BRPI0613402A2 - uso de inibidores de histona deacetilases em combinação com compostos que agem como nsaid para a terapia de doenças humanas - Google Patents

Abstract

USO DE INIBIDORES DE HISTONA DEACETILASES EM COMBINAçãO COM COMPOSTOS QUE AGEM COMO NSAID PARA A TERAPIA DE DOENçAS HUMANAS. A presente invenção refere-se ao uso médico de compostos que agem como inibidores de enzimas tendo atividade de histona deacetilases em condições onde sua combinação com compostos conhecidos como NSAID, Fármacos Antiinflamatórios Não-Esteroidais, causa um efeito terapêutico benéfico aumentado. Estas condições compreendem câncer, condições de predisposição a câncer, doenças inflamatórias e metabólicas. Adicionalmente, a invenção incluí a fabricação de medicamentos clinicamente usados para a terapia das doenças aqui mencionadas, administrando-se os compostos separadamente na forma de dois fármacos individuais, ou em uma forma administrativa que contém ambos os fármacos em uma unidade de aplicação simples.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "uso de ini-bidores de histona deacetilases em combinação com com-postos que agem como nsald para a terapia de doençashumanas".

A presente invenção refere-se ao uso médico de compostos queagem como inibidores de enzimas tendo atividade de histona deacetilasesem condições onde sua combinação com compostos conhecidos comoNSAID, fármacos antiinflamatórios Não-Esteroidais, causa um efeito tera-pêutico benéfico aumentado. Estas condições compreendem câncer, condi-ções de predisposição a câncer, doenças inflamatórias e metabólicas. Adi-cionalmente, a invenção inclui a fabricação de medicamentos clinicamenteusados para a terapia das doenças aqui mencionadas, administrando-se oscompostos separadamente na forma de dois fármacos individuais, ou emuma forma administrativa que contém ambos os fármacos em uma unidadede aplicação simples.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Regulação de Cromatina e Doenças

A remodelagem local de cromatina é uma etapa chave na ativa-ção transcricional de genes. As mudanças dinâmicas no acondicíonamentonucleossomal de DNA devem ocorrer para permitir que as proteínas trans-cricionais façam contato com o modelo de DNA. Um dos mecanismos maisimportantes que influenciam a remodelagem de cromatina e transcrição dogene são as modificações pós-translacionais de histonas e outras proteínascelulares por acetilação e mudanças subseqüentes na estrutura da cromati-na (Davie, 1998, Curr Opin Genet Dev 8, 173-8; Kouzarides, 1999, Curr OpinGenet Dev 9, 40-8; Strahl and Allis, 2000, Nature 403, 41-4). No caso de hi-peracetilação de histona, mudanças na atração eletrostática para DNA eobstáculo estérico introduzido pelo grupo acetil hidrofóbico conduzem a de-sestabilização da interação de histonas com DNA. Como um resultado, aacetilação de histonas rompe os nucleossomas, e permite que o DNA setorne acessível à maquinaria transcricional. A remoção dos grupos acetilpermite que as histonas se liguem mais hermeticamente ao DNA e aos nu-cleossomas adjacentes, e, desse modo, mantenham uma estrutura de cro-matina transcricionalmente reprimida. A acetilação é mediada por uma sériede enzimas como atividade de histona acetiltransferase (HAT). Inversamen-te, os grupos acetila são removidos por enzimas de histona deacetilase(HDAC) específicas. O rompimento destes mecanismos dá ocorrência à máregulação transcricional, e pode contribuir para uma variedade de doençashumanas, incluindo enfermidades autoimunes, inflamatórias ou hiperprolife-rativas, incluindo transformação tumorigênica e progressão de tumor.

Adicionalmente, outras moléculas, tais como fatores de transcri-ção, alteram sua atividade e estabilidade, dependendo de seu estado de aci-lação. Por exemplo, PML-RAR, a proteína de fusão associada com leucemiapromielocítica aguda (APL), inibe p53 através da mediação de deacetilaçãoe degradação de p53, desse modo permitindo que a APL exploda para livraras trajetórias de supervisão de câncer dependente de p53. A expressão dePML-RAR nas células precurssoras hematopoiéticas resulta na repressão deativação transcricional mediada por p53, e proteção de apoptose dependen-te de p53 disparada por estresses genotóxicos (raios-X, estresse oxidativo).Contudo, a função de p53 é reinstalada na presença de inibidores de HDACimplicando em recrutamento ativo da HDAC em p53 por PML-RAR como omecanismo subjacente à inibição de p53 (Insinga et aí., February 2004, EM-BO Journal, 1-11). Portanto, a acetilação de proteínas distintas de histonas,tal como acetilação de p53, desempenha um papel crucial na atividade deantitumor de inibidores de HDAC.

Receptores Nucleares e Histona Deacetilases

Os receptores de hormônio nucleares são fatores de transcriçãodependentes de Iigante que controlam o desenvolvimento e homeostase a-través de ambos os controles positivo e negativo de expressão de gene. Osdefeitos nestes processos regulatórios são as causas de muitas doenças, edesempenham um papel importante no desenvolvimento de câncer. Muitosreceptores nucleares, incluindo T3R, RAR e PPAR, podem interagir com co-repressores, tais como N-CoR e SMRT, na ausência de Iigante e, desse mo-do, inibem a transcrição. Além disso, N-CoR foi também reportado para inte-ragir com progesterona ocupada com antagonístico e receptores de estrogê-nio. Mais interessantemente, N-CoR e SMRT têm se mostrado existir emcomplexos grandes de proteína, que também contêm proteínas mSin3 e his-tona deacetilases (Pazin and Kadonaga, 1997; Cell 89, 325-8). Desse modo,a alteração induzida por Iigante de receptores nucleares de repressão paraativação reflete a mudança de complexos co-repressores e co-activadorescom atividades enzimáticas antagonísticas.

Regulação de Gene por Receptores Nucleares

Tais complexos co-repressores que contêm atividade de HDAC,não somente medeiam a repressão por receptores nucleares, mas tambéminteragem com fatores de transcrição adicionais incluindo Mad-1, BCL-6, eETO. Muitas destas proteínas desempenham papéis chaves nas doenças deproliferação e diferenciação de célula (Pazin and Kadonaga, 1997, Cell 89,325-8; Huynh and Bardwell, 1998, Oncogene 17, 2473-84; Wang, J. et al.,1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10860-5). T3R, por exemplo, foi origi-nalmente identificado na base de sua homologia com .a oncogene viral v-erbA, que, em contraste ao receptor tipo selvagem, não se liga ao ligante, efunciona como um repressor constitutivo de transcrição. Além disso, muta-ções em RARs foram associadas com um número de cânceres humanos,particularmente leucemia promielocítica (APL) e carcinoma hepatocelular.Nos pacientes com APL1 as proteínas de fusão de RAR resultantes de trans-locações cromossomais envolvem, ou a proteína de leucemia promielocítica(PML), ou a proteína de informação de zinco promielocítica (PLZF). Emboraambas as proteínas de fusão possam interagir com os componentes docomplexo co-repressor, a adição de ácido retinóico rejeita o complexo co-repressor de PML-RAR, pelo qual PLZF-RAR interage constitutivamente.Estas descobertas proporcionam uma explanação porque os pacientes comPML-RAR APL alcançam remissão completa seguindo tratamento de ácidoretinóico pelo qual pacientes com PLFZ-RAR APL respondem muito pobre-mente (Grignani et al., 1998, Nature 391, 815-8; Guidez et al., 1998, Blood91, 2634-42; He et al., 1998, Nat Genet 18, 126-35; Lin et al., 1998, Nature391,811-4).Recentemente, um paciente com PML-RAR que tinha experi-mentado reincidências múltiplas após tratamento com ácido retinóico, tinhasido tratado com o fenilbutirato inibidor de HDAC, resultando em remissãocompleta da leucemia (Warrell et al., 1998, J. Natl. Câncer Inst. 90,1621-1625).

A Família de Proteína de Histona Deacetilases

O recrutamento de histona acetiltranferases (HATs) e histonadeacetilases (HDACs) é considerado como um elemento chave na regulaçãodinâmica de muitos genes que desempenham papéis importantes naproliferação e diferenciação celular. A hiperacetilação de extremidades N-terminais de histonas H3 e H4 se correlaciona com a ativação de gene pelaqual a deacetilação pode mediar repressão transcricional.

Conseqüentemente, muitas doenças têm sido ligadas a mudanças naexpressão de gene causadas por mutações que afetam os fatores detranscrição. A repressão aberrante por proteínas de fusão de leucemia, taiscomo PML-RAR, PLZF-RAR, AML-ETO, e Stat5-RAR, serve como umexemplo prototípico neste particular. Em todos estes casos, as translocaçõescromossomais convertem os ativadores transcricionais em repressores, quereprimen constititivamente os genes alvos importantes para diferenciaçãohematopoiética, via recrutamento de HDACs. É plausível que eventossimilares também contribuam para patogênese em muitos outros tipo decâncer. Existe evidência de crescimento que o mesmo se mantémverdadeito para enfermidades autoimunes, inflamatórias e hiperproliferativas.

As histona deacetilases de mamífero podem ser divididas emtrês sub-classes (Gray and Ekstróm, 2001). As HDACs 1, 2, 3, e8 que sãohomólogas da proteína RPD3 de levedura constituem a classe I. As HDACs4, 5, 6, 7, 9, e 10 estão relacionadas a proteína Hda 1 de levedura, e formama classe II. Recentemente, vários homólogos de mamífero da proteína Sir2de levedura têm sido identificados, formando uma terceira classe dedeacetilases que são dependente de NAD. Além disso, a HDAC11 foiclassificada como uma histona deacetilase de classe I com característicasestruturais de uma HDAC de classe II. Todas estas HDACs parecem existirna célula como sub-unidades de uma pletora de complexos de multiproteína.Em particular, as HDACs de classe I e Il têm sido mostradas interagindo comos co-repressores transcricionais mSin3, N-CoR e SMRT que servem comofarores de ligação requeridos para o recrutamento de HDACs em fatores detranscrição.

