KR101720608B1 - 대사 지문용 재료 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다공성 졸-겔 재료에 그래핀옥사이드를 도입시킨 필름 형태의 표면 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석(SALDI MS)을 위한 대사 지문용 재료와 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 그래핀옥사이드를 다공성 졸-겔 필름에 도입시킴으로써, 그래핀계 SALDI MS의 이온화 특성을 유지하면서 주변의 장해 요소를 감소시킬 수 있었다. 또한, 그래핀옥사이드가 도입된 졸-겔 필름은 주입된 그래핀옥사이드의 이온화 특성을 잃어버리지 않으면서 메트릭스 재료의 백그라운드 신호를 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 장시간 동안 SALDI MS 성능에서의 안전성을 나타냈다.
또한, 졸-겔 구조의 다공성 특성은 메트릭스와 샘플 간에 우수한 접촉효과를 제공하여 분석물로 레이저 에너지를 효과적으로 전달할 수 있다.

Description

대사 지문용 재료 및 이의 제조방법{Materials for metabolite fingerprinting, and method for preparing thereof}
본 발명은 대사 지문용 재료 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 그래핀옥사이드를 다공성 졸-겔 필름에 도입시켜 표면 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 이용한 다양한 대사산물의 분석에 유용한 대사 지문용 재료와 이의 제조방법에 관한 것이다.
대사 지문(Metabolite fingerprinting)은유전적, 환경적, 화학적, 또는 병적인 요인에 의해 발생된 대사물질의 변화를 규명하기 위하여, 주어진 샘플에서 대사물질의 스냅샷을 얻는 방법이다. 높은 처리량(throughput)을 가지는 스크리닝법은 표현형질에 의한 분류(phenotypic classification), 돌연변이 스크리닝, 생물학적 제품의 품질 관리, 및 질병 진단과 같은 다양한 연구 분야에 활발하게 적용되고 있다.
NMR, IR, MS와 같은 대사 지문분석 방법 중, 기질-보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석(matrix-assisted laser desorption/ionizationmass spectrometry, 이하'MALDI MS' 라 함)플랫폼은 속도, 염 내성(salt tolerance), 및 생물학적 원재료 분석능과 같은 이유로 지대한 관심을 받고 있다. 그러나, 레이저-흡수 매트릭스로 저분자량 유기산을 이용하는 종래 MALDI MS는 m/z<500의 영역에서 메트릭스의 백그라운드 이온 신호로 인해 작은 대사체를 검출하는 데 있어 심각한 방해가 되고 있다.
이러한 문제를 극복하기 위하여, 표면 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석(surface-assisted laser desorption/ionization mass, 이하 'SALDI MS'라 함)이도입되었는데, 이 방법은 레이저 탈착/이온화 메트릭스로서 저분자량 유기산 대신에 나노구조 또는 다공성 및 거친 표면을 가지는 무기 물질을 도입함으로써 저분자량 영역의 신호방해를 최소화시킨 것이다.
이러한 무기 SALDI 메트릭스 중에서, 그래핀, 산-산화된 그래핀(acid-oxidized graphene), 그래핀옥사이드(GO), 및 환원된 그래핀옥사이드를 포함하는 그래핀계 재료들이 많은 관심을 받고 있는데, 이는 이들 재료가 다른 카본 나노구조 메트릭스에 비해 우수한 표면적을 가지고, 우수한 전기적 특성, 낮은 백그라운드 이온 신호, 우수한 분석 효능 또는 흡착능을 가지기 때문이다.
그러나, 상기 그래핀계 메트릭스를 이용하여 SALDI MS 에서 효과적인 분석능을 나타내는 대사 지문 재료에 대한 개발은 미흡한 실정이다.
JP 2006-504093
W.-Y. Chen and Y.-C. Chen, Anal. Chem., 2003, 75, 4223-4228.
본 발명에서는 최초로 그래핀계 SALDI MS를 대사 지문용 플랫폼으로 연구하였으며, 대부분의 표준 혼합 샘플에서 깨끗한 질량 분석 결과를 성공적으로 얻을 수 있었다.
