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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder
Behandlung einer demyelinisierenden Erkrankung, ein Verfahren zur
Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur
Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden Erkrankung.
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Unter
einer demyelinisierenden Erkrankung oder Entmarkungskrankheit wird
eine Schädigung des zentralen Nervensystems verstanden,
bei der es zu einem Abbau der Myelinscheide der Nervenzellen bzw.
von deren Axone und somit zu einer Zerstörung der Marksubstanz
kommt.
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Zu
den demyelinisierenden Erkrankungen zählen die autoimmune
Neuropathie und das hierunter fallende Guillain-Barré-Syndrom.
Dieses neurologische Erkrankungsbild wird durch eine Polyradikulitis
verursacht, d. h. eine Schädigung der aus dem Rückenmark
hervorgehenden Nervenwurzeln und der peripheren Nerven mit Lähmungserscheinungen, die
typischerweise an den Beinen beginnen und sich bis hin zur Atemlähmung
ausbreiten können. Die Polyradikulitis ist die häufigste
Ursache akut auftretender symmetrischer Lähmungen in der
westlichen Welt. In Deutschland erkranken jährlich etwa
1000 bis 1500 Menschen daran.
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Das
Guillain-Barré-Syndrom kann sich dabei auf verschiedene
Arten ausprägen: als akute inflammatorische demyelinisierende
Polyneuropathie (AIDP), dem häufigsten Subtyp des Guillain-Barré-Syndroms,
als chronisch inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie
(CIDP), wobei in beiden Fällen die Antikörper
sich gegen die körpereigenen Schwann-Zellen und das periphere
Myelin richten, oder als akute motor-axonale Neuropathie (AMAN),
bei der die Antikörper gegen die körpereigenen
motorischen Axone gerichtet sind, sowie als akute motor-sensorische
axonale Neuropathie (AMSAN), bei der die Autoantikörper
gegen die körpereigenen motorischen und sensorischen Axone gerichtet
sind.
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Die
genaue Ursache des Guillain-Barré-Syndroms ist unbekannt.
Die Erkrankung wird höchstwahrscheinlich durch einen immunpathologischen Mechanismus
hervorgerufen, bei dem im Körper Autoantikörper
gegen Ganglioside oder Myelin bzw. die Zellmembranen der Axone des
peripheren Nervensystems gebildet werden. Man postuliert eine molekulare Ähnlichkeit,
auch Mimikry genannt, zwischen Antigenen, welche im Rahmen viraler
bzw. bakterieller Infektionen in den Körper gelangen, und
solchen, die beim Guillain-Barré-Syndrom angegriffen werden.
Bei zwei Drittel der erkrankten Menschen lässt sich eine
vorausgegangene virale oder bakterielle Infektion nachweisen. Üblicherweise
handelt es sich um Infektionen des Magendarmtraktes oder der Atemwege.
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Schwere
Fälle des Guillain-Barré-Syndrom werden derzeit
mittels Immuntherapie behandelt. Dabei werden entweder Immunglobuline
in Kombination mit Kortikoiden gegeben oder es wird eine Plasmapherese
durchgeführt. Nachteilig ist hierbei, dass die Verabreichung
von Kortikoiden mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen einhergeht.
Die Therapie mit Immunglobulinen führt häufig
nicht zum Therapieerfolg und ist zudem mit hohen Kosten verbunden.
Entsprechendes gilt für die Plasmapherese.
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Vor
diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ein neues zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden
Erkrankung wirksames Arzneimittel bereitzustellen, mit dem vorzugsweise
die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden.
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Diese
Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Histondeacetylase-Inhibitors
(HDACi) gelöst.
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Ein
HDACi wird erfindungsgemäß definiert als eine
Substanz, die die Wirkung von Histondeacetylasen (HDAC), vorzugsweise
auf enzymatischer und/oder Expressionsebene, spezifisch zu hemmen vermag.
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HDAC
katalysieren die Abspaltung von Acetylresten von Histonproteinen.
Dieser Vorgang ist ein wesentlicher Bestandteil der sogenannten
epigenetischen Prozessierung, welche auf globaler Ebene die Genexpression
beeinflusst, und bewirkt eine Kondensation des Chromatins, welches
wiederum zu einer Repression der Genexpression führt. Somit
findet eine Änderung der Genregulation oder -expression statt.
HDAC modulieren jedoch nicht nur Histone, sondern katalysieren auch
eine Acetylierung von Proteinen wie Tubulin oder Hitzeschock-Protein
90.
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Eine
große Anzahl strukturell sehr unterschiedlicher HDACi sind
bekannt, zu denen beispielsweise Hydroxaminsäuren wie Trichostatin
A (TSA), Suberoylanilid-Hydroxyaminsäure (SAHA), Suberoyl-Bishydroxaminsäure
(SBHA), 2-Amino-3H-phenoxazin-3-on (APO) und 2-Amino-7-methoxy-3H-phenoxazin-3-on
(AMPO), zyklische Tetrapeptide wie Depsipeptid und Trapoxin A, kurzkettige Fettsäuren
wie Valproinsäure (VPA) und Butyrat, Benzamide wie MS-275
und CI-994, Ketone wie Trifluoromethyl ketone und alpha-Ketoamide
sowie verschiedene weitere Substanzen wie Depudecin oder MGCD-0103
zählen. Sämtliche dieser Verbindungen sind als
erfindungsgemäße HDACi geeignet.
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HDACi
induzieren über die Inhibition von HDAC eine Hyperacetylierung
der Histonproteine. Nach aktuellen Modellen wird davon ausgegangen, dass
hierdurch eine geringere Bindungsaffinität der Histone
an die DNA entsteht und es nachfolgend zu einer Relaxation, d. h.
besseren Zugänglichkeit der DNA, z. B. für Transkriptionsfaktoren,
kommt. Daraus resultiert eine epigenetische Modifikation der zellulären
Genexpression, die unter anderem die Hochregulation von bislang
reprimierten Genen bedingt.
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Es
ist bekannt, dass HDACi in humanen Zellen Signalkaskaden für
einen Proliferationsstopp und eine zelluläre Differenzierung
induzieren. HDACi werden deshalb als Anti-Tumormittel vorgeschlagen; vgl. Weidle
et al. (2000), "Inhibition of histone deacetylases: a new
strategy to target epigenetic modifications for anticancer treatment" Anticancer
Res, 20: 1471–1485.
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Die
Verwendung von HDACi zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden
Erkrankung ist im Stand der Technik bislang nicht bekannt.
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Dabei
ist es bevorzugt, wenn als HDACi Valproinsäure und/oder
ein Derivat hiervon eingesetzt werden.