Terapia com Inibidores de HDAC

Investigações clínicas adicionais têm sido recentemente inicia-das para explorar o tratamento clínico sistêmico de pacientes de câncer como princípio de inibição de HDAC. Por agora, um ensaio de fase clínica Il como derivado de ácido butírico proximamente relacionado Pivanex (Titan Phar-maceuticals) como uma monoterapia foi completado, demonstrando ativida-de no câncer de pulmão de célula não-pequena de estágio lll/IV (Keer et al.,2002, ASCO, Abstract No. 1253). Mais inibidores de HDAC foram identifica-dos, com NVP-LAQ824 (Novartis) e SAHA (Aton Pharma Inc.) sendo mem-bros da classe estrutural de ácidos hidroxâmicos testados em ensaios clíni-cos de fase Il (Marks et al., 2001, Nature Reviews Câncer 1, 194-202). Outraclasse compreende tetrapeptídeos cíclicos, tais como depsipeptídeo(FR901228 - Fujisawa), usados com sucesso em um ensaio de fase Il para otratamento de Iinfomas de célula T (Piekarz et al., 2001, Blood 98, 2865-8).Além disso, MS-27-275 (Mitsui Pharmaceuticals), um composto relacionadoá classe de benzamidas, está agora sendo testado em um ensaio de fase Iitratando pacientes com malignidades hematológicas.

O Ácido Valpróico como Inibidor de HDAC

O ácido valpróico (VPA; ácido 2-propil-pentanóico) tem ativida-des biológicas múltiplas que dependem de mecanismos moleculares diferen-tes de ação:

- VPA é um fármaco antiepiléptico.

- VPA é teratogênico. Quando usado como um fármaco antiepi-léptico durante gravidez, VPA pode induzir defeitos de nascimento (defeitosde fechamento do tubo neural e outras más-formações) em uma pouca per-centagem de crianças nascidas. Em camundongos, VPA é teratogênico namaioria de embriões de camundongo quando corretamente dosado.

- VPA ativa um receptor de hormônio nuclear (PPARô). Váriosfatores de transcrição adicionais são também de-reprimidos, mas alguns fa-tores não são significantemente de-reprimidos (receptor de glicocorticóide,PPARcc).

- VPA ocasionalmente causa hepatotoxicidade, que pode de-pender de ésteres pobremente metabolizados com coenzima A.

- VPA é um inibidor de HDACs.

- VPA induz degradação proteassomal de HDAC-2.

O uso de derivados de VPA permite determinar que as ativida-des diferentes são mediadas por mecanismos moleculares diferentes de a-ção. A teratogenicidade e atividade antiepiléptica seguem modos diferentesde ação porque os compostos podem ser isolados, que são ou preferencial-mente teratogênicos, ou preferencialmente antiepilépticos (Nau et al., 1991,Pharmacol. Toxicol. 69, 310-321). A ativação de PPARô foi verificada estarestritamente correlacionada com a teratogenicidade (Lampen et al., 1999,Toxicol. Appl. Pharmacol. 160, 238-249), sugerindo que, ambas, ativação dePPARÔ e teratogenicidade requerem a mesma atividade molecular de VPA.Também, a diferenciação de células F9 se correlaciona estritamente com aativação de PPARô e teratogenicidade, conforme sugerido por Lampen etal., 1999, e documentado pela análise de marcadores de diferenciação (Wer-ling et al., 2001, Mol. Pharmacol. 59, 1269-1276). Foi mostrado que a ativa-ção de PPARô é causada pala atividade inibitória de VPA e seus derivados(WO 02/07722 A2; WO 03/024442 A2). Além disso, foi mostrado que o inibi-dor de HDAC estabelecido, o PPARô ativa o TSA e induz o mesmo tipo dediferenciação de célula F9 como VPA. A partir destes resultados, pode serconcluído que não somente a ativação de PPARô, mas também a induçãode diferenciação de célula F9 e teratogenicidade de VPA ou derivados deVPA, são causadas pela inibição de HDAC.

A atividade de VPA na promoção da degradação proteassomalseletiva de HDAC-2 é distinta de sua atividade como um inibidor da atividadeenzimática de HDACs, conforme nenhum dos inibidores de HDAC bem ca-racterizados Tricostatin A e MS-27-275 afetam a degradação de HDAC-2(Krámer et al, 2003, 22(13), 3411 -3420).As atividades antiepilépticas e de sedação seguem relaciona-mentos de atividade estruturai diferentes e, desse modo, obviamente depen-dem de uma atividade de VPA primária de inibição de HDCA. O mecanismode hepatotoxicidde é pobremente compreendido, e é desconhecido se eleestá associado com a formação do éster de VPA-CoA. A inibição de HDAC,contudo, parece não requerer formação de éster de CoA.

Ácido Valpróico como inibidor de histona deacetilases

O VPA foi desenvolvido como um fármaco usado para o trata-mento de epilepsia. Conseqüentemente, o VPA é usado sistemicamente,oralmente, ou intravenosamente, para permitir que o fármaco ultrapasse osangue da barreira cerebral para alcançar as regiões-alvos epilépticas notecido cerebral de modo a cumprir sua missão antiepilética. Além disso, oVPA tem mostrado possuir efeitos benéficos quando usado para o tratamen-to de muitos tipos diferentes de cânceres humanos como um agente simplesou em combinação com uma variedade total de outras terapias antitumoraisque são individualmente baseadas em modos diferentes de ataques de açãopela inibição de conjuntos específicos de enzimas tendo atividade de HDAC,e, desse modo, induzindo a diferenciação e/ou apoptose (WO 02/07722 A2,EP 1170008; WO 03/024442 A2, EP 1293205 A1). Para o tratamento ouprevenção de doenças malignas, doenças autoimunes ou outras enfermida-des inflamatórias ou hiperproliferativas, o VPA pode também ser administra-do sistemicamente, oralmente, ou intravenosamente. Além disso, foi mostra-do que o VPA permeia a pele humana eficazmente e, portanto, pode seradministrado topicamente na pele, exibindo efeitos benéficos quando usadopara o tratamento tópico ou prevenção de enfermidades de pele humanaautoimunes, inflamatórias ou hiperproliferativas, por exemplo, psoríase ecâncer de pele humano (Pedido EP No. 03014278.0).

Fármacos Antiinflamatórios Não-Esteroidais (NSAIDs) e seu uso

Os fármacos antiinflamatórios não-esteroidais (NSAIDs) são ini-bidores das enzimas ciclooxigenase, as enzimas chaves no metabolismo deácido aracdônico para prostaglandinas e tromboxanos. Recentemente foidescoberto que as enzimas ciclooxigenase compreendem duas isoformas:COX-1 e C0X-2. A C0X-1 é constitutivamente expressa em muitos tecidosonde contribui para funções fisiológicas. Sua inibição por NSAIDs tem sidoassociada com as toxicidades comuns destes agentes, incluindo ulceraçãogástrica e hemorragia. A COX-2 é uma enzima induzível que é induzida emresposta a citoquinas e fatores de crescimento nos locais de inflamação, eem alguns tumores, incluindo, mas não limitado a, adenomas de cólon, cân-cer de cólon e colorretal, seio, e tumores de pulmão e próstata.

Os inibidores de COX estão sendo usados para o tratamento deuma variedade de doenças e condições, incluindo dor, enfermidades infla-matórias, tais como artrite reumatóide, mas também para a inibição de cres-cimento de pólipo intestinal, por exemplo, em pacientes que sofrem de Poli-pose Adenomatosa Familial (FAP). Os estudos epidemiológicos têm mostra-do que pessoas que tomaram NSAIDs por períodos prolongados de tempotêm uma taxa inferior do que esperada de adenomas e carcinomas colorre-tais.

Entre esta classe amplamente usada de NSAID s estão aspirina,salicilato de metila, diclofenaco [Voltaren®, Nu-Diclo®, Cataflam®], meclofe-namato [Meclomen®], ácido mefânico [Ponstel®], meloxicam [Mobic®], na-bumetona [Relafen®], naproxen [Aleve®, Anaprox®, Naprosyn®, Naprelan®,Naxen®, Novo-Naprox®, Synflex®], oxaprozin [Daypro®], fenilbutazona[Cotylbutazone®, Alka Butazolidine®], piroxicam [Feldene®, Nu-Pirox®], su-Iindac [Clinoril®, Novo-Sundac®], tenoxicam [Mobiflex®, diflunisal [Dolo-bid®], ácido tiaprofênico [Albert Tiafen®, Surgam®], tolmetin [Tolectin®], e-todolac [Lodine®], fenoprofen [Nalfon®], floctafenina [Idarac®], flurbiprofen[Ansaid®, Froben®], ibuprofen [Advil®, Dolgesic®, Excedrin®, Genpril®, Hal-tran®, Ibifon®, Ibren®, Ibu®, Ibuprin®, Ibuprohm®, Medipren®, Midol®, Mo-trin®, Nuprin®, Pamprin®, Q-Profen®, Rufen®, Trendar®], indometacin [In-docin®, Indocid®], cetoprofen [Orudis®, Oruvail®, Actron®, Rhodis®], nime-sulid [Aulin®]. Um número de NSAIDs (denominado coxibs) inibem seletiva-mente atividade enzimática de Cox-2: esta subclasse compreende celecoxib[Celebrex®, Celebra®, Onsenal®] rofecoxib [Vioxx®, Vioxx Dolor®, Ceoxx®]valdecoxib [Bextra®, Valdyn®], parecoxib [Dynastat®, Rayzon®] Iumiracoxib[Prexige®], etoricoxib [Arcoxia®], deracoxib, tilmacoxib, robenacoxib, firoco-xib e cimicoxib.

Contudo, em Dezembro de 2004, uma medicação de dor de ar-trite reumatóide e osteoartrite mais prescrita Celebrex® (Celecoxib; PfizerInc.), um comitê de segurança que estava monitorando de um a dois anos osensaios do fármaco Celebrex® verificou através de dados preliminares queos pacientes que estavam tomando altas dosagens do fármaco estavam su-portando riscos um tanto aumentados de problemas de coração e derramecerebral. Estas descobertas conduziram ao término dos estudos.

