impressão digital e a matériaparticulada, à espectrometria de massa.
Deverá ser entendido que os termos "amostra" e/ou "analisado",no contexto da presente invenção, podem ser adotado para significar uma30 impressão, uma amostra tirada de uma impressão e/ou um resíduo presenteou incluído na impressão.
Em alguns métodos da invenção, a impressão digital é submeti-da à "lifting" a partir de uma superfície e aplicada com matéria particulada(agente de processamento), quer antes ou depois do "lifting" e a impressãodigital submetida à "lifting" (pelo menos, o material compreendido na impres-são) é depois colocado em um aparelho de espectrometria de massa. Emoutros métodos, a impressão é feita diretamente em um suporte de amostrae, depois da aplicação do agente de processamento para a impressão, osuporte de amostra é colocado no aparelho espectrométrico de massa.
Em uma modalidade, o método ainda compreende localizar e/ouvisualizar a impressão digital e o exame da impressão usando a técnica deespectrometria de massa descrita acima, por exemplo, MALDI-TOF-MS e/ouSALDI-TOF-MS.
De acordo com um aspecto da invenção, é provido um métodopara determinar a presença de um resíduo dentro de uma impressão digitallocalizada sobre uma superfície, o dito método compreendendo as etapasde:i) aplicar à impressão digital um agente de processamento, porexemplo, uma matéria particulada compreendendo um material selecionadoa partir de um metal, óxido de metal, nitreto de metal, uma partícula de car-bonoo e combinações dos mesmos;ii) submeter uma impressão digital à espectrometria de massapara detectar a presença ou ausência do dito resíduo.
Como anteriormente estabelecido, portanto, a invenção refere-seà detecção, opcionalmente incluindo quantificação, de resíduos dentro deimpressões digitais. O termo "resíduo" refere-se a qualquer material que sedeseja detectar, em particular, para compostos pré-selecionados. O resíduoestá, ou pode estar dentro isto é incluído em uma impressão digital, isto é, omaterial que constitue a impressão digital contém, ou se suspeita que conte-nha ou possa conter o resíduo.
Em uma modalidade, a matéria particulada é hidrofóbica. Emuma classe de métodos, a matéria particulada pode ser usada em combina-ção com outros agentes da matriz e/ou outros agentes de detecção da im-pressão digital.A presente invenção provê um método que permite a detecçãode (1) uma substância produzida endogenamente por exemplo proteínas,lipídeos, DNA, peptídeos e/ou metabólitos derivados endogenamente queestá presente como um resíduo incluído em uma impressão digital; (2) umcomposto ou metabólito exógeno que está presente como um resíduo incluí-do em uma impressão digital; e/ou (3) um resíduo de contato que está pre-sente em ou dentro da impressão digital. Exemplos dos tipos de resíduossão discutidos mais tarde, mas incluem por exemplo (1) esqualeno e coleste-rol; (2) cocaína e seus metabólitos, e nicotina e seus metabólitos e (3) resí-duos balísticos de, por exemplo, armas de fogo e/ou explosivos, resíduos demanuseio de drogas (narcóticos), por exemplo, cocaína.
Em uma modalidade, o método também permite a detecção deresíduos de contato que são co-depositados sobre superfícies junto comcomponetes derivados endogenamente (isto é, metabólitos endógenos e/oumetabólitos exógenos).
O método descrito aqui a seguir tipicamente não requer os pro-cedimentos de extração complicados, antes da análise associada com astécnicas do conhecimento anterior e, adicionalmente, provê limites de detec-ção mais baixos.
Uma classe de métodos busca determinar a presença ou ausên-cia de uma substância predeterminada. Nesse caso, o espectro da massa éexaminado para a presença de um ou mais picos associados com essasubstância conhecida. Outra classe de métodos busca identificar uma oumais substâncias em uma impressão, através da comparação de picos noespectro da massa, com um banco de dados ou biblioteca de picos. Ambasas classes de métodos podem ser realizadas em combinação.
Em uma modalidade, o método compreende detecção e/ou iden-tificação de um resíduo incluído em uma impressão digital que foi diretamen-to depositado em um suporte de amostra MALDI-TOF-MS ou SALDI-TOF-MS antes da aplicação da matéria particulada. Em uma modalidade alterna-tiva, o método compreende a detecção da presença ou ausência de um re-síduo dentro de uma impressão digital que foi submetida à "lifting" usandoum meio de "lifting", por exemplo, uma fita de "lifting", partir de uma superfí-cie. A superfície pode ser o sítio de deposição da impressão digital em, porexemplo, uma cena de crime. O método pode compreender contactar a im-pressão digital submetida à "lifting" com um suporte de amostra MALDI-TOF-MS ou SALDI-TOF-MS antes da aplicação da matéria particulada.
O método pode alternativamente compreender contactar a im-pressão digital com a matéria particulada, antes da aplicação de meios de"lifting", por exemplo, fita de "lifting", para a impressão digital. Em uma mo-dalidade, a superfície é polvilhada, primeiro, a fim de localizar a impressãolatente. Isto é seguido pelo "lifting" da impressão polvilhada com a fita de"lifting". A impressão, localizada na fita de "lifting", é depois aplicada a umaplaca alvo MALDI ou SALDI (suporte de amostra) antes da análise de MS.
Tipicamente, um suporte de amostra de MALDI-TOF-MS ouSALDI-TOF-MS tende a ser uma placa, por exemplo, uma placa de aço ino-xidável, que é projetada para se encaixar em um sistema de MS. A placapode compreender uma cavidade ou uma pluralidade de cavidades às quaisa amostra (isto é a impressão digital, por exemplo, a impressão digital sub-metida à "lifting") é adicionada. Em uma modalidade, as impressões são de-pósitos semi-sólidos que estão presentes em uma superfície viscosa da fitade "lifting".
O método pode ser empregado qualitativamente para determinara presença ou ausência de um resíduo e/ou quantitativamente para determi-nar a quantidade de um resíduo. Além do mais, em uma modalidade, o mé-todo pode ser usado para visualizar ou formar a imagem da impressão digi-tal. Essa visualização ou formação de imagem é importante pois permite queo "dono" da impressão digital seja identificado. A fim de ajudar na visualiza-ção da impressão digital, preferivelmente a partícula adicionalmente com-preende um corante, por exemplo um corante fluorescente ou colorido. Co-rantes apropriados serão do conhecimento daqueles versados na técnica,mas podem, por exemplo incluir, rodamina 6G.
Em um aspecto, a presente invenção também provê o uso dematéria particulada compreendendo metal, oxido de metal e/ou carbonoopara a detecção de um resíduo ou resíduos na impressão digital, em umatécnica de espectrometria de massa auxiliada por matriz.
Em um aspecto da presente invenção, é provido o uso de umatécnica de espectrometria de massa auxiliada por matriz em uma identifica-ção de resíduos incluídos em uma impressão digital. Particularmente, é pro-vido o uso de uma técnica de MALDI-TOF-MS e/ou SALDI-TOF-MS paradetectar um resíduo em uma impressão digital. O resíduo pode ser um resí-duo endógeno (por exemplo, uma substância ou metabólito endógeno, porexemplo, esqualeno, ou um metabólito exógeno, por exemplo uma droga oumetabólito de uma droga), e/ou um resíduo de "contato", por exemplo, resí-duos balísticos de, tipicamente, explosivos ou armas de fogo. Em uma mo-dalidade, uma técnica de MALDI-TOF-MS e/ou SALDI-TOF-MS pode serusada com imagens de agentes de impressão digital que podem ser usadaspara (particularmente visualizar) impressões digitais. Exemplos de agentesde impressão digital convencionais incluem alumínio, Magneta Flake e póbranco comercial. Em uma modalidade, agentes de matriz apropriados sãousados na técnica de MALDI-TOF-MS/ SALDI-TOF-MS para auxiliar no pro-cesso de dessorção/ionização. Exemplos de agentes de matriz convencio-nais incluem ácido 2,5-Dihidroxibenzóico (DHB ou DHBA) e ácido cinâmicode a-ciano-4-hidroxi (a-CHCA).
Em uma modalidade alternativa, o uso de MALDI-TOF-MS e/ouSALDI-TOF-MS compreende o uso de uma matéria particulada que compre-ende um material selecionado a partir de (1) metal; (2) óxido de metal (3)nitreto de metal e (4) carbono como agente de matriz. A matéria particuladapode ainda compreender características adicionais que são descritas aqui aseguir. A matéria particulada tipicamente pode também ser usada como umagente para detectar e/ou produzir imagens da impressão digital. Em umamodalidade, a impressão digital tem um resíduo dentro dela (isto é incluídonela). Em uma modalidade, a matéria particulada pode ser usada em combi-nação com outros agentes de matriz ou materiais (também conhecidos àsvezes como agentes de auxílio à matriz e/ou agentes de ampliação da ma-triz).Em uma modalidade, o uso pode ainda compreender a identifi-cação do resíduo.
Descrição Detalhada da Invenção
Do princípio ao fim da descrição e das reivindicações deste rela-tório, as palavras "compreende" e "contêm" e variações das palavras, porexemplo, "compreendendo" e "compreende", significam "incluindo, mas nãolimitado a", e não pretendem excluir (e não excluem) outras porções, aditi-vos, componentes, números inteiros ou etapas.
Do princípio ao fim da descrição e das reivindicações desta es-pecificação, o singular abrange o plural, a não ser que o contexto exija deoutra maneira. Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o relatóriodeve ser compreendida como considerando a pluralidade como também asingularidade, a menos que o contexto exija de outra maneira.
Aspectos, números inteiros, características, compostos, porçõesquímicas ou grupos descritos em conjunto com um aspecto, modalidade ouexemplo da invenção em particular, devem ser entendidos como sendo apli-cáveis a qualquer outro aspecto, modalidade, ou exemplo descrito aqui aseguir, a menos que seja incompatível com isso.
Do princípio ao fim da descrição, vários aspectos desta invençãopodem ser apresentados no formato de uma série. Deverá ser entendido quea descrição em formato de série é meramente por conveniência e brevidadee não deve ser considerada como uma limitação inflexível no escopo da in-venção. Por conseguinte, a descrição de uma série deverá ser consideradacomo tendo descrito especificamente todas as subvariações possíveis comotambém os valores numéricos individuais dentro da série. Por exemplo, adescrição de uma série tal como de 1 até 6 deverá ser considerada comotendo especificamente descrito subvariações tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., como também números individuaisdentro dessa série, por exemplo, 1,2,3, 4, 5, e 6. Isto se aplica independen-temente da extensão da série. Deverá também ficar entendido que a descri-ção de um número de séries deverá ser considerada como tendo especifi-camente descrito uma combinação de pontos extremos.Método
A presente invenção refere-se ao uso de espectrometria demassa na análise de resíduo de impressão digital. Especificamente, a pre-sente invenção refere-se ao uso de uma técnica de espectrometria de massaauxiliada por matriz, por exemplo, MALDI-TOF-MS e/ou SALDI-TOF-MS naanálise de resíduos de impressão digital.
