CN102526732A

CN102526732A - 靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途

Info

Publication number: CN102526732A
Application number: CN201110428818XA
Authority: CN
Inventors: 谢欣; 杜昌升; 吕婕
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。经研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸给药EAE小鼠后，EAE小鼠发病时间推迟，发病症状减轻，发病率降低，CNS炎症细胞浸润减少。本发明的优点在于首次发现了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸能够有效减轻EAE发病症状。本发明的有益效果在于目前能有效治疗MS且副作用小的药物非常少，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸是广谱的治疗癫痫药物，现作为临床实验药物用于治疗癌症，作为治疗MS疾病的药物具有很大的可能性。本发明给治疗MS疾病提供了新的作用靶点和药物来源。

Description

靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及一种靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

背景技术

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一种与神经系统相关的自身免疫性炎性疾病。它的特征是免疫调节的中枢神经系统的脱髓鞘和神经退行性病变。多发性硬化的发病机制包括：氧压力、兴奋性中毒、自身免疫和激素失调[Camelo，S.，et al.，Transcriptional therapy with thehistone deacetylase inhibitor trichostatin A ameliorates experimental autoimmuneencephalomyelitis.J Neuroimmunol，2005.164(1-2)：p.10-21.]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一种由T细胞调节的脱髓鞘疾病，其病理特征与MS相似，广泛用作于MS的动物模型。

免疫系统经常会受到大量外来抗原的攻击，通过具体的受体与这些抗原作用，免疫系统产生具体的响应如：免疫细胞激活、增殖和炎症基因的表达，这些响应都会相继产生炎症。在清除这些抗原以后，免疫系统又恢复到非激活状态，准备响应新的抗原攻击。免疫响应的强度和持续时间必须受到严格的调控，否则失控的炎症反应会导致严重的组织损伤。免疫平衡是免疫系统保持稳定免疫细胞数量和阻止在频繁的外来抗原的刺激下产生有害的炎症响应的固有性能[Sun，H.，et al.，TIPE2，a negative regulator of innate and adaptive immunity thatmaintains immune homeostasis.Cell，2008.133(3)：p.415-26.]。近年来的研究表明至少有两类分子是维持免疫平衡所必需的。第一类是限制免疫细胞激活和扩增的分子，如TGF-β或IL-10[Van Parijs，L.and A.K.Abbas，Homeostasis and self-tolerance in the immune system：turninglymphocytes off.Science，1998.280(5361)：p.243-8。Wahl，S.M.，J.Wen，and N.Moutsopoulos，TGF-beta：a mobile purveyor of immune privilege.Immunol Rev，2006.213：p.213-27.]。第二类是调控细胞死亡的分子，如Fas，Bim，Bax和caspases家族[Van Parijs，L.and A.K.Abbas，Homeostasis and self-tolerance in the immune system：turning lymphocytes off.Science，1998.280(5361)：p.243-8.Nagata，S.and T.Suda，Fas and Fas ligand：lpr and gld mutations.ImmunolToday，1995.16(1)：p.39-43].。

组蛋白去乙酰化酶是一组在细胞染色质水平、通过诱导组蛋白去乙酰化来调控包括染色质重组、转录活化或抑制、细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等一系列生物学效应的酶，特别是与细胞活化后的基因转录表达调控有关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类与组蛋白乙酰化功能相关的分子。组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)负责核心组蛋白乙酰化和去乙酰化的动态平衡以及在基本的细胞活动的调节如转录发挥了关键作用。目前已发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂按结构，可以分为以下几种类型：(1)短链脂肪酸：如丁酸盐及其衍生物苯基丁酸盐(比如Phenylbutyrate，PB)；(2)氧酸类：如曲古菌素A(TrichostatinA，TSA)、SAHA、SBHA、CBHA等；(3)环型四肽类：如FR901228，Oxamfltin等；(4)苯酸胺类。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂一直用作为精神病学和神经病学药物，如情绪稳定剂和抗癫痫药。丙戊酸是主要的抗癫痫药物之一，一直用于治疗双相情感障碍。与其他抗癫痫药物一样，丙戊酸可以抑制钠、钾、钙离子通道功能，也可以增强γ-aminobutyric的传递[Czuczwar，S.J.and P.N.Patsalos，The new generation of GABA enhancers.Potential in the treatment of epilepsy.CNS Drugs，2001.15(5)：p.339-50.Perucca，E.，Clinical pharmacology and therapeutic use of thenew antiepileptic drugs.Fundam Clin Pharmacol，2001.15(6)：p.405-17.]。除此以外，丙戊酸近年来也用于癌症[Marks，P.A.and M.Dokmanovic，Histone deacetylase inhibitors：discovery anddevelopment as anticancer agents.Expert Opin Investig Drugs，2005.14(12)：p.1497-511.]与炎症疾病[Adcock，I.M.，HDAC inhibitors as anti-inflammatory agents.Br J Pharmacol，2007.150(7)：p.829-31.]的治疗研究。此外，与其它组蛋白去乙酰化酶抑制剂相同，丙戊酸是能够改变许多基因的表达。这些相应基因表达的蛋白质在细胞活性发挥重要的作用并可能影响，如细胞周期调控，分化，DNA修复，与细胞凋亡的几个重要途径[Chen，Y.，et al.，Induction of hepaticdifferentiation of mouse bone marrow stromal stem cells by the histone deacetylase inhibitor VPA.JCell Mol Med，2009.13(8B)：p.2582-92.]。