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Diese
Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solcher HDACi eingesetzt
wird, dessen positiven Wirkungen auf eine demyelinisierende Erkrankung
von den Erfindern an einem etablierten Modellsystem erfolgreich
getestet wurden.
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Valproinsäure,
die auch als 2-Propylenpentansäure bezeichnet wird, handelt
es sich um eine kurzkettige verzweigte Fettsäure mit der
CAS-Nr. 99-66-1, die unter den Handelsnamen Valproat, Convulex,
Ergenyl und anderen vertrieben wird.
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Unter
Derivaten von Valproinsäure werden abgeleitete Stoffe ähnlicher
chemischer Struktur verstanden, die sich von der Valproinsäure
beispielsweise durch den Austausch einzelner Atome gegen andere
Atome oder einer funktionellen Gruppe gegen eine andere funktionelle
Gruppe unterscheiden, ohne dass dadurch die erfindungsgemäß aufgefundene Wirksamkeit
des Derivats gegenüber der Valproinsäure wesentlich
beeinträchtigt wird. Als Derivate der Valproinsäure
werden deshalb vorzugsweise solche Abkömmlinge bezeichnet,
deren Wirksamkeit in der Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden
Erkrankung bezogen auf die Valproinsäure noch 50%, vorzugsweise
60%, weiter bevorzugt 70%, weiter bevorzugt 80%, weiter bevorzugt
90%, weiter bevorzugt 95%, weiter bevorzugt 99% und höchst
bevorzugt über 100% beträgt.
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Die
Erkenntnisse der Erfinder überraschend. Der Valproinsäure
werden bislang im Stand der Technik andere Eigenschaften zugeschrieben.
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Bei
der Valproinsäure handelt es sich um ein etabliertes Arzneimittel
zur Behandlung von epileptischen Anfälle und bipolaren
Störungen. Experimentelle und klinische Daten haben ferner
ergeben, dass es sich bei der Valproinsäure um ein potentes
Antitumormittel handelt; vgl. Blaheta et al. (2005), "Evolving anticancer
drug valproic acid: insights into the mechanism and clinical studies." Med
Res Rev 25, S. 383–397.
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Ferner
wurde für Valproinsäure eine neuroprotektive und
eine axonale Remodellierungseigenschaft beschrieben; vgl. Gurvich
et al. (2002), "Lithium and valproic acid: parallels and
contrasts in diverse signaling contexts" Pharmacol Ther
96, S. 45–66.
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Außerdem
wurde vor kurzem in einem Modell der experimentellen Ischämie
gezeigt, dass Valproinsäure das Hirninfarktvolumen reduziert,
die Aktivität der Mikroglia unterdrückt, die Anzahl
von Mikroglia reduziert und andere inflammatorische Marker in dem
ischämischen Gehirn inhibiert; vgl. Kim et al.
(2007), "Histone deacetylase inhibitors exhibit anti-inflammatory
and neuroprotective effects in a rat permanent ischemic model of
stroke: multiple mechanisms of action." J Pharmacol Exp
Ther 321, S. 892–901.
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Außerdem
wurde beschrieben, dass Valproinsäure die Sekretion von
TNF-α und IFN-γ von reaktiven Helfer T-Zellen
und Monozyten abmildert; vgl. Chen et al. (2007), "Valproic
acid and other histone deacetylase inhibitors induce microglial
apoptosis and attenuate lipopolysaccharide-induced dopaminergic
neurotoxicity." Neuroscience 149, pp. 203–212; und Peng
et al. (2005), "Valproate pretreatment protects dopaminergic
neurons from LPS-induced neurotoxicity in rat primary midbrain cultures:
role fo microglia" Brain Res Mol Brain Res 134, S. 162–169.
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Ferner
wurde beschrieben, dass oral verabreichte Valproinsäure
bei künstlich induzierter Colitis die Schwere der Erkrankung
reduziert, was mit einer Unterdrückung von proinflammatorischen
Zytokinen wie IFN-γ und IL-6 einhergeht; vgl. Glauben
et al. (2006), "Histone hyperacetylation is associated
with amekioration of experimental colitis in mice." J Immunol
176, S. 5015–5022.
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Außerdem
wird Valproinsäure als antikonvulsives Agens beschrieben.
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Die
Verwendung von Valproinsäure zur Prophylaxe und/oder Behandlung
einer demyelinisierenden Erkrankung ist im Stand der Technik bislang
nicht bekannt.
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Die
Erfinder haben ihre Erkenntnisse über die positiven Wirkungen
der Valproinsäure auf eine demyelinisierende Erkrankung
am Modellsystem der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN) gewonnen.
Bei der EAN handelt es sich um eine T-Zell vermittelte inflammatorische
demyelinisierenden Erkrankung des peripheren Nervensystems, die
viele klinische, elektrophysiologische und immunologische Phänomene
einer autoimmunen Neuropathie des Menschen, insbesondere des Guillain-Barré-Syndroms
bzw. des Subtyps der AIDP widerspiegelt. Deshalb handelt es sich
bei EAN um ein in Fachkreisen akzeptiertes Modell, um Mechanismen
der Pathologie und Therapie von demyelinisierenden Erkrankungen,
insbesondere der AIDP, zu untersuchen. Die anhand der EAN gewonnenen
Erkenntnisse lassen sich deshalb auf demyelinisierende Erkrankungen
im Allgemeinen, insbesondere aber auf die AIDP übertragen.
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Konkret
konnten die Erfinder feststellen, dass sich der Krankheitsverlauf
von EAN sowohl bei einer therapeutischen als auch einer prophylaktischen
Behandlung mit Valproinsäure deutlich verbesserte. Die
Verabreichung von Valproinsäure führte zu einer
reduzierten Demyelinisierung und einer verminderten Infiltration
von inflammatorischen Zellen in die betroffenen Nerven. Ferner wurde
die Aktivierung von Mikroglia im Rückenmark, wobei es sich
um ein typisches Phänomen von demyelinisierenden Erkrankungen
handelt, deutlich inhibiert. Die Erfinder konnten auch feststellen,
dass die Verabreichung von Valproinsäure zu einer Reduktion
der Expression von Zytokinen in den Lymphknoten führt.
Ferner konnten die Erfinder feststellen, dass die Verabreichung
von Valproinsäure zu einer Abnahme der Expression von IL-17,
einem Schlüsselfaktor bei Autoimmunerkrankungen, führt.
Schließlich wurde festgestellt, dass der Forkhead-Box-Transkriptionsfaktor 3
(Foxp3), der eine wichtige Rolle bei der Homöostase des
Immunsystems spielt, durch die Verabreichung von Valproinsäure
verstärkt exprimiert wird.