Como estabelecido anteriormente, o termo "resíduo" refere-se aqualquer material de compostos pré-selecionados que se deseja detectar,em particular. O resíduo está, ou pode estar dentro, isto é, incluído em umaimpressão digital, quer dizer, o material que constitue a impressão digitalcontém, ou é suspeito de conter, ou pode conter o resíduo.
Em um aspecto da presente invenção, é provido um método pa-ra determinar a presença de um resíduo em uma impressão digital, o métodocompreendendo (i) aplicar uma matéria particulada para uma impressão digi-tal, a matéria particulada tendo as propriedades a seguir: (1) é apropriadapara uso como um agente de matriz em uma técnica de espectrometria demassa auxiliada por matriz, e (2) é apropriada para uso como um agentepara detectar e/ou criar a imagem da impressão digital; e (ii) submeter a im-pressão digital à espectrometria de massa para detectar a presença ou au-sência do dito resíduo.
Preferivelmente, a matéria particulada é hidrofóbica. A invençãoainda inclui métodos para analisar um substrato hidrofóbico por espectrome-tria de massa auxiliada por matriz, caracterizada pelo fato de que a matriz éhidrofóbica. Em uma modalidade, o método compreende, por exemplo, antesda etapa (ii), preparar pelo menos uma calibragem padrão para uso na cali-bragem da técnica espectrométrica de massa. Em uma modalidade, o méto-do compreende analizar o resultado da etapa (ii) para por exemplo determi-nar se um resíduo específico (por exemplo nicotina) está presente na im-pressão digital. Como exposto acima, a pessoa versada compreenderá que otermo "impressão digital" inclui referência a uma impressão parcial e/ou im-pressões de outras partes do corpo e que, por exemplo, uma porção de umaimpressão digital na qual a matéria particulada foi aplicada pode ser subme-tida à espectrometria de massa. Tipicamente, uma impressão digital é sub-metida à "lifting" a partir da superfície anterior àquela de aplicação da espec-trometria de massa, e o termo "impressão digital" por conseguinte inclui im-pressões digitais que foram submetidas à "lifting". Em modalidades, a im-pressão digital é submetida à "lifting" antes da aplicação da matéria particu-lada. Considera-se que a invenção inclui métodos em que a etapa ii) com-preende submeter a matéria particulada à espectrometria de massa. É aindaconsiderado que a invenção inclui métodos em que a etapa (ii) compreendesubmeter ambas, a impressão digital e a matéria particulada, à espectrome-tria de massa. Em uma classe de métodos, a etapa (i) compreende submer-são de um artigo, no qual uma impressão é ou pode ser depositada, em ummeio líquido que compreende a matéria particulada antes de ser removida.O comprimento da imersão não é decisiva e pode variar a partir de cerca de15 minutos até cerca de 12 horas ou mais. A impressão pode depois sersubmetida à "lifting" a partir do artigo usando a fita de "lifting".
Deverá ser entendido que os termos "amostra" e/ou "analisado",no contexto da presente invenção, podem ser empregados para significaruma impressão digital e/ou um resíduo presente na ou dentro da impressãodigital, quer depositado diretamente ou alternativamente submetido à "lifting"a partir de uma superfície usadno o smeios de "lifting", por exemplo, a fita de"lifting".
Em uma modalidade, a técnica espectrométrica de massa é se-lecionada a partir de MALDI-TOF-MS e SALDI-TOF-MS. Resumindo, MAL-DI-TOF-MS requer mixagem de amostras com moléculas da matriz e a apli-cação do material da matriz para uma amostra ou similares. O alvo da MAL-Dl- é introduzido em uma fonte de íon de um espectrômetro de massa queestá sob alto vácuo. Um forte campo elétrico é aplicado entre a(s) placa(s)de amostra e de extração. Um laser é disparado na amostra, resultando emum evento de dessorção devido à absorção da energia do laser pelas molé-culas da matriz.
Dessa maneira, a invenção compreende métodos que utilizamum material que é apropriado, como um material de matriz, em um processode MALDI-TOF-MS e/ou de SALDI-TOF-MS. Sem estar ligado pela teoriacientífica, considera-se que a matéria particulada contém um material quepode absorver energia do laser e transferi-la para um analisado que estácompreendido na amostra. Na presente invenção, o analisado é tipicamenteuma substância que forma um resíduo, ou resíduos, dentro de uma impres-são digital. A transferência de energia para o analisado resulta em ionizaçãodo analisado e aceleração através do analisador de massa. Quando a MAL-DI-TOF-MS é usada dessa maneira, isto é com transferência de íons parauma amostra (analisado), é conhecida como detecção de íon positivo.
Em uma modalidade, a transferência de eléctrons pode ser doanalisado para a matéria particulada. Nessa modalidade, a MALDI-TOF-MS(ou SALDI-TOF-MS) é considerada para funcionar em um modo de ioniza-ção negativo.
Se a amostra (por exemplo, o resíduo ou o resíduo suspeito so-bre ou dentro da impressão digital) é considerada como tendo grupos fun-cionais que prontamente aceitam um próton (H+) então pode ser usada adetecção de íon positiva. Se há uma suspeita de que a amostra (por exem-plo, o resíduo ou o resíduo suspeitoso sobre ou impressão digital) tem gru-pos funcionais que prontamente perdem uma detecção de íon negativo en-tão pode ser usada a detecção de íon negativa.
O método pode permitir a presença de (i) resíduos endógenospor exemplo, metabólitos endógenos e metabólitos exógenos e (ii) resíduosde contato incluídos na impressão digital a ser determinada. Os metabólitosendógenos e os resíduos de "contato" podem ser co-depositados dentro daimpressão digital. O método pode ainda permitir a identificação do resíduo.
Uma classe de métodos pode ser usada para detectar e/ou iden-tificar resíduos endógenos, por exemplo, resíduos que foram produzidoscomo um resultado de metabolismo de uma substância pelo corpo de umapessoa. Os resíduos endógenos podem incluir metabólitos endógenos (porexemplo, metabólitos de moléculas produzidas pelo corpo) ou metabólitosexógenos (por exemplo, metabólitos de moléculas ingeridas ou transferidaspara dentro do corpo e subseqüentemente metabolizadas pelo corpo).
Outros exemplos de resíduos endógenos que podem ser identifi-cados pelo método incluem por exemplo, substâncias endógenas (por e-xemplo, esqualeno, colesterol, ceras e ésteres, esteróides por exemplo, es-trógenos e testosterona e marcadores de gênero e saúde) que podem sersecretados através dos poros da pele e depositadas com outros químicosdentro da impressão digital. O método pode também ser usado para detectaros metabólitos e conjugados dos mencionados acima. Exemplos de resíduosendógenos podem também incluir metabólitos endógenos por exemplo dro-ga e seus metabólitos incluindo drogas e seus metabólitos, drogas e meta-bólitos prescritos e compostos derivados de fontes dietéticas ou produtos dedecomposição das mesmas. O método poderia também ser aplicado à análi-se proteômica ou genômica das células (por exemplo, células de mudançade pele) ou DNA respectivamente localizadas dentro da impressão desen-volvida. O método pode também ser usado para detectar outros resíduos decontato por exemplo, drogas ilegais por exemplo narcóticos, material explo-sivo, por exemplo, material usado em processos de fabricação de bomba, eresíduo do uso de uma arma de fogo.
Em um aspecto adicional da presente invenção, é provido o usode uma técnica de MALDI-TOF-MS e/ou SALDI-TOF-MS para detectar e/ouidentificar um resíduo incluído em uma impressão digital. O resíduo pode serum resíduo endógeno e/ou um resíduo de "contato", por exemplo, resíduosde balística de, por exemplo, explosivos ou armas de fogo. Em uma modali-dade, o resíduo pode ser um resíduo de "contato", o que quer dizer, um re-síduo que foi transferido para a mão de uma pessoa, através de contato comuma substância e, subseqüentemente, transferido para uma superfície coma impressão digital da pessoa. A detecção de tais resíduos é de particularinteresse para os departamentos de anutenção da lei e podem provar seruma peça importante de evidência forense. Em uma modalidade, a matériaparticulada que compreende um material selecionado a partir de metal, óxidode metal, carbonoo e combinações dos mesmos é usada para contatar aimpressão digital e atua como uma matriz no aparelho de MALDI-TOF-MS.Em uma modalidade alternativa, a impressão digital pode sercontatada pelo agente de desenvolvimento da impressão digital que podeser usado para detectar impressões digitais. Exemplos de agentes conven-cionais de impressão digital incluem alumínio, Magneta Flake e CommercialWhite. O método pode depois tipicamente usar uma agente de matri9z deMALDI-TOF-MS por exemplo DHBA (ácido 2,5-dihidroxibenzóico) ou ácidoa-ciano-4-hidroxi cinâmico (α-CHCA) ou outro agente de matriz que podeser, por exemplo, a matéria particulada como descrita aqui a seguir.
O método da presente invenção pode ser usado para analisaruma variedade de resíduos que podem ser encontrados em uma impressãodigital. Dessa maneira, em uma modalidade, o método pode ser usado paradesenvolver e analisar impressões digitais latentes de fumantes. Ficou bemdemonstrado que a nicotina é amplamente metabolisada para cotinina invivo [22] e existe evidência de que ambas, nicotina e cotinina, são excreta-das juntas no suor [8]. As figuras 11 e 12 demonstram que a matéria particu-lada, como descrita aqui a seguir, particularmente partículas de sílica hidro-fóbica contendo uma substância selecionada a partir de metal, nitretos demetal, óxidos de metal e carbonoo, podem ser usadas como agentes de de-senvolvimento para visualizar impressões digitais latentes de fumantes, eque tais impressões podem ser analisadas por MALDI-TOF-MS diretamente,em uma superfície apropriada, ou em seguida ao "lifting" da superfície, paradetectar nicotina e/ou os seus metabólitos.
Em uma modalidade, o método descrito aqui a seguir pode serusado para detectar ou determinar se uma pessoa manuseou ou ingeriudrogas, por exemplo, cocaína.
Em outras modalidades, o método descrito aqui a seguir podeser usado como parte de uma triagem pessoal para determinar se uma pes-soa é, por exemplo, um fumante ou se tomou consumiu drogas como, porexemplo, cocaína.
Embora o método descrito possa ser usado para identificar seum resíduo particular está presente em ou dentro da impressão digital deuma pessoa, os resultados não são do mais alto nível de exatidão e podem,portanto, ser inacetáveis atualmente para o padrão requerido por por exem-plo, pelos cortes criminais. Nesses casos, por exemplo, se o método estásendo realizado com a finalidade de evidenciar o uso, perante uma corte dejustiça, ele podem ainda compreender espectrometria de massa tandem, oque quer dizer realizar uma técnica de espectrometria de massa adicional,tipicamente para prover informação estrutural para um composto presenteem um resíduo em uma impressão digital.