大量研究表明，机体方面的因素遗传、内分泌、免疫系统调节功能紊乱等因素在自身免疫病发病中起重要作用。近年来还发现免疫球蛋白(Ig)同种型和独特型基因、T细胞受体(TCR)基因、细胞因子基因、细胞凋亡(apoptosis)基因等均与自身免疫病有不同程度的相关性。如在类风湿性关节炎和SLE患者中发现IgVH基因缺失。此外，免疫系统调节功能的紊乱如T细胞亚群比例失调或功能异常与自身免疫病的关系。应用CD系列单抗检测SLE和类风湿关节炎患者外周血CD8⁺T细胞的比例，在病情活动时明显降低，用ConA在体外刺激病人外周血淋巴细胞不能诱导出非特异的Ts细胞功能效应，这些变化在经治疗使病情缓解后得到恢复。但应用抗CD8⁺T细胞抗体处理实验性脑脊髓炎(EAE)的小鼠却发现有利于病情缓解和降低死亡率。也发现用抗CD4⁺T细胞抗体治疗类风湿关节炎显示良好的效果。这些发现都表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂在调节EAE发病中扮演着重要角色。

发明内容

针对现有技术中的不足，发明人致力于研究EAE发病的介质和机理，组蛋白乙酰化与去乙酰化的动态平衡在EAE发病中的作用，以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂能否作为自身免疫病的治疗靶点，并且完成了本发明。在本发明的研究中，发明人发现在EAE动物模型中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸能减少CNS的炎症细胞浸润，减轻EAE的临床症状。本发明的研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸在EAE发病中扮演了重要角色，主要通过诱导T细胞凋亡，从而维持免疫平衡。增加抗原免疫平衡打破，致敏性T细胞过度激活，从而增加炎性细胞因子的增加，引起EAE发病。炎症细胞的过度激活及对组织的浸润是许多自身免疫病(包括多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮、炎症性肠病等)的共同特征。

因此，本发明的目的是提供一种靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

所述的靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸。

所述的自身免疫性疾病包括多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮或炎症性肠病(inflammatory bowel disease)。

经研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸给药EAE小鼠后，EAE小鼠发病时间推迟，发病症状减轻，发病率降低，CNS炎症细胞浸润减少。近一步研究发现，组蛋白去乙酰化酶通过作用于细胞凋亡相关蛋白，从而影响T细胞凋亡过程，改变T细胞平衡而导致EAE的发病。而给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸后，可以恢复T细胞的动态平衡，减轻EAE病情。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以用于临床治疗多发性硬化等疾病，本发明不仅揭示了MS发病的部分机制，同时也为疾病的临床干预提供了新的治疗靶点。

本发明同现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明的优点在于首次发现了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸能够有效减轻EAE发病症状。本发明的有益效果在于目前能有效治疗MS且副作用小的药物非常少，而组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸是广谱的治疗癫痫药物，现作为临床实验药物用于治疗癌症，作为治疗MS疾病的药物具有很大的可能性。本发明给治疗MS疾病提供了新的作用靶点和药物来源。

附图说明

图1为丙戊酸改善EAE临床症状。

用MOG_35-55免疫雌性C57/B6小鼠。丙戊酸从免疫后第3天或第12天开始每天腹腔注射或灌胃注射一次并记录临床分数。对照组腹腔注射或灌胃注射水。A，腹腔注射100或300mg/kg丙戊酸，从第3天开始；B，灌胃注射100或300mg/kg丙戊酸，从第3天开始；C，灌胃注射300mg/kg丙戊酸，从第12天开始。数据表示为mean±SEM(n＝10)。^***p＜0.001，与对照组相比(two-way ANOVA)。取野生型或免疫后给生理盐水及丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)第17天小鼠腰髓组织石蜡切片进行病理组织染色。D，H&E染色和E，快蓝染色。左侧方形中放大后置于右侧。F和G，对E-F中细胞浸润总数及脱髓鞘数进行定量分析，数据以mean±SEM表示。每组取4只小鼠，每只小鼠脊髓取15片切片进行分析，与野生型比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^###p＜0.001(Student’st-test)。