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Diese
von den Erfindern Erkenntnisse prädestinieren die Valproinsäure
als Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden
Erkrankung.
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Nach
einer bevorzugten Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße
Arzneimittel zur Minderung von Neuropathieschmerzen vorgesehen.
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Diese
Maßnahme hat den Vorteil, dass ein sehr häufig
bei demyelinisierenden Erkrankungen auftretendes Symptom gezielt
behandelt wird. Die Eignung des HDACi bzw. der Valproinsäure
zur Hemmung des Neuropathieschmerzes konnten die Erfinder aus Experimenten
an Mikrogliazellen ableiten.
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Dabei
ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel den HDACi, vorzugsweise
Valproinsäure, in einer Menge enthält, dass nach
Verabreichung in ein zu behandelndes Lebewesen in Letzterem Konzentrationen
von ca. 0,05 bis ca. 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise
30 bis 60 mg/kg Körpergewicht, weiter bevorzugt ca. 45
mg/kg Körpergewicht bereitgestellt werden.
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Diese
Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel bereits
solche Mengen an Wirkstoff enthält, die in dem Lebewesen
für eine ausreichende Konzentration sorgen, um die erfindungsgemäßen Wirkungen
zu erzielen. Die sich derzeit auf dem Markt befindlichen Arzneimittel
enthalten beispielsweise 150, 300 und 600 mg Valproinsäure
pro Darreichungsform, d. h. pro Tablette oder Injektionsdosis. Diese
derzeit erhältlichen Präparate können
somit ohne weiteres erfindungsgemäß verwendet
werden. Bei dem Lebewesen handelt es sich um ein Säugetier,
vorzugsweise um einen Menschen.
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Weiter
ist es bevorzugt, wenn das erfindungsgemäße Arzneimittel
den HDACi, vorzugsweise Valproinsäure, als einzigen bzw.
alleinigen Wirkstoff enthält.
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So
konnten die Erfinder überraschenderweise feststellen, dass
die erkannte Wirkung auf demyelinisierende Erkrankungen bereits
eintritt, wenn das Arzneimittel einen HDACi, vorzugsweise Valproinsäure,
als einzigen Wirkstoff enthält und somit eine Monotherapie
erfolgen kann. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine
einfache und kostengünstige Herstellung des erfindungsgemäßen
Arzneimittels möglich ist, da lediglich ein Wirkstoff formuliert
werden muss.
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Alternativ
kann das erfindungsgemäße Arzneimittel neben dem
HDACi einen weiteren Nicht-HDACi-Wirkstoff gegen eine demyelinisierende Erkrankung
enthalten.
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Diese
Maßnahme hat den Vorteil, dass in die Pathologie der Erkrankung
an einer weiteren Stelle eingegriffen wird und somit die therapeutische
Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittels
gegebenenfalls noch mal erhöht werden kann.
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Auch
können sich ergebende synergetische Effekte mit dem weiteren
Wirkstoff ausgenutzt werden. Als weitere Wirkstoffe kommen beispielsweise Immunglobuline,
Kortikoide sowie S1P-Rezeptorantagonisten, bspw. FTY720, in Frage.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung
einer demyelinisierenden Erkrankung, das folgende Schritte aufweist:
(1) Bereitstellung eines HDACi, vorzugsweise von Valproinsäure,
und (2) Formulierung des HDACi, vorzugsweise der Valproinsäure,
in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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Pharmazeutisch
akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben.
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Für
das vorstehend genannte Herstellungsverfahren gelten die Eigenschaften
und Vorteile der erfindungsgemäßen Verwendung
entsprechend.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prophylaxe
und/oder Behandlung einer demyelinisierenden Erkrankung bei einem Lebewesen,
das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung eines HDACi,
vorzugsweise von Valproinsäure, (2) Verabreichung des HDACi,
vorzugsweise der Valproinsäure, in das Lebewesen, und (3)
gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (1) und (2).
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Bei
dem Lebewesen handelt es sich um ein Säugetier, vorzugsweise
um einen Menschen.
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Für
das vorstehend genannte Prophylaxe- und Behandlungsverfahren gelten
die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen
Verwendung beschriebenen Vorteile und Eigenschaften entsprechend.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel
zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden Erkrankung,
das einen HDACi, vorzugsweise Valproinsäure, in einer therapeutisch
wirksamen Menge sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger
aufweist.
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Die
therapeutisch wirksame Menge des HDACi bzw. von Valproinsäure
lässt sich mittels dem Fachmann bekannter Verfahren, beispielsweise über Titrationsexperimente,
in denen verschiedenen Konzentrationen eingesetzt werden, ohne weiteres
ermitteln. Die wirksame Menge kann individuell festgelegt werden.
So hängt diese beispielsweise von der konkret zu therapierenden
demyelinisierenden Erkrankung, dem Krankheitsverlauf, dem Schweregrad
der Erkrankung, dem zu behandelnden Patienten, insbesondere dessen
immunologischem Zustand, Geschlecht, Alter, weiterer Erkrankungen,
etc. ab.
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Die
im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung
beschriebenen Eigenschaften und Vorteile gelten für das
erfindungsgemäße Arzneimittel entsprechend.
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Es
versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend
noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils
angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder
in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden
Erfindung zu verlassen.
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Die
Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen weiter
erläutert, die rein illustrativ sind und die Reichweite
der Erfindung nicht einschränken. Dabei wird auf die beigefügten
Figuren Bezug genommen. Diese zeigen Folgendes:
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1 Die
suppressive und therapeutische Behandlung mit Valproinsäure
schwächt die neurologische Schwere und den Verlust von
Körpergewicht in EAN-Ratten ab. EAN-Ratten (n = 6) wurden
intraperitoneal einmal täglich mit Valproinsäure
(300 mg/kg Körpergewicht in 1 ml PBS) oder PBS (1 ml) injiziert.
Für eine suppressive/prophylaktische Behandlung wurde Valproinsäure
vom Tag 0 bis zum Tag 20 verabreicht. Für eine therapeutische
Be handlung wurde Valproinsäure vom Tag 10 bis zum Tag 21 verabreicht.