따라서 본 발명의 목적은 표면 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법을 이용하여 메트릭스로 사용된 재료의 높은 백그라운드 신호를 최대한 억제시키면서도, 다양한 대사산물을 분석할 수 있는 대사 지문용 재료를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 특징을 가지는 대사 지문용 재료의 제조방법을 제공하는 데도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 대사 지문용 재료는 다공성 졸-겔 재료에 그래핀옥사이드가 도입된 필름 구조를 가지는 것을 그 특징으로 한다.
상기 다공성 졸-겔 재료는 졸-겔법으로 다공성 필름을 형성할 수 있는 것이 바람직하다.
상기 졸-겔법으로 다공성 필름을 형성할 수 있는 재료는 테트라에틸올소실리케이트(tetraethylorthosilicate)를 포함하는 실리콘계 단위체, TiO2, 지르코니아 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 대사 지문용 재료의 제조방법은 그래핀옥사이드를 제조하는 단계, 상기 그래핀옥사이드에 졸-겔 용액을 첨가하여 졸-겔법으로그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름을 제조하는 단계, 및 상기 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름의 초음파 처리하여 표면의 그래핀옥사이드를 제거시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 초음파 처리는 물을 이용하여 5분~60분간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 그래핀옥사이드를 다공성 졸-겔 필름에 도입시킴으로써, 그래핀계 SALDI MS의 이온화 특성을 유지하면서 주변의 장해 요소를 감소시킬 수 있었다. 또한, 그래핀옥사이드가 도입된 졸-겔 필름은 주입된 그래핀옥사이드의 이온화 특성을 잃어버리지 않으면서 메트릭스 재료의 백그라운드 신호를 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 장시간 동안 SALDI MS 성능에서의 안전성을 나타냈다.
또한, 졸-겔 구조의 다공성 특성은 메트릭스와 샘플 간에 우수한 접촉효과를 제공하여 분석물로 레이저 에너지를 효과적으로 전달할 수 있어, 종래 대사 지문 재료에 비해 높은 분석능을 나타내는 효과를 가진다.
따라서, 본 발명에 따른 대사 지문용 재료는 낮은 백그라운드를 가지는 지문법에 유용한 정보를 생성할 수 있으며, 사후 통계 분석에 결정적인 질량 스펙트럼의 배경 차분(background subtraction) 및 노이즈 감소와 같은 데이터 프로세싱 단계를 단순화시킬 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름의 제조 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 실시예 1에 따라 제조된 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔(GOSG) 필름의 FE-SEM 측정 사진이고,
도 3은 초음파 처리(sonication) 전(a)과 후(b)의 GOSG 필름의 SEM 이미지이고,
도 4는 초음파 처리(sonication) 전(c)과 후(d)의 GOSG 필름의 분말상 X-선 회절 패턴을 나타낸 것이고,
도 5 양이온 모드에서 뇌의 총 지질 추출물에서 (a)는 GOSG와 (b) bare sol-gel SALDI 의 질량 분석 결과이고
도 6은 양이온 모드에서 뇌의 총 지질 추출물의 GOSG SALDI 질량 분석 결과이고,
도 7은 음이온 모드에서 β-estradiol의 SALDI 질량 분석 결과를 나타낸 결과이고,
도 8은 양이온 모드에서 토마토 (Lycopersiconesculentum) (0.5 ㎍/spot)의 (a) GO 입자 및, (b) GOSG SALDI 의 질량 분석 그래프이고,
도 9는 음이온 모드에서 토마토 (Lycopersiconesculentum) (0.5 ㎍/spot)의 메탄올 추출물의 (a) GO 입자 및, (b) GOSG SALDI 의 질량 분석 그래프이고,
다음 도 10은 GO 입자 메트릭스 또는 GOSG를 포함하는 Chlorella Vulgaris의 SALDI 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,
다음 도 11은 메트릭스 없는 Chlorella Vulgaris 의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 발명은 SALDI MS을 이용한 다양한 대사산물의 지문 분석용 재료와 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 대사 지문용 재료는 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔(graphene oxide-embedded sol-gel, 이하 'GOSG'라 함) 필름인 것을 그 특징으로 한다.
