BRPI0613382A2 - anticorpos isolados, anticorpo monoclonal, célula de hibridoma, método de identificação, método de inibição do crescimento de uma célula, método de tratamento terapêutico, método de determinação da presença de uma proteìna, métodos de diagnósticos da presença de tumor e usos de um anticorpo - Google Patents

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BRPI0613382A2
BRPI0613382A2 BRPI0613382-7A BRPI0613382A BRPI0613382A2 BR PI0613382 A2 BRPI0613382 A2 BR PI0613382A2 BR PI0613382 A BRPI0613382 A BR PI0613382A BR PI0613382 A2 BRPI0613382 A2 BR PI0613382A2
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BR
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antibody
seq
polypeptide
cell
tat
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BRPI0613382-7A
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Mark Dennis
William Mallet
Paul Polakis
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Genentech Inc
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Abstract

A presente invenção refere-se a composições de matéria úteis para o diagnóstico e tratamento de tumores em mamíferos e a métodos de uso dessas composições de matéria para o mesmo.

Description

"ANTICORPOS ISOLADOS, ANTICORPO MONOCLONAL, CÉLULA DEHIBRIDOMA, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO, MÉTODO DE INIBIÇÃO DOCRESCIMENTO DE CÉLULA, MÉTODO DE TRATAMENTO TERAPÊUTICO,MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE PROTEÍNA EMÉTODOS DE DIAGNÓSTICOS DA PRESENÇA DE TUMOR"
Pedidos Relacionados
O presente pedido é pedido não provisório depositado com baseem 37 C. F. R. § 1.53 (b) (1), que reivindica prioridade com base em 35 U. S.C. § 119 (e) para os pedidos provisórios com números de série 60/692.092,depositado em vinte de junho de 2005, e 60/793.951, depositado em 21 de abrilde 2006, cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a composições de matéria úteispara o diagnóstico e tratamento de tumores em mamíferos e a métodos de usodessas composições de matéria para tanto.
Antecedentes da Invenção
Tumores malignos (cânceres) são a segunda principal causa demorte dos Estados Unidos, depois das doenças cardíacas (Boring et al, CACancel J. Clin. 43: 7 (1993)). O câncer é caracterizado pelo aumento daquantidade de células anormais, ou neoplásticas, derivadas de tecido normalque se proliferam para formar massa de tumor, invasão de tecidos adjacentespor essas células de tumores neoplásticos e geração de células malignas queeventualmente se difundem por meio do sangue ou sistema linfático paranódulos linfáticos regionais e para locais distantes por meio de processodenominado metástase. E m estado canceroso, uma célula prolifera-se sobcondições em que as células normais não cresceriam. O câncer manifesta-seem ampla variedade de formas, caracterizadas por diferentes graus deinvasividade e agressividade.Em tentativas de descobrir alvos celulares eficazes para terapia ediagnóstico de câncer, os pesquisadores buscaram identificar polipeptídeosassociados a transmembrana ou membrana de outra forma que são expressosespecificamente sobre a superfície de um ou mais tipos específicos de célulacancerosa em comparação com uma ou mais células não cancerosas normais.Freqüentemente, esses polipeptídeos associados a membranas são expressosde forma mais abundante sobre a superfície das células cancerosas emcomparação com a superfície das células não cancerosas. A identificaçãodesses polipeptídeos de antígenos da superfície celular associados a tumoresgerou a capacidade de dirigir-se especificamente a células cancerosas paradestruição por meio de terapias com base em anticorpos. Neste particular,observa-se que terapia com base em anticorpos comprovou ser muito eficaz notratamento de certos cânceres. HERCEPTIN® e RITUXAN®, por exemplo(ambos da Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia), são anticorposque vêm sendo utilizados com sucesso no tratamento de câncer de mama elinfoma não de Hodgkin, respectivamente. Mais especificamente,HERCEPTIN® é anticorpo monoclonal humanizado derivado de DNArecombinante que se une seletivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano (HER2).
Observa-se sobreexpressão de proteína HER2 em 25 a 30% de cânceres demama primários. RITUXAN® é anticorpo monoclonal humano/murino quiméricogeneticamente elaborado dirigido contra o antígeno CD20 encontrado nasuperfície de linfócitos B normais e malignos. Estes dois anticorpos sãoproduzidos de forma recombinante em células de CHO.
Apesar dos avanços identificados acima na terapia de câncer demamíferos, existe grande necessidade de agentes terapêuticos e dediagnóstico adicionais capazes de detectar a presença de tumor em mamíferose de inibir efetivamente o crescimento de células neoplásticas,respectivamente. Conseqüentemente, é objeto da presente invenção identificarpolipeptídeos associados a membranas celulares que sejam expressos deforma mais abundante sobre um ou mais tipos de células cancerosas emcomparação com células normais ou sobre outras células de câncer diferentese o uso desses polipeptídeos e seus ácidos nucleicos codificadores para aprodução de composições de matéria úteis no tratamento terapêutico edetecção por diagnóstico de câncer em mamíferos.
Descrição Resumida da Invenção
A. Realizações
No presente relatório descritivo, os Depositantes descrevem pelaprimeira vez a identificação de polipeptídeos celulares (e seus ácidos nucleicoscodificadores ou seus fragmentos) que são expressos até grau mais alto sobrea superfície de um ou mais tipos de células cancerosas em comparação com asuperfície de um ou mais tipos de células não cancerosas normais. Essespolipeptídeos são indicados no presente como polipeptídeos Alvo AntigênicosAssociados a Tumores (polipeptídeos "TAT") e espera-se que sirvam de alvoseficazes para a terapia e diagnóstico de câncer em mamíferos.
Conseqüentemente, em realização da presente invenção, apresente invenção fornece molécula de ácido nucleico isolada que contémseqüência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo alvo antigênico associadoa tumores ou seu fragmento (polipeptídeo 'TAT").
Em certos aspectos, a molécula de ácido nucleico isoladacompreende seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de 80%de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente pelo menoscerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüênciasde ácido nucleico para (a) molécula de DNA que codifica polipeptídeo TAT decomprimento total que contém seqüência de aminoácidos conforme descrito nopresente, seqüência de aminoácidos de polipeptídeo TAT que não contém opeptídeo de sinal descrito no presente, domínio extracelular de polipeptídeoTAT transmembrana, com ou sem o peptídeo de sinal, conforme descrito nopresente, ou qualquer outro fragmento especificamente definido de seqüênciade aminoácidos de polipeptídeo TAT de comprimento total conforme descritono presente; ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a).
Em certos aspectos, a molécula de ácido nucleico isoladacompreende seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de 80%de identidade de seqüências de ácido nucleico, alternativamente pelo menoscerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüênciasde ácido nucleico para (a) molécula de DNA que compreende a seqüência decodificação de cDNA de codifica polipeptídeo TAT de comprimento totalconforme descrito no presente, seqüência de codificação de polipeptídeo TATque não contém o peptídeo de sinal descrito no presente, seqüência decodificação de domínio extracelular de polipeptídeo TAT transmembrana, comou sem o peptídeo de sinal, conforme descrito no presente, ou a seqüência decodificação de qualquer outro fragmento especificamente definido de seqüênciade aminoácidos de polipeptídeo TAT de comprimento total conforme descritono presente; ou (b) o complemento da molécula de DNA de (a).
Em aspectos adicionais, a presente invenção refere-se a moléculade ácido nucleico isolada que compreende seqüência de nucleotídeos quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências de ácidonucleico, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%ou 100% de identidade de seqüências de ácido nucleico para (a) molécula deDNA que codifica o mesmo polipeptídeo maduro codificado pela região decodificação de comprimento total de qualquer dos cDNAs de proteína humanadepositados junto à ATCC conforme descrito no presente; ou (b) ocomplemento da molécula de DNA de (a).
Outro aspecto da presente invenção fornece molécula de ácidonucleico isolado que compreende seqüência de nucleotídeos que codificapolipeptídeo TAT que possui domínio transmembrana excluído ou domíniotransmembrana desativado, ou é complementar a essa seqüência denucleotídeos codificadora, em que o(s) domínio(s) transmembrana desse(s)polipeptídeo(s) é(são) descrito(s) no presente. São contemplados, portanto,domínios extracelulares solúveis dos polipeptídeos TAT descritos no presente.
Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a moléculasde ácido nucleico isolado que se hibridizam em (a) seqüência de nucleotídeosque codifica polipeptídeo TAT que contém seqüência de aminoacidos decomprimento total conforme descrito no presente, seqüência de aminoacidosde polipeptídeo TAT que não contém o peptídeo de sinal conforme descrito nopresente, domínio extracelular de polipeptídeo TAT transmembrana, com ousem o peptídeo de sinal, conforme descrito no presente, ou qualquer outrofragmento especificamente definido de seqüência de aminoacidos depolipeptídeo TAT de comprimento total conforme descrito no presente; ou (b) ocomplemento da seqüência de nucleotídeos de (a). Neste particular, umarealização da presente invenção refere-se a fragmentos de seqüência decodificação de polipeptídeo TAT de comprimento total ou seu complemento,conforme descrito no presente, que podem encontrar uso, por exemplo, comosondas de hibridização úteis, por exemplo, como sondas de diagnóstico,primers de PCR, sondas de oligonucleotídeo sem sentido, ou para acodificação de fragmentos de polipeptídeo TAT de comprimento total quepodem opcionalmente codificar polipeptídeo que compreende local de uniãopara anticorpo de polipeptídeo anti-TAT, oligopeptídeo de união de TAT ououtra molécula orgânica pequena que se une a polipeptídeo TAT. Essesfragmentos de ácidos nucleicos normalmente possuem pelo menos de cerca decinco nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15; 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 35, 40; 45, 50, 55, 60; 65, 6, 7, 8; 9, 10, 11, 12; 13, 14, 115, 16; 17, 18,19, 20; 21, 22, 155, 160; 165, 170, 175, 180; 185, 190, 195, 200; 210, 220, 230,240, 250; 260, 270, 280, 290, 300; 310, 320, 330, 340, 350; 360, 370, 380, 390,400; 410, 420, 430, 440, 450; 460, 470, 480, 490, 500; 510, 520, 530, 540, 550;560, 570, 580, 590, 600; 610, 620, 630, 640, 650; 660, 670, 680, 690, 700; 710,720, 730, 740, 750; 760, 770, 780, 790, 800; 810, 820, 830, 840, 850; 860, 870,880, 890, 900; 910, 920, 930, 940, 950; 960, 970, 980, 990 ou 1000nucleotídeos de comprimento, em que, neste contexto, a expressão "cerca de"indica o comprimento de seqüência de nucleotídeos de referência mais oumenos 10% daquele comprimento indicado. Além disso, esses fragmentos deácidos nucleicos normalmente são compreendidos de nucleotídeosconsecutivos derivados da seqüência de codificação de comprimento total depolipeptídeo TAT ou seu complemento. Observa-se que fragmentos inovadoresde seqüência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo TAT ou seucomplemento podem ser determinados de forma rotineira por meio doalinhamento da seqüência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo TAT comoutras seqüências de nucleotídeos conhecidas, utilizando qualquer dentre umasérie de programas de alinhamento de seqüências bem conhecidos edeterminando qual(is) fragmento(s) de seqüências de nucleotídeoscodificadoras de polipeptídeos TAT é(são) inovador(es). Todos essesfragmentos inovadores de seqüências de nucleotídeos codificadoras depolipeptídeos TAT, ou seu complemento, são contemplados no presente.Também são contemplados os fragmentos de polipeptídeos TAT codificadospor estes fragmentos de moléculas de nucleotídeos, preferencialmente osfragmentos de polipeptídeos TAT que compreendem um local de união paraanticorpo anti-TAT, oligopeptídeo de união de TAT ou outra molécula orgânicapequena que se une a polipeptídeo TAT.
Em outra realização, a presente invenção fornece polipeptídeosTAT isolados codificados por qualquer das seqüências de ácido nucleicoisoladas identificadas acima no presente.
Em um dado aspecto, a presente invenção refere-se apolipeptídeo TAT isolado, que compreende seqüência de aminoácidos quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%de identidade de seqüências de aminoácidos para polipeptídeo TAT quecontém seqüência de aminoácidos de comprimento total conforme descrito nopresente, seqüência de aminoácidos de polipeptídeo TAT que não contém opeptídeo de sinal descrito no presente, domínio extracelular de proteína depolipeptídeo TAT transmembrana, com ou sem o peptídeo de sinal, conformedescrito no presente, seqüência de aminoácidos codificada por qualquer dasseqüências de ácido nucleico descritas no presente ou qualquer outrofragmento especificamente definido de seqüência de aminoácidos depolipeptídeo TAT de comprimento total conforme descrito no presente.
Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se apolipeptídeo TAT isolado que compreende seqüência de aminoácidos quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüências de aminoácidos,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% deidentidade de seqüências de aminoácidos para seqüência de aminoácidoscodificada por qualquer dos cDNAs de proteína humana depositados junto àATCC conforme descrito no presente.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se apolipeptídeo TAT isolado que compreende seqüência de aminoácidos que écodificada por seqüência de nucleotídeos que se hibridiza no complemento demolécula de DNA que codifica (a) polipeptídeo TAT que contém seqüência deaminoácidos de comprimento total conforme descrito no presente, (b)seqüência de aminoácidos de polipeptídeo TAT que não contém o peptídeo desinal conforme descrito no presente, (c) domínio extracelular de polipeptídeoTAT transmembrana, com ou sem o peptídeo de sinal, conforme descrito nopresente, (d) seqüência de aminoácidos codificada por qualquer dasseqüências de ácidos nucleicos descritas no presente ou (e) qualquer outrofragmento especificamente definido de seqüência de aminoácidos depolipeptídeo TAT de comprimento total conforme descrito no presente.
Em aspecto específico, a presente invenção fornece polipeptídeo TATisolado sem a seqüência de sinal N-terminal e/ou sem a metionina inicial e écodificado por seqüência de nucleotídeos que codifica essa seqüência deaminoácidos conforme descrito acima no presente. Processos de sua produçãotambém são descritos no presente, em que esses processos compreendem ocultivo de célula hospedeira que compreende vetor que compreende a molécula deácido nucleico codificadora apropriada sob condições adequadas para a expressãodo polipeptídeo TAT e recuperação do polipeptídeo TAT do cultivo celular.
Outro aspecto da presente invenção fornece polipeptídeo TATisolado que possui domínio transmembrana excluído ou domíniotransmembrana desativado. Processos de sua produção também são descritosno presente, em que esses processos compreendem o cultivo de célulahospedeira que compreende vetor que compreende a molécula de ácidonucleico codificadora apropriada sob condições adequadas para a expressãodo polipeptídeo TAT e recuperação do polipeptídeo TAT do cultivo celular.
Em outras realizações da presente invenção, a presente invençãofornece vetores que compreendem DNA que codifica qualquer dospolipeptídeos descritos no presente. Também são fornecidas célulashospedeiras que compreendem qualquer desses vetores. Como forma deexemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli oucélulas de levedura. Processo de produção de qualquer dos polipeptídeosdescritos no presente é adicionalmente fornecido e compreende o cultivo decélulas hospedeiras sob condições apropriadas para expressão do polipeptídeodesejado e recuperação do polipeptídeo desejado do cultivo celular.
Em outras realizações, a presente invenção fornece polipeptídeosquiméricos isolados que compreendem qualquer dos polipeptídeos TATdescritos no presente fundidos a polipeptídeo heterólogo (não de TAT).
Exemplo dessas moléculas quiméricas compreende qualquer dos polipeptídeosTAT descritos no presente fundidos a polipeptídeo heterólogo, tal comoseqüência de marca de epítopos ou região Fc de imunoglobulina.
Em outra realização, a presente invenção fornece anticorpo quese une, preferencialmente de forma específica, a qualquer dos polipeptídeosdescritos acima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é anticorpo monoclonal,fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpode fita única ou anticorpo que inibe competitivamente a união de anticorpo anti-polipeptídeo TAT ao seu epítopo antigênico correspondente. Os anticorpos deacordo com a presente invenção podem ser opcionalmente conjugados aagente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como toxina que inclui,por exemplo, maitansinóide ou caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo,enzima nucleolítica ou similares. Os anticorpos de acordo com a presenteinvenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO ou célulasbacterianas e inibem preferencialmente o crescimento ou a proliferação decélula à qual se unem, ou induzem sua morte. Para fins de diagnóstico, osanticorpos de acordo com a presente invenção podem ser marcados de formadetectável, fixados a suporte sólido ou similar.Em outras realizações da presente invenção, a presente invençãofornece vetores que compreendem DNA que codifica qualquer dos anticorposdescritos no presente. Também são fornecidas células hospedeiras quecompreendem qualquer desses vetores. Como forma de exemplo, as célulashospedeiras podem ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura.Processo de produção de qualquer dos anticorpos descritos no presente éadicionalmente fornecido e compreende o cultivo de células hospedeiras sobcondições apropriadas para expressão do anticorpo desejado e recuperação doanticorpo desejado do cultivo celular.
Em outra realização, a presente invenção fornece oligopeptídeos("oligopeptídeos de união de TAT") que se unem, preferencialmente de formaespecífica, a qualquer dos polipeptídeos TAT descritos acima ou abaixo.Opcionalmente, os oligopeptídeos de união de TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser conjugados a agente inibidor do crescimento ou agentecitotóxico tal como toxina, que inclui, por exemplo, maitansinóide oucaliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo, enzima nucleolítica ou similares.Os oligopeptídeos de união de TAT de acordo com a presente invenção podemser opcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas e inibempreferencialmente o crescimento ou a proliferação de célula à qual se unem, ouinduzem sua morte. Para fins de diagnóstico, os oligopeptídeos de união deTAT de acordo com a presente invenção podem ser marcados de formadetectável, fixados a suporte sólido ou similar.
Em outras realizações da presente invenção, a presente invençãofornece vetores que compreendem DNA que codifica qualquer dosoligopolipeptídeos de união de TAT descritos no presente. Também sãofornecidas células hospedeiras que compreendem qualquer desses vetores.Como forma de exemplo, as células hospedeiras podem ser células CHO,células de E. coli ou células de levedura. Processo de produção de qualquerdos oligopolipeptídeos de união de TAT descritos no presente é adicionalmentefornecido e compreende o cultivo de células hospedeiras sob condiçõesapropriadas para expressão do oligopolipeptídeo desejado e recuperação dooligopolipeptídeo desejado do cultivo celular.
Em outra realização, a presente invenção fornece moléculasorgânicas pequenas ("moléculas orgânicas de união de TAT) que se unem,preferencialmente de forma específica, a qualquer dos polipeptídeos TAT descritosacima ou abaixo. Opcionalmente, as moléculas orgânicas de união de TAT deacordo com a presente invenção podem ser conjugadas a agente inibidor docrescimento ou agente citotóxico tal como toxina, que inclui, por exemplo,maitansinóide ou caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo, enzima nucleolíticaou similares. As moléculas orgânicas de união de TAT de acordo com a presenteinvenção inibem preferencialmente o crescimento ou a proliferação de célula à qualse unem, ou induzem a sua morte. Para fins de diagnóstico, as moléculas orgânicasde união de TAT de acordo com a presente invenção podem ser marcadas deforma detectável, fixadas a suporte sólido ou similar.
Em ainda outra realização, a presente invenção refere-se acomposição de matéria que compreende polipeptídeo TAT conforme descritono presente, polipeptídeo TAT quimérico conforme descrito no presente,anticorpo anti-TAT conforme descrito no presente, oligopeptídeo de união deTAT conforme descrito no presente ou molécula orgânica de união de TATconforme descrito no presente, em combinação com veículo. Opcionalmente, oveículo é veículo farmaceuticamente aceitável.
Em ainda outra realização, a presente invenção refere-se a artigoindustrializado que compreende recipiente e composição de matéria contida nointerior do recipiente, em que a composição de matéria pode compreenderpolipeptídeo TAT conforme descrito no presente, polipeptídeo TAT quiméricoconforme descrito no presente, anticorpo anti-TAT conforme descrito nopresente, oligopeptídeo de união de TAT conforme descrito no presente oumolécula orgânica de união de TAT conforme descrito no presente. O artigopode ainda compreender opcionalmente marca afixada ao recipiente ou bulaincluída com o recipiente, referente ao uso da composição de matéria para otratamento terapêutico ou a detecção diagnostica de tumor.
Outra realização da presente invenção refere-se ao uso depolipeptídeo TAT conforme descrito no presente, polipeptídeo TAT quiméricoconforme descrito no presente, anticorpo anti-polipeptídeo TAT conformedescrito no presente, oligopeptídeo de união de TAT conforme descrito nopresente ou molécula orgânica de união de TAT conforme descrito no presente,para a preparação de medicamento útil no tratamento de condição que reageao polipeptídeo TAT, polipeptídeo TAT quimérico, anticorpo anti-polipeptídeoTAT, oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união de TAT.
Outras realizações da presente invenção referem-se a qualqueranticorpo isolado que compreende uma ou mais dentre as seqüências HVR-L1,HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 ou HVR-H3 descritas no presente ou qualqueranticorpo que se una ao mesmo epítopo de qualquer desses anticorpos.
B. Realizações Adicionais
Outra realização da presente invenção refere-se a método deinibição do crescimento de célula que expressa polipeptídeo TAT, em que ométodo compreende o contato da célula com anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica pequena que se une ao polipeptídeo TAT, em que a uniãodo anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica ao polipeptídeo TAT causainibição do crescimento da célula que expressa o polipeptídeo TAT. Emrealizações preferidas, a célula é célula cancerosa e a união do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica ao polipeptídeo TAT causa a morte dacélula que expressa o polipeptídeo TAT. Opcionalmente, o anticorpo éanticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado ou anticorpo de fita única. Os anticorpos, oligopeptídeos de uniãode TAT e moléculas orgânicas de união de TAT empregados nos métodos deacordo com a presente invenção podem ser opcionalmente conjugados aagente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como toxina, que inclui,por exemplo, maitansinóide ou caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo,enzima nucleolítica ou similares. Os anticorpos e oligopeptídeos de união deTAT empregados nos métodos de acordo com a presente invenção podem seropcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a método detratamento terapêutico de mamífero que possui tumor canceroso que compreendecélulas que expressam polipeptídeo TAT, em que o método compreende aadministração ao mamífero de quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se une ao polipeptídeo TAT, deforma a resultar no tratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, oanticorpo é anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico,anticorpo humanizado ou anticorpo de fita única. Os anticorpos, oligopeptídeos deunião de TAT e moléculas orgânicas de união de TAT empregados nos métodos deacordo com a presente invenção podem ser opcionalmente conjugados a agenteinibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como toxina, que inclui, por exemplo,maitansinóide ou caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo, enzima nucleolíticaou similares. Os anticorpos e oligopeptídeos empregados nos métodos de acordocom a presente invenção podem ser opcionalmente produzidos em células CHO oucélulas bacterianas.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a métodode determinação da presença de polipeptídeo TAT em amostra suspeita deconter o polipeptídeo TAT, em que o método compreende a exposição daamostra a anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se uneao polipeptídeo TAT e determinação da união do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica ao polipeptídeo TAT na amostra, em que a presença dessaunião indica a presença do polipeptídeo TAT na amostra. Opcionalmente, aamostra pode conter células (que podem ser células cancerosas) suspeitas deexpressarem o polipeptídeo TAT. O anticorpo, oligopeptídeo de união de TATou molécula orgânica de união de TAT empregada no método pode seropcionalmente marcada de forma detectável, fixada a suporte sólido ou similar.
Realização adicional da presente invenção refere-se a método dediagnóstico da presença de tumor em mamíferos, em que o métodocompreende a detecção do nível de expressão de gene que codificapolipeptídeo TAT (a) em amostra de teste de células de tecido obtidas a partirdo mencionado mamífero e (b) em amostra de controle de células nãocancerosas normais conhecidas da mesma origem ou tipo de tecido, em quenível de expressão mais alto do polipeptídeo TAT na amostra de teste, emcomparação com a amostra controle, indica a presença de tumor no mamíferodo qual a amostra de teste foi obtida.
Outra realização da presente invenção refere-se a método dediagnóstico da presença de tumor em mamíferos, em que o métodocompreende (a) contato de amostra de teste que compreende células de tecidoobtidas do mamífero com anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânicapequena que se une a polipeptídeo TAT e (b) detecção da formação decomplexo entre o anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena e opolipeptídeo TAT na amostra de teste, em que a formação de complexo indicaa presença de tumor no mamífero. Opcionalmente, o anticorpo, oligopeptídeode união de TAT ou molécula orgânica de união de TAT empregada éopcionalmente marcado de forma detectável, fixado a suporte sólido ou similare/ou a amostra de teste de células de tecido é obtida a partir de indivíduosuspeito de ter tumor canceroso.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a métodode tratamento ou prevenção de disfunção proliferatíva celular associada àexpressão ou atividade alterada, preferencialmente aumentada, de polipeptídeoTAT, em que o método compreende a administração a paciente necessitadodesse tratamento de quantidade eficaz de antagonista de polipeptídeo TAT.Preferencialmente, a disfunção proliferatíva celular é câncer e o antagonista dopolipeptídeo TAT é anticorpo anti-polipeptídeo TAT, oligopeptídeo de união deTAT, molécula orgânica de união de TAT ou oligonucleotídeo sem sentido.Tratamento ou prevenção eficaz da disfunção proliferatíva celular pode serresultado de morte direta ou inibição do crescimento de células que expressampolipeptídeo TAT ou por meio de antagonização da atividade potencializadorado crescimento celular de polipeptídeo TAT.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a método deunião de anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena a célula queexpressa polipeptídeo TAT, em que o método compreende o contato de célula queexpressa polipeptídeo TAT com o mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica pequena sob condições que são apropriadas para a união do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena ao mencionado polipeptídeo TAT epermissão da união entre eles. Em realizações preferidas, o anticorpo é marcadocom molécula ou composto que é útil para deteminar qualitativa e/ouquantitativamente a localização e/ou a quantidade de união do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena à célula.
Outras realizações da presente invenção referem-se ao uso de (a)polipeptídeo TAT, (b) ácido nucleico que codifica polipeptídeo TAT ou vetor oucélula hospedeira que compreende aquele ácido nucleico, (c) anticorpo anti-polipeptídeo TAT, (d) oligopeptídeo de união de TAT ou (e) molécula orgânicapequena de união de TAT na preparação de medicamento útil para (i) otratamento terapêutico ou detecção por diagnóstico de câncer ou tumor; ou (ii)o tratamento terapêutico ou prevenção de disfunção proliferatíva celular.Outra realização da presente invenção refere-se a método deinibição do crescimento de célula cancerosa, em que o crescimento damencionada célula cancerosa depende ao menos em parte do(s) efeito(s)potencializador(es) do crescimento de polipeptídeo TAT (em que o polipeptídeoTAT pode ser expresso pela própria célula cancerosa ou por célula que produzpolipeptídeo(s) que possui(em) efeito potencializador do crescimento sobrecélulas cancerosas), em que o método compreende o contato do polipeptídeoTAT com anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se uneao polipeptídeo TAT, de forma a antagonizar a atividade potencializadora docrescimento do polipeptídeo TAT e, por sua vez, inibir o crescimento da célulacancerosa. Preferencialmente, o crescimento da célula cancerosa écompletamente inibido. De preferência ainda maior, a união do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena ao polipeptídeo TAT induz amorte da célula cancerosa. Opcionalmente, o anticorpo é anticorpo monoclonal,fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ouanticorpo de fita única. Os anticorpos, oligopeptídeos de união de TAT emoléculas orgânicas de união de TAT empregados nos métodos de acordocom a presente invenção podem ser opcionalmente conjugados a agenteinibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como toxina, que inclui, porexemplo, maitansinóide ou caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo,enzima nucleolítica ou similares. Os anticorpos e oligopeptídeos de união deTAT empregados nos métodos de acordo com a presente invenção podem seropcionalmente produzidos em células CHO ou células bacterianas.
Ainda outra realização da presente invenção refere-se a métodode tratamento terapêutico de tumor em mamífero, em que o crescimento domencionado tumor depende ao menos em parte do(s) efeito(s)potencializador(es) do crescimento de polipeptídeo TAT, em que o métodocompreende a administração ao mamífero de quantidade terapeuticamenteeficaz de anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se uneao polipeptídeo TAT, de forma a antagonizar a atividade potencializadora docrescimento do mencionado polipeptídeo TAT, resultando no tratamentoterapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, o anticorpo é anticorpomonoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado ou anticorpo de fita única. Os anticorpos, oligopeptídeos de uniãode TAT e moléculas orgânicas de união de TAT empregados nos métodos deacordo com a presente invenção podem ser opcionalmente conjugados aagente inibidor do crescimento ou agente citotóxico tal como toxina, que inclui,por exemplo, maitansinóide ou caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo,enzima nucleolítica ou similares. Os anticorpos e oligopeptídeos empregadosnos métodos de acordo com a presente invenção podem ser opcionalmenteproduzidos em células CHO ou células bacterianas.
C. Outras Realizações Adicionais
Em ainda outras realizações, a presente invenção refere-se aoconjunto de potenciais reivindicações a seguir para o presente pedido:
1. Ácido nucleico isolado que contém seqüência denucleotídeos que possui pelo menos 80% de identidade de seqüências deácido nucleico para:
(a) molécula de DNA que codifica a seqüência de aminoácidosexibida como SEQ ID N° 2;
(b) molécula de DNA que codifica a seqüência de aminoácidosexibida como SEQ ID N° 2 sem o seu peptídeo de sinal associado;
(c) molécula de DNA que codifica domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) molécula de DNA que codifica domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1;(f) seqüência de codificação de comprimento total daseqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).
2. Ácido nucleico isolado que contém:
(a) seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência deaminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência deaminoácidos exibida como SEQ ID N° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de nucleotídeos que codifica domínioextracelular do polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com o seu peptídeo desinal associado;
(d) seqüência de nucleotídeos que codifica domínioextracelular do polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seu peptídeo desinal associado;
(e) seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1;
(f) região de codificação de comprimento total da seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).
3. Ácido nucleico isolado que se hibridiza em:
(a) ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácidosexibida como SEQ ID N° 2;
(b) ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácidosexibida como SEQ ID N° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(c) ácido nucleico que codifica domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) ácido nucleico que codifica domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1;(f) região de codificação de comprimento total da seqüênciade nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f)-
4. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, em que ahibridização ocorre sob condições estringentes.
5. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, que possuipelo menos cerca de cinco nucleotídeos de comprimento.
6. Vetor de expressão que compreende o ácido nucleico deacordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3.
7. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 6, emque o mencionado ácido nucleico é ligado operativamente a seqüências decontrole reconhecidas por célula hospedeira transformada com o vetor.
8. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressãode acordo com a reivindicação 7.
9. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8, que écélula de CHO, célula de E. coli ou célula de levedura.
10. Processo de produção de polipeptídeo que compreende ocultivo da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8 sob condiçõesapropriadas para expressão do mencionado polipeptídeo e recuperação domencionado polipeptídeo do cultivo celular.
11. Polipeptídeo isolado que possui pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1.
12. Polipeptídeo isolado que contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 sema sua seqüência de peptídeo de sinal associada;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDN°1.
13. Polipeptídeo quimérico que compreende o polipeptídeo deacordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12 fundido a polipeptídeo heterólogo.
14. Polipeptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 13,em que o mencionado polipeptídeo heterólogo é seqüência de marca deepítopo ou região Fc de imunoglobulina.
15. Anticorpo isolado que se une a polipeptídeo que possuipelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1.
16. Anticorpo isolado que se une a polipeptídeo que possui:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDN°1.
17. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou 16, que é anticorpo monoclonal.
18. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é fragmento de anticorpo.
19. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é anticorpo humanizado ou quimérico.
20. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é conjugado a agente inibidor do crescimento.
21. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é conjugado a agente citotoxico.
22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, em que oagente citotoxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, em que oagente citotoxico é toxina.
24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
25. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, em que atoxina é maitansinóide.
26. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é produzido em bactérias.
27. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é produzido em células de CHO.
28. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que induz a morte de célula à qual se une.
29. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou16, que é marcado de forma detectável.
30. Ácido nucleico isolado que contém seqüência denucleotídeos que codifica o anticorpo de acordo com qualquer dasreivindicações 15 ou 16.31. Vetor de expressão que compreende o ácido nucleico deacordo com a reivindicação 30, ligado operativamente a seqüências de controlereconhecidas por célula hospedeira transformada com o vetor.
32. Célula hospedeira que compreende o vetor de expressãode acordo com a reivindicação 31.
33. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 32, que écélula de CHO, célula de E. coli ou célula de levedura.
34. Processo de produção de anticorpo que compreende ocultivo da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 32 sob condiçõesapropriadas para expressão do mencionado anticorpo e recuperação domencionado anticorpo do cultivo celular.
35. Oligopeptídeo isolado que se une a polipeptídeo que possuipelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1.
36. Oligopeptídeo isolado que se une a polipeptídeo que possui:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ IDN° 1.
37. Oligopeptídeo de acordo com qualquer das reivindicações35 ou 36, que é conjugado a agente inibidor do crescimento.
38. Oligopeptídeo de acordo com qualquer das reivindicações35 ou 36, que é conjugado a agente citotóxico.
39. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 38, em que oagente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
40. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 38, em que oagente citotóxico é toxina.
41. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 40, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
42. Oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 40, em que atoxina é maitansinóide.
43. Oligopeptídeo de acordo com qualquer das reivindicações35 ou 36, que induz a morte de célula à qual se une.
44. Oligopeptídeo de acordo com qualquer das reivindicações35 ou 36, que é marcado de forma detectável.
45. Molécula orgânica de união de TAT que se une apolipeptídeo que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1.
46. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 45, quese une a polipeptídeo que contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N°1.
47. Molécula orgânica de acordo com qualquer dasreivindicações 45 ou 46, que é conjugada a agente inibidor do crescimento.
48. Molécula orgânica de acordo com qualquer dasreivindicações 45 ou 46, que é conjugada a agente citotóxico.
49. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 48, emque o agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
50. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 48, emque o agente citotóxico é toxina.
51. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 50, emque a toxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
52. Molécula orgânica de acordo com a reivindicação 50, emque a toxina é maitansinóide.
53. Molécula orgânica de acordo com qualquer dasreivindicações 45 ou 46, que induz a morte de célula à qual se une.
54. Molécula orgânica de acordo com qualquer dasreivindicações 45 ou 46, que é marcada de forma detectável.
55. Composição de matéria que compreende:
(a) polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11;
(b) polipeptídeo de acordo com a reivindicação 12;
(C) polipeptídeo quimérico de acordo com a reivindicação 13;
(d) anticorpo de acordo com a reivindicação 15;
(e) anticorpo de acordo com a reivindicação 16;
(f) oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 35;(g) oligopeptídeo de acordo com a reivindicação 36;
(h) molécula orgânica de união de TAT de acordo com areivindicação 45; ou
(i) molécula orgânica de união de TAT de acordo com areivindicação 46; em combinação com veículo.
56. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 55,em que o mencionado veículo é veículo farmaceuticamente aceitável.
57. Artigo industrializado que compreende:
(a) recipiente; e
(b) composição de matéria de acordo com a reivindicação 55contida no interior do mencionado recipiente.
58. Artigo industrializado de acordo com a reivindicação 57,que compreende adicionalmente rótulo afixado ao mencionado recipiente oubula incluída com o mencionado recipiente, referente ao uso da mencionadacomposição de matéria para o tratamento terapêutico ou a detecçãodiagnostica de câncer.
59. Método de inibição do crescimento de célula que expressaproteína que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ ID
N° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada célulacom anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se une à mencionadaproteína, de forma que a união do mencionado anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica à mencionada proteína cause inibição do crescimento damencionada célula.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é anticorpo monoclonal.
61. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é fragmento de anticorpo.
62. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é anticorpo quimérico ou humanizado.
63. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente inibidor do crescimento.
64. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente citotóxico.
65. Método de acordo com a reivindicação 64, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
66. Método de acordo com a reivindicação 64, em que oagente citotóxico é toxina.
67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a toxinaé selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
68. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a toxinaé maitansinóide.
69. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
70. Método de acordo com a reivindicação 59, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
71. Método de acordo com a reivindicação 59, em que amencionada célula é célula cancerosa.
72. Método de acordo com a reivindicação 71, em que amencionada célula cancerosa é adicionalmente exposta a tratamento comradiação ou agente quimioterapêutico.
73. Método de acordo com a reivindicação 71, em que amencionada célula cancerosa é selecionada a partir do grupo que consiste de célulade câncer de mama, célula de câncer colo-retal, célula de câncer do pulmão, célulade câncer do ovário, célula de câncer do sistema nervoso central, célula de câncerdo fígado, célula de câncer da bexiga, célula de câncer pancreatico, célula decâncer da cervical, célula de melanoma e célula de leucemia.
74. Método de acordo com a reivindicação 71, em que amencionada proteína é expressa mais abundantemente pela mencionada célulacancerosa em comparação com célula normal da mesma origem de tecido.
75. Método de acordo com a reivindicação 59, que causa amorte da mencionada célula.
76. Método de acordo com a reivindicação 59, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N° 1.
77. Método de tratamento terapêutico de mamífero que possuitumor canceroso que compreende células que expressam proteína que possuipelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende a administração ao mencionadomamífero de quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo, oligopeptídeoou molécula orgânica que se une à mencionada proteína, de forma a tratareficientemente o mencionado mamífero.
78. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é anticorpo monoclonal.
79. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é fragmento de anticorpo.
80. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é anticorpo quimérico ou humanizado.
81. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente inibidor do crescimento.
82. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente citotoxico.
83. Método de acordo com a reivindicação 82, em que omencionado agente citotoxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
84. Método de acordo com a reivindicação 82, em que oagente citotoxico é toxina.
85. Método de acordo com a reivindicação 84, em que a toxinaé selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
86. Método de acordo com a reivindicação 84, em que a toxinaé maitansinóide.
87. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
88. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
89. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado tumor é adicionalmente exposto a tratamento com radiação ouagente quimioterapêutico.90. Método de acordo com a reivindicação 77, em que omencionado tumor é tumor de mama, tumor colo-retal, tumor do pulmão, tumordo ovário, tumor do sistema nervoso central, tumor do fígado, tumor da bexiga,tumor pancreático ou tumor cervical.
91. Método de acordo com a reivindicação 77, em que amencionada proteína é expressa mais abundantemente pelas célulascancerosas do mencionado tumor em comparação com célula normal damesma origem de tecido.
92. Método de acordo com a reivindicação 77, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ ID N° 1.
93. Método de determinação da presença de proteína em amostrasuspeita de conter a mencionada proteína, em que a mencionada proteína possuipelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende a exposição da mencionadaamostra a anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se une àmencionada proteína e determinação da união do mencionado anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionada proteína na mencionadaamostra, em que a união do anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica àmencionada proteína indica a presença da mencionada proteína namencionada amostra.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, em que amencionada amostra compreende célula suspeita de expressar a mencionadaproteína.
95. Método de acordo com a reivindicação 94, em que amencionada célula é célula cancerosa.
96. Método de acordo com a reivindicação 93, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é marcado de formadetectável.
97. Método de acordo com a reivindicação 93, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 sema sua seqüência de peptídeo de sinal associada;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQ IDN° 1.
98. Método de diagnóstico da presença de tumor emmamíferos, em que o mencionado método compreende a determinação donível de expressão de gene que codifica proteína que possui pelo menos 80%de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1 emamostra de teste de células de tecido obtidas do mencionado mamífero e emamostra de controle de células normais conhecidas da mesma origem detecido, em que nível mais alto de expressão da mencionada proteína naamostra de teste, em comparação com a amostra controle, indica a presençade tumor no mamífero do qual a amostra de teste foi obtida.
99. Método de acordo com a reivindicação 98, em que a etapade determinação do nível de expressão de gene que codifica a mencionadaproteína compreende o emprego de oligonucleotídeo em hibridização in situ ouanálise RT-PCR.
100. Método de acordo com a reivindicação 98, em que a etapade determinação do nível de expressão de gene que codifica a mencionadaproteína compreende o emprego de anticorpo em análise deimunohistoquímica ou Western Blot.
101. Método de acordo com a reivindicação 98, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDNM.
102. Método de diagnóstico da presença de tumor emmamíferos, em que o mencionado método compreende o contato de amostrade teste de células de tecido obtidas do mencionado mamífero com anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que se une a proteína que possui pelomenos 80% de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1 edetecção da formação de complexo entre o mencionado anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica e a mencionada proteína na amostra deteste, em que a formação de complexo indica a presença de tumor nomencionado mamífero.
103. Método de acordo com a reivindicação 102, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é marcado de formadetectável.
104. Método de acordo com a reivindicação 102, em que amencionada amostra de teste de células de tecido é obtida a partir de indivíduosuspeito de ter tumor canceroso.
105. Método de acordo com a reivindicação 102, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDN°1.
106. Método de tratamento ou prevenção de disfunçãoproliferativa celular associada ao aumento da expressão ou atividade deproteína que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende a administração a pacientenecessitado desse tratamento de quantidade eficaz de antagonista damencionada proteína, de forma a tratar ou evitar eficientemente a mencionadadisfunção proliferativa celular.
107. Método de acordo com a reivindicação 106, em que amencionada disfunção proliferativa celular é câncer.
108. Método de acordo com a reivindicação 106, em que omencionado antagonista é anticorpo anti-polipeptídeo TAT, oligopeptídeo de uniãode TAT, molécula orgânica de união de TAT ou oligonucleotídeo sem sentido.
109. Método de união de anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica a célula que expressa proteína que possui pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada célulacom anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se une à mencionadaproteína, de forma a permitir a ocorrência da união do anticorpo, oligopeptídeoou molécula orgânica à mencionada proteína e unir o mencionado anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionada célula.
110. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é anticorpo monoclonal.
111. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é fragmento de anticorpo.
112. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é anticorpo quimérico ou humanizado.
113. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente inibidor do crescimento.
114. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente citotóxico.
115. Método de acordo com a reivindicação 114, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
116. Método de acordo com a reivindicação 114, em que oagente citotóxico é toxina.
117. Método de acordo com a reivindicação 116, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
118. Método de acordo com a reivindicação 116, em que atoxina é maitansinóide.
119. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
120. Método de acordo com a reivindicação 109, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.121. Método de acordo com a reivindicação 109, em que amencionada célula é célula cancerosa.
122. Método de acordo com a reivindicação 121, em que amencionada célula cancerosa é adicionalmente exposta a tratamento comradiação ou agente quimioterapêutico.
123. Método de acordo com a reivindicação 121, em que amencionada célula cancerosa é selecionada a partir do grupo que consiste de célulade câncer de mama, célula de câncer colo-retal, célula de câncer do pulmão, célulade câncer do ovário, célula de câncer do sistema nervoso central, célula de câncerdo fígado, célula de câncer da bexiga, célula de câncer pancreático, célula decâncer da cervical, célula de melanoma e célula de leucemia.
124. Método de acordo com a reivindicação 123, em que amencionada proteína é expressa mais abundantemente pela mencionada célulacancerosa em comparação com célula normal da mesma origem de tecido.
125. Método de acordo com a reivindicação 109, que causa amorte da mencionada célula.
126. Uso de ácido nucleico de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
127. Uso de ácido nucleico de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de medicamento para o tratamentode tumor.
128. Uso de ácido nucleico de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de medicamento para o tratamentoou prevenção de disfunção proliferativa celular.
129. Uso de vetor de expressão de acordo com qualquer dasreivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.130. Uso de vetor de expressão de acordo com qualquer dasreivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de medicamento para o tratamento detumor.
131. Uso de vetor de expressão de acordo com qualquer dasreivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de medicamento para o tratamento ouprevenção de disfunção proliferativa celular.
132. Uso de célula hospedeira de acordo com qualquer dasreivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
133. Uso de célula hospedeira de acordo com qualquer dasreivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de medicamento para o tratamentode tumor.
134. Uso de célula hospedeira de acordo com qualquer dasreivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de medicamento para o tratamentoou prevenção de disfunção proliferativa celular.
135. Uso de polipeptídeo de acordo com qualquer dasreivindicações 11 a 14 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
136. Uso de polipeptídeo de acordo com qualquer dasreivindicações 11 a 14 na preparação de medicamento para o tratamento de tumor.
137. Uso de polipeptídeo de acordo com qualquer dasreivindicações 11 a 14 na preparação de medicamento para tratamento ouprevenção de disfunção proliferativa celular.