图2为丙戊酸减少致病性T细胞的CNS浸润。

A，取幼稚型或免疫后给生理盐水及丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)第17天小鼠腰髓冰冻切片进行CD45⁺和CD4⁺T细胞免疫荧光染色。左侧方形中放大后置于右侧。DAPI用于染细胞核。B-D，用37-70％percoll正常组及EAE对照组或给丙戊酸组(300mg/kg)小鼠CNS浸润细胞并用流式仪分析总浸润细胞数(B)，CD4⁺T细胞数(C)，和Th1和Th17细胞数(D)。数据来源三次独立实验，每次实验每组3只小鼠(mean±SEM)。与正常组比较，^*p＜0.05和^***p＜0.001；与对照组比较，^#p＜0.05(Student’s t-test)。

图3为丙戊酸减少EAE小鼠的外周T细胞数量。

A和B，正常组及EAE对照组或给丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)组小鼠第10天的平均体重(B)和脾脏净重(A)。数据以mean±SEM(n＝6)表示，与正常组比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^#p＜0.05(Student’s t-test)。C-F，分离免疫第10天的正常组及EAE对照组或给丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)组小鼠的脾脏(C和D)或外周血(E和F)的白细胞并进行流式分析。C和E，细胞用anti-CD45抗体(白细胞)，anti-CD4，anti-CD8和anti-B220(B细胞)进行表面染色检测CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞and B细胞。D and F，CD4⁺T细胞内的胞内染色IFN-γ，IL-17和Foxp-3流式检测Th1，Th17和Treg细胞。数据来源三次独立实验，每次实验每组3只小鼠(mean±SEM)。与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01和^***p＜0.001；与对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001(Student’s t-test)。

图4为丙戊酸增加活化的T细胞的凋亡。

细胞用anti-CD4，anti-CD8，annexin V和PI抗体进行染色并用流式进行分析，凋亡细胞的比例为annexin V阳性细胞所占总细胞的比例。A-D，取正常小鼠的脾脏的白细胞，以每孔3×10⁶个细胞铺于48孔板，在含有10ng/ml IL-2，2μg/ml anti-mouse CD28抗体和2μg/mlanti-mouse CD3抗体的完全10％RPMI1640培养基中培养48小时。活细胞利用Ficoll (1077)密度离心法进行纯化。纯化后的细胞以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，并加入2μg/mlanti-mouse CD3抗体进行重刺激，分别培养24，48，72小时后收集细胞。A和B，丙戊酸促进CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡。C和D，泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK(10μM)抑制丙戊酸的作用。E and F，丙戊酸促进MOG特异性的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡。取第10天EAE小鼠的脾细胞，以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，并加入20μg/ml MOG进行重刺激，分别培养24，48，72小时后收集细胞。数据来源三次独立实验(mean±SEM)。与正常组比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^###p＜0.001(Student’s t-test)。

图5为丙戊酸促进人外周血中T细胞的凋亡。

正常人的外周血单核细胞以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，在含有2μg/ml anti-humanCD28抗体和2μg/ml anti-human CD3抗体的完全10％RPMI1640培养基中，分别培养24，48，72小时后收集细胞。细胞用anti-CD4，anti-CD8，annexin V和PI抗体进行染色并用流式进行分析，凋亡细胞的比例为annexin V阳性细胞所占总细胞的比例。A和B，丙戊酸促进CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡。C和D，泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK(20μM)抑制丙戊酸的作用。数据来源三次独立实验(mean±SEM)。与正常组比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^###p＜0.001(Student’s t-test)。

图6为丙戊酸通过活化caspase信号通路调节T细胞凋亡。

分离免疫第10天对照组和给丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)组EAE小鼠的脾细胞(A)、T细胞(B)和非T细胞(C)利用QPCR分析caspase1，3，6，8和9的表达水平。数据来源三次独立实验，每次实验每组3只小鼠(mean±SEM)。D-G，分离免疫第10天对照组和给丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，从第3天开始)组EAE小鼠的脾细胞，细胞用在裂解液中冰上超声裂解30秒，定蛋白浓度后等量蛋白样品上样。D和E，丙戊酸上调caspase3的表达水平。F和G，丙戊酸增强H3乙酰化水平。数据来源三次独立实验，每次实验每组3只小鼠(mean±SEM)。与对照组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01和^***p＜0.001(Student’s t-test)。

具体实施方式

以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。

实施例

材料与方法

动物

C57BL/6雌鼠购自上海实验动物中心(上海，中国)并饲养于同济大学实验动物中心SPF级实验室，至8-9周开始实验并维持光-暗12小时循环交替，给以充足的食料和洁净饮水。所有实验均获得批准，并按照同济大学的动物保健委员会的指引进行。