Dessa forma, em uma modalidade, o método compreende sub-meter uma impressão digital e/ou matéria particulada à MALDI-TOF-MS-MSe/ou SALDI-TOF-MS-MS. A MALDI-TOF-MS-MS/ SALDI-TOF-MS-MS tipi-camente fragmenta íons de amostra específica dentro de um espectrômetrode massa e, dessa maneira, provê informação estrutural adicional sobre umresíduo. Assim, em uma modalidade, o método compreende identificaçãodos íons de fragmento resultantes. Essa informação estrutural pode ser útilem certas situações, por exemplo, como mencionado acima, como evidênciaperante uma corte de justiça.
Método e usos descritos aqui a seguir podem ser usados emuma variedade de aplicações. Em uma modalidade, os métodos e usos po-dem ser utilizados como parte de um processo de triagem pessoal, por e-xemplo por funcionários, para determinar se uma pessoa fuma ou é um vici-ado em drogas ilegais. Em uma modalidade, os métodos e usos podem serutilizados como parte de um processo de "teste de droga" no campo, porexemplo, do esporte profissional ou amador.
Em uma modalidade, o método descrito aqui a seguir pode serusado para detectar resíduos, quer sejam resíduos de contato ou resíduoendógenos, que contêm substâncias ilegais ou proibidas e /ou metabólitosdas mesmas. Particularmente, o método pode ser usado para testar despor-tistas profissionais e/ou amadores em eventos desportivos e/ou testes alea-tórios para verificar a presença ou ausência de substâncias proibidas em umresíduo tirado da impressão digital da pessoa. A vantagem de usar o presen-te método sobre os métodos usados atualmente é que a análise é realizadadiretamente na impressão digital do próprio indivíduo e, dessa maneira, asubstituição de uma amostra não é possível como é ò caso nos métodosatualmente usados de amostras de urina e saliva amostras seguidas por tri-agens de análise de drogas.
O uso de MALDI-TOF-MS e/ou SALDI-TOF-MS para detectare/ou identificar um resíduo em uma impressão digital não foi anteriormenteconsiderado e, por isso, o uso dessas técnicas para detectar e/ou identificarum resíduo em uma impressão digital faz parte da invenção. O uso podecompreender por em contato uma matéria particulada, como descrita aqui aseguir, com uma impressão digital. Alternativamente, o uso pode compreen-der fazer o contato de um agente de detecção de impressão digital conven-cional com uma impressão digital. Nesta modalidade, o uso pode aindacompreender o uso de um agente de matriz que é convencionalmente co-nhecido em uma etapa de espectrometria de massa. Alternativamente, amatéria particulada, como descrita aqui a seguir, pode ser usada como umagente de matriz em uma etapa de espectrometria de massa.
Os métodos e usos da presente invenção podem também serutilizados em pontos de entrada em um país para testar os viajantes por con-ta da presença de resíduos que podem sugerir, por exemplo, manuseio outomada de droga ilegal, manuseio de substâncias proibidas por exemplo ar-mas de fogo e balística.
Como descrito acima, os métodos podem ser usados como evi-dência forense, por exemplo, manuseio de droga ou balística em uma corte,por exemplo uma corte criminal.
Matéria Particulada
A presente invenção utiliza matéria particulada que pode serposta em contato com uma impressão digital e que pode, subseqüentemen-te, ser usada em uma técnica de espectrometria de massa para determinarse um resíduo está presente na impressão digital.
A matéria particulada preferivelmente compreende um materialselecionado a partir de metal, nitreto de metal, oxido de metal, carbono ecombinação dos mesmos.
Em uma modalidade da presente invenção, a matéria particuladapode compreender partículas de sílica hidrofóbica. Uma classe de partículasde sílica hidrofóbica é possível de ser obtida pelo método a seguir:
Um método (designado como método A) para preparar partícu-las de sílica hidrofóbica é provido compreendendo fazer uma reação em con-junto, em uma única etapa, de uma mistura de (1) monômeros de éter desilano, por exemplo, um alcoxisilano e (2) monômeros de éter de silano or-ganicamente substituídos, por exemplo, um siicato modificdo por fenila, comum agente hidrolisante por exemplo um álcali.
Dessa maneira, o método tipicamente compreende o uso demonômeros de alcoxisilano. O método pode compreender o uso de tetralco-xisilanos (abreviados aqui a seguir como TAOS). Os TAOS's são particular-mente selecionados a partir de TEOS (tetraetoxisilano) ou TMOS (tetrameto-xisilano).
Em uma modalidade, a mistura ainda compreende um solventemissível em água, por exemplo, etanol, e também água. O método pode serrealizado a temperatura ambiente. A duração da reação não é crítica. A rea-ção entre os monômeros de TAOS e monômeros de PTEOS pode ser reali-zada durante a noite ou por um período de tempo equivalente, isto quer dizerentre cerca de 12 e cerca de 18 horas. A duração da reação tem um efeitosobre o tamanho das partículas de sílica produzidas. Acredita-se que quantomais cedo a reação é interrompida, menores serão as partículas que sãoformadas. Portanto, a reação pode ser realizada durante um período de me-nos de 12 horas por exemplo entre 6 e 12 horas. A reação pode ser alterna-tivamente realizada durante mais de 18 horas. Se desejado, a temperaturapode ser elevada (ou reduzida) e a duração da reação reduzida (ou aumen-tada).
O agente de hidrolização, tipicamente um álcali, atua como umcatalisador dentro da reação. Preferivelmente esse catalisador é um hidróxi-do, por exemplo hidróxido de amônio. O catalisador pode ao invés disso serum ácido. Exemplos de ácidos são os ácidos minerais, por exemplo ácidoclorídrico. Neste método, a reação compreende uma hidrólise induzida porácido.O monômero de éter de silano, por exemplo um TAOS, e o monô-mero de éter de silano organicamente substituído, por exemplo monômeros dePTEOS podem ser usados, por exemplo, em relações (PTEOS:TAOS) de 2:1até 1:2 por exemplo 4:3 a 3:4 e em particular 1.2:1, a 1:1.2. Em uma classede métodos, a relação é pelo menos cerca de 1:1, por exemplo até 1:5, porexemplo 1:2. Em uma classe de métodos, a relação PTEOS:TAOS é preferi-velmente 1:1 v/v. Deverá ser entendido que, quando um ou ambos dosTAOS e PTEOS são substituídos por reagentes alternativos, as mesmasrelações devem ser usadas.
As partículas de sílica hidrofóbicas produzidas pelo método aci-ma têm a tendência de ser predominantemente nanopartículss, o que querdizer, de um diâmetro médio de aproximadamente 200nm a cerca de 900nm,tipicamente cerca de 300nm a 800nm e particularmente 400nm a 500nm.Essas nanopartículas podem ser subseqüentemente processadas para for-mar micropartículas, que podem ser consideradas nanopartículas coalescen-tes. As micropartículas podem ser produzidas usando um método que porexemplo compreende as etapas a seguir:
i) centrifugar uma suspensão de partículas;
ii) transferir uma suspensão de partículas de sílica hidrofóbicapara o interior de uma fase aquosa;
iii) extrair a suspensão da fase aquosa para o interior de umafase orgânica;
iv) evaporar a fase orgânica; e
v) comprimir e peneirar o produto obtido em (iv).
A fase orgânica preferivelmente compreende um solvente orgâ-nico que é não polar ou tem baixa polaridade. A fase orgânica pode ser di-clorometano ou outro solvente orgânico por exemplo, alcanos, por exemplo,hexano, tolueno, acetato de etila, clorofórmio e dietil éter.
Alternativamente, micropartículas de sílica hidrofóbica podemser obtidas a partir de um produto de reação contendo nanopartículas desílica hidrofóbica usando um método que compreende:
(a) centrifugar o produto da reação; e(b) lavar o produto da reação em um fluido.
0 método pode compreender repetir as etapas (a) e (b) uma plu-ralidade de vezes. Preferivelmente1 o fluido é um aquoso: mistura de solven-te e é tipicamente uma águar:mistura de solvente orgânico. Tipicamente, osolvente orgânico é etanol. Preferivelmente o fluido inicial compreende umamistura de água e solvente orgânico a uma relação de cerca de 60 (água):40(solvente) a cerca de uma mistura de 40:60 v/v. Em outras modalidades, osolvente pode ser, por exemplo, dimetilformamida, n-propanol ou iso-propanol.
Tipicamente, a proporção de solvente na mistura é aumentadaentre a lavagem inicial (isto é suspensão) (b) e a lavagem final (suspensão).Para obter micropartículas que são nanopartículas coalescentes, a suspen-são final é secada. As micropartículas podem ser depois peneiradas. Umavez peneiradas, as micropartículas estão prontas para aplicação como umagente de desenvolvimento de impressão digital por exemplo na etapa (i) dopresente método para detectar um resíduo na impressão digital.
As micropartículas podem ser consideradas como sendo agre-gados de nanopartículas de sílica menores. Nessa modalidade, as micropar-tículas são de tamanho suficiente para serem eficientemente capturadas u-sando máscaras faciais e conseqüentemente não inaladas. Dessa maneira,em uma modalidade, as micropartículas de sílica têm um diâmetro médio depelo menos 10 μηι, tipicamente pelo menos 20 μητι. Tipicamente, as micro-partículas têm um diâmetro médio de cerca de 30-90μηι. Em algumas moda-lidades, as micropartículas têm um diâmetro médio de entre cerca de 45-65μηι ou a partir de cerca de 65 a 90μηι. Particularmente, a matéria particu-Iada que compreende as micropartículas pode ser uma matéria particuladaseca.
Em uma classe de métodos, a matéria particulada compreendenanopartículas de sílica hidrofóbica. Nanopartículas de sílica hidrofóbica po-dem ser isoladas usando um método que compreende centrifugar um produ-to de reação a partir do método A e suspendê-lo em uma mistura de solven-te aquoso. A mistura de solvente aquoso é uma primeira mistura de solventeaquoso e é preferivelmente uma mistura de 50:50. O método pode aindacompreender a remoção do produto de reação a partir da primeira misturade solvente aquoso, centrifugá-lo e suspendê-lo em uma segunda mistura desolvente aquoso. Preferivelmente, a segunda mistura de solvente aquosotem uma proporção similar de solvente e componente aquoso como a pri-meira mistura. A solução aquosa que faz parte da mistura de solvente aquo-so é preferivelmente água. O solvente que forma a porção de solvente damistura de solvente aquoso é, por exemplo, um solvente missível na água,por exemplo, etanol. Alternativamente, dimetilformamida, n-propanol ou iso-propanol podem ser usados.