138. Uso de anticorpo de acordo com qualquer dasreivindicações 15 a 29 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
139. Uso de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações15 a 29 na preparação de medicamento para o tratamento de tumor.140. Uso de anticorpo de acordo com qualquer dasreivindicações 15 a 29 na preparação de medicamento para o tratamento ouprevenção de disfunção proliferativa celular.
141. Uso de oligopeptídeo de acordo com qualquer dasreivindicações 35 a 44 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
142. Uso de oligopeptídeo de acordo com qualquer dasreivindicações 35 a 44 na preparação de medicamento para o tratamento de tumor.
143. Uso de oligopeptídeo de acordo com qualquer dasreivindicações 35 a 44 na preparação de medicamento para o tratamento ouprevenção de disfunção proliferativa celular.
144. Uso de molécula orgânica de união de TAT de acordo comqualquer das reivindicações 45 a 54 na preparação de medicamento para otratamento terapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
145. Uso de molécula orgânica de união de TAT de acordo comqualquer das reivindicações 45 a 54 na preparação de medicamento para otratamento de tumor.
146. Uso de molécula orgânica de união de TAT de acordo comqualquer das reivindicações 45 a 54 na preparação de medicamento para otratamento ou prevenção de disfunção proliferativa celular.
147. Uso de composição de matéria de acordo com qualquerdas reivindicações 55 ou 56 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
148. Uso de composição de matéria de acordo com qualquerdas reivindicações 55 ou 56 na preparação de medicamento para o tratamentode tumor.
149. Uso de composição de matéria de acordo com qualquerdas reivindicações 55 ou 56 na preparação de medicamento para o tratamentoou prevenção de disfunção proliferativa celular.
150. Uso de artigo industrializado de acordo com qualquer dasreivindicações 57 ou 58 na preparação de medicamento para o tratamentoterapêutico ou detecção de diagnóstico de câncer.
151. Uso de artigo industrializado de acordo com qualquer dasreivindicações 57 ou 58 na preparação de medicamento para o tratamento detumor.
152. Uso de artigo industrializado de acordo com qualquer dasreivindicações 57 ou 58 na preparação de medicamento para o tratamento ouprevenção de disfunção proliferativa celular.
153. Método de inibição do crescimento de célula, em que ocrescimento da mencionada célula depende ao menos em parte de efeito depotêncialização do crescimento de proteína que possui pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada proteínacom anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se une à mencionadaproteína, de forma a inibir o crescimento da mencionada célula.154. Método de acordo com a reivindicação 153, em que amencionada célula é célula cancerosa.
155. Método de acordo com a reivindicação 153, em que amencionada proteína é expressa pela mencionada célula.
156. Método de acordo com a reivindicação 153, em que a uniãodo mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionadaproteína antagoniza atividade potencializadora do crescimento celular damencionada proteína.
157. Método de acordo com a reivindicação 153, em que a uniãodo mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionadaproteína induz a morte da mencionada célula.
158. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é anticorpo monoclonal.
159. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é fragmento de anticorpo.
160. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é anticorpo quimérico ou humanizado.
161. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente inibidor do crescimento.
162. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente citotóxico.
163. Método de acordo com a reivindicação 162, em que omencionado agente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
164. Método de acordo com a reivindicação 162, em que oagente citotóxico é toxina.165. Método de acordo com a reivindicação 164, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
166. Método de acordo com a reivindicação 164, em que atoxina é maitansinóide.
167. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
168. Método de acordo com a reivindicação 153, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
169. Método de acordo com a reivindicação 153, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 semo seu peptídeo de sinal associado;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDN°1.
170. Método de tratamento terapêutico de tumor em mamífero,em que o crescimento do mencionado tumor depende ao menos em parte deefeito de potencialização do crescimento de proteína que possui pelo menos80% de identidade de seqüência de aminoácidos para:
(a) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2;
(b) polipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem o seupeptídeo de sinal associado;
(c) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, com o seu peptídeo de sinal associado;
(d) domínio extracelular do polipeptídeo exibido como SEQ IDN° 2, sem o seu peptídeo de sinal associado;
(e) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeosexibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1,em que o mencionado método compreende o contato da mencionada proteínacom anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica que se une à mencionadaproteína, de forma a tratar efetivamente o mencionado tumor.
171. Método de acordo com a reivindicação 170, em que amencionada proteína é expressa pelas células do mencionado tumor.
172. Método de acordo com a reivindicação 170, em que a uniãodo mencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à mencionadaproteína antagoniza atividade potencializadora do crescimento celular damencionada proteína.
173. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é anticorpo monoclonal.
174. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é fragmento de anticorpo.
175. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é anticorpo quimérico ou humanizado.
176. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente inibidor do crescimento.
177. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é conjugado aagente citotoxico.
178. Método de acordo com a reivindicação 177, em que omencionado agente citotoxico é selecionado a partir do grupo que consiste detoxinas, antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
179. Método de acordo com a reivindicação 177, em que oagente citotoxico é toxina.
180. Método de acordo com a reivindicação 179, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
181. Método de acordo com a reivindicação 179, em que atoxina é maitansinóide.
182. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é produzido em bactérias.
183. Método de acordo com a reivindicação 170, em que omencionado anticorpo é produzido em células de CHO.
184. Método de acordo com a reivindicação 170, em que amencionada proteína contém:
(a) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2;
(b) seqüência de aminoácidos exibida como SEQ ID N° 2 sema sua seqüência de peptídeo de sinal associada;
(c) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, com a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(d) seqüência de aminoácidos de domínio extracelular dopolipeptídeo exibido como SEQ ID N° 2, sem a sua seqüência de peptídeo desinal associada;
(e) seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos exibida como SEQ ID N° 1; ou
(f) seqüência de aminoácidos codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeos exibida comoSEQIDN°1.
186. Anticorpo isolado que se une ao mesmo epítopo unido poranticorpo produzido por qualquer das linhagens de células de hibridomaexibidas na Tabela 11.
187. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éanticorpo monoclonal.
188. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éfragmento de anticorpo.
189. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éanticorpo humanizado ou quimérico.
190. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éconjugado a agente inibidor do crescimento.
191. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éconjugado a agente citotóxico.
192. Anticorpo de acordo com a reivindicação 191, em que oagente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
193. Anticorpo de acordo com a reivindicação 191, em que oagente citotóxico é toxina.
194. Anticorpo de acordo com a reivindicação 193, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.195. Anticorpo de acordo com a reivindicação 193, em que atoxina é maitansinóide.
196. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éproduzido em bactéria.
197. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que éproduzido em células de CHO.
198. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que induz amorte de célula à qual se une.
199. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, que émarcado de forma detectável.
200. Anticorpo de acordo com a reivindicação 186, quecompreende pelo menos uma das regiões de determinação decomplementaridade de qualquer anticorpo produzido por qualquer daslinhagens de células de hibridoma exibidas na Tabela 11.
201. Anticorpo monoclonal produzido por qualquer das célulasde hibridoma exibidas na Tabela 11.
202. Célula de hibridoma que produz anticorpo monoclonal quese une a polipeptídeo TAT.
203. Método de identificação de anticorpo que se une a epítopounido por anticorpo produzido por qualquer das linhagens de células dehibridoma exibidas na Tabela 11, em que o mencionado método compreende adeterminação da capacidade de primeiro anticorpo de bloquear a união desegundo anticorpo produzido por qualquer das linhagens de células dehibridoma exibidas na Tabela 11a polipeptídeo TAT, em que a capacidade domencionado primeiro anticorpo de bloquear a união do mencionado segundoanticorpo ao mencionado polipeptídeo TAT em pelo menos 40% e emconcentrações iguais de anticorpo indica que o mencionado primeiro anticorpoé capaz de unir-se a epítopo unido pelo mencionado segundo anticorpo.Outras realizações adicionais da presente invenção serãoevidentes para os técnicos no assunto mediante leitura do presente relatóriodescritivo.
Breve Descrição das Figuras
As Figuras 1A-E exibem seqüência de nucleotídeos (SEQ ID N° 1)de cDNA de TAT10772, em que SEQ ID N° 1 é clone denominado no presente"DNA772".
As Figuras 2A-B exibem a seqüência de aminoácidos (SEQ ID N°2) derivada da seqüência de codificação de SEQ ID N° 1 exibida na Figura 1.
A Figura 3 ilustra alinhamento de seqüências de aminoácidos dascadeias leves variáveis para o seguinte: seqüência de consenso de subgrupo Ihumano de cadeia leve (huKI; SEQ ID N° 3); anticorpo anti-TAT10772 11D10murino (mu11D10-L; SEQ ID N° 4) e anticorpo "humanizado" enxertado anti-TAT10772 11D10 (enxerto de 11D10; SEQ ID N° 5).
A Figura 4 ilustra alinhamento de seqüências de aminoácidos dascadeias pesadas variáveis para o seguinte: seqüência de consenso desubgrupo III humano de cadeia pesada (hum III; SEQ ID N° 6); anticorpo anti-TAT10772 11D10 murino (mu11D10-H; SEQ ID N° 7) e anticorpo "humanizado"enxertado anti-TAT10772 11D10 (enxerto de 11D10; SEQ ID N° 8).
A Figura 5 ilustra alinhamento de seqüências de aminoácidos dascadeias leves variáveis para o seguinte: seqüência de consenso de subgrupohumano I de cadeia leve (huKI; SEQ ID N° 3); anticorpo anti-TAT10772 3A5murino (mu3A5-L; SEQ ID N° 9) e anticorpo "humanizado" enxertado anti-TAT10772 3A5 (enxerto de 3A5; SEQ ID N° 10).
As Figuras 6A-B ilustra alinhamento de seqüências deaminoácidos das cadeias pesadas variáveis para o seguinte: seqüência deconsenso de subgrupo III humano de cadeia pesada (hum III; SEQ ID N° 6);anticorpo anti-TAT10772 3A5 murino (mu3A5-H; SEQ ID N° 11); anticorpo"humanizado" enxertado anti-TAT10772 3A5 "variante L" (enxerto 3A5.L; SEQID N° 12); e anticorpo "humanizado" enxertado anti-TAT10772 3A5 "variante F"(enxerto 3A5.F; SEQ ID N° 13).
A Figura 7 exibe várias seqüências de HVR-L1 (SEQ ID N° 14-34)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 8 exibe várias seqüências de HVR-L2 (SEQ ID N° 35-58)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 9 exibe várias seqüências de HVR-L3 (SEQ ID N° 59-73)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 10 exibe várias seqüências de HVR-H1 (SEQ ID N° 74-93)de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 11 exibe várias seqüências de HVR-H2 (SEQ ID N° 94-112) de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidadeselecionados.
A Figura 12 exibe várias seqüências de HVR-H3 (SEQ ID N° 113-118) de anticorpos derivados de 11D10 amadurecidos por afinidadeselecionados.
A Figura 13 exibe seqüência de HVR-L1 (SEQ ID N° 119) deanticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 14 exibe várias seqüências de HVR-L2 (SEQ ID N° 120-121) de anticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 15 exibe seqüência de HVR-L3 (SEQ ID N° 122) deanticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 16 exibe seqüências de HVR-H1 (SEQ ID N° 123) deanticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
A Figura 17 exibe seqüências de HVR-H2 (SEQ ID N° 124-127)de anticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidade selecionados.
As Figuras 18A-B exibem seqüências de HVR-H3 (SEQ ID N°128-183) de anticorpos derivados de 3A5 amadurecidos por afinidadeselecionados.
A Figura 19 ilustra exemplos de seqüências de estrutura deconsenso humano receptoras para uso na prática da presente invenção comidentificadores de seqüências conforme segue: estrutura de consensosubgrupo I VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 184), estrutura deconsenso subgrupo I VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas(SEQ ID N° 185 a 187), estrutura de consenso subgrupo II VH humano menosCDRs de Kabat (SEQ ID N° 188), estrutura de consenso subgrupo II VHhumano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 189 a 191),estrutura de consenso subgrupo III VH humano menos CDRs de Kabat"variante L" (SEQ ID N° 192) e estrutura de consenso subgrupo III VH humanomenos CDRs de Kabat "variante F" (SEQ ID N° 193).
A Figura 20 ilustra exemplos de seqüências de estrutura deconsenso humano receptoras para uso na prática da presente invenção comidentificadores de seqüências conforme segue: estrutura de consensosubgrupo I VL capa humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 194), estruturade consenso subgrupo II VL capa humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N°195), estrutura de consenso subgrupo III VL capa humano menos CDRs deKabat (SEQ ID N° 196) e estrutura de consenso subgrupo IV VL capa humanomenos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 197).
As Figuras 21A e B exibem as seqüências de cadeia pesadavariável completas para os anticorpos a seguir: 3A5v1 (SEQ ID N° 198), 3A5v2(SEQ ID N° 199), 3A5v3 (SEQ ID N° 200), 3A5v4 (SEQ ID N° 201), 3A5v5(SEQ ID N° 202), 3A5v6 (SEQ ID N° 203), 3A5v7 (SEQ ID N° 204), 3A5v8(SEQ ID N° 205), 3A5v1b.52 (SEQ ID N° 206), 3A5v1b.54 (SEQ ID N° 207),3A5v4b.52 (SEQ ID N° 208) e 3A5v4b.54 (SEQ ID N° 2Ò9). Todos estesanticorpos contêm a seqüência de aminoácidos de cadeia leve variável huKI deSEQ ID N° 3.
A Figura 22 exibe as seqüências de cadeia leve variávelcompletas (SEQ ID N° 210-211) empregadas para certos anticorpos anti-TAT10772 descritos no presente.
A Figura 23 exibe a capacidade de vários anticorpos 3A5humanizados de inibir a união de 3A5 quimérico marcado com rutênio apolipeptídeo alvo TAT10772 com domínio 5' biotinilado. "h2H7 ctr" é anticorpocontrole negativo que não se une especificamente a TAT10772.
A Figura 24 exibe a capacidade de vários anticorpos 3A5humanizados de inibir a união de 3A5 quimérico marcado com rutênio apolipeptídeo CA125 biotinilado. "h2H7 ctr" é anticorpo controle negativo quenão se une especificamente a TAT10772.
A Figura 25 exibe os resultados de análise ELISA utilizando váriosanticorpos 3A5 humanizados para medir a união a células OVCAR-3. "h2H7ctr" é anticorpo controle negativo que não se une especificamente a TAT10772.
A Figura 26 exibe proliferação in vitro de células OVCAR-3 (queexpressam de forma endógena polipeptídeo TAT10772) após tratamento comanticorpos 11D10-vc-MMAF quiméricos ou 3A5-vc-MMAF quiméricos.
A Figura 27 exibe proliferação in vitro de células OVCAR-3 (queexpressam de forma endógena polipeptídeo TAT10772) após tratamento comanticorpos 11D10-VC-MMAE quiméricos ou 3A5-vc-MMAE quiméricos.
A Figura 28 exibe proliferação in vitro de células OVCAR-3 (queexpressam de forma endógena polipeptídeo TAT10772) após tratamento comanticorpo 11D10-MC-MMAF quiméricos ou 3A5-MC-MMAF quiméricos.
A Figura 29 exibe proliferação in vitro de células PC3transfectadas com vetor que permite a expressão por essas células depolipeptídeo TAT10772 (PC3/A5.3B2) ou células PC3 que não expressampolipeptídeo TAT10772 (PC3/neo) após tratamento com anticorpos 11D10-vc-MMAF quiméricos ou 3A5-vc-MMAF quiméricos.
A Figura 30 exibe proliferação in vitro de células PC3transfectadas com vetor que permite a expressão por essas células depolipeptídeo TAT10772 (PC3/A5.3B2) ou células PC3 que não expressampolipeptídeo TAT10772 (PC3/neo) após tratamento com anticorpos 11D10-vc-PAB-MMAE quiméricos ou 3A5-vc-PAB-MMAE quiméricos.
A Figura 31 exibe proliferação in vitro de células PC3transfectadas com vetor que permite a expressão por essas células depolipeptídeo TAT10772 (PC3/A5.3B2) ou células PC3 que não expressampolipeptídeo TAT10772 (PC3/neo) após tratamento com anticorpos 11D10-MC-MMAF quimérico ou 3A5-MC-MMAf quiméricos.
A Figura 32 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de injeção subcutânea) em tumores derivados de PC3-A5.3B2 apóstratamento com vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas,anticorpos de controle ou veículo isolado.
A Figura 33 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
A Figura 34 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
A Figura 35 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
A Figura 36 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(tumores de xenoenxerto em camundongos brutos, dez milhões de células porcamundongo) em tumores derivados de PC3/A5.3B2 após tratamento comvários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos de controleou veículo isolado.
A Figura 37 exibe medições de volume de tumor médio in vivo(modelo de transplante em almofada de gordura de mamíferos emcamundongo bege SCID) em tumores derivados de OVCAR-3 após tratamentocom vários anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinas, anticorpos decontrole ou veículo isolado.
Descrição Detalhada da Invenção
I. Definições
As expressões "polipeptídeo TAT" e "TAT", da forma utilizada nopresente e quando imediatamente seguidas por designação numérica,designam diversos polipeptídeos, em que a designação completa (ou seja,TAT/número) designa seqüências de polipeptídeos específicas conformedescrito no presente. As expressões "TAT/polipeptídeo número" e"TAT/número", em que o termo "número" é fornecido na forma de designaçãonumérica real da forma utilizada no presente, engloba polipeptídeos deseqüência nativa, variantes de polipeptídeos e fragmentos de polipeptídeos deseqüência nativa e variantes de polipeptídeos (que são adicionalmentedefinidos no presente). Os polipeptídeos TAT descritos no presente podem serisolados a partir de uma série de fontes, tais como a partir de tipos de tecidoshumanos ou de outra fonte, ou preparados por meio de métodos sintéticos e/ourecombinantes. A expressão "polipeptídeo TAT" designa cada polipeptídeoTAT/número individual descrito no presente. Todas as descrições no presenterelatório descritivo referentes ao "polipeptídeo TAT" designam cada um dospolipeptídeos individual e coletivamente. Descrições, por exemplo, dapreparação, purificação, derivação, formação de anticorpos para ou contra,formação de oligopeptídeos de união de TAT para ou contra, formação demoléculas orgânicas de união de TAT para ou contra, administração de,composições que contêm, tratamento de doença com etc. referem-se a cadapolipeptídeo de acordo com a presente invenção individualmente. A expressão"polipeptídeo TAT" também inclui variantes dos polipeptídeos TAT/númerodescritos no presente.
"Polipeptídeo TAT de seqüência nativa" compreende polipeptídeoque contém a mesma seqüência de aminoácidos do polipeptídeo TATcorrespondente derivado da natureza. Esses polipeptídeos TAT de seqüêncianativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meiossintéticos ou recombinantes. A expressão "polipeptídeo TAT de seqüêncianativa" engloba especificamente formas secretadas ou truncadas de ocorrêncianatural do polipeptídeo TAT específico (tais como seqüência de domínioextracelular), formas variantes de ocorrência natural (tais como formasalternativamente divididas) e variantes alélicas de ocorrência natural dopolipeptídeo. Em certas realizações da presente invenção, os polipeptídeosTAT de seqüência nativa descritos no presente são polipeptídeos de seqüêncianativa maduros ou de comprimento total que compreendem as seqüências deaminoácidos de comprimento total exibidas nas figuras anexas. Códons deinício e de parada (se indicados) são exibidos em negrito e sublinhados nasfiguras. Os resíduos de ácido nucleico indicados como "N" ou "X" nas figurasanexas são quaisquer resíduos de ácido nucleico. Embora se demonstre queos polipeptídeos TAT descritos nas figuras anexas começam com resíduos demetionina denominados no presente posição de aminoácido 1 nas figuras, épossível e concebível que outros resíduos de metionina localizados acima ouabaixo no fluxo a partir da posição de aminoácido 1 nas figuras possam serempregados como o resíduo de aminoácido inicial para os polipeptídeos TAT.
O "domínio extracelular" ou "ECD" de polipeptídeo TAT designauma forma do polipeptídeo TAT que é essencialmente livre dos domínioscitoplasmáticos e de transmembrana. Normalmente, ECD de polipeptídeo TATconterá menos de 1% desses domínios citoplasmáticos e/ou detransmembrana e, preferencialmente, conterá menos de cerca de 0,5% dessesdomínios. Compreender-se-á que quaisquer domínios de transmembranaidentificados para os polipeptídeos TAT de acordo com a presente invençãosão identificados de acordo com critérios rotineiramente empregados natécnica para identificar aquele tipo de domínio hidrofóbico. As fronteiras exatasde domínio transmembrana podem variar, mas, muito provavelmente, em nãomais de cerca de cinco aminoácidos em cada extremidade do domínio,conforme identificado inicialmente no presente. Opcionalmente, portanto,domínio extracelular de polipeptídeo TAT pode conter cerca de cinco ou menosaminoácidos sobre cada lado da fronteira entre domínio de transmembrana edomínio extracelular, conforme identificado nos Exemplos ou no relatóriodescritivo e esses polipeptídeos, com ou sem o peptídeo de sinal associado eácido nucleico que os codifica, são contemplados pela presente invenção.
A localização aproximada dos "peptídeos de sinal" dos diversospolipeptídeos TAT descritos no presente pode ser exibida no presente relatóriodescritivo e/ou nas figuras anexas. Observa-se, entretanto, que a fronteira C-terminal de peptídeo de sinal pode variar, mas mais provavelmente em nãomais de cerca de cinco aminoácidos sobre cada lado da fronteira C-terminal depeptídeo de sinal conforme identificado inicialmente no presente, em que afronteira C-terminal do peptídeo de sinal pode ser identificada de acordo comcritérios empregados rotineiramente na técnica para identificar aquele tipo deelemento de seqüência de aminoácidos (tal como Nielsen et al, Prot. Eng. 10:1-6 (1997) e von Heinje et al, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). Alémdisso, também se reconhece que, em alguns casos, a divisão de seqüência desinal de polipeptídeo secretado não é totalmente uniforme, o que resulta emmais de uma substância secretada. Estes polipeptídeos maduros, em que opeptídeo de sinal é dividido em não mais de cerca de cinco aminoácidos sobrecada lado da fronteira C-terminal do peptídeo de sinal conforme identificado nopresente, e os polinucleotídeos que os codificam são contemplados pelapresente invenção.
"Variante de polipeptídeo TAT" indica polipeptídeo TAT,preferencialmente polipeptídeo TAT ativo, conforme definido no presente, quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácidoscom seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa de comprimento totalconforme descrito no presente, seqüência de polipeptídeos TAT que nãocontém o peptídeo de sinal conforme descrito no presente, domínio extracelularde polipeptídeo TAT, com ou sem o peptídeo de sinal conforme descrito nopresente ou qualquer outro fragmento de seqüência de polipeptídeos TAT decomprimento total conforme descrito no presente (tal como os codificados porácido nucleico que representa somente uma parte da seqüência de codificaçãocompleta para polipeptídeo TAT de comprimento total). Essas variantes depolipeptídeos TAT incluem, por exemplo, polipeptídeos TAT em que sãoadicionados ou excluídos um ou mais resíduos de aminoácidos no terminal Nou C da seqüência de aminoácidos nativa de comprimento total. Normalmente,variante de polipeptídeo TAT possuirá pelo menos cerca de 80% de identidadede seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81%,82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência de aminoácidos paraseqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa de comprimento totalconforme descrito no presente, seqüência de polipeptídeos TAT que nãocontém o peptídeo de sinal conforme descrito no presente, domínio extracelularde polipeptídeo TAT com ou sem o peptídeo de sina! conforme descrito nopresente ou qualquer outro fragmento especificamente definido de seqüênciade polipeptídeos TAT de comprimento total conforme descrito no presente.
Normalmente, polipeptídeos variantes de TAT normalmente possuem pelomenos cerca de dez aminoácidos de comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150,160; 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310,320; 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440 ,450, 460, 470,480; 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590 ou 600 aminoácidosde comprimento ou mais. Opcionalmente, os polipeptídeos variantes TATpossuirão não mais de uma substituição de aminoácido conservadora emcomparação com a seqüência de polipeptídeos TAT nativa, alternativamentenão mais de duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituiçõesde aminoácidos conservadoras em comparação com a seqüência depolipeptídeos TAT nativa.
"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos", comrelação às seqüências de polipeptídeos TAT identificadas no presente, édefinido como o percentual de resíduos de aminoácidos em possível seqüênciaque são idênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência de polipeptídeosTAT específica, após o alinhamento das seqüências e introdução de intervalos,se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de seqüências,sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidadede seqüências. O alinhamento para propósitos de determinação do percentualde identidade de seqüências de aminoácidos pode ser atingido de váriasformas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, porexemplo, software de computador disponível ao público, tal como softwareBLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assuntopodem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindoquaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longodo comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitosdo presente, entretanto, valores de percentual de identidade de seqüências deaminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparaçãode seqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programaALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador decomparação de seqüências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e ocódigo fonte exibido na Tabela 1 abaixo foi depositado com documentação deusuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC20559, Estados Unidos, onde está registrado com o n° de Registro de DireitosAutorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível aopúblico por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou podeser compilado a partir do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. Oprograma ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em sistema operativo UNIX,preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação deseqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparaçõesde seqüências de aminoácidos, o percentual de identidade de seqüências deaminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com ou contrauma dada seqüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamenteexpressa como dada seqüência de aminoácidos A que possui ou compreendecerto percentual de identidade de seqüências de aminoácidos para, com oucontra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculado conforme segue:
100 vezes a fração X/Y
em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliadoscomo coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüênciasALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é aquantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quandoo comprimento da seqüência de aminoácidos A não for igual ao comprimentoda seqüência de aminoácidos B, o percentual de identidade de seqüências deaminoácidos de A para B não será igual ao percentual de identidade deseqüências de aminoácidos de B para A. Como exemplos de cálculos depercentuais de identidade de seqüências de aminoácidos utilizando estemétodo, as Tabelas 2 e 3 demonstram como calcular o percentual deidentidade de seqüências de aminoácidos da seqüência de aminoácidosdenominada "Proteína de Comparação" e a seqüência de aminoácidosdenominada "TAT", em que "TAT" representa a seqüência de aminoácidos depolipeptídeo TAT hipotético de interesse, "Proteína de Comparação" representaa seqüência de aminoácidos de polipeptídeo com o qual o polipeptídeo "TAT"de interesse está sendo comparado e cada um dentre "X", "Y" e "Z" representadiferentes resíduos de aminoácidos hipotéticos. A menos que especificadoespecificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade deseqüências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos conformedescrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa decomputador ALIGN-2.
"Polipeptídeo variante TAT" ou "seqüência de ácido nucleicovariante TAT" indica molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo TAT,preferencialmente polipeptídeo TAT ativo, conforme definido no presente, quepossui pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de ácido nucleicocom seqüência de ácido nucleico que codifica seqüência de polipeptídeos TATde seqüência nativa e comprimento total conforme descrito no presente,seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa e comprimento total quenão contém o peptídeo de sinal conforme descrito no presente, domínioextracelular de polipeptídeo TAT, com ou sem o peptídeo de sinal conformedescrito no presente ou qualquer outro fragmento de seqüência depolipeptídeos TAT de comprimento total conforme descrito no presente (talcomo os codificados por ácido nucleico que representa somente uma parte daseqüência de codificação completa para polipeptídeo TAT de comprimentototal). Normalmente, polipeptídeo variante TAT possuirá pelo menos cerca de80% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos, alternativamente pelomenos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência deácidos nucleicos para seqüência de ácidos nucleicos que codifica seqüência depolipeptídeos TAT de seqüência nativa e comprimento total conforme descritono presente, seqüência de polipeptídeos TAT de seqüência nativa ecomprimento total que não contém o peptídeo de sinal conforme descrito nopresente, domínio extracelular de polipeptídeo TAT com ou sem a seqüênciade sinal conforme descrito no presente ou qualquer outro fragmento deseqüência de polipeptídeos TAT de comprimento total conforme descrito nopresente. As variantes não englobam a seqüência de nucleotídeos nativa.
Normalmente, os polinucleotídeos variantes de TAT possuem pelomenos cerca de cinco nucleotídeos de comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15; 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40; 45, 50, 55, 60; 65, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; 13,14, 115, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22; 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195,200; 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300; 310, 320, 330, 340, 350,360, 370, 380, 390, 400; 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500; 510,520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600; 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670,680, 690, 700; 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800; 810, 820, 830,840, 850, 860, 870, 880, 890, 900; 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990ou 1000 nucleotídeos de comprimento, em que, neste contexto, a expressão"cerca de" indica o comprimento de seqüência de nucleotídeos de referênciamais ou menos 10% daquele comprimento indicado."Percentual (%) de identidade de seqüência de ácidos nucleicos",com relação às seqüências de ácidos nucleicos codificadoras de TATidentificadas no presente, é definido como o percentual de nucleotídeos empossível seqüência que são idênticos aos nucleotídeos na seqüência de ácidosnucleicos de TAT de interesse, após o alinhamento das seqüências eintrodução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo deidentidade de seqüências. O alinhamento para propósitos de determinação dopercentual de identidade de seqüências de ácido nucleico pode ser atingido devárias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando,por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como softwareBLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para os propósitos dopresente, entretanto, valores de percentual de identidade de seqüências deácidos nucleicos são gerados utilizando o programa de computador decomparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo para oprograma ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computadorde comparação de seqüências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e ocódigo fonte exibido na Tabela 1 abaixo foi depositado com documentação deusuário no Escritório Norte-Ámericano de Direitos Autorais, Washington DC20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de DireitosAutorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível aopúblico por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou podeser compilado a partir do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. Oprograma ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em sistema operativo UNIX,preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação deseqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparaçõesde seqüências de ácidos nucleicos, o percentual de identidade de seqüênciasde ácidos nucleicos de uma dada seqüência de ácidos nucleicos C para, comou contra uma dada seqüência de ácidos nucleicos D (que pode seralternativamente expressa como dada seqüência de ácidos nucleicos C quepossui ou compreende certo percentual de identidade de seqüências de ácidosnucleicos para, com ou contra uma dada seqüência de ácidos nucleicos D) écalculado conforme segue:
100 vezes a fração W/Z
em que W é a quantidade de nucleotídeos avaliados comocoincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüências ALIGN-2no alinhamento de C e D naquele programa e em que Z é a quantidade total denucleotídeos em D. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da seqüência deácidos nucleicos C não for igual ao comprimento da seqüência de ácidosnucleicos D, o percentual de identidade de seqüências de ácidos nucleicos deC para D não será igual ao percentual de identidade de seqüências de ácidosnucleicos de D para C. Como exemplos de cálculos de percentuais deidentidade de seqüências de ácidos nucleicos, as Tabelas 4 e 5 demonstramcomo calcular o percentual de identidade de seqüências de ácidos nucleicos daseqüência de ácidos nucleicos denominada "DNA de Comparação" para aseqüência de ácidos nucleicos denominada "TAT-DNA", em que "TAT-DNA"representa seqüência de ácidos nucleicos codificadora de TAT hipotética deinteresse, "DNA de Comparação" representa a seqüência de nucleotídeos demolécula de ácido nucleico com a qual a molécula de ácido nucleico "TAT-DNA" de interesse está sendo comparada e cada um dentre "N", "L" e "V"representa nucleotídeos hipotéticos diferentes. A menos que especificadoespecificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade deseqüências de ácidos nucleicos utilizados no presente são obtidos conformedescrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa decomputador ALIGN-2.
Em outras realizações, polinucleotídeos variantes de TAT sãomoléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeo TAT e que sãocapazes de hibridização, preferencialmente sob condições de lavagem ehibridização estringentes, em seqüências de nucleotídeos que codificampolipeptídeo TAT de comprimento total conforme descrito no presente.Polipeptídeos variantes de TAT podem ser aqueles que são codificados porpolinucleotídeo variante de TAT.
A expressão "região de codificação de comprimento total", daforma utilizada com referência a ácido nucleico que codifica polipeptídeo TAT,designa a seqüência de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo TAT decomprimento total de acordo com a presente invenção (que freqüentemente éexibida entre códons de início e de parada, inclusive, nas figuras anexas). Aexpressão "região de codificação de comprimento total", da forma utilizada comreferência a ácido nucleico depositado na ATCC, designa a parte do cDNA quecodifica polipeptídeo TAT que é inserida no vetor depositado na ATCC (quefreqüentemente é exibida entre códons de início e de parada, inclusive, nasfiguras anexas).
"Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipeptídeosTAT descritos no presente, indica polipeptídeo que foi identificado e separadoe/ou recuperado a partir de componente do seu ambiente natural. Oscomponentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais quetipicamente interfeririam com utilizações diagnosticas ou terapêuticas para opolilpeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceosou não proteináceos. Em realizações preferidas, o polipeptídeo será purificado(1) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos deseqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando seqüenciador dexícaras de centrifugação; ou (2) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul deCoomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O polipeptídeo isoladoinclui o polipeptídeo in situ em células recombinantes, já que pelo menos umcomponente do ambiente natural do polipeptídeo TAT não estará presente.Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado por meio depelo menos uma etapa de purificação.
Ácido nucleico codificador de polipeptídeo TAT "isolado" ou outroácido nucleico codificador de polipeptídeo é molécula de ácido nucleico que éidentificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleicocontaminante com a qual normalmente é associada na fonte natural do ácidonucleico codificador de polipeptídeo. Uma molécula de ácido nucleicocodificadora de polipeptídeo isolada é diferente na forma ou ambiente em que éencontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico codificadoras depolipeptídeos isoladas são diferenciadas, portanto, da molécula de ácidonucleico codificadora de polipeptídeo específica que existe em células naturais.Molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada inclui,entretanto, moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeo contidasem células que normalmente expressam o polipeptídeo no qual, por exemplo, amolécula de ácido nucleico encontra-se em local cromossômico diferente decélulas naturais.
A expressão "seqüências de controle" designa seqüências deDNA necessárias para a expressão de seqüência de codificação ligadaoperativamente em organismo hospedeiro específico. As seqüências decontrole que são apropriadas para procariotes, por exemplo, incluem promotor,opcionalmente seqüência de operadores, e local de união de ribossomos. Ascélulas eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais depoliadenilação e amplificadores.
Ácido nucleico é "ligado operativamente" quando é colocado emrelação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. DNA para seqüênciaprévia ou líder de secreção, por exemplo, é ligado operativamente a DNA parapolipeptídeo caso seja expresso na forma de proteína prévia que participa dasecreção do polipeptídeo; promotor ou amplificador é ligado operativamente aseqüência de codificação caso afete a transcrição da seqüência; ou local deunião de ribossomos é ligado operativamente a seqüência de codificação casoseja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, "ligadooperativamente" indica que as seqüências de DNA que são ligadas sãocontíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Osaprimoradores, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é obtidapor meio de ligação em locais de restrição convenientes. Caso estes locais nãoexistam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes sãoutilizados de acordo com a prática convencional.
A "estringência" das reações de hibridização pode ser facilmentedeterminada pelos técnicos comuns no assunto e geralmente é cálculoempírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem econcentração de sal. De forma geral, sondas mais compridas necessitam detemperaturas mais altas para combinação apropriada, enquanto sondas maiscurtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridização geralmentedepende da capacidade de recombinação de DNA desnaturado quandolinhagens complementares estiverem presentes em ambiente abaixo da suatemperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre asonda e a seqüência hibridizável, mais alta a temperatura correspondente quepode ser utilizada. Como resultado, segue-se que temperaturascorrespondentes mais altas tenderiam a tornar as condições de reação maisestringentes, enquanto temperaturas mais baixas o fazem em menorproporção. Para detalhes adicionais e explicações sobre a estringência dasreações de hibridização, vide Ausubel et al, Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência", daforma definida no presente, podem ser identificadas por aquelas que: (1)empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, tal como0,015 M cloreto de sódio/0,0015 M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfato desódio a 50 °C; (2) empregam durante a hibridização agente desnaturante, talcomo formamida, por exemplo 50% (v/v) formamida com albumina de sorobovino a 0,1%/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato desódio sob pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a42 °C; ou (3) hibridização por uma noite em solução que emprega 50%formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM defosfato de sódio (pH 6.8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt,DNA de esperma de salmão sonicado (50 jj.g/ml), 0,1% SDS e 10% sulfato dedextran a 42 °C, com lavagem por dez minutos a 42 °C em 0,2 x SSC (cloretode sódio/citrato de sódio), seguidos por lavagem em alta estringência por dezminutos que consiste de 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C.
"Condições moderadamente estringentes" podem ser identificadasconforme descrito por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução delavagem e condições de hibridização (tais como temperatura, resistência iônicae % SDS) menos estringentes que as descritas acima. Um exemplo decondições moderadamente estringentes é a incubação por uma noite a 37 °Cem solução que compreende: 20% formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução deDernhardt, 10% sulfato de dextran e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmãodividido desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de37-50 °C. Os técnicos no assunto reconhecerão como ajustar a temperatura,resistência iônica etc. conforme o necessário para acomodar fatores tais comocomprimento de sonda e similares.
A expressão "marcado por epítopo" utilizada no presente designapolipeptídeo quimérico que compreende polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT fundido a "polipeptídeo de marca". O polipeptídeo de marca contémresíduos suficientes para fornecer epítopo contra o qual pode ser fabricadoanticorpo, mas ainda é suficientemente curto para não interferir com a atividadedo polipeptídeo ao qual é fundido. O polipeptídeo de marca também é, depreferência, razoavelmente exclusivo, de forma que o anticorpo não apresentereação cruzada substancial com outros epítopos. Os polipeptídeos de marcaapropriados contêm pelo menos seis resíduos de aminoácidos e, normalmente,cerca de oito a cinqüenta resíduos de aminoácidos (preferencialmente, cercade dez a vinte resíduos de aminoácidos).
"Ativo" ou "atividade" para os propósitos do presente indicaforma(s) de polipeptídeo TAT que retém(êm) atividade biológica e/ouimunológica de TAT nativo ou de ocorrência natural, em que atividade"biológica" indica função biológica (seja inibidora ou estimulante) causada porTAT nativo ou de ocorrência natural diferente da capacidade de induzir aprodução de anticorpo contra epítopo antigênico possuído por TAT nativo ou deocorrência natural e atividade "imunológica" designa a capacidade de induçãoda produção de anticorpo contra epítopo antigênico possuído por TAT nativo oude ocorrência natural.
O termo "antagonista" é utillizado no sentido mais amplo e incluiqualquer molécula que bloqueie, iniba ou neutralize, total ou parcialmente, aatividade biológica de polipeptídeo TAT nativo descrito no presente. De formasimilar, o termo "agonista" é utillizado no sentido mais amplo e inclui qualquermolécula que imite atividade biológica de polipeptídeo TAT nativo descrito nopresente. Moléculas agonistas ou antagonistas apropriadas incluemespecificamente anticorpos agonistas ou antagonistas ou fragmentos deanticorpos, fragmentos ou variantes de seqüências de aminoácidos depolipeptídeos TAT nativos, peptídeos, oligonucleotídeos sem sentido,moléculas orgânicas pequenas etc. Métodos de identificação de agonistas ouantagonistas de polipeptídeo TAT podem compreender o contato depolipeptídeo TAT com possível molécula agonista ou antagonista e medição demudança detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmenteassociadas ao polipeptídeo TAT.
"Tratar, "tratamento" ou "melhoria" designa o tratamento terapêutico emedidas profiláticas ou preventivas, em que o objeto é o de evitar ou reduzir avelocidade (diminuir) da condição ou disfunção patológica desejada. Osnecessitados de tratamento incluem os que já possuem a disfunção, bem como ospropensos a ter a disfunção ou aqueles em que a disfunção deva ser evitada.Paciente ou mamífero é "tratado" com sucesso de câncer que expressepolipeptídeo TAT se, após receber quantidade terapêutica de anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união de TAT segundo osmétodos de acordo com a presente invenção, o paciente observar reduçãoobservável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução daquantidade de células cancerosas ou ausência das células cancerosas, redução dotamanho do tumor, inibição (ou seja, redução da velocidade até certo ponto e,preferencialmente, suspensão) da infiltração de células cancerosas em órgãosperiféricos, incluindo a difusão de câncer em tecido mole e ossos; inibição (ou seja,redução até certo ponto e, preferencialmente, suspensão) da metástase tumorosa;inibição, até certo ponto, do crescimento de tumores; e/ou melhoria, até certo ponto,de um ou mais dos sintomas associados ao câncer específico, redução da morbideze mortalidade e melhoria de questões de qualidade de vida. Desde que possa evitaro crescimento de células cancerosas existentes e/ou matá-las, o anticorpo anti-TATou oligopeptídeo de união de TAT pode ser citostático e/ou citotóxico. A reduçãodesses sinais ou sintomas pode também ser sentida pelo paciente.
Os parâmetros acima para a determinação do tratamento bemsucedido e melhoria da doença são facilmente mensuráveis por meio deprocedimentos rotineiros familiares dos médicos. Para a terapia de câncer,pode-se medir a eficácia determinando-se, por exemplo, o tempo para oprogresso da doença (TTP) e/ou determinando-se a velocidade de reação(RR). Pode-se determinar a metástase por meio de testes de estágio,varrimento de ossos e testes para a determinação do nível de cálcio e outrasenzimas para determinar a difusão para os ossos. Podem também serrealizados varrimentos de CT para verificar a difusão para a pélvis e nóduloslinfáticos na área. Raios X do tórax e medição dos níveis de enzimas no fígadopor meio de métodos conhecidos são utilizados para determinar metástasepara os pulmões e fígado, respectivamente. Outros métodos rotineiros demonitoramento da doença incluem ultrassonografia transretal (TRUS) e biópsiade agulhas transretais (TRNB).
Administração "crônica" indica a administração do(s) agente(s) emmodo contínuo, ao contrário de modo agudo, de forma a manter o efeitoterapêutico inicial (atividade) por maior período de tempo. Administração"intermitente" é o tratamento que não é efetuado consecutivamente seminterrupção, mas sim de natureza cíclica.
"Mamífero", para os propósitos de tratamento, redução dossintomas ou de diagnóstico de câncer, designa qualquer animal classificadocomo mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda,bem como animais domésticos, de esportes ou zoológico, tais como cães,gatos, bois, cavalos, carneiros, porcos, cabras, coelhos etc. Preferencialmente,o mamífero é ser humano.
A administração "em combinação com" um ou mais agentesterapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) econsecutiva em qualquer ordem.
"Veículos", da forma utilizada no presente, incluem veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que são atóxicospara a célula ou mamífero a eles sendo expostos nas dosagens econcentrações empregadas. Freqüentemente, o veículo fisiologicamenteaceitável é solução tamponada com pH aquoso. Exemplos de veículosfisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outrosácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo debaixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais comoalbumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, taiscomo polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina,asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, taiscomo EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíonsformadores de sais, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais comoTWEEN®, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS®.
Por "fase sólida" ou "suporte sólido", indica-se matriz não aquosaà qual anticorpo, oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de uniãode TAT de acordo com a presente invenção pode aderir-se ou fixar-se.Exemplos de fases sólidas englobadas no presente incluem as formadas totalou parcialmente de vidro (tal como vidro de poros controlados), polissacarídeos(tais como agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones.
Em certas realizações, dependendo do contexto, a fase sólida podecompreender a cavidade de placa de teste; em outras, é coluna de purificação(tal como coluna de cromatografia de afinidade). Esta expressão também incluifase sólida descontínua de partículas discretas, tais como as descritas naPatente Norte-Americana n° 4.275.149.
"Lipossomo" é pequena bolha composta de diversos tipos delipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para o fornecimento de drogas(tais como polipeptídeo TAT, seu anticorpo ou oligopeptídeo de união de TAT)a mamíferos. Os componentes do lipossomo são normalmente dispostos emformação bicamadas, similar à disposição de lipídios de membranas biológicas.
Molécula "pequena" ou molécula orgânica "pequena" é definida nopresente como tendo peso molecular de menos de cerca de 500 Daltons.
"Quantidade eficaz" de polipeptídeo, anticorpo, oligopeptídeo de uniãode TAT, molécula orgânica de união de TAT ou seu agonista ou antagonista, daforma descrita no presente, é quantidade suficiente para conduzir propósitoespecificamente indicado. "Quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamentee de maneira rotineira, com relação ao propósito indicado.
A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" designa aquantidade de anticorpo, polipeptídeo, polipeptídeo de união de TAT, moléculaorgânica de união de TAT ou outra droga eficaz para o "tratamento" de doençaou disfunção em paciente ou mamífero. No caso de câncer, a quantidadeterapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de célulascancerosas, reduzir o tamanho do tumor, inibir (ou seja, reduzir a velocidadeaté certo ponto e, preferencialmente, suspender) a infiltração de célulascancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e,preferencialmente, suspender) a metástase tumorosa; inibir, até certo ponto, ocrescimento de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, um ou mais dossintomas associados ao câncer. Vide a definição de "tratamento" no presente.