Anteriormente, Merck&Co. também cessou as vendas de seufármaco inibidor de COX-2 Vioxx® após efeitos colaterais similares seremobtidos em ensaios clínicos.

Conforme mencionado acima, as enzimas COX regulam os ní-veis de prostaglandinas que modulam uma variedade de funções importan-tes no corpo. Um tipo de prostaglandina, por exemplo, ajuda a revestir o es-tômago com um fluido protetor denominado mucosa gástrica. Quando a pro-dução deste fluido protetor é diminuída, algumas pessoas estão em risco dedesenvolvimento de úlceras estomacais.

A COX-2 converte ácido araquidônico no corpo em prostaglandi-nas. Em células de câncer, os níveis de COX-2 também se elevam e dispa-ram à produção de prostaglandinas. As prostaglandinas se ligam à célulastumorais, e ajudam a acionar os genes envolvidos na geração de novos va-sos sangüíneos, e, desse modo, suportando crescimento rápido de célula.

Também, o relacionamento entre NSAIDs, prostaglandinas(PGs)1 proliferação e apoptose foi explorado, por exemplo, em células deadenocarcinoma de cólon que expressam COX e sintetizam PGs. As célulasde câncer de cólon HT-29 que produzem PG, por exemplo, foram inibidas decrescimento, e pelos inibidores de COX sulindac e piroxicam. O câncer co-Iorretal é o segundo câncer mais freqüente no mundo Ocidental, freqüente-mente letal quando invasão e/ou metástase ocorre. Em adição ao fator decrescimento hepatócito (HGF), a invasão de câncer de cólon é agora acredi-tada ser acionada também por prostaglandinas, geradas pela enzima cicloo-xigenase-2 (Cox-2).

Desse modo, para muitas células, uma ligação tem sido estabe-lecida entre síntese de prostaglandinas e controle de crescimento de célula,tal como descrito nas células Balb/c 3T3, onde proliferação dependente dofator de crescimento epidermal é inibida pelo inibidor de COX indometacin.

Também a Aspirina que tem sido usada para controlar dor e in-flamação por mais de um século, tem sido ligada por estudos epidemiológi-cos com uma incidência aumentada de câncer colorretal com seu uso delongo prazo anteriores a 1980. Ao mesmo tempo os primeiros relatóriosmostrando regressão de adenomas colorretais em resposta a NSAID sulin-dac foram reportados. Nos anos subseqüentes, o uso de outras NSAIDs,que inibem enzimas ciclooxigenase (COX), foi ligado a risco reduzido decâncer em tecidos múltiplos incluindo aqueles do seio, próstata e pulmão.

Hoje, a sobreexpressão de COX-2, e também as enzimas àmontante e à jusante da trajetória de síntese de prostaglandina, têm sidodemonstrada em tipos de câncer múltiplos, e algumas lesões pré-neoplásticas. As interações diretas de prostaglandinas com seus receptorsatravés de trajetórias de autocrina ou paracrina para aumentar a sobrevivên-cia celular ou estimular angiogênese têm sido propostas como os mecanis-mos moleculares suportando as funções pró-carcinogênicas de enzimas Ci-clooxigenase (Para revisão vide: Câncer Lett. 2004 Nov 8;215(1): 1-20. Ci-clooxigenases em câncer: progress and perspective. Zha S, Yegnasubrama-nian V, Nelson WG, Isaacs WB, De Marzo AM.).

Neste particular, recentemente também estudos pré-clínicos su-geriram que a ciclooxigenase COX-2 pode estar envolvida na patogênesemolecular de alguns tipos de câncer de pulmão. Muitos dos estudos disponí-veis apontam para seu envolvimento em câncer de pulmão de célula não-pequena. A sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão de célulanão-pequena expressando altos níveis de COX-2 é marcadamente reduzida.

O tratamento de seres humanos com o inibidor de COX-2 seletivo Celecoxibaumenta os efeitos antitumor de quimioterapia em pacientes com câncer depulmão de célula não-pequena. COX-2 tem sido mostrado regular algunsaspectos de angiogênese associada a tumor (Clin Câncer Res. 2004 Jun15;10(12 Pt 2):4266s-4269s. Ciclooxigenase como um alvo no câncer depulmão. Brown JR, DuBois RN.).

Em adição, vários estudos têm sugerido que a expressão de ci-clooxigenase-2 (COX-2) está associada com parâmetros de câncer de seioagressivo, incluindo tamanho grande de tumor, metástase de nodo de Iinfaauxiliar positiva, e estado de tumor HER2-positivo. Os estudos de tumoresde mamíferos em camundongos e ratos indicaram que expressão de COX-2de moderada a alta está relacionada a gênese de tumores de mamíferos quesão sensíveis ao tratamento com inibidores de COX-2 não-específico e es-pecíficos (Semin Oncol. 2004 Apr;31(2 Suppl 7):22-9. O papel de inibição deCOX-2 no tratamento e prevenção de câncer de seio. Arun B, Goss P.).

A COX-2 é também altamente expressa em câncer de próstata,particularmente nas células epiteliais de neoplasia e câncer intraepitelialprostática de alto grau. Foi demonstrado que tratamento de linhas de célulade câncer de próstata humano com um inibidor de COX-2 seletivo induz a-poptose ambos in vitro e in vivo. Os resultados in vivo também indicam que oinibidor de COX-2 diminui a densidade de microvaso de tumor e angiogêne-se. Os inibidores de COX-2 podem impedir a regulação hipóxica de um fatorangiogênico potente, fator de crescimento endotelial vascular. Estes resulta-dos indicam que inibidores de COX-2 podem, portanto, servirem como agen-tes quimiopreventivos e terapêuticos efetivos no câncer da próstata. (Uro-logy. 2001 Aug;58(2 Suppl 1):127-31. O papel da ciclooxigenase-2 no câncerde próstata. Kirschenbaum A, Liu X, Yao S, Levine AC).

Combinação de inibidores de HDAC e NSAID

O documento WO 03/039599 A1 geralmente descreve combina-ções de inibidores de ciclooxigenase-2 com inibidores de histona deacetilasee seu uso no tratamento de lesões de cólon pré-malígnas, ou um câncer decólon, ou outras malignidades.

Os inventores do presente pedido surpreendentemente verifica-ram que a combinação de inibidores de HDAC com inibidores de enzimas deCOX é particularmente útil no tratamento de doenças que são caracterizadaspela regulação da histona deacetilase HDAC-2. Foi adicionalmente verifica-do que esta combinação resulta em uma inibição sinergística inesperada deeventos biológicos à montante que também são regulados por enzimas deCOX1 tais como a secreção de prostaglandinas.

A presente invenção, portanto, refere-se ao uso de um inibidorde histona deacetilase em combinação com uma NSAID para a fabricaçãode um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença naqual a doença é definida pela regulação da histona deacetilase HDAC-2 notecido afetado pela doença.

A invenção adicionalmente refere-se a um método para o trata-mento ou prevenção de uma doença que é caracterizada pela regulação deHDAC-2, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade desteuma quantidade eficaz de um inibidor de histona deacetilase, e uma quanti-dade eficaz de uma NSAID.

Outro aspecto da invenção é o uso de um inibidor de histonadeacetilase em combinação com uma NSAID para a fabricação de um medi-camento para o tratamento ou prevenção de uma doença na qual a induçãode hiperacetilação de histonas tem um efeito benéfico, caracterizado em quepelo menos um tecido do indivíduo a ser tratado mostra regulação da histonadeacetilase HDAC-2. Quando a doença é um tumor, o tecido é usualmentetecido de tumor.

A regulação de HDAC-2 no tecido afetado pela doença pode sero resultado de ou associada com mutações diferentes. As mutações de APCque conduzem a uma falta de função de APC, ou mutações de beta-cateninaque conduzem a um ganho de função de beta-catenina, pode causar umaumento nos níveis de HDAC-2. Similarmente, a regulação ou função au-mentada de c-myc pode conduzir a uma regulação de HDAC-2. Geralmente,mutações e alterações da trajetória de Wnt podem conduzir a regulação deHDAC-2. Conseqüentemente, o tecido afetado pela doença pode abrigarpelo menos uma mutação no gene APC. Alternativamente, o tecido afetadopela doença pode abrigar pelo menos uma mutação no gene beta-cateninaque conduz a um ganho de função de beta-catenina, ou uma estabilizaçãoou meia-vida aumentada de proteína de beta-catenina. Em ainda outra con-cretização, o tecido afetado pela doença mostra regulação ou função au-mentada de c-myc. Em ainda outra concretização, o tecido afetado pela do-ença mostra mutações e/ou alterações da trajetória de Wnt que conduz aregulação de HDAC-2.

Em uma concretização preferida, o tecido afetado pela doençaabriga pelo menos uma mutação no gene APC e pelo menos uma mutaçãono gene beta-catenina. Em outra concretização, o tecido afetado pela doen-ça abriga pelo menos uma mutação no gene APC e pelo menos uma muta-ção no gene beta-catenina, e regulação ou função aumentada de c-myc.

O termo "tecido", conforme aqui usado, denota material biológicoa partir do corpo de um indivíduo. O termo "tecido" inclui células obtidas apartir do corpo do indivíduo. A frase "afetado pela doença" refere-se a umasituação onde as células ou o tecido são diferentes das células ou tecidocorrespondentes de um indivíduo saudável. Por exemplo, as células ou teci-do podem exibir divisão de célula não-controlada ou abriga mutações de ge-ne que não estão presentes nas células correspondentes de um indivíduosaudável, ou mostram sinais de inflamação. Em uma primeira etapa adicio-nal, o material de tecido pode ser provido pela obtenção de uma biópsia deum corpo do indivíduo.

A regulação de HDAC-2 no tecido afetado pela doença a ser tra-tado é pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 25%, mais prefe-rivelmente pelo menos 50%, conforme comparado ao nível de HDAC-2 (pro-teína ou mRNA) do tecido correspondente de um indivíduo saudável. O ter-mo "regulação" refere-se a quantidade de proteína HDAC-2 e/ou HDAC-2mRNA. Preferivelmente, ambos a proteína e mRNA são regulados.