Die klinischen Werte und das Körpergewicht wurden jeden
zweiten Tag nach der Immunisierung bestimmt. (A): Die suppressive
Verabreichung von Valproinsäure verzögert signifikant
den Beginn von EAN, reduziert die neurologische Schwere und verkürzte
die Dauer von EAN im Vergleich zu Kontroll-EAN. (B): Die suppressive/prophylaktische
Behandlung mit Valproinsäure reduziert ebenfalls signifikant
den EAN-induzierten Gewichtsverlust. (C): Die therapeutische Behandlung
mit Valproinsäure reduziert die neurologische Schwere von
EAN und verkürzt die Dauer von EAN. (D): Die therapeutische
Behandlung mit Valproinsäure reduziert die neurologische
Schwere von EAN und verkürzt die Dauer von EAN. (E): Die
therapeutische Verabreichung von Valproinsäure verbesserte
nicht den EAN-induzierten Gewichtsverlust.
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2 Die
suppressive und therapeutische Behandlung mit Valproinsäure
inhibiert die histopathologischen Veränderungen in den
Ischiasnerven von EAN-Ratten. In EAN-Ratten (n = 4) wurde einmal täglich
Valproinsäure (300 mg/kg Körpergewicht) oder PBS
injiziert. Für eine suppressive/prophylaktische Behandlung
wurde Valproinsäure vom Tag 0 bis zum Tag 15 verabreicht.
Für eine therapeutische Behandlung wurde Valproinsäure
vom Tag 10 bis zum Tag 15 verabreicht. Die Ratten wurden am Tag
16 getötet, die Ischiasnerven entnommen, mit Luxol Fast Blue
(LFB) gefärbt und mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Gezeigt werden repräsentative Mikroaufnahmen für
die Vehikelkontrolle (A), suppressive/prophylaktische Valproinsäure-behandelte
(B) oder therapeutische Valproinsäure-behandelte (C) EAN-Ratten.
Die Maßstabsbalken in (A) und (B) entsprechen 50 μm.
(D): Die mittleren histologischen Werte wurden berechnet, wie im
Material-und-Methoden-Teil beschrieben. Eine suppressive/prophylaktische
und therapeutische Valproinsäure-Behandlung reduziert die
mittleren histologischen Werte im Vergleich zu den Kontroll-EAN-Ratten
signifikant. **:p < 0,01, VPA-S:
Suppressive/prophylaktische Valproinsäure-Behandlung, VPA-T:
Therapeutische Valproinsäure-Behandlung.
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3 Die
suppressive und therapeutische Valproinsäure-Behandlung
inhibiert die T-Zell-, B-Zell-, und Makrophagen-Infiltration in
die Ischiasnerven von EAN-Ratten. In EAN-Ratten (n = 4) wurde einmal
täglich Valproinsäure (300 mg/kg) oder PBS intraperitoneal
injiziert. Für eine suppressive Behandlung wurde Valproinsäure
vom Tag 0 bis zum Tag 15 verabreicht. Für eine therapeutische
Behandlung wurde Valproinsäure vom Tag 10 bis zum Tag 15 verabreicht.
Die Ratten wurden am Tag 16 getötet und die Ischiasnerven
wurden für eine immunhistochemische Färbung entnommen.
Eine CD3-Immunfärbung (A, D und G) wurde durchgeführt,
um T-Zellen zu detektieren, eine ED-1-Immunfärbung (B,
E und H) erfolgte zur Detektion von reaktiven Makrophagen und eine
OX22-Immunfärbung (C, F und I) erfolgte zur Detektion von
B-Zellen. Gezeigt werden repräsentative Mikroaufnahmen
für die Kontrolle (A–C), suppressive/prophylaktische
Valproinsäure-(D–F) oder therapeutische Valproinsäure-behandelte
(G–I) EAN-Ratten. Der Maßstabsbalken entspricht
50 μm. (J–L): Ferner wurde die Infiltration von T-Zellen,
Makrophagen und B-Zellen in Ischiasnerven semiquantifiziert, wie
im Material-und Methoden-Teil angegeben. Der ungepaarte T-Test wurde durchgeführt,
um Unterschiede zwischen Valproinsäure-behandelten und
Kontroll-EAN-Ratten zu vergleichen. Die suppressive und therapeutische
Behandlung von Valproinsäure reduziert in EAN-Ratten signifikant
die Infiltration von T-Zellen, Makrophagen und B-Zellen in Ischiasnerven.
*:p < 0,05 und
**:p < 0,01 im
Vergleich zur jeweiligen Vehikelkontrolle, VPA-S: Suppressive/prophylaktische
Valproinsäure-Behandlung, VPA-T: Therapeutische Valproinsäure-Behandlung.
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4 Die
suppressive und therapeutische Valproinsäure-Behandlung
schwächt die Aktivierung von Mikroglia im Lendenrückenmark
von EAN-Ratten ab. In EAN-Ratten (n = 4) wurde einmal täglich
Valproinsäure (300 mg/kg Körpergewicht) oder PBS
injiziert. Für eine suppressive Behandlung wurde Valproinsäure
vom Tag 0 bis zum Tag 15 verabreicht. Für eine therapeutische
Behandlung wurde Valproinsäure vom Tag 10 bis zum Tag 15
verabreicht. Die Ratten wurden am Tag 16 getötet und das
Lendenrückenmark wurde für die immunhistochemische
Färbung entnommen. Die ED-1-Immunfärbung wurde
für die Detektion von reaktiven Mikroglia verwendet. Gezeigt
werden repräsentative Mikroaufnahmen des dorsalen Horns
eines Lendenwirbels für die Kontrolle (A–B), suppressive/prophylaktische
Valproinsäure-(C–D) oder therapeutische Valproinsäure-behandelte
(E–F) EAN-Ratten. Die Maßstabsbalken in (A), (C)
und (E) entsprechen 50 μm in für (B), (D) und
(F) 25 μm. VPA-S: Suppressive/prophylaktische VPA-Behandlung,
VPA-T: Therapeutische VPA-Behandlung.
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5 Valproinsäure
unterdrückt die Expression der mRNA von IL-1β,
IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-6 und IL-17 in den Lymphknoten
von EAN-Ratten, nicht aber von TGF-β. Valproinsäure
(300 mg/kg Körpergewicht) oder PBS wurde EAN-Ratten (n
= 3) einmal täglich von Tag 0 bis Tag 15 verabreicht. Die
Ratten wurden am Tag 16 getötet. Die mRNA aus den Lymphknoten
aus beiden Gruppen wurde isoliert und die relativen Expressionsspiegel
von IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL4, IL-6, IL-17
und TGF β wurden mittels RT-PCR analysiert. (A): Aufnahmen
der Gelelektrophorese mit den PCR-Produkten zeigen deutlich reduzierte
mRNA-Spiegel von IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-4,
IL-6 und IL-17, nicht aber von TGF-β nach einer Behandlung
mit Valproinsäure. (B): Das Balkendiagramm zeigt die semi-qualifizierten
Ergebnisse der Signalintensitäten relativ zum Haushaltsgen
GAPDH. Der ungepaarte T-Test wurde durchgeführt, um die Unterschiede
zu vergleichen. *:p < 0,05
und **:p < 0,01
im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle.