본 발명에서는 다양한 탄소계 재료 중에서도 우수한 물리적 성능과, 식물 대사체나 긴 사슬 지방산과 같은 재료의 분석에 보다 우수한 그래핀옥사이드를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 상기 그래핀옥사이드를 도입시킬 메트릭스 재료로서 졸-겔법을 이용하여 다공성 필름을 형성할 수 있는 재료를 이용하였다. 상기 졸-겔법은 통상의 공지된 졸-겔 합성 방법을 의미한다.
이러한 본 발명의 졸-겔법으로 다공성 필름을 형성할 수 있는 재료는 테트라에틸올소실리케이트(tetraethylorthosilicate)를 포함하는 실리콘계 단위체, TiO2, 지르코니아 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 다공성 필름을 형성할 수 있는 것이면 어느 것이나 무방하다. 상기 실리콘계 단위체는 실리콘(Si)을 포함하는 물질(예를 들어, 실리콘계 고분자 등)을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서와 같이 그래핀옥사이드를 졸-겔법을 이용하여 도입시킨 다공성 필름 상태의 대사 지문용 재료는 메트릭스로 사용된 재료의 백그라운드 신호는 억제시키면서 분석하고자 하는 물질의 신호는 강하게 나타내는 효과를 가진다.백그라운드 신호가 억제되는 이유는 백그라운드 신호를 낼 수 있는 그래핀옥사이드가 졸-겔 필름에 둘러싸여 있어,레이저에 의한 탈착되는 정도가 최소화되기 때문이다.
또한 분석하고자 하는 물질의 신호가 강하게 나타나는 이유는 졸-겔 필름 구조가 그래핀옥사이드와 분석물질이 효과적으로 접촉할 수 있는 다공성이기 때문이다. 상기 '다공성'은 본 발명에 따른 졸-겔 필름이 다수의 기공(pore)을 함유하는 구조를 포함하는 의미이다.
따라서, 본 발명과 같이 그래핀옥사이드를 졸-겔 필름으로 도입시키고, 사용되는 졸-겔 필름을 다공성 구조를 가지게 함으로써 SALDI MS을 이용한 다양한 대사산물의 지문 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 상기 GOSG 대사 지문용 재료는 특히 표면 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(SALDI MS)을 이용한 환경 오염원, 고분자, 펩타이드, 및 다른 소형 대사체의 분석에 성공적으로 적용될 수 있다. 상기 SALDI MS를 이용한 분석시, 그래핀옥사이드의 이온화 특성은 그대로 유지하면서 메트릭스 재료의 백그라운드 신호를 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 장시간 동안 SALDI MS 성능에서의 안전성을 나타낼 수 있어 바람직하다.
이러한 본 발명에 따른 상기 대사 지문용 재료의 제조방법은 그래핀옥사이드를 제조하는 단계, 상기 그래핀옥사이드에 졸-겔 용액을 첨가하여 졸겔법으로 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름을 제조하는 단계, 및 상기 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름의 초음파 처리하여 표면의 그래핀옥사이드를 제거시키는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
첫 번째 단계는 그라파이트로부터 그래핀옥사이드를 제조하는 과정으로, 본 발명에 따른 그래핀옥사이드는 변형된 Hummers 방법에 의해 합성하였다.
두 번째 단계는 상기 제조된 그래핀옥사이드를 에탄올/물/염산 혼합액에 (10:10:1, v/v/v)에 혼합시키고, 여기에 졸-겔법으로 다공성 필름을 형성할 수 있는 재료를 첨가하여 졸-겔 용액을 제조한다. 상기 졸-겔 용액을 소정의 기판(예를 들어, 실리콘 웨이퍼 등)에 공지된 방법으로 도포시켜 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름을 형성시킨다. 상기 졸-겔 용액의 도포 방법은 특별히 한정되지 않으며, 스핀 코팅법이 가장 간단하게 이용될 수 있다. 상기 졸-겔법으로 다공성 필름을 형성할 수 있는 재료는 테트라에틸올소실리케이트(tetraethylorthosilicate)를 포함하는 실리콘계 단위체, TiO2, 지르코니아 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
그 다음, 상기 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름을 초음파 처리하여, 상기 졸-겔 필름의 표면에 잔류된 그래핀옥사이드를 제거시키는 과정을 거친다. 상기 초음파 처리는 물(H2O) 속에서 5분~60분간 수행되는 것이 잔류된 그래핀옥사이드를 효과적으로 제거시킬 수 있어 바람직하다.