Se o tecido afetado por uma doença exibe regulação da histonadeacetilase HDAC-2, ou a extensão de regulação pode ser determinada pelamedição da quantidade e/ou expressão de HDAC-2. Por exemplo, a quanti-dade de proteína de HDAC-2 pode ser determinada por um imunoensaiousando-se anticorpos dirigidos contra HDAC-2. Tais imunoensaios são co-nhecidos àqueles versados na técnica. Os anticorpos dirigidos contra HDAC-2 são descritos em Krámer et al. (2003) EMBO J. 22, 3411-3420, e podemser obtidos de várias fontes, tais como Santa Cruz Biotechnology, Inc., Zy-med, SigmaAIdrich, e outras companhias.

Western blotting pode ser usado, que é geralmente conhecidona técnica. O material celular ou tecido pode ser homogeneizado e tratadocom agente de desnaturação e/ou redução para obter as amostras. A amos-tra pode ser carregada em um gel de poliacrilamida para separar as proteí-nas, seguido por transferência para uma membrana, ou diretamente man-chada em uma fase sólida. O anticorpo é, em seguida, compactado com aamostra. Após uma ou mais etapas de lavagem, o anticorpo ligado é detec-tado usando-se técnicas que são conhecidas na técnica. Eletroforese de gelde proteínas e Manchamento Ocidental é descrito em Golemis, "Protein-Protein lnteractions: A Laboratory Manual", CSH Press 2002, Cold SpringHarbor N.Y.

A imunohistoquímica pode ser usada após fixação e permeabili-zação de material de tecido, por exemplo, fatias de tumors sólidos. O anti-corpo é, em seguida, incubado com a amostra, e, em seguida a uma ou maisetapas de lavagem, o anticorpo ligado é detectado. As técnicas são esboça-das em Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press1988, Cold Spring Harbor N.Y..

Em uma concretização preferida, a quantidade de proteína deHDAC-2 é determinada por meio de um ELISA. Uma variedade de formatosdo ELISA pode ser considerada. Em um formato, o anticorpo é imobilizadoem uma fase sólida, tal como uma placa de microtitulação, seguido por blo-queio de locais de ligação inespecíficos, e incubação com a amostra. Emoutro formato, a amostra é primeiro contactada com a fase sólida para imobi-lizar a proteína de HDAC-2 contida na amostra. Após bloqueio e opcional-mente lavagem, o anticorpo é contactado com a amostra imobilizada. Astécnicas de ELISA são descritas em Harlow and Lane, "Antibodies, A Labo-ratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y..

Alternativamente, a quantidade de HDAC-2 mRNA ou cDNA po-de ser determinada por tecnologia de ácido nucléico conforme conhecida aum versado na técnica. Preferivelmente técnicas de hibridização e/ou técni-cas de PCR são empregadas. As técnicas de northern blotting podem serusadas para determinar a quantidade de HDAC-2 RNA na amostra. Em umaconcretização preferida, RT-PCR é usado. O versado na técnica é capaz dedesignar iniciadores adequados e/ou sondas a serem usados nestes méto-dos com base na seqüência de nucleotídeo de HDAC-2. A seqüência de nu-cleotídeo e métodos adequados para determinar a quantidade e/ou expres-são de HDAC-2 são descritos no documento 2004/027418 A2.

De acordo com um aspecto do uso ou método da invenção, umaetapa diagnostica pode ser realizada de modo a determinar se um indivíduotem uma doença que é caracterizada pela regulação de HDAC-2. Esta etapadiagnostica pode compreender determinar em uma amostra de tecido aquantidade ou expressão de ácido nucléico ou proteína de HDAC-2. Se aamostra de tecido exibe regulação de HDAC-2, o indivíduo do qual o tecidofoi obtido pode ser tratado de acordo com o uso ou método da invenção.

O tratamento de combinação de acordo com a invenção pode,portanto, ser precedido pela etapa de determinação em uma amostra de te-cido da quantidade de ou a expressão de ácido nucléico ou proteína deHDAC-2 (por exemplo, mRNA). Opcionalmente, o indivíduo pode ser sele-cionado se a quantidade ou a expressão de ácido nucléico ou proteína deHDAC-2 na referida amostra é significantemente mais alta (pelo menos 10,ou 50%) do que aquela em uma amostra de referência de um indivíduosaudável.

Pode ser adicionalmente determinado se ou não mutações nogene APC ou no gene beta-catenina estão presentes. Ainda, a presença ouausência de regulação ou função aumentada de c-myc pode ser determina-da de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Várias mutações de beta-catenina em cânceres humanos sãodescritas na Tabela 1 de Polakis (2000) Genes & Development 14:1837-1851 (vide página 1840 neste). Estas mutações são incorporadas aqui porreferência. Em uma concretização desta invenção, a doença a ser tratada écaracterizada por pelo menos uma destas mutações de beta-catenina notecido afetado pela doença.

As mutações no gene APC têm sido amplamente descritas naliteratura, e estão freqüentemente associadas com o desenvolvimento decânceres gastrointestinais, incluindo cânceres do estômago, duodeno, cólone reto, tornando o gene APC como um guardião de cancerogênese colônica(Behrens and Lustig, Int. J. Dev. Biol. 48: 477-487, 2004; e citações neste).Além disso, mutações de APC têm também se verificado em uma variedadede cânceres adicionais (Beroud and Soussi, Nucleic Acids Res. 24(1):121-4,1996), incluindo cânceres pancreáticos (Flanders and Foulkes, Med. Genet.33: 889-898, 1996), cânceres de tireóide (Kurihara et al; Thyroid14(12):1020-9, 2004), câncer de pulmão (Ohgaki et al.; Câncer Lett.207(2): 197-203, 2004), câncer de rim (Pecina-Slaus et al., Pathology36(2):145-51, 2004), melanoma (Worm et al., Oncogene 23(30):5215-26,2004; Reifenberger et al., Int J Câncer 100(5):549-56, 2002). Além disso, asmutações de APC em pacientes de síndrome de FAP e Turcot têm tambémsido associadas com o desenvolvimento de meduloblastoma, carcinoma detireóide papilar, hepatoblastoma, e tumores desmóides (Lynch et al., Dig.Dis. Sei. 46(11):2325-32, 2001), bem como tumores de cérebro (Sunahara etal., Nippon Rinsho 58(7):1484-9, 2000; Hamilton et al., N. Engl. J. Med.332(13):839-47, 1995). A descrição destes documentos e as mutações aquidescriras são incorporadas aqui por referência.

Preferivelmente, a doença a ser tratada ou impedida é uma con-dição herdada que conduz a câncer. As doenças podem adicionalmente sercâncer ou uma enfermidade inflamatória.

Em uma concretização preferida, a condição herdada que con-duz a câncer é Polipose Adenomatosa Familial (FAP).

Um aspecto da invenção é o uso de um inibidor de histona dea-cetilase em combinação com uma NSAID para a fabricação de um medica-mento para tratamento ou prevenção de uma enfermidade inflamatória.

A doença a ser tratada ou impedida pode ser câncer de seio de-pendente do receptor de estrogênio, câncer de seio independente do recep-tor de estrogênio, câncer de próstata dependente do receptor de hormônio,câncer de próstata independente do receptor de hormônio, câncer de cére-bro, câncer renal, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer pancreático,câncer de bexiga, câncer esofageal, câncer de estômago, câncer genitouri-nário, câncer gastrointestinal, câncer uterino, câncer ovariano, astrocitomas,gliomas, câncer de pele, carcinoma de célula escamosa, Keratoakantoma,doença de intestino, Linfoma de célula-T cutânea, melanoma, carcinoma decélula basal, queratose actínica; ictiose; acne, acne vulgaris, sarcomas, sar-coma de Kaposi, osteosarcoma, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma depulmão de célula pequena, carcinoma de pulmão de célula não-pequena,leucemias, Iinfomas e/ou outros cânceres de célula sangüínea.

Em outro aspecto, a doença é artrite reumatóide, síndrome deresistência de tireóide, diabetes, talassemia, cirrose, infecção protozoal, es-pondilite reumatóide, todas as formas de reumatismo, osteoartrite, artritegotosa, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente de insulina, diabe-tes não-dependente de insulina, asma, rinite, uveíte, Iupus eritematóides,colite ulcerativa, Morbus Crohn, doença inflamatória de intestino, diarréiacrônica, psoríase, dermatite atópica, doença de osso, enfermidades fibropro-liferativas, aterosclerose, anemia aplástica, síndrome de DiGeorge, doençade Graves, epilepsia, estado epiléptico, doença de Alzheimer, depressão,esquizofrenia, enfermidade esquizoafetiva, mania, derrame cerebral, sinto-mas psicóticos incongruentes de humor, enfermidade bipolar, enfermidadesafetivas, meningite, distrofia muscular, esclerose múltipla, agitação, hipertro-fia cardíaca, falha no coração, dano de reperfusão e/ou obesidade.

A NSAID a ser usada no tratamento de combinação pode ser uminibidor de ciclooxigenase, preferivelmente é um inibidor de ciclooxigenase-2. NSAIDs preferidas de acordo com esta invenção são salicilatos, ácidosarilalcanóicos, ácidos 2-arilpropiônicos, ácidos N-arilantranílicos, oxicams,tais como meloxicam e piroxicam, coxibs, tais como celecoxib, valdecoxib,lumiracoxib, etoricoxib, e rofecoxib, sulfonanilidas, indometacin, sulindac,aspirina, flurbiprofen, ibuprofen, fármacos de naproxen, e derivados destes.

Conforme aqui usado, o termo "inibidor de histona deacetilase"denota uma substância que é capaz de inibir a atividade de histona deaceti-Iase de uma enzima tendo atividade de histona deacetilase.

A atividade inibitória de um inibidor de histona deacetilase podeser determinada em um ensaio in vitro, conforme conhecido àqueles versa-dos na técnica (W003/001403). O valor IC50 pode ser tomado conforme me-dido para a atividade inibitória de um inibidor de histona deacetilase. Um va-lor IC5O baixo indica uma alta atividade inibitória; um alto valor IC5o indicauma baixa atividade inibitória. Os inibidores de histona deacetilase usadosde acordo com esta invenção preferivelmente têm um valor IC5o de menosdo que 1 mM, mais preferivelmente de menos do que 500 μΜ com relação apelo menos uma histona deacetilase.