A etapa de fazer a suspensão do produto de reação em umamistura de solvente aquoso pode ser repetida uma pluralidade de vezes.Preferivelmente, a composição da mistura de solvente aquoso é alteradapara aumentar a proporção de solvente na mistura de solvente aquoso du-rante o curso de suspensões repetidas. Preferivelmente, o método compre-ende, em uma etapa final, a suspensão do produto de reação em uma "mis-tura" de solvente aquoso que é 0% aquoso: 100% solvente. O número totalde suspensões é tipicamente de 3 a 10, por exemplo 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Tipi-camente, depois de cada suspensão, exceto a suspensão final, as suspen-sões são centrifugadas. As nanopartículas podem ser armazenadas na sus-pensão etanólica final. Será apreciado que a centrifugação seja um métodoexemplar de isolamento de nanopartículas da mistura de solvente aquoso eoutras técnicas de separação não estão excluídas.
Em uma modalidade, a matéria particulada compreende nano-partículas de sílica hidrofóbica. Uma classe de matéria particulada é umasuspensão de nanopartículas de sílica hidrofóbica em um fluido. O fluido po-de ser uma suspensão aquosa etanólica. Alternativamente, outros solventesorgânicos podem ser usados em lugar do etanol na suspensão, por exemplodimetilformamida, n-propanol ou iso-propanol.
A natureza física e as dimensões das partículas compreendidasdentro da matéria particulada podem ser determinadas usando scans SEM eTEM. As partículas estão na forma de sílica amorfa que é comumente usadacomo um agente antiaglutinação em uma variedade de produtos de alimen-tação, e como um agente antiaglutinação e como um excipiente em farma-cêuticos preparações de vários fármacos e vitaminas [12].
Dessa maneira, em uma modalidade preferida, a matéria particu-Iada que compreende nanopartículas é aplicada a uma impressão digital ousuperfície em um meio líquido apropriado. Tipicamente, o meio líquido é umamistura aquosa de solvente. O solvente pode ser um solvente missível emágua. Em uma modalidade, o componente aquoso é água. O solvente podeser por exemplo um solvente missível em água, isto é, 100% missível emtodas as proporções em água. Em uma modalidade o solvente é etanol. Aágua: a relação do solvente varia de cerca de 99.9:0.1 (água: solvente) atécerca de 96:4 (água: solvente). O nível de solvente preferivelmente é nãomais do que cerca de 4%, uma vez que o nível de solvente mais alto poderesultar em impressões digitais que ficam dissolvidas ou sua definição é re-duzida. É preferível incluir pelo menos uma quantidade de traço de solventepara garantir que as nanopartículas permanecem como partículas discretase não coalescentes para a formação de agregados.
Alternativamente, a matéria particulada pode compreender partí-culas de sílica hidrofóbica podem ser obtidas usando métodos da técnica,(veja por exemplo, Tapec et al NanoSci. Nanotech. 2002. Vol. 2. N2 3/4 pp.405-409; E. R. Menzel1 S. M Savoy1 S. J. Ulvick1 Κ. H. Cheng1 R. H. Murdocke M. R. Sudduth, Photoluminescent Semiconductor Nanocrystals for Finger-print Detection, Journal of Forensic Sciences (1999) 545-551; and E. R. Men-zel, M. Takatsu, R. H. Murdock, K. Bouldin and Κ. H. Cheng1 Photolumines-cent CdS/Dendrimer Nanocomposites for Impressão digital Detection1 Jour-nal of Forensic Sciences (2000) 770-773).
Em uma modalidade, a matéria particulada compreende partícu-las de sílica hidrofóbica dentro da qual um corante foi incorporado. Em umamodalidade, o corante para ser incorporado no interior da partícula pode serpor exemplo um coloerido ou um corante fluorescente. Exemplos de coran-tes incluídos no escopo da invenção são, embora não limitados a, derivadosfluorescentes por exemplo Oregon Green1 Tokyo Green1 SNAFL, e carboxi-naptofluorescente, rodamina (por exemplo rodamina B e rodamina 6G) eanálogos dos mesmos, tiazol laranja, percolato de oxazina, azul de metileno,amarelo básico 40, vermelho básico 28, e violeta cirstal e análogos dosmesmos. Sem ficar preso à teoria científica, é considerado que os corantesque são carregados positivamente, por exemplo, rodamina, são melhor in-corporados quando PTEOS é usado no método do que corantes que com-preendem grupo aniônico ou catiônico tais como grupos carboxílicos. Exem-plos de outros corantes que podem ser usados na invenção incluem aquelesque possuem uma subestrutura aromática planar e são grupos funcionaiscarregados positivamente (por exemplo, brometo de etídio e outros agentesde intercalação de DNA).
Pode ser vantajoso para as partículas que sejam magnéticas ouparamagnéticas. Por exemplo, micropartículas magnetizáveis podem facil-mente ser pulverizadas sobre as impressões digitais, usando um bastãomagnético ou outra ferramenta apropriada. Em uma modalidade preferida dainvenção, portanto, subpartículas magnéticas ou para-magnéticas são incor-poradas no interior de partículas de sílica hidrofóbica. Em uma modalidadeda invenção, as partículas são magnetizáveis por exemplo magnéticas ouparamagnéticas. As partículas magnéticas e/ou paramagnéticas podem serqualquer componente magnético ou paramagnético, por exemplo, metais,nitretos de metal, óxidos de metal e carbonoo. Exemplos de matais magnéti-cos incluem ferro, enquanto exemplos de um oxido de metal incluem magne-tita e hematita.
Em uma modalidade adicional preferida da invenção o carbono écarbono negro-de-fumo, nanopartículas de carbonoo, um composto de fule-reno ou grafite ou um análogo dos mesmos. Um composto de fulereno écomposto de pelo menos 60 átomos de carbonoo (por exemplo C6o)· Preferi-velmente, o carbono está na forma de nanopartículas de carbono. Nanopar-tículas de carbono podem estar na forma de, por exemplo, nanotubos decarbono (derivados ou não derivados). Os nanotubos de carbono podem sernanotubos de carbono de paredes múltiplas e/ou nanotubos de carbono deparede única.Em uma modalidade, o oxido de metal é selecionado a partir deoxido de titânio (TiO2), magnetita, hematita e combinações dos mesmos. Emuma modalidade, o metal é selecionado a partir de alumínio, ferro e combi-nações dos mesmos. Entretanto, consdiera-se que, em modalidades alterna-tivas, a pessoa versada considerará que o óxido de metais alternativo ou osnitretos de metal podem ser usados, os quais auxiliam no processo de des-sorção/ ionização do MALDI-TOF-MS e/ou SALDI-TOF-MS podem ser usa-dos na invenção. Similarmente, a pessoa versada considerará que outrosmetais e/ou formas de carbono que auxiliam no processo de ionização po-dem ser usados na matéria particulada. O metal, óxido de metal, nitreto demetal ou carbono podem ser embebidos no interior das partículas da matériaparticulada. As partículas da matéria particulada preferivelmente têm um di-âmetro médio de < 100μm, por exemplom, um diâmetro de < 1μm. Em umamodalidade, as partículas têm um diâmetro médio de cerca de 10nm a cercade 100μm.
A hidrofobicidade das partículas de sílica aumenta a ligação daspartículas à impressão digital. Dessa maneira, em uma modalidade, metal,óxido de metal e carbono são incorporados e/ou embebidos em uma partícu-la de sílica hidrofóbica.
Naqueles métodos que envolvem uma impressão digital, a maté-ria particulada e a impressão digital são contactadas em conjunto. Deveráser entendido que o termo "impressão digital" neste contexto pode se referira, por exemplo, uma impressão digital depositada em uma superfície ou,alternativamente, a uma impressão digital "indireta" que foi submetida à "lif-ting" a partir de uma superfície usando meios de "lifting" convencionais, porexemplo, fita de "lifting".
A aplicação da matéria particulada pode ser por meio de umbastão magnético e, nessa modalidade, a matéria particulada é magnéticaou para-magnética. Isso tem vantagens de saúde e segurança, pois reduzqualquer exposição pessoal à matéria particulada, particularmente atravésde inalação. Alternativamente, o artigo em que a impressão é depositadapode ser imerso em um meio líquido (isto é suspensão de nanopartículas) edepois removida. A duração da imersão não é crítica e pode variar de cercade 15 minutos a cerca de 12 horas ou mais.
Em uma modalidade, portanto, a matéria particulada compreen-de partículas de sílica hidrofóbica que compreendem partículas magnetizá-veis como descrito acima.
Uma classe de matéria particulada compreende partículas desílica hidrofóbica. As partículas podem ser nanopartículas ou micropartículasou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, as micropartículasde sílica têm um diâmetro médio de pelo menos 10 μηπ, tipicamente pelomenos 20 μm. Tipicamente, as micropartículas têm um diâmetro médio decerca de 30-90μm. Em algumas modalidades, as micropartículas têm umdiâmetro médio entre cerca de 45-65μm ou de cerca de 65 a 90μm.
Imagina-se que nanopartículas que têm um diâmetro médio decerca de 200nm a cerca de 900nm podem ser usadas pelos métodos. Prefe-rivelmente, as nanopartículas têm um diâmetro médio de entre cerca de 400e 500nm. Entretanto, é encarado que a matéria particulada que compreendenanopartículas tendo um diâmetro que é de cerca de 200nm a cerca de900nm por exemplo 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850 ou 900nm podem ser usadas no método.
O termo "diâmetro médio" pode ser tomado para significar um"diâmetro médio" de partículas tipicamente formadas a partir dos métodos dainvenção. O termo "médio" é um termo estatístico que é essencialmente asoma de todos os diâmetros medidos divididos pelo número de partículasusadas em cada medição. Os diâmetros de nanopartículas podem ser esti-mados a partir de gravuras SEM e a escala usada nas gravuras, e para asmicropartículas o diâmetro pode ser estimado a partir de uma combinaçãodo tamanho da peneira, os resultados das medições da distribuição do ta-manho de partícula e das gravuras SEM. Uma maneira em que um diâmetromédio pode ser determinado é usando um Malvern Mastersizer (MalvemInstruments Ltd.).
Em uma modalidade, a matéria particulada pode compreenderuma mistura de (1) partículas de sílica hidrofóbica como descrito aqui a se-guir e (2) partículas magnéticas ou paramagnéticas, por exemplo partículasde ferro.
Em uma modalidade, a matéria particulada compreende partícu-las de sílica hidrofóbica que, adicionalmente, compreendem uma moléculaque auxilia na visualização e/ou formação de imagem de uma impressãodigital. Em uma modalidade, a partícula de sílica hidrofóbica compreendeuma molécula corante. Exemplos de corantes incluem por exemplo rodaminapor exemplo rodamina 6G e derivados das mesmas. A etapa de visualizar asimpressões digitais pode ser realizada usando vários métodos conhecidosna técnica. Por exemplo, métodos ópticos podem ser usados, por exemplo,uma luz de pesquisa de UV, escaneador óptico incluindo um escaneadoróptico de base chata, um escaneador fluorescente e um escaneador visívelde UV.