상기 초음파 처리 과정을 통하여 백그라운드 신호를 효과적으로 낮추거나 제거시킬 수 있으며, 이로 인해 상대적으로 분석하고자 하는 샘플의 신호는 향상시킬 수 있어 분석능을 개선시키는 효과를 가진다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 1
1)그래핀 옥사이드(GO) 제조
그래핀옥사이드는 변형된 Hummers 방법에 의해 합성하였다. 1.0 g의 그라파이트와NaCl 50g 혼합물을 모르타르와 막자를이용하여 곱게 갈아 미세 분말로 만들었다. 상기 미세 분말을 순수와 에탄올로 여러 번 세척한 다음, 80℃에서 건조시켰다. 건조된 분말을 농축 H2SO4 (4 mL), K2S2O8 (0.84 g), 및 P2O5 (0.84 g)와 혼합한 다음, 80℃에서 4.5시간 동안 가열시켰다. 여기에 순수 (167 mL)을 첨가하여 냉각시킨 현탁액을 실온(r.t.)에서 밤새 추가 교반시켰다.
상기 얻어진 고체 결과물을 여과시키고, 순수로 여러 번 세척한 분말을 80℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 상기 고형물을 약하게 교반되는 아이스 배쓰에서H2SO4 (40 mL) 과 KMnO4 (5 g)으로 처리하였다. 그 다음, 순수를 가하여 35℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 순수 (167 mL)과 30% H2O2 (10 mL)를 가하여 2시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 아이스 배쓰에서 0.5시간 동안 추가 교반시켰다.
최종 그래핀옥사이드 합성물을 여과시켜 얻고, 추출물의 pH가 7.0이 될때까지 순수로 세척하였다.
2) 그래핀 옥사이드가 도입된 졸-겔 ( GOSG ) 필름 제조
상기 1)에서 제조된 5g의 GO를 2.1 mL ethanol/H2O/2M HCl (10:10:1, v/v/v)에 혼합하고, 10분동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, TEOS 100 ㎕을 가하고, 최종 용액을 30분간 약하게 교반시켜 졸-겔 용액을 얻었다. 졸-겔 필름 기판은 실리콘 웨이퍼 (5mm x 5mm)를 사용하였으며, 상기 기재의 유기불순물을 피라냐 용액으로 세척하여 제거하고, 에탄올로 헹구었다. 상기 실리콘 기판을 150℃에서 20분간 건조시켰다.
그 다음, 상기 졸-겔 용액 5방울을 상기 실리콘 웨이퍼 기판에 가하여 스핀 코팅시켰다. 스핀코팅된 웨이퍼는 상온에서 3시간 동안 1차 건조시키고, 추가로 150℃에서 밤새 추가로 건조시켰다. 필름 표면의 GO 입자를 제거하기 위하여, 필름 코팅된 웨이퍼를 물에서 30분 동안 약하게 초음파처리(sonication)하고, 에어 건조시켰다.
실험예 1 : GOSG 필름의 구조 확인
상기 제조된 GOSG 필름의 구조 확인을 위하여, Hitachi Ultra-High-Resolution Analytical FE-SEM SU-70 (accelerating voltage = 5 kV)를 이용하였으며, 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다.
다음 도 2를 참조하면, 필름 상부 표면의 SEM 이미지로부터 그래핀옥사이드의 존재를 선명하게 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터, TEOS 졸-겔 필름에 그래핀옥사이드가 효과적으로 도입되었음을 확인하였다.
실험예2 :초음파 처리에 따른 GOSG 필름의 구조 확인
초음파 처리(sonication)에 따른 GOSG 필름의 구조 확인을 위하여, SEM 측정과 분말 상태의 X-선 회절 패턴을 Bruker D8 Advance diffractometer (40 kV, 40 mA, step size = 0.02°)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 3과 4에 나타내었다.