试剂

MOG_35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)购自吉泰生化(上海，中国)，纯度＞95％。M-MLV Reverse Transcriptase和RNasin Ribonuclease inhibitor购自Promega(Fitchburg，WI)。SYBR Green JumpStart^TM Taq ReadyMix^TM kit和sodium fluorescein购自Sigma (St.Louis，MO)。Ficoll-Paque^TM PLUS和Percoll^TM购自GE healthcare。Fluorescein isothiocyanate(FITC)anti-mouse CD45，FITC anti-mouse CD8a，phycoerythrin(PE)anti-mouse CD45R(B220)和APCanti-mouse/rat Foxp3staining set购自eBioscience(San Diego，CA)。PE-Cy7anti-mouse CD4，PE anti-mouse IL17a，APC anti-mouse IFN-γ，PE anti-mouse Foxp3和BD Cytofix/Cytoperm kit购自BD bioscience (Franklin Lakes，NJ)。

Mouse CD4Cell Negative Isolation Kit购自Invitrogen (Carlsbad，CA)。APC anti-mouse CD4/CD8and APC anti-human CD4/CD8购自Biolegend(San Diego，CA)。

EAE诱导及小鼠给药

8-9周雌性C57BL/6小鼠皮下注射200μg MOG_35-55辅以完全弗氏佐剂及热灭活结核杆菌(H37Ra strain，5mg/ml，BD Diagnostics)。免疫第0天及第2天每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200ng(Calbiochem)。采取“双盲法”每天为小鼠评分，评分按“5分制”标准如下：0分，无临床症状；1分，尾部瘫痪；2分，轻度瘫痪(单侧或双侧后肢无力，不完全瘫痪)；3分，截瘫(双侧后肢完全瘫痪)；4分，截瘫并前肢无力或瘫痪；5分，濒死状态或死亡。

小鼠给药，丙戊酸从免疫后第3天腹腔或口服给药(100-300mg/kg，溶于水中)或第12天开始口服给药(300mg/kg，溶于水中)至研究结束。水为阴性对照(每只100μl)。

组织病理与免疫荧光分析

为分析CNS浸润，小鼠PBS灌流后取脊髓；为进行组织及免疫荧光染色，小鼠麻醉后PBS灌流及4％多聚甲醛灌流固定。组织样品4％多聚甲醛固定过夜。石蜡包埋后H&E染色分析炎症浸润，快蓝染色分析脊髓脱髓鞘。冰冻切片用anti-mouse CD45和anti-mouse CD4

I抗及相应II抗染色。

实时-定量PCR

根据产品说明，利用TRIzol(Invitrogen)提取脾细胞总RNA，用六碱基随机引物和M-MLV Reverse Transcriptase(Progema)逆转录至cDNA。利用SYBR Green JumpStart^TM TaqReadyMix^TM kit(Sigma)及各基因引物序列在LightCycler quantitative PCR apparatus(Stratagene)上进行实时定量-PCR检测各基因表达情况。引物序列如下：

Caspase1上游引物-CCCCAGGCAAGCCAAAT，

Caspase1下游引物-GTGCCATCTTCTTTGTTCTGTTC；

Caspase3上游引物-CTGACTGGAAAGCCGAAACTC，

Caspase3下游引物-TGGATGAACCACGACCCG；

Caspase6上游引物-AGTACAAGATGGACCACAAGAGG，

Caspase6下游引物-GTTCTTCTGCTCTGAGGTCGTTA；

Caspase8上游引物-GGAAGACATAACCCAACTCCG，

Caspase8下游引物-CTTGTCACCGTGGGATAGGAT；

Caspase9上游引物-GATCAGGGGACATGCAGATATG，

Caspase9下游引物-TCTTGGCAGTCAGGTCGTTC；

β-actin上游引物-GGCTGTATTCCCCTCCATCG，

β-actin下游引物-CCAGTTGGTAACAATGCCATGTT。

CNS浸润白细胞分离及分析

用组织匀浆器冰上将脊髓组织匀浆后用70μm细胞过滤器滤过，细胞悬液4℃，500g，离心10分钟后，用8ml 37％percoll重悬细胞，小心加入到4ml 70％percoll液体中，25℃，780g，离心25分钟。收集位于37％-70％percoll中间层细胞并流式检测。