Exemplos
As modalidades da invenção serão descritas a título de exemplosomente, com referência às figuras que acompanham em que;Figura 1: ilustra escaneadores fluorescentes de impressões digitais de-positados em, ou submeticos a "lifting" a partir de uma lâminade vidro usando rodamina 6G (Rh.6G) como agente de contato
(Aex 543 nm, Aem 590 nm)
Figura 1a: Impressões digitais latentes depositadas em uma lâmina demicroscópio. Superior e Inferior com Rodamina 6G, o centro éum controle em branco.
Figura 1b: As impressões digitais de 1a desenvolvidas com pó de im-pressão digital "Sunderland White" (partículas de sílica hidro-fóbida embebidas em TÍO2-)
Figura 1c: Residual das impressões de 1b depois de submetidas à "lif-ting" com fita de "lifting" de impressão digital comercial.
Figura 1d: As impressões digitais submetidas a "lifting" a partir de 1b nafita de "lifting" comercial.
Figura 2: ilustra o espectro de massa da rodamina 6G depositado a par-tir do etanol (superior), e a rodamina 6G a partir da impressãodigital submetida à "lifting" (inferior), ambos analisados na fitade MALDI (abaixo).
Figura 3: ilustra a resposta do sitema de MALDI-TOF-MS para o carbo-no negro de fumo embebido nas partículas de sílica na pre-sença e na ausência de cloridrato de cocaína.
Figura 4: ilustra uma comparação do material da matriz para detectarcocaína nas impressões digitais espetadas, aplicado direta-mente sobre uma placa de metal de MALDI-TOF-MS. O traçoinferior foi obtido quando usando ácido 2,5-dihidroxibenzoico(DHB) a 10 mg ml"1, e o traço superior com partículas de sílicahidrofóbica magnética.
Figura 4a: Comparação de material de matriz para detectar cocaína emimpressões digitais espetadas diretamente em uma placa demetal de MALDI-TOF-MS. O traço inferior foi obtido quando foiusado DHB a 10 mg ml"1, e o traço superior com partículas desílica hidrofóbica magnética.
Figura 4b: Intensidades espectrais a 304,5 m/z de impressões digitaisdepositadas em placas de metal alvo e pulverizadas com ostrês pós, tanto na presença quanto na ausência de cocaína
Figura 5: ilustrates o espectro de massa de impressões digitais latentessubmetidos à "lifting" polverizado por partículas de sílica hidro-fóbica embebidas por TiO2- para detectar contato com cocaí-na; contato positivo (traço superior), e sem contato com cocaí-na (traço inferior).
Figura 6: Uma fotografia de uma unidade única de cavidade/célula sobrea superfície de uma placa de MALDI alvo de 96 cavidades lo-calizada dentro de um espectrômetro de massa, mostrando odetalhe da crista (estrias leves) de uma impressão digital sub-metida à "lifting" pré-pulverizada com partículas de sílica hidro-fóbica embebidas em TiO2-, antes da análise por MALDI-TOF-MS.
Figura 7: ilustra intensidades relativas a 433,55 m/z (íon molecular paraesqualeno mais adução de sódio) para impressões submetidasà "lifting" pulverizadas com 10 formulações.de partículas hidro-fóbicas partículas (1-10) e controles (11 e 12). Nenhum pico a386 m/z, devido a colesterol, foi observado.
Figura 8: ilustra intensidades relativas a 433,55 m/z (esqualeno, peso daformula: 410,72, mais adução de sódio (22,99)) por padrões deesqualeno na presença de oito formulações de pós hidrofóbi-cos (1-8) e dois controles (9, 10).Figura 9: ilustra intensidades relativas a 386,37 m/z (Peso da fórmula: 386,65 para colesterol) por padrões de colesterol na presença
de oito formulações de pós hidrofóbicos (1-8) e dois controles(9,10)
Figura 10: ilustra um espectro de massa para padrões de esqualeno ecolesterol. (a) MALDI-TOF-MS para padrão de esqualeno. (b) MALDI-TOF-MS para padrão de colesterol
Figura 11: MALDI-TOF-MS de impressões digitais latentes de um não-fumante (FR) em uma placa de aço inoxidável, e picadas com10 μΙ de uma solução contendo uma 1 Mg/ml de mistura de ni-cotina (RMM 163) e cotinina (RRM 176). De cima a baixo; a- impressões latentes picadas não pulverizadas com partículas
hidrofóbicas ou tratadas com DHB
b- impressões latentes picadas tratadas com DHBc- impressões latentes picadas pré-pulverizadas com partículashidrofóbicas
d- impressões latentes não picadas pré-pulverizadas com partí-
culas hidrofóbicas
Figura 12: MALDI-TOF-MS de impressões digitais latentes de um ex-fumante (24 horas apartir do último cigarro) depositadas emum aço inoxidável pré-pulverizado com partículas hidrofóbicas a) faixa de 155-180 m/z, b) faixa de 180-205 m/z, c) faixa de
205-450 m/z
Figura 13: MALDI-TOF-MS-MS de impressões digitais latentes de umaimpressão pulverizada de um fumante. Picos em 163, 148,133, 119, 105, 91, 84 e 79 são característicos da nicotina edão uma prova sem ambigüidade de sua presença.Figura 14: MALDI-TOF-MS-MS de impressões digitais latentes de umaimpressão pulverizada de um fumante. Picos em 177, 161,147, 135, 119, 105, 97, 91 e 79 são característicos da cotininae dão prova sem ambigüidade de sua presença.
Materiais e Métodos
O escaneador Tecan LS300 usado neste estudo é da TecanUK., Reading, Berkshire. Um sistema de Kratos Axima-CFR MALDI-TOF-MS(Shimadzu Biotech, Manchester UK.) é usado com placas alvo de metalShimadzu. A matriz comercial usada é um ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB)(10 mg ml"1 em 50:50 de Acetonitrila: água desionizada [dH20]). A suspen-são de negro-de-fumo foi gentilmente oferecida por Cabot Corp, CheshireUK. Todas as outras substâncias químicas foram oferecidas por Sigma-Aldrich, Dorset UK., incluindo o dióxido de titânio na forma de anatase. Osagentes de pulverização comercial, escovas de digitalizar a impressão, bas-tões magnéticos e fitas de "lifting" comercial estão disponíveis em CrimeScene Investigation Equipment Ltd., (anteriormente K9 Scenes of Crime Ltd.)Northampton, UK.
Uma solução de calibragem foi preparada para uso no sistemade MALDI-TOF-MS. Soluções de cloridrato de papaverina (10 mg/ml emdH20), e reserpina (5 mg/ml de solução em dimetilformamida, DMF) forampreparados. Uma alíquota dessa solução de papaverina (100 μΙ) foi mistura-da com alíquotas da solução de reserpina (200 μΙ) e dH20 (400 μΙ) e DMF(300 μΙ). Uma solução de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB, 10 mg/ml) foitambém preparada em acetonitrila/água (50:50 v/v). A solução calibrantefinal foi preparada misturando junto os 10 μΙ de cada solução de DHB e amistura de reserpina e papaverina. Alíquotas (1 ul) dessa solução foram u-sadas em cada experimento e o m/z para os íons moleculares dos dois pa-drões foi usado para calibrar o sistema.Preparação de Partículas de Sílica Hidrofóbica Embebidas
Esse método é uma adaptação da preparação de sílica vaziabaseada em nanopartículas. [12], e 30 ml de etanol, 5 ml de dH20, 2,5 ml decada tetraetoxissilano e 2,5 ml de feniltrietoxissilano que são misturados emum tubo centrífugo. Para isso, são adicionados 2 ml de solução de hidróxidode amônio (28%) para iniciar a formação de nanopartículas, e a solução ésubmetida à rotação durante a noite. A suspensão particulada resultante éextraída repetidamente com dicloreto/água ou etanol/água de metileno(50:50 em ambos os casos). A suspensão é centrifugada (por exemplo, 5min em 3000 rpm). A sobrenadante é removida e são adicionados 10 ml dedH20 e o mesmo volume de diclorometano. A suspensão é submetida à ro-tação por 10 minutos adicionais, antes da suspensão ser centrifugada no-vamente. A camada superior aquosa da solução é removida e outras alíquo-tas adicionais de água e diclorometano serem adicionadas. Esse processode enxágue e centrifugação é repetido 4 vezes até que nenhuma água : di-clorometano adicionais passam ser acrescentados. Depois desse tempo, aspartículas são secadas a partir de diclorometano em uma incubadora a40°C.
Uma vez secadas, as partículas são comprimidas em uma ar-gamassa e pilão, antes de serem peneiradas para produzir tamanhos de par-tícula apropriados. As partículas hidrofóbicas foram peneiradas através depeneiras de teste de latão com malha de bronze (Endecot Ltd., London (JK)a mão. As frações dos tamanhos de partícula usadas nesse estudo foramabaixo de aproximadamente 63 μιτι. Um Malvern Mastersizer (Malvern Ins-truments Ltd., Malvern, UK) é usado para verificar as distribuições dos tama-nhos das partículas.
Para o dióxido de titânio que contém partículas, 25 mg de dióxi-do de titânio é adicionado para o tubo da centrífuga, antes da adição dosreagentes de silanização. Para as partículas de Negro-de-Fumo (CB), 5 mlde uma diluição de prega de 1:2-1:100 da suspensão do negro-de-fumo, for-necida em água, é adicionado à solução precursora no lugar do TiO2. Parapartículas magnéticas, a magnetita particulada é preparada de acordo com ométodo publicado. [13,14] 5 ml dessa suspensão em água são depois adi-cionados à solução precursora no lugar de dH20.
Demonstração de que os Resíduos de Contato são Eficazmente Submetidosao "lifting" de Impressões Digitais Latentes
Uma impressão digital foi colocada em uma solução de Rodami-na 6G (Rh 6G; 100 μg ml"1 in EtOH). O dedo foi abanado para evaporar oexcesso de EtOH antes da deposição de uma impressão digital sobre umalâmina de vidro limpa. Três impressões foram depositadas, 2 com Rh 6G eum controle em branco. Essas foram examinadas usando um escaneadorTecan LS300 (Aex 543 nm, Aem 590 nm, 120 de ganho). Elas foram depoispulverizadas com micropartículas hidrofóbicas de sílica em que, dentro de-las, foi incorporado dióxido de titânio, antes de serem visualizadas sob asmesmas condições de escaneamento. Elas foram depois submetidas à "lif-ting" usando fita de "lifting" comercialmente disponível (11,5 χ 6,5 cm) e am-bos, o resíduo sobre a lâmina de vidro e a fita de "lifting", foram escaneados.