GOSG 필름의 단면 SEM 이미지(도 3a)로부터, Si 웨이퍼 상에 균일하게 GOSG 가 코팅됨을 확인하였다. 코팅 두께는 약 10㎛였다.
또한, PXRD 패턴을 나타낸 도 4(c)를 참조하면, 약하고 브로드한 (002) 회절 피크가 2θ = 11.79°에서 관찰되었다. 상기 필름에서 그래핀옥사이드에 해당되는 d-spacing 값은 0.751nm였고, 이 값은 그래핀옥사이드의 값으로 보고되고 있는 0.63~0.77nm의 값 안에 들어가는 것이다.
흥미로운 사실은, 짧은 초음파처리를 통하여 필름이 보다 더 스무스해진다는 것이다.(도 4d 참조) 초음파처리한 필름의 PXRD 패턴에서는 2θ = 11.85°보다 감소된 (002) 회절 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 초음파처리 후에 그래핀옥사이드의 함량이 상대적으로 줄어들었기 때문인 것으로 보여진다.(도 4d 참조)
초음파 처리 후 그래핀옥사이드의 약한 PXRD 특성 피크에도 불구하고, 필름에서 그래핀옥사이드의 존재는 필름 상부 표면의 SEM 이미지로부터 선명하게 확인할 수 있었다. (도 2 참조)
실험예3 : GOSG SALDI MS 의 이온화 특성 실험
GOSG SALDI MS의 이온화 특성 실험을 위하여 돼지 뇌의 총 지질 추출물을 이용하여 1차 분석하였다.
다음 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, GOSG SALDI MS는 세레브로시드-중심 지질 프로파일(cerebroside-focused lipid profile)을 나타냈다. 이러한 결과는, 카본계 SALDI 메트릭스들이 주로 세레브로시드를 이온화시키지만 양이온 모드에서는 인지질의 이온화를 억제시키기 때문에 분석물질의 이온화가 주로 GO에 의해 이루어졌음을 의미한다.
양이온 모드에서 뇌의 총 지질 추출물의 GOSG SALDI 질량 분석 결과인 도 6을 참조하면, 앞서 설명한 바와 같이 초음파 처리를 통하여 알려지지 않은 백그라운드 신호들은 효과적으로 제거시키고 샘플의 신호는 초음파 처리에 의해 향상되는 것으로 나타났다. 또한, GOSG에 의한 낮은 질량 영역에서 백그라운드 신호의 억제는 다양한 기준들에 의해 측정될 수 있다.
다음 도 7은 음이온 모드에서 β-estradiol의 SALDI 질량 분석 결과를 나타낸 것으로 이를 참조하면, 낮은 백그라운드 신호를 가지는 카본계 SALDI 메트릭스에 의해 쉽게 이온화되는 것을 알 수 있다. GO 입자 메트릭스는 비교적 깨끗한 백그라운드를 가지는 β-estradiol 의 염기성형 이온을 생성시키지만, 강력한 카본 클러스터 이온 신호들은 여전히 존재함을 알 수 있다. (도 7a)
그러나 본 발명에 따른 GOSG SALDI MS에 의하면, GOSG에 사용된 레이저 파워가 GO 입자 메트릭스에 사용된 것보다 30% 더 높다(3100 vs . 2350, arbitrary units)는 사실에도 불구하고, 감도(sensitivity) 손실 없이도 대부분의 카본 클러스터 백그라운드 이온들이상당히 제거됨을 알 수 있다. (도 7b 참조)
상기 GOSG SALDI MS의 기본적인 특성 평가 후, GOSG SALDI MS 분석에 의한 대사 지문을 위해 두 종류의 가공되지 않은 천연 샘플을 이용하였다. 제1샘플 형태는 대사체학(metabolomics) 연구에서 가장 광범위하게 사용되는 샘플 형태 중의 하나인 메탄올계 대사 추출물을 이용하였다. 다음 도 8과 9는 GO 입자 메트릭스 또는 GOSG를 포함하는 토마토 대사 추출물의 SALDI 질량 분석 그래프를 나타낸 것이며, 잠정피크들에 대해서는 다음 표 1에 나타내었다.