CD4⁺T细胞分离和体外分化

磁珠分离8-9周C57BL/6小鼠脾中幼稚CD4⁺T细胞，分离CD4⁺T细胞加入anti-CD3(2μg/ml；145-2C11，soluble；BD Pharmingen)和anti-CD28(2μg/ml；37.51，soluble；BDPharmingen)抗体激活后分别加入IL-12(10ng/ml；Peprotech)和anti-IL-4(10μg/ml；11B11；BD Pharmingen)诱导分化为Th1细胞及加入TGF-β1(5ng/ml；Peprotech)，重组鼠IL-2(50U/ml；Peprotech)和anti-IFN-γ(10μg/ml；XMG1.2；BD Pharmingen)诱导分化为Treg细胞，或加入anti-IL-4，anti-IFN-γ，Th17“鸡尾酒”含TGF-β1(3ng/ml)，IL-6(30ng/ml；eBioscience)，tumor necrosis factor(10ng/ml；Peprotech)和IL-1β(10ng/ml；Peprotech)诱导分化为Th17细胞。各种浓度的复合物同时加入以评估其对T细胞分化的影响。

流式细胞检测

脾细胞或CNS浸润细胞与phorbol 12-myristate 13-acetate(50ng/ml；Sigma)，ionomycin(750ng/ml；Sigma)和brefeldin A(1.0μg/ml；Sigma)37℃孵育5小时，相应抗体染色表面标记物，表面染色后细胞重悬于固定/通透液(Cytofix/Cytoperm kit；BD Pharmingen)，胞内染色按产品说明操作。对于Foxp3染色，细胞不用phorbol 12-myristate 13-acetate和ionomycin刺激，而是使用Foxp3Staining Buffer set并按产品说明操作。结果用Guava easyCyte^TM 8HT System和GuavaSoft软件进行分析。

T细胞凋亡实验

取正常小鼠的脾脏的白细胞，以每孔3×10⁶个细胞铺于48孔板，在含有10ng/ml IL-2，2μg/ml anti-mouse CD28抗体和2μg/ml anti-mouse CD3抗体的完全10％RPMI1640培养基中培养48小时。活细胞利用Ficoll(1.077)密度离心法进行纯化。纯化后的细胞以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，并加入2μg/ml anti-mouse CD3抗体进行重刺激，分别培养24，48，72小时后收集细胞。取EAE小鼠的脾细胞，以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，并加入20μg/mlMOG进行重刺激，分别培养24，48，72小时后收集细胞。人外周血单核细胞以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，在含有2μg/ml anti-human CD28抗体和2μg/ml anti-human CD3抗体的完全10％RPMI1640培养基中，分别培养24，48，72小时后收集样品。细胞用anti-CD4，anti-CD8，annexin V和PI抗体进行染色并用流式进行分析，凋亡细胞的比例为annexin V阳性细胞所占总细胞的比例。

Western blot

分离免疫第10天对照组和给丙戊酸(300mg/kg，oral，从第3天开始)组EAE小鼠的脾细胞，细胞用PBS洗后在裂解液(50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，0.1％Chaps，1mM EDTA，1mM NaF，1mM Na₃VO₄和protease inhibitors)中裂解，冰上超声30秒，BCA定蛋白浓度，等量蛋白样品上样SDS-PAGE电泳后电转到PVDF膜。Western blot采用兔抗caspase3抗体及相关HRP-结合二抗。

数据统计

数据表示为mean±SEM，EAE小鼠处理组间统计学差异用two-way ANOVA test分析。其他数据分析如基因表达，细胞因子生成后病理学统计分析用Student’s t-test分析。p＜0.05为有统计学意义。

结果：

丙戊酸减轻EAE的临床症状

为研究丙戊酸对EAE的治疗作用，用不同给药方式和不同药物剂量治疗MOG诱导的EAE小鼠。图1为丙戊酸改善EAE临床症状。免疫后第3天腹腔注射(图1A)和灌胃给药(图1B)至实验结束，对照组注射水。免疫后第3天给药后无论何种给药方式，丙戊酸均可抑制EAE的病情(图1A和1B)。此外腹腔注射给药丙戊酸(300mg/kg)也明显延缓了EAE的发病(图1A)。进一步研究发现，当EAE已发病后即免疫后第12天(图1C)，灌胃给药丙戊酸(300mg/kg)仍能减轻EAE的病情，显示该药具有预防及治疗EAE的作用。与对照相比，灌胃给药丙戊酸(300mg/kg)至免疫第17天的脊髓组织病理检测显示，丙戊酸可明显减少白细胞在脊髓的浸润(图1D和1F)。快蓝染色显示对照组EAE小鼠脊髓白质出现多个广泛区域脱髓鞘现象，而给药丙戊酸后脱髓鞘明显减少(图1E和1G)。