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6 Valproinsäure
induziert Foxp3+-Zellen im peripheren Blut
und in Ischiasnerven von EAN-Ratten, reduziert jedoch die IL-17+-Zellen. Valproinsäure (300 mg/kg
Körpergewicht) oder PBS wurde einmal täglich vom
Tag 0 bis zum Tag 15 in EAN-Ratten (n = 3) verabreicht. Die Ratten
wurden am Tag 16 getötet. Das Blut wurde intrakardial unter Anästhesie
entnommen und mittels FACS auf Foxp3+-Zellen
und IL-17+-Zellen analysiert, wie im Material-
und Methodenteil beschrieben. Die Ischiasnerven wurden entnommen
und die Akkumulation von Foxp3+-Zellen und
IL-17+-Zellen wurde durch Immunhistochemie
detektiert. Repräsentative FACS-Profile und Mikroaufnahmen
zeigen, dass die Behandlung mit Valproinsäure im peripheren
Blut und Ischiasnerven von EAN-Ratten zu einer Abnahme von Foxp3+-Zellen (A–D) jedoch zu einer Zunahme von
IL-17+-Zellen (E–H) führt.
Die Maßstabsbalken entsprechen 50 μm.
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Ausführungsbeispiele
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1. Material und Methoden
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1.1 Tiere
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Männliche
Lewis-Ratten im Alter von 8–10 Wochen, einem Gewicht von
170–200 g (Charles River, Sulzfeld, Deutschland), wurden
bei einem Zyklus mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit
bei freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Sämtliche
Behandlungen der Tiere erfolgten gemäß einem Protokoll,
das von den lokalen Behörden genehmigt wurde. Es wurden
alle denkbaren Bemühungen unternommen, um die Anzahl der
Tiere und deren Leid zu minimieren.
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1.2 Induktion von EAN und Behandlung mit
Valproinsäure
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EAN
wurde induziert, wie beschrieben; vgl. Zhang et al. (2008), "FTY720
ameliorates experimental autoimmune neuritis by inhibition of lymphocyte and
monocyte infiltration into peripheral nerves." Exp Neurol
210, S. 6810–690. Kurz zusammengefasst, die Ratten
wurden durch subkutane Injektion in beide hinteren Fußballen
mit 100 μl eines Inokulums immunisiert, das 100 μg
des synthetischen neuritogenen P2-Peptides mit den Aminosäuren
57–81 des peripheren Myelins (GeneScript Corporation, Scotch Plains,
NJ, Vereinigte Staaten von Amerika) enthielt. Das Peptid wurde in
Phos phat-gepufferter Saline (PBS) (2 mg/ml) gelöst und
dann mit einem gleichen Volumen von komplettem Freund'schem Adjuvans (CFA),
das 2 mg/mL Mycobakterium tuberculosis enthielt, emulgiert, um eine
Endkonzentration von 1 mg/ml) zu erhalten.
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Die
klinischen Werte von EAN wurden jeden Tag wie folgt evaluiert: 0
= normal, 1 = reduzierter Tonus des Schwanzes, 2 = schwacher Schwanz,
beeinträchtigtes Aufrichten, 3 = ausbleibendes Aufrichten, 4
= Gangataxie, 5 = leichte Parese der hinteren Extremitäten,
6 = moderate Paraparese, 7 = schwere Paraparese oder Paraplegie
der hinteren Extremitäten, 8 = Tetraparese, 9 = moribund,
10 = Tod.
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Für
die suppressive/prophylaktische Behandlung wurde Valproinsäure
(Cayman Chemical, Michigan, Vereinigte Staaten von Amerika) intraperitoneal
einmal täglich vom Tag 0 bis zum Tag 20 (6 Ratten pro Gruppe)
injiziert. Für die therapeutische Behandlung wurden 6 EAN-Ratten
tägliche Injektionen von Valproinsäure vom Tag
10 bis zum Tag 21 (6 Ratten pro Gruppe) verabreicht. Während
den beiden Behandlungen wurden 300 mg/kg Körpergewicht Valproinsäure
in 1 ml PBS verabreicht und das gleiche Volumen von PBS wurde der
Kontrollgruppe verabreicht.
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1.3 Immunhistochemie
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Um
die inflammatorische Zellinfiltration und pathologischen Veränderungen
in dem peripheren Nervensystem und im Rückenmark zu evaluieren, wurden
vier Valproinsäure-behandelte und Kontroll-EAN-Ratten am
Tag 16 der suppressiven oder therapeutischen Behandlung getötet.
Die Ratten wurden mit Ether tiefenanästhesiert und intrakardial
mit 4°C kaltem 4%-igem Paraformaldehyd in PBS perfundiert.
Die linken und rechten Ischiasnerven und Lendenrückenmark
wurden rasch entnommen und in 4% Paraformaldehyd über Nacht
bei 4°C post-fixiert. Die Ischiasnerven wurden in zwei
gleichlange Segmente geschnitten, in Parafin eingebettet, seriell
geschnitten (3 μm) und auf Silan-beschichtete Objektträger
gegeben.
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Nach
dem Wachsentfernen wurden die Querschnitte in einem 500 W Mikrowellengerät
für 15 Minuten in Citratpuffer (2,1 g Natriumcitrat pro
Liter, pH 6) gekocht. Die endogene Peroxidase wurde mit 1% H2O2 in Methanol für
15 Minuten inhibiert. Die Schnitte wurden mit 10%-igem normalem
Schweineserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) inkubiert, um die
nicht-spezifische Bindung von Immunglobulinen zu blockieren, und
anschließend mit den folgenden monoklonalen Antikörpern
inkubiert: CD3 (1:50, Serotec, Oxford, Vereinigtes Königreich)
für T-Lymphozyten, OX22 (1:200; Serotec, Oxford, Vereinigtes
Königreich) für B-Zellen, ED1 für aktivierte
Makrophagen oder Mikroglia (1:100; Serotec, Oxford, Vereinigtes
Königreich), IL-17 (1:100; Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland)
oder Foxp3 (1:250; eBioscience, Frankfurt, Deutschland). Die Antikörperbindung
an die Gewebeschnitte wurde mit einem biotinyliertem IgG F(ab)2-Sekundärantikörperfragment
(DAKO, Hamburg, Deutschland) visualisiert. Anschließend wurden
die Schnitte mit einem Streptavidin-Avidin-Biotin-Komplex (DAKO,
Hamburg, Deutschland) inkubiert, gefolgt von der Entwicklung mit
Diaminobenzidinsubstrat (DAB), (Fluka, Neu-Ulm, Deutschland). Schließlich
wurden die Schnitte mit Maier's Hemalum gegengefärbt.