(a) Positive ion mode
m/z Species m/z Species
202.79 [Glucose + Na]+ 698.74 [PC 28:1 + Na]+
230.66 [Traumatic acid + H]+ 714.75 [Tomato cerebroside+ H]+
260.76 [Flavone + K]+ 716.69 [PE 31:0 + K]+
286.98 [Kaempferol + H]+ 735.52 [Tomato cerebroside+Na]+
303.10 [Quercetin + H]+ 751.43 [Tomato cerebroside+ K]+
316.86 [Isorhamnetin + H]+ 770.51 [PC 32:1 + K]+
319.88 [Myricetin + H]+ 812.71 [PC 36:0 + Na]+
332.83 [Malvidin + H]+ 866.37 [PC 40:9 + K]+
346.84 [Caffeoylspermidine+K]+ 892.57 [TAG 54:4 +Na]+
364.77 [Sucrose + Na]+ 910.68 [PC 42:1 + K]+
380.72 [Sucrose + K]+ 924.59 [β1-tomatidine + Na]+
402.81 [Cyananin + Na]+ 936.64 [PE 48:1 + Na]+
416.81 [Tomatidine + H]+ 954.12 [TAG 58:1 + Na]+
438.79 [Tomatidine + Na]+ 974.05 [TAG 60:5 + Na]+
440.91 [Isoliquiritin + Na]+ 1030.70 [Dehydrotomatine + H]+
452.77 [Tomatidenol + K]+ 1055.96 [α-tomatine + Na]+
456.87 [Tomatidine + K]+ 1071.97 [α-tomatine + K]+
632.61 [Ceramide 38:1 + Na]+ 1087.40 [Lycoperoside H + H]+
648.54 [PE 30:0 + H]+ 1113.51 [Lycoperoside A + Na]+
662.63 [LPC 28:1 + H]+ 1129.36 [Lycoperoside A + K]+
674.67 [LPC 26:0 + K]+
a. Abbreviations: PE-phosphatidylethanolamine; LPC-lysophosphatidylcholine; PC-phosphatidylcholine; TAG-triacylglycerol.
Figure 112015040375414-pat00001

양이온 모드의 결과인 다음 도 8을 참조하면, 주요 대사체들이 GO 메트릭스 입자와 GOSG 필름 간에 서로 비슷하게 관찰되었다. 그러나, GOSG는 m/z 100-300 영역에서 더 낮은 백그라운드 신호를 나타내고, 보다 더 상세한 샘플 특성 –GO-유도된 백그라운드 이온 신호와 명확하게 구별되는 질량 스펙트럼 피크- 이 GO 입자 SALDI MS에서 (113 개의 샘플특성 피크를 GOSG로 얻을 수 있었고, 반면에 GO 입자를 사용하면 72개의 샘플 특성 피크만 관찰되었다.)보다 더 높은 m/z 300-800 영역에서 관찰되었다.
이러한 결과로부터 GOSG SALDI MS 는 낮은 백그라운드를 가지는 지문법에 더 유용한 정보를 생성할 수 있으며, 이로써 사후 통계 분석에 결정적인 질량 스펙트럼의 배경 차분(background subtraction) 및 노이즈 감소와 같은 데이터 프로세싱 단계를 단순화시킬 수 있을 것으로 기대한다.
상기에서 기재한 바와 같이, GO 입자와 GOSG 간 스펙트럼의 질적 차이는 다음 도 9에 나타낸 음이온 모드에서 보다 명확하게 나타난다. GO 입자 메트릭스에 도입된 천연 샘플의 경우, GO-입자 SALDI MS의 경우 높은 백그라운드 신호들은 문턱 레이저 파워(1500-1600, arbitrary units)에서도 제거되지 않았다. 따라서, m/z 100-400 영역에서의 몇몇 주요 지방산을 제외하고는 GO-유래된 신호들로부터 샘플의 특성 피크들을 구별하는 것은 매우 어려웠다.(도 9a 참조)
그러나, GOSG SALDI MS의 경우 동일한 m/z 영역에서 명확히 구별되는 대사체특성을 나타내었으며, 이는 유용한 정보가 풍부한 대사 지문에 이용될 수 있을 것으로 보인다. (242개의 샘플특성 피크를 GOSG로 얻을 수 있었고, 반면에 GO 입자를 사용하면 116개의 샘플 특성 피크만 관찰되었다.)