用MOG_35-55免疫雌性C57/B6小鼠。丙戊酸从免疫后第3天或第12天开始每天腹腔注射或灌胃注射一次并记录临床分数。对照组腹腔注射或灌胃注射水。A，腹腔注射100或300mg/kg丙戊酸，从第3天开始；B，灌胃注射100或300mg/kg丙戊酸，从第3天开始；C，灌胃注射300mg/kg丙戊酸，从第12天开始。数据表示为mean±SEM(n＝10)。^***p＜0.001，与对照组相比(two-way ANOVA)。取野生型或免疫后给生理盐水及丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)第17天小鼠腰髓组织石蜡切片进行病理组织染色。D，H&E染色和E，快蓝染色。左侧方形中放大后置于右侧。F和G，对E-F中细胞浸润总数及脱髓鞘数进行定量分析，数据以mean±SEM表示。每组取4只小鼠，每只小鼠脊髓取15片切片进行分析，与野生型比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^###p＜0.001(Student’st-test)。丙戊酸可以改善神经病理学症状与抑制CNS免疫细胞浸润

图2为丙戊酸减少致病性T细胞的CNS浸润。A，取幼稚型或免疫后给生理盐水及丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)第17天小鼠腰髓冰冻切片进行CD45⁺和CD4⁺T细胞免疫荧光染色。左侧方形中放大后置于右侧。DAPI用于染细胞核。B-D，用37-70％percoll正常组及EAE对照组或给丙戊酸组(300mg/kg)小鼠CNS浸润细胞并用流式仪分析总浸润细胞数(B)，CD4⁺T细胞数(C)，和Th1和Th17细胞数(D)。数据来源三次独立实验，每次实验每组3只小鼠(mean±SEM)。与正常组比较，^*p＜0.05和^***p＜0.001；与对照组比较，^#p＜0.05(Student’s t-test)。

进一步用原位免疫荧光染色显示CNS白细胞浸润表明，丙戊酸给药后能明显减少EAE小鼠脊髓中白细胞和CD4⁺T细胞的数量(图2A)。流式分析给药对免疫后第17天CNS白细胞浸润影响，结果进一步验证丙戊酸给药后总的CNS浸润数(图2B)和CD4⁺T细胞在CNS的聚集都减少了(图2C)。Th1和Th17是EAE主要的致病性CD4⁺T细胞。丙戊酸给药后，Th1和Th17的绝对数明显下降(图2D)。综上所述，给药丙戊酸能明显减少CNS的炎症浸润。

丙戊酸减少了EAE小鼠外周组织中的T细胞数量。

图3为丙戊酸减少EAE小鼠的外周T细胞数量。A和B，正常组及EAE对照组或给丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)组小鼠第10天的平均体重(B)和脾脏净重(A)。数据以mean±SEM(n＝6)表示，与正常组比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^#p＜0.05(Student’st-test)。C-F，分离免疫第10天的正常组及EAE对照组或给丙戊酸(灌胃注射，300mg/kg，第3天给药)组小鼠的脾脏(C和D)或外周血(E和F)的白细胞并进行流式分析。C和E，细胞用anti-CD45抗体(白细胞)，anti-CD4，anti-CD8和anti-B220(B细胞)进行表面染色检测CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞and B细胞。D and F， CD4⁺T细胞内的胞内染色IFN-γ，IL-17和Foxp-3流式检测Th1，Th17和Treg细胞。数据来源三次独立实验，每次实验每组3只小鼠(mean±SEM)。与正常组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01和^***p＜0.001；与对照组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01和^###p＜0.001(Student’s t-test)。

给药丙戊酸后小鼠脾脏的净重明显下降(图3A和3B)。利用表面染色检测脾细胞中CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞和B细胞的比例，丙戊酸给药后CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞所占白细胞中的比例明显减少，但B细胞所占比例并没有明显变化(图3C).进一步检测了CD4亚群细胞中Th1，Th17和Treg细胞的数量。与对照组相比，给药后的Th1，Th17和Treg细胞数量明显下降(图3D)。另外，在各组小鼠外周血的表面染色和胞内染色数据可以观察到同样的结果(图3E和3F)。

丙戊酸增强了T细胞的凋亡

数据表明丙戊酸给药后在EAE小鼠的外周组织中T细胞的比例是明显下降的。基于这些数据结果，假设丙戊酸可能影响了T细胞的存活。幼稚型脾单核细胞细胞与anti-mouse CD3抗体共孵育，并用不同浓度的丙戊酸(0.3和1mM)进行处理。发现丙戊酸增强了CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡程度。同时丙戊酸对T细胞的促凋亡作用可以部分被广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK(10μM)所抑制(图4A-D)。免疫后第10天的小鼠脾细胞用MOG(20μg/ml)进行重刺激并用丙戊酸(1mM)处理，同样可以观察到丙戊酸促进了MOG特异性CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞凋亡，同时此作用也被Z-VAD-FMK所抑制(图4E和4F)。