Desde que possa evitar o crescimento de células cancerosas existentes e/oumatá-las, a droga pode ser citostática e/ou citotóxica.
"Quantidade inibidora do crescimento" de anticorpo anti-TAT,polipeptídeo TAT, oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica deunião de TAT é quantidade capaz de inibir o crescimento de células,especialmente tumorosas, tais como células de câncer, in vitro ou in vivo.
"Quantidade inibidora do crescimento" de anticorpo anti-TAT, polipeptídeo TAT,oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união de TAT para ospropósitos de inibição do crescimento de células neoplásticas pode serdeterminada empiricamente e de forma rotineira.
"Quantidade citotóxica" de anticorpo anti-TAT, polipeptídeo TAT,oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união de TAT é quantidadecapaz de causar a destruição de células, especialmente tumorosas, tais comocélulas de câncer, in vitro ou in vivo. "Quantidade citotóxica" de anticorpo anti-TAT,polipeptídeo TAT, oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união deTAT para os propósitos de inibição do crescimento de células neoplásticas pode serdeterminada empiricamente e de forma rotineira.
O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobreespecificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-TAT isolados (incluindoanticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes), composições de anticorposanti-TAT com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos anti-TAT de fita única e fragmentos de anticorpos anti-TAT (vide abaixo), desde queexibam a atividade biológica ou imunológica desejada. O termo "imunoglobulina" (Ig)é utilizado de forma intercambiável com anticorpo no presente.
"Anticorpo isolado" é aquele que tenha sido identificado, separadoe/ou recuperado a partir de componente do seu ambiente natural. Oscomponentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais queinterfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo epodem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) atémais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do métodoLowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficientepara a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidosinterna ou N-terminal, utilizando seqüenciador de xícaras de centrifugação; ou(3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ounão redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchasde prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes,desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo nãoesteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparadopor meio de pelo menos uma etapa de purificação.
A unidade básica de anticorpo de quatro cadeias é glicoproteínaheterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeiaspesadas (H) idênticas (um anticorpo de IgM consiste de cinco das unidadesheterotetraméricas básicas, juntamente com um polipeptídeo adicionaldenominado cadeia J, contendo, portanto, dez locais de união de antígenos,enquanto os anticorpos de IgA secretados podem polimerizar-se para formarconjuntos polivalentes que compreendem de duas a cinco das unidadesbásicas de quatro cadeias juntamente com a cadeia J). No caso de IgGs, aunidade de quatro cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cadacadeia L é ligada a uma cadeia H por uma união de dissulfeto covalente,enquanto as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais uniões dedissulfeto, dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L tambémcontém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cada cadeia Hcontém, no terminal N, um domínio variável (Vh) seguido por três domíniosconstantes (Ch) para cada uma das cadeias aeye quatro domínios Ch para osisotipos \i e e. Cada cadeia L contém, no terminal N, um domínio variável (VL)seguido por domínio constante (Cl) na sua outra extremidade. O VL é alinhadoao VH e o Cl é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada (Ch1).Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem superfícieintermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. Oemparelhamento de Vh e VL entre si forma um único local de união deantígenos. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes deanticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology, oitava edição,Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange,Norwalk CT, 1994, pág. 71 e Capítulo 6.A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode serclassificada em um dentre dois tipos claramente distintos, denominados capa elambda, com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domíniosconstantes. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constantedas suas cadeias pesadas (Ch), as imunoglobulinas podem ser atribuídas adiferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA,IgD, IgE, IgG e IgM, que contêm cadeias pesadas denominadas a, 5, s, y, e \i,respectivamente. As classes y and a são adicionalmente divididas emsubclasses com base em diferenças relativamente menores de função eseqüência Ch; seres humanos, por exemplo, expressam as subclasses aseguir: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2.
O termo "variável" designa o fato de que certos segmentos dosdomínios variáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos. Odomínio V media a união de antígenos e define a especificidade de anticorpoespecífico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade não édistribuída regularmente ao longo da série de 110 aminoácidos dos domíniosvariáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de estiramentos relativamenteinvariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de quinze a trintaaminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade,denominadas "regiões hipervariáveis" que contêm de nove a doze aminoácidosde comprimento cada uma. Os domínios variáveis de cadeias leve e pesadanativas compreendem quatro FRs cada um, adotando em grande parteconfiguração de folha p, conectadas por três regiões hipervariáveis, queformam laços que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura defolha B. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boaproximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia,contribuem para a formação do local de união de antígenos de anticorpos (videKabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Osdomínios constantes não estão diretamente envolvidos na união de anticorpo aantígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação doanticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada nopresente, designa anticorpo obtido a partir de população de anticorpossubstancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações deocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Osanticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para umúnico local antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpospoliclonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentesdeterminantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um únicodeterminante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorposmonoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma nãocontaminada por outros anticorpos. O adjetivo "monoclonal" não deve serconsiderado exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer métodoespecífico. Os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem serpreparados, por exemplo, por meio da metodologia de hibridoma descrita emprimeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), ou pode ser fabricadautilizando métodos de DNA recombinante em células vegetais, animais,eucarióticas ou bacterianas (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n°4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partirde bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, porexemplo, em Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991).
Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamenteanticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), em que uma parte da cadeia levee/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classeou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) éidêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorpos derivadosde outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos,bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividadebiológica desejada (vide Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison etal, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorposquiméricos de interesse no presente incluem anticorpos "primatizados", quecompreendem seqüências de união de antígenos de domínio variávelderivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo,Chimpanzé etc.) e seqüências de regiões constantes humanas.
Anticorpo "intacto" é aquele que compreende um local de união deantígenos, bem como um Cl e pelo menos domínios contantes de cadeiapesada, Ch1, Ch2 e Ch3. Os domínios constantes podem ser domíniosconstantes de seqüência nativa (por exemplo, domínios constantes deseqüências nativas humanas) ou suas variantes de seqüências deaminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou maisfunções efetoras.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de anticorpointacto, preferencialmente a região variável ou de união de antígenos doanticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentosde Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos, anticorpos lineares (vide Patente Norte-Americana n° 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al, Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorposmultiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentosidênticos de união de antígenos, denominados fragmentos "Fab", e umfragmento "Fc" residual, cuja designação reflete a capacidade de cristalizaçãorápida. O fragmento de Fab consiste de uma cadeia L inteira, juntamente com odomínio de região variável da cadeia H (Vh), e o primeiro domínio constante deuma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento de Fab é monovalente com relaçãoà união de antígenos, ou seja, contém um único local de união de antígenos. Otratamento com pepsina de um anticorpo gera um único fragmento F(ab')2grande, que corresponde aproximadamente a dois fragmentos de Fab ligadospor dissulfeto que possuem atividade de união de antígenos divalentes e aindasão capazes de reticular antígenos. Os fragmentos de Fab' diferem dosfragmentos de Fab por conterem alguns resíduos adicionais no terminal carbóxido domínio Ch1 , incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação doanticorpo. Fab'-SH é a designação do presente para Fab' em que o(s)resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta(m) um grupo tiollivre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos naforma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínas de articulaçãoentre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpostambém são conhecidos.
O fragmento de Fc compreende as partes carbóxi-terminais das duascadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos sãodeterminadas por seqüências na região Fc, que também é a parte reconhecida porreceptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local dereconhecimento e de união de antígenos completo. Esse fragmento consiste de umdímero de um domínio de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada emassociação firme e não covalente. Da dobra desses dois domínios, emanam seislaços hipervariáveis (três laços da cadeia H e L cada) que contribuem com osresíduos de aminoácidos para união de antígenos e conferem especificidade deunião de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado(ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicos para umantígeno) possui a capacidade de reconhecer e unir antígeno, embora em afinidademenor que todo o local de união.
"Fv de cadeia isolada", também abreviado como "sFv" ou "scFv",são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpos Vhe VL conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, opolipeptídeo de sFv compreende adicionalmente uma ligação de polipeptídeoentre os domínios Vh e VL, o que permite que o sFv forme a estrutura desejadapara união de antígenos. Para análise de sFv, vide Pluckthun, ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, abaixo.
O termo "diacorpos" designa fragmentos de anticorpos pequenospreparados por meio da construção de fragmentos de sFv (vide parágrafoanterior) com ligações curtas (cerca de cinco a dez resíduos) entre os domíniosVH e VL, de forma a atingir-se o emparelhamento intercadeias mas nãointracadeias dos domínios V, resultando em fragmento bivalente, ou seja,fragmento contendo dois locais de união de antígenos. Os diacorposbiespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv "cruzados", em queos domínios Vh e VL dos dois anticorpos estão presentes sobre diferentescadeias de polipeptídeos. Os diacorpos são descritos mais completamente, porexemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei.U. S. A., 90: 6444-6448 (1993).
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (porexemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüênciamínima derivada do anticorpo não humano. Em sua maioria, os anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), em queresíduos de região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos deregião hipervariável de espécie não humana (anticorpo doador), tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano que apresente acapacidade, afinidade e especificidade de anticorpo desejada. Em algunscasos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana sãosubstituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, osanticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essasmodificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todosdentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ousubstancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos deimunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são asde seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado tambémcompreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de região constante deimunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para detalhesadicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al,Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
"Anticorpo dependente de espécie", tal como anticorpo anti-IgEhumano de mamífero, é anticorpo que possui afinidade de união mais fortepara antígeno de primeira espécie de mamífero que para homólogo daqueleantígeno de segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpodependente de espécie "une-se especificamente" a antígeno humano (ou seja,possui valor de afinidade de união (Kd) de não mais de cerca de 1 x 10"7 M,preferencialmente não mais de cerca de 1 x 10"8 e, de maior preferência, nãomais de cerca de 1 x 10~9 M), mas possui afinidade de união para homólogo doantígeno de segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menoscerca de cinqüenta vezes, pelo menos cerca de quinhentas vezes ou pelomenos cerca de mil vezes mais fraca que a sua afinidade de união para oantígeno humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser de qualquerdos diversos tipos de anticorpos definidos acima, mas é preferencialmenteanticorpo humano ou humanizado.
A expressão "numeração de resíduos de domínio variável como emKabat" ou "numeração de posição de aminoácidos como em Kabaf e suasvariações designa o sistema de numeração utilizado para domínios variáveis decadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorposem Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991). Utilizandoeste sistema de numeração, a seqüência de aminoácidos linear real pode contermenos aminoácidos ou adicionais correspondentes à redução ou inserção em FRou CDR do domínio variável. Domínio variável de cadeia pesada pode incluir, porexemplo, um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) apóso resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (tais como resíduos 82a, 82b, 82c etc. deacordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração deresíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por meio dealinhamento em regiões de homologia da seqüência do anticorpo com seqüêncianumerada de Kabat "padrão".
A expressão "substancialmente similar" ou "substancialmenteidêntico", da forma utilizada no presente, indica grau suficientemente alto desimilaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado aanticorpo de acordo com a presente invenção e o outro associado a anticorpode referência/comparativo), de tal forma que os técnicos no assuntoconsiderariam a diferença entre os dois valores como sendo de pouco ounenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto dacaracterística biológica medida pelos mencionados valores (tais como valoresKd). A diferença entre os mencionados dois valores é preferencialmente demenos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 40%,preferencialmente menos de cerca de 30%, preferencialmente menos de cercade 20%, preferencialmente menos de cerca de 10% em função do valor para oanticorpo comparativo/de referência.
"Afinidade de união" geralmente designa a resistência da somatotal de interações não covalentes entre um único local de união de molécula(tal como anticorpo) e seu parceiro de união (tal como antígeno). A menos queindicado em contrário, da forma utilizada no presente, "afinidade de união"designa afinidade de união intrínseca que reflete interação 1:1 entre membrosde par de união (tais como anticorpo e antígeno). A afinidade de uma moléculaX pelo seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante dedissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por meio de métodos comunsna técnica, que incluem os descritos no presente. Anticorpos de baixa afinidadegeralmente unem antígeno lentamente e tendem a dissociar-se rapidamente,enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente unem antígeno maisrapidamente e tendem a permanecer unidos por mais tempo. Uma série demétodos de medição da afinidade de união é conhecida na técnica, qualquerdos quais pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção.Realizações ilustrativas específicas são descritas a seguir.
Em uma realização, "Kd" ou "valor Kd" de acordo com a presenteinvenção é medido por meio de teste de união de antígenos radiomarcados(RIA) realizado com a versão Fab de anticorpo de interesse e o seu antígenoconforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de uniãode solução de Fabs para antígeno por meio de equilíbrio de Fab comconcentração mínima de antígeno marcado com 125l na presença de série detitulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno unidocom placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al (1999), J. Mol. Biol.293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos(Dynex) são revestidas por uma noite com 5 ^g/mT de anticorpo anti-Fab decaptura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadasem seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cincohoras à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em placa não adsorvente(Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125l]-antígeno são misturados comdiluições em série de Fab de interesse (tal como consistente com adeterminação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al (1997), CâncerRes. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por umanoite; entretanto, a incubação pode prosseguir por período mais longo (talcomo 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, asmisturas são transferidas para a placa de captura para incubação àtemperatura ambiente (tal como por uma hora). A solução é removida emseguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após asecagem das placas, adiciona-se 150 fxl/cavidade de cintilante (MicroScint-20;Packard) e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) pordez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de uniãomáxima são selecionadas para uso em testes de união competitiva. De acordocom outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes deressonância de plasma de superfície utilizando BlAcore® 2000 ou BlAcore®3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascasde biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativadascom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 |j.g/ml (cercade 0,2 nM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 fjJ/minuto para atingircerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeçãode antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos.Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sobvelocidade de fluxo de cerca de 25 jal/min. Taxas de associação (ko„) e taxasde dissociação (koff) são calculadas utilizando modelo de união Langmuir um aum simples (Software de Avaliação BlAcore versão 3.2) por meio deconfiguração simultânea do sensograma de associação e dissociação. Aconstante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão IWkon-Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso ataxa de associação exceda 106 M"1 S"1 por meio do teste de ressonância deplasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada emseguida utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumentoou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM deanticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, talcomo espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ouespectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com cubetavermelha de agitação.
"Taxa de associação", "taxa ligado" ou "kon" de acordo com apresente invenção pode também ser determinada com o mesmo método deressonância de plasma de superfície descrito acima utilizando BlAcore® 2000ou BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas deantígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU).Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5,BlAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM deacetato de sódio, pH 4,8, em 5 ^ig/ml (cerca de 0,2 jaM) antes da injeção emvelocidade de fluxo de 5 ^l/minuto para atingir cerca de dez unidades deresposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção, 1 M de etanolamina éinjetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluiçõesseriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25jal/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadasutilizando modelo de união Langmuir um a um simples (Software de AvaliaçãoBlAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma deassociação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foicalculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol.Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M"1 S"1 por meio doteste de ressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação épreferencialmente determinada em seguida utilizando método de resfriamentofluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão defluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS,pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conformemedido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo deparada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 800(ThermoSpectronic) com cubeta agitada. "Kd" ou "valor Kd" de acordo com apresente invenção é medido em uma realização por meio de teste de união deantígenos radiomarcados (RIA) realizado com a versão Fab de anticorpo emolécula de antígeno, conforme descrito por meio do teste a seguir, que medea afinidade de união de solução de Fabs para antígeno por meio de equilíbriode Fab com concentração mínima de antígeno marcado com 125l na presençade série de titulação de antígeno não marcado e captura em seguida deantígeno unido com placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al (1999),J. Mol. Biol. 293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas demicrótítulos (Dynex) são revestidas por uma noite com 5 ng/ml de anticorpoanti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) ebloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS porduas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em placa nãoadsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125l]-antígeno sãomisturados com diluições em série de Fab de interesse (consistente com adeterminação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al (1997), CâncerRes. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por umanoite; entretanto, a incubação pode prosseguir por período mais longo (talcomo 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, asmisturas são transferidas para a placa de captura para incubação àtemperatura ambiente por uma hora. A solução é removida em seguida e aplaca é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após a secagemdas placas, adiciona-se 150 ^l/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard)e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) por dezminutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de uniãomáxima são selecionadas para uso em testes de união competitiva. De acordocom outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes deressonância de plasma de superfície empregando BlAcore® 2000 ou BlAcore®3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascasde biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) são ativadascom cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor.
Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 ng/ml (cercade 0,2 |aM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 |il/minuto para atingircerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeçãode antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos.Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sobvelocidade de fluxo de cerca de 25 (il/min. Taxas de associação (kon) e taxasde dissociação (k0ff) são calculadas utilizando modelo de união Langmuir um aum simples (Software de Avaliação BlAcore versão 3.2) por meio deconfiguração simultânea do sensograma de associação e dissociação. Aconstante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão k0ff/kon.Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso ataxa de associação exceda 106 M"1 S"1 por meio do teste de ressonância deplasma de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada emseguida utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumentoou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm;emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM deanticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença deconcentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, talcomo espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ouespectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubetavermelha de agitação.
Em uma realização, "taxa de associação", "taxa ligado" ou "kon"de acordo com a presente invenção é determinada com o mesmo método deressonância de plasma de superfície descrito acima utilizando BlAcore® 2000ou BlAcore® 3000 (BlAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas deantígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU).Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5,BlAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) deacordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM deacetato de sódio, pH 4,8, em 5 fig/ml (cerca de 0,2 nM) antes da injeção emvelocidade de fluxo de 5 ^l/minuto para atingir cerca de dez unidades deresposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M deetanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para mediçõescinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) sãoinjetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade defluxo de cerca de 25 nl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (kotf)são calculadas utilizando modelo de união Langmuir um a um simples (Software deAvaliação BlAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensogramade associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foicalculada como razão IWkon- Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol.293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M"1 S"1 por meio do teste deressonância de plasma de superfície acima, a taxa de associação épreferencialmente determinada em seguida utilizando método de resfriamentofluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão defluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2,na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido emespectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (AvivInstruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic)com cubeta agitada.
A expressão "substancialmente reduzido" ou "substancialmentediferente", da forma utilizada no presente, indica grau suficientemente alto dediferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado a anticorpode acordo com a presente invenção e o outro associado a anticorpocomparativo/de referência), de tal forma que os técnicos no assuntoconsiderariam a diferença entre os dois valores como sendo de significaçãoestatística dentro do contexto da característica biológica medida pelosmencionados valores (tais como valores Kd e reação HAMA). A diferença entreos mencionados dois valores é preferencialmente de mais de cerca de 10%,preferencialmente mais de cerca de 20%, preferencialmente mais de cerca de30%, preferencialmente mais de cerca de 40%, preferencialmente mais decerca de 50% em função do valor para o anticorpo comparativo/de referência.
"Antígeno" é antígeno previamente determinado ao qual podeunir-se seletivamente um anticorpo. O antígeno alvo pode ser polipeptídeo,carboidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto sintético ou deocorrência natural. Preferencialmente, o antígeno alvo é polipeptídeo.
"Estrutura humana receptora" para os propósitos do presente é estrutura quecompreende a seqüência de aminoácidos de estrutura VL ou VH derivada deestrutura de imunoglobulina humana, ou de estrutura de consenso humano.
Estrutura humana receptora "derivada de" estrutura de imunoglobulina humanaou estrutura de consenso humano pode compreender a sua mesma seqüênciade aminoácidos ou pode conter alterações de seqüência de aminoácidospreviamente existentes. Quando alterações de aminoácidos previamenteexistentes estiverem presentes, preferencialmente não mais de cinco epreferencialmente quatro ou menos, ou três ou menos alterações deaminoácidos previamente existentes estão presentes. Quando alterações deaminoácidos previamente existentes estiverem presentes em VH, estasalterações encontram-se preferencialmente em apenas três, duas ou uma dasposições 71H, 73H e 78H; os resíduos de aminoácidos nestas posições podemser, por exemplo, 71A, 73T e/ou 78A. Em uma realização, a estrutura humanareceptora VL possui seqüência idêntica à seqüência de estrutura deimunoglobulina humana VL ou seqüência de estrutura de consenso humano.
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem sercapazes de unir-se ao mesmo epítopo que é unido por segundo anticorpo. Osanticorpos monoclonais são considerados compartilhando o "mesmo epítopo" casocada um bloqueie a união do outro em 40% ou mais na mesma concentração deanticorpo em análise de união de competição de anticorpos in vivo padrão.
"Estrutura de consenso humano" é estrutura que representa oresíduo de aminoácido de ocorrência mais comum em seleção de seqüênciasde estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção deseqüências VL ou VH de imunoglobulina humana é de subgrupo de seqüênciasde domínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é subgrupo comoem Kabat et al. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo capa Icomo em Kabat et al. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é subgrupo IIIcomo em Kabat et al.
"Estrutura de consenso de subgrupo III VH" compreende aseqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos emsubgrupo III pesado variável de Kabat et al.
"Estrutura de consenso de subgrupo I VL" compreende aseqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos emsubgrupo I capa leve variável de Kabat et al.
"Estrutura humana não modificada" é estrutura humana quecontém a mesma seqüência de aminoácidos da estrutura humana receptora, talcomo que não contém substituição(ões) de aminoácido(s) humano(s) para nãohumano(s) na estrutura humana receptora.
"Região hipervariável alterada" para os propósitos do presente éregião hipervariável que compreende uma ou mais (tal como uma a cerca dedezesseis) substituições de aminoácidos no seu interior.
"Região hipervariável não modificada" para os propósitos dopresente é região hipervariável que contém a mesma seqüência deaminoácidos de anticorpo não humano do qual foi derivada, ou seja, que nãocontenha uma ou mais substituições de aminoácidos no seu interior.
A expressão "região hipervariável", "HVR" ou "HV, da forma utilizadano presente, indica as regiões de domínio variável de anticorpo que são deseqüência hipervariável e/ou formam circuitos definidos estruturalmente.Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três em VH(H1, H2 e H3) e três em VL (L1, L2, L3). Uma série de delineações de regiõeshipervariáveis encontra-se em uso e é englobada no presente. As Regiões deDeterminação de Complementaridade (CDRs) de Kabat baseiam-se navariabilidade de seqüências e são as mais comumente utilizadas (Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Chothia refere-se, porsua vez, ao local dos circuitos estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987)). As regiões hipervariáveis de "contato" baseiam-se em análise dasestruturas de cristais complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destasregiões hipervariáveis são indicados abaixo. A menos que indicado em contrário,será empregada a numeração de Kabat. Locais de regiões hipervariáveis sãogeralmente os seguintes: aminoácidos 24-34 (HVR-L1), aminoácidos 49-56 (HVR-L2), aminoácidos 89-97 (HVR-L3), aminoácidos 26-35A (HVR-H1), aminoácidos 49-65 (HVR-H2) e aminoácidos 93-102 (HVR-H3).
As regiões hipervariáveis podem também compreender "regiõeshipervariáveis estendidas" conforme segue: aminoácidos 24-36 (L1) e aminoácidos46-56 (l_2) no VL. Os resíduos de domínios variáveis são numerados de acordocom Kabat et al, acima, para cada uma dessas definições.
Resíduos de "estrutura" ou "FR" são os resíduos de domíniosvariáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido nopresente.
"Anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência deaminoácidos que corresponde à de anticorpo produzido por ser humano e/oufoi fabricado utilizando qualquer das técnicas de fabricação de anticorposhumanos descritas no presente. Esta definição de anticorpo humano excluiespecificamente anticorpo humanizado que compreende resíduos de união deantígenos não humanos.
Anticorpo "amadurecido por afinidade" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento daafinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parentalque não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos amadurecidos porafinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares parao antígeno alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos pormeio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992) descrevem amadurecimento por afinidade por meio de troca dedomínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de cadeia principale/ou CDR é descrita por: Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sei., U. S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol.155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); eHawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
Anticorpo "bloqueador" ou anticorpo "antagonista" é aquele queinibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que une. Anticorpos debloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancial oucompletamente a atividade biológica do antígeno.
"Oligopeptídeo de união de TAT" é oligopeptídeo que se une,preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conforme descritono presente. Oligopeptídeos de união de TAT podem ser sintetizadosquimicamente utilizando metodologia de síntese de oligopeptídeos conhecidaou podem ser preparados e purificados utilizando tecnologia recombinante. Osoligopeptídeos de união de TAT normalmente possuem pelo menos cerca decinco aminoácidos de comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 5, 6, 7, 8; 9, 10, 11, 12, 13, 14, 47, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 55, 56, 57, 58, 59, 60; 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,74, 75, 76, 77, 78, 79, 80; 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimento ou mais, em que essesoligopeptídeos são capazes de unir-se, preferencialmente de forma específica,a polipeptídeo TAT conforme descrito no presente. Os oligopeptídeos de uniãode TAT podem ser identificados sem experimentação indevida, utilizandométodos bem conhecidos. Neste particular, observa-se que os métodos deseleção de bibliotecas de oligopeptídeos em busca de oligopeptídeos quesejam capazes de unir-se especificamente a polipeptídeo alvo são bemconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n°5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 e5.663.173; Patentes PCT n° WO 84/03506 e WO 84/03564; Geysen et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad.Sei. U. S. A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al, Synthetic Peptides as Antigens,130-149 (1986); Geysen et al, J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofset al, J. immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al (1990), Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A., 87: 6378; Lowman, H. B. et al (1991), Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al (1991), Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al (1991), J.Mol. Bioi, 222: 581; Kang, A. S. et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88:8363 e Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668).
"Molécula orgânica de união de TAT" é molécula orgânicadiferente de oligopeptídeo ou anticorpo conforme definido no presente que seune, preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conformedescrito no presente. Moléculas orgânicas de união de TAT podem seridentificadas e sintetizadas quimicamente utilizando metodologia conhecida(vide, por exemplo, as Patentes PCT n° WO 00/00823 e WO 00/39585). Asmoléculas orgânicas de união de TAT normalmente possuem tamanho demenos de cerca de 2000 daltons, alternativamente tamanho de menos de cercade 1500, 750, 500, 250 ou 200 daltons, em que essas moléculas orgânicas quesão capazes de união, preferencialmente de forma específica, a polipeptídeoTAT conforme descrito no presente podem ser identificadas semexperimentação indevida utilizando métodos bem conhecidos. Neste particular,observa-se que os métodos de seleção de bibliotecas de moléculas orgânicasem busca de moléculas que sejam capazes de unir-se a polipeptídeo alvo sãobem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patentes PCT n° WO 00/00823e WO 00/39585).
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "que une"antígeno de interesse, tal como antígeno de polipeptídeo associado a tumoralvo, é aquele que une o antígeno com afinidade suficiente para que oanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica seja útil como agenteterapêutico e/ou de diagnóstico para dirigir célula ou tecido que expresse oantígeno e não apresente reação cruzada significativa com outras proteínas.
Nessas realizações, a extensão da união do anticorpo, oligopeptídeo ou outramolécula orgânica a proteína "não alvo" será de menos de cerca de 10% daunião do anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica à sua proteínaalvo específica, conforme determinado por meio de análise de ordenamento decélulas ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA).
Com relação à união de anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica amolécula alvo, a expressão "união específica", "une-se especificamente a" ou"é específica para" polipeptídeo específico ou epítopo sobre polipeptídeo alvoespecífico indica união que é mensuravelmente diferente de interação nãoespecífica. A união específica pode ser medida, por exemplo, por meio dadeterminação da união de molécula em comparação com a união de moléculacontrole, que geralmente é molécula com estrutura similar que não possuiatividade de união. A união específica pode ser determinada, por exemplo, pormeio de competição com molécula controle que é similar ao alvo, tal comoexcesso de alvo não marcado. Neste caso, indica-se união específica caso aunião do alvo marcado a uma sonda seja competitivamente inibida por alvo nãomarcado em excesso. A expressão "união específica", "une-se especificamentea" ou "é específico para" polipeptídeo específico ou epítopo sobre polipeptídeoalvo específico, da forma utilizada no presente, pode ser exibida, por exemplo,por molécula que possui Kd para o alvo de pelo menos cerca de 10"4 M,alternativamente pelo menos cerca de 10~5 M, alternativamente pelo menoscerca de 10"6 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"7 M,alternativamente pelo menos cerca de 10~8 M, alternativamente pelo menoscerca de 10"9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10~10 M,alternativamente pelo menos cerca de 10'11 M, alternativamente pelo menoscerca de 10~12 M ou mais. Em uma realização, a expressão "união específica"indica união em que uma molécula une-se a polipeptídeo específico ou epítoposobre polipeptídeo específico sem união substancial a nenhum outropolipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "inibe ocrescimento de células tumorosas que expressam polipeptídeo TAT" ouanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "inibidora do crescimento"é aquele que resulta na inibição mensurável do crescimento de célulascancerosas que expressem ou sobreexpressem o polipeptídeo TAT apropriado.O polipeptídeo TAT pode ser polipeptídeo transmembrana expresso sobre asuperfície de célula cancerosa ou pode ser polipeptídeo que é produzido esecretado por célula cancerosa. Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos oumoléculas orgânicas inibidoras do crescimento preferidas inibem o crescimentode células tumorosas que expressam TAT em mais de 20%, preferencialmentecerca de 20% a cerca de 50% e, de preferência ainda maior, mais de 50% (porexemplo, cerca de 50% a cerca de 100%) em comparação com o controleapropriado, em que o controle é tipicamente de células tumorosas não tratadascom o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica sendo testada. Emuma realização, a inibição do crescimento pode ser medida em concentraçãode anticorpos de cerca de 0,1 a 30 ng/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM emcultivo celular, em que a inibição do crescimento é determinada em um a dezdias após a exposição das células tumorosas ao anticorpo. A inibição docrescimento de células tumorosas in vivo pode ser determinada de diversasformas, conforme descrito no capítulo de Exemplos Experimentais abaixo. Oanticorpo é inibidor do crescimento in vivo caso a administração do anticorpoanti-TAT a cerca de 1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg de peso do corpo resultena redução do tamanho do tumor ou proliferação de células tumorosas em atécerca de cinco dias a três meses a partir da primeira administração doanticorpo, preferencialmente em até cerca de cinco a trinta dias.
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "induz aapoptose" é aquele que induz a morte celular programada, conformedeterminado por meio da união de anexina V, fragmentação de DNA, contraçãocelular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ouformação de bolhas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). A célulaé normalmente aquela que sobreexpressa polipeptídeo TAT.Preferencialmente, a célula é célula tumorosa, tal como célula da próstata,mama, ovário, estômago, endométrio, pulmão, rim, cólon e bexiga. Diversosmétodos são disponíveis para avaliação dos eventos celulares associados àapoptose. A translocação de fosfatidil serina (PS), por exemplo, pode sermedida pela união de anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada pormeio de escalas de DNA; e condensação nuclear/de cromatina juntamente comfragmentação de DNA pode ser avaliada por meio de qualquer aumento dascélulas hipodiplóides. Preferencialmente, o anticorpo, oligopeptídeo ou outramolécula orgânica que induz a apoptose é aquele que resulta em cerca deduas a 50 vezes, preferencialmente cerca de cinco a 50 vezes e, de maiorpreferência, cerca de dez a 50 vezes, a indução de união de anexina comrelação à célula não tratada em teste de união de anexina.
As "funções efetoras" de anticorpos designam as atividadesbiológicas atribuíveis à região Fc (região Fc de seqüência nativa ou região Fccom variação de seqüência de aminoácidos) de anticorpo e variam de acordocom o isotipo do anticorpo. Exemplos das funções efetoras de anticorposincluem: citotoxicidade dependente de complemento e união de C1q; união dereceptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos(ADCC); fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular(tais como receptores de células B); e ativação de células B.
"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos"ou "ADCC" indica forma de citotoxicidade na qual Ig segregado unido areceptores Fc (FcRs) presentes sobre certas células citotóxicas (tais comocélulas Matadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem queessas células efetoras citotóxicas unam-se especificamente a uma célula alvoque contenha antígenos e subseqüentemente matem a célula desejada comcitotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamentenecessários para essa matança. As células primárias para a mediação deADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitosexpressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre célulashematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para determinar a atividade de ADCCde molécula de interesse, pode ser realizado teste ADCC in vitro, tal como odescrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337. Célulasefetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneasperiféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ouadicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode serdeterminada in vivo, tal como em modelo animal como o descrito em Clynes etal, (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).
"Receptor de Fc" ou "FcR" descreve receptor que se une à regiãoFc de anticorpo. O FcR preferido é FcR humano de seqüência nativa. Alémdisso, FcR preferido é aquele que une anticorpo IgG (receptor gama) e incluireceptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicase, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FcyRIIincluem FcyRIIA ("receptor de ativação") e FcyRIIB ("receptor de inibição"), quepossuem seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nosseus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém motivode ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domíniocitoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém motivo de inibição combase em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático. (videanálise M. em Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs sãoanalisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capeiet al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro,são englobados pelo termo "FcR" no presente. O termo também inclui oreceptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGsmaternos para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al, J.Immunol. 24: 249 (1994)).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressampelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitoshumanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sangüíneasperiféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células Tcitotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas. As célulasefetoras podem ser isoladas a partir de fonte nativa, tal como sangue.
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa alise de célula alvo na presença de complemento. A ativação do processoclássico de complemento é iniciada pela união do primeiro componente dosistema de complemento (C1q) a anticorpos (da subclasse apropriada) que sãounidos ao seu antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento,pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, emGazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Os termos "câncer" e "canceroso" designam ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelocrescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas semlimitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidadeslinfóides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer decélulas escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais),câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer dopulmão não de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinomaescamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncergástrico ou estomacal, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático,glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer dabexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon,câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma uterino ou endométrico, carcinomadas glândulas salivares, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer davulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinomapeniano, melanoma, mieloma múltiplo e linfoma de células B, câncer docérebro, bem como da cabeça e do pescoço, e metástases associadas.
As expressões "disfunção proliferativa celular" e "disfunçãoproliferativa" designam disfunções que são associadas a algum grau deproliferação celular anormal. Em uma realização, a disfunção proliferativacelular é câncer.
"Tumor", da forma utilizada no presente, indica toda proliferação ecrescimento de células neoplásticas, seja maligna ou benigna, e todas ascélulas e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.
Anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que "induz amorte celular" é aquela que faz com que uma célula viável torne-se inviável. Acélula é aquela que expressa polipeptídeo TAT, preferencialmente célula quesobreexpressa polipeptídeo TAT em comparação com célula normal do mesmotipo de tecido. O polipeptídeo TAT pode ser polipeptídeo transmembranaexpresso sobre a superfície de célula cancerosa ou pode ser polipeptídeo queé produzido e secretado por célula cancerosa. Preferencialmente, a célula écélula cancerosa, tal como célula da mama, ovário, estômago, endométrio,glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireóide, pancreática ou da bexiga. A mortecelular in vitro pode ser determinada na ausência de células efetoras imunes ecomplementares para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidademediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC). Desta forma, o teste de morte celularpode ser realizado utilizando soro desativado por calor (ou seja, na ausência decomplemento) e na ausência de células efetoras imunes. Para determinar se oanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica é capaz de induzir a mortecelular, a perda da integridade da membrana conforme avaliado por meio daabsorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (vide Moore et al,Cytotechnology 17: 1-11 (1995)) ou 7AAD pode ser avaliada com relação acélulas não tratadas. Os anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas indutoras da morte celular preferidas são as que induzem a absorçãode PI no teste de absorção de PI em células BT474.
"Células que expressam TAT" são células que expressampolipeptídeo TAT endógeno ou transfectado sobre a superfície celular ou emforma secretada. "Câncer que expressa TAT" é câncer que compreende célulasque contêm polipeptídeo TAT presente sobre a superfície celular ou queproduzem e secretam polipeptídeo TAT. "Câncer que expressa TAT" produzopcionalmente níveis suficientes de polipeptídeo TAT sobre a superfície dassuas células, de forma que anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou outra moléculaorgânica possa unir-se a elas e apresentar efeito terapêutico com relação aocâncer. Em outra realização, "câncer que expressa TAT' opcionalmente produze secreta níveis suficientes de polipeptídeo TAT, de forma que anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou outro antagonista de molécula orgânica possa unir-se aelas e apresentar efeito terapêutico com relação ao câncer. Com relação a esteúltimo, o antagonista pode ser oligonucleotídeo sem sentido que reduz, inibe ouevita a produção e secreção do polipeptídeo TAT secretado por célulastumorosas. Câncer que "sobreexpressa" polipeptídeo TAT é aquele queapresenta níveis significativamente mais altos de polipeptídeo TAT na suasuperfície celular, ou o produz e secreta, em comparação com célula nãocancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa sobreexpressão pode ser causadapor amplificação genética ou por maior transcrição ou tradução. Asobreexpressão de polipeptídeo TAT pode ser determinada em teste dediagnóstico ou prognóstico por meio da avaliação dos níveis mais altos daproteína TAT presente sobre a superfície de uma célula ou por ela secretada(tal como por meio de teste de imunohistoquímica utilizando anticorpos anti-TAT preparados contra polipeptídeo TAT isolado que pode ser preparadoutilizando tecnologia de DNA recombinante de ácido nucleico isolado quecodifica o polipeptídeo TAT; análise FACS etc). Alternativa, ou adicionalmente,pode-se medir os níveis de mRNA ou ácido nucleico codificador depolipeptídeo TAT na célula, por meio, por exemplo, de hibridização in situfluorescente utilizando sonda com base em ácido nucleico correspondente aácido nucleico que codifica TAT ou seu complemento (FISH; vide WO 98/45479publicada em outubro de 1998), Southern Blot, Northern Blot ou técnicas dereação em cadeia de polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa em temporeal (RT-PCR). Pode-se também estudar a sobreexpressão de polipeptídeoTAT, medindo-se o antígeno retirado em fluido biológico tal como soro,utilizando, por exemplo, testes com base em anticorpos (vide também, porexemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.933.294 emitida em doze de junhode 1990; WO 91/05264 publicada em 18 de abril de 1991; Patente Norte-Americana n° 5.401.638 emitida em 28 de março de 1995; e Sias et al, J.Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Além dos testes acima, diversos outrostestes in vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, porexemplo, expor as células no corpo do paciente a anticorpo que sejaopcionalmente marcado com marca detectável, tal como isótopo radioativo, epode-se avaliar a união do anticorpo a células do paciente, por exemplo, pormeio de varrimento externo para avaliação da radioatividade ou de análise debiópsia retirada de paciente exposto anteriormente ao anticorpo.
Da forma utilizada no presente, o termo "imunoadesina" designamoléculas similares a anticorpos que combinam a especificidade de união deproteína heteróloga ("adesina") com as funções efetoras de domíniosconstantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinascompreendem fusão de seqüência de aminoácidos com a especificidade deunião desejada, que é diferente do local de união e reconhecimento deantígenos de anticorpo (ou seja, é "heteróloga") e seqüência de domínioconstante de imunoglobulina. A parte de adesina de molécula de imunoadesinaé tipicamente seqüência de aminoácidos contígua que compreende pelo menoso local de união de receptor ou ligante. A seqüência de domínio constante deimunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquerimunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, IgA(incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.
A palavra "marca", da forma utilizada no presente, designacomposto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamenteao anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica, de forma a geraranticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "marcada". A marca podeser detectável por si própria (tais como marcas de radioisótopos ou marcasfluorescentes) ou, no caso de marca enzimática, pode catalisar a alteraçãoquímica de composto ou composição de substrato que seja detectável.
A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,indica substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causadestruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos(tais como 211At, 131l, 125l, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, suas enzimas e fragmentos taiscomo enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas demoléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes e osdiversos agentes antitumores ou anticâncer descritos abaixo. Outros agentescitotóxicos são descritos abaixo. Agente tumoricida causa a destruição decélulas tumorosas.
"Agente quimioterapêutico" é composto químico útil no tratamentode câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentesalquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos dealquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas emetilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina,trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol;colchicinas; ácido betulínico; camptotecin (incluindo o análogo sintéticotopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecin, escopolectin e 9-aminocamptotecin); briostatin; calistatin;CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin ebizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatin; duocarmicin(incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobin;pancratistatin; sarcodictiin; espongistatin; mostardas de nitrogênio tais comoclorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan, novembichin,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias taiscomo carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina eranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo,caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicinaômega 11 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engi, 33: 183-186(1994)); dinemicin, incluindo dinemicin A; esperamicin; bem comoneocarzinostatin cromoforo e cromoforos antibióticos de enediinacromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicin, autramicin,azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin,cromomicinas, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicin ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicin,cianomorfolino-doxorubicin, 2-pirrolino-doxorubicin e desoxidoxorubicin),epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicinas tais comomitomicin C, ácido micofenólico, nogalamicin, olivomicinas, peplomicin,potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin,tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabólitos, tais comometotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais comodenopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina, taiscomo fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais comocalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano,testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona;aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina;bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona;elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucida; nitrato de gálio;hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatin;fenamet; pirarubicin; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo depolissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxin;sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridinA e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida("Ara-C"); tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação denanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE®(Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina(GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platinatais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposida(VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplarin;leucovovin; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicin;aminopterin; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000;difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; capecitabina(XELODA®); sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dequaisquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima taiscomo CHOP, abreviação para terapia combinada de ciclofosfamida,doxorubicin, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, abreviação de regime detratamento com oxaliplatin (ELOXATINTIM) combinada com 5-FU e leucovovin.
Também são incluídos nesta definição agentes anti-hormonaisque agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios quepodem promover o crescimento do câncer e apresentam-se freqüentemente naforma de tratamento sistêmico ou do corpo todo. Eles podem ser os próprioshormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores de receptores deestrógenos seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindotamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen,trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; reguladores de receptores de estrógenos (ERDs); agentes quefuncionam para suprimir ou desconectar os ovários, tais como agonistas dehormônios liberadores de hormônios leutinizantes (LHRH) tais como acetato deleuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelin, acetato de buserelin etripterelin; outros anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; einibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção deestrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida,acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol,vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®. Além disso, essadefinição de agentes quimioterapêuticos inclui bifosfonatos tais como clodronato(por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095,zoledronato/ácido zoledrônico ZOMETA®, alendronato FOSAMAZ®, pamidronatoAREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem comotroxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo cistosina); oligonucleotídeossem sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes emprocessos de sinalização implicados em proliferação de células aberrantes, taiscomo PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R);vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia genética, tais comovacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor datopoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosílato de lapatinib(inibidor de moléculas pequenas tirosino quinase duplo EGFR e ErbB-2 tambémconhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamenteaceitáveis de quaisquer dos acima.
"Agente inibidor de crescimento", da forma utilizada no presente,designa composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula,especialmente célula cancerosa que expressa TAT, seja in vitro ou in vivo.Desta forma, o agente inibidor do crescimento pode ser aquele que reduzsignificativamente o percentual de células que expressam TAT em fase S.Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes quebloqueiam o progresso do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais comoagentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M.Bloqueadores clássicos de fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina),taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como doxorubicin, epirubicin,daunorubicin, etoposida e bleomicin. Os agentes que prendem G1 tambéminvadem a prisão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, taiscomo tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatin,metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem serencontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds.,Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and AntineoplasticDrugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág.13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anticancerígenas, ambasderivadas da árvore de teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer),derivado do teixo europeu, é análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®,Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a reunião demicrotubos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam microtubos aoevitarem a despolimerização, o que resulta na inibição de mitose em células.
"Doxorubicin" é antibiótico de antraciclina. O nome químicocompleto de doxorubicin é (8S-cís)-10-[(3-amino-2,3,6-trideóxi-a-L-lixo-hexapiranosil)óxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11-tri-hidróxi-8-(hidroxiacetil)-1-metóxi-5,12-naftacenodiona.
O termo "citoquina" é termo genérico para proteínas liberadas porpopulação celular que agem sobre outra célula como mediadoresintercelulares. Exemplos dessas citoquinas são linfoquinas, monoquinas ehormônios de polipeptídeos tradicionais. Encontram-se incluídos entre ascitoquinas hormônios do crescimento, tais como hormônio do crescimentohumano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio docrescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina;relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônioestimulante dos folículos (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) ehormônio luteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimentodos fibroblastas; prolactina; lactogênio da placenta; fator de necrose tumorosaaep; substância inibidora mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina decamundongos; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular;integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tais comoNGF-P; fator de crescimento das plaquetas, fatores de crescimento detransformação (TGFs) tais como TGF-a e TGF-P; fator de crescimento similar àinsulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferonas, taiscomo interferona-a, P e y; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais comomacrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); egranulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; fator de necrose tumorosa talcomo TNF-a ou TNF-p; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF eligante de kits (KL). Da forma utilizada no presente, o termo citoquina incluiproteínas de fontes naturais ou de cultivo celular recombinante e equivalentesbiologicamente ativos das citoquinas de seqüência nativa.