De acordo com uma concretização preferida, o inibidor de histo-na deacetilase é capaz de inibir preferencialmente um subconjunto de histo-na deacetilases ou deacetilases selecionadas. O termo "inibir preferencial-mente", conforme aqui usado, refere-se a uma situação onde um primeirogrupo de histona deacetilases é inibido mais fortemente do que um segundogrupo de histona deacetilases por um dado inibidor de histona deacetilase.

Usualmente, o inibidor de histona deacetilases que inibe preferencialmenteum primeiro grupo de histona deacetilases tem um valor IC5o de menos doque 800 μΜ, preferivelmente menos do que 500 μΜ com relação a histonadeacetilases de referido primeiro grupo. O valor IC50 com relação a histonadeacetilases do segundo grupo é usualmente maior do que 800 μΜ, preferi-velmente maior do que 1 mM.

Em uma concretização preferida, o inibidor de histona deacetila-se é capaz de inibir preferencialmente histona deacetilases de classe I. Deacordo com esta primeira concretização, as histona deacetilases de classe Isão inibidas mais fortemente do que as histona deacetilases de classe II.

Nesta primeira concretização, o inibidor de histona deacetilase usualmentetem valores IC50 de menos do que 800 μΜ, preferivelmente menos do que500 μΜ com relação as enzimas de histona deacetilase HDAC 1, 2, 3 e 8.

Em adição, o inibidor de histona deacetilase usualmente tem um valores IC50de mais do que 800 μΜ, preferivelmente de mais do que 1 mM com relaçãoa enzima de HDAC de classe Il 4, 5, 6, 7, 9 e 10. Em uma concretização es-pecífica, o inibidor de histona deacetilase a ser usado inibe HDAC-2 maisforte do que outras histona deacetilases. É mais preferido que a histona dea-cetilase usada de acordo com esta invenção tenha um valor IC50 de menos doque 800 μΜ, preferivelmente de menos do que 500 μΜ com relação a HDAC-2.

Preferivelmente, o inibidor de histona deacetilase usada de a-cordo com esta invenção é capaz de regular inferiormente a proteína deHDAC-2 ou níveis de mRNA nas células tratadas com as mesmas. Isto podeser determinado conforme descrito em Krámer et al. (2003) EMBO J. 22,3411-3420, a descrição da qual sendo aqui incorporada por referência. Aregulação inferior pode ser pelo menos 10%, ou pelo menos 25%, ou pelomenos 50%.

O inibidor de histona deacetilase usado no tratamento de combi-nação desta invenção pode ser um composto de fórmula I

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no qual R1 e R2 independentemente são uma cadeia de hidrocarboneto alifá-tica C3-25 linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que compreende op-cionalmente um ou vários heteroátomos, e que pode ser substituída, R3 éhidroxila, halogênio, alcóxi ou um grupo amino opcionalmente alquilatado, ouum sal farmaceuticamente aceitável destes. Preferivelmente R1 e R2 inde-,pendentemente são uma cadeia de hidrocarboneto C3.25 linear ou ramificadaque compreende opcionalmente uma dupla ou tripla ligação.

Mais preferivelmente, o inibidor de histona deacetilase é ácidovalpróico ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Em outros aspectos o inibidor de histona deacetilase pode serselecionado a partir do grupo consistindo em derivados de ácido hidro-xâmico, benzamidas, piroxamidas e derivados destes, metabólitos microbiasexibindo atividade inibitória de HDAC, ácidos graxos e derivados destes, te-trapeptídeos cíclicos, compostos peptídicos, inibidores de classe Ill deHDAC e inibidores de SlRT, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

O derivado de ácido hidroxâmico pode ser um composto tal co-mo NVP-LAQ824, LBH-589, MGCD0103, Tricostatin A (TSA), Suberoil anili-de ácido hidroxâmico, CBHA, G2M-701, G2M-702, G2M-707, Piroxamida,Scriptaid, CI-994, CG-1521, Chlamidocin, Biaril hidroxamato, A-161906, Bi-cíclico aril-N-hidroxicarboxamidas, PXD-101, Sulfonamida ácido hidroxâmi-co, TPX-HA análogo (CHAP)1 Oxamflatin, Trapoxin, Depudecin, Apidicin,benzamidas, (tais como MS-27-275, e MGCD0103) ácido butírico e deriva-dos deste, Pivanex (Butirato de pivaloiloximetila), trapoxin A, Depsipeptídeo(FK-228) e compostos peptídicos relacionados, Tacedinalina e MG2856, ouum sal farmaceuticamente aceitável destes.

Uma concretização preferida desta invenção é o uso de ácidovalpróico em combinação com Celecoxib (comercializada, por exemplo, co-mo Celebrex®) (ou outros coxibs)) para a fabricação de um medicamentopara a prevenção ou tratamento de uma doença conforme definida aqui aci-ma. Mais preferivelmente, ácido valpróico é usado em combinação com Ce-lecoxib para tratamento de FAP.

Outra concretização preferida desta invenção é o uso de ácidovalpróico em combinação com Sulindac (ou outros ácidos arilalcanóicos)para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento deuma doença conforme definida acima. Mais preferivelmente, ácido valpróicoé usado em combinação com Sulindac para tratamento de FAP.

Outra concretização preferida desta invenção é o uso de ácidovalpróico em combinação com aspirina (ou outros salicilatos) para a fabrica-ção de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doençaconforme definida acima. Mais preferivelmente, ácido valpróico é usado emcombinação com aspirina para tratamento de FAP.

Outra concretização preferida desta invenção é o uso de ácidovalpróico em combinação com Ibuprofen (ou outros ácidos 2-arilpropiônicos)para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento deuma doença conforme definida acima. Mais preferivelmente, ácido valpróicoé usado em combinação com Ibuprofen para tratamento de FAP.

Outra concretização preferida desta invenção é o uso de ácidovalpróico em combinação com ácido fenâmico (ou outros ácidos N-arilantranílicos) para a fabricação de um medicamento para a prevenção outratamento de uma doença conforme definida acima. Mais preferivelmente,ácido valpróico é usado em combinação com ácido fenâmico para tratamen-to de FAP.

Outra concretização preferida desta invenção é o uso de ácidovalpróico em combinação com piroxicam (ou outros oxicams) para a fabrica-ção de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doençaconforme definida acima. Mais preferivelmente, ácido valpróico é usado emcombinação com piroxicam para tratamento de FAP.

Em um aspecto específico, a presente invenção refere-se a umacombinação, tal como uma preparação combinada ou uma composição far-macêutica, que compreende (a) ácido valpróico ou um sal farmaceuticamen-te aceitável deste, e (b) Celecoxib. Em outro aspecto específico, a presenteinvenção refere-se a uma combinação, tal como uma preparação combinadaou uma composição farmacêutica, que compreende (a) ácido valpróico ouum sal farmaceuticamente aceitável deste, e (b) Sulindac. Em outro aspectoespecífico, a presente invenção refere-se a uma combinação, tal como umapreparação combinada ou uma composição farmacêutica, que compreende(a) ácido valpróico ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, e (b) (b)aspirina. Em outro aspecto específico, a presente invenção refere-se a umacombinação, tal como uma preparação combinada ou uma composição far-macêutica, que compreende (a) ácido valpróico ou um sal farmaceuticamen-te aceitável deste, e (b) lbuprofen. Em outro aspecto específico, a presenteinvenção refere-se a uma combinação, tal como uma preparação combinadaou uma composição farmacêutica, que compreende (a) ácido valpróico ouum sal farmaceuticamente aceitável deste, e (b) ácido fenâmico. Em outroaspecto específico, a presente invenção refere-se a uma combinação, talcomo uma preparação combinada ou uma composição farmacêutica, quecompreende (a) ácido valpróico ou um sal farmaceuticamente aceitável des-te, e (b) piroxicam.

Os ingredientes ativos (a) e (b) podem estar presentes na formalivre, ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, para um uso si-multâneo, concorrente, separado ou seqüencial. As partes do kit de partespodem ser administradas simultaneamente, ou disparadas cronologicamen-te, isto é, em pontos de tempo diferentes, e com intervalos de tempo iguaisou diferentes para qualquer parte do kit de partes.

O medicamento de acordo com a invenção pode ser aplicadopor administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral, na-sal, intraperitoneal ou baseada em supositório.

Os compostos de fármaco diferentes podem ser administradosna forma de dois fármacos individuais, ou em uma forma administrativa quecontém ambas os fármacos em uma unidade de aplicação simples. Os com-postos de fármaco diferentes podem ser administrados simultaneamente, oudisparados cronologicamente, isto é, em pontos de tempo diferentes, e comintervalos de tempo iguais ou diferentes para qualquer composto da combi-nação.

Verificou-se surpreendentemente que doses terapêuticas deuma NSAID e inibidor de histona deacetilase podem ser significantementereduzidas, conforme comparado as respectivas monoterapias com estescompostos.

Portanto, a dosagem preferida de uma NSAID quando usada emcombinação com um inibidor de histona deacetilases pode ser reduzida para30-60% da dose recomendada ou aprovada, mais preferivelmente 60-80%, emais preferivelmente para 80-90%.