图4为丙戊酸增加活化的T细胞的凋亡。

细胞用anti-CD4，anti-CD8，annexin V和PI抗体进行染色并用流式进行分析，凋亡细胞的比例为annexin V阳性细胞所占总细胞的比例。A-D，取正常小鼠的脾脏的白细胞，以每孔3×10⁶个细胞铺于48孔板，在含有10ng/ml IL-2，2μg/ml anti-mouse CD28抗体和2μg/mlanti-mouse CD3抗体的完全10％RPMI1640培养基中培养48小时。活细胞利用Ficoll(1.077)密度离心法进行纯化。纯化后的细胞以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，并加入2μg/mlanti-mouse CD3抗体进行重刺激，分别培养24，48，72小时后收集细胞。A和B，丙戊酸促进CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡。C和D，泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK(10λM)抑制丙戊酸的作用。E and F，丙戊酸促进MOG特异性的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡。取第10天EAE小鼠的脾细胞，以每孔1×10⁶个细胞铺于96孔板，并加入20μg/ml MOG进行重刺激，分别培养24，48，72小时后收集细胞。数据来源三次独立实验(mean±SEM)。与正常组比较，^***p＜0.001；与对照组比较，^###p＜0.001(Student’s t-test)。

进一步检测了丙戊酸对人外周血单核细胞的影响。将人外周血单核细胞与anti-humanCD3和anti-human CD28抗体共孵育，并用丙戊酸(0.3和1mM)处理。

图5为丙戊酸促进人外周血中T细胞的凋亡。

发现丙戊酸增强了CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的凋亡程度(图5A和5B)，并且丙戊酸对T细胞的促凋亡作用可以部分被广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK(20μM)所抑制(图5C和5D)。丙戊酸上调了免疫组织中caspase家族的表达水平

丙戊酸诱导的凋亡与依赖于caspase8的级联反应有关。所以，检测了caspase家族成员的表达水平变化。

图6为丙戊酸通过活化caspase信号通路调节T细胞凋亡。

发现丙戊酸给药后caspase3和caspase8的表达水平都有所上调(图6A)。进一步研究发现caspase3和caspase8的表达水平在T细胞中都有明显的上升，而在非T细胞中变化不明显(图6B和6C)。利用western-blot实验进一步证明了丙戊酸给药上调了caspase3的表达(图6D和6E)和组蛋白H3的乙酰化水平(图6F和6G)。这些数据都表明丙戊酸增强caspase3的活性从而加强免疫细胞的凋亡。

讨论

近年来，组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为非细胞毒性的新型肿瘤靶向治疗药物倍受关注，其中许多药物都进入了临床研究阶段。主要抗肿瘤机制是：组蛋白去乙酰化酶抑制剂阻滞肿瘤细胞的细胞周期、促进分化、诱导凋亡；抑制了肿瘤细胞的迁移、浸润、转移；抑制肿瘤细胞的血管生成[Marks，P.A.and M.Dokmanovic，Histone deacetylase inhibitors：discovery anddevelopment as anticancer agents.Expert Opin Investig Drugs，2005.14(12)：p.1497-511.]。作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，近几年来丙戊酸被认为是一种新型的抗癌药。例如，丙戊酸以镁盐形式治疗宫颈癌和卵巢癌进入III期临床试验。丙戊酸处理MV411细胞会引起一些凋亡特定性的变化如DNA片段化，丝氨酸磷脂蛋白外转，线粒体释放细胞色素C，以及caspases-3，-8，and-9的活化。Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以抑制丙戊酸引起的DNA片段化。这些数据均显示丙戊酸有通过caspase依赖性信号通路的抗白血病的作用[Kawagoe，R.，H.Kawagoe，and K.Sano，Valproic acid induces apoptosis in human leukemia cells by stimulating bothcaspase-dependent and-independent apoptotic signaling pathways.Leuk Res，2002.26(5)：p.495-502.]。有文献报道丙戊酸可以恢复慢性淋巴细胞白血病患者的外周血细胞的凋亡信号[Bokelmann，I.and U.Mahlknecht，Valproic acid sensitizes chronic lymphocytic leukemia cells toapoptosis and restores the balance between pro-and antiapoptotic proteins.Mol Med，2008.14(1-2)：p.20-7.]。丙戊酸可以通过影响内源或外源凋亡通路的caspase活化来调节慢性淋巴细胞白血病细胞的凋亡。简而言之，丙戊酸通过恢复促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡来影响慢性淋巴细胞白血病细胞的凋亡。