O termo "bula" é utilizado para indicar instruçõescostumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtosterapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem,administração, contra-indicações e/ou avisos com referência ao uso dessesprodutos terapêuticos.
Tabela 1
<table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table>
#define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag 7
#define MAXGAP 24 t* dont continue to penalize gaps largerthanthis *l
#define JMPS 1024 /* max jmps in an path 7
#define MX 4 I* save if there's at least MX-1 bases since last jmp 7
#define DMAT 3 /* value of matching bases 7
#define DMIS O /* penalty for mismatched bases 7<table>table see original document page 113</column></row><table>int dmaxO; /* final diag */
int dna; /* set if dna: main() */
int endgaps; /* set if penalizing end gaps */
int gapx, gapy; /* total gaps in seqs */
int lenO, Ien1; /*seqlens7
int ngapx, ngapy; /* total size of gaps 7
int smax; /* max score: nw() 7
int *xbm; /* bitmap for matching 7
long offset; /* current offset in jmp file 7
structdiag *dx; /* holds diagonais 7
structpath pp[2]; /* holds path for seqs 7
char *calloc(), *malloc(), *index(), *strcpy();
char *getseq(), *g_calloc();
/* Needleman-Wunsch alignment program
*
* usage: progs filei file2
* where filei and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity
* Any lines beginning with or '<' are ignored
* Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct)
* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
* Outpüt is in the file "align.out"
*
* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
7
#include "nw.h"<table>table see original document page 115</column></row><table>seqx[0] = getseq(namex[0], &lenO);seqx[1] = getseq(namex[1], &len1);xbm = (dna)? dbval: pbval;
endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ofile = "align.out"; /* output file */
nw(); /* fill in the matrix, get the possible jmps */
readjmps(); /* get the actual jmps 7print(); /* print stats, alignment 7
cleanup(O); /* unlink any tmp files 7}
/* do the alignment, return best score: main()
* dna: values in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983
* pro: PAM 250 values
* When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer
* a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx
* to a gap in seq y.
7
nw() nw{
char *px, *py; /* seqs and ptrs 7
int *ndely, *dely;/* keep track of dely 7
int ndelx, delx; /* keep track of delx 7
int *tmp; /* for swapping rowO, rowl 7
int mis; /* score for each type 7
int insO, ins1; /* insertion penalties 7register id; /* diagonal index */
register ij; /*jmp index*/
register *colO, *col1; /* score for curr, last row */
register xx, yy; /* index into seqs 7
dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", Ien0+len1+1, sizeof(struct diag));ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", Ien1+1, sizeof(int));dely = (int *)g_calloc("to get dely", Ien1+1, sizeof(int));colO = (int *)g_calloc("to get colO", Ien1+1, sizeof(int));col1 = (int *)g_calloc("to get coM", Ien1+1, sizeof(int));insO = (dna)? DINSO : PINSO;ins1 = (dna)? DINS1 : PINS1;smax = -10000;if (endgaps) {
for (colO[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= Ien1; yy++) {
colO[yy] = dely[yy] = col0[yy-1] - ins1;ndely[yy] = yy;
>
colO[0] = 0; /* Waterman Buli Math Biol 84 7
}else
for (yy = 1; yy <= Ien1; yy++)delyfyy] = -insO;/* fill in match matrix7
for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) {/* initialize first entry in col
7if (endgaps) {
if (xx == 1)
col1[0] = delx = -(insO+ins1);else
col1[0] = delx = colO[0] - ins1;ndelx = xx;
}
else {
col1[0] = 0;delx = -insO;ndelx = 0;
}
for (py = seqx[1], yy = 1; yy <= Ien1; py++, yy++) {mis = col0[yy-1];if (dna)
mis += (xbmPpx-Wl&xbmrpy-VV])? DMAT : DMIS;
else
mis += _day[*px-'A,][*py-,A'];
/* update penalty for dei in x seq;
* favor new dei over ongong dei
* ignore MAXGAP if weighting endgaps7
if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) {if (col0[yy] - insO >= dely[yy]) {
dely[yy] = colOfyy] - (ins0+ins1);ndely[yy]= 1;<table>table see original document page 119</column></row><table>ndelx++;
}
/* pick the maximum score; we're favoring* mis over any dei and delx over dely*/
id = xx-yy+ Ien1 - 1;
if (mis >= delx && mis >= dely[yy])
col1[yy] = mis;else if (delx >= dely[yy]) {
col1[yy] - delx;
ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) {dx[id].ijmp++;if (++ij >= MAXJMP) {writejmps(id);ij = dx[id].ijmp = 0;dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset);
}
>
dx[id].jp.n[ij] = ndelx;dx[id].jp.x[ij] = xx;dx[id].score = delx;
}
else {col1[yy] = dely[yy];ij = dx[id].ijmp;if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) {dx[id].ijmp++;if (++jj >= MAXJMP) {writejmps(id);ij = dx[id].ijmp = 0;dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset);
>
>
dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy];dx[id].jp.x[ij] = xx;dx[id].score = delyfyy];
}
if (xx == lenO && yy < Ien1) {/* last col
*/
if (endgaps)
col1[yy] -= ins0+ins1*(len1-yy);if (col1[yy] > smax) {
smax = col1[yy];dmax = id;
>
}
}
if (endgaps && xx < lenO)col1[yy-1] -= insO+ins1*(lenO-xx);if (col1[yy-1] > smax) {smax = col1[yy-1];dmax = id;
}
tmp = colO; colO = col1; col1 = tmp; >(void) free((char *)ndely);(void) free((char *)dely);(void) free((char *)colO);(void) free((char *)col1); }/*
* print() — only routine visible outside this module
*
* static:
* getmat() - trace back best path, count matches: print()
* pr_align() - print alignment of described in array p[]: print()
* dumpblock() - dump a block of lines with numbers, stars: pr_align()
* nums() - put out a number line: dumpblock()
* putline() - put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock()
* stars() - -put a line of stars: dumpblock()
* stripname() - strip any path and prefix from a seqname*/
#include "nw.h"#define SPC3
#define PLINE 256 /* maximum output line 7<table>table see original document page 123</column></row><table><table>table see original document page 124</column></row><table>p1 = seqx[1] + pp[0].spc;nO = pp[1].spc + 1;n1 = pp[0].spc + 1;nm = 0;
while (*p0 && *p1 ) {if (sizO) {
p1++;n1++;sizO-;
}
else if (sizl) {
p0++;n0++;sizl-;
}
else {
if (xbm[*pO-,A,]&xbm[*p1-,A'])
nm++;if (n0++ == pp[0].x[iO])
sizO = pp[0].n[iO++J;if (n1++ == pp[1].x[i1])
sizl = pp[1].n[i1++];
p0++;p1++;
}
}
/* pct homology:<table>table see original document page 126</column></row><table>else
fprintf(fx,
"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d perresidue)\n",smax, PINSO, PINS1);if (endgaps)
fprintf(fx,
"<endgaps penalized. left endgap: %d %s%s, right endgap: %d%s%s\n",
firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap == 1)? "": "s",lastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap == 1)? "": "s");
else
fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n");
}
static nm; /* matches in core - for checking */
static Imax; /* lengths of stripped file names */
static ij[2]; /* jmp index for a path */
static nc[2]; /* number at start of current line 7
static ni[2J; /* current elem number -- for gapping 7
static siz[2];
static char *ps[2]; /* ptr to current element 7static char *po[2]; /* ptr to next output char slot 7static char out[2][P_LINE]; /* output line 7static char star[P_LINE]; /* set by stars() 7/*
* print alignment of described in struct path pp[]
7
staticpr_align(){
int nn; /* char count */
int more;register i;
for (i = 0, Imax = 0; i < 2; {nn = stripname(namex[i]);if (nn > Imax)
Imax = nn;nc[i] = 1;ni[i] = 1;siz[i] = ij[i] = 0;ps[i] = seqx[i];po[i] = out[i]; }
for (nn = nm = 0, more = 1; more;) {for (i = more = 0; i < 2; i++) {/*
* do we have more of this sequence?*/
if (!*ps[i])
continue;
more++;
if (pp[i].spc) { í* leading space */*po[i]++ = '';pp[i].spc~;
}<table>table see original document page 129</column></row><table>for (i = 0; i < 2; i++)
po[i] = out[i];
nn = 0;
* dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align()7
static
dumpblock(){
register i;
for (i = 0; i < 2; i++)*po[i]~ = W;
(void) putcC\n', fx);for (i = 0; i < 2; i++) {
if (*out[i] && fout[i] != " || *(po[i]) != '')) {if (i == 0)
nums(i);if (i ==0&& *out[1])stars();
putline(i);
if (i ==0&& *out[1])
fprintf(fx, star);
if(i==1)
nums(i);
dumpblock
.dumpblock<table>table see original document page 131</column></row><table>i++;
}
}
*pn = W;
nc[ix] = i;
for (pn = nline; *pn; pn++)(void) putc(*pn, fx);(void) putc('\n\ fx);
}
/*
* put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock()*/
static
putline(ix) putiineint ix; {
...putiine
int i;register char *px;
for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++)
(void) putc(*px, fx);for (; i < lmax+P_SPC; i++)
(void) putc('fx);
4
* I* these count from 1:
* ni[] is current element (from 1)
* nc[] is number at start of current line<table>table see original document page 133</column></row><table>nm++;
>
else if (!dna && _day[*pO-'A,][*p1-'A'] > 0)cx =
else
cx = ";}
else
cx ='';*px++ = cx;
}
*px++ = '\n';*px = W;
}
/*
* strip path or prefix from pn, return len: pr_align()7
static
strip name(pn)
char *pn; /* file name (may be path) */
{
register char *px, *py;py = 0;
for (px = pn; *px; px++)if (*px == 7')
py = px+ 1;<table>table see original document page 135</column></row><table>}
/*
* read, return ptr to seq, set dna, len, maxlen
* skip lines starting with '<', or '>'
* seq in upper or lower case7
char *
getseq(file, len)
char *file; /* file name 7int *len; /* seq len 7
{
char line[1024], *pseq;
register char *px, *py;int natgc, tlen;
FILE *fp;if ((fp = fopen(file,"r")) == 0) {
fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file);
exit(1);
>
tlen = natgc = 0;
while (fgets(line, 1024, fp)) {
if (*line == ';' || *line == '<■ || *line == '>")
continue;for (px = line; *px != VT; px++)
if (isupper(*px) || islower(*px))tlen++;
}
if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) {fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlen+6,
file);
exit(1);
}
pseq[0] = pseq[1] = pseq[2] = pseq[3] = '\0';
...getseq
py = pseq + 4;*len = tlen;rewind(fp);while (fgets(line, 1024, fp)) {
if (*line == V || *line == '< || *line == '>')
continue;for (px = line; *px != VT; px++) {if (isupper(*px))*py++ = *px;
else if (islower(*px))
*py++ = toupperfpx);if (indexCATGCUYÍpy-l)))natgc++;
>}
*py++ = '\0*;
*py = W;
(void) fclose(fp);dna = natgc > (tlen/3);-> return(pseq+4);
}
char *<table>table see original document page 138</column></row><table>}
}
for (i = iO = i1 = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO;; i++) {while (1) {
for (j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.x[j] >= xx; j~)
»
...readjmps
if 0 < 0 && dx[dmax].offset && fj) {
(void) lseek(fd, dx[dmax].offset, 0);(void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp));
(voíd) read(fd, (char *)&dx[dmax].offset, sizeof(dx[dmax].offset));dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1; }
else
break; }
if(i>=JMPS){
fprintf(stderr, "%s: too many gaps in alignment\n", prog);cleanup(1);
}
if(j>= 0){siz = dx[dmax].jp.n[j];
xx = dx[dmax].jp.x[j];dmax += siz;
if (siz < 0) { /* gap in second seq */
pp[1].n[i1] = -siz;xx += siz;
/* id = xx-yy + Ien1 -1 */
pp[1].x[i1] = xx - dmax + Ien1 -1;
gapy++;<table>table see original document page 140</column></row><table>(void) close(fd);
if (ti) {
(void) unlink(jname);fj = 0;offset = 0;} }
/*
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()*/
writejmps(ix)
int ix;
{
char *mktemp();
if (!fj) {
if (mktemp(jname) < 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n", prog, jname);cleanup(1);
>
if ((fj = fopen(jname, "w")) == 0) {
fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname);exit(1);
}
}
(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj);(void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj);
>Tabela 2
<table>table see original document page 142</column></row><table>
Tabela 3
<table>table see original document page 142</column></row><table>
Tabela 4
<table>table see original document page 142</column></row><table>(número de nucleotídeos com coincidências idênticas entre as duas seqüênciasde ácidos nucleicos conforme determinado por meio de ALIGN-2) dividido por(número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucleico TAT-DNA) =6 dividido por 14 = 42,9%
Tabela 5
<table>table see original document page 143</column></row><table>
II. Composições e Métodos de Acordo com a Presente Invenção
A. Anticorpos anti-TAT
Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-TAT que podem encontrar uso no presente como agentes terapêuticos e/ou dediagnóstico. Exemplos de anticorpos incluem anticorpos policlonais,monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.
1. Anticorpos Policlonais
Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados emanimais por meio de diversas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip)do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígenorelevante (especialmente ao utilizar-se peptídeos sintéticos) a uma proteína* que seja imunogênica na espécie a ser imunizada. O antígeno pode serconjugado, por exemplo, a hemocianina de conchas (KLH), albumina de soro,tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando agente bifuncionalou derivatizante, tal como éster maleimidobenzoil sufossuccinimida(conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (atravésde resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR,em que R e R1 são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos ou derivados por meio da combinação, por exemplo, de 100 ngou 5 \ig da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos,respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeçãoda solução por via intradérmica em diversos locais. Um mês mais tarde, osanimais são incentivados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ouconjugado em adjuvante completo de Freund, por meio de injeção subcutâneaem diversos locais. Sete a quatorze dias mais tarde, os animais são sangradose o soro é testado para determinar a titulagem de anticorpos. Os animais sãoincentivados até a estabilização do título. Os conjugados podem também serelaborados em cultivo celular recombinante, na forma de fusões de proteínas.Além disso, agentes agregantes tais como alúmen são adequadamenteutilizados para aumentar a reação imunológica.
2. Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais podem ser elaborados utilizando ométodo de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser elaborados por meio de métodos de DNArecombinante (Patente Norte-Americana n° 4.816.567).
No método de hibridoma, camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado conforme descrito acimapara gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos quese unirão especificamente à proteína utilizada para imunização.
Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após aimunização, os linfócitos são isolados e fundidos em seguida com linhagem decélulas de mieloma utilizando agente de fusão apropriado, tal como polietilenoglicol, para formar célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultivo apropriado, que contém preferencialmente umaou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das célulasde mieloma parentais não fundidas (também denominadas parceiro de fusão).Caso as células de mieloma parentais, por exemplo, não possuam a enzimahipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio decultivo selecionado para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina,aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento decélulas com deficiência de HGPRT.
Células de mieloma parceiras de fusão preferidas são aquelasque se fundem eficientemente, sustentam a produção estável em alto nível deanticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveisa meio seletivo que seleciona contra as células parentais não fundidas. Aslinhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino,tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 e derivados, tais como células X63-Ag8-653disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos,Manassas, Virgínia, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humanoe heteromieloma humano-de camundongos também foram descritas para aprodução de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001(1984); e Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
O meio de cultivo no qual as células de hibridoma estãocrescendo é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonaisdirigidos contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de união deanticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada pormeio de imunoprecipitação ou por teste de união in vitro, tal comoradioimunoensaio (RIA) ou teste imunossorvente ligado por enzimas (ELISA).
A afinidade de união do anticorpo monoclonal pode serdeterminada, por exemplo, por meio da análise de Scatchard descrita emMunson et al, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Após a identificação das células de hibridoma que produzemanticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clonespodem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição ecultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies andPractice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultivoapropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo naforma de tumores de ascite em animal, por exemplo, por meio de injeçãointraperitoneal das células em camundongos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultivo, fluido de ascite ou soro pormeio de procedimentos convencionais de purificação de anticorpos, tais comocromatografia de afinidade (utilizando, por exemplo, proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de troca de íons, cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese de gel, diálise etc.
DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado eseqüenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, por exemplo,sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de unir-se especificamente agenes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). As célulasde hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA podeser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida emcélulas hospedeiras tais como células de E. coli, células de COS de símios, célulasde Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma,não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorposmonoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre aexpressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluemSkerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Plückthun, Immunol.Revs. 130:151-188 (1992).
Em realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentosde anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorposgeradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348: 552-554 (1990), Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos humanos emurinos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaçõessubseqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade(faixa de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo,como estratégia de construção de bibliotecas de fagos muito grandes(Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266 (1993)). Desta forma, estastécnicas são alternativas viáveis para as técnicas de hibridoma de anticorposmonoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzirpolipeptídeos de anticorpos de fusão ou quiméricos, por meio de substituição,por exemplo, de seqüências de domínio constante de cadeia pesada e cadeialeve (CH e CL) pelas seqüências murinas homólogas (Patente Norte-Americanan° 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851 (1984)),ou por meio de fusão da seqüência de codificação de imunoglobulina com aseqüência de codificação para polipeptídeo não de imunoglobulina(polipeptídeo heterólogo), no todo ou em parte. As seqüências de polipeptídeosnão de imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de anticorpo,ou são substituídas pelos domínios variáveis de um local de combinação deantígenos de anticorpo para criar anticorpo bivalente quimérico quecompreende um local de combinação de antígenos que possui especificidadepara um antígeno e outro local de combinação de antígenos que possuiespecificidade para antígeno diferente.
3. Anticorpos humanizados e humanos
Os anticorpos anti-TAT de acordo com a presente invençãopodem compreender adicionalmente anticorpos humanizados ou anticorposhumanos. Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (tais comomurinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seusfragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subseqüências de uniãode antígenos de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluemimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de regiãode determinação complementar (CDR) do paciente são substituídos porresíduos de CDR de espécie não humana (anticorpo doador), tal comocamundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade ecapacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura Fvda imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanoscorrespondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreenderresíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüênciasde estrutura ou CDR importadas. Geralmente, o anticorpo humanizadocompreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente doisdomínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDRcorrespondem às de imunoglobulina não humana e todas ou substancialmentetodas as regiões FR são as de seqüência de consenso de imunoglobulinahumana. O anticorpo humanizado também compreenderá idealmente pelomenos uma porção de região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente ade imunoglobulina humana (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986);Riechmann et al, Nature, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,2:593-596(1992)).
Métodos de humanização de anticorpos não humanos são bemconhecidos na técnica. Geralmente, anticorpo humanizado contém um ou maisresíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana.
Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentementedenominados resíduos "importados", que são tomados tipicamente a partir dedomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al,Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988);Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio de substituição deCDRs ou seqüências de CDR de roedores pelas seqüências correspondentesde anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados"são anticorpos quiméricos (Patente Norte-Americana n° 4.816.567), em quesubstancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sidosubstituído pela seqüência correspondente de espécie não humana. Na prática,os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em quealguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR sãosubstituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na elaboração dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade e reação de HAMA (anticorpo anti-camundongo humano) quando o anticorpo destinar-se a uso terapêutico humano.
De acordo com o chamado método de "melhor adequação", a seqüência dodomínio variável de anticorpo roedor é selecionada contra toda a biblioteca deseqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência de domínio Vhumano que é mais próxima da do roedor é identificada e a sua região de estrutura(FR) humana é aceita para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utilizaregião de estrutura específica derivada da seqüência de consenso de todos osanticorpos humanos de subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. Amesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes(Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A, 89: 4285 (1992); Presta et al, J.Immunol. 151:2623 (1993)).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade de união para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo commétodo preferido, anticorpos humanizados são preparados por meio deprocesso de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüênciasparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Sãodisponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturasconformacionais tridimensionais prováveis de possíveis seqüências deimunoglobulina selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da possível seqüência deimunoglobulina, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidadeda possível imunoglobulina de unir o seu antígeno. Desta forma, os resíduos deFR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora eimportada para atingir a característica de anticorpo desejada, tal como maiorafinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos da regiãohipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos na influência daunião de antígenos.
São contempladas diversas formas de anticorpo anti-TAThumanizado. O anticorpo humanizado pode ser, por exemplo, fragmento deanticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado a um ou mais agentescitotóxicos, a fim de gerar imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpohumanizado pode ser anticorpo intacto, tal como anticorpo lgG1 intacto.
Como alternativa para a humanização, podem ser geradosanticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animaistransgênicos (tais como camundongos) que são capazes, medianteimunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos naausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, porexemplo, que a exclusão homozigótica do gene da região de união de cadeiapesada de anticorpos (Jh) em camundongos quiméricos e mutantes delinhagem de gérmens resulta na inibição completa da produção de anticorposendógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina dalinhagem de gérmen humano nesses camundongos com mutação da linhagemde gérmens resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafiocom antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. A/aí/. Acad. Sei. U. S.A. 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemannet al, Yearin Immuno. 7: 33 (1993); Patentes Norte-Americanas n° 5.545.806,5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm); 5,545,807; e WO 97/17852.
Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos(McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorposhumanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes dedomínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. Deacordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonadosem quadro em gene de proteína de revestimento maior ou menor de* bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma defragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula dê fago.Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita única dogenoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais doanticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo queexibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades dacélula B. A exibição de fago pode ser realizada em uma série de formatos,analisados, por exemplo, em Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., CurrentOpinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fontes de segmentosde gene V podem ser utilizadas para exibição do fago. Clackson et al, Nature,352: 624-628 (1991) isolaram conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona abaços de camundongos imunizados. Repertório de genes V de doadoreshumanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para conjuntodiverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al, J. Mol. Bioi. 222: 581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Vide também asPatentes Norte-Americanas n° 5.565.332 e 5.573.905.
Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem tambémser gerados por células B ativadas in vitro (vide as Patentes Norte-Americanasn° 5.567.610 e 5.229.275).
4. Fragmentos de anticorpos
Em certas circunstâncias, existem vantagens na utilização defragmentos de anticorpos, e não anticorpos inteiros. O menor tamanho dosfragmentos permite liberação rápida e pode gerar maior acesso aostumores sólidos.
Foram desenvolvidas diversas técnicas de produção de fragmentosde anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio dedigestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo, Morimoto et al,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan etal, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agoraproduzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos deanticorpos Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em E. coli e dele secretados,de forma a permitir a produção fluente de grandes quantidades desses fragmentos.Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagosde anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH podemser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formarfragmentos de F(ab')2 (Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordocom outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente apartir do cultivo de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de Fab e F(ab')2com maior meia-vida in vivo que compreendem resíduos de epítopos de união dereceptores de recuperação são descritos na Patente Norte-Americana n° 5.869.046.Outras técnicas de produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para ostécnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é fragmento deFv de fita única (scFv). Vide WO 93/16185; Patente Norte-Americana n° 5.571.894;e Patente Norte-Americana n° 5.587.458. Fv e sFv são as únicas espécies comlocais de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; por isso,elas são apropriadas para reduzida união não específica durante a utilização in vivo.Proteínas de fusão de sFv podem ser contruídas para gerar a fusão de proteínaefetora no terminal amino ou carbóxi de sFv. Vide Antibody Engineeríng, ed.Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpo pode também ser "anticorpo linear",conforme descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 5.641.870. Essesfragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
5. Anticorpos biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuemespecificidades de união para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplosde anticorpos biespecíficos podem unir-se a dois epítopos diferentes deproteína TAT conforme descrito no presente. Outros desses anticorpos podemcombinar local de união de TAT com local de união para outra proteína.Alternativamente, braço anti-TAT pode ser combinado com braço que se une amolécula acionadora sobre leucócito, tal como molécula receptora de células T(por exemplo, CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI(CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a dirigir e localizarmecanismos de defesa celular para a célula que expressa TAT. Anticorposbiespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicospara células que expressem TAT. Esses anticorpos possuem braço de uniãode TAT e braço que une o agente citotóxico (tal como saporina, anti-interferona-a, vinca alcalóide, cadeia A rícina, metotrexato ou hapteno deisótopo radioativo). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados naforma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (taiscomo anticorpos biespecíficos F(ab')2)-
WO 96/16673 descreve anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRIIIbiespecífico e a Patente Norte-Americana n° 5.837.234 descreve anticorpo anti-ErbB2/anti-FcyRI biespecífico. Anticorpo anti-ErbB2/Fca biespecífico é exibidoem WO 98/02463. A Patente Norte-Americana n° 5.821.337 ensina anticorpoanti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico.
Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos decomprimento total baseia-se na coexpressão de dois pares de cadeia leve ecadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuemespecificidades diferentes (Millstein et al, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devidoà disposição aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esseshibridomas (quadromas) produzem mistura potencial de dez moléculas deanticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica" correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada pormeio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e osrendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos emWO 93/08829 e em Traunecker et al, 1991, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
De acordo com abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de união desejadas (locais de combinaçãode anticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências de domínio constante deimunoglobulina. Preferencialmente, a fusão efetua-se com domínio constantede cadeia pesada de Ig, que compreende pelo menos parte das regiões dearticulação, Ch2 e Ch3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeiapesada (CH1) contendo o local necessário para união de cadeias levespresente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificadores das fusõesde cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina são inseridos em vetores de expressão separados ecotransfectados em célula hospedeira apropriada. Isso proporciona maiorflexibilidade de ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos depolipeptídeos em realizações em que razões desiguais das três cadeias depolipeptídeos utilizadas na construção proporcionam rendimento ideal doanticorpo biespecífico desejado. É possível, entretanto, inserir as seqüênciascodificadoras de duas ou de todas as três cadeias de polipeptídeos em umúnico vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias depolipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando asrazões não apresentarem efeito significativo sobre o rendimento dacombinação de cadeia desejada.
Em realização preferida desta abordagem, os anticorposbiespecíficos são compostos de cadeia pesada de imunoglobulina híbrida comprimeira especificidade de união em um braço e um par de cadeia leve ecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece segunda especificidadede união) no outro braço. Concluiu-se que esta estrutura assimétrica possibilitaa separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia deimunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve de imunoglobulinaem apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona forma fácil deseparação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Para detalhesadicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo,Suresh et al, Methods in Enzymology, 121:210(1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente Norte-Americana n° 5.731.168, a superfície intermediária entre um par de moléculasde anticorpos pode ser construída de forma a maximizar o percentual deheterodímeros que é recuperado do cultivo de células recombinantes. Asuperfície intermediária preferida compreende pelo menos uma parte dodomínio Ch3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidospequenas da superfície intermediária da primeira molécula de anticorpo sãosubstituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano)."Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s)lateral(is) grande(s) são criadas sobre a superfície intermediária da segundamolécula de anticorpo por meio da substituição de cadeias laterais deaminoácidos grandes com menores (por exemplo, alanina ou treonina). Issoproporciona mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobreoutros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado,por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico alvo a célulasindesejadas (Patente Norte-Americana n° 4.676.980) e para o tratamento deinfecções por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorposheteroconjugados podem ser fabricados utilizando qualquer método reticulanteconveniente. Os agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos natécnica e descritos na Patente Norte-Americana n° 4.676.980, juntamente comuma série de técnicas reticulantes.As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligaçõesquímicas. Brennan et al, 229:81, Science, 229: 81 descrevem um procedimentoem que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerarfragmentos de F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agenteformador de complexo de ditiol arsenito de sódio, para estabilizar ditióisvizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos deFab' gerados são convertidos em seguida em derivados de tionitrobenzoato(TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então novamente convertido no Fab'-tiol por meio de redução com mercaptoetilamina e é misturado com quantidadeeqüimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico.Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentespara a imobilização seletiva de enzimas.
Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta defragmentos de Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)descrevem a produção de molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmentehumanizado. Cada fragmento de Fab' foi secretado separadamente de E. coli esubmetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpobiespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de unir-se a célulasque sobreexpressam o receptor de ErbB2 e células T humanas normais, bem comoacionar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor demama humanos. Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentosde anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultivo celular recombinantetambém foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo,utilizando fechos de leucina. Kostelny et al, J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992).Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às partesFab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão genética. Os homodímeros deanticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, emseguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Estemétodo pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos.A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A, 90: 6444-6448 (1993) forneceu mecanismo alternativo de fabricação defragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem VHconectado a V|_ por ligante que é curto demais para permitir o emparelhamentoentre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios Vhe Vl de um fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VL e Vhcomplementares de outro fragmento, de maneira a formar dois locais de união deantígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficosutilizando dímeros Fv de fita única (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al, J.Immunol., 152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.
Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J.Immunol. 147: 60 (1991).
6. Anticorpos heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados também se encontram dentro doescopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostosde dois anticorpos unidos covalentemente. Esses anticorpos foram propostos,por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas(Patente Norte-Americana n° 4.676.980) e para o tratamento de infecções porHIV (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Contempla-se que osanticorpos podem ser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos naquímica de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentesreticularif.es. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizandoreação de troca de dissulfeto ou por meio da formação de ligação tioéter.Exemplos de reagentes apropriados com este propósito incluem iminotiolato e4-mercaptobutirimidato de metila e os descritos, por exemplo, na PatenteNorte-Americana n° 4.676.980.
7. Anticorpos multivalentes
Anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado)mais rapidamente que anticorpo bivalente por célula que expresse antígeno aoqual se unem os anticorpos. Os anticorpos de acordo com a presente invençãopodem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes da classe IgM) comtrês ou mais locais de união de antígenos (por exemplo, anticorpostetravalentes) que podem ser facilmente produzidos por meio de expressãorecombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias de polipeptídeos doanticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender domínio de dimerizaçãoe três ou mais locais de união de antígenos. O domínio de dimerizaçãopreferido compreende (ou consiste de) região Fc ou região de articulação.
Neste cenário, o anticorpo compreenderá região Fc e três ou mais locais deunião de antígenos amino-terminais para a região Fc. O anticorpo multivalentepreferido do presente compreende (ou consiste de) três a cerca de oito, maspreferencialmente quatro locais de união de antígenos. O anticorpomultivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (e,preferencialmente, duas cadeias de polipeptídeos), em que a(s) cadeia(s) depolipeptídeo(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. A(s) cadeia(s)de polipeptídeo(s) pode(m) compreender, por exemplo, VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é primeiro domínio variável, VD2 é segundo domínio variável,Fc é uma cadeia de polipeptídeos de região Fc, X1 e X2 representamaminoácido ou polipeptídeo e n é 0 ou 1. A(s) cadeia(s) de polipeptídeo(s)w pode(m) compreender, por exemplo: cadeia de VH-CH1-ligação flexível-VH-CH1-região Fc; ou cadeia de VH-CH1-VH-CH1 -região Fc. O anticorpomultivalente do presente compreende ainda, preferencialmente, pelo menosdois (preferencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeialeve. O anticorpo multivalente do presente pode compreender, por exemplo,cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve.Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve contemplados no presentecompreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente,compreendem ainda um domínio CL.
8. Elaboração de função efetora
Pode ser desejável modificar o anticorpo de acordo com apresente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de forma aaumentar a citotoxicidade mediada por células dependente de antígenos(ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo.Isso pode ser atingido por meio da introdução de uma ou mais substituições deaminoácidos em região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente,resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, de forma apermitir a formação de uniões de dissulfeto intercadeias nessa região. Oanticorpo homodimérico gerado desta forma pode possuir capacidade deinternalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complementoaprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). VideCaron et al, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B., J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumorosaaprimorada podem também ser preparados utilizando reticulantesheterobifuncionais conforme descrito em Wolff et al, Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser elaborado anticorpo que contémregiões Fc duplas e, portanto, pode possuir capacidades de ADCC e lisecomplementar aprimoradas. Vide Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a meia vida do anticorpo em soro, pode-seincorporar um epítopo de união de receptor de salvados ao anticorpo(especialmente fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, naPatente Norte-Americana n° 5.739.277. Da forma utilizada no presente, aexpressão "epítopo de união de receptor de salvados" designa epítopo daregião Fc de molécula de IgG (tal como IgGi, lgG2, lgG3 ou lgG4) que éresponsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG.
9. Imunoconiuqados
A presente invenção também se refere a imunoconjugados quecompreendem um anticorpo conjugado a agente citotóxico tal como agentequimioterapêutico, agente inibidor do crescimento, toxina (tal como toxinaenzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ouseus fragmentos) ou isótopo radioativo (ou seja, radioconjugado).
Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração dessesimunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas eseus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A,fragmentos ativos não de união da toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (dePseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia demodeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurítes fordii, proteínas de diantina,proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordicacharantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma série deradionucletos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados.Exemplos incluem 212Bi, 1311, 131 In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo eagente citotóxico são fabricados utilizando uma série de agentes acopladoresde proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres(tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato dedi-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (taiscomo bis(p-azidobenzoií) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais comobis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo,conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono14 (MX-DTPA) é exemplo de agente quelante para conjugação deradionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026.
Os conjugados de anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculaspequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteno e CC1065 e osderivados dessas toxinas que apresentam atividade de toxina também sãocontemplados no presente.
Maitansina e maitansinóides
Em realização preferida, anticorpo anti-TAT (comprimento total oufragmentos) de acordo com a presente invenção é conjugado a uma ou maismoléculas de maitansinóide.
Maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem inibindo apolimerização de tubulina. M aitansina foi isolada pela primeira vez a partir doarbusto do leste africano Maytenus serrata (Patente Norte-Americana n° 3.896.111).Descobriu-se em seguida que certos micróbios também produzem maitansinóides,tais como maitansinol e ésteres C-3 maitansinol (Patente Norte-Americana n°4.151.042). Maitansinol sintético, seus derivados e análogos são descritos, porexemplo, nas Patentes Norte-Americanas n° 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746,4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4,308,269, 4.309.428,4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866,4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533, cujos relatórios descritivos sãoexpressamente incorporados ao presente como referência.
Conjugados de anticorpo e maitansinóide
Èm tentativa de aumento do seu índice terapêutico, maitansina emaitansinóides foram conjugados a anticorpos que se unem especificamente aantígenos de células tumorosas. Imunoconjugados contendo maitansinóides esua utilização terapêutica são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas n° 5.208.020, 5.416.064 e Patente Européia n° EP 0.425.235 B1,cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente comoreferência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93: 8618-8623 (1996)descreveram imunoconjugados que compreendem maitansinóide denominadoDM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido a câncer colo-retal humano.Concluiu-se que o conjugado é altamente citotóxico com direção a célulascancerosas do cólon cultivadas e exibiu atividade antitumorosa em teste decrescimento tumoroso in vivo. Chari et al, Câncer Research 52: 127-131 (1992)descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado, por meiode ligação de dissulfeto, ao anticorpo A7 murino que se une a um antígenosobre linhagens de células de câncer do cólon humano ou a outro anticorpomonoclonal murino TA.1 que une o oncogene HER-2/new. A citotoxicidade doconjugado de TA.1 e maitansinóide foi testada in vitro sobre a linhagem decélulas de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antígenosde superfície HER-2 por célula. O conjugado de drogas atingiu grau decitotoxicidade similar à droga de maitansinóide livre, que poderá ser aumentadapor meio do aumento da quantidade de moléculas de maitansinóide pormolécula de anticorpo. O conjugado de A7 e maitansinóide exibiu baixacitotoxicidade sistêmica em camundongos.
Conjugados de maitansinóide e anticorpo anti-polipeptídeo TAT(imunoconjugados)
Os conjugados de maitansinóide e anticorpo anti-TAT sãopreparados por meio de ligação química de anticorpo anti-TAT a molécula demaitansinóide sem reduzir significativamente a atividade biológica do anticorpoou da molécula de maitansinóide. Em média, três a quatro moléculas demaitansinóide conjugadas por molécula de anticorpo exibiram eficácia noaumento da citotoxicidade de células alvo sem prejudicar função ousolubilidade do anticorpo, embora se esperasse que até uma molécula detoxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade sobre o uso de anticorpo bruto.Maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados pormeio de técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais.Maitansinóides apropriados são descritos, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 5.208.020 e nas outras patentes e publicações não patenteadasdescritas acima no presente. Os maitansinóides preferidos são maitansinol eanálogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posiçõesda molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.
Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para afabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, que incluem, porexemplo, os descritos na Patente Norte-Americana n° 5.208.020 ou Patente EP0425235B1, Chari et al, Câncer Research 52: 127-131 (1992) e Pedido dePatente Norte-Americano n° 10/960.602, depositado em oito de outubro de2004, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presentecomo referência. Conjugados de anticorpo e maitansinóide que compreendemo componente ligante SMCC podem ser preparados conforme descrito noPedido de Patente Norte-Americano n° 10/960.602, depositado em oito deoutubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos de dissulfeto, grupos detioéter, grupos instáveis ácidos, grupos fotoinstáveis, grupos instáveis depeptidase ou grupos instáveis de esterase, conforme descrito nas patentesidentificadas acima, com grupos de dissulfeto e tioéter sendo preferidos.Grupos de ligação adicionais são descritos e exemplificados no presente.
Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser" fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínasbifuncionais, tais como 3-(2-pÍridildÍtio)propionato de N-succinimidila (SPDP),ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Osagentes acopladores particularmente preferidos incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737(1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para fornecerligação de dissulfeto.
O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide emdiversas posições, dependendo do tipo da ligação. Ligação éster pode serformada, por exemplo, por meio de reação com grupo hidroxila, utilizandotécnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3que contém um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila,na posição C-15 modificada com grupo hidroxila e na posição C-20 que contémgrupo hidroxila. Em realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 demaitansinol ou análogo de maitansinol.
Auristatinas e Dolostatinas
Em algumas realizações, o imunoconjugado compreendeanticorpo de acordo com a presente invenção conjugado a dolastatinas ouderivados e análogos peptídicos de dolostatina, as auristatinas (PatentesNorte-Americanas n° 5.635.483 e 5.780.588). Demonstrou-se que dolastatinase auristatinas interferem com dinâmicas de microtúbulos, hidrólise de GTP edivisão nuclear e celular (Woyke et al (2001), Antimicrob. Agents andChemother. 45 (12): 3580-3584) e possuem atividade anticâncer (US5.663.149) e antifúngica (Pettit et al (1998), Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). A porção de droga dolastatina ou auristatina pode ser ligadda aoanticorpo por meio do terminal N (amino) ou do terminal C (carboxila) daporção de droga peptídica (WO 02/088172).
Exemplos de realizações de auristatina incluem as porções dedroga monometilauristatina ligadas por terminal N DE e DF (ou seja, MMAE eMMAF), descritas em Senter et al, Proceedings of the American Association forCâncer Research, Volume 45, Resumo n° 623, apresentado em 28 de marçode 2004, cujo relatório descritivo é expressamente incorporado integralmentecomo referência.
Tipicamente, porções de drogas com base em peptídeo podemser preparadas por meio da formação de união de peptídeo entre dois ou maisaminoácidos e/ou fragmentos de peptídeos. Estas uniões de peptídeos podemser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de faseslíquidas (vide E. Schrõder e K. Lübke, The Peptides, volume 1, págs. 76-136,1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química depeptídeos. As porções de droga auristatina/dolastatina podem ser preparadasde acordo com os métodos de: U. S. 5.635.483: US 5.780.588; Pettit et al(1989), J. Am. Chem. Soe. 111: 5463-5465; Pettit et al (1998), Anti-CancerDrug Design 13: 243-277; Pettit, G. R. et al, Synthesis, 1996, 719-725; Pettit etal (1996), J. Chem. Soe. Perkin Trans. 15: 859-863; e Doronina (2003), Nat.Biotechnol. 21 (7): 778-784.
Caliqueamicina
Outro imunoconjugado de interesse compreende anticorpo anti-TAT conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A famíliacaliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas de DNA de fitadupla em concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados dafamília de caliqueamicina, vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.712.374,5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296(todas da American Cyanamid Company). Análogos estruturais decaliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a yi, 012,a3', N-acetil-yA PSAG e e'i (Hinman et al, Câncer Research, 53: 3336-3342(1993), Lode et al, Câncer Research, 58: 2925-2928 (1998) e as PatentesNorte-Americanas da American Cyanamid mencionadas acima). Outra drogaantitumorosa à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é antifolato.Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm locais intracelulares de ação e nãocruzam facilmente a membrana de plasma. Portanto, a absorção celular dessesagentes por meio de internalização mediada por anticorpos aumentagrandemente os seus efeitos citotóxicos.
Outros agentes citotóxicos
Outros agentes antitumorosos que podem ser conjugados aosanticorpos anti-TAT de acordo com a presente invenção incluem BCNU,estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, família de agentes conhecidacoletivamente como complexo LL-E33288, descrito nas Patentes Norte-Americanas n° 5.053.394 e 5.770.710, bem como esperamicinas (PatenteNorte-Americana n° 5.877.296).
Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem serutilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de união da toxina dedifteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A,cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuntesfordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide,por exemplo, WO 93/21232, publicada em 28 de outubro de 1993.
A presente invenção contempla ainda imunoconjugado formadoentre anticorpo e composto com atividade nucleolítica (por exemplo,ribonuclease ou endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase).
Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreenderum átomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponívelpara a produção de anticorpos anti-TAT rádio-conjugados. Exemplos incluemAt211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativosde Lu. Quando o conjugado for utilizado para diagnóstico, ele podecompreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como tc99m ou1123, ou uma marca de centrifugação para formação de imagens por deressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação deimagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio,manganês ou ferro.
As rádio-marcas ou outras podem ser incorporadas ao conjugadode formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado oupode ser sintetizado por meio de síntese química de aminoácidos, utilizandoprecursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor-19 nolugar de hidrogênio. Marcas tais como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111 podem serligadas por meio de resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligadopor meio de resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978),Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser utilizado para incorporariodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press,1989) descreve outros métodos em detalhes.
Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem serfabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínasbifuncionais, tais como 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidila (SPDP),ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano(IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilaHCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (taiscomo glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) ecompostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito emVitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) éexemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo.Vide WO 94/11026. O ligante pode ser "ligante divisível" que possibilita aliberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, liganteinstável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante dedimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992); Patente Norte-Americana n° 5.208.020).
Os compostos de acordo com a presente invenção contemplamexpressamente, mas sem limitar-se a ADC preparado com reagentesreticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP,SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS,sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato desuccinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (tal como pormeio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, E. U. A.). Vide páginas 467 a498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão quecompreende o anticorpo anti-TAT e agente citotóxico, por exemplo, por meio detécnicas recombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA podecompreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes do conjugado,sejam elas adjacentes entre si ou separadas por região codificadora de peptídeo deligação que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a"receptor" (tal como estreptavidina) para uso em direcionamento prévio detumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado aopaciente, seguido pela remoção de conjugado não unido da circulação,utilizando agente limpante e, em seguida, administração de "ligante" (tal comoavidina) que é conjugado a agente citotóxico (tal como radionucleotídeo).
10. Imunolipossomos
Os anticorpos anti-TAT descritos no presente também podem serformulados como imunolipossomos. "Lipossomo" é uma pequena bolhacomposta de diversos tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útilpara o fornecimento de drogas a mamíferos. Os componentes do lipossomosão normalmente dispostos em formação bicamadas, similar à disposição delipídios de membranas biológicas. Os lipossomos que contêm o anticorpo sãopreparados por meio de métodos conhecidos na técnica, conforme descrito emEpstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4030 (1980); Patentes Norte-Americanas n°4.485.045 e 4.544.545; e WO 97/38731 publicada em 23 de outubro de 1997.Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na Patente Norte-Americana n° 5.013.556.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio dométodo de evaporação de fase reversa com composição de lipídios quecompreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG(PEG-PE). Os lipossomos são extrudados por meio de filtros com tamanho deporo definido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentosde Fab' do anticorpo de acordo com a presente invenção podem serconjugados aos lipossomos descritos em Martin et al, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por meio de reação de intercâmbio de dissulfetos. Agentequimioterapêutico é opcionalmente contido no interior do lipossomo. VideGabizon et al, J. National Câncer Inst. 81 (19): 1484 (1989).