Em um aspecto específico, a presente invenção refere-se a umacombinação, tal como uma preparação combinada ou uma composição far-macêutica, que compreende (a) ácido valpróico ou um sal farmaceuticamen-te aceitável deste, e (b) Celecoxib, onde a dose diária de celecoxib para otratamento é entre 100 mg e 600 mg, e a dose diária de ácido valpróico ouum sal farmaceuticamente aceitável deste é entre 10 mg/kg de peso corpó-reo e 60 mg/kg de peso corpóreo. Mais preferível, a dose diária de celecoxibé entre 200 mg e 500 mg, e a dose diária de ácido valpróico ou um sal far-maceuticamente aceitável deste, é entre 20 mg/kg de peso corpóreo e45 mg/kg de peso corpóreo. Mais preferivelmente, estas combinações sãousadas para tratamento de FAP.Em outro aspecto específico, a presente invenção refere-se auma combinação, tal como uma preparação combinada ou uma composiçãofarmacêutica, que compreende (a) PXD101 ou um sal farmaceuticamenteaceitável deste, e (b) Celecoxib, onde a dose diária de celecoxib para o tra-tamento é entre 100 mg e 600 mg, e a dose diária de PXD101 é entre 300mg/kg e 10 g. Mais preferível, a dose diária de celecoxib é entre 200 mg e500 mg, e a dose diária de PXD101 é entre 500 mg e 5 g. Mais preferivel-mente, estas combinações são usadas para tratamento de FAP.

Em outra concretização da invenção, a dosagem preferida deum inibidor de histona deacetilase quando usada em combinação com umaNSAID pode ser reduzida para 30-60% da dose recomendada ou aprovadapara o fármaco, mais preferivelmente para 60-80%, e mais preferivelmentepara 80-90%.

À luz do perfil de efeito colateral já previamente conhecido des-tes fármacos, em adição com dados recentes agora também adicionando umrisco aumentado potencial de cardiotoxicidade e derrame cerebral a estalista de efeitos colaterais possíveis, pode ser requerido abaixar os níveis dedose destes fármacos, particularmente se um longo tempo ou ainda aplica-ção crônica é requerida. Isto, de fato, pode ser alcançado por novos cami-nhos terapêuticos de combinar outras aproximações terapêuticas com o usode inibidores de COX1 permitindo, desse modo, uma dosagem diminuída deinibidores de COX pela manutenção de pelo menos o mesmo sucesso tera-pêutico com efeitos colaterais reduzidos, ou mesmo aumentando o benefíciodo paciente.

Nesta invenção foram apresentados dados mostrando que osinibidores de HDAC podem regular inferiormente a expressão de COX-2, epodem, desse modo, inibir a secreção celular de prostaglandinas. Isto, porsua vez, contribui para as propriedades anticancerosas de tais inibidores deHDAC. Contudo, e mais importantemente, agora nesta presente invenção,foi mostrado que surpreendentemente a combinação de tais inibidores deHDAC com inibidores de enzimas de COX resultam em uma inibição siner-gística não-esperada de eventos biológicos a jusante que são também regu-lados pelas enzimas de COX1 tais como a secreção de prostaglandinas. Es-tas atividades sinergísticas podem ser em parte devido a inibição enzimáticacausada pelos inibidores de COX, e segundo pela regulação inferior da ex-pressão de genes de COX. Contudo, visto que ambos mecanismos envol-vem a mesma estrutura alvo, pode ser esperado que esta explanação nãoseja suficiente para explanar os efeitos sinergísticos observados, particular-mente vistos nos sistemas de teste in vivo mais relevantes em animais. Des-se modo, deve ser concluído que atividades surpreendentes adicionais, maissimilarmente ligadas a atividade de inibição de histona deacetilases, são a-tribuíveis para causar tais efeitos sinergísticos benéficos. Estas descobertaspodem ser agora transferidas para teste clínico humano de modo a propor-cionar a pacientes que sofrem de câncer ou enfermidades inflamatórias umanova opção terapêutica baseada na terapia combinacional usando inibidoresde HDAC junto com inibidores de COX.

Em adição, pode ser esperado baseado nesta atividade sinergís-tica combinada, pode ser possível abaixar as doses usadas para as NSAID squando usadas em combinação com inibidores de HDAC que resultariam emuma diminuição de efeitos colaterais relacionados ao uso destas NSAIDs.

Desse modo, como na situação de Polipose Adenomatosa Fami-lial (FAP), uma combinação de inibidores de HDAC e NSAIDs é esperadaconduzir a uma redução sinergística de crescimento de pólipo intestinal ecarga de pólipo. Como um resultado, o padrão atualmente de cuidado parapacientes de, a saber, uma colectomia profilática (remoção cirúrgica do in-testino) pode ser adiado, potencialmente por anos. Em adição, visto que pó-lipos individuais nestes pacientes finalmente progridem para câncer de có-lon, esta progressão pode ser suprimida e retardada.

Adicionalmente, esta invenção cobre o uso de uma combinaçãode inibidores de HDAC com inibidores de COX para a terapia de uma varie-dade total de indicações de câncer, incluindo, mas não limitado a, câncer docólon, seio, pulmão e próstata.

Também, baseado na atividade antiinflamatória de inibidores deHDAC1 estes podem ser empregados em combinação com inibidores deCOX que agem como antiinflamatório para capacitar uma nova opção tera-pêutica que combina ambos conceitos inibitórios para alcançar aditivo, oumesmo benefícios terapêuticos sinergísticos em enfermidades inflamatórias.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Regulação inferior da expressão de RNA e proteína de COX-2por inibidores de histona deacetilases.

A expressão de Cox-2 é regulada inferiormente por inibidores deHDAC (figuras 1 e 2). Isto pode ser mostrado para os compostos inibitóriosde HDAC ácido valpróico (VPA, TSA, G2M-701, G2M-702 e G2M-707 (videWO 2004/009536 A1 para detalhes em G2M-701, G2M-702 e G2M-707) nonível de RNA e proteína em vários si temas, tais como células de câncer epi-teliais de pulmão humano A-549, células de melanoma SK-Mel, células decarcinoma de cólon HT-29, células de carcinoma de mamíferos MDA-MB-231, monócitos THP-1 e linfócitos humanos primários e macrófagos. Os ní-veis de Cox-1 analisados ao mesmo tempo não são afetados conforme mos-trado na figura 1. Em contraste, o inibidor de COX-2 Celecoxib (figura 2) nãoaltera a expressão de COX-2.

As células THP-1 foram induzidas a diferenciarem por adição de20 ng/ml de TPA ao meio de crescimento por 3 dias. Células aderentes fo-(ram semeadas, e uma densidade de 5x105 células por cavidade de uma pla-ca de 6 cavidades, e foram incubadas com 1 mM de VPA ou 10 DM deG2M-707 durante a noite (figura 1A). A expressão de Cox-2 foi, em seguida,induzida pela adição de 10 DgAnI de LPS por 6 horas. O RNA foi preparadousando-se o Kit RNeasy de Qiagen de acordo com as instruções do fabri-cante. Transcrição reversa foi feita com 1 Dg de RNA em um volume de 20Dl. 1 Dl foi usado para cada reação de PCR com iniciadores específicos pa-ra os genes indicados. Por outro lado, a regulação inferior de TNF-D, IFN-De IL-6, também uma regulação inferior de COX-2 RNA, mas não de COX-1RNA por ambos inibidores de HDAC, podem ser observadas (figura 1 A).

RT-PCR semi-quantitativa foi também realizada com forma iso-lada de RNA para linfócitos de sangue periféricos de pacientes tratados comdoses de 30 mg/kg/d (Paciente 1) ou 120 mg/kg/dia de VPA (Paciente 2),respectivamente. A figura 1B mostra claramente uma regulação inferior deCox-2, mas não do gene de controle GAPDH por tratamento de VPA.

A regulação de Cox-2 no nível de proteína por inibidores deDHAC é mostrada em vários tipos de células na figura 2. Aqui, as célulasA549 e células de melanoma SK-MeI mostraram expressão constitutiva deCOX-2, e não foram adicionalmente induzidas. Nas células de carcinoma decólon HT-29, expressão de Cox-2 foi induzida pelo tratamento com 100ng/ml de TNF-α por 4 horas. Para células de carcinoma de mamífero MDA-MB-231 e monócitos-THP-1, 10 μg/ml de LPS foi usado como um indutorpara expressão de Cox-2 por 16 horas ou 6 horas, respectivamente. O tra-tamento com inibidor de HDAC foi feito por 72 horas (A-549), 48h (SK-Mel),começando 16 horas antes da indução (para células THP-1), ou 30 minutosantes da indução (para células HT29 e MDA-MB-231).

As células foram semeadas em densidades entre 5x104 e 1x105células por cavidade de placas de 24 cavidades. Lysis foi feita pela remoçãode meio de crescimento e adição de 200 μΙ de tampão de amostra de La-emmli por cavidade. 60 μΙ foram carregados em 8% de géis acrilamidas esubmetidos a eletroforese contínua. As proteínas manchadas na membranade PVDF foram sondadas com um anticorpo de cabra-anti-Cox-2 (St.Cruz,sc1747), ou um anticorpo de camundongo anti-pan-actina (Ab-5, NeoMar-kers). Em todos os sistemas, uma regulação inferior de proteína de Cox-2,mas não da proteína de controle Actin por inibidores de HDAC, pode ser ob-servada (figura 2).

Exemplo 2

A inibição de secreção de prostaglandina por inibidores de histo-na deacetilases, e sua combinação com inibidores de enzimas de COX(NSAIDs).

A inibição de nível de proteína de Cox-2 por inibidores de HDACresulta também na regulação inferior de prostaglandina secretada em váriossistemas. Esta redução de prostaglandina alcança o mesmo nível como como inibidor de Cox-2 Celecoxib (Cel), conforme mostrado na figura 3.Nas células de carcinoma de cólon HT-29, a expressão de Cox-2foi induzida pelo tratamento com 100ng/ml de TNF-D por 4 horas, para célu-las de carcinoma de mamífero MDA-MB-231, 10 Dg/ml de LPS foi usadocomo um indutor para expressão de Cox-2 por 16 horas. O inibidor de HDACe tratamento de inibidor de Cox foi feito por 30 minutos antes da indução(HT-29, MDA-MB-231), ou 16 horas antes de Iysis (A549). Os níveis de pros-taglandina nos sobrenadantes foram analisados com o Kit de prostaglandinaE2 EIA de Cayman de acordo com as instruções do fabricante. As barrasmostram a média de dois valores, as barras de erro refletem a faixa dos doisvalores (figura 3).