Experimento para Demonstrar a Detecção de MALDI-TOF-MS de Resíduode Contato Submetido à "lifting" (Rodamina 6G)
Nesse experimento alguns grãos de pó de Rh. 6G foram adicio-nados diretamente na ponta de um dedo, antes da deposição como uma im-pressão digital sobre uma lâmina de vidro como antes, mas nenhum agentede pulverização foi adicionado. A impressão digital foi depois submetida à"lifting" usando uma fita condutora de duas fases, e depositada em um alvode metal. A fita condutora é apropriada para uso na MALDI-TOF e foi umpresente de Shimadzu Biotech. A placa alvo foi depois colocada dentro dosistema de MALDI-TOF-MS e a impressão digital examinada para verificar apresença de Rh. 6G. A MS resultante, com o m/z detectável para Rh. 6G emaproximadamente 444, foi comparada àquela de um padrão de 1 μΙ de umasolução de 100 μg ml"1 em etanol) equivalente a 100 ng de corante deposi-tado sobre uma peça de fita plana.
Experimento para demonstrar a eficácia do neqro-de-fumo embebido compartículas de sílica como agentes intensificadores em SALDI-TOF-MS
A resposta do instrumento para células com nanopartículas em-bebidas em CB- na presença e ausência de cocaína, que foram depositadasnas áreas/células circulares na superfície da placa alvo de metal, foi estuda-da. Todos os resultados foram executados em triplicata. O cloridrato de co-caína (1μg espalhado como 1μΙ de uma 1 mg/ml de solução de etanol)) foiadicionado a 2 conjuntos de cavidades. O conjunto positivo, 1 μl de 10 mgml"1 de suspensão de nanopartículas embebidas em CB- (matriz) foi adicio-nado à célula. O outro conjunto foi deixado como um controle para mostrar aresposta da cocaína sem qualquer matriz. Um controle de matriz na ausên-cia de cocaína foi também estudado como foram células vazias do metalalvo. As células foram secadas como previamente descrito, antes da análise.
Detecção de Resíduos de Contato de Cocaína por MALDI-TOF-MS
Uma quantidade pequena (uns poucos grãos) de cloridrato decocaína foi depositada em uma ponta de dedo colocando a ponta do dedoem uma droga. Depois o dedo foi posto em contato direto com uma placaalvo de metal limpa, depositando uma impressão sobre a superfície do alvoe a impressão resultante cobriu inúmeras células/cavidades na superfície. Asimpressões latentes foram depois pulverizadas com as partículas de sílicahidrofóbica embebidas com magnetita, ou agentes comerciais de pulveriza-ção. Esses foram: pó de alumínio, Magneta Flake® e pó branco que se achouconter dióxido de titânio. Um bastão magnético comercial foi usado para a-plicar os dois pós magnéticos, enquanto uma escova comercial foi usadapara os pós não magnéticos. Para provar a presença de cocaína na impres-são digital, a matriz comercial DHB, 10 μl de 10 mg ml"1 foi misturada com 10μl de 10 mg ml"1 de solução de cloridrato de cocaína e 1μl dessa mistura foiadicionado às cavidades do alvo MALDI. O alvo de metal foi depois secadoem uma caixa de aquecimento (Shimadzu/Kratos Instruments) e subseqüen-temente colocado no sistema MS.
Experimento para demonstrar a eficácia das Partículas de TiQp/PTEOS paraa Detecção de Resíduos de Cocaína nas Impressões digitais submetidas à"liftinq"
Impressões digitais perfuradas com cocaína e vazias foram de-positadas sobre lâminas de vidro como descrito acima. Essas foram desen-volvidas usando partículas de Ti02/PTE0S usando uma escova de digitalizarimpressão Zephyr. As impressões foram depois submetidas à "lifting" usan-do uma fita de "lifting" comercial e isto foi invertido e o lado da impressãoprojetado até a placa alvo de MALDI. As impressões digitais foram depoisexaminadas para verificar a presença ou ausência de cocaína por MS.
Detecção de Colesterol e Esqualeno em Impressões Digitais pelo Uso deMALDI- TOF-MS, Usando as Partículas como Matriz Intesificadora
Uma placa alvo de metal foi limpada e secada. Doze impressõesdigitais de índice de mão direita foram depositadas sobre a placa de metal.Essas foram depois deixadas para secar em uma incubadora a 37°C durantecerca de 1,5 hora. Cada impressão digital foi pulverizada com dez formula-ções diferentes de partículas hidrofóbicas preparadas como descrito acima.O agente embebido dentro das partículas é apresentado entre parêntesesem cada caso. Além disso, alguns dos pós resultantes (1,5,6 e 8), foramtambém subseqüentemente e completamente misturados com DHB paraproduzir 1% peso/peso da formulação. Esses foram usados para determinarse a presença dessa matriz melhorou a detecção de esqualeno na impres-são latente em seguida à pulverização e MALDI-TOF-MS. Quatro formula-ções de pó Preto foram usadas. Essas tinham proporções diferentes de Ne-gro-de-fumo dentro delas resultantes da síntese inicial. Os números entreparênteses referem-se à relação de negro-de-fumo ao dH20 usado na sínte-se inicial:1. Pó branco A (dióxido de titânio; 1,0% peso/peso DHB; pó)2. Pó branco B (dióxido de titânio)3. Pó violeta A (violeta cristal)4. Pó preto A (1:10)5. Pó preto B (1:10, 1,0% peso/peso DHB: pó)6. Pó violeta B (violeta cristal; 1,0% peso/peso DHB: pó)7. Pó fluorescente vermelho A (rodamina 6G)8. Pó fluorescente vermelho B (rodamina 6G; 1,0% peso/peso DHB: pó)9. Pó preto C (1:5)10. Pó preto D (1:2)Cada uma das dez primeiras impressões foi individualmente pul-verizada com os pós numerados de 1 a 10 correspondentes, e as impres-sões resultantes foram fotografadas com uma câmera digital (as fotografiasnão estão mostradas). Elas foram depois individualmente analisadas emMALDI-TOF-MS, incluindo uma impressão que não tinha sido tratada com oagente ou matriz (impressão 12), e uma impressão pulverizada somentecom apenas ácido de dihidroxibenzóico (impressão 11).Detecção Direta de Colesterol e Esgualeno pelo Uso de MALDI-TOF-MS.Usando as Partículas Hidrofóbicas como Matrizes Intensificadoras Soluções de colesterol e esqualeno (ambas 2 mg/ml) foram pre-
paradas em 100% de etanol e 500 μΙ alíquotas de cada solução e foram mis-turas juntas. 24 pontos (cada um de 0,5 μΙ) dessa solução foram espalhadossobre um alvo de metal seco limpo, e deixado para secar no ar durante 2horas. As cavidades individualmente pulverizadas com cada formulação de oito pós hidrofóbicos (3 pontos para cada formulação). As formulações foramidênticas àquelas descritas em 2.8:
1. Pós Fluorescente Vermelho A
2. Pó preto A
3. Pó preto B4. Pó violeta A
5. Pó violeta B
6. Pós Fluorescente Vermelho B
7. Pó preto C
8. Pó preto D
A pulverização foi realizada como descrito acima sobre a super-
fície da placa de metal com cada um dos pós. Uma solução separada foitambém preparada misturando 500 ^da solução de colesterol/esqualenocom 500 μΙ da solução de 10 mg/ml de DHB (matriz). Três pontos (0,5 μΙ)dessa solução foram também espalhados sobre o alvo de metal e deixadosno ar seco. Cada ponto no alvo de metal foi analisado na MALDI-TOF-MS, eos picos para ambos, colesterol (m/z 386) e esqualene (m/z 410) e suas a-duções de metal foram monitoradas.Resultados
Demonstração de que Os Resíduos de Contato são Eficazmente Submeti-dos à "liftinq" a partir de Impressões Digitais Latentes
A eficiência do processo de "lifting" de impressão digital e o de-talhe da estria resultantes das impressões foram estudados. A rodamina 6Gfoi usada como um contato modelo devido a sua alta fluorescência. Assim,as impressões de alta fluorescência foram vistas em seguida ao contato (im-pressões superiores e inferioes na Fig 1a), enquanto que a impressão nor-mal (centro da Fig 1a) não foi fluorescente sob as condições de escanea-mento usadas.
Quando o agente de pulverização de sílica hidrofóbica foi aplica-do para as três impressões, elas se tornaram visualmente distintas (não a-presentadas) e todas as três impressões agora deram impressões claras emescaneamento fluorescente (Fig 1b) devido à fluorescência da rodamina etambém devido à luz espalhada a partir das partículas de sílica depositadasna impressão. Seguindo o "lifting" das impressões usando a fita de "lifting",pouca fluorescência permaneceu na superfície da lâmina de vidro (Fig 1c)demonstrando a eficiência do processo de "lifting". Escaneamentos da su-perfície da fita agora revelaram impressões "fluorescentes" demonstrandoque as impressões submetidas à "lifting" de agente de pulverização perma-necem intactas durante esse processo (Fig 1d).
Os resultados vistos na Figura 1 sugerem que a aplicação de fitade "lifting" comercial resulta na trasferência da massa do material depositadoda impressão digital latente a partir da lâmina de vidro sobre a fita. Essa se-ria a primeira etapa na detecção de qualquer material na impressão digitallatente por MALDI-TOF-MS.
Detecção por MALDI-TOF-MS de Resíduo de Contato Submetido à "liftinq"(Rodamina 6G)
Dado o sucesso desse experimento, surgiu a hipótese de que arodamina submetida à "lifting", a partir da superfície de lâminas microscópi-cas de vidro, poderia ser detectada usando MALDI-TOF-MS. Os resultadossão apresentados na figura 2. O traço superior é aquele da impressão digitalsubmetida à "lifting" e tem um pico a 443t m/z correspondente a Rh 6G. Oespectro inferior é do padrão de Rh 6G adicionado diretamente ao alvo deMALDI. As formas e padrões dos picos são similares sugerindo o mesmocomposto. A massa diminuída vista no traço superior é provavelmente devi-dao à ligeira elevação da fita usada durante a deposição da fita de "lifting"sobre a placa alvo que deveria diminuir o tempo de vôo das espécies ioniza-das.
A fita condutora é projetada para ser grudada plana a um alvo deMALDI e a amostra adicionada à superfície superior. È também relativamen-te frágil e facilmente esticada o que poderá distorcer a impressão digital de-senvolvida original. Com dificuldade, ela foi usada para submeter à "lifting" aimpressão da lâmina do microscópio e foi depositada no alvo de MALDI damelhor forma possível. Não foi possível torná-la plana devido a sua fragilida-de e natureza pegajosa.
Os resultados apresentados na Figura 2 demonstraram que osresíduos de contato, na forma de um pó, podem ser submetidos à "lifting" apartir de uma superfície e podem ser detectados com sucesso usando o sis-tema de MALDI-TOF-MS.