B. Oligopeptídeos de união de TAT
Os oligopeptídeos de união de TAT de acordo com a presenteinvenção são oligopeptídeos que se unem, preferencialmente de formaespecífica, a polipeptídeo TAT conforme descrito no presente. Oligopeptídeosde união de TAT podem ser sintetizados quimicamente utilizando metodologiade síntese de oligopeptídeos conhecida ou podem ser preparados e purificadosutilizando tecnologia recombinante. Os oligopeptídeos de união de TATnormalmente possuem pelo menos cerca de cinco aminoácidos decomprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10; 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30; 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40; 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50; 51, 52, 53, 54, 55,56, 57, 58, 59, 60; 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70; 71, 72, 73, 74, 75, 76,77, 78, 79, 80; 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90; 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimento ou mais, em que essesoligopeptídeos são capazes de unir-se, preferencialmente de forma específica,a polipeptídeo TAT conforme descrito no presente. Os oligopeptídeos de uniãode TAT podem ser identificados sem experimentação indevida, utilizandométodos bem conhecidos. Neste particular, observa-se que os métodos deseleção de bibliotecas de oligopeptídeos em busca de oligopeptídeos quesejam capazes de unir-se especificamente a polipeptídeo alvo são bemconhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n°5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 e5.663.173; Patentes PCT n° WO 84/03506 e WO 84/03564; Geysen et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A, 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc. Natl. Acad.Sei. U. S. A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al, Synthetic Peptides as Antigens,130-149 (1986); Geysen et al, J. Immunol. Meth., 102: 259-274 (1987); Schoofset al, J. Immunol., 140: 611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al (1990), Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A., 87: 6378; Lowman, H. B. et al (1991), Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al (1991), Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al (1991), J.Mol. Biol., 222: 581; Kang, A. S. et al (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88:8363 e Smith, G. P. (1991), Current Opin. Biotechnol., 2: 668).
Neste particular, exibição de bacteriófagos (fagos) é método bemconhecido que permite a seleção de grandes bibliotecas de oligopeptídeos paraidentificar membro(s) dessas bibliotecas que seja(m) capaz(es) de unir-seespecificamente a polipeptídeo alvo. Exibição de fagos é método por meio doqual polipeptídeos variantes são exibidos na forma de proteínas de fusão paraa proteína de revestimento sobre a superfície de partículas de bacteriófagos(Scott, J. K. e Smith, G. P. (1990), Science 249: 386). A utilidade de exibição defagos reside no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteínasaleatorizadas seletivamente (ou cDNAs clonados aleatoriamente) podem serordenadas rápida e eficientemente para as seqüências que unem moléculaalvo com alta afinidade. A exibição de bibliotecas de peptídeos (Cwirla, S. E. etal (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 87: 6378) ou de proteínas (Lowman,H. B. et al (1991), Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T. et al (1991), Nature,352: 624; Marks, J. D. et al (1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang, A. S. et al(1991), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88: 8363) sobre fagos vem sendoutilizada para selecionar milhões de polipeptídeos ou oligopeptídeos paradeterminar aqueles com propriedades de união específicas (Smith, G. P.(1991), Current Opin. Biotechnol., 2: 668). A seleção de bibliotecas de fagos demutantes aleatórios requer estratégia de construção e propagação de grandequantidade de variantes, procedimento de purificação por afinidade utilizando oreceptor alvo e meio de avaliação dos resultados de enriquecimentos de união.Patentes Norte-Americanas n° 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 e 5.663.143.
Embora a maior parte dos métodos de exibição de fagos tenhautilizado fago filamentoso, sistemas de exibição de fago lambdóide (WO95/34683; US 5.627.024), sistemas de exibição de fagos T4 (Ren et al, Gene,215: 439 (1998); Zhu et al, Câncer Research, 58 (15): 3209-3214 (1998); Jianget al, Infection & Immunity, 65 (11): 4770-4777 (1997); Ren etal, Gene, 195 (2):303-311 (1997); Ren, Protein Sei., 5: 1833 (1996); Efimov et al, Vírus Genes,10: 173 (1995)) e sistemas de exibição de fagos T7 (Smith e Scott, Methods inEnzymology, 217: 228-257 (1993); US 5.766.905) também são conhecidos.
Muitos outros aprimoramentos e variações do conceito básico deexibição de fagos já foram desenvolvidos. Estes aprimoramentos aumentam acapacidade dos sistemas de exibição de selecionar bibliotecas de peptídeospara união a moléculas alvo selecionadas e exibir proteínas funcionais com opotencial de seleção dessas proteínas em busca de propriedades desejadas.
Dispositivos de reação combinatória para reações de exibição de fagos foramdesenvolvidos (WO 98/14277) e bibliotecas de exibição de fagos foramutilizadas para analisar e controlar interações bimoleculares (WO 98/20169;WO 98/20159) e propriedades de peptídeos helicoidais restritos (WO98/20036). WO 97/35196 descreve método de isolamento de ligante deafinidade no qual biblioteca de exibição de fagos é colocada em contato comsolução na qual o ligante unir-se-á a molécula alvo e segunda solução na qualo ligante de afinidade não se unirá à molécula alvo, para isolar seletivamenteligantes de união. WO 97/46251 descreve método de biocombinação debiblioteca de exibição de fagos aleatória com anticorpo purificado por afinidadee isolamento em seguida do fago de união, seguido por processo demicrocombinação utilizando recipientes de microplacas para isolar fago deunião com alta afinidade. O uso de proteína A de Staphylococcus aureus comomarca de afinidade também foi relatado (Li et al (1998), Mol. Biotech., 9: 187).WO 97/47314 descreve o uso de bibliotecas de subtração de substrato paradiferenciar especificidades de enzimas utilizando biblioteca combinatória quepode ser biblioteca de exibição de fagos. Método de seleção de enzimasapropriadas para uso em detergentes utilizando exibição de fagos é descritoem WO 97/09446. Métodos adicionais de seleção de proteínas de uniãoespecíficas são descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 5.498.538,5.432.018 eWO 98/15833.
Métodos de geração de bibliotecas de peptídeos e seleçãodessas bibliotecas também são descritos nas Patentes Norte-Americanas n°5.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018,5.698.426, 5.763.192 e 5.723.323.
C. Moléculas orgânicas de união de TAT
Moléculas orgânicas de união de TAT são moléculas orgânicasdiferentes de oligopeptídeos ou anticorpos conforme definido no presente que seunem, preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conforme descritono presente. Moléculas orgânicas de união de TAT podem ser identificadas esintetizadas quimicamente utilizando metodologia conhecida (vide, por exemplo, asPatentes PCT n° WO 00/00823 e WO 00/39585). As moléculas orgânicas de uniãode TAT normalmente possuem tamanho de menos de cerca de 2000 daltons,alternativamente tamanho de menos de cerca de 1500, 750, 500, 250 ou 200daltons, em que essas moléculas orgânicas que são capazes de união,preferencialmente de forma específica, a polipeptídeo TAT conforme descrito nopresente podem ser identificadas sem experimentação indevida utilizando métodosbem conhecidos. N este particular, observa-se que os métodos de seleção debibliotecas de moléculas orgânicas em busca de moléculas que sejam capazes deunir-se a polipeptídeo alvo são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo,Patentes PCT n° WO 00/00823 e WO 00/39585). As moléculas orgânicas de uniãode TAT podem ser, por exemplo, aldeídos, cetonas, oximas, hidrazonas,semicarbazonas, carbazidas, aminas primárias, aminas secundárias, aminasterciárias, hidrazinas N-substituídas, hidrazidas, álcoois, éteres, tióis, tioéteres,dissulfetos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, uréias, carbamatos, carbonatos,cetais, tiocetais, acetais, tioacetais, haletos de arila, sulfonatos de arila, haletos dealquila, sulfonatos de alquila, compostos aromáticos, compostos heterocíclicos,anilinas, alquenos, alquinas, dióis, aminoálcoois, oxazolidinas, oxazolinas,tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos,cloretos de sulfonila, compostos diazo, cloretos ácidos ou similares.
D. Seleção de anticorpos anti-TAT. oligopeptídeos de união deTAT e moléculas orgânicas de união de TAT com as propriedades desejadasForam descritos acima métodos de geração de anticorpos,oligopeptídeos e moléculas orgânicas que se unem a polipeptídeos TAT. Pode-se selecionar adicionalmente anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas com certas características biológicas, conforme o desejado.
Os efeitos inibidores do crescimento de anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou outra molécula orgânica de acordo com a presente invençãopodem ser determinados por meio de métodos conhecidos na técnica,utilizando, por exemplo, células que expressem polipeptídeo TAT de formaendógena ou após transfecção com o gene TAT. Linhagens de célulastumorosas e células transfectadas com TAT apropriadas, por exemplo, podemser tratadas com anticorpo monoclonal anti-TAT, oligopeptídeo ou outramolécula orgânica de acordo com a presente invenção em concentraçõesdiversas por alguns (por exemplo, dois a sete) dias e manchadas com violetade cristal ou MTT ou analisadas por meio de algum outro teste colorimétrico.
Outro método de medição da proliferação seria por meio da comparação daabsorção de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência deanticorpo anti-TAT, oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica deunião de TAT de acordo com a presente invenção. Após o tratamento, ascélulas são colhidas e a quantidade de radioatividade incorporada no DNA équantificada em contador de cintilação. Controles positivos apropriados incluemo tratamento de linhagem celular selecionada com anticorpo inibidor docrescimento conhecido, para inibir o crescimento daquela linhagem celular. Ainibição do crescimento de células tumorosas in vivo pode ser determinada devárias formas conhecidas na técnica. Preferencialmente, a célula tumorosa éaquela que sobreexpressa polipeptídeo TAT. Preferencialmente, o anticorpoanti-TAT, oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união deTAT inibirá a proliferação celular de célula tumorosa que expresse TAT in vitroou in vivo em cerca de 25 a 100%, em comparação com a célula tumorosa nãotratada, de maior preferência cerca de 30 a 100% e, de preferência aindamaior, cerca de 50 a 100% ou 70 a 100%, em uma realização, emconcentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 jag/ml. A inibição docrescimento pode ser medida em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a30 ng/ml ou cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultivo celular, em que a inibição docrescimento é determinada em um a dez dias após a exposição das célulastumorosas ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo caso aadministração do anticorpo anti-TAT a cerca de 1 ng/kg até cerca de 100 mg/kgde peso do corpo resulte na redução do tamanho do tumor ou redução daproliferação de células tumorosas em até cerca de cinco dias a três meses apartir da primeira administração do anticorpo, preferencialmente em até cercade cinco a trinta dias.
Para selecionar anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo de união deTAT ou molécula orgânica de união de TAT que induza a morte celular, pode-se determinar a perda de integridade da membrana, conforme indicado, porexemplo, pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano ou 7AADcom relação ao controle. Pode-se realizar teste de absorção de PI na ausênciade complemento e células efetoras imunes. As células tumorosas queexpressam polipeptídeo TAT são incubadas com meio isolado ou meio quecontenha o anticorpo anti-TAT apropriado (tal como a cerca de 10 ng/ml),oligopeptídeo de união de TAT ou molécula orgânica de união de TAT. Ascélulas são incubadas por período de três dias. Após cada tratamento, ascélulas são lavadas e divididas em 12 x 75 tubos de 35 mm com tampa decoador (1 ml por tubo, três tubos por grupo de tratamento) para a remoção demassas celulares. Os tubos recebem então PI (10 ng/ml). As amostras podemser analisadas utilizando citômetro de fluxo FACSCAN® e softwareFACSCONVERT® CelIQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos anti-TAT,oligopeptídeos de união de TAT ou moléculas orgânicas de união de TAT queinduzem níveis estatisticamente significativos de morte celular, conformedeterminado por meio da absorção de PI, podem ser selecionados comoanticorpos anti-TAT, oligopeptídeos de união de TAT ou moléculas orgânicasde união de TAT que induzem a morte celular.
Para selecionar anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas que se unam a epítopo sobre polipeptídeo TAT unido por anticorpode interesse, pode-se realizar teste bloqueador cruzado de rotina, tal como odescrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Ed. Harlow e David Lane (1988). Esse teste pode ser utilizado para determinarse anticorpo de teste, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica une o mesmolocal ou epítopo na forma de anticorpo anti-TAT conhecido. Alternativa ouadicionalmente, pode-se realizar mapeamento de epítopos por meio demétodos conhecidos na técnica. A seqüência de anticorpos pode sofrermutagênese, por exemplo, por meio de varrimento de alanina, para identificarresíduos de contato. O anticorpo mutante é testado inicialmente paradeterminar a união com anticorpo policlonal, para garantir dobra apropriada.
Em método diferente, peptídeos correspondentes a regiões diferentes depolipeptídeo TAT podem ser utilizados em testes de competição com osanticorpos de teste ou com anticorpo de teste e anticorpo com epítopoconhecido ou caracterizado.
E. Terapia de Pró-Drogas Mediada por Enzimas Dependentesde Anticorpos (ADEPT)
Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem tambémser utilizados em ADEPT, por meio de conjugação do anticorpo a enzima ativadorade pró-drogas, que converte pró-droga (tal como agente quimioterapêutico depeptidila, vide WO 81/01145) em droga anti-cancerígena ativa. Vide, por exemplo,WO 88/07378 e a Patente Norte-Americana n° 4.975.278.
O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPTinclui qualquer enzima capaz de agir sobre pró-droga, de forma a convertê-laem sua forma citotóxica mais ativa.
Enzimas que são úteis no método de acordo com a presenteinvenção incluem, mas sem limitar-se a fosfatase alcalina útil para a conversãode pró-drogas contendo fosfato em drogas livres; arilsulfatase útil para aconversão de pró-drogas contendo sulfato em drogas livres; citosinadesaminase útil para a conversão de 5-fluorocitosina não tóxica na droga anti-cancerígena, 5-fluorouracil; proteases, tais como serratia protease, termolisina,subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L) quesão úteis para a conversão de pró-drogas contendo peptídeos em drogaslivres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para a conversão de pró-drogas quecontêm substituintes D-aminoácidos; enzimas divisoras de carboidratos, taiscomo p-galactosidase e neuraminidase úteis para a conversão de pró-drogasglicosiladas em drogas livres; p-lactamase útil para a conversão de drogasderivadas com p-lactamas em drogas livres; e penicilino amidases, tais comopenicilino V amidase ou penicilino G amidase, úteis para a conversão dedrogas derivadas nos seus nitrogênios amina com grupos fenoxiacetila oufenilacetila, respectivamente, em drogas livres. Alternativam ente, anticorposcom atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas",podem ser utilizados para converter as pró-drogas de acordo com a presenteinvenção em drogas ativas livres (vide, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Conjugados de anticorpo e abzima podem ser preparadosconforme descrito no presente para fornecimento da abzima a população decélulas tumorosas.As enzimas de acordo com a presente invenção podem serunidas covalentemente aos anticorpos anti-TAT por meio de métodos bemconhecidos na técnica, tais como a utilização dos reagentes reticulantesheterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, as proteínas de fusãoque compreendem pelo menos a região de união de antígenos de anticorpo deacordo com a presente invenção, ligado a pelo menos uma partefuncionalmente ativa de enzima de acordo com a presente invenção, podemser construídas utilizando métodos de DNA recombinantes bem conhecidos natécnica (vide, por exemplo, Neuberger et al, Nature, 312: 604-608 (1984).
F. Polipeptídeos TAT de comprimento total
A presente invenção também fornece seqüências de nucleotídeosrecém identificadas e isoladas que codificam polipeptídeos indicados no presentepedido como polipeptídeos TAT. Particularmente, cDNAs (parciais e decomprimento total) que codificam diversos polipeptídeos TAT foram identificados eisolados, conforme descrito em mais detalhes nos Exemplos abaixo.
Conforme descrito nos Exemplos abaixo, diversos clones de cDNAforam depositados na ATCC. As seqüências de nucleotídeos reais destes clonespodem ser facilmente determinadas pelos técnicos no assunto por meio deseqüenciamento do clone depositado utilizando métodos rotineiros na técnica. Aseqüência de aminoácidos prevista pode ser determinada a partir da seqüência denucleotídeos utilizando conhecimentos de rotina. P ara os polipeptídeos TAT eácidos nucleicos codificadores descritos no presente, em alguns casos, os
Depositantes identificaram o que se acredita ser o quadro de leitura maisidentificável com as informações de seqüências disponíveis no momento.
G. Variantes de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT
Além dos anticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT de seqüêncianativa e comprimento total descritos no presente, contempla-se a preparaçãode variantes de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT. Variantes depolipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT podem ser preparadas por meio daintrodução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no DNA codificador e/oupor meio de síntese do polipeptídeo ou anticorpo desejado. Os técnicos noassunto apreciarão que as mudanças de aminoácidos podem alterar processospós-tradução do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT, tais como a mudançado número ou posição de locais de glicosilação ou alteração das característicasde ancoramento de membranas.
Variações dos anticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT descritosno presente podem ser elaboradas, por exemplo, utilizando quaisquer dosmétodos e orientações para mutações conservadoras e não conservadorasdescritas, por exemplo, na Patente Norte-Americana n° 5.364.934. Variaçõespodem ser substituição, exclusão ou inserção de um ou mais códons quecodificam o anticorpo ou polipeptídeo que resulta em alteração da seqüênciade aminoácidos em comparação com o polipeptídeo ou anticorpo de seqüêncianativa. Opcionalmente, a variação é realizada por meio da substituição de pelomenos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dosdomínios do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT. Orientação nadeterminação de qual resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ouexcluído sem prejudicar a atividade desejada pode ser encontrada por meio decomparação da seqüência do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT com a demoléculas de proteína conhecidas homólogas e minimização da quantidade dealterações de seqüências de aminoácidos realizadas em regiões de altahomologia. Substituições de aminoácidos podem ser o resultado dasubstituição de um aminoácido com outro aminoácido que possui propriedadesquímicas e/ou estruturais similares, tais como a substituição de leucina comserina, ou seja, substituições de aminoácidos conservadoras. Inserções ouexclusões podem estar opcionalmente na faixa de cerca de um a cincoaminoácidos. A variação permitida pode ser determinada realizando-sesistematicamente inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos naseqüência e testando-se as variantes resultantes para determinar a atividadeexibida pela seqüência nativa madura ou de comprimento total.
Fragmentos de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT sãofornecidos no presente. Esses fragmentos podem ser truncados no terminal Nou terminal C, ou podem não conter resíduos internos, por exemplo, emcomparação com proteína ou anticorpo nativo de comprimento total. Certosfragmentos não contêm resíduos de aminoácidos que não são essenciais paraatividade biológica desejada do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT.
Fragmentos de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT podemser preparados por meio de qualquer dentre uma série de métodosconvencionais. Fragmentos de peptídeos desejados podem ser quimicamentesintetizados. Abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos depolipeptídeos ou anticorpos por meio de digestão enzimática, tal como por meiode tratamento da proteína com enzima conhecida por dividir proteínas emlocais definidos por resíduos de aminoácidos específicos, ou por meio dedigestão do DNA com enzimas de restrição apropriadas e isolamento dofragmento desejado. Ainda outro método apropriado envolve o isolamento e aamplificação de fragmento de DNA que codifica fragmento de polipeptídeo ouanticorpo desejado, por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR).Oligonucleotídeos que definem os terminais desejados do fragmento de DNAsão empregados nos primers 5' e 3' na PCR. Preferencialmente, fragmentos depolipeptídeos TAT e anticorpo anti-TAT compartilham pelo menos umaatividade biológica e/ou imunológica com o polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT nativo descrito no presente.
Em realizações específicas, substituições conservadoras deinteresse são exibidas na Tabela 6 sob o título substituições preferidas. Casoessas substituições resultem em mudança da atividade biológica, mudançasmais substanciais, denominadas "exemplos de substituições" na Tabela 6 ouconforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes deaminoácidos, são introduzidas e os produtos selecionados.
Tabela 6
<table>table see original document page 182</column></row><table>Vai (V) ile; leu; met; phe; Leu
ala; norleucina
Modificações substanciais da função ou identidade imunológicado anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT são atingidas por meio da seleçãode substituições que difiram significativamente de efeito sobre a manutenção(a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, talcomo na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ouhidrofobicidade da molécula no local desejado; ou (c) do volume da cadeialateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com basenas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituições não conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe. Esses resíduos substituídospodem também ser introduzidos nos locais de substituição conservadores ou,de maior preferência, nos locais restantes (não conservados).
As variações podem ser elaboradas utilizando métodosconhecidos na técnica, tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeos(dirigida a local), varrimento de alanina e mutagênese de PCR. MutagêneseH dirigida a local (Carter et al, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al,Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), mutagênese de conjunto (Wells et al, Gene,34: 315 (1985)), mutagênese de seleção de restrição (Wells et al, Philos. Trans.R. Soe. London SerA, 317: 415 (1986)) ou outros métodos conhecidos podemser realizados sobre o DNA clonado para produzir o DNA variante de anticorpoanti-TAT ou polipeptídeo TAT.
Pode-se também empregar análise de aminoácidos de varrimentopara identificar um ou mais aminoácidos ao longo de seqüência contígua.Dentre os aminoácidos de varrimento preferidos, encontram-se aminoácidosneutros relativamente pequenos. Esses aminoácidos incluem alanina, glicina,serina e cisteína. Alanina é tipicamente aminoácido de varrimento preferidodentre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do beta-carbono e émenos propensa a alterar a conformação de cadeia principal da variante(Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). Alanina também étipicamente preferida por ser o aminoácido mais comum. Além disso, ela éfreqüentemente encontrada em posições enterrada e exposta (Creighton, TheProteins (W. H. Freeman & Co., Nova Iorque); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 11(1976)). Caso a substituição de alanina não gere quantidades adequadas devariante, pode-se utilizar aminoácido isotérico.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação adequada do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT podetambém ser substituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidadeoxidativa da molécula e evitar retícula aberrante. Por outro lado, união(ões) decisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TATpara aumentar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo forfragmento de anticorpo, tal como fragmento de Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariavel deanticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado).
Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentoadicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação aoanticorpo parental do qual é (são) gerada(s). Uma forma conveniente degeração dessas variantes de substituição envolve a maturação de afinidadeutilizando exibição de fagos. Resumidamente, vários locais de regiãohipervariável (tais como seis a sete locais) sofrem mutações para gerar todasas substituições amino possíveis em cada local. As variantes de anticorposgeradas desta forma são exibidas de maneira monovalente a partir departículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene IIIde M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago sãoselecionadas em seguida de acordo com a sua atividade biológica (tal comoafinidade de união), da forma descrita no presente. A fim de identificarpossíveis locais de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese devarrimento de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiõeshipervariáveis que contribuem significativamente para a união de antígenos.Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar estrutura de cristal docomplexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre oanticorpo e polipeptídeo TAT humano. Esses resíduos de contato e resíduosvizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicaselaboradas no presente. Após a geração dessas variantes, o quadro devariantes é submetido a seleção conforme descrito no presente e os anticorposcom propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem serselecionados para desenvolvimento adicional.
Moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes deseqüência de aminoácidos do anticorpo anti-TAT são preparadas por meio deuma série de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, massem limitar-se ao isolamento a partir de fonte natural (no caso de variantes deseqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio demutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida para local), mutagênesede PCR e mutagênese de conjunto de variante preparada anteriormente ouversão não variante do anticorpo anti-TAT.
H. Modificações de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TATModificações covalentes de anticorpos anti-TAT e polipeptídeosTAT também são incluídas no escopo da presente invenção. Um tipo demodificação covalente inclui a reação de resíduos de aminoácidos desejadosde anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT com agente derivante orgânico queseja capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N ou C-terminais do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT. A derivação com agentesbifuncionais é útil, por exemplo, para reticular anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT em superfície ou matriz de suporte insolúvel em água parauso no método de purificação de anticorpos anti-TAT e vice versa. Os agentesreticulantes comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, N-hidroxissuccinimido ésteres, tais como ésteres comácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindodissuccinimidil ésteres tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano, e agentes taiscomo 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metila.
Outras modificações incluem a desamidação de resíduosglutaminila e asparaginila nos resíduos de glutamila e aspartilacorrespondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilaçãode grupos hidroxila de resíduos serila ou treonila, metilação dos grupos a-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., SãoFrancisco, págs. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação dequalquer grupo carboxila C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT incluído no escopo da presente invenção compreende a alteraçãodo padrão de glicosilação nativa do anticorpo ou polipeptídeo. "Alteração do padrãode glicosilação nativa" destina-se, para os propósitos do presente, a indicar aexclusão de uma ou mais porções carboidrato encontradas em polipeptídeo TAT ouanticorpo anti-TAT de seqüência nativa (seja por meio de remoção do local deglicosilação subjacente ou de exclusão da glicosilação por meios químicos e/ouenzimáticos) e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estejampresentes no polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT de seqüência nativa. Alémdisso, a expressão inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínasnativas, que envolvem alteração da natureza e das proporções das diversasporções carboidrato presentes.
A glicosilação de anticorpos e outros polipeptídeos é tipicamenteN-ligada ou O-ligada. N-ligado designa a ligação da porção de carboidrato àcadeia lateral de resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeosasparagino-X-serina e asparagino-X-treonina, em que X é qualqueraminoácido, com exceção de prolina, são as seqüências de reconhecimentopara a ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina.Desta forma, a presença de qualquer dessas seqüências de tripeptídeos empolipeptídeo cria potencial local de glicosilação. Glicosilação O-ligada designa aligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a ácidohidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora também possam serutilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.
A adição de locais de glicosilação ao anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT é convenientemente conseguida por meio da alteração daseqüência de aminoácidos, de forma que contenha uma ou mais dasseqüências de tripeptídeos descritas acima (para locais de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita por meio da adição de um ou maisresíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT original, ou substituição por ele (para locais de glicosilação Co-ligados). A seqüência de aminoácidos do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeoTAT pode ser opcionalmente alterada por meio de mudanças em nível de DNA,particularmente por meio de mutação do DNA que codifica o anticorpo anti-TATou polipeptídeo TAT em bases previamente selecionadas, de forma que sejamgerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados.
Outro meio de aumentar a quantidade de porções de carboidratosobre o anticorpo anti-TAT ou o polipeptídeo TAT é por meio de acoplamentoquímico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo. Estes métodos sãodescritos na técnica, tal como em WO 87/05330, publicada em 11 de setembrode 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crít. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).
A remoção de carboidratos presentes sobre o anticorpo anti-TATou polipeptídeo TAT pode ser realizada química ou enzimaticamente, ou pormeio de substituição mutacional de códons que codificam resíduos deaminoácidos que servem de alvos para a glicosilação. Métodos dedesglicosilação química são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo,por Hakimuddin et al, Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) e por Edge et al,Anal. Biochem., 118: 131 (1981). A divisão enzimática de porções decarboidrato sobre polipeptídeos pode ser atingida por meio do uso de umasérie de endo e exo-glicosidases, conforme descrito por Thotakura et al, Meth.Enzymol., 138: 350(1987).
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT compreende a ligação do anticorpo ou polipeptídeo a um dentreuma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol (PEG),polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da forma descrita nas Patentes Norte-Americanas n° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou4.179.337. O anticorpo ou polipeptídeo pode também ser capturado emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de acumulação oupolimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ougelatina e microcápsulas de póli(metilmetacrilato), respectivamente) em sistemas defornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas dealbumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões.Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição,Oslo, A., Ed. (1980).
O anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT de acordo com apresente invenção pode também ser modificado de maneira a formar moléculasquiméricas que compreendem anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT fundidoa outra seqüência de aminoácidos ou polipeptídeo heteróloga.
Em uma realização, essa molécula quimérica compreende fusãodo anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT com polipeptídeo de marca quefornece epítopo ao qual pode unir-se seletivamente anticorpo anti-marca. Amarca de epítopo geralmente é colocada no terminal amino ou carboxila doanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT. A presença dessas formas marcadascom epítopo do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT pode ser detectadautilizando anticorpo contra o polipeptídeo de marca. Além disso, o fornecimentoda marca de epítopo permite que o anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TATseja facilmente purificado por meio de purificação de afinidade utilizandoanticorpo anti-marca ou outro tipo de matriz de afinidade que se una à marcade epítopo. Diversos polipeptídeos de marcas e seus anticorposcorrespondentes são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem marcaspóli-histidina (póli-his) ou póli-histidina-glicina (póli-his-gli); o polipeptídeo demarca flu HA e seu anticorpo 12CA5 (Field et al, Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165(1988)); a marca c-myc e seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10(Evan et al, Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)) e a marcaglicoproteína D (gD) do vírus simplex da herpes e seu anticorpo (Paborsky etal, Protein Engineeríng, 3 (6): 547-553 (1990)). Outros polipeptídeos de marcaincluem o peptídeo Flag (Hopp et al, BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)); opeptídeo epítopo KT3 (Martin et al, Science, 255: 192-194 (1992)); peptídeoepítopo a-tubulina (Skinner et al, J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)); e amarca de peptídeo de proteína 10 de gene T7 (Lutz-Freyermuth et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A., 87: 6393-6397 (1990)).
Em realização alternativa, a molécula quimérica podecompreender fusão do anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT comimunoglobulina ou região específica de imunoglobulina. Para forma bivalenteda molécula quimérica (também denominada "imunoadesina"), essa fusãopoderá ser para a região Fc de molécula IgG. As fusões Ig incluempreferencialmente a substituição de forma solúvel (com domíniotransmembrana excluído ou desativado) de anticorpo anti-TAT ou polipeptídeoTAT no lugar de pelo menos uma região variável em molécula Ig. Emrealização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui asregiões de articulação, CH2 e CH3 ou de articulação, CH1, CH2 e CH3 demolécula lgG1. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também aPatente Norte-Americana n° 5.428.130, emitida em 27 de junho de 1995.
I. Preparação de polipeptídeos TAT e anticorpos anti-TAT
A descrição abaixo refere-se principalmente à produção deanticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT por meio do cultivo de célulastransformadas ou transfectadas com vetor que contém ácido nucleico quecodifica anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT. Contempla-se, naturalmente,que métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem serempregados para preparar anticorpos anti-TAT e polipeptídeos TAT. Aseqüência de aminoácidos apropriada, ou partes dela, pode ser produzida, porexemplo, por meio de síntese direta de peptídeos utilizando métodos de fasesólida (vide, por exemplo, Stewart et al, Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H.Freeman Co., São Francisco CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soe, 85: 149-2154 (1963)). A síntese de proteínas in vitro pode ser realizada utilizandométodos manuais ou automaticamente. Pode-se atingir síntese automatizadautilizando, por exemplo, Sintetizador de Peptídeos da Applied Biosystems(Foster City CA) utilizando instruções do fabricante. Diversas partes doanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT podem ser quimicamente sintetizadasseparadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticospara produzir o anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT desejado.
1. Isolamento de DNA que codifica polipeptídeo TAT ouanticorpo anti-TAT
DNA que codifica anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT podeser obtido a partir de biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido que seacredita possuir o mRNA de polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT e oexpressa em nível detectável. Conseqüentemente, DNA de polipeptídeo TATou anticorpo anti-TAT humano pode ser convenientemente obtido a partir debiblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano. O gene que codificapolipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT pode também ser obtido a partir debiblioteca genômica ou por meio de procedimentos sintéticos conhecidos (taiscomo síntese de ácidos nucleicos automatizada).
Bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (tais comooligonucleotídeos com pelo menos cerca de vinte a oitenta bases) projetadaspara identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. A seleçãodo cDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser conduzidautilizando procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989). Meio alternativo de isolar o gene que codificaanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT é o uso de metodologia PCR(Sambrook et al, acima; Dieffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
Métodos de seleção de biblioteca de cDNA são bem conhecidosna técnica. As seqüências de oligonucleotídeos selecionadas como sondasdeverão possuir comprimento suficiente e ser suficientemente não ambíguaspara minimizar falsos positivos. O oligonucleotídeo é preferencialmentemarcado de forma a poder ser detectado mediante hibridização em DNA nabiblioteca sendo selecionada. Métodos de marcação são bem conhecidos natécnica e incluem o uso de radiomarcas como ATP marcado com 32P,biotinilação ou marcação com enzimas. As condições de hibridização, queincluem estringência moderada e alta estringência, são fornecidas emSambrook et al, acima.
As seqüências identificadas nesses métodos de seleção debibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras seqüências conhecidasdepositadas e disponíveis em bancos de dados públicos tais como GenBank eoutros bancos de dados de seqüências particulares. A identidade de seqüências(em nível de aminoácidos ou nucleotídeos) em regiões definidas da molécula ou aolongo da seqüência de comprimento total pode ser determinada utilizando métodosconhecidos na técnica e conforme descrito no presente.
Ácido nucleico que contém seqüência de codificação de proteínaspode ser obtido selecionando-se cDNA selecionado ou bibliotecas genômicas,utilizando a seqüência de aminoácidos deduzida descrita no presente pelaprimeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos de extensão de primersconvencionais conforme descrito em Sambrook et al, acima, para detectarprecursores e intermediários de processamento de mRNA que possam nãohaver sofrido transcrição reversa em cDNA.
2. Seleção e transformação de células hospedeiras
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas comvetores de clonagem ou expressão descritos no presente para a produção depolipeptídeos TAT ou anticorpos anti-TAT e cultivadas em meios nutrientesconvencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores,seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam asseqüências desejadas. As condições de cultivo, tais como meios, temperatura,pH e similares, podem ser selecionadas pelos técnicos no assunto semexperimentação indevida. De forma geral, princípios, protocolos e métodospráticos para maximizar a produtividade de cultivos celulares podem serencontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. J.Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al, acima.
Métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação decélulas procarióticas são conhecidos dos técnicos comuns no assunto, tais comoCaCb, CaP04, mediada por lipossomos e eletroporação. Dependendo da célulahospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando métodos padrãoapropriados para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto decálcio, conforme descrito em Sambrook et al, acima, ou eletroporação, é geralmenteutilizado para procariotes. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada paraa transformação de certas células vegetais, conforme descrito por Shaw et al, Gene,23: 315 (1983) e WO 89/05859, publicada em 29 de junho de 1989. Para células demamíferos sem essas paredes celulares, pode ser empregado o método deprecipitação de fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52: 456-457(1978). Aspectos gerais de transfecções de sistemas hospedeiros de células demamíferos foram descritos na Patente Norte-Americana n° 4.399.216.
Transformações em levedura são tipicamente conduzidas de acordo com o métodode Van Solingen et al, J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al, Proc. Natl. Acad. Sei.(U. S. A.), 76: 3829 (1979). Podem também ser utilizados, entretanto, outrosmétodos de introdução de DNA em células, tais como por meio de microinjeçãonuclear, eletroporação, fusão de protoplastas bacterianos com células intactas, oupolicátions, tais como polibreno e poliornitina. Para diversos métodos detransformação de células de mamíferos, vide Keown et al, Methods in Enzymology,185: 527-537 (1990) e Mansour et al, Natum, 336: 348-352 (1988).
Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão doDNA nos vetores do presente incluem células procarióticas, de levedura oueucarióticas superiores. Os procariotes apropriados incluem, mas sem limitar-se a eubactérias, tais como organismos grama-negativos ou grama-positivos,como Enterobactérias, tais como E. coli. Várias linhagens de E. coli sãodisponíveis ao público, tais como E. coli K12 linhagem MM294 (ATCC 31.446);E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli linhagem W3110 (ATCC 27.325) e K5 772(ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluementerobactérias tais como Escherichia, por exemplo E. coli, Enterobacter,Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo Salmonella typhimuríum,Serratia, por exemplo Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli taiscomo B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descritoem DD 266.710, publicada em doze de abril de 1989), Pseudomonas tais comoP. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e nãolimitadores. A linhagem W3110 é hospedeiro parental ou hospedeiroparticularmente preferido porque é linhagem hospedeira comum parafermentações de produtos de DNA recombinante. Preferencialmente, a célulahospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. A linhagemW3110, por exemplo, pode ser modificada para efetuar mutação genética nosgenes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplosdesses hospedeiros incluindo E. coli W3110 linhagem 1A2, que contém ogenótipo completo tonA; E. coli W3110 linhagem 9E4, que contém o genótipocompleto tonA ptr3; E. coli W3110 linhagem 27C7 (ATCC 55.244), que contémo genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompTkarí; E. coliW3110 linhagem 37D6, que contém o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15(argF-lac) 169 degP ompT rbs7 HvG karí; E. coli W3110 linhagem 40B4, que éa linhagem 37D6 com mutação de exclusão degP não resistente a canamicina;e linhagem de E. coli que contém protease periplasmática mutante descrita naPatente Norte-Americana n° 4.946.783, emitida em sete de agosto de 1990.
Alternativamente, métodos de clonagem in vitro tais como PCR ou outrasreações de polimerase de ácido nucleico são apropriados.Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpos eproteínas de fusão de anticorpos podem ser produzidos em bactérias,particularmente quando a função efetora de Fc e glicosilação não foremnecessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico for conjugado a agentecitotóxico (tal como toxina) e o imunoconjugado demonstrar por si próprioeficácia na destruição das células tumorosas. Anticorpos de comprimento totalapresentam maior meia vida em circulação. A produção em E. coli é maisrápida e mais eficiente com relação ao custo. Para a expressão de fragmentosde anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, US 5.648.237(Carter et al), US 5.789.199 (Joly et al) e US 5.840.523 (Simmons et al), quedescrevem a região de início de tradução (TIR) e seqüências de sinal paraotimizar a expressão e secreção, e estas patentes são incorporadas aopresente como referência. Após a expressão, o anticorpo é isolado da pasta decélulas de E. coli em fração solúvel e pode ser purificado, por exemplo, atravésde coluna de proteína A ou G, dependendo do isotipo. A purificação final podeser conduzida de forma similar ao processo de purificação de anticorpoexpresso, por exemplo, em células de CHO.
Além dos procariotes, micróbios eucarióticos tais como fungosfilamentosos ou levedura são hospedeiros de expressão ou clonagemapropriados para vetores codificadores de anticorpos anti-TAT ou polipeptídeosTAT. Saccharomyces cerevisiae é microorganismo hospedeiro eucarióticoinferior comumente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe(Beach e Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139.383, publicada em dois demaio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente Norte-Americana n°4.943.529; Fleer et al, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)), tais como K. lactis(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al, J. Bacteríol., 154 (2): 737-742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K.wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC36.906; Van den Berg et al, Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotoleranse K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070;Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)); Cândida;Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al, Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A, 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tal comoSchwanniomyces oceidentalis (EP 394.538, publicada em 31 de outubro de1990); e fungos filamentosos, tais como Neurospora, Penicillium,Tolypocladium (WO 91/00357, publicada em dez de janeiro de 1991) ehospedeiros Aspergillus, tais como A. nidulans (Ballance et al, Biochem.Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn et al, Gene, 26: 205-221(1983); Yelton et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 81: 1470-1474 (1984)) e A.niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)). Leveduras metilotrópicassão apropriadas no presente e incluem, mas sem limitar-se a levedura capazde crescimento sobre metanol selecionada a partir dos gêneros que consistemde Hansenula, Cândida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis eRhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplos desta classede leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
As células hospedeiras apropriadas para a expressão deanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT glicosilado são derivadas deorganismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluemcélulas de insetos tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem comocélulas vegetais, tais como cultivos celulares de algodão, milho, batata, soja,petúnia, tomate e fumo. Foram identificadas numerosas linhagens bacilovirais,variantes e células hospedeiras de insetos permissivos correspondentes dehospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca dafruta) e Bombyx mori. Uma série de linhagens virais para transfecção édisponível ao público, tais como a variante L-1 de Autographa califomica NPV ea linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV e esses vírus podem ser utilizadoscomo o vírus do presente, de acordo com a presente invenção, particularmentepara transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
O interesse foi maior, entretanto, em células de vertebrados e apropagação de células de vertebrados no cultivo (cultivo de tecidos) tornou-seprocedimento rotineiro. Exemplos de linhagens celulares de hospedeirosmamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293ou 293 subclonadas para crescimento em cultivo em suspensão, Graham et al,J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCCCCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4,Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCCCRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2),células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo(BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário decamundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, AnnalsN. Y. Acad. Sei. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem dehepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão descritos acima para a produção de anticorpos anti-TAT oupolipeptídeos TAT e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificadosconforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ouamplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.
3. Seleção e uso de vetor reproduzívelO ácido nucleico (tal como cDNA ou DNA genômico) que codificaanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT pode ser inserido em vetor reproduzívelpara clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Diversos vetores sãodisponíveis ao público. O vetor pode estar, por exemplo, na forma deplasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A seqüência de ácido nucleicoapropriada pode ser inserida no vetor por meio de uma série de procedimentos.De forma geral, DNA é inserido em local(is) de endonuclease de restriçãoapropriado(s) utilizando métodos conhecidos na técnica. Os componentes devetor geralmente incluem, mas sem limitar-se a um ou mais dentre seqüênciade sinal, origem de reprodução, um ou mais genes marcadores, elementoamplificador, promotor e seqüência de término de transcrição. A construção devetores apropriados que contêm um ou mais destes componentes empregatécnicas de ligação padrão que são conhecidas dos técnicos no assunto.
O TAT pode ser produzido de forma recombinante não apenasdiretamente, mas também como polipeptídeo de fusão com polipeptídeoheterólogo, que pode ser seqüência de sinal ou outro polipeptídeo que possuilocal de divisão específico no terminal N do polipeptídeo ou proteína madura.
De forma geral, a seqüência de sinal pode ser componente do vetor ou podeser uma parte do DNA que codifica polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT queé inserido no vetor. A seqüência de sinal pode ser seqüência de sinalprocariótico selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina,penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor. Para secreçãode leveduras, a seqüência de sinal pode ser, por exemplo, o líder de invertase de levedura, líder fator alfa (que inclui líderes fatores a de Saccharomyces eKluyveromyces), este último descrito na Patente Norte-Americana n°5.010.182) ou líder de fosfatase ácida, o líder de glucoamilase de C. albicans(EP 362.179, publicada em quatro de abril de 1990), ou o sinal descrito em WO90/13646, publicada em quinze de novembro de 1990. Em expressão decélulas de mamíferos, seqüências de sinal de mamíferos podem ser utilizadaspara dirigir a secreção da proteína, tais como seqüências de sinal depolipeptídeos secretados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, bemcomo líderes de secreção viral.
Tanto os vetores de expressão quanto de clonagem contêm umaseqüência de ácido nucleico que permite que o vetor se reproduza em uma oumais células hospedeiras selecionadas. Essas seqüências são bem conhecidaspara uma série de bactérias, levedura e vírus. A origem de reprodução doplasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias grama-negativas, a origem de plasmídeo 2\x é apropriada para levedura e diversasorigens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetoresde clonagem em células de mamíferos.
Os vetores de clonagem e de expressão conterão tipicamentegene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes deseleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticosou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina;(b) complementam deficiências auxotróficas; ou (c) fornecem nutrientesfundamentais não disponíveis a partir de meios complexos, tais como o genecodificador de D-alanino racemase para Bacilli.
Exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para célulasde mamíferos são os que permitem a identificação de células competentespara absorção do ácido nucleico codificador de polipeptídeo TAT ou anticorpoanti-TAT, tal como DHFR ou timidino quinase. Célula hospedeira apropriada,ao empregar-se DHFR do tipo selvagem, é a linhagem de células de CHO comdeficiência na atividade de DHFR, preparada e propagada conforme descritopor Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 77: 4216 (1980). Gene deseleção apropriado para uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeode levedura YRp7 (Stinchcomb et al, Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al,Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et ai, Gene, 10: 157 (1980)). O gene frplfornece marcador de seleção para linhagem mutante de levedura que nãopossui a capacidade de crescimento em triptofano, tal como ATCC n° 44076 ouPEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)).
Os vetores de expressão e de clonagem normalmente contêmpromotor ligado operativamente à seqüência de ácido nucleico codificadora depolipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT para dirigir a síntese de mRNA. Sãobem conhecidos promotores reconhecidos por uma série de célulashospedeiras potenciais. Promotores apropriados para uso com hospedeirosprocarióticos incluem os sistemas promotores de p-lactamase e lactose (Changet al, Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al, Nature, 281: 544 (1979)),fosfatase alcalina, sistema promotor de triptofano a (trp) (Goeddel, NucleicAcids Res., 8: 4057 (1980); EP 36.776) e promotores híbridos tais como opromotor tac (deBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 80: 21-25 (1983)).
Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão seqüênciaShine-Dalgarno (S. D.) ligada operativamente ao DNA codificador do anticorpoanti-TAT ou polipeptídeo TAT.
Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para uso comhospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase(Hitzeman et al, J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) ou outras enzimas glicolíticas(Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase,hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfatoisomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase,fosfoglicose isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de leveduras, que são promotores indutíveisque apresentam a vantagem adicional de transcrição controlada por condiçõesde crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2,isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas degradadoras associadas aometabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase e enzimas responsáveis pela utillização de maltose e galactose.Os vetores apropriados e promotores para uso na expressão de levedura sãoadicionalmente descritos em EP 73.657.
A transcrição de polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT a partir devetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, porpromotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírusda catapora (UK 2.211.504 publicada em cinco de julho de 1989), adenovírus (talcomo Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário,citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), depromotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou promotorde imunoglobulina, e de promotores de choque de calor, desde que essespromotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
A transcrição de DNA codificador do anticorpo anti-TAT oupolipeptídeo TAT por eucariotes superiores pode ser aumentada por meio dainserção de seqüência amplificadora no vetor. Os amplificadores sãoelementos de DNA com ação eis, normalmente cerca de 10 a 300 bp, queagem sobre promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas seqüênciasamplificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina,elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, utilizar-se-á amplificador de vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem oamplificador SV40 do lado posterior da origem de reprodução (bp 100-270), oamplificador promotor precoce de citomegalovírus, o amplificador de poliomado lado posterior da origem de reprodução e amplificadores de adenovírus. Oamplificador pode ser dividido no vetor em posição 5' ou 3' para a seqüênciacodificadora de polipeptídeo TAT ou anticorpo anti-TAT, mas encontra-selocalizado preferencialmente em local a 5' do promotor.Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiraseucarióticas (células de leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, sereshumanos ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterãoas seqüências necessárias para o término da transcrição e estabilização domRNA. Essas seqüências são normalmente disponíveis a partir das regiõesnão traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3' dos DNAs ou cDNAs virais oueucarióticos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos naforma de fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNAcodificador de anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT.
Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras apropriadaspara adaptação à síntese de anticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT em cultivode células de vertebrados recombinantes são descritos em Gething et al,Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al, Nature, 281: 40-46 (1979); EP117.060; e EP 117.058.
4. Cultivo das células hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpoanti-TAT ou polipeptídeo TAT de acordo com a presente invenção podem sercultivadas em uma série de meios. Meios disponíveis comercialmente, taiscomo F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma) e Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) sãoapropriados para o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer dosmeios descritos em Ham et al, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal.Biochem. 102: 255 (1980), Patentes Norte-Americanas n° 4.767.704,4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195;ou Patente Norte-Americana Ref. 30.985, podem ser utilizados como meios decultivo para as células hospedeiras. Qualquer desses meios pode sersuplementado conforme o necessário com hormônios e/ou outros fatores decrescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimentoepidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato),tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina),antibióticos (tais como droga GENTAMYCIN®), elementos de traço (definidoscomo compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finaisna faixa micromolar) e glicose ou fonte de energia equivalente. Qualquer outrosuplemento necessário pode também ser incluído em concentraçõesapropriadas que seriam conhecidas dos técnicos no assunto. As condições decultivo, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormentecom a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para ostécnicos comuns no assunto.
5. Detecção da expressão/amplificação genética
A expressão e/ou amplificação genética pode ser medida em amostradiretamente, por exemplo, por meio de Southern Blot, Northern Blot convencionalpara quantificar a transcrição de mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. T7:5201-5205 (1980)), dot blot (análise de DNA) ou hibridização in situ, utilizandosonda adequadamente marcada, com base nas seqüências fornecidas no presente.
Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que podem reconhecer duplexespecíficos, incluindo duplex de DNA, duplex de RNA e duplex híbridos de DNA-RNA ou duplex de DNA e proteína. Os anticorpos, por sua vez, podem sermarcados e o teste pode ser conduzido com o duplex unido a superfície, de formaque, mediante a formação de duplex sobre a superfície, a presença de anticorpounido ao duplex possa ser detectada.
A expressão genética, alternativamente, pode ser medida pormeio de métodos imunológicos, tais como manchas imunohistoquímicas decélulas ou seções de tecidos e teste de cultivo celular ou fluidos do corpo, paraquantificar diretamente a expressão de produto genético. Os anticorpos úteispara manchas imunohistoquímicas e/ou teste de fluidos de amostra podem sermonoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero.Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra polipeptídeoTAT de seqüência nativa ou contra peptídeo sintético com base nasseqüências de DNA fornecidas no presente ou contra seqüência exógenafundida a DNA de TAT e que codifica epítopo de anticorpo específico.
6. Purificação de anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT
Formas de anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT podem serrecuperadas de meio de cultivo ou de lisatos de células hospedeiras. Se unidopor membrana, ele pode ser liberado da membrana utilizando solução dedetergente apropriada (tal como Triton-X 100) ou por meio de divisãoenzimática. Células empregadas na expressão de anticorpo anti-TAT epolipeptídeo TAT podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos,tais como ciclo de congelamento e descongelamento, sonicação, rompimentomecânico ou agentes lisantes celulares.
Pode-se desejar purificar anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT apartir de proteínas de células recombinantes ou polipeptídeos. Os procedimentos aseguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: fracionamentosobre coluna de troca de íons; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa;cromatografia sobre sílica ou sobre resina de troca de cátions, tal como DEAE;cromatoconcentração; SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio; filtragem degel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose pararemover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes metálicas para unirformas marcadas por epítopo do anticorpo anti-TAT e polipeptídeo TAT. Váriosmétodos de purificação de proteínas podem ser empregados e esses métodos sãoconhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods inEnzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purífication: Principies and Practice,Springer-Verlag, Nova Iorque (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s)dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e doanticorpo anti-TAT ou polipeptídeo TAT específico produzido.Ao utilizar-se técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido de forma intracelular, no espaço periplasmático ou segregadodiretamente para o meio. Caso o anticorpo seja produzido de forma intracelular,como primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles célulashospedeiras ou fragmentos usados, são removidos, por exemplo, por meio decentrifugação ou ultrafiltragem. Carter et al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)descrevem procedimento de isolamento de anticorpos que são secretados parao espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é derretidana presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonila(PMSF) ao longo de cerca de trinta minutos. Fragmentos celulares podem serremovidos por meio de centrifugação. Quando o anticorpo for secretado para omeio, sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmenteconcentrados em primeiro lugar utilizando filtro de concentração de proteínasdisponível comercialmente, tal como unidade de ultrafiltragem Amicon ouMillipore Pellicon. Inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído emqualquer das etapas acima para inibir a proteólise e podem ser incluídosantibióticos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.
A composição de anticorpo preparada a partir das células pode serpurificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese degel, diálise e cromatografia de afinidade, em que cromatografia de afinidade é atécnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligante deafinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc deimunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizadapara purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas y1, y2 ou y4 humanas(Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Recomenda-se Proteína G paratodos os isotipos de camundongos e para y3 humano (Guss et al, EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). A matriz à qual é ligado o ligante de afinidade é mais freqüentementeagarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis,tais como vidro de poros controlados ou póli(estirenodivinil)benzeno, permitemvelocidades de fluxo mais altas e tempos de processamento mais curtos que o quepode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreender domínio Ch3, aresina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ) é útil para purificação. Outrastécnicas de purificação de proteínas, tais como o fracionamento sobre coluna detroca de íons, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia sobresílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®, cromatografia sobre resina detroca de ânions ou cátions (tal como coluna de ácido poliaspártico),cromatoconcentração, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônia, tambémsão disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.
Após qual(is)quer etapa(s) de purificação preliminar(es), a misturaque compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetidaa cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH, utilizando tampão deeluição sob pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixasconcentrações de sais (por exemplo, cerca de 0 a 0,25 M de sal).
J. Formulações Farmacêuticas
Formulações terapêuticas dos anticorpos anti-TAT, oligopeptídeosde união de TAT, moléculas orgânicas de união de TAT e/ou polipeptídeos TATutilizados de acordo com a presente invenção são preparadas paramolécula orgânica que possui o grau desejado de pureza com veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientesou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens econcentrações empregadas e incluem tampões tais como acetato, Tris, fosfato,citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico emetionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio,cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcoolfenólico, butílico ou benzílico; alquil parabéns tais como metil ou propil paraben;catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixopeso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais comoalbumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, taiscomo polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina,asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos eoutros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantestais como EDTA; tonificantes, tais como trehalose e cloreto de sódio; açúcares,tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; tensoativo, tal comopolissorbato; contraíons formadores de sais tais como sódio; complexosmetálicos (tais como complexos de proteína e Zn); e/ou tensoativos nãotônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Oanticorpo compreende preferencialmente o anticorpo em concentração de 5 a200 mg/ml, preferencialmente 10 a 100 mg/ml.
As formulações do presente podem também conter mais de umcomposto ativo, conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não seprejudiquem entre si. Além de anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo de união deTAT ou molécula orgânica de união de TAT, por exemplo, pode ser desejávelincluir na formulação anticorpo adicional, tal como segundo anticorpo anti-TATque une epítopo diferente sobre o polipeptídeo TAT ou anticorpo para algumoutro alvo, tal como fator de crescimento que afete o crescimento do câncerespecífico. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreenderainda agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citoquina, agente inibidor docrescimento, agente anti-hormonal e/ou cardioprotetor. Essas moléculasencontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades quesão eficazes para o propósito pretendido.Os ingredientes ativos podem também ser capturados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou porpolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ougelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, emsistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington'sPharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed. (1980).
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.
Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham oanticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes oumicrocápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluempoliésteres, hidrogéis (tais como póli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool(poli)vinílico, polilactidas (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímerosde ácido L-glutâmico e L-glutamato de y-etila, etileno vinil acetato nãodegradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácido glicólico, taiscomo LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero deácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através demembranas de filtragem estéreis.
K. Diagnóstico e tratamento com anticorpos anti-TAT,oligopeptídeos de união de TAT e moléculas orgânicas de união de TAT
Para determinar a expressão de TAT no câncer, são disponíveisdiversos testes de diagnóstico. Em uma realização, a sobreexpressão depolipeptídeo TAT pode ser analisada por meio de imunohistoquímica (IHC).Seções de tecidos embutidas em parafina de biópsia de tumor podem sersubmetidas ao teste de IHC de acordo com critérios de intensidade demanchas de proteína TAT a seguir:
Nota 0: não se observa nenhuma mancha ou a mancha demembranas é observada em menos de 10% de células tumorosas.
Nota 1+: é detectada mancha de membrana fraca/poucoperceptível em mais de 10% das células tumorosas. As células somente sãomanchadas em parte da sua membrana.
Nota 2+: é observada mancha de membrana completa fraca amoderada em mais de 10% das células tumorosas.
Nota 3+: é observada mancha de membrana completa moderadaa forte em mais de 10% das células tumorosas.
Os tumores com notas 0 ou 1+ para expressão de polipeptídeoTAT podem ser caracterizados como não sobreexpressando TAT, enquanto ostumores com notas 2+ ou 3+ podem ser caracterizados comosobreexpressando TAT.
Alternativa ou adicionalmente, testes FISH tais como INFORM®(vendido pela Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem serconduzidos sobre tecido tumoroso embutido em parafina e fixo por formalina,para determinar a extensão (se houver) da sobreexpressão de TAT no tumor.
A amplificação ou sobreexpressão de TAT pode ser avaliadautilizando teste de diagnóstico in vivo, por exemplo, por meio da administraçãode molécula (tal como anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica) que unas a molécula a ser detectada e seja marcada com marca detectável (tal comoisótopo radioativo ou marca fluorescente) e varrimento externo do pacientepara localização da marca.
Conforme descrito acima, os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeose moléculas orgânicas de acordo com a presente invenção possuem diversasaplicações não terapêuticas. Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos emoléculas orgânicas de acordo com a presente invenção podem ser úteis parao diagnóstico e avaliação de cânceres que expressam polipeptídeo TAT (talcomo em formação de radioimagens). Os anticorpos, oligopeptídeos emoléculas orgânicas também são úteis para a purificação ou imunoprecipitaçãode polipeptídeo TAT de células, para detecção e quantificação de polipeptídeoTAT in vitro, por exemplo em ELISA ou Western Blot, para matar e eliminarcélulas que expressam TAT a partir de população de mistura de células comoetapa na purificação de outras células.
Atualmente, dependendo do estágio do câncer, o tratamento docâncer envolve uma ou uma combinação das terapias a seguir: cirurgia pararemover o tecido canceroso, terapia de radiação e quimioterapia. A terapia comanticorpos anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas pode serespecialmente desejável em pacientes mais idosos que não tolerem bem atoxicidade e os efeitos colaterais da quimioterapia e em doenças metastáticasem que a terapia de radiação apresenta utilidade limitada. Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos e moléculas orgânicas direcionadoras de tumores deacordo com a presente invenção são úteis para reduzir cânceres queexpressem TAT mediante diagnóstico inicial da doença ou durantereincidência. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-TAT, oligopeptídeoou molécula orgânica pode ser utilizado isoladamente ou em terapia decombinação, por exemplo, com hormônios, antiangiogenes ou compostosradiomarcados, ou com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. Pode-seadministrar tratamento com anticorpos anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica em conjunto com outras formas de terapia convencional, sejaconsecutivamente com a terapia convencional, antes ou depois desta. Drogasquimioterapêuticas tais como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (palictaxel),estramustina e mitoxantrona são utilizadas no tratamento de câncer,particularmente em pacientes com bons riscos. Neste método de acordo com apresente invenção para o tratamento ou redução de câncer, pode-seadministrar anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica ao pacientecom câncer em conjunto com tratamento com um ou mais dos agentesquimioterapêuticos acima. Contempla-se, particularmente, terapia decombinação com palictaxel e derivados modificados (vide, por exemplo, EP0600517). O anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica seráadministrado com dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterapêutico.Em outra realização, o anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânicaé administrado em conjunto com quimioterapia, para aumentar a atividade eeficácia do agente quimioterapêutico, tal como paclitaxel. Phy sician's DeskReference (PDR) descreve dosagens desses agentes que foram utilizadas notratamento de diversos cânceres. O regime de dosagem e as dosagens dessasdrogas quimioterapêuticas mencionadas acima que são terapeuticamenteeficazes dependerão do câncer específico sendo tratado, da extensão dadoença e de outros fatores familiares para o médico especializado e podem serdeterminados pelo médico.
Em realização específica, é administrado ao paciente umconjugado que compreende anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica conjugada a agente citotóxico. Preferencialmente, o imunoconjugadounido à proteína TAT é internalizado pela célula, resultando em maior eficáciaterapêutica do imunoconjugado para matar a célula cancerosa à qual se une.Em realização preferida, o agente citotóxico dirige-se ou interfere com o ácidonucleico na célula cancerosa. Exemplos desses agentes citotóxicos sãodescritos acima e incluem maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases eendonucleases de DNA.
Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos, moléculas orgânicas ouseus conjugados de toxina são administrados a pacientes humanos, de acordocom métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo,na forma de mistura ou de infusão contínua ao longo de período de tempo, porvia intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea,intraarticular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou inalatória. Prefere-seadministração intravenosa ou subcutânea do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica.
Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com aadministração do anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica. Aadministração combinada inclui coadministração, utilizando formulaçõesseparadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutivaem qualquer ordem, em que há preferencialmente período de tempo em queambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividadesbiológicas. Preferencialmente, essa terapia combinada resulta em efeitoterapêutico sinérgico.
Pode também ser desejável combinar a administração do(s)anticorpo(s) anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas com aadministração de anticorpo dirigido a outro antígeno tumoroso associado aocâncer específico.
Em outra realização, o método de tratamento terapêutico deacordo com a presente invenção envolve a administração combinada deanticorpo(s) anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas e um ou maisagentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo acoadministração de coquetéis de agentes quimioterapêuticos diferentes. Osagentes quimioterapêuticos incluem fosfato de estramustina, prednimustina,cisplatina, 5-fluoroacil, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiuréia e hidroxiuréiataxanos (tais como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina.Cronogramas de preparação e dosagem para esses agentesquimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções dosfabricantes ou conforme determinado empiricamente pelos técnicos noassunto. Cronogramas de preparação e dosagem para essa quimioterapiatambém são descritos em Chemotherapy Service, Ed. M. C. Perry, Williams &Wilkins, Baltimore MD (1992).
O anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pode sercombinado com composto anti-hormonal; por exemplo, composto anti-estrógeno tal como tamoxifen; anti-progesterona tal como onapristona (vide EP616.812); ou anti-andrógeno, tal como flutamida, em dosagens conhecidaspara essas moléculas. Quando o câncer a ser tratado for câncer independentede andrógenos, o paciente pode haver sido submetido anteriormente a terapiaanti-andrógenos e, depois que o câncer tornar-se independente deandrógenos, o anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica (e,opcionalmente, outros agentes, conforme descrito no presente) pode seradministrado ao paciente.
Às vezes, pode ser benéfico também coadministrar cardioprotetor(para evitar ou reduzir disfunções miocardianas associadas à terapia) ou umaou mais citoquinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, opaciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células cancerosas e/outerapia de radiação simultaneamente com a terapia de anticorpos,oligopeptídeos ou moléculas orgânicas, antes ou depois dela. Dosagensapropriadas para qualquer dos agentes coadministrados acima são asutilizadas no presente e podem ser reduzidas devido à ação combinada(sinergia) do agente e anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica.
Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem e omodo de administração serão selecionados pelos médicos de acordo comcritérios conhecidos. A dosagem apropriada de anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica dependerá do tipo de doença a ser tratado, conformedefinido acima, severidade e curso da doença, se o anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapiaanterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica e critério do médico atendente. O anticorpo, oligopeptídeoou molécula orgânica é administrado adequadamente ao paciente uma vez ouao longo de uma série de tratamentos. Preferencialmente, o anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica é administrado por meio de infusãointravenosa ou de injeções subcutâneas. Dependendo do tipo e da severidadeda doença, cerca de 1 ^ig/kg a cerca de 50 mg/kg de peso do corpo (porexemplo, cerca de 0,1 a 15 mg/kg/dose) de anticorpo pode ser dosagem inicialpossível para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de umaou mais administrações separadas ou de infusão contínua. Regime dedosagem pode compreender a administração de dose de carregamento inicialde cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2mg/kg do anticorpo anti-TAT. Entretanto, outros regimes de dosagem podemser úteis. Dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 ng/kg a 100 mg/kgou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administraçõesrepetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, otratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas dadoença. O progresso dessa terapia pode ser facilmente monitorado por meiode testes e métodos convencionais, com base em critérios conhecidos domédico ou outros técnicos no assunto.
Além da administração da proteína de anticorpo ao paciente, opresente pedido contempla a administração do anticorpo por meio de terapiagenética. Essa administração de ácido nucleico codificador do anticorpo éenglobada pela expressão "administração de quantidade terapeuticamente eficazde anticorpo". Vide, por exemplo, WO 96/07321 publicada em 14 de março de 1996,referente à utilização de terapia genética, para gerar anticorpos intracelulares.
Existem duas abordagens principais para a colocação do ácidonucleico (opcionalmente contido em vetor) nas células do paciente: in vivo e exvivo. Para fornecimento in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente nopaciente, normalmente no local em que é necessário o anticorpo. Paratratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico éintroduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradasao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranasporosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n° 4.892.538 e 5.238.187). Existe uma série de técnicasdisponíveis para a introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. Astécnicas variam dependendo da transferência ou não do ácido nucleico paracélulas cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro desejado.Técnicas apropriadas de transferência de ácido nucleico para células demamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos, eletroporação, microinjeção,fusão celular, DEAE-dextran, método de precipitação de fosfato de cálcio etc.Vetor comumente utilizado para fornecimento ex vivo do gene é vetor retroviral.
As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo atualmentepreferidas incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus Isimplex da Herpes ou vírus adenoassociado) e sistemas com base em lipídios(lipídios úteis para transferência mediada por lipídios do gene são, por exemplo,DOTMA, DOPE e DC-Chol). Para análise dos protocolos de terapia genética emarcação genética atualmente conhecidos, vide Anderson et al, Science 256: 808-813 (1992). Vide também WO 93/25673 e as referências ali mencionadas.
Os anticorpos anti-TAT de acordo com a presente invençãopodem apresentar-se nas diferentes formas englobadas pela definição de"anticorpo" do presente. Portanto, os anticorpos incluem anticorpo intacto ou decomprimento total, fragmentos de anticorpos, anticorpos de seqüência nativaou variantes de aminoácidos, anticorpos de fusão, quiméricos ou humanizados,imunoconjugados e seus fragmentos funcionais. Em anticorpos de fusão,seqüência de anticorpo é fundida a seqüência de polipeptídeos heterólogos. Osanticorpos podem ser modificados na região Fc para fornecer funções efetorasdesejadas. Conforme discutido em mais detalhes nas seções abaixo, com asregiões Fc apropriadas, o anticorpo original unido sobre a superfície celularpode induzir a citotoxicidade, por exemplo, por meio de citotoxicidade celulardependente de anticorpos (ADCC), do recrutamento de complemento emcitotoxicidade dependente de complemento ou algum outro mecanismo.
Alternativamente, quando for desejável eliminar ou reduzir a função efetora, deforma a minimizar os efeitos colaterais ou complicações terapêuticas, podemser utilizadas outras regiões de Fc.
Em uma realização, o anticorpo concorre para unir-se ou unir-sesubstancialmente ao mesmo epítopo dos anticorpos de acordo com a presenteinvenção. Também são contemplados anticorpos que possuem ascaracterísticas biológicas dos anticorpos anti-TAT de acordo com a presenteinvenção, incluindo especificamente o direcionamento de tumores in vivo equalquer inibição da proliferação celular ou características citotóxicas.
Os métodos de produção dos anticorpos acima são descritos emdetalhes no presente.
Os anticorpos anti-TAT, oligopeptídeos e moléculas orgânicas dopresente são úteis para o tratamento de câncer que expresse TAT ou reduçãode um ou mais sintomas do câncer em mamíferos. Esse câncer inclui câncerda próstata, câncer do trato urinário, câncer do pulmão, câncer de mama,câncer do cólon e câncer do ovário, mais especificamente adenocarcinoma dapróstata, carcinomas das células renais, adenocarcinomas colo-retais,adenocarcinomas do pulmão, carcinomas de células escamosas do pulmão emesotelioma plêurica. Os cânceres englobam cânceres metastáticos de acordocom qualquer dos anteriores. O anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânicaé capaz de unir-se a pelo menos uma parte das células cancerosas queexpressam polipeptídeo TAT no mamífero. Em realização preferida, oanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é eficaz para destruir ou matarcélulas tumorosas que expressem TAT ou inibir o crescimento dessas célulastumorosas, in vitro ou in vivo, mediante união a polipeptídeo TAT sobre acélula. Esse anticorpo inclui anticorpo anti-TAT original (não conjugado anenhum agente). Os anticorpos originais que apresentam propriedadescitotóxicas ou de inibição do crescimento celular podem ser adicionalmentearmados com agente citotóxico para torná-los ainda mais potentes nadestruição das células tumorosas. Podem ser conferidas propriedadescitotóxicas a anticorpo anti-TAT, por exemplo, por meio de conjugação doanticorpo com agente citotóxico, para formar imunoconjugado conformedescrito no presente. O agente citotóxico ou agente inibidor do crescimento épreferencialmente molécula pequena. São preferíveis toxinas, tais comocaliqueamicina ou maitansinóide e seus análogos ou derivados.
A presente invenção fornece composição que compreendeanticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com apresente invenção e veículo. Para os propósitos do tratamento de câncer,podem ser administradas composições ao paciente necessitado dessetratamento, em que a composição pode compreender um ou mais anticorposanti-TAT presentes na forma de imunoconjugado ou como anticorpo original.
Em realização adicional, as composições podem compreender essesanticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas em combinação com outrosagentes terapêuticos, tais como agentes citotóxicos ou inibidores docrescimento, incluindo agentes quimioterapêuticos. A presente invençãotambém fornece formulações que compreendem anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com a presente invenção eveículo. Em uma realização, a formulação é formulação terapêutica quecompreende veículo farmaceuticamente aceitável.Outro aspecto da presente invenção é ácido nucleico isoladocodificador dos anticorpos anti-TAT. São englobados os ácidos nucleicoscodificadores das duas cadeias H e L e, especialmente, os resíduos de regiãohipervariável, cadeias que codificam o anticorpo de seqüência nativa, bemcomo variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo.
A presente invenção também fornece métodos úteis de tratamento decâncer que expressa polipeptídeo TAT ou redução de um ou mais sintomas docâncer em mamíferos, que compreende a administração de quantidadeterapeuticamente eficaz de anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânicaao mamífero. As composições terapêuticas de anticorpos, oligopeptídeos oumoléculas orgânicas podem ser administradas a curto prazo (agudas), crônicas ouintermitentes, conforme receitado pelo médico. Também são fornecidos métodos deinibição do crescimento e morte de célula que expresse TAT.
A presente invenção também fornece kits e artigosindustrializados que compreendem pelo menos um anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica. Kits que contêm anticorpos anti-TAT,oligopeptídeos ou moléculas orgânicas apresentam uso, por exemplo, paratestes de morte celular de TAT, purificação ou imunoprecipitação depolipeptídeo TAT das células. Para isolamento e purificação de TAT, porexemplo, o kit pode conter anticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica acoplada a esferas (tais como esferas de sepharose). Podem serfornecidos kits que contêm os anticorpos, oligopeptídeos ou moléculasorgânicas para detecção e quantificação de TAT in vitro, por exemplo emELISA ou Western Blot. Esse anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica útilpara detecção pode receber marca, tal como fluorescente ou rádio-marca.
L. Artigos Industrializados e Kits
Outra realização da presente invenção é artigo industrializado quecontém materiais úteis para o tratamento de câncer que expressa anti-TAT. Oartigo industrializado compreende recipiente e rótulo ou bula sobre o recipienteou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas,ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formados a partir de umasérie de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém composiçãoque é eficaz para o tratamento da condição cancerosa e pode ter porta deacesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, saco de solução intravenosaou ampola que contém tampa perfurável por agulha de injeção hipodérmica).
Pelo menos um agente ativo da composição é anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com a presente invenção. Orótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento de câncer.
O rótulo ou bula compreenderá adicionalmente instruções de administração dacomposição de anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica ao paciente comcâncer. Além disso, o artigo industrializado pode compreender adicionalmentesegundo recipiente que compreende tampão farmaceuticamente aceitável, talcomo água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada comfosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outrosmateriais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluemoutros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Também são fornecidos kits que são úteis para diversospropósitos, tais como para testes de morte de células que expressam TAT,purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo TAT a partir de células. Paraisolamento e purificação de polipeptídeo TAT, por exemplo, o kit pode conteranticorpo anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica acoplada a esferas(tais como esferas de sepharose). Podem ser fornecidos kits que contêm osanticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas para detecção equantificação de polipeptídeo TAT in vitro, por-exemplo, em ELISA ou WesternBlot. Da mesma forma que com o artigo industrializado, o kit compreenderecipiente e rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. O recipientecontém composição que compreende pelo menos um anticorpo anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica de acordo com a presente invenção.Podem ser incluídos recipientes adicionais que contenham, por exemplo,diluentes, tampões e anticorpos controle. O rótulo ou bula pode fornecerdescrição da composição, bem como instruções para o uso in vitro ou emdiagnóstico desejado.
M. Usos para polipeptídeos TAT e ácidos nucleicos quecodificam polipeptídeos TAT
Seqüências de nucleotídeos (ou seu complemento) que codificampolipeptídeos TAT possuem diversas aplicações na técnica de biologiamolecular, incluindo usos como sondas de hibridização, em mapeamentogenético e cromossômico e na geração de sondas de RNA e DNA sem sentido.Ácido nucleico codificador de TAT também será útil para a preparação depolipeptídeos TAT por meio dos métodos recombinantes descritos no presente,em que esses polipeptídeos TAT podem encontrar uso, por exemplo, napreparação de anticorpos anti-TAT conforme descrito no presente.
O gene TAT de seqüência nativa de comprimento total, ou suaspartes, pode ser utilizado como sonda de hibridização para que biblioteca decDNA isole o cDNA de TAT de comprimento total ou isole ainda outros cDNAs(tais como os que codificam variantes de TAT de ocorrência natural ou TAT deoutras espécies) que possuem identidade de seqüências desejada para aseqüência de TAT nativa descrita no presente. Opcionalmente, o comprimentodas sondas será de cerca de vinte a cerca de cinqüenta bases. As sondas dehibridização podem ser derivadas de regiões ao menos parcialmenteinovadoras da seqüência de nucleotídeos nativa de comprimento total, em queessas regiões podem ser determinadas sem experimentação indevida ou apartir de seqüências genômicas que incluem promotores, elementosamplificadores e introns de TAT de seqüência nativa. Como forma de exemplo,método de seleção compreenderá o isolamento da região de codificação dogene TAT utilizando a seqüência de DNA conhecida para sintetizar sondaselecionada de cerca de quarenta bases. Sondas de hibridização podem sermarcadas por uma série de marcas, que incluem radionucleotídeos tais como32P ou 32S, ou marcas enzimáticas tais como fosfatase alcalina acoplada àsonda por meio de sistemas de acoplamento de avidina/biotina. Sondasmarcadas que possuem seqüência complementar à do gene TAT de acordocom a presente invenção podem ser utilizadas para selecionar bibliotecas decDNA humano, DNA genômico ou mRNA para determinar a quais membrosdessas bibliotecas a sonda se hibridiza. Métodos de hibridização são descritoscom mais detalhes nos Exemplos abaixo. Quaisquer seqüências de ESTdescritas no presente pedido podem ser empregadas de forma similar comosondas, utilizando os métodos descritos no presente.
Outros fragmentos úteis dos ácidos nucleicos codificadores deTAT incluem oligonucleotídeos com ou sem sentido que compreendemseqüência de ácido nucleico de fita simples (RNA ou DNA) capaz de unir-se aseqüências de mRNA de TAT alvo (com sentido) ou DNA de TAT (semsentido). Oligonucleotídeos com ou sem sentido, de acordo com a presenteinvenção, compreendem fragmento da região de codificação de DNA de TAT.
Esse fragmento geralmente compreende pelo menos cerca de quatorzenucleotídeos, preferencialmente cerca de quatorze a trinta nucleotídeos. Acapacidade de derivação de oligonucleotídeo com ou sem sentido, com baseem seqüência de cDNA codificadora de uma dada proteína é descrita, porexemplo, em Stein e Cohen (Câncer Res. 48: 2659, 1988) e van der Krol et al(BioTechniques 6: 958, 1988).
A união de oligonucleotídeos com ou sem sentido a seqüênciasde ácido nucleico alvo resulta na formação de duplex que bloqueia atranscrição de bloco ou tradução da seqüência alvo por um dentre váriosmeios, que incluem maior degradação dos duplex, término prematuro datranscrição ou tradução ou por outros meios. Esses métodos são englobadospela presente invenção. Os oligonucleotídeos sem sentido podem serutilizados, portanto, para bloquear a expressão de proteínas TAT, em queessas proteínas TAT podem desempenhar papel na indução de câncer emmamíferos. Oligonucleotídeos com ou sem sentido compreendemadicionalmente oligonucleotídeos que possuem cadeias principais de açúcar-fosfodiéster modificadas (ou outras ligações de açúcar, tais como as descritasem WO 91/06629) e em que essas ligações de açúcar são resistentes anucleases endógenas. Esses oligonucleotídeos com ligações de açúcarresistentes são estáveis in vivo (ou seja, capazes de resistir à degradaçãoenzimática), mas retêm especificidade de seqüências para que sejam capazesde unir-se a seqüências de nucleotídeos alvo.
Locais intragênicos preferidos para união sem sentido incluem aregião que incorpora o códon de início/início de tradução (5'-AUG/5'-ATG) oucódon de parada/término (5'-UAA, 5-UAG e 5-UGA/5-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA)do quadro de leitura aberta (ORF) do gene. Estas regiões designam parte domRNA ou gene que engloba cerca de 25 a cerca de cinqüenta nucleotídeoscontíguos em qualquer direção (ou seja, 5' ou 3') a partir de códon de início outérmino de tradução. Outras regiões preferidas para união sem sentido incluem:intons; exons; junções de intron e exon; quadro de leitura aberta (ORF) ou"região de codificação", que é a região entre o códon de início de tradução e ocódon de término de tradução; a tampa 5' de mRNA que compreende resíduode guanosina N7-metilado unido ao resíduo mais 5' do mRNA por meio deligação de 5'-5' trifosfato e inclui a própria estrutura de tampa 5', bem como oscinqüenta primeiros nucleotídeos ao lado da tampa; a região não traduzida 5'(5' UTR), a parte de mRNA na direção 5' a partir do códon de início de traduçãoe, desta forma, que inclui nucleotídeos entre o local de tampa 5' e o códon deinício de tradução de mRNA ou nucleotídeos correspondentes sobre o gene; ea região não traduzida 3' (3'UTR), a parte de mRNA na direção 3' a partir docódon de término de tradução e, desta forma, que inclui nucleotídeos entre ocódon de término de tradução e a extremidade 3' de mRNA ou nucleotídeoscorrespondentes sobre o gene.
Exemplos específicos de compostos sem sentido preferidos úteispara inibir a expressão de proteínas TAT incluem oligonucleotídeos que contenhamcadeias principais modificadas ou ligações intemucleotídeos não naturais.
Oligonucleotídeos que contêm cadeias principais modificadas incluem aqueles queretêm um átomo de fósforo na cadeia principal e os que não contêm átomo defósforo na cadeia principal. Para os fins do presente relatório descritivo e conformeindicado às vezes na técnica, oligonucleotídeos modificados que não possuemátomo de fósforo na sua cadeia principal intemucleotídeos podem também serconsiderados oligonucleotídeos. Cadeias principais de oligonucleotídeosmodificados preferidas incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais,fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metila eoutros alquila que incluem fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno efosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3-amino fosforamidato eaminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos,tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos que contêm ligações 3-5'normais, seus análogos 2-5' ligados e os que possuem polaridade invertida, emque uma ou mais ligações intemucleotídeos é ligação 3' a 3', 5' a 5' ou 2' a 2'.
Oligonucleotídeos preferidos que possuem polaridade invertida compreendem umaúnica ligação 3' a 3' na ligação intemucleotídeos mais 3', ou seja, um único resíduode nucleotídeo invertido que pode ser abásico (a nucleobase está faltando oucontém grupo hidroxila no seu lugar). Também são incluídas vários sais, saismisturados e formas de ácido livre. Patentes norte-americanas representativas queensinam a preparação de ligações que contêm fósforo incluem, mas sem limitar-seàs Patentes Norte-Americanas n° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243
5.177.1965.399.6765.536.8215.565.555
5.188.897; 5.264.4235.405.939; 5.453.4965.541.306; 5.550.111
5.286.717; 5.321.1315.476.925; 5.519.1265.587.361; 5.194.599
5.276.019; 5.278.3025.455.233; 5.466.6775.563.253; 5.571.7995.527.899; 5.721.218; 5.672.697 e 5.625.050,
cada uma das quais éincorporada ao presente como referência.
Cadeias principais de oligonucleotídeos modificadas preparadas quenão incluem átomo de fósforo no seu interior possuem cadeias principais que sãoformadas por ligações intemucleotídeos alquila ou cicloalquila de cadeia curta,ligações intemucleotídeos de heteroátomos e alquila ou cicloalquila misturadas ouuma ou mais ligações intemucleotídeos heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeiacurta. Estas incluem as que possuem ligações morfolino (formadas em parte a partirda porção de açúcar de nucleotídeo); cadeias principais de siloxano; cadeiasprincipais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetila etioformacetila; cadeias principais de metileno formacetila e tioformacetila; cadeiasprincipais de riboacetila; cadeias principais que contêm alqueno; cadeias principaisde sulfamato; cadeias principais de metilenoimino e metileno hidrazino; cadeiasprincipais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e outas quecontêm partes componentes de N, O, S e CH2 misturadas. Patentes norte-americanas representativas que ensinam a preparação desses oligonucleotídeosincluem, mas sem limitar-se às Patentes Norte-Americanas n° 5.034.506
5.166.3155.405.9385.596.0865.623.070
5.185.444; 5.214.1345.434.257; 5.466.6775.602.240; 5.610.289
5.264.562; 5,264,5645.541.307; 5.561.2255,610,289; 5.618.704
5.216.141; 5.235.0335.470.967; 5.489.6775,602,240; 5.608.0465.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 e 5,677,439,cada uma das quais é incorporada ao presente como referência.
Em outros oligonucleotídeos sem sentido preferidos, tanto aligação de açúcar quanto a intemucleotídeos, ou seja a cadeia principal, dasunidades de nucleotídeos são substituídas com grupos inovadores. Asunidades de base são mantidas para hibridização com composto alvo de ácidonucleico apropriado. Um desses compostos oligoméricos, mimético deoligonucleotídeo que se demonstrou possuir excelentes propriedades dehibridização, é denominado ácido nucleico de peptídeo (PNA). Em compostosde PNA, a cadeia pricipal de açúcar de oligonucleotídeo é substituída comcadeia principal que contém amida, particularmente cadeia principal deaminoetilglicina. As nucleobases são retidas e unidas direta ou indiretamente aátomos de nitrogênio aza da porção de amida da cadeia principal. Patentesnorte-americanas representativas que ensinam a preparação de compostos dePNA incluem, mas sem limitar-se às Patentes Norte-Americanas n° 5.539.082;5.714.331 e 5.719.262, cada uma das quais é incorporada ao presente comoreferência. Ensinamentos adicionais de compostos de PNA podem serencontrados em Nielsen et al, Science, 1991, 254, 1497-1500.
Oligonucleotídeos sem sentido preferidos incoporam cadeiasprincipais de fosforotioato e/ou cadeias principais de heteroátomos, particularmente-CH2-NH-O-CH2- -CH2-N(CH3)-0-CH2- (conhecida como cadeia principal demetileno (metilimino) ou MMI), -CH2-0-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- e-0-N(CH3)-CH2-CH2- (em que a cadeia principal de fosfodiéster nativa érepresentada como -O-P-O-CH2-), descritas na Patente Norte-Americana n°5.489.677 indicada acima, e as cadeias principais de amida da Patente Norte-Americana n° 5.602.240 indicada acima. Também são preferidos oligonucleotídeossem sentido que contêm estruturas de cadeia principal de morfolino da PatenteNorte-Americana n° 5.034.506 indicada acima.
Oligonucleotídeos modificados podem também conter uma oumais porções de açúcar substituídas. Oligonucleotídeos preferidoscompreendem um dentre os seguintes na posição 2': OH; F; O-alquila, S-alquila ou N-alquila; O-alquenila, S-alquenila ou N-alquenila; O-alquinila,S-alquinila ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que o alquila, alquenila ealquinila podem ser alquila Ci a C10 substituído ou não substituído ou alquenilaC2 a C10 e alquinila. São particularmente preferidos 0[(CH2)nO]mCH3,0(CH2)nOCH3, 0(CH2)nNH2) 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 e0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, em que nem são de 1 a cerca de 10. Outrosoligonucleotídeos sem sentido preferidos compreendem um dos seguintes naposição 2': alquila inferior C1 a Ci0, alquenila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila,aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituído, grupo divisor de RNA,grupo relator, intercalante, grupo para aprimorar as propriedadesfarmacocinéticas de oligonucleotídeo ou grupo para aprimorar as propriedadesfarmacodinâmicas de oligonucleotídeo, bem como outros substituintes quepossuem propriedades similares. Modificação preferida inclui 2'-metoxietóxi(2'-0-CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-0-(2-metoxietila) ou 2'-MOE)(Martin et al, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), ou seja, grupo alcoxialcóxi.Modificação preferida adicional inclui 2'-dimetilaminooxietóxi, ou seja, grupo0(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2-DMAOE, conforme descrito nosexemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnicacomo 2'-0-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), ou seja,2,-0-CH2-0-CH2-N(CH2).
Modificação preferida adicional inclui Ácidos Nucleicos Travados(LNAs), nos quais o grupo 2'-hidroxila é ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' doanel de açúcar, de maneira a formar porção de açúcar bicíclica. A ligação épreferencialmente grupo metileno (-CH2-)n que une o átomo de oxigênio 2' e oátomo de carbono 4', em que n é 1 ou 2. LNAs e sua preparação são descritosem WO 98/39352 e WO 99/14226.
Outras modificações preferidas incluem 2'-metóxi (2'-0-CH3),2,-aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2 NH2), 2'-alila (2,-CH2-CH=CH2), 2'-0-alila(2'-0-CH2-CH=CH2) e 2-fluoro (2'-F). A modificação 2' pode estar na posiçãoarabino (superior) ou na posição ribo (inferior). Modificação 2'-arabino preferidaé 2'-F. Modificações similares podem também ser realizadas em outrasposições sobre o oligonucleotídeo, particularmente a posição 3' do açúcarsobre o nucleotídeo 3'-terminal ou em oligonucleotídeos 2-5' ligados'e aposição 5' do nucleotídeo 5' terminal. Os oligonucleotídeos podem tambémpossuir imitações de açúcar tais como porções ciclobutila no lugar de açúcarpentofuranosila. Patentes norte-americanas representativas que ensinam apreparação dessas estruturas de açúcar modificadas incluem, mas sem limitar-se às Patentes Norte-Americanas n° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080;5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811;5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265;5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; e 5.700.920, cada uma das quais éintegralmente incorporada como referência.
Os oligonucleotídeos podem também incluir substituições oumodificações de nucleobases (freqüentemente indicadas na técnicasimplesmente como "bases"). Da forma utilizada no presente, nucleobases"não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) eguanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracil (U).Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases naturais e sintéticas, taiscomo 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina,2-aminoadenina, derivados 6-metila e outros alquila de adenina e guanina,derivados 2-propila e outros alquila de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinila (-C=C-CH3 ou -CH2-C=CH), uracil e citosina e outros derivados alquinila de bases de pirimidina, 6-azo uracil, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino,8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outros uracils e citosinas 5-substituídos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina,8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. Nucleobases modificadas adicionais incluempirimidinas tricíclicas, tais como fenoxazino citidino (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2 (3H)-ona), fenotiazino citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2 (3H)-ona), grampos G tais como fenoxazino citidinasubstituída (por exemplo, 9-(2-aminoetóxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidino (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidino(H-pirido[3',2,:4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Nucleobases modificadaspodem também incluir aquelas em que a base de purina ou pirimidina ésubstituída com outros heterociclos, tais como 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases adicionais incluemas descritas na Patente Norte-Americana n° 3.687.808, as descritas em TheConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineeríng, págs. 858-859,Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, e as descritas por Englisch et al,Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613. Certas destasnucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de união doscompostos oligoméricos de acordo com a presente invenção. Estas incluempirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6substituídas, que incluem 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil e 5-propinilcitosina. Demonstrou-se que substituições de 5-metilcitosina aumentama estabilidade de duplex de ácido nucleico em 0,6 a 1,2 0 C. (Sanghvi et al,, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs.276-278) e são substituições de bases preferidas, ainda mais especificamentequando combinadas com modificações de açúcar 2'-0-metoxietila. Patentesnorte-americanas representativas que ensinam a preparação dessasnucleobases modificadas incluem, mas sem limitar-se a: Patente Norte-Americana n° 3.687.808, bem como Patentes Norte-Americanas n° 4.845.205;5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255;5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091;5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.681.941 e 5.750.692,cada uma das quais é incorporada ao presente como referência.
Outra modificação de oligonucleotídeos sem sentido que ligamquimicamente ao oligonucleotídeo uma ou mais porções ou conjugados queaumentam a atividade, distribuição celular ou absorção celular dooligonucleotídeo. Os compostos de acordo com a presente invenção podemincluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionais tais comogrupos hidroxila primários ou secundários. Os grupos conjugados de acordocom a presente invenção incluem intercaladores, moléculas relatoras,poliaminas, poliamidas, polietileno glicóis, poliéteres, grupos que aumentam aspropriedades farmacodinâmicas de oligômeros e grupos que aumentam aspropriedades farmacocinéticas de oligômeros. Grupos conjugados típicosincluem colesteróis, lipídios, lipídios de cátions, fosfolipídios, fosfolipídioscatiônicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina,fluoresceínas, rodaminas, coumarinas e tinturas. Grup os que melhoram aspropriedades farmacodinâmicas, no contexto da presente invenção, incluemgrupos que aumentam a absorção de oligômeros, aumentam a resistência deoligômeros à degradação e/ou fortalecem a hibridização específica deseqüências com RNA. Os grupos que melhoram as propriedadesfarmacocinéticas, no contexto da presente invenção, incluem grupos queaumentam a absorção, distribuição, metabolismo ou excreção de oligômeros.