제2샘플 형태는 미세조류(microalgae) 배양 샘플을 선택하였다. 저렴한 방법으로 미세조류 바이오매스로부터재생가능한바이오연료를 생산하는 데 전세계적으로 많은 관심이 있다. 경제적인 미세조류 오일 생산을 위한 방향으로, 유전적 또는 대사적 엔지니어링-유도된 변화 또는 에너지-풍부 대사 축적물, 주로 지질 및 탄화수소계 물질들이 빠르게, 또한 조심스럽게 연구될 필요가 있다. 이러한 목적을 위해, 카본계SALDI MS는 지방산과 이의 유도체들의 검출하는 데 있어 그 유효성을 이전 연구들에서 검증되었기 때문에 매우 유용한 가능성을 가지고 있다.
다음 도 10은 GO 입자 메트릭스 또는 GOSG를 포함하는 Chlorella Vulgaris의 SALDI 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고, 잠정 피크들에 대해서는 다음 표 2에 정리하였다.
Figure 112015040375414-pat00002
다음 도 10을 참조하면, 미세조류 샘플의 경우 GOSG SALDI MS 가 GO-입자 SALDI MS 의 성능에 비해 우수하게 나타나는 것은 지방산(free fatty acidsㅡ FAs), 인지질, 및 디아실글리세라이드(diacylglycerides, DAGs)를 포함하는 다양한 지질 종들이 GOSG 에 의해서 보다 명확하게 검출되는 반면, GO 입자 메트릭스는 높은 백그라운드 레벨을 가지는 주요 지방산과 관련된 지문만을 나타냈다.
여기서, 지질 지문은 메트릭스 없는 LDI MS에 의한 단일 조류 세포에서 얻어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 GOSG SALDI MS와 메트릭스 없는 LDI MS의 성능을 미세조류로부터 직접 검출한 지질을 측정 및 비교하였으며, 그 결과를 다음 도 11에 나타내었다. 다음 도 11은 메트릭스 없는 Chlorella Vulgaris 의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다. 사용된 레이저 파워는 GOSG SALDI MS 에 비해 더 높은 것을 사용하였으며, (5000 vs . 3200, arbitrary units) 이러한 높은 레이저 파워는 백그라운드 레벨과 파쇄입도(degree of fragmentation)을 높일 수 있다.
또한, 메트릭스가 없는 환경에서는 샘플 표면에 신호가 잘 나오는 'hot' 스팟(spots)과 신호가 잘 나오지 않는 'cold' 스팟이 명백하게 나타나며, 이는 높은 쓰루풋을 가지는 스크리닝 방법에는 바람직하지 않은 재생할 수 없는 평균 지질 지문을 의미한다.
이러한 현상으로부터 GOSG에 의해 분석물질로 보다 효과적인 에너지 전달이 이루어짐을 의미하며, 이는 GOSG SALDI MS가 미세조류 대사 지문에서 메트릭스 없는 LDI MS에 비해 더 튼튼한 플랫폼으로 작용할 수 있음을 의미한다.

Claims (4)

  1. 그래핀옥사이드를 제조하는 단계;
    상기 그래핀옥사이드를 에탄올/물/염산 10:10:1의 부피비로 혼합된 용액에 혼합하는 단계;
    테트라에틸올소실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS)를 포함하는 실리콘계 단위체, TiO2, 지르코니아 중에서 선택되는 1종 이상인 졸-겔 재료를 첨가하여 졸-겔법으로 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름을 제조하는 단계; 및
    상기 그래핀옥사이드가 도입된 다공성 졸-겔 필름의 초음파 처리하여 표면의 그래핀옥사이드를 제거시키는 단계; 를 포함하는 대사 지문용 재료의 제조방법
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 초음파 처리는 물을 이용하여 5분~60분간 수행되는 것인 대사 지문용 재료의 제조방법.
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