Eficácia das Partículas de Sílica Embebidas em Neqro-de-fumo como Agen-tes Intensificadores na MALDI-TOF-MS para Cocaína
Para demonstrar que os resultados foram observados na pre-sença da matriz e da cocaína, e não a partir do sinal de antecedentes, análi-ses adicionais foram realizadas usando quantidades de cocaína e matrizconhecidas. As respostas das partículas de sílica magnética, na presença eausência de cocaína, foram comparadas às respostas do alvo vazio e decocaína sem qualquer matriz.
As respostas a 304 m/z das partículas de sílica embebidas emnegro-de-fumo na presença e ausência de cocaína foram comparadas àsrespostas o alvo em branco e cocaína sem nenhuma matriz de DHB. As in-tensidades dos picos de MS devido à cocaína são apresentadas na Figura 3.A presença das partículas de sílica resultou em um aumento de 10- vezes aintensidade do pico comparado com aquela vista na ausência da cocaína.Boa reprodutibilidade foi observada (intensidade média 90,275 e um rsd de5,8%, n=3) comparada com os resutados correspondentes na presença deDHB de 56,552 e um rsd de 112%, n=3.
O uso de SALDI potencial de partículas embebidas em negro-de-fumo comparado com a matriz de DHB convencional foi estudado. O clo-ridrato de cocaína foi usado como o analisado do alvo, como a identificaçãodeste nas impressões digitais é de interesse para os órgãos de manutençãoda lei, pois ele pode demonstrar que o indivíduo que proveu a impressãodigital esteve em contato com a cocaína. Os espectros de massa de cocaínana presença de uma matriz química convencional (DHB) e a nova matriz depulverização são apresentados na Figura 4 na qualidade de impressões de-positadas diretamente no alvo de MALDI de metal. O espectro inferior mos-tra aquele da cocaína na presença de DHB enquanto que o superior mostraa cocaína na presença de nanopartículas de PTEOS magnéticas, deposita-das pelo bastão magnético. Ambos mostram espectros similares, correspon-dendo àquele da droga, mas com uma resposta aparentemente aumentadana presença das partículas magnéticas. Isto mostra que as partículas dePTEOS magnéticas auxiliam com o processo de dessorção de cocaína deuma maneira similar àquela da matriz convencional. O PTEOS magnéticotambém apresentou potencial como um pó de visualização de impressãodigital como um bom detalhe de estria foi observado nas impressões desen-volvidas (não mostrado).
Resultados similares foram também observados para picos decocaína a 304,5 m/z para impressões de contato depositadas em uma placaalvo de metal e pulverizadas com pós hidrofóbicos contendo dióxido de titâ-nio, negro-de-fumo (1:10), ou tratadas com DHB ou que foram deixadas nãotratadas (detalhes não apresentados) quando as intensidades relativas eram1,700, 10,000, 9,000 e 100 mV respectivamente (Figura 4b).
Eficácia das Partículas Embebidas em TiO? para a Detecção de Resíduos deem Impressões Digitais Submetidas à "liftinq"
Tendo demonstrado a eficácia do processo de "lifting" (Figuras 1e 2), e a detecção de cocaína a partir de impressões latentes espetadas nosalvos de MALDI (Figuras 3 a 5), levantou-se a hipótese de que a cocaínapoderia ser detectada em impressões digitais submetidas à "lifting" direta-mente da fita de "lifting" comercial. Os resultados são apresentados na Figu-ra 6. O traço inferior é aquele observado para a impressão submetida à "lif-ting" que não esteve em contato com cocaína, enquanto que a superior é ade uma impressão que esteve em contato com a droga. Um pico limpo ésomente visto no traço superior a m/z em 304 correspondendo à cocaína.
Em ambos os casos, as impressões originais foram pulverizadas com partí-culas de sílica hidrofóbicas embebidas em TiO2-. A Figura 7 mostra a áreaalvo analisada pela MALDI-TOF da impressão digital espetada com cocaína.
Uma fotografia similar foi obtida para o controle negativo (não apresentada).
O diâmetro da cavidade é de 3,4 mm e o detalhe da estria limpa da impres-são digital pode ser observado. Os espectros na Figura 6 foram obtidos porescaneamento a laser sobre as áreas definidas dentro das células e a médiados sinais calculada para produzir os espectros.
Detecção de colesterol e esqualeno a partir de impressões digitais pelo usode MALDI- TOF-MS, usando as partículas hidrofóbicas como matriz intensi-ficdora
Neste experimento 12 impressões foram depositadas diretamen-te sobre uma placa alvo de MS de aço inoxidável. Depois de envelhecidas,as impressões foram pulverizadas com uma das dez formulações diferentesdo agente de pulverização hidrofóbica. As impressões foram depois subme-tidas à "lifting" e examinadas usando o sistema de MALDI-TOF-MS.
Foi anticipado que ambos, colesterol e esqualeno, seriam detec-tados, mas na prática somente o esqualeno foi observado. Isso foi visto am/z de 433 correspondendo ao íon molecular mais a adução de sódio. Comovisto na Figura 7, a intensidade observada na ausência de qualquer agenteintensificador foi cerca de 2,000 mV (impressão 12). Isso foi intensificado atécerca de 14,000 por DHB. Dos pós, aqueles contendo as proporções maisaltas de negro-de-fumo deram as melhores respostas (impressões 9 e 10), ea proporção mais alta de carbono quanto mais intenso o pico, de modo quea amostra com a maior intensidade de cerca de 22,000 mV, foi associadacom um negro-de-fumo: relação de diluição de 1:2.
Geralmente a presença de DHB dentro do pó ligeiramente inten-sificou a intensidade do pico (impressões de dióxido de titânio 1 e 2-, relaçãode negro-de-fumo 4 a 5 de 1:10), porém isso apresentou a tendência paranão ser visto no caso de pós contendo os corantes de cristal violeta (3 e 6) erodamina 6G (7 e 8) em que baixos sinais equivalentes a ou menos do que aimpressão não tratada 12 foram produzidos.
Detecção Direta de Colesterol e Esoualeno Através do Uso de MALDI-TOF-MS, Usando Partículas Hidrofóbicas como Matrizes de Intensificação
Uma vez que o colesterol não foi visto na MS das impressões,foi decidido determinar se esse composto poderia ser detectado usando osistema de MALDI-TOF-MS na presença de DHB e de novos agentes depulverização. Em conseqüência, os padrões de uma mistura de esqualeno ecolesterol foram depositados sobre a superfície de uma placa alvo de metale oito conjuntos desses pontos em triplicata foram pulverizados com oitoformulações de pós hidrofóbicos usados em 3,6, ou foram tratados comDHB, ou deixados sem serem tratados.
Nesse caso, os picos devido a esqualeno foram novamente ob-servados a m/z de 433 devido à adução de sódio do composto, com pós 1,2, 7 e 8 dando sinais de que foram apreciavelmente maiores do que a inten-sidade vista na presença de DHB (Figura 8). A maior intensidade foi vistacom o pó fluorescente vermelho (rodamina 6G, pó 1, 49,000 mV), com ne-gro-de-fumo novamente dando boas respostas (1:10, 6000 mV; 1:5, 36,000mV; e 1:2, 4,000 mV). Um pico a m/z de 386 foi agora observado, mas emtodos os casos os valores de intensidade foram muito mais baixos do queaqueles vistos para o esqualeno. O mais alto foi produzido na presença dopó contendo corante de cristal violeta (1,800 mV, pó 4), com aqueles con-tendo negro-de-fumo também produzindo picos relativamente bons (todos cer-ca de 800 mV para o pó 3,1:10 mais DHB, pó 7,1:5 e pó 8,1:2) (Figura 9).
Os atuais espectros desses dois compostos são apresentadosna Figura 10a (esqualeno) e figura 10b (colesterol). Esses claramente mos-tram a melhor resposta de esqualeno sob as condições usadas.Detecção Direta de Metabólitos Exóqenos de Fumantes em Impressões Digi-tais Latentes Pulverizadas Usando MALDI-TOF-MS
O agente de pulverização hidrofóbica usado foi um agente incor-porado ao negro-de-fumo formado com uma proporção de partida de negro-de-fumo: PTEOS de 1:2, a síntese do qual é descrita na próxima seção des-te relatório.
Esse foi homogeneamente incorporado em uma mistura de par-tículas de ferro finas (diâmetro < 60 μΜ) e ácido esteárico (1,0 % peso/peso)de modo que a proporção de partículas hidrofóbicas para as partículas deferro foi 2: 98 peso/peso. Impressões latentes foram pulverizadas usando umbastão magnético comercial e ou analisadas in situ quanto às impressões nasuperfície de placas de aço inoxidável (placas alvo de MALDI-TOF-MS daShimadzu), ou submetidas à "lifting" usando fita de "lifting" comercial. As im-pressões submetidas à "lifting" foram ligadas, o lado da impressão para ci-ma, nas placas alvo usando fita adesiva comercial. A MALDI-TOF-MS foirealizada usando um Kratos Axima CFR Plus MALDI-TOF-MS (ShimadzuBiotech, Manchester, UK), operado em modo de "reflectron" de íon positivo.A matriz comercial usada foi o ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB) (10 mg ml"1em 50:50 de acetonitrila: água deionisada [dH20]).
Os resultados apresentados na Figura 11 demonstram que ne-nhum pico, devido à nicotina (FW 162) ou cotinina (FM 176), é observado naausência de um agente de intensificação da matriz para uma impressão la-tente que é espetada com a mistura de nicotina e cotinina (10 ng de cada,11a). Quando o DHB do agente de auxílio da matriz convencional é adicio-nado às impressões que foram espetadas com cada um dos compostos, en-tão os picos em 163 e 177 são observados (11c). Quando o agente de pul-verização hidrofóbica é adicionado às impressões latentes espetadas, entãoos picos em 163 e 177 são novamente observados indicando que esse a-gente também atua como um agente intensificador. Um pico adicional emm/z 199 é agora observado provavelmente devido à adução de sódio de co-tinina. Um pico em m/z 157 é observado no espectro em relação a uma im-pressão não espetada pulverizada com um agente de pulverização hidrofó-bica, junto com um pico a m/z em 163, de aproximadamente a mesma inten-sidade. Nenhum pico foi observado nesse espectro (11 d) em 177 e 199. De-ve-se observar que na Figura 11b, o pico em 163 é de intensidade conside-ravelmente maior do que o pico em 157, presumivelmente devido à presençade nicotina.