Porções conjugadas incluem, mas sem limitar-se a porções de lipídios, taiscomo porção de colesterol (Letsinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 1989,89, 6553-6556), ácido eólico (Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Lei, 1994,4, 1053-1060), tioéter, tal como hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al, Ann. N. Y.Acad. Sei., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let,1993, 3, 2765-2770), tiocolesterol (Oberhauser et al, Nucl. Acids Res., 1992,20, 533-538), cadeia alifática, tal como dodecandiol ou resíduos undecila(Saison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al, FEBSLett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49-54),fosfolipídio, tal como di-hexadecil-rac-glicerol ou1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amônio (Manoharan et al,Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18,3777-3783), poliamina ou cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al,Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ou adamantano ácido acético(Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), porção palmitila(Mishra et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) ou porçãooctadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Os oligonucleotídeos deacordo com a presente invenção podem também ser conjugados a substânciasde drogas ativas, tais como aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofen,suprofen, fenbufen, cetoprofen, (S)-(+)-pranoprofen, carprofen, dansilsarcosina,ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácido flufenâmico, ácido folínico, benzotiadiazida,clorotiazida, diazepina, indometicin, barbiturato, cefalosporin, droga sulfa,antidiabético, antibacteriano ou antibiótico. Conjugados de oligonucleotídeo edroga e sua preparação são descritos no pedido de patente norte-americanocom número de série 09/334.130 (depositado em quinze de junho de 1999) eas Patentes Norte-Americanas n° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465;5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5,580,731; 5.591.584;5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5,578,718;5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941;4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136;4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538;5,578,717; 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584, 5,109,124; 5,118,802, 5,138,045;5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481;5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941, cada umadas quais é incorporada ao presente como referência.
Não é necessário que todas as posições em um dado compostosejam modificadas uniformemente e, de fato, mais de uma das modificaçõesmencionadas acima pode ser incorporada em um único composto ou mesmoem um único nucleosídeo em um oligonucleotídeo. A presente invençãotambém inclui compostos sem sentido que são compostos quiméricos.Compostos sem sentido "quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presenteinvenção, são compostos sem sentido, particularmente oligonucleotídeos, quecontêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada qual composta depelo menos uma unidade monomérica, ou seja, nucleotídeo no caso decomposto de oligonucleotídeo. Estes oligonucleotídeos contêm tipicamentepelo menos uma região em que o oligonucleotídeo é modificado de forma aconferir ao oligonucleotídeo maior resistência à degradação por nuclease,maior absorção celular e/ou maior afinidade de união para o ácido nucleicoalvo. Região adicional do oligonucleotídeo pode servir de substrato paraenzimas capazes de dividir híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. Como formade exemplo, RNase H é endonuclease celular que divide o cordão de RNA deduplex RNA.DNA. A ativação de RNase H resulta, portanto, na divisão do RNAalvo, de forma a aumentar grandemente a eficiência da inibição deoligonucleotídeos de expressão genética. Conseqüentemente, resultadoscomparáveis podem freqüentemente ser obtidos com oligonucleotídeos maiscurtos ao utilizar-se oligonucleotídeos quiméricos, em comparação comdesoxioligonucleotídeos de fosforotioato que se hibridizam na mesma regiãoalvo. Compostos sem sentido quiméricos de acordo com a presente invençãopodem ser formados como estruturas compostas de dois ou maisoligonucleotídeos, oligonucleotídeos modificados, oligonucleosídeos e/oumiméticos de oligonucleotídeos, conforme descrito acima. Os oligonucleotídeossem sentido quiméricos preferidos incorporam pelo menos um açúcarmodificado 2' (preferencialmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) no terminal 3' paraconferir resistência a nuclease e região com pelo menos quatro açúcares 2'-Hcontíguos para conferir atividade de RNase H. Esses compostos também foramdenominados na técnica híbridos ou gapmers. Os gapmers preferidos contêmregião de açúcares modificados 2' (preferencialmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) noterminal 3' e no terminal 5' separados por pelo menos uma região que contémpelo menos quatro açúcares 2'-H contíguos e preferencialmente incorporamligações de cadeia principal de fosforotioato. Patentes norte-americanasrepresentativas que ensinam a preparação dessas estruturas híbridas incluem,mas sem limitar-se às Patentes Norte-Americanas n° 5.013.830; 5.149.797;5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065;5.652.355; 5,652,356 e 5.700.922, cada uma das quais é integralmenteincorporada ao presente como referência.
Os compostos sem sentido utilizados de acordo com a presenteinvenção podem ser conveniente e rotineiramente fabricados por meio dométodo bem conhecido de síntese de fases sólidas. Equipamento para essassínteses é vendido por diversos fornecedores que incluem, por exemplo,Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Quaisquer outros meios para essasíntese conhecidos na técnica podem ser adicional ou alternativamenteempregados. Sabe-se bem como utilizar métodos similares para prepararoligonucleotídeos tais como os fosforotioatos e derivados alquilados. Oscompostos de acordo com a presente invenção podem também ser misturados,encapsulados, conjugados ou associados de outra forma com outrasmoléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, tais comoHpossomos, moléculas dirigidas a receptores, formulações orais, retais, locaisou outras, para assistir na tomada, distribuição e/ou absorção. Patentes norte-americanas representativas que ensinam a preparação dessas formulaçõesque assistem na tomada, distribuição e/ou absorção incluem, mas sem limitar-se às Patentes Norte-Americanas n° 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016;5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330;4.534.899; 5.013.556; 5,108,921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633;5.395.619; 5,416,016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528;5.534.259; 5,543,152; 5.556.948; 5.580.575; e 5.595.756, cada uma das quaisé incorporada ao presente como referência.
Outros exemplos de oligonucleotídeos com ou sem sentidoincluem os oligonucleotídeos que são ligados covalentemente a porçõesorgânicas, tais como as descritas em WO 90/10048 e outras porções queaumentam a afinidade do oligonucleotídeo para seqüência de ácido nucleicoalvo, tal como poli-(L-lisina). Adicionalmente, agentes intercalantes, tais comoelipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos podem ser ligados aoligonucleotídeos com ou sem sentido para modificar as especificidades deunião do oligonucleotídeo com ou sem sentido para a seqüência denucleotídeos alvo.
Oligonucleotídeos com ou sem sentido podem ser introduzidosem célula que contém a seqüência de ácido nucleico alvo por meio de qualquermétodo de transferência genética, incluindo, por exemplo, transfecção de DNAmediada por CaP04> eletroporação ou utilizando vetores de transferênciagenética tais como vírus Epstein-Barr. Em procedimento preferido,oligonucleotídeo com ou sem sentido é inserido em vetor retroviral apropriado.Célula que contém a seqüência de ácido nucleico alvo é colocada em contatocom o vetor retroviral recombinante, seja in vivo ou ex vivo. Vetores retroviraisapropriados incluem, mas sem limitar-se aos derivados do retrovírus murino M-MuLV, N2 (retrovírus derivado de M-MuLV), ou os vetores de cópia dupladenominados DCT5A, DCT5B e DCT5C (vide WO 90/13641).Oligonucleotídeos com ou sem sentido podem também serintroduzidos em célula que contém a seqüência de nucleotídeos alvo por meiode formação de conjugado com molécula de união de ligantes, conformedescrito em WO 91/04753. As moléculas de união de ligantes apropriadasincluem, mas sem limitar-se a receptores da superfície celular, fatores decrescimento, outras citoquinas ou outros ligantes que se unem a receptores dasuperfície celular. Preferencialmente, a conjugação da molécula de união deligantes não interfere substancialmente com a capacidade da molécula deunião de ligantes de unir-se à sua molécula ou receptor correspondente, oubloquear a entrada do oligonucleotídeo com ou sem sentido ou sua versãoconjugada na célula.
Alternativamente, oligonucleotídeo com ou sem sentido pode serintroduzido em célula que contém a seqüência de ácido nucleico alvo por meioda formação de complexo de oligonucleotídeo e lipídio, conforme descrito emWO 90/10448. O complexo de lipídio e oligonucleotídeo com ou sem sentido épreferencialmente dissociado na célula por lipase endógena.
As moléculas de DNA ou RNA com ou sem sentido geralmentepossuem menos de cerca de cinco nucleotídeos de comprimento,alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10; 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,1 8, 19, 20; 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30; 35, 40, 45, 50; 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100; 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150; 155,160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200; 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,280, 290, 300; 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400; 410, 420, 430,440, 450, 460, 470, 480, 490, 500; 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590,600; 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700; 710, 720, 730, 740, 750,760, 770, 780, 790, 800; 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900; 910,920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleotídeos de comprimento,em que, neste contexto, a expressão "cerca de" indica o comprimento deseqüência de nucleotídeos de referência mais ou menos 10% daquelecomprimento indicado.
As sondas podem também ser empregadas em métodos de PCRpara gerar conjunto de seqüências para identificação de seqüências decodificação de TAT relacionadas de perto.
Seqüências de nucleotídeos que codificam TAT podem também serutilizadas para construir sondas de hibridização para mapeamento do gene quecodifica aquele TAT e para análise genética de indivíduos com disfunçõesgenéticas. As seqüências de nucleotídeos fornecidas no presente podem sermapeadas para cromossomo e regiões específicas de cromossomo utilizandométodos conhecidos, tais como hibridização in situ, análise de ligações contramarcadores cromossômicos conhecidos e seleção de hibridização com bibliotecas.
Quando as seqüências de codificação para TAT codificaremproteína que se une a outra proteína (tal como quando o TAT for receptor), TATpode ser utilizado em testes para identificar as outras proteínas ou moléculasenvolvidas na interação de união. Por meio destes métodos, podem seridentificados inibidores da interação de união de ligante e receptor. Asproteínas envolvidas nessas interações de união podem também ser utilizadaspara selecionar inibidores de moléculas pequenas ou peptídeos ou agonistasda interação de união. Além disso, o TAT receptor^pode ser utilizado para isolarligante(s) correlativo(s). Testes de seleção podem ser projetados paraencontrar compostos de chumbo que imitem a atividade biológica de TATnativo ou receptor para TAT. Esses testes de seleção incluirão testesapropriados para seleção de alto rendimento de bibliotecas químicas, tornando-as particularmente apropriadas para a identificação de possíveis drogas demoléculas pequenas. As moléculas pequenas contempladas incluemcompostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos. Os testes podem ser realizadosem uma série de formatos, que incluem testes de união entre proteínas, testesde seleção bioquímica, imunotestes e testes com base em células, que sãobem caracterizados na técnica.
Ácidos nucleicos que codificam TAT ou suas formas modificadaspodem também ser utilizados para gerar animais transgênicos ou animais"knock out" que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e seleção dereagentes terapeuticamente úteis. Animal transgênico (tal como camundongoou rato) é animal que possui células que contêm transgene, que foi introduzidono animal ou ancestral do animal em estado pré-natal, tal como embrionário.Transgene é DNA que é integrado ao genoma de célula da qual desenvolve-seanimal transgênico. E m uma realização, cDNA que codifica TAT pode serutilizado para clonar DNA genômico que codifica TAT de acordo com métodosestabelecidos e as seqüências genômicas utilizadas para gerar animaistransgênicos que contêm células que expressam DNA que codifica TAT.Métodos de geração de animais transgênicos, particularmente animais taiscomo camundongos ou ratos, tornaram-se convencionais na técnica e sãodescritos, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas n° 4.736.866 e4.870.009. Tipicamente, células específicas seriam dirigidas para incorporaçãode transgene TAT com amplificadores específicos de tecido. Animaistransgênicos que incluem uma cópia de transgene que codifica TAT introduzidona linhagem de gérmen do animal em estágio embrionário podem ser utilizadospara examinar o efeito da maior expressão de DNA que codifica TAT. Essesanimais podem ser utilizados como animais de teste para reagentes que seacredita conferirem proteção, por exemplo, contra condições patológicasassociadas à sua sobreexpressão. Segundo esta faceta da presente invenção,animal é tratado com o reagente e incidência reduzida da condição patológica,em comparação com animais não tratados que possuem o transgene, indicariapotencial intervenção terapêutica para a condição patológica.
Alternativamente, podem ser construídos homólogos de TAT nãohumanos para construir animal "knock out" TAT que contém gene alterado oudefeituoso que codifica TAT como resultado da recombinação homóloga entreo gene endógeno que codifica TAT e DNA genômico alterado que codifica TATintroduzido em célula haste embriônica do animal. cDNA que codifica TAT podeser utilizado, por exemplo, para clonar DNA genômico que codifica TAT deacordo com métodos estabelecidos. Uma porção do DNA genômico quecodifica TAT pode ser excluída ou substituída com outro gene, tal como geneque codifica marcador selecionável que pode ser utilizado para monitorar aintegração. Tipicamente, várias quilobases de DNA lateral inalterado (nas duasextremidades 5' e 3') são incluídas no vetor (vide, por exemplo, Thomas eCapecchi, Cell, 51: 503 (1987) para descrição de vetores de recombinaçãohomólogos). O vetor é introduzido em linhagem de células haste embriônicas(tal como por meio de eletroporação) e são selecionadas as células em que oDNA introduzido recombinou-se de forma homóloga com o DNA endógeno(vide, por exemplo, Li et al, Cell, 69: 915 (1992)). As células selecionadas sãoinjetadas em seguida em blastocisto de animal (tal como camundongo ou rato)para formar quimeras de agregação (vide, por exemplo, Bradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J.Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152). Pode ser implantado emseguida embrião quimérico em feto de animal fêmea pseudoprenha apropriadoe o embrião é trazido a termo para criar animal knock out. A prole que abriga oDNA recombinado de forma homóloga nas suas células gérmen pode seridentificada por meio de técnicas padrão e utilizada para criar animais em quetodas as células do animal contêm o DNA recombinado de forma homóloga. Osanimais knockout podem ser caracterizados, por exemplo, pela sua capacidadede defesa contra certas condições patológicas e pelo seu desenvolvimento decondições patológicas devido à ausência do polipeptídeo TAT.
Ácido nucleico que codifica os polipeptídeos TAT pode tambémser utilizado em terapia genética. Em aplicações de terapia genética, genes sãointroduzidos em células a fim de atingir a síntese in vivo de produto genéticoterapeuticamente eficaz, tal como para substituição de gene defeituoso."Terapia genética" inclui tanto terapia genética convencional, na qual se atingeefeito duradouro com um único tratamento, quanto a administração de agentesterapêuticos genéticos, que envolve a administração única ou repetida demRNA ou DNA terapeuticamente eficaz. DNAs e RNAs sem sentido podem serutilizados como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de certosgenes in vivo. Já se observou que oligonucleotídeos sem sentido curtos podemser importados em células onde agem como inibidores, apesar das suas baixasconcentrações intracelulares causadas pela sua absorção restrita pelamembrana celular. (Zamecnik et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 83: 4143-4146 (1986)). Os oligonucleotídeos podem ser modificados para aumentar asua absorção, tal como por meio de substituição dos seus grupos fosfodiéstercarregados negativamente por grupos não carregados.
Existe uma série de métodos disponíveis para a introdução deácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo datransferência ou não do ácido nucleico para células cultivadas in vitro ouin vivonas células do hospedeiro desejado. Técnicas apropriadas de transferência deácido nucleico para células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos,eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextran, método deprecipitação de fosfato de cálcio etc. Os métodos de transferência genética invivo atualmente preferidos incluem a transfecção com vetores virais(tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por lipossomos e proteínas derevestimento viral (Dzau et al, Trenós in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). Emalgumas situações, é desejável fornecer à fonte de ácido nucleico agente quese dirija às células alvo, tal como anticorpo específico para proteína demembrana da superfície celular ou a célula alvo, ligante para receptor sobre acélula alvo etc. Ao empregar-se lipossomos, proteínas que se unem a proteínade membrana da superfície celular associada a endocitose podem serutilizadas para dirigir e/ou facilitar a absorção, por exemplo, de proteínas decapsídeo ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula específico,anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização e proteínasque dirigem localização intracelular e aumentam a meia vida intracelular. Ométodo de endocitose mediada por receptor é descrito, por exemplo, por Wu etal, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sei.U. S. A. 87, 3410-3414 (1990). Para análise de protocolos de terapia genética emarcação de genes, vide Anderson et al, Science 256, 808-813 (1992).
As moléculas de ácido nucleico que codificam os polipeptídeosTAT ou seus fragmentos descritos no presente são úteis para a identificação decromossomos. Neste particular, existe necessidade contínua de identificaçãode novos marcadores de cromossomos, pois relativamente poucos reagentesmarcadores de cromossomos, com base nos dados de seqüência real, sãodisponíveis atualmente. Cada molécula de ácido nucleico de TAT de acordocom a presente invenção pode ser utilizada como marcador de cromossomos.
Os polipeptídeos TAT e moléculas de ácido nucleico de acordocom a presnete invenção podem também ser utilizados em diagnóstico paratipificação de tecidos, em que os polipeptídeos TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser expressos de forma diferente em um tecido emcomparação com outro, preferencialmente em tecido doente em comparaçãocom tecido normal do mesmo tipo de tecido. Moléculas de ácido nucleico deTAT encontrarão uso para a geração de sondas para PCR, análise Northern,análise Southern e análise Western.
A presente invenção engloba métodos de seleção de compostospara identificar os que imitam o polipeptídeo TAT (agonistas) ou evitam o efeitodo polipeptídeo TAT (antagonistas). Testes de seleção para possíveis drogasantagonistas são projetados para identificar compostos que se unam ouformem complexo com polipeptídeos TAT codificados pelos genes identificadosno presente ou interfiram de outra forma com a interação dos polipeptídeoscodificados com outras proteínas celulares, incluindo, por exemplo, a inibiçãoda expressão de polipeptídeo TAT de células. Esses testes de seleção incluirãotestes apropriados para seleção de alto rendimento de bibliotecas químicas,tornando-as particularmente apropriadas para a identificação de possíveisdrogas de moléculas pequenas.
Os testes podem ser realizados em uma série de formatos, queincluem testes de união entre proteínas, testes de seleção bioquímica, imunotestese testes com base em células, que são bem caracterizados na técnica.
Todos os testes para antagonistas são comuns pelo fato de queconvocam o contato da possível droga com polipeptídeo TAT codificado porácido nucleico identificado no presente sob condições e por tempo suficientepara permitir a interação entre esses dois componentes.
Nos testes de união, a interação é união e o complexo formado podeser isolado ou detectado na mistura de reação. Em realização específica, opolipeptídeo TAT codificado pelo gene identificado no presente ou a possível drogaé imobilizada sobre fase sólida, tal como placa de microtítulos, por meio de ligaçõescovalentes ou não covalentes. A ligação não covalente geralmente é realizada pormeio de revestimento da superfície sólida com solução do polipeptídeo TAT esecagem. Alternativamente, anticorpo imobilizado, tal como anticorpo monoclonal,específico para o polipeptídeo TAT a ser imobilizado, pode ser utilizado paraancorá-lo a superfície sólida. O teste é realizado por meio da adição do componentenão imobilizado, que pode ser marcado por marca detectável, ao componenteimobilizado, tal como a superfície revestida que contém o componente ancorado.Após o término da reação, os componentes não reagidos são removidos, tal comopor meio de lavagem, e os complexos ancorados sobre a superfície sólida sãodetectados. Quando o componente originalmente não imobilizado conduzir marcadetectável, a detecção de marca imobilizada sobre a superfície indica que ocorreu aformação de complexos. Quando o componente originalmente não imobilizado nãoconduzir marca, a formação de complexos pode ser detectada, por exemplo,utilizando anticorpo marcado que une especificamente o complexo imobilizado.
Caso o possível composto interaja com polipeptídeo TATespecífico codificado por gene identificado no presente mas não se una a ele, asua interação com aquele polipeptídeo pode ser testada por meio de métodosbem conhecidos de detecção de interações entre proteínas. Esses testesincluem abordagens tradicionais, tais como retícula, coimunoprecipitação ecopurificação por meio de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso,interações entre proteínas podem ser monitoradas utilizando sistema genéticocom base em leveduras descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song,Nature (London) 340: 245-246 (1989); Chien et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A. 88: 9578-9582 (1991)), conforme descrito por Chevray e Nathans, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89: 5789-5793 (1991). Muitos ativadores detranscrição, tais como GAL4 de levedura, consistem de dois domíniosmodulares fisicamente discretos, um que age como domínio de união de DNA eo outro que funciona como domínio de ativação de transcrição. O sistema deexpressão de levedura descrito nas publicações acima (geralmentedenominado "sistema bi-híbrido") utiliza esta propriedade e emprega duasproteínas híbridas, uma em que a proteína alvo é fundida ao domínio de uniãode DNA de GAL4 e outra em que as possíveis proteínas ativadoras sãofundidas ao domínio de ativação. A expressão de gene relator GAL1-/acZ sob ocontrole de promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividadede GAL4 por meio de interação entre proteínas. As colônias que contêmpolipeptídeos em interação são detectadas com substrato cromogênico para p-galactosidase. Kit completo (MATCHMAKER®) para a identificação deinterações entre proteínas entre duas proteínas específicas utilizando o métodobi-híbrido é disponível comercialmente por meio da Clontech. Este sistemapode também ser estendido para mapear domínios de proteínas envolvidos eminterações de proteínas específicas, bem como para indicar resíduos deaminoácidos que são fundamentais para estas interações.
Os compostos que interferem com a interação de gene quecodifica polipeptídeo TAT identificado no presente e outros componentes intraou extracelulares podem ser testados conforme segue: normalmente épreparada mistura de reação que contém o produto do gene e o componenteintra ou extracelular sob condições e por tempo que permitam a interação e aunião dos dois produtos. Para testar a capacidade de possível composto deinibir a união, a reação é conduzida na ausência e na presença do compostode teste. Além disso, pode-se adicionar placebo a terceira mistura de reação,para que sirva de controle positivo. A união (formação de complexos) entre ocomposto de teste e o componente intra ou extracelular presente na mistura émonitorada conforme descrito acima. A formação de complexo na(s)reação(ões) de controle, mas não na mistura de reação que contém ocomposto de teste, indica que o composto de teste interfere com a interação docomposto de teste e seu parceiro de união.
Para testar antagonistas, o polipeptídeo TAT pode ser adicionadoa célula junto com o composto a ser selecionado em busca de atividadeespecífica e a capacidade do composto de inibir a atividade de interesse napresença do polipeptídeo TAT indica que o composto é antagonista para opolipeptídeo TAT. Alternativamente, antagonistas podem ser detectadoscombinando-se o polipeptídeo TAT e antagonista potencial com receptores depolipeptídeos TAT unidos por membrana ou receptores recombinantes sobcondições apropriadas para teste de inibição competitiva. O polipeptídeo TATpode ser marcado, tal como por meio de radioatividade, de tal forma que aquantidade de moléculas de polipeptídeo TAT unidas ao receptor possa serutilizada para determinar a eficácia do potencial antagonista. O gene quecodifica o receptor pode ser identificado por meio de numerosos métodosconhecidos dos técnicos no assunto, tais como extração de ligante e ordenamento de FACS. Coligan et al, Current Protocols in Immun., 1 (2):Capítulo 5 (1991). Preferencialmente, emprega-se clonagem de expressão emque RNA poliadenilado é preparado a partir de célula que reage aopolipeptídeo TAT e biblioteca de cDNAs criada a partir desse RNA é divididaem conjuntos e utilizada para a transfecção de células COS ou outras célulasque não reagem ao polipeptídeo TAT. Células transfectadas que são cultivadassobre lâminas de vidro são expostas a polipeptídeo TAT marcado. Opolipeptídeo TAT pode ser marcado por uma série de meios, que incluem aiodização ou inclusão de local de reconhecimento para quinase de proteínaespecífica de local. Após a fixação e a incubação, as lâminas são submetidas aanálise auto-radiográfica. Conjuntos positivos são identificados e subconjuntossão preparados e novamente transfectados utilizando processo de re-seleção eformação de subconjuntos interativo, gerando eventualmente um único cloneque codifica o suposto receptor.
Como abordagem alternativa para a identificação de receptores, opolipeptídeo TAT marcado pode ser ligado por fotoafinidade com membranacelular ou preparações de extrato que expressam a molécula receptora.Material reticulado é resolvido por PAGE e exposto a filme de raio X. Ocomplexo marcado que contém o receptor pode ser extirpado, resolvido emfragmentos de peptídeos e submetido a microsseqüenciamento de proteínas. Aseqüência de aminoácidos obtida por meio do microsseqüenciamento seriautilizada para projetar um conjunto de sondas de oligonucleotídeosdegeneradas para selecionar biblioteca de cDNA para identificar o gene quecodifica o suposto receptor.Em outro teste de antagonistas, células de mamíferos oupreparação de membrana que expressa o receptor seriam incubadas compolipeptídeo TAT marcado na presença do possível composto. A capacidadedo composto de aumentar ou bloquear esta interação poderá então ser medida.
Exemplos mais específicos de potenciais antagonistas incluemoligonucleotídeo que se une às fusões de imunoglobulina com polipeptídeoTAT e, particularmente, anticorpos que incluem, sem limitação, anticorpos polie monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de fita única, anticorposanti-idiotípicos e versões quiméricas ou humanizadas desses anticorpos oufragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos.Alternativamente, antagonista potencial pode ser proteína relacionada de perto,tal como forma do polipeptídeo TAT que sofreu mutação e reconhece oreceptor mas não proporciona nenhum efeito, de forma a inibircompetitivamente a ação do polipeptídeo TAT.
Outro potencial antagonista de polipeptídeo TAT é construção deDNA ou RNA sem sentido preparada utilizando tecnologia sem sentido, emque, por exemplo, molécula de DNA ou RNA sem sentido age para bloqueardiretamente a tradução de mRNA por meio de hibridização em mRNA alvo eevitando a tradução de proteína. Tecnologia sem sentido pode ser utilizadapara controlar a expressão genética por meio de formação de hélice tripla ouRNA ou DNA sem sentido, em que os dois métodos baseiam-se na união depolinucleotídeo a DNA ou RNA. A parte de codificação 5' da seqüência depolinucleotídeos que codifica os polipeptídeos TAT maduros do presente éutilizada, por exemplo, para projetar oligonucleotídeo de RNA sem sentido comcomprimento de cerca de dez a quarenta pares de bases. Oligonucleotídeo deDNA é projetado para ser complementar a região do gene envolvida natranscrição (hélice tripla - vide Lee et al, Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979);Cooney et al, Science, 241: 456 (1988); Dervan et al, Science, 251: 1360(1991)), de forma a evitar a transcrição e a produção do polipeptídeo TAT. Ooligonucleotídeo de RNA sem sentido hibridiza-se no mRNA in vivo e bloqueiaa tradução da molécula de mRNA no polipeptídeo TAT (sem sentido - Okano,Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors ofGene Expression (CRC Press: Boca Raton FL, 1988). Os oligonucleotídeosdescritos acima podem também ser fornecidos para células de tal forma que oRNA ou DNA sem sentido possa ser expresso in vivo para inibir a produção dopolipeptídeo TAT. Ao utilizar-se DNA sem sentido, oligodesoxirribonucleotídeosderivados do local de início de tradução, tal como cerca de -10 a +10 posiçõesda seqüência de nucleotídeos do gene alvo, são preferidos.
Potenciais antagonistas incluem moléculas pequenas que seunem ao local ativo, ao local de união do receptor, fator de crescimento ououtro local de união relevante do polipeptídeo TAT, de forma a bloquear aatividade biológica normal do polipeptídeo TAT. Exemplos de moléculaspequenas incluem, mas sem limitar-se a peptídeos pequenos ou moléculassimilares a peptídeos, preferencialmente peptídeos solúveis, e compostosorgânicos ou inorgânicos não de peptidila sintéticos.
Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes decatalisar a divisão específica de RNA. Ribozimas agem por meio dehibridização específica de seqüências para o RNA alvo complementar, seguidapor divisão endonucleolítica. Locais de divisão de ribozima específicos dentrode alvo de RNA potencial podem ser identificados por meio de métodosconhecidos. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Rossi, CurrentBiology 4: 469-471 (1994) e a Patente PCT n° WO 97/33551 (publicada emdezoito de setembro de 1997).
Moléculas de ácido nucleico em formação de hélice triplautilizadas para inibir a transcrição deverão possuir fita única e ser compostasde desoxinucleotídeos. A composição base desses oligonucleotídeos éprojetada de forma a promover a formação de hélice tripla por meio de regrasde emparelhamento de bases Hoogsteen, que geralmente necessitam deestiramentos dimensionáveis de purinas ou pirimidinas em uma fita de duplex.
Para mais detalhes, vide, por exemplo, a Patente PCT n° WO 97/33551, acima.
Estas moléculas pequenas podem ser identificadas por qualquerum ou mais dos testes de seleção discutidos acima e/ou por qualquer outrométodo de seleção bem conhecido dos técnicos no assunto.
Ácido nucleico codificador de polipeptídeo TAT isolado pode serutilizado no presente para a produção recombinante de polipeptídeo TATempregando métodos bem conhecidos na técnica e conforme descrito nopresente. Por sua vez, os polipeptídeos TAT produzidos podem serempregados para gerar anticorpos anti-TAT utilizando métodos bemconhecidos na técnica e conforme descrito no presente.
Os anticorpos que unem especificamente polipeptídeo TATidentificado no presente, bem como outras moléculas identificadas pelos testesde seleção descritos acima, podem ser administrados para o tratamento devárias disfunções, incluindo câncer, na forma de composições farmacêuticas.
Caso o polipeptídeo TAT seja intracelular e anticorpos inteiros sejamutilizados como inibidores, são preferidos anticorpos intemalizantes. Entretanto,lipofecções ou lipossomos também podem ser utilizados para fornecer o anticorpo,ou fragmento de anticorpo, para células. Ao utilizar-se fragmentos de anticorpos, omenor fragmento inibidor que se une especificamente ao domínio de união daproteína alvo é preferido. Com base nas seqüências de região variável de anticorpo,por exemplo, podem ser projetadas moléculas de peptídeos que retenham acapacidade de união da seqüência de proteínas alvo. Esses peptídeos podem sersintetizados quimicamente e/ou produzidos por meio de tecnologia de DNArecombinante. Vide, por exemplo, Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90:7889-7893 (1993).A formulação do presente pode também conter mais de umcomposto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não seprejudiquem entre si. Alternativa ou adicionalmente, a composição podecompreender um agente que aprimore a sua função, tal como agentecitotóxico, citoquina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor docrescimento. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes emcombinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
Os Exemplos a seguir são oferecidos unicamente para fins deilustração e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção denenhuma forma.
Todas as referências de patentes e literatura mencionadas nopresente relatório descritivo são integralmente incorporadas ao presente comoreferência.
Exemplos
Os reagentes disponíveis comercialmente indicados nosExemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, a menosque indicado em contrário. A fonte dessas células identificadas nos exemplos aseguir e em todo o relatório descritivo por números de acesso ATCC é aColeção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Manassas VA.
Exemplo 1
Formação de Perfis de Expressão de Tecidos Utilizando GeneExpress®Banco de dados particular contendo informações sobre expressãogenética (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg MD) foi analisado emtentativa de identificar polipeptídeos (e seus ácidos nucleicos codificadores)cuja expressão é significativamente regulada para cima de forma detectável emtecido(s) tumoroso(s) específico(s) de interesse em comparação com outro(s)tumor(es) e/ou tecidos humanos normais. Especificamente, a análise do bancode dados GeneExpress® foi conduzida utilizando software disponível por meioda Gene Logic Inc., Gaithersburg MD, para uso com o banco de dadosGeneExpress® ou com software particular escrito e desenvolvido pelaGenentech, Inc. para uso com o banco de dados GeneExpress®. A avaliaçãode coincidências positivas na análise baseia-se em diversos critérios queincluem, por exemplo, especificidade de tecido, especificidade de tumor e nívelde expressão em tecidos essenciais normais e/ou em proliferação normal. A(s)molécula(s) a seguir exibe(m) perfil de expressão de tecidos que evidencia altaexpressão de tecidos e regulagem para cima detectável significativa ereproduzível da expressão em tumor(es) específico(s) em comparação comoutro(s) tumor(es) humano(s) e/ou tecidos humanos normais e opcionalmenteexpressão relativamente baixa em tecidos essenciais normais e/ou emproliferação normais.
Utilizando a análise de expressão descrita acima, determinou-seque mRNA que codifica o polipeptídeo TAT10772 é significativamente expressode forma reproduzível e detectável em certos tipos de tumores pancreáticos, demama e ovário cancerosos humanos em comparação com os tecidospancreáticos, de mama e ovário humanos normais correspondentes,respectivamente.
A. Ovário
Em primeiro experimento, a expressão de TAT10772 foi analisadaem grupo de 89 amostras de tecido de ovário humano normais independentes.Os resultados destas análises demonstraram que o nível de expressão demRNA TAT10772 em todas as amostras de tecido de ovário humano normalanalisadas foi notadamente consistente e encontrou-se dentro de distribuiçãomuito firme, em que nenhuma amostra de tecido de ovário humano normalevidenciou aumento de mais de seis vezes na expressão de TAT10772 emcomparação com o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo deamostras como um todo.
Para fins de comparação quantitativa, uma série de tiposdiferentes e independentes de amostras de tecido de ovário humano cancerosotambém foi analisada para determinar a expressão de TAT10772. Osresultados obtidos destas análises demonstraram que o nível de expressão deTAT10772 nas amostras cancerosas foi bastante variável, em que quantidadesignificativa das amostras cancerosas exibiu aumento de pelo menos seisvezes (até cerca de 580 vezes) da expressão de TAT10772 em comparaçãocom o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo de amostras detecido de ovário normal analisado. Mais especificamente, observou-sesobreexpressão de TAT10772 detectável e reproduzível para os tipos decâncer de ovário a seguir em compaação com ovário normal (em que osalgarismos exibidos entre parênteses para cada tipo de câncer representam aquantidade de amostras independentes que exibiram aumento de pelo menosseis vezes da expressão de TAT10772 em comparação com o nível médio deexpressão de TAT10772 para o grupo de amostras de tecido de ovário normalanalisado/o número total de amostras de tumor independentes analisado):adenocarcinoma endometrióide (13/17), cistadenocarcinoma do soro, incluindopapilar (52/57) e adenocarcinoma de células limpas (7/10). Foram conduzidosexperimentos adicionais que confirmaram estes resultados.
B. Mama
Em outro experimento, a expressão de TAT10772 foi analisadaem grupo de 22 amostras de tecido de mama humano normais independentes.
Os resultados destas análises demonstraram que o nível de expressão demRNA TAT10772 em todas as amostras de tecido de mama humano normalanalisadas foi notadamente consistente e encontrou-se dentro de distribuiçãomuito firme, em que nenhuma amostra de tecido de mama humano normalevidenciou aumento de mais de duas vezes na expressão de TAT10772 emcomparação com o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo deamostras como um todo.
Para fins de comparação quantitativa, 209 carcinomas dos dutosinfiltrantes HER-2 negativos humanos independentes das amostras de tecidode mama foram também analisados para determinar a expressão deTAT10772. Os resultados obtidos destas análises demonstraram que o nível deexpressão de TAT10772 nas amostras cancerosas foi bastante variável, emque 76 das 209 amostras testadas exibiram aumento de pelo menos duasvezes (até cerca de quinze vezes) da expressão de TAT10772 em comparaçãocom o nível médio de expressão de TAT10772 para o grupo de amostras detecido de mama normal analisado.
C. Pâncreas
Em outro experimento, a expressão de TAT10772 foi analisadaem grupo de 51 amostras de tecido de pâncreas humano normaisindependentes. Os resultados destas análises demonstraram que o nível deexpressão de mRNA TAT10772 em todas as amostras de tecido de pâncreashumano normal analisadas foi notadamente consistente e encontrou-se dentrode distribuição muito firme, em que nenhuma amostra de tecido de pâncreashumano normal evidenciou aumento de mais de duas vezes na expressão deTAT10772 em comparação com o nível médio de expressão de TAT10772 parao grupo de amostras como um todo.
Para fins de comparação quantitativa, 65 amostras de tecido deadenocarcinoma pancreático humano independentes foram também analisadospara determinar a expressão de TAT10772. Os resultados obtidos destasanálises demonstraram que o nível de expressão de TAT10772 nas amostrascancerosas foi bastante variável, em que 33 das 65 amostras testadas exibiramaumento de pelo menos duas vezes (até cerca de 21 vezes) da expressão deTAT10772 em comparação com o nível médio de expressão de TAT10772 parao grupo de amostras de tecido de pâncreas normal analisado.
Dado o acima, o polipeptídeo TAT10772 e o ácido nucleico quecodifica aquele polipeptídeo são excelentes alvos que podem ser exploradospara a determinação quantitativa e qualitativa do nível de expressão dopolipeptídeo TAT10772 e o mRNA que o codifica, em várias amostras de tecidode mamíferos, de forma a permitir que se tome comparações quantitativas equalitativas entre eles. Portanto, o polipeptídeo TAT10772 e o ácido nucleicoque codifica esse polipeptídeo são moléculas cujo perfil de expressão exclusivopode ser explorado para o diagnóstico de certos tipos de tumores cancerososem mamíferos, conforme descrito acima. Além disso, como esta análisedemonstra que o polipeptídeo TAT10772 é sobreexpresso de formasignificativa, reproduzível e detectável em certos tumores humanos emcomparação com os seus tecidos humanos normais correspondentes, opolipeptídeo TAT10772 serve de excelente alvo que pode ser explorado para otratamento terapêutico desses tumores em mamíferos.
Exemplo 2
Análise de Microconjuntos para Detectar a Regulagem para Cima depolipeptídeos tat em tumores cancerosos
Microconjuntos de ácido nucleico, que contêm freqüentementemilhares de seqüências genéticas, são úteis para a identificação de genesexpressos de forma diferencial em tecidos doentes, em comparação com osseus parceiros normais. Utilizando microconjuntos de ácido nucleico, amostrasde mRNA de teste e de controle de amostras de tecido de teste e de controlesofrem transcrição reversa e são marcadas para gerar sondas de cDNA. Assondas de cDNA são hibridizadas em seguida em um conjunto de ácidosnucleicos imobilizados sobre suporte sólido. O conjunto é configurado de talforma que a seqüência e a posição de cada membro do conjunto sejamconhecidas. Seleção de genes que conhecidamente são expressos em certosestados de doenças, por exemplo, pode ser reunida sobre suporte sólido. Ahibridização de sonda marcada com membro de conjunto específico indica quea amostra da qual a sonda foi derivada expressa aquele gene. Caso o sinal dehibridização de sonda de amostra de teste (tecido doente) seja maior que osinal de hibridização de sonda de amostra controle (tecido normal), o(s)gene(s) sobreexpresso(s) no tecido doente é(são) identificado(s). A implicaçãodeste resultado é que proteína sobreexpressa em tecido doente é útil nãoapenas como marcador de diagnóstico para determinar a presença dacondição de doença, mas também como alvo terapêutico para tratamento dacondição de doença.
A metodologia de hibridização de ácidos nucleicos e tecnologia demicroconjuntos é bem conhecida na técnica. No presente exemplo, apreparação específica de ácidos nucleicos para hibridização e sondas, lâminase condições de hibridização são todas detalhadas no Pedido de Patente PCTcom número de série PCT/US 01/10482; depositado em trinta de março de2001 e que é incorporado ao presente como referência.
No presente exemplo, tumores cancerosos derivados de váriostecidos humanos foram estudados para determinar a expressão genéticaregulada para cima com relação a tumores cancerosos de diferentes tipos detecidos e/ou tecidos humanos não cancerosos em tentativa de identificar ospolipeptídeos que são sobreexpressos em tumor(es) canceroso(s)específico(s). Em certos experimentos, tecido de tumor humano canceroso etecido de tumor humano não canceroso do mesmo tipo de tecido(freqüentemente do mesmo paciente) foram obtidos e analisados paradeterminar a expressão de polipeptídeo TAT. Além disso, tecido de tumorhumano canceroso de qualquer dentre uma série de diferentes tumoreshumanos foi obtido e comparado com amostra controle epitelial "universal" quefoi preparada por meio da reunião de tecidos humanos não cancerosos comorigem epitelial, que incluem fígado, rim e pulmão. mRNA isolado dos tecidosreunidos representa mistura de produtos genéticos expressos dessesdiferentes tecidos epiteliais, de forma a fornecer excelente controle negativocom o qual são comparados quantitativamente os níveis de expressão genéticaem tumores de origem epitelial. Experimentos de hibridização demicroconjuntos utilizando as amostras controle reunidas geraram plotagemlinear em análise bicolor. A inclinação da linha gerada em análise bicolor foiutilizada em seguida para normalizar as razões de (detecção de teste: controle)em cada experimento. As razões normalizadas de vários experimentos foramcomparadas em seguida e utilizadas para identificar a formação de conjuntosde expressão genética. Desta forma, a amostra "controle universal" reunida nãoapenas permitiu determinações da expressão genética relativa efetivas emcomparação simples de duas amostras, mas também permitiu comparaçõesentre múltiplas amostras ao longo de vários experimentos.
Nos experimentos do presente, sondas de ácido nucleico derivadasdas seqüências de ácido nucleico que codificam polipeptídeo TAT descritas nopresente foram utilizadas na criação do microconjunto e RNA de diversos tecidostumorosos foi empregado para a sua hibridização. Valor baseado na razãonormalizada:razão experimental foi denominado "razão de corte". Somente valoresacima desta razão de corte foram determinados como sendo significativos. Osignificado de razões foi estimado a partir da quantidade de ruído ou difusãoassociada a cada experimento, mas utilizou-se tipicamente razão de corte de 1,8 aduas vezes ou mais para identificar possíveis genes relativamente sobreexpressosem amostras de tumores, em comparação com o tecido normal correspondentee/ou o controle universal epitelial normal reunido. As razões para os genesidentificados desta forma como sendo relativamente sobreexpressos em amostrasde tumores variaram de duas a quarenta vezes, ou até mais. Comparativamente,em experimento controle em que o mesmo RNA foi marcado em cada cor ehibridizado contra si próprio, para virtualmente todos os genes com sinais acima dofundo, a razão observada é de significativamente menos de 1,8 vezes. Isso indicaque o ruído experimental acima de razão de 1,8 vezes é extremamente baixo e quealteração observada de 1,8 vezes ou mais é significativa e espera-se querepresente diferença real, detectável e reproduzível da expressão entre as amostrasanalisadas e comparadas.
Os resultados destes experimentos demonstraram que mRNA quecodifica o polipeptídeo TAT10772 é significativamente sobreexpresso (ou seja,pelo menos duas vezes) em oito dentre dez amostras de tumor de ováriohumano independentes testadas em comparação com tecido de ovário humanonormal e a amostra controle epitelial reunida. Estes dados tambémdemonstram que a sobreexpressão observada é significativa, detectável ereproduzível ao longo de várias amostras de tumor de ovário humano emcomparação com amostras de ovário humano correspondentes normais e aamostra controle epitelial humana reunida. Conforme descrito acima, estesdados demonstram que os polipeptídeos TAT10772 de acordo com a presenteinvenção e o ácido nucleico codificador são úteis não apenas comomarcadores de diagnóstico para determinar a presença de um ou mais tumoresde ovário humano, mas também servem de potenciais alvos terapêuticos parao tratamento desses tumores em seres humanos.
Exemplo 3
Análise Quantitativa da Expressão de mRNA de TAT
Neste teste, teste de 5'-nuclease (tal como TaqMan®) e PCRquantitativo em tempo real (tal como Sistema de Detecção de Seqüências ABIPrizm 7700® (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City CA))foram utilizados para encontrar genes que são significativamentesobreexpressos em tumor(es) canceroso(s) em comparação com outrostumores cancerosos ou tecido não canceroso normal. A reação de teste 5'nuclease é técnica baseada em PCR fluorescente, que faz uso da atividade de5'-exonuclease de enzima de polimerase de DNA Taq para monitorar aexpressão genética em tempo real. Dois primers de oligonucleotídeos (cujasseqüências são baseadas no gene ou seqüência de EST de interesse) sãoutilizados para gerar amplicon típico de reação de PCR. Terceirooligonucleotídeo, ou sonda, é projetado para detectar seqüência denucleotídeos localizada entre os dois primers de PCR. A sonda não éextensível por enzima polimerase de DNA Taq e é marcada com tinturafluorescente relatora e tintura fluorescente refrescante. Qualquer emissãoinduzida por laser da tintura relatora é resfriada pela tintura refrescante quandoas duas tinturas estiverem em posição próxima quando sobre a sonda. Durantea reação de amplificação por PCR, a enzima polimerase de DNA Taq divide asonda de maneira dependente de modelo. Os fragmentos de sonda resultantesdissociam-se em solução e o sinal da tintura relatora liberada é livre do efeitode resfriamento do segundo fluoroforo. Uma molécula de tintura relatora éliberada para cada nova molécula sintetizada e a detecção da tintura relatoranão resfriada fornece a base de interpretação quantitativa dos dados. Esteteste é bem conhecido e utilizado rotineiramente na técnica para identificarquantitativamente as diferenças de expressão genética entre duas amostras detecido humano diferentes; vide, por exemplo, Higuchi et al, Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak et al, PCR Methods Appl., 4: 357-362 (1995); Heid et al,Genome Res. 6: 986-994 (1996); Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A.95 (25): 14717-14722 (1998); Pitti et al, Nature 396 (6712): 699-703 (1998) eBieche et al, Int. J. Câncer 78: 661-666 (1998).