Os inibidores de HDAC podem ainda aumentar a redução desecreção de prostaglandina causada pelo inibidor de Cox Celecoxib nos mo·nócitos THP-1 e células de carcinoma mamárias MDA-MB-231, conformemostrado na figura 4. Nos monócitos THP-1, os inibidores de HDAC G2M-707 e TSA podem reduzir os níveis de prostaglandina adicionalmente, mes-mo após eles já terem sido expressos por Celecoxib. Esta inibição aumenta-da de secreção de prostaglandina deve estar relacionada como sinergística,visto que o uso de combinações de Celecoxib e inibidores de HDAC resul-tam em uma inibição muito mais pronunciada de secreção de prostaglandinado que somente na adição das atividades inibitórias individuais teriam suge-irido. Desse modo, a função inibitória de HDAC destes inibidores de HDACparecem suportar surpreendentemente a função inibitória de COX- em regu-lação inferior da secreção de prostaglandina por um mecanismo assim des-coberto que permite estes resultados sinergísticos. Também, nas célulasMDA-MB-231 do inibidor de HDAC, a dose de VPA pode dependentementeaumentar a expressão de secreção de prostaglandina por Celecoxib. Emparalelo, os níveis de proteína de Cox-2 foram reduzidos conforme já descrito.

Em detalhes, as células foram semeadas a uma densidade de7,5 x104 por cavidade em placas de 24 cavidades. Os sobrenadantes foramanalisados em uma diluição de 1:3 em duplicatas com um Kit de prostaglan-dina E2 EIA de Cayman de acordo com as instruções do fabricante. As bar-ras mostram a média de dois valores. Os extratos de célula foram prepara-dos pela remoção do meio de crescimento completamente, e adição de 200□ I de tampão de Amostra Laemmli por cavidade. Subseqüentemente, 60 Dlforam carregados em 8% de géis de acrilamida, e submetidos a eletroforesedescontínua. As proteínas manchadas em membranas de PVDF foram son-dadas com um anticorpo de cabra anti-Cox-2 (St.Cruz, sc1747), ou um anti-corpo de camundongo anti-pan-actin (para analisar a expressão deste prote-ína de controle) (Ab-5, NeoMarkers).

Exemplo 3

Inibição sinergística de crescimento de adenoma in vivo pelo usode inibidores de histona deacetilases em combinação com inibidores de Cox-2.

O tratamento com VPA reduz significantemente o número deadenomas no modelo de camundongo APCmin. Resultados similares foramobtidos pela utilização do inibidor de Cox-2 Celecoxib neste modelo. Contudo,após terapia de combinação usando ambas os fármacos neste modelo aomesmo tempo, uma redução sinergística nos números de adenomas foi obser-vada. Isto novamente revela fortemente que a atividade dupla de VPA, sua ca-pacidade de regular inferiormente níveis de proteína de Cox-2, e sua funçãoinibitória de HDAC, são responsáveis pelo efeito terapêutico sinergístico obser-vado quando empregado junto com inibidores de Cox-2 clássicos (figura 5A).

São mostrados valores médios de 15 (grupos de controle), 17(grupo de VPA), 13 (grupo de Celecoxib) ou 5 (grupo de tratamento de com-binação) animais por grupo com barras de erro padrões. P < 0,05 (duas a-mostras teste-t; Controle vs. VPA- e Celecoxib-tratado e monoterapia vs.animais tratados por terapia de combinação.

A figura 5b mostra níveis de prostaglandina em extratos de fíga-do de camundongos APCmin (um modelo de animal de Polipose Adenomato-sa Familiall uma doença hereditária que conduz ao desenvolvimento de cân-cer de cólon) após tratamento com VPA e Celecoxib sozinho, e após trata-mento com a combinação de ambos os fármacos. Aqui, pode ser mostradoque ambos os fármacos diminuem os níveis de prostaglandinas a uma ex-tensão similar. Usando-se ambos os fármacos em terapia de combinação aomesmo tempo resulta em uma diminuição aditiva de secreção de prosta-glandina. Esta supressão aumentada de secreção de prostaglandina foi adi-tiva, novamente revelando que o sinergismo observado na redução de cres-cimento de adenoma não pode somente ser explanado pela interferênciacom a inibição de secreção de prostaglandina, mas preferivelmente deve seratribuído a atividade dupla de VPA, (i) agindo como um inibidor de enzimasde HDAC, e (ii) sua capacidade de regular inferiormente a expressão deCox-2 com uma redução subseqüente de níveis de prostaglandina.

São mostrados valores médios de dois (grupo de controle), qua-tro (grupo de VPA) e cinco (celecoxib e grupos de combinação) animais comdesvios padrões.

Em detalhe, sete a dezesseis camundongos heterozigóticos demesmo sexo C57BL/6J-APCmin/+ de duas semanas de idade (Jackson Labo-ratories, Bar Harbor, Maine) foram, ou deixados não-tratados, ou foram tra-tados com VPA ou Celecoxib, ou ambos os fármacos, respectivamente. Osanimais de controle foram injetados (i.p.) com PBS. VPA foi injetado (i.p.)como solução aquosa isotônica de seu sal de sódio (2x400 mg/kg/dia) porquarto semanas, enquanto Celecoxib foi alimentado aos animais ad Iibitumcom sua dieta a 1250 ppm (0,12%) por quarto semanas. O grupo de combi-nação recebeu a mesma dosagem conforme os grupos de tratamento sim-pies de ambos, os grupos VPA e o Celecoxib, por quatro semanas. Nos tra-Étos intestinais totais de sacrifício foram abertos longitudinalmente e fixadosem 10% de formaldeído tamponado por 10% de fosfato por 24 horas, segui-do por fixação de etanol em 50% de etanol por três dias. O contraste de pó-lipo foi aumentado realizando-se um manchamento de 1 minuto em 0,1% deazul de metileno antes da determinação de números e tamanhos de pólipossob uma dissecação em microscópio por dois observadores independentesnão cientes do tratamento que o camundongo recebeu.

A atividade de ciclooxigenase foi acessada ex vivo no tecido he-pático conforme descrito (Reuter et al., 2002; BMC Câncer 2:19). Brevemen-te, os camundongos foram eutanizados 3 horas, em seguida a dose final deveículo ou fármacos, e uma amostra de tecido de fígado (-100 mg), foi obti-da. As amostras foram, em seguida, colocadas em tubos de microcentrífugacontendo 1 ml de tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4), e finalmentecortado em pedaços com cortadores por 15 segundos. As amostras foramem seguida incubadas por 20 minutos a 37° em um banho de água turbulen-to. Após o período de incubação, as amostras foram centrifugadas a 9000 χg por 30 segundos, e os sobrenadantes coletados. Os sobrenadantes foramcongelados em nitrogênio líquido, e armazenados a -80°C para determina-ção subseqüente de teor de prostaglandina E2. Concentrações de PGE2foram determinadas em duplicatas após diluição de 1:20 de sobrenadantesusando-se um Imunoensaio de Enzima competitivo comercialmente disponí-vel (Cayman Chemical).

Exemplo 4

Inibidores de HDAC reduzem as classificações de severidadeclínica em um modelo terapêutico de Artrite Reumatóide induzida por Colá-geno (CIA).

Cox-2 é conhecido por ser central ao processo inflamatório (Du-bois R. et al., FASEB J 12, 1063-1073 (1998)). Ela é rapidamente reguladapelo mediador de inflamação TNF-D, e as prostaglandinas produzidas porenzimas de COX enzimas suprimem adicionalmente imunossupervisão.Desse modo, a inibição de enzimas de COX e subseqüente diminuição deprodução de prostaglandina finalmente conduzem a alívio de sintomas infla-matórios e, desse modo, exploram seus efeitos paliativos. Contudo, ela nãoafeta eficazmente a causa do processo inflamatório. Nos anos recentes apesquisa para uma terapia preferivelmente causai de doenças inflamatóriasresultou no desenho de novas terapias tendo como alvo TNF-D como o me-diador de inflamação central.

Recentemente, foi descoberto que inibidores de HDAC revelamatividade antiinflamatória (vide também figura 1 em que os inibidores deHDAC regulam inferiormente a expressão de citoquinas inflamatórias, inclu-indo TNF-D). Portanto, pode ser proposto que os inibidores de HDAC podemser empregados em combinação com inibidores de Cox que agem como an-tiinflamatórios para capacitar uma nova opção terapêutica que combina am-bos os conceitos inibitórios para alcançar benefícios terapêuticos aditivos oumesmo sinergísticos quando do tratamento de enfermidades inflamatórias.Aqui, em particular, e conforme mencionado acima, o mecanismo duplo deinibidores de HDAC, a saber, sua atividade inibitória de HDAC e sua capaci-dade de regular inferiormente expressão de Cox-2 e, desse modo, subse-qüentemente diminuir os níveis de prostaglandina, contribuem para esta su-posição.

Para avaliar a capacidade dos inibidores de HDAC para inibirsecreção de TNF-α solúvel in vivo, um modelo de inflamação induzido porLPS agudo em camundongos 3H1 foi usado. Os camundongos foram injeta-dos i.p. com substâncias testadas 1 hora antes da i.p. injeção de LPS. A-mostras de sangue foram retiradas após 1 hora de estímulo de LPS, e osníveis de TNF-α no soro foram determinados usando-se um ensaio TNF-aELISA. Conforme mostrado na figura 6 (painel inferior), pré-tratamento comVPA e G2M-707 conduziu a uma redução de 60% nos níveis de soro deTNF-α absoluto em comparação aos camundongos de controle.

Este experimento mostra claramente que os inibidores de HDACsão inibidores potentes de níveis de TNF-D in vivo, e podem ser usados pa-ra tratar doenças inflamatórias que respondem a uma redução de níveis emCox-2 e TNF-α.

Em detalhes, camundongos foram tratados com VPA (400,mg/kg/dia, n=8), G2M-701 (1 mg/camundongo/dia, n=4), G2M-707 (1mg/camundongo/dia, n=4), ou com 200μΙ de PBS (controle, n=8) 1 hora an-tes da inflamação ser induzida com 50 pg de LPS (Sigma) por camundongo.Uma hora após o tratamento de LPS, o sangue foi tomado por puncionamen-to cardíaco, e o soro foi isolado. O soro foi testado em um módulo de TNF-Dintercalado por ELISA de Bender MedSystems. O ensaio foi realizado con-forme descrito no manual do fabricante. ABTS foi usado como um substrato,e a medição foi efetuada com uma leitora de placa de 96 cavidades a umcomprimento de onda de 405 nm. Níveis absolutos OD a 405 nm são dados.