A Figura 11 claramente demonstra que nicotina e cotinina (am-bas de 10 ng por impressão), quando aplicadas às impressões digitais laten-tes, não podem ser detectadas por TOF-MS, somente quando nenhum in-tensificador de matriz tal como DHB é adicionado (11a comparado com 11c).Essa figura também demonstra que o agente de pulverização hidrofóbicausado para desenvolver a impressão latente também atua como um intensi-ficador de tal maneira que esses compostos são novamente detectados(11b). Os principais picos foram encontrados em valores de m/z de 163,3 (opeso da fórmula para nicotina é de 162,23) e 177,3 (o peso da fórmula paracotinina é de 176,22) e 199,2. Este último pico é possivelmente devido à a -dução de sódio de cotinina (Ci0H12N2ONa, peso da fórmula de 199,21). Es-ses picos estão ausentes da impressão digital latente pré-pulverizada quenão foi espetada com nicotina e cotinina (11d).
Os espectros correspondentes para um ex-fumante, que nãofumou durante 24 horas, são apresentados na Figura 2. Picos maiores nãodevidos à matriz de pulverização são vistos em m/z de 163,1 (nicotina) e199,1 (adução de sódio de cotinina) com um pico menos em 177,1 (cotinina).
É do interesse notar que, quando os espectros em números demassa mais altos são examindos, os picos em 307,4 e 433,4 são vistosquanto às impressões aplicadas diretamente em placas de aço inoxidável.Esses são provavelmente devidos à adução de sódio de ácido esteárico (FW307.47) e a adução de sódio de esqualeno (FW 433.71) respectivemente.Esses originados do ácido esteárico usados na formulação do agente depulverização, e do esqualeno natural secretado como um componente endó- geno da impressão digital.
Esses picos podem ser usados para calibrar os picos obtidoscom impressões submetidas à "lifting" uma vez que eles estão presentes nasuperfície da fita de "lifting" que é, ela mesma, ligada à da placa alvo de açoinoxidável. Isso eleva a superfície de modo que o tempo de vôo das espé-cies ionizadas é agora menor do que a partir da superfície de aço e os valo-res dos picos de m/z aparentes são menores. Dessa maneira, para os es-pectros obtidos para as impressões de fumantes, em fitas submetidas à "lif-ting", os picos para as aduções de sódio são vistos em 305,1 e 431,2, juntocom os picos em 174,6 (maior) e 197,4. As massas menores dos picos po-dem ser corrigidas por unidades de 2,3 m/z dando picos a 176,9 (cotinina) e199,7 (adução de cotinina de sódio).
Os picos em 161, 167 e 168 são consistentemente vistos no MSde fumantes. Sabe-se que embora a nicotina constitua cerca de 95% dosalcalóides nas folhas de tabaco, uma variedade de outros alcalóides tambémestá presente. Desses, a nornicotina (RMM 148) e a anatabina (RMM 160)são as mais abundantes [22]. O pico a m/z em 161 pode ser devido à anata-bina, uma vez que as formas protonadas de nicotina e cotinina são observa-das nos espectros, entretanto um trabalho adicional é necessário para con-firmar isto.
Preparação de Agente Incorporado de Neqro-de-fumo
O método básico para a preparação de nanopartículas vaziasenvolve misturar 30 ml de etanol, 5 ml de dH20, 2,5 ml de cada um de tetra-etoxissilano (TEOS) e 2,5 ml de feniltrietoxissilano (PTEOS) em um tubocentrífugo. Adicionar a essa mistura 2 ml de solução de hidróxido de amônioe fazer rodar a solução durate uma noite. Depois desse tempo centrifugar asuspensão (3 minutos a 3,000 rpm).
O produto é isolado em seguida a uma série de etapas de centri-fugação e lavagem usando 10:90 v/v etanol/água e depois retendo comouma suspensão em 97:3 v/v água/etanol. Esses foram também submetidos àanálise de distribuição do tamanho de partícula, e SEM e TEM.
Para partículas de negro-de-fumo, 5 ml de uma diluição de 1:100de solução de negro-de-fumo em água é adicionada à solução precursora.Para partículas magnéticas revestidas de TEOS:PTEOS, uma magnetita par-ticulada é preparada de acordo com os métodos publicados e 5 ml da sus-pensão em água adicionada à solução precursora.
Os Parágrafos a Seguir Fazem Parte da Descrição:
1. Um método de determinar a presença de um resíduo dentrode uma impressão digital localizada em uma superfície, o dito método com-preendendo a etapa de;
i) aplicar à impressão digital uma matéria particulada compreen-dendo um metal, oxido de metal ou partícula de carbono;
ii) submeter a impressão digital à espectrometria de massa paradetectar a presença ou ausência do dito resíduo.
2. Um método de acordo com o parágrafo 1, em que a técnicaespectrofométrica de massa é MALDI-TOF-MS ou SALDI-TOF-MS.
3. Um método de acordo com o parágrafo 1 ou 2 em que o mé-todo adicionalmente inclui visualização da impressão digital latente usando acomposição.
4. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3,em que o oxido de metal é óxido de titânio, oxido de ferro (magnetita) ou ometal é alumínio ou ferro.
5. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3,em que o carbono é negro-de-fumo, um composto de fulereno ou grafite ouum análogo dos mesmos.
6. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5,em que a matéria particulada compreende partículas que o dito metal, óxidode metal ou carbono estão embebidos.
7. Um método de acordo com o parágrafo 6, em que o diâmetroda partícula é ^ 100 m.
8. Um método de acordo com o parágrafo 7, em que o diâmetroda partículaéál m.
9. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6 a 8,em que as partículas são partículas de sílica hidrofóbica.
10. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6 a9, em que a partícula adicionalmente compreende um corante.
11. Um método de acordo com o parágrafo 10, em que o coranteé fluorescente.
12. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6 a 11, em que a partícula é magnética ou para-magnética.
13. Um método de acordo com o parágrafo 12, em que a partícu-Ia é uma nanopartícula magnética de feniltrietoxissilano (PTEOS).
14. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6 a 13em que o resíduo é um metabólito endógeno.
15. Um método de acordo com o parágrafo 14, em que o meta-bólito endogeno é esqualeno.
16. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 14,em que o resíduo é um resíduo de contato.
17. Um método de acordo com o parágrafo 16, em que o resíduode contato é um narcótico.
18. Um método de acordo com o parágrafo 17, em que o narcó-tico é cocaína.
19. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18,em que pelo menos um metabólito endógeno e pelo menos um resíduode contato são co-depositados dentro da impressão digital.
20. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 19,em que a impressão digital é depositada diretamente no suporte de a-mostra de MALDI-TOF-MS/SALDI-TOF-MS antes da aplicação da matériaparticulada.
21. Um método de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 19,em que a impressão digital é submtida à "lifting" a partir de seu sítio dedeposição usando uma fita de "lifting" e contatada com o suporte da amostrade MALDI-TOF-MS/SALDI-TOF-MS antes da aplicação da matéria particulada.
22. Um método como substancialmente aqui a seguir descritocom referência aos exemplos que acompanham.Referências
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Claims (30)

1. Método para determinar a presença de um resíduo dentro deuma impressão digital, caracterizado pelo fato de que uma técnica de espec-trometria de massa auxiliada por matriz é usada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo:i) aplicar à impressão digital matéria particulada que (1) é capazde atuação como a matriz em uma técnica de espectrometria de massa auxi-liada por matriz; e (2) auxilia a detecção e/ou criação de imagem de umaimpressão digital, para formar uma impressão digital aplicada à partícula; e;ii) submeter o material de formação da impressão digital aplicadaà partícula a espectrometria de massa de modo a detectar a presença ouausência do resíduo.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a matériaparticulada é hidrofóbica.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3,em que a matéria particulada compreende partículas de sílica hidrofóbica.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, em que a matéria particulada compreende um metal, nitreto de metal, oxi-do de metal ou carbono.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o oxido de metal é selecionado a partir de oxido de titânio, oxidode ferro (magnetita), hemaíita e combinações dos mesmos.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o carbono é selecionado a partir de negro-de-fumo, um compostode fulereno, nanotubos de carbono, grafite, um análogo dos mesmos oucombinações dos mesmos.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o metal é selecionado a partir de alumínio, ferro e combinaçõesdos mesmos. ν
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, em que a matéria particulada compreende partículas de sílica hidrofóbicae o metal, nitreto de metal, oxido de metal ou a partícula de carbono estáembebida dentro das partículas de sílica hidrofóbica.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o diâmetromédio da partícula é £ 100pm e opcionalmente é um diâmetro médio a partirde cerca de 10 a cerca de 90pm, opcionalmente cerca de 45 a cerca de 65μm e ainda opcionalmente cerca de 65 a cerca de 90pm.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o diâmetromédio das partículas é < 1μm e opcionalmente cerca de 200 a cerca de 900nm, opcionalmente cerca de 300 a cerca de 600nm e ainda opcional-mente cerca de 400 a cerca de 500nm.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, em que o material particulado adicionalmente compreende uma moléculacorante.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a molécu-la corante é fluorescente ou colorida.
14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou reivindicação 13, em que uma molécula corante e/ou molécula colorida é embebida dentroda partícula de sílica hidrofóbica.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 14, em que o material particulado é magnético ou para-magnético.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15, em que a impressão digital é submetida à "lifting" a partir de seu sítio dedeposição usando uma fita de "lifting", e contactada com um suporte de a-mostra de espectrometria de massa, depois que a matéria particulada foiaplicada à impressão digital.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, em que a técnica de espectrometria de massa auxiliada por matriz éMALDI-TOF-MS ou SALDI-TOF-MS.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que a técnica auxiliada por matriz é selecionada a partir de MALDI-TOF-MS-MS, SALDI-TOF-MS-MS e combinações dos mesmos.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, que adicionalmente inclue visualização e/ou criação de imagem daimpressão digital.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, que o resíduo é um resíduo endógeno por exemplo um metabólitoendógeno e/ou um metabólito exógeno.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o metabó-lito endógeno é esqualeno.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o metabó-lito endógeno é um metabólito de nicotina, por exemplo cotinina.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-19 em que o resíduo é um resíduo de contato.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o resíduode contato é um narcótico.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o narcóti-co é cocaína.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an-teriores, em que pelo menos um resíduo endógeno e pelo menos um resíduode contato são co-depositados dentro da impressão digital.
27. Combinação de uma fita de "lifting" de impressão digital euma matéria particulada compreendendo um material que (1) é capaz deatuar como um agente de matriz em uma técnica de especteometria auxilia-da por matriz; e (2) auxiliar a detecção e/ou criação de imagem de uma im-pressão digital, para formar uma impressão digital aplicada à partícula.
28. Combinação de acordo com a reivindicação 27, em que amatéria particulada é hidrofóbica.
29. Uso de uma técnica de espectrometria de massa auxiliadapor matriz para determinar um resíduo dentro de uma impressão digital.
30. Uso de acordo com a reivindicação 29, em que a técnica deespectrometria de massa auxiliada por matriz é selecionada a partir deMALDI-TOF-MS, SALDI-TOF-MS e combinações das mesmas.
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