-
Um
die Daten der Immunfärbung zu evaluieren, wurden die prozentualen
Anteile der Bereiche von Immunreaktivität (IR) zu Bereichen
der Ischiasnervquerschnitte kalkuliert. Zusammengefasst, Aufnahmen
der Ischiasnervquerschnitte wurden unter einer 50-fachen Vergrößerung
unter Verwendung eines Nikon-Coolscope (Nikon, Düsseldorf,
Deutschland) mit festgelegten Parametern erfasst. Die Aufnahmen
wurden unter Verwendung von Image-Pro Plus (IPP; Media Cybernetics,
MD, Vereinigte Staaten von Amerika) analysiert. Bereiche von IR
wurden durch Schwellenwertsegmentierung ausgewählt und sämtliche
Parameter wurden für alle Aufnahmen festgelegt. Die Bereiche
der Ischiasnervquerschnitte wurden manuell aus gewählt.
Für jede EAN-Ratte wurden vier Querschnitte vom Stamm und
den mittleren Bereichen beider Seiten analysiert. Die Ergebnisse
werden als arithmetische Mittel der prozentualen Anteile der IR-Bereiche
zu Bereichen der Ischiasnervquerschnitte nebst Standardabweichung
vom Mittelwert (SEM) angegeben.
-
Myelin
wurde durch Standardfärbung mit Luxol Fast Blue (LFB) sichtbar
gemacht. Histologische Veränderungen zwischen Valproinsäure
behandelten und Kontroll-EAN-Ratten wurden durch eine etablierte
semiquantitative Methode verglichen. Zusammengefasst, vier Querschnitte
vom Stamm und vom mittleren Bereich beider Seiten der EAN-Ratten
wurden analysiert. Sämtliche perivaskulären Bereiche,
die in den Querschnitten vorhanden waren, wurden durch zwei Beobachter
evaluiert, denen die Behandlung nicht bekannt war, und das Ausmaß der
pathologischen Veränderung wurde semiquantitativ nach der folgenden
Skala graduiert: 0 = normaler perivaskulärer Bereich; 1
= leichtes zelluläres Infiltrat angrenzend an das Gefäß;
2 = zelluläre Infiltration plus Demyelinisierung in unmittelbarer
Nähe zu dem Gefäß; 3 = zelluläre
Infiltration und Demyelinisierung über den gesamten Schnitt.
Die Ergebnisse werden als mittlerer histologischer Wert angegeben;
vgl. Hartung et al. (1988), "The role of macrophages
and eicosanoids in the pathogenesis of experimental allergic neuritis.
Serial clinical, electrophysiological, biochemical and morphological
observations." Brain 111 (Pt 5), S. 1039–1059.
-
1.4 Durchfluss cytometrische Analyse von
IL-17+-Zellen und Foxp3+-Zellen
im Blut
-
Für
die intrazelluläre Detektion von IL-17 wurde anästhetisierten
Ratten Blut intrakardial entnommen. 100 μl Blut wurde fixiert
und mit Erythrolyse (Serotec, Oxford, Vereinigtes Königreich)
gemäß den Angaben des Herstellers lysiert und
mit 0,5% Saponin in Waschpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur
permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen mit Kaninchen-Anti-IL-17-Antikörper
(1:100, Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland) für eine Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit Waschpuffer
erfolgte die Detektion durch Inkubation mit einem FITC-markierten
Ziegen-zu-Kaninchen-IgG-F(ab)2-Fragment (1:100, Abcam Cambridge,
Vereinigtes Königreich), und zwar für eine Stunde
bei Raumtemperatur im Dunkeln.
-
Für
die Detektion der Foxp3-Expression erfolgte eine Fixierung und Permeabilisierung
von Blutzellen unter Verwendung des eBioscience Foxp3-Staining Buffer
Sets (eBioscience, Frankfurt, Deutschland). FITC-markierte Foxp3-Antikörper (eBioscience,
Frankfurt, Deutschland) wurden für die Färbung
gemäß dem Protokoll, das von eBioscience empfohlen
wurde, verwendet.
-
Für
sämtliche Färbungen wurde eine Isotypkontrolle
verwendet. Nach der Färbung der Zellen wurden diese in
PBS suspendiert und mit einer FACScan (Becton Dickinson, Überlingen,
Deutschland) analysiert. Die mononuklearen Zellen wurden durch Vorwärts-
und Seitwärts-Scatter gegated.
-
1.5 Semi-quantitative RT-PCT-Analyse der
Cytokinexpression in den Lymphknoten
-
Die
Ratten wurden intrakardial mit 4°C kühlem PBS
unter Anästhesie perfundiert, die Leistenlymphknoten wurden
rasch entfernt und in flüssigem Stickstoff bis zur RNA-Isolierung
gelagert. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Trizol LS Reagens
(Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) aus den Lymphknoten isoliert
und unter Verwendung des QuantiTect Reverse Transcription Kits (Qiagen,
Hilden, Deutschland) revers in cDNA transkribiert. cDNA-Äquivalente
von 20 ng der Gesamt-RNA wurden einer anschließenden semi-quantitativen
PCR-Analyse unterzogen, wobei Primer verwendet wurden, die spezifisch
sind für Interleukin-1β (IL-1β), Tumornekrosefaktor
Alpha (TNF-α), IL-6, IFN-γ, IL-4, IL-17, TGF-β oder
das Haushaltsgen Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH).