最近，Achachi等人报道在白血病或淋巴瘤的羊模型上发现丙戊酸有一定的治疗作用，可以导致淋巴细胞的减少和肿瘤的消退[Achachi，A.，et al.，Valproate activates bovine leukemiavirus gene expression，triggers apoptosis，and induces leukemia/lymphoma regression in vivo.ProcNatl Acad Sci U S A，2005.102(29)：p.10309-14.]。因此，在本研究中利用丙戊酸治疗EAE小鼠。观察到丙戊酸激活了caspase信号通路，增强了T细胞的凋亡，并改善了EAE的临床病症。白介素-2主要由激活后的T细胞分泌，是重要的免疫应答和T细胞平衡的调节因子[Takahashi，K.，et al.，Induction of interdigitating reticulum cell-like differentiation in humanmonocytic leukemia cells by conditioned medium from IL-2-stimulated helper T-cells.VirchowsArch B Cell Pathol Incl Mol Pathol，1992.62(2)：p.105-13]。近来有文献报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和FR235222有抑制白介素-2的表达和增强免疫抑制的作用[Takahashi，I.，et al.，Selective inhibition of IL-2 gene expression by trichostatin A，a potent inhibitor of mammalianhistone deacetylase.J Antibiot(Tokyo)，1996.49(5)：p.453-7.Matsuoka，H.，et al.，Mechanism ofHDAC inhibitor FR235222-mediated IL-2transcriptional repression in Jurkat cells.IntImmunopharmacol，2007.7(11)：p.1422-32.].。组蛋白去乙酰化酶抑制剂被认为是一类有效的治疗淋巴瘤的药物。组蛋白去乙酰化酶抑制剂对T细胞淋巴瘤作用显著，而对B细胞淋巴瘤无明显作用[Zain，J.and O.A.O′Connor，Targeting histone deacetyalses in the treatment of B-andT-cell malignancies.Invest New Drugs，2010.28Suppl 1：p.S58-78]。在本研究中，同时发现丙戊酸给药后EAE小鼠脾细胞中T细胞比例明显下降而B细胞无明显变化。

丙戊酸是广谱的抗癫痫药物，对各种癫痫病症均有明显的改善。在一定程度上认为脑部疾病与蛋白乙酰化水平的失衡和转录功能障碍。所以利用各种组蛋白去乙酰化酶抑制剂在神经退行性疾病的干预已成为一个有前途的新治疗策略[Chuang，D.M.，et al.，Multiple roles ofHDAC inhibition in neurodegenerative conditions.Trends Neurosci，2009.32(11)：p.591-601.]。组蛋白去乙酰化酶的抑制剂具有神经保护，营养和抗炎性能；改善神经系统表现，学习/记忆和其他疾病表型经常看到这些模型[Adcock，I.M.，HDAC inhibitors as anti-inflammatory agents.Br J Pharmacol，2007.150(7)：p.829-31.]。现已有文献报道如TSA在一定程度上可以改善多发性硬化[Camelo，S.，et al.，Transcriptional therapy with the histone deacetylase inhibitortrichostatin A ameliorates experimental autoimmune encephalomyeliti s.J Neuroimmunol，2005.164(1-2)：p.10-21.]，丙戊酸起到一定的神经保护作用，在治疗脑内出血和老年痴呆症等方面都有一定疗效[Sinn，D.I.，et al.，Valproic acid-mediated neuroprotection in intracerebralhemorrhage via histone deacetylase inhibition and transcriptional activation.Neurobiol Dis，2007.26(2)：p.464-72]。人的组蛋白去乙酰化酶酶主要分为四类，其中I和II类组蛋白去乙酰化酶对中枢神经系统有重要的作用[Marks，P.A.and M.Dokmanovic，Histone deacetylase inhibitors：discovery and development as anticancer agents.Expert Opin Investig Drugs，2005.14(12)：p.1497-511.]。非选择性组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA和SAHA可以抑制包括HDAC6在内的大部分锌依赖性的组蛋白去乙酰化酶作用，从而影响血脑屏障的通透性[Hooke r，J.M.，et al.，Histone deacetylase inhibitor，MS-275，exhibits poor brain penetration：PK studies of[C]MS-275using Positron Emission Tomography.ACS Chem Neurosci，2010.1(1)：p.65-73.]。组蛋白去乙酰化酶丙戊酸可以改善由MCAO诱导的血脑屏障通透性的破坏和脑水肿[Wang，Z.，et al.，Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebralischemia：the roles of HDAC and MMP-9inhibition.J Cereb Blood Flow Metab，2011.31(1)：p.52-7]。

在本研究中，发现组蛋白去乙酰化酶丙戊酸可以增强T细胞凋亡，从而维持免疫平衡，减少了外周组织中激活状态的T细胞，从而减少了中枢神经系统的炎症反应，减轻脱髓鞘作用，以及减少神经元与轴突的丢失。进一步研究表明组蛋白去乙酰化酶丙戊酸在EAE的预防和治疗方面有明显的效果。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的靶向调节组蛋白乙酰化水平的药物为组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的自身免疫性疾病包括多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮或炎症性肠病。