Para avaliar esta potência antiinflamatória de inibidores deHDAC em um modelo de inflamação in vivo terapêutico, nós aplicamos VPAe G2M-707 a camundongos que desenvolveram artrite induzida por coláge-no (CIA).

A figura 6 (painel superior) mostra o resultado de tratamentocom VPA ou G2M-707 em tal modelo para Artrite Reumatóide (RA). Ambosos fármacos reduziram eficientemente as classificações de severidade clíni-cas (classificação de soma), conforme comparado ao grupo de controle, e aeficácia foi mantida através do curso do tratamento. Prednisolon, um fárma-co corticosteróide no uso clínico para RA1 foi usado como um controle positi-va neste estudo.

Cada ponto de dados representa a média de 9 (grupo de VPA),8 (grupo de G2M-707) ou 4 (grupo de Prednisolon) animais, respectivamen-te. P < 0,05 (duas amostras teste-t; Controle vs. VPA-tratado e Controle vs.animais tratados com Prednisolon).

Em detalhe, neste modelo terapêutico CIA, camundongos fê-meas DBA/1 de 7 semanas de idade foram imunizados com 100 pg de colá-geno de colágeno tipo Il de frango (Chondrex) em CFA. O desenvolvimentode artrite começou 21 a 28 dias após imunização, e alcançou uma incidênciade 93% após 6 semanas. A severidade foi de média a alta, e alcançou umaclassificação média de 10,3 (classificação máxima 15) em animais não-tratados. Os camundongos foram monitorados diariamente para sinais deartrite usando-se um sistema de classificação estabelecido. No primeiro sinalde artrite, os camundongos afetados foram transferidos para um grupo detratamento. Os camundongos foram tratados por 15 dias com controle deveículo ou VPA a 2 χ 400 mg/kg/dia i.p., ou G2M-707 aa 2 χ 1mg/camundongo/dia i.p., ou Prednisolon a 2 χ 20 mg/kg/dia (i.p.). A severi-dade clínica de artrite foi acessada baseado na aparência de cada pata, esubjetivamente classificada em uma escala de 0 a 4. As classificações decada membro foram somadas, dando uma classificação de severidade má-xima de 16. O sistema de classificação foi conforme segue: 0, nenhuma artri-te; 1, vermelhidão de pata e um ou dois dedos inchados; 2, inchamento mé-dio a moderado de toda pata; 3, inchamento extensivo de toda pata; 4, in-chamento extremo de toda a pata, e começo de anaquilose. Após início dadoença, os animais foram classificados 3 vezes em uma semana.

Claims (30)

1. Uso de um inibidor de histona deacetilase em combinaçãocom um NSAID para a fabricação de um medicamento para o tratamento ouprevenção de uma doença, caracterizado pelo fato de que a histona deaceti-lase HDAC-2 é regulada no tecido afetado por referida doença.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosparte do tecido afetado por referida doença (a) abriga pelo menos uma mu-tação no gene APC, ou (b) abriga pelo menos uma mutação no gene β-catenina que conduz a um ganho de função de β-catenina, ou uma estabili-zação ou meia vida aumentada da proteína β-catenina, ou (c) mostra regula-ção ou função aumentada de c-myc, e/ou (d) mostra mutações ou alteraçõesda trajetória Wnt que conduz a regulação de HDAC-2.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a doençaé uma condição herdada que conduz a câncer, enfermidades de predisposi-ção de câncer, ou uma enfermidade inflamatória.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,em que a condição herdada é Polipose Adenomatosa Familial.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,em que a NSAID é um inibidor de Ciclooxigenase.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,em que a NSAID é um inibidor de Ciclooxigenase-2.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,em que a NSAID é selecionada de salicilatos, ácidos arilalcanóicos, ácidos 2-arilpropiônicos, ácidos N-arilantranílicos, oxicams, tais como meloxicam epiroxicam, coxibs, tais como celecoxib, valdecoxib, lumiracoxib, etoricoxib, erofecoxib, sulfonanilidas, indometacin, sulindac, aspirin, flurbiprofen, ibupro-fen, fármacos de naproxen, e derivados dos mesmos.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,em que o inibidor de histona deacetilase é um composto de fórmula I<formula>formula see original document page 34</formula>em que R1 e R2 independentemente são uma cadeia de hidrocarboneto alifá-tica C3-25 linear ou ramificada, saturada ou insaturada, que compreende op-cionalmente um ou vários heteroátomos, e que pode ser substituída, R3 éhidroxila, halogênio, alcóxi ou um grupo amino opcionalmente alquilatado, ouum sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, em que R1 e R2 inde-pendentemente são uma cadeia de hidrocarboneto C3-25 linear ou ramificadaque compreende opcionalmente uma dupla ou tripla ligação.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,em que o inibidor de histona deacetilase é ácido valpróico ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,em que o inibidor de histona deacetilase é selecionado a partir do grupoconsistindo em derivados de ácido hidroxâmico, benzamidas, piroxamidas ederivados dos mesmos, metabólitos microbias exibindo atividade inibitória deHDAC, ácidos graxos e derivados dos mesmos, tetrapeptídeos cíclicos,compostos peptídicos, inibidores de classe Ill de HDAC e inibidores de SIRT,ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,em que o inibitor de histona deacetilases é selecionado a partir do grupoconsistindo em derivados de ácido hidroxâmico (tais como NVP-LAQ824,LBH-589, Tricostatin A (TSA), Suberoil anilide ácido hidroxâmico, CBHA,G2M-701, G2M-702, G2M-707, Piroxamida, Scriptaid, CI-994, CG-1521, C-hlamidocin, hidroxamato de Biarila, A-161906, Bicíclico aril-N-hidroxicarboxamidas, PXD-101, Sulfonamida ácido hidroxâmico, TPX-HAanálogo (CHAP), Oxamflatin, Trapoxin, Depudecin, Apidicin, benzamidas,(tais como MS-27-275, e MGCD0103) ácido butírico e derivados do mesmo,Pivanex (Butirato de pivaloiloximetila), trapoxin A, Depsipeptídeo (FK-228) ecompostos peptídicos relacionados, Tacedinalina e MG2856, ou um sal far-maceuticamente aceitável dos mesmos.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,em que a doença é câncer de seio dependente do receptor de estrogênio,câncer de seio independente do receptor de estrogênio, câncer de próstatadependente do receptor de hormônio, câncer de próstata independente doreceptor de hormônio, câncer de cérebro, câncer renal, câncer de cólon,câncer colorretal, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer esofageal,câncer de estômago, câncer genitourinário, câncer gastrointestinal, cânceruterino, câncer ovariano, astrocitomas, gliomas, câncer de pele, carcinomade célula escamosa, Keratoakantoma, doença de intestino, Linfoma de célu-la-T cutênea, melanoma, carcinoma de célula basal, queratose actínica; icti-ose; acne, acne vulgaris, sarcomas, sarcoma de Kaposi, osteosarcoma,câncer de cabeça e pescoço, carcinoma de pulmão de célula pequena, car-cinoma de pulmão de célula não-pequena, leucemias, Iinfomas e/ou outroscânceres de célula sangüínea.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12,em que a doença é síndrome de resistência de tireóide, diabetes, talassemi-a, cirrose, infecção protozoal, artrite reumatóide, espondilite reumatóide, to-das as formas de reumatismo, osteoartrite, artrite gotosa, esclerose múltipla,diabetes mellitus dependente de insulina, diabetes não-dependente de insu-lina, asma, rinite, uveíte, Iupus eritematóides, colite ulcerativa, MorbusCrohn, doença inflamatória de intestino, diarréia crônica, psoríase, dermatiteatópica, doença de osso, enfermidades fibroproliferativas, aterosclerose, a-nemia aplástica, síndrome de DiGeorge1 doença de Graves, epilepsia, esta-do epiléptico, doença de Alzheimer, depressão, esquizofrenia, enfermidadeesquizoafetiva, mania, derrame cerebral, sintomas psicóticos incongruentesde humor, enfermidade bipolar, enfermidades afetivas, meningite, distrofiamuscular, esclerose múltipla, agitação, hipertrofia cardíaca, falha no cora-ção, dano de reperfusão e/ou obesidade.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14,em que o medicamento é aplicado por administração intravenosa, in-tramuscular, subcutânea, tópica, oral, nasal, intraperitoneal ou supositório.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15,em que os componentes de fármaco diferentes são administrados separa-damente na forma de dois fármacos individuais, ou em uma forma adminis-trativa que contém ambos fármacos em uma unidade de aplicação simples.

17. Composição farmacêutica compreendendo ácido valpróicoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, celecoxib, e pelo menosum excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

18. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente ácido valpróico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ecomo um segundo componente celecoxib.

19. Composição farmacêutica compreendendo ácido valpróicoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, Sulindac e pelo menosum excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

20. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente ácido valpróico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ecomo um segundo componente Sulindac.

21. Composição farmacêutica compreendendo ácido valpróicoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, aspirina, e pelo menosum excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

22. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente ácido valpróico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ecomo um segundo componente aspirina.

23. Composição farmacêutica compreendendo ácido valpróicoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, lbuprofen, e pelo menosum excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

24. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente ácido valpróico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ecomo um segundo componente Iboprofen.

25. Composição farmacêutica compreendendo ácido valpróicoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ácido fenâmico, e pelomenos um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

26. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente ácido valpróico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ecomo um segundo componente ácido fenâmico.

27. Composição farmacêutica compreendendo ácido valpróicoou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, piroxicam, e pelo menosum excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

28. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente ácido valpróico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ecomo um segundo componente piroxicam.

29. Composição farmacêutica compreendendo PXD101 ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo, Celecoxib, e pelo menos umexcipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

30. Kit farmacêutico compreendendo como um primeiro compo-nente PXD101, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e comoum segundo componente Celecoxib.