Die Primersequenzen waren Folgende: IL-1β [Sinn: TCG TGA
TGT ACC AGT TGG GG (SEQ ID Nr. 1); Gegensinn: CTC CAT GAG CTT TGT
ACA AG (SEQ ID Nr. 2)], TNF-α [Sinn: TGA TCG GTC CCA ACA
AGG A (SEQ ID Nr. 3)]; Gegensinn: TGC TTG GTG GTT TGC TAC GA (SEQ
ID Nr. 4)], IL-6 [Sinn: GCC CTT CAG GAA CAG CTA TG (SEQ ID Nr. 5);
Gegensinn, CAG AAT TGC CAT TGC ACA AC (SEQ ID Nr. 6)], IFN-γ [Sinn:
AAA GAC AAC CAG GCC ATC AG (SEQ ID Nr. 7); Gegensinn, CTT TTC CGC
TTC CTT AGG CT (SEQ ID Nr. 8)], IL-4 (Sinn: TGA TGG GTC TCA GCC
CCC ACC TTG C (SEQ ID Nr. 9); Gegensinn: CTT TCA GTG TTG TGA GCG
TGG ACT C (SEQ ID Nr. 10)], IL-17 [Sinn: TGG ACT CTG AGC CGC ATT
GA (SEQ ID Nr. 11); Gegensinn, GAC GCA TGG CGG ACA ATA GA (SEQ ID
Nr. 12)], TGF-β [Sinn: TGA ACC AAG GAG ACG GAA TAG AGG (SEQ
ID Nr. 13); Gegensinn, TAG TGT GTG TCC AGG CTC CAA ATG (SEQ ID Nr.
14)], und GAPDH (Sinn, AGG TCA CCC AGA GCT GAA CG (SEQ ID Nr. 15);
Gegensinn, CAC CCT GTT GCT GTA GCC GTA T (SEQ ID Nr. 16)]. In Vorexperimenten
wurden die optimalen Zyklusbedingungen etabliert, die eine Amplifizierung
jeder cDNA im linearen Bereich ermöglichten. Die PCR-Produkte
wurden auf 1,5%-igem Agarosegelen enthaltend 10 μg/ml Ethidiumbromid
separiert, unter Verwendung des UV-Solosystems (Whatman Biometra,
Goettingen, Deutschland) fotografiert und die densitometrische Analyse erfolgte
mit der Software BioDocAnalyze (Whatman Biometra, Goettingen, Deutschland).
Die Ergebnisse wurden kalkuliert als Anteil der Ziel-mRNAs relativ
zu jenem des Haushaltsgenes GAPDH (drei Proben von jeder Gruppe
wurden mit der PCR analysiert).
-
1.6 Evaluierung und Statistische Analyse
-
Der
ungepaarte T-Test wurde durchgeführt, um Unterschiede zwischen
Valproinsäure und Kontroll-EAN-Ratten zu vergleichen (Graph
Pad Prism 4,0 für Windows). Für sämtliche
statistischen Analysen wurden die Signifikantniveaus auf p < 0,05 gesetzt.
-
2. Ergebnisse
-
2.1 Eine suppressive/prophylaktische und
therapeutische Behandlung mit Valproinsäure schwächt
den Verlauf einer EAN ab
-
EAN
wurde durch subkutane Injektion des neuritogenen synthetischen P2-Peptides
induziert. Für eine suppressive/prophylaktische Behandlung wurden
Valproinsäure oder PBS (Kontrollgruppe) unmittelbar nach
der Immunisierung und anschließend einmal täglich
bis zum Tag 20 injiziert. Das erste neurologische Anzeichen der
Kontroll-EAN-Ratten, d. h. ein reduzierter Tonus des Schwanzes,
wurde am Tag 10 beobachtet (mittlerer klinischer Wert: 0,33 ± 0,17). Die
neurologische Schwere der EAN nahm in der Kontrollgruppe mit einem
Maximalwert am Tag 15 rasch zu (mittlerer neurologischer Wert: 6,67 ± 0,33). Anschließend
nahm die Schwere der EAN langsam ab und die Ratten waren am Tag
21 vollständig regeneriert (mittlerer klinischer Wert 0 ± 0).
In mit Valproinsäure behandelten EAN-Ratten wurden die
ersten neurologischen Anzeichen am Tag 14 (mittlerer klinischer
Wert: 0,2 ± 0,2) beobachtet, mit maximalen Werten am Tag
15 (mittlerer klinischer Wert: 0,6 ± 0,24), und eine vollständige
Erholung der Ratten wurde am Tag 18 beobachtet (mittlerer klinischer
Wert: 0 ± 0). Daraus ergibt sich, dass die suppressive/prophylaktische
Behandlung mit Valproinsäure den Beginn von EAN deutlich
verzögert, die neurologische Schwere verringert und die
Dauer der Erkrankung verkürzt; vgl. 1A.
-
Ein
weiteres Merkmal von EAN ist der zunehmende Gewichtsverlust; vgl. Zhu
et al. (1999) "Linomide suppresses experimental autoimmune
neuritis in Lewis rats by inhibiting myelin antigen-reactive T arid
B cell responses." Clin Exp Immunol 115, S. 56–63.
-
In
Kontroll- und Valproinsäure behandelten EAN-Ratten wurde
unmittelbar nach der Immunisierung (Tag 1) ein rascher Gewichtsverlust
beobachtet, dem eine leichte Gewichtszunahme folgte. Kontroll-EAN-Ratten
zeigten Gewichtsverlust während der Dauer der neurologischen
Erkrankung vom Tag 10 bis zum Tag 17 nach der Immunisierung, gefolgt von
einer leichten Gewichtszunahme (1B).
Hierzu im Gegensatz zeigte sich in EAN-Ratten, die mit Valproinsäure
behandelt wurden, während der Dauer der neurologischen
Erkrankung kein signifikanter Gewichtsverlust, was einen deutlich
milderen Verlauf der Erkrankung signalisiert; vgl. 1B.
-
Für
die therapeutische Behandlung wurde mit dem Beginn des Auftretens
von neurologischen Anzeichen (Tag 10 bis Tag 21 nach der Immunisierung)
einmal täglich Valproinsäure oder PBS injiziert. Wie
in 1C gezeigt, reduziert die therapeutische Behandlung
mit Valproinsäure die Schwere der EAN vom Tag 14 bis zum
Tag 20 (p < 0,05
im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle) und ermöglicht eine
raschere Erholung der Ratten (Tag 10 bis Tag 19 für mit
Valproinsäure behandelte EAN-Ratten und Tag 10 bis Tag 21
für Kontroll-EAN-Ratten). Allerdings schwächt
die therapeutische Valproinsäure-Behandlung den Verlust
des Körpergewichts in EAN-Ratten im Vergleich zur Kontrolle
nicht ab; vgl. 1B.
-
2.2 Eine suppressive/prophylaktische und
therapeutische Behandlung mit Valproinsäure reduziert die EAN-bedingte
Demyelinisierung und inflammatorische Zellinfiltration in den Ischiasnerven
-
EAN-Ratten
wurden, wie beschrieben, suppressiv/prophylaktisch und therapeutisch
mit Valproinsäure oder PBS behandelt und am Tag 16 getötet, um
die Ischiasnerven für eine histologische Analyse zu entnehmen
(n = 4). Eine LFB-Färbung wurde durchgeführt,
um Myelin und die Zellinfiltration darzustellen. Wie in 2A gezeigt, wird eine deutliche perivaskuläre
Demyelinisierung und Infiltration von inflammatorischen Zellen bei
Ischiasnerven von PBS behandelten EAN-Ratten beobachtet. Im Vergleich zur
PBS-Kontrolle führt eine suppressive/prophylaktische Valproinsäure-Behandlung
zu einer signifikanten Abnahme der perivaskulären Demyelinisierung und
Infiltration von inflammatorischen Zellen; vgl. 2B.
Eine therapeutische Behandlung mit Valproinsäure reduziert
deutlich die perivaskuläre Demyelinisierung und verursacht
nur eine leichte Zellakkumulierung in den Ischiasnerven von EAN-Ratten;
vgl. 2C. Die histologischen Veränderungen
zwischen den mit Valproinsäure behandelten und mit PBS
behandelten EAN-Ratten wurden ferner mittels einer etablierten semiquantitativen
Methode verglichen. In den Ischiasnerven waren die mittleren histologischen Werte
deutlich niedriger in den suppressiv/prophylaktisch (0,2 ± 0,04)
oder therapeutisch (0,76 ± 0,06) mit Valproinsäure
behandelten EAN-Ratten als in den Kontroll-EAN-Ratten (1,5 ± 0,05),
vgl. 2D.
-
Die
Abschwächung der Infiltration der verschiedenen Typen von
inflammatorischen Zellen in Ischiasnerven von EAN-Ratten am 16.
Tag nach der suppressiven/prophylaktischen und therapeutischen Valproinsäure-Behandlung
wurde außerdem mittels Immunhistochemie charakterisiert.
In PBS-Kontroll-EAN-Ratten wurde die Infiltration von T-Zellen (CD3+), B-Zellen (OX22+)
und Makrophagen (ED-1+) beobachtet und die
dominantesten Zellen waren Makrophagen; vgl. 3A–C.
Sowohl die suppressive/prophylaktische als auch therapeutische Behandlung
mit Valproinsäure reduziert signifikant die Infiltration
von T-Zellen (p < 0,05),
B-Zellen (p < 0,01)
und Makrophagen (p < 0,01)
in die Ischiasnerven von EAN-Ratten im Vergleich zu der PBS-Kontrolle;
vgl. 3.
-
2.3 Die suppressive/prophylaktische und
therapeutische Valproinsäure-Behandlung inhibiert die Aktivierung
von Spinal-Mikroglia in EAN
-
Die
auffälligsten pathologischen Befunde der EAN liegen in
einer Aktivierung des peripheren Nervensystems und der Proliferation
von Mikroglia im Rückenmark und es ist bekannt, dass diese
mit einer mechanischen Allodynie einhergehen. Reaktive Mikroglia
wurden durch ED-1 Immunfärbung detektiert, welches CD68
erkennt, ein lysosomales Membranprotein. Lendenrückenmark
aus Ratten des 16. Tages nach der suppressiven/prophylaktischen
und therapeutischen Behandlung mit Valproinsäure wurden
entnommen und immunhistochemisch untersucht. In PBS-behandelten
Ratten des 16. Tages wurden ED-1+-Zellen
detektiert, und zwar hauptsächlich in der grauen Substanz,
insbesondere in den oberflächlichen Ebenen des dorsalen
Horns; vgl. 4A. Nach einer suppressiven/prophylaktischen und/oder
therapeutischen Behandlung mit Valproinsäure wurden nur
selten spinale ED-1+-Zellen detektiert;
vgl. 4B und C.
-
2.4 Valproinsäure verändert
das Profil der Cytokinexpression in den Lymphknoten von EAN-Ratten
-
Die
Immunantworten werden durch Cytokine orchestriert, deren Zusammenspiel über
das Ergebnis von Immunantworten entscheidet; vgl.
W. E.
Paul und R. A. Seder (1994), "Lymphocyte responses and cytokines." Cell
76, S. 241–251. Um die Mechanismen zu verstehen,
die den Effekten von Valproinsäure in EAN zugrunde liegen,
wurde das Cytokinexpressionsprofil auf dem Niveau der mRNA in den Lymphknoten
untersucht. Die EAN-Ratten wurden suppressiv/prophylaktisch mit
Valproinsäure behandelt und in den Lymphknoten wurde am
Tag 17 die Expression von Th1, wie beispielsweise IL-1β,
INF-γ und TNF-α, Th2, wie beispielsweise IL-4
und IL6, Th17, wie beispielsweise IL-17, und T-regulatorischen Cytokinen,
wie beispielsweise TGF-β detektiert.
-
Wie
in 5 gezeigt, reduziert eine suppressive/prohylaktische
Behandlung mit Valproinsäure signifikant die mRNA-Expression
von IL-1β, INF-γ, TNF-α, IL-4, IL-17
und IL-6 (p < 0,05),
zeigt jedoch keine signifikanten Auswirkungen auf die Expression von
TGF-β in EAN im Vergleich zur PBS-Kontrolle.
-
2.5 Valproinsäure reduziert im
peripheren Blut und den Ischiasnerven von EAN-Ratten die IL-17+-Zellen und erhöht die Foxp3+-Zellen.
-
Es
ist bekannt, dass IL-17 eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl
von Autoimmunerkrankungen spielt, und dass T-regulatorische Zellen,
die den Forkhead-Box-Transkriptionsfaktor 3 (Foxp3) exprimieren,
wichtig für die Regulation der Homöostase des
Immunsystems sind. Deshalb wurden die Auswirkungen von Valproinsäure
auf IL-17+-Zellen und Foxp3+-Zellen
in EAN-Ratten analysiert, die bis zum Tag 16 suppressiv/prophylaktisch
mit Valproinsäure behandelt und anschließend getötet
wurden. Im peripheren Blut nimmt nach der Behandlung mit Valproinsäure
der prozentuale Anteil von Foxp3+-Zellen
zu (6A und B), der prozentuale Anteil
von IL-17+-Zellen jedoch ab (6E und F). Gleichzeitig reduziert eine
Behandlung mit Valproinsäure die Akkumulierung von IL-17+-Zellen in den Ischiasnerven (6G und H), erhöht jedoch die
Infiltration von Foxp3+-Zellen (6C und D).
-
3. Fazit
-
Wie
die Erfinder anhand der Experimentellen Autoimmunen Neuritis (EAN)
demonstrieren konnten, handelt es sich bei einem Histondeacetylase-Inhibitor
(HDACi), vorzugsweise Valproinsäure, um einen potenten
Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer demyelinisierenden
Erkrankung.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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