O procedimento de 5' nuclease é conduzido em dispositivo PCRquantitativo em tempo real tal como a Detecção de Seqüências ABI Prism7700®. O sistema consiste de termociclizador, laser, câmera de dispositivoacoplado a carga (CCD) e computador. O sistema amplifica amostras emformato de 96 cavidades sobre termociclizador. Durante a amplificação, sinalfluorescente induzido por laser é recolhido em tempo real por meio de cabos defibra ótica para todas as 96 cavidades e detectado no CCD. O sistema incluisoftware para condução do instrumento e para análise dos dados.
O material de partida para a tela foi mRNA isolado de uma sériede diferentes tecidos cancerosos. O mRNA é quantificado precisamente, talcomo fluorometricamente. Como controle negativo, RNA foi isolado de váriostecidos normais do mesmo tipo de tecido dos tecidos cancerosos sendotestados. Freqüentemente, amostra(s) de tumor(es) é(são) comparada(s)diretamente com amostra(s) normal(is) "coincidente(s)" do mesmo tipo detecido, o que significa que o tumor e a(s) amostra(s) normal(is) são obtidos domesmo indivíduo.
Dados de teste de 5' nuclease são inicialmente expressos comoCt, ou o ciclo limite. Este é definido como o ciclo no qual o sinal relatoracumula-se acima do nível de fundo de fluorescência. Os valores ACt sãoutilizados como medida quantitativa do número relativo de cópias iniciais deseqüência alvo específica em amostra de ácido nucleico ao comparar-seresultados de mRNA de câncer com resultados de mRNA humano normal.Como uma unidade Ct corresponde a um ciclo PCR ou aumento relativo decerca de duas vezes com relação ao normal, duas unidades correspondem aaumento relativo de quatro vezes, três unidades correspondem a aumentorelativo de oito vezes e assim por diante, pode-se medir quantitativamente oaumento dobrado relativo da expressão de mRNA entre dois ou mais tecidosdiferentes. Neste particular, é bem aceito na técnica que este teste ésuficientemente sensível tecnicamente para detectar de forma reproduzívelaumento de pelo menos duas vezes na expressão de mRNA em amostra detumor humano com relação a controle normal.
Utilizando esta técnica, determinou-se que mRNA que codifica opolipeptídeo TAT10772 é significativamente sobreexpresso (ou seja, pelomenos duas vezes) em nove dentre dez amostras de tumor de ovário humanotestadas em comparação com amostras de tecido de ovário humano normal dediferentes doadores de tecido, bem como várias amostras de tumor de ováriohumano normal "coincidentes", derivadas do mesmo doador de tecido humanodo qual a(s) amostra(s) de tumor(es) foi(ram) derivada(s). Conforme descritoacima, estes dados demonstram que os polipeptídeos TAT10772 de acordocom a presente invenção e o ácido nucleico codificador são úteis não apenascomo marcadores de diagnóstico para determinar a presença de tumores doovário humanos, mas também servem de potenciais alvos terapêuticos para otratamento desses tumores em seres humanos.
Exemplo 4
Hibridação In situ
A hibridização in situ é método potente e versátil de detecção elocalização de seqüências de ácido nucleico em preparações de tecidos oucélulas. Pode ser útil, por exemplo, identificar locais de expressão genética,analisar a distribuição de transcrição no tecido, identificar e localizar infecçõesvirais, seguir alterações na síntese específica de mRNA e auxiliar nomapeamento de cromossomos.
Realizou-se hibridização in situ seguindo versão otimizada doprotocolo de Lu e Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994), utilizando ribossondas33P-marcadas geradas por PCR. Resumidamente, tecidos humanos embutidosem parafina fixados com formalina foram seccionados, desparafinados,desproteinados em proteinase K (20 g/ml) por quinze minutos a 37 °C eprocessados adicionalmente para hibridização in situ conforme descrito por Lue Gillett, acima. Ribossonda sem sentido [33-P] UTP-marcada foi gerada a partirde produto de PCR e hibridizada a 55 °C por uma noite. As lâminas forammergulhadas em emulsão de rastreamento nuclear Kodak NTB2 e expostas porquatro semanas.
Síntese de ribossonda 33P
6,0 ul (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol) foram secos a vácuo em velocidade. A cada tubo contendo 33P-UTP,foram adicionados os ingredientes a seguir:
2,0 ul de 5x tampão de transcrição1,0 u1 de DTT (100 mM)
2,0 ul de mistura NTP (2,5 mM: 10 n; 10 mM de GTP, CTP
e ATP cada + 10 nl de H20)
o - 1,0nldeUTP(50^iM)
1,0 ul de Rnasin1,0 ul de modelo de DNA (1 jag)1,0 ul de H20
1,0 nl de RNA polimerase (para produtos de PCR T3 = AS,
T7 = S, normalmente)
Os tubos foram incubados a 37 °C por uma hora. 1,0 jal de RQ1DNase foram adicionados, seguidos por incubação a 37 °C por quinze minutos.Adicionou-se 90 juil de TE (10 mM de Tris, pH 7,6/1 mM de EDTA, pH 8,0) e amistura foi colocada com pipeta sobre papel DE81. A solução restante foi carregadaem unidade de ultrafiltragem Microcon 50 e centrifugada utilizando o programa 10(seis minutos). A unidade de filtragem foi invertida sobre segundo tubo ecentrifugada utilizando o programa 2 (três minutos). Após a centrifugação derecuperação final, adicionou-se 100 yú de TE. 1 \ú do produto final foi colocado compipeta sobre papel DE81 e contado em 6 ml de Bioflúor II.
A sonda foi conduzida sobre gel de TBE e uréia. 1 a 3 fJ da sondaou 5 nl de RNA Mrk lil foram adicionados a 3 jj.I de tampão de carga. Apósaquecimento sobre bloco de aquecimento a 95 °C por três minutos, a sonda foiimediatamente colocada sobre gelo. As cavidades de gel receberam fluxo, aamostra foi carregada e conduzida a 180-250 volts por 45 minutos. O gel foiembalado em embalagem saran e exposto a filme XAR com tela deintensificação em congelador a -70 °C por uma hora a uma noite.
33P Hibridizacão
A. Tratamento prévio de seções congeladas
As lâminas foram removidas do congelador, colocadas sobrebandejas de alumínio e descongeladas à temperatura ambiente por cincominutos. As bandejas foram colocadas em incubador a 55 °C por cinco minutospara reduzir a condensação. As lâminas foram fixadas por dez minutos emparaformaldeído a 4% sobre gelo na capela de defumação e lavadas em 0,5 xSSC por cinco minutos à temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQH2O). Após desproteinação em 0,5 ng/ml de proteinase K por dez minutos a 37°C (12,5 \i\ de 10 mg/ml de padrão em 250 ml de tampão de RNAse livre deRNase previamente aquecido), as seções foram lavadas em 0,5 x SSC por dezminutos à temperatura ambiente. As seções foram desidratadas em 70%, 95%,100% etanol, por dois minutos cada.
B. Tratamento prévio de seções embutidas em parafina
As lâminas foram desparafinadas, colocadas em SQ H2O eenxaguadas por duas vezes em 2 x SSC à temperatura ambiente, por cincominutos a cada vez. As seções foram desproteinadas em 20 ng/ml de proteinase K(500 de 10 mg/ml em 250 ml de tampão RNase livre de RNase; 37 °C, quinzeminutos) - embrião humano, ou 8 x proteinase K (100 jal em 250 ml de tampãoRNase, 37 °C, trinta minutos) - tecidos de formalina. Enxágüe subseqüente em 0,5 xSSC e desidratação foram realizados conforme descrito acima.
C. Hibridizacão prévia
As lâminas foram depositadas em caixa de plástico forrada comtampão de caixa (4 x SSC, 50% formamida) - papel filtro saturado.
D. Hibridizacão1,0 x 106 cpm sonda e 1,0 |*l de tRNA (50 mg/ml de padrão) porlâmina foram aquecidos a 95 °C por três minutos. As lâminas foram resfriadassobre gelo e adicionou-se 48 \i\ de tampão de hibridização por lâmina. Apósturbilhonamento, 50 ^il de mistura 33P foram adicionados a 50 \i\ de hibridizaçãoprévia sobre a lâmina. As lâminas foram incubadas por uma noite a 55 °C.
E. Lavagens
A lavagem foi realizada 2x10 minutos com 2 x SSC, EDTA àtemperatura ambiente (400 ml 20 x SSC + 16 ml 0,25 M EDTA, Vf = 4L),seguida por tratamento com RNase A a 37 °C por trinta minutos (500 (xl de 10mg/ml em 250 ml de tampão Rnase = 20 ng/ml). As lâminas foram lavadas 2 x10 minutos com 2 x SSC, EDTA à temperatura ambiente. As condições delavagem de estringência foram as seguintes: duas horas a 55 °C, 0,1 x SSC,EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDTA, Vf = 4L).
F. Oligonucleotídeos
Realizou-se análise in situ sobre uma série de seqüências deDNA descritas no presente. Os oligonucleotídeos empregados para estasanálises foram obtidos de forma que sejam complementares aos ácidosnucleicos (ou aos seus complementos) conforme exibido nas figuras anexas.
G. Resultados
Com relação à expressão de TAT10772 em tecidos humanosnormais, observa-se forte expressão da mucosa brônquica e glândulassubmucosas. Entretanto, todos os outros tecidos humanos normais testados sãonegativos para a expressão de TAT10772. Por outro lado, observa-se forteexpressão de TAT10772 em treze dentre quinze tumores do ovário (tumoresepiteliais da superfície e adenocarcinoma) testados. Também se observa forteexpressão de TAT10772 em oito dentre nove adenocarcinomas uterinos humanos.
Exemplo 5
Preparação de Anticorpos que Unem TAT10772Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais quepodem unir TAT10772 especificamente.
Métodos de produção dos anticorpos monoclonais sãoconhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Goding, acima.Imunogenes que podem ser empregados incluem TAT purificado, proteínas defusão que contêm TAT e células que expressam TAT recombinante sobre asuperfície celular. A seleção do imunogene pode ser realizada pelos técnicosno assunto sem experimentação indevida.
Camundongos, tais como Balb/c, são imunizados com o imunogeneTAT emulsificado em adjuvante de Freund completo e injetados por via subcutâneaou intraperitoneal em quantidade de 1 a 100 microgramas. Alternativamente, oimunogene é emulsificado em adjuvante MPL-TDM (Ribi ImmunochemicalResearch, Hamilton MT) e injetado nas almofadas das patas traseiras do animal. Oscamundongos imunizados são incentivados em seguida após dez a doze dias comimunogene adicional emulsificado no adjuvante selecionado. Em seguida, por váriassemanas, os camundongos podem também ser incentivados com injeções deimunização adicionais. Amostras de soro podem ser obtidas periodicamente doscamundongos por meio de sangramento retroorbital para teste em ensaios ELISApara detectar anticorpos anti-TAT.
Após a detecção de título de anticorpo apropriado, os animais"positivos" para anticorpos podem ser injetados com injeção intravenosa final deTAT. Três a quatro dias mais tarde, os camundongos são sacrificados e as célulasdo baço são colhidas. As células do baço são fundidas em seguida (utilizandopolietileno glicol a 35%) a uma linha de células de mieloma murino selecionadas talcomo P3X63AgU.1, disponível por meio da ATCC, n° CRL 1597. As fusões geramcélulas de hibridoma que podem ser colocadas em placas em seguida em placasde cultivo de tecidos com 96 cavidades que contêm meio HAT (hipoxantina,aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridosde mieloma e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma serão selecionadas em ELISA paradeterminar a reatividade contra TAT. A determinação de células de hibridoma"positivas" que secretam os anticorpos monoclonais desejados contra TATencontra-se dentro do conhecimento da técnica.
As células de hibridoma positivas podem ser injetadas por viaintraperitoneal em camundongos Balb/c singeneicos para produzir ascite quecontém os anticorpos monoclonais anti-TAT. Alternativamente, as células dehibridoma podem ser cultivadas em frascos de cultivo de tecidos ou garrafascilíndricas. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos na ascite pode serrealizada utilizando precipitação com sulfato de amônio, seguida por cromatografiade exclusão de géis. Alternativamente, pode-se empregar cromatografia deafinidade com base na união de anticorpo a proteína A ou proteína G.
Utilizando o método descrito acima, onze linhagens de células dehibridoma separadas e distintas foram geradas, cada uma das quais produzanticorpos monoclonais que se unem ao polipeptídeo TAT10772. Estas onzelinhagens de células de hibridomas são denominadas a seguir 16F7.1.15 (queproduz o anticorpo monoclonal 16F7),17A8.1.3 (que produz o anticorpomonoclonal 17A8), 9F3.1.3 (que produz o anticorpo monoclonal 9F3),16E12.2.15 (que produz o anticorpo monoclonal 16E12), 16A7.1.3 (que produzo anticorpo monoclonal 16A7), 10G11.1.1 (que produz o anticorpo monoclonal10G11), 5B10 (que produz o anticorpo monoclonal 5B10), 11D10.1.14 (queproduz o anticorpo monoclonal 11D10), 5F6.1.24 (que produz o anticorpomonoclonal 5F6), 7G6.2.6 (que produz o anticorpo monoclonal 7G6) e 3A5.3(que produz o anticorpo monoclonal 3A5.3). Demonstrou-se que os anticorposmonoclonais produzidos por estas onze linhagens de hibridoma unem-se aopolipeptídeo TAT10772 utilizando métodos bem conhecidos e rotineiramenteempregados tais como Western Blot, análise ELISA, análise de ordenamentoFACS de células que expressam o polipeptídeo TAT10772 e/ou análiseimunohistoquímica. Dentre as onze linhagens de hibridoma que produzemanticorpos monoclonais anti-TAT10772 funcionais, duas (clones de hibridoma11D10.1.14 e 3A5.3) foram depositadas com base nos termos do Tratado deBudapeste junto à Coleção Norte-Americana de Tipos de Tecidos, Manassas,VA, conforme descrito em detalhes adicionais abaixo.
Exemplo 6
Análises de União Competitiva e Mapeamento de Epítopos
Os epítopos de TAT10772 unidos pelos anticorpos monoclonaisdescritos foram determinados por meio de análise de unão competitiva padrão(Fendly et al, Câncer Research 50: 1550-1558 (1990)). Estudos de bloqueiocruzado foram elaborados sobre anticorpos por meio de fluorescência diretasobre células PC3 intactas elaboradas para expressar TAT10772 utilizando aMáquina de Seleção PANDEX® para quantificar a fluorescência. Cadaanticorpo monoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC),utilizando procedimentos estabelecidos (Wofsy et al, Selected Methods inCellular Immunology, pág. 287, Mishel e Schiigi (eds.), São Francisco: W. J.Freeman Co. (1980)). Monocamadas confluentes de células PC3 queexpressam TAT10772 foram tripsinizadas, lavadas por uma vez e novamentesuspensas em 1,75 x 106 células por mililitro em PBS frio contendo 0,5% dealbumina de soro bovino (BSA) e 0,1% NaN3. Concentração final de partículasde látex a 1% (IDC, Portland OR) foi adicionada para reduzir a obstrução dasmembranas de placas PANDEX®. Células em suspensão, 20 nl, e 20 yA deanticorpos monoclonais purificados (100 ng/ml a 0,1 ng/ml) foram adicionadosàs cavidades de placas PANDEX® e incubadas sobre gelo por trinta minutos.Diluição previamente determinada de anticorpos monoclonais marcados comFITC em 20 nl foi adicionada a cada cavidade, incubada por trinta minutos,lavada e a fluorescência foi quantificada pela Máquina de Seleção PANDEX®.Os anticorpos monoclonais foram considerados compartilhando epítopo casocada um bloqueasse a união do outro em 40% ou mais em comparação comanticorpo monoclonal irrelevante controle e à mesma concentração deanticorpo. Neste experimento, os anticorpos monoclonais 16F7, 17A8, 9F3,16E12, 16A7, 10G11, 5B10, 11D10, 5F6, 7G6 e 3A5 receberam os epítoposTAT10772 B, B, B, B, B, B, A, B, B, C e D, respectivamente. Utilizando esteteste, os técnicos comuns no assunto podem identificar outros anticorposmonoclonais que se unem ao mesmo epítopo descrito acima.
Também foi conduzida análise de exclusão para identificar o localaproximado na seqüência de polipeptídeos exibida como SEQ ID N° 2 dosepítopos antigênicos descritos acima. Estas análises demonstraram que oepítopo antigênico TAT10772 A é encontrado entre os aminoácidos 6471 e6560 de SEQ ID N° 2, epítopo antigênico TAT10772 B é encontrado entre osaminoácidos 6389 e 6470 de SEQ ID N° 2, epítopo antigênico TAT10772 C éencontrado entre os aminoácidos 6663 e 6806 de SEQ ID N° 2 e epítopoantigênico TAT10772 D é encontrado entre os aminoácidos 3765 e 6397 deSEQ ID N° 2 (que compreende cerca de dezessete seqüências de repetiçãosimilares a mucin com 150 aminoácidos e, portanto, compreende maisprovavelmente diversos locais de epítopos antigênicos similares). Polipeptídeosque compreendem qualquer destes locais de epítopos antigênicosespecificamente identificados (e moléculas de ácido nucleico que codificamestes polipeptídeos) são englobados na presente invenção.
Em experimento separado, demonstrou-se que a união deanticorpo monoclonal para 3A5 a células OVCAR-3, OVCA-432 e SK-OV-3conforme determinado por meio de análises de citometria de fluxo padrão,encontra-se em paralelo com o nível de expressão de mRNA TAT10772expresso em cada uma destas três linhagens celulares específicas, conformedeterminado por meio de análises de PCR quantitativas padrão. Maisespecificamente, conforme determinado por meio de análise de PCRquantitativa padrão, células OVCAR-3, OVCA-432 e SK-OV-3 expressam nívelalto, moderado e baixo de mRNA TAT10772, respectivamente. Ao empregar-seo anticorpo monoclonal 3A5 em análises de citometria de fluxo padrão paraquantificar a capacidade de 3A5 de unir-se a estas células, observou-se que aunião de 3A5 fica em paralelo quantitativamente com a quantidade relativa demRNA TAT10772 presente nestas linhagens celulares. Estes dados sugeremque a quantidade de mRNA TAT10772 em qualquer tipo de célula específicodetermina quantitativamente a quantidade de polipeptídeo TAT10772 expressapor aquele tipo de célula e, por sua vez, determina a capacidade de qualqueranticorpo anti-TAT10772 de unir-se àquele tipo de célula.
Exemplo 7
Análise Imunohistoquímica
Anticorpos contra TAT10772 foram preparados conforme descritoacima e realizou-se análise imunohistoquímica utilizando os anticorpos monoclonais3A5 e 11D10 conforme segue. Seções de tecido foram fixadas em primeiro lugarpor cinco minutos em acetona/etanol (congelado ou embutido em parafina). Asseções foram lavadas em seguida em PBS e depois bloqueadas com avidina ebiotina (kit Vector) por dez minutos, cada qual seguido por lavagem em PBS. Asseções foram bloqueadas em seguida com soro a 10% por vinte minutos e depoismanchadas para remover o excesso. Adicionou-se anticorpo primário em seguidaàs seções em concentração de 10 j^g/ml por uma hora e depois as seções foramlavadas em PBS. Adicionou-se anticorpo secundário biotinilado (anti-anticorpoprimário) em seguida às seções por trinta minutos e depois as seções foramlavadas com PBS. As seções foram expostas em seguida aos reagentes do kitVector ABC por trinta minutos e as seções foram depois lavadas em PBS. Asseções foram expostas em seguida a Diaminobenzidina (Pierce) por cinco minutose deopis lavadas em PBS. As seções foram contramanchadas em seguida comhematoxilina Mayers, cobertas com tampa e visualizadas. Análiseimunohistoquímica pode também ser realizada conforme descrito em Sambrook etal, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press,1989, e Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology, Unidade 3.16, JohnWiley& Sons (1997).
Os resultados destas análises demonstram que o anticorpomonoclonal 11D10 não se une de forma detectável a nenhum dos tecidoshumanos normais a seguir: aorta, cérebro, cólon, fígado, rim, intestino delgado,estômago, pulmão (tanto tecido alveolar quanto brônquico). Entretanto, seisdentre treze amostras de adenocarcinoma do ovário humano independentes euma dentre sete amostras de adenocarcinoma endométrico humanoindependentes exibem forte união ao anticorpo 11D10. Além disso, emexperimento separado, o anticorpo 11D10 une-se fortemente a uma dentrenove amostras de tumor de adenocarcinoma mucinoso humano, treze dentre22 amostras de tumor de adenocarcinoma endometrióide humano, dezessetedentre 26 amostras de tumor de cistoadenocarcinoma do soro humano e trêsdentre oito amostras de tumor de células limpas humano.
Os resultados destas análises demonstram que o anticorpomonoclonal 3A5, como o anticorpo monoclonal 11D10, não se une de formadetectável a nenhum dos tecidos humanos normais relacionados acima.
Entretanto, o anticorpo 3A5 une-se fortemente a dois dentre doisadenocarcinomas do ovário humano independentes (manchas membranosas),dezesseis dentre vinte amostras de tumores de adenocarcinomaendometrióides, 24 dentre 25 amostras de tumor de cistadenocarcinoma dosoro humano e cinco dentre dez amostras de tumor de células limpas.
Exemplo 8
Anticorpo Monoclonal 3A5 é Internalizado Mediante união ao
Polipeptídeo TAT10772 Sobre CélulasEste experimento demonstra que o anticorpo monoclonal 3A5torna-se internalizado em células às quais une polipeptídeo TAT10772 sobre asuperfície celular. Especificamente, células OVCAR-3 foram incubadas pordezoito horas com o anticorpo monoclonal 3A5 e dextrano fluorescente e, emseguida 3A5 associado a células foi detectado quantitativamente com anticorpoanti-3A5 marcado com fluoresceína. Estas análises demonstraram que oanticorpo 3A5 colocaliza-se com dextran, o que indica o tráfico do anticorpo3A5 para componentes subcelulares das células incubadas, que incluem oscompartimentos lisossômicos destas células.
Exemplo 9
Humanização de anticorpos monoclonais murinos
Este exemplo demonstra a aplicabilidade do método de reparo deCDRs para humanização de anticorpos murinos 11D10 e 3A5 dirigidos contraTAT10772.
Foram utilizadas três formas de TAT10772 durante o processo dehumanização. O antígeno oculto TAT10772 humano, CA125, engloba oantígeno oculto completo e foi adquirido da US Biological C0050-10. A hasteTAT10772 consiste do último domínio de mucina mais C-terminal e aseqüência C-terminal a seguir gerando a região de transmembrana prevista(aminoácidos 6282 a 6979 de SEQ ID N° 2). TAT10772 de cinco domínios(aminoácidos 4471 a 5171 de SEQ ID N° 2) é parte recombinante do domínioextracelular que codifica cinco domínios de mucina mais a seqüência C-terminal que gera a região de transmembrana prevista. A haste MUC16 e odomínio de 5-mucina foram expressos em células CHO e purificados por meiosconvencionais.
Os números de resíduos são de acordo com Kabat (Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). São utilizadasabreviações de aminoácidos de uma letra. Degenerações de DNA sãorepresentadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B=C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
Clonagem de domínios variáveis 11D10 e 3A5 murinos egeração de anticorpos 11D10 e 3A5 quiméricos
RNA total foi extraído de células de hibridoma produtoras de11D10 ou 3A5 utilizando métodos padrão. Os domínios leve variável (VL) epesado variável (VH) foram amplificados utilizando RT PCR com primersdegenerados para as cadeias leve e pesada. Os primers frontais foramespecíficos para a seqüência de aminoácidos N-terminal das regiões VL e VH.Respectivamente, os primers reversos LC e HC foram projetados paracombinar-se a região no domínio leve constante (CL) e pesado constante 1(CH1), que são altamente conservados entre as espécies. VL e VHamplificados foram clonados em vetores de expressão de mamíferos. Aseqüência de polinucleotídeos dos insertos foi determinada utilizando métodosde seqüenciamento de rotina. As seqüências de aminoácidos VL (mu11D10-L)e VH (mu11D10-H) de 11D10 são exibidas nas Figuras 3 e 4, respectivamente(SEQ ID N° 4 e 7, respectivamente); as seqüências de aminoácidos VL(mu3A5-L) e VH (mu3A5-H) de 3A5 são exibidas nas Figuras 5 e 6,respectivamente (SEQ ID N° 9 e 11, respectivamente). As regiões de HVR deacordo com a numeração de Kabat são exibidas em negrito nas Figuras 3 a 6.
Região hipervariável direta enxerta-se à estrutura deconsenso humano receptora
O fagomídeo utilizado para este trabalho é vetor de exibição deFab-g3 monovalente e consiste de dois quadros de leitura abertos sob ocontrole do promotor phoA. O primeiro quadro de leitura aberta consiste daseqüência de sinal stll fundido aos domínios VL e CH1 da cadeia levereceptora e o segundo consiste da seqüência de sinal stll fundida aos domíniosVH e CH1 da cadeia pesada receptora seguida pela proteína de revestimentode fago menor P3.
Os domínios VL e VH dos anticorpos 11D10 e 3A5 murinos foramalinhados com as seqüências de consenso do subgrupo I capa VL humano(huKI; SEQ ID N° 3) e subgrupo III VH humano (hulll; SEQ ID N° 6). Paraelaborar os enxertos de HVR, regiões hipervariáveis dos anticorpos murinosforam enxertadas nas estruturas receptoras huKI e hulll. Para 3A5, foramtestadas duas estruturas de VH receptor (denominadas no presente 3A5.L e3A5.F, respectivamente), que diferem somente na posição de aminoácido 78(vide as Figuras 6A e B).
Regiões hipervariáveis de anticorpos 11D10 e 3A5 murinos foramelaboradas na estrutura de consenso humano receptora para gerar os enxertosde HVR diretos, enxerto de 11D10, enxerto de 3A5.L e enxerto de 3A5.F. Nodomínio VL, as regiões a seguir foram enxertadas no receptor de consensohumano: posições 24 a 34 (HVR-L1), 49 a 56 (HVR-L2) e 89 a 97 (HVR-L3). Nodomínio VH, as posições 26 a 35A (HVR-H1), 49 a 65 (HVR-H2) e 93 a 102(HVR-H3) foram enxertadas (Figuras 3 a 6). MacCalIum et al (MacCalIum et al,J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) analisaram estruturas de cristal de complexode antígeno e anticorpo e encontraram a posição 49 da cadeia leve e asposições 49, 93 e 94 da cadeia pesada são parte da região de contato deantígeno e, desta forma, parece razoável incluir estas posições nas definiçõesde HVR-L2, HVR-H2 e HVR-H3 ao humanizar anticorpos.
As variantes de enxerto direto foram geradas por meio demutagênese de Kunkel, utilizando oligonucleotídeo separado para cada regiãohipervariável. Os clones corretos foram determinados por meio deseqüenciamento de DNA.
Aleatorização das regiões hipervariáveis
Para cada anticorpo enxertado, diversidade de seqüências foiintroduzida separadamente em cada região hipervariável utilizando estratégiade aleatorização mole (bibliotecas SR) que mantém orientação em direção àseqüência de região hipervariável murina. Isso foi obtido utilizando estratégiade síntese de oligonucleotídeos envenenados descrita em primeiro lugar porGallop et al, J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994). Para dada posição emregião hipervariável a sofrer mutação, o códon que codifica o aminoácido dotipo selvagem é envenenado com mistura 70-10-10-10 de nucleotídeos,resultando em taxa de mutação média de 50% em cada posição.
Oligonucleotídeos aleatorizados moles podem ser padronizadosapós as seqüências de região hipervariável murina e englobaram as mesmasregiões definidas pelos enxertos de região hipervariável direta. A posição deaminoácido no início de H2 (posição 49) no domínio VH teve a diversidade deseqüências limitada a A, G, S ou T, utilizando o códon RGC.
Além das bibliotecas de aleatorização moles descritas acima, cadaposição em cada região hipervariável de enxerto de 3A5.L e enxerto de 3A5.F foitotalmente aleatorizada em todos os vinte aminoácidos possíveis utilizandooligonucleotídeos que codificam NNS. Isso foi conseguido em dois tipos debibliotecas. No primeiro, foram elaboradas diversas bibliotecas, cada qualconsistindo de vinte membros que possuem uma única posição localizada em umadas regiões hipervariáveis de 3A5 totalmente aleatorizadas. Para cobrir cadaposição nas regiões hipervariáveis, 63 bibliotecas deste tipo foram geradas ecombinadas em uma "biblioteca de posição única" (biblioteca SP) reunida queengloba mutações isoladas localizadas ao longo de cada posição hipervariável. Asegunda biblioteca introduziu todos os vinte aminoácidos em todas as posições(biblioteca FR) em uma única região hipervariável ao mesmo tempo. Para estesdois tipos de bibliotecas, havia seis bibliotecas, cada qual englobando uma regiãohipervariável separada do enxerto de 3A5.L ou enxerto de 3A5.F.
Para evitar a nova seleção da seqüência enxertada de CDR dotipo selvagem, introduziu-se códon de parada (TAA) no meio de cada HVR pormeio de mutagênese de Kunkel, resultando em seis modelos difernetes paracada enxerto (enxerto de 11D10, enxerto de 3A5.L e enxerto de 3A5.F), cadaqual com códon de parada introduzido em HVR diferente. Ao gerar asbibliotecas SR, FR e SP, oligonucleotídeos aleatorizados foram utilizados paraintroduzir diversidade, bem como para reparar o códon de parada no modelocorrespondente. Para bibliotecas 3A5, utilizou-se mistura de modelos 3A5.L e3A5.F durante a construção de cada biblioteca. Todos os três tipos debibliotecas foram gerados para humanização de 3A5, enquanto somente abiblioteca SR foi gerada para humanização de 11D10.
Geração de bibliotecas de fagos
Conjuntos de oligonucleotídeos aleatorizados projetados paracada região hipervariável conforme descrito acima foram fosforiladosseparadamente em reações de 20 \i\ contendo 660 ng de oligonucleotídeo, 50mM de Tris pH 7,5, 10 mM de MgCI2, 1 mM de ATP, 20 mM de DTT e 5 U depolinucleotídeo quinase por uma hora a 37 °C.
Para gerar as bibliotecas SR e FR, cada conjunto deoligonucleotídeo fosforilado dirigido para introduzir diversidade em uma únicaHVR foi combinado com 20 ^g de modelo Kunkel que contém o códon deparada correspondente. A reação foi realizada em 50 mM de Tris pH 7,5, 10mM de MgCI2 em volume final de 500 resultando em razão entreoligonucleotídeo e modelo de 3. A mistura foi combinada a 90 °C por quatrominutos, 50 °C por cinco minutos e resfriada sobre gelo em seguida. O modelocombinado (250 nl) foi preenchido em seguida por meio da adição de 1 uJ de100 mM ATP, 10 ^il de 25 mM dNTPs (25 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTPcada), 15 ^l de 100 mM DTT, 25 \i\ de 10X tampão TM (0,5 M Tris, pH 7,5, 0,1M MgCfe), 2400 U de T4 ligase e 30 U de T7 polimerase por três horas àtemperatura ambiente. O produto cheio foi limpo e eletroporado em seguida emcélulas SS320 e propagado na presença de fago auxiliar M13/K07 conformedescrito por Sidhu et al, Methods in Enzymology 328: 333-363 (2000). Ostamanhos das bibliotecas variaram de 1 a 2 x 109 clones independentes.Clones aleatórios das bibliotecas iniciais foram seqüenciados para determinar aqualidade da biblioteca.
Diversas (63) reações de mutagênese de Kunkel padrão foramrealizadas em placa de PCR de 96 cavidades para gerar as bibliotecas de 3A5SP. A partir das reações de oligonucleotídeos fosforilados (acima), adicionou-se 2 nl a 300 ng de modelo de Kunkel que contém o códon de paradacorrespondente em 50 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de MgCfe em volume final de10 nl. A mistura foi combinada a 90 °C por dois minutos, 50 °C por cincominutos e resfriada em seguida sobre gelo. O modelo combinado foipreenchido em seguida por meio da adição de 0,5 {il de 10 mM ATP, 0,5 de10 mM dNTPs (10 mM de d ATP, dCTP, dGTP e dTTP cada), 1 jil de 100 mMDTT, 1 nl de 10X tampão TM (0,5 M Tris, pH 7,5, 0,1 M MgCI2), 80 U de T4ligase e 4 U de T7 polimerase em volume total de 20 ^l por duas horas àtemperatura ambiente. Estes produtos preenchidos e ligados foramtransformados em células XL1-azuis, cultivados em 0,5 ml de 2YT que contém5 ug/ml de tetraciclina e fago auxiliar M13/K07 (MOI 10) por duas horas a 37°C, reunidos em seguida e transferidos para 500 ml de 2YT que contém 50pg/ml de carbenacilina e cultivados por dezesseis horas a 37 °C.Seleção de fagos
Para as seleções de fagos descritas abaixo, haste TAT10772 (2fxg/ml), CA125 (17 ^ig/ml), TAT10772 de cinco domínios (2 ug/ml) ou neutravidin (2ug/ml) foram imobilizados em PBS sobre placas de microtítulos MaxiSorp (Nunc)por uma noite a 4 °C. As placas foram bloqueadas por pelo menos uma horautilizando Bloqueador de Caseína (Pierce). Fago foi colhido do sobrenadante decultivo e suspenso em PBS contendo 1% BSA e 0,05% TWEEN® 20 (PBSBT).Após a seleção de fagos, conforme descrito abaixo, placas de microtítulos foramextensamente lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e fagounido foi eluído incubando-se as cavidades com 100 mM de HCI por trinta minutos.Fagos foram neutralizados com 1 M Tris, pH 8, e amplificados utilizando célulasXL1-Azuis e fago auxiliar M13/K07 e cultivados por uma noite a 37 °C em 2YT, 50ng/ml de carbenacilina. Os títulos de fagos eluídos de cavidade retentora alvo foramcomparados com títulos de fago recuperados de cavidade retentora não alvo paradeterminar o enriquecimento.
O método de ordenamento de soluções foi descrito (Fuh et al, J.Mol. Biol. (2004)) e permite a seleção de velocidades ligadas mais altas pormeio de controle de concentração alvo biotinilada e velocidades desligadasmais baixas resultantes de concorrência com alvo não marcado. HasteTAT10772 e TAT10772 com cinco domínios foram biotinilados utilizando Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce).
A haste TAT10772 foi utilizada como fago alvo para ahumanização de 11D10. A haste TAT10772 foi imobilizada diretamente sobreplacas de microtítulos MaxiSorp (Nunc) a 2 (ig/ml em PBS para a primeirarodada de seleção de fagos. Rodadas sucessivas de seleção utilizaram métodode seleção solúvel (Fuh et al, J. Mol. Biol. (2004)). Haste TAT10772 biotiniladafoi incubada em primeiro lugar com a biblioteca de fagos por uma hora, seguidapor captura por cinco minutos do fago unido sobre placa revestida comneutravidina. Adicionou-se excesso de haste TAT10772 não marcada (mais de100 nM) antes da etapa de captura para períodos de tempo crescentes paraaumentar a estringência de seleção. A tabela a seguir resume as condiçõesque foram utilizadas para combinação de solução das bibliotecas 11D10.
Rodada de Seleção [Haste TAT10772 biotinilada] Incubação com hasteTAT10772 em excesso
2 10 nM 20 min a 25 °C<table>table see original document page 274</column></row><table>
CA125 e TAT10772 com cinco domínios foram utilizados como alvos de fagospara humanização de 3A5. Bibliotecas foram ordenadas individualmente para aprimeira rodada de seleção contra TAT10772 com cinco domínios imobilizado(2 ng/ml em PBS) ou CA125 (17 ng/ml em PBS) que foi revestido sobre placasde microtítulos Nunc MaxiSorp. Após a amplificação, as bibliotecas foramreunidas de acordo com o seu tipo de biblioteca (FR/SR/SP) e se foramcombinadas contra CA125 ou TAT10772 com cinco domínios e ordenadas porduas rodadas adicionais contra os seus alvos imobilizados correspondentes.
Três rodadas sucessivas de seleção foram realizadas por meio de combinaçãocontínua contra os alvos imobilizados ou por meio de seleção contra TAT10772com cinco domínios biotinilado solúvel utilizando estratégia de ordenamento desolução (Fuh et al, J. Mol. Biol. (2004)). Para o método de ordenamento desolução, bibliotecas de fagos foram incubadas com 1 nM de TAT10772 comcinco domínios biotinilado por uma hora, seguido pela adição de TAT10772com cinco domínios não marcado em excesso (mais de 100 nM) por até 22horas para aumentar a estringência de seleção. Fago unido ao TAT10772 comcinco domínios biotinilado foi capturado rapidamente (cinco minutos), utilizandoplaca revestida com neutravidina.
ELISA de Fago de Haste TAT10772
Placas de microtítulos MaxiSorp foram revestidas com hasteTAT10772 a 2 jxg/ml em PBS por uma noite e, em seguida, bloqueadas comBloqueador de Caseína. Fago de sobrenadantes de cultivo foi incubado comhaste TAT10772 diluída em série em PBST contendo 1% BSA em placa demicrotítulos de cultivo de tecidos por uma hora, após o quê, 80 |il da misturaforam transferidos para as cavidades revestidas alvo por quinze minutos paracapturar fago não unido. A placa foi lavada com PBST e adicionou-se anti-M13conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 em PBSBT) porquarenta minutos. A placa foi lavada com PBST e desenvolvida por meio daadição de substrato Tetrametilbenzidina (Kirkegaard e Perry Laboratories,Gaithersburg MD). A absorção a 450 nm foi plotada em função daconcentração alvo em solução para determinar IC50. Este foi utilizado comoestimativa de afinidade para o clone de Fab exibido sobre a superfície do fago.
Determinação da Afinidade e Produção de Fab e IgG
Para expressar proteína de Fab para medições de afinidade,códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e g3 no vetor deexibição de fagos. Clones foram transformados em células 34B8 de E. coli ecultivadas em meios C. R. A. P. completos a 30 °C (Presta et al, Câncer Res.57: 4593-4599 (100997)). Células foram cultivadas por meio de centrifugação,suspensas em PBS, 100 (xM de PMSF, 100 nM de benzamidina, 2,5 mM deEDTA e rompidas abertas utilizando microfluidificador. Fab foi purificado comcromatografia de afinidade de Proteína G.
Determinações de afinidade foram realizadas por meio deressonância de plasma de superfície utilizando BlAcore TM-2000. Cerca de500 RU de TAT10772 com cinco domínios ou cerca de 300 RU de IgG foramimobilizados em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, sobre chip sensor CM5 ediluições por duas vezes em série do parceiro de união correspondente (1 a1000 nM) em PBST receberam injeção em velocidade de fluxo de 20 ^il/min.Cada amostra foi analisada com associação de cinco minutos e dissociação dedez minutos. Após cada injeção, o chip foi regenerado utilizando 10 mM deglicina, pH 1,5. A resposta de união foi corrigida subtraindo-se o RU de célulade fluxo padrão. Modelo Languir 1:1 de definição simultânea de kon e k0fr foiutilizado para análise cinética.
Humanização de 11D10A estrutura receptora humana utilizada para humanização de 11D10consiste no domínio VL capa I humano de consenso e variante do domínio VH deconsenso subgrupo III humano. Os domínios VL e VH de 11D10 murino foramalinhados com os domínios capa I e subgrupo III humanos; cada região dedeterminação de complementaridade (CDR) foi identificada e enxertada na estruturareceptora humana para gerar enxerto de HVR que poderá ser exibido na forma deFab sobre fago (Figs. 3 e 4). Ao testar-se fago que exibe o enxerto 11D10 HVR paradeterminar a união a CA125 imobilizado, observou-se união de fagos. Quando aseqüência de enxerto de 11D10 HVR foi expressa na forma de Fab, análise Biacoretambém demonstrou união a CA125.
Foi gerada bibilioteca de SR para 11D10, na qual cada HVR foialeatorizada mole individualmente. As seis bibliotecas SR foram combinadasseparadamente contra haste TAT10772 imobilizada por cinco rodadas deseleção. Observou-se o início do enriquecimento após a terceira rodada e, emseguida à quinta rodada, os clones foram tomados para análise de seqüênciasde DNA. Foram observadas alterações de seqüências dirigidas a cada uma dasHVRs. Clones foram selecionados utilizando ELISA anti-fago TAT10772.Clones selecionados foram expressos como Fab para análise adicional pormeio de Biacore. Vários clones foram reformatados como IgG para análise deScatchard. Análise de FACS utilizando células OVCAR-3 demonstrou quetodos os anticorpos humanizados 11D10 testados foram capazes de ordenarpor FACS efetivamente as mencionadas células. A partir destes resultados, ficaclaro que existem diversas alterações de seqüências que podem reparar aafinidade de 11D10 enxertado sobre estrutura humana e que este anticorpopode ser humanizado por meio de reparo de CDRs para gerar afinidades queatendem ou excedem a do anticorpo murino inicial.
Humanização de 3A5
Duas estruturas receptoras humanas, 3A5.L e 3A5.F, foram utilizadaspara humanização de 3A5 e são baseadas no domínio VL capa I humano deconsenso e no domínio VH de consenso subgrupo III humano. Os domínios VL eVH de 3A5 murino foram alinhados com os domínios capa I e subgrupo IIIhumanos; cada região de determinação de complementaridade (CDR) foiidentificada e enxertada na estrutura receptora humana para gerar enxerto de HVRque poderá ser exibido na forma de Fab sobre fago (Figs. 5 e 6). Ao testar-se fagoque exibe o enxerto 3A5 HVR para determinar a união a CA125 imobilizado,observou-se união de fagos. Quando expresso na forma de Fab, análise Biacoretambém demonstrou união a TAT10772 com cinco domínios.
Foram geradas bibliotecas de SR, FR e SP, nas quais introduziu-se diversidade separadamente em cada HVR do enxerto de 3A5 HVR. Asbibliotecas foram reunidas contra CA125 e TAT10772 com cinco domíniosutilizando estratégias de ordenamento de solução e de fase sólida. O métodode ordenamento de solução permite a seleção de clones com alta afinidade pormeio de manipulação da concentração alvo biotinilada e tempo de captura defagos enquanto a adição de alvo não marcado pode ser utilizado para eliminarclones com velocidades de desligamento mais altas (Fuh et al, J. Mol. Biol.340, 1073-1093 (2004)). Observou-se enriquecimento após a segunda rodadaem todas as bibliotecas. Análise de FACS utilizando células OVCAR-3demonstrou que todos os anticorpos humanizados 3A5 testados foram capazesde ordenar por FACS efetivamente as mencionadas células.
Após a quinta rodada, clones foram tomados para análise deseqüências de DNA de cada biblioteca e revelaram alterações de seqüênciasdirigidas a HVR-H3, o que sugere que o novo projeto desta CDR foi importantepara a restauração da união de antígenos.
Análise de seqüências de clones humanizados
Foram obtidas as seqüências de aminoácidos para todas asregiões de HVR de cadeia leve e de cadeia pesada de todos os cloneshumanizados. Para anticorpos 11D10 humanizados, as seqüências de HVRobtidas são exibidas nas Figuras 7 a 12. Para anticorpos 3A5 humanizados, asseqüências de HVR obtidas são exibidas nas Figuras 13 a 18. As Figuras 19 e20 exibem exemplos de seqüências de estrutura de consenso humanareceptoras para cadeias pesadas variáveis e leves variáveis,respectivamente. A presente invenção engloba anticorpos quecompreendem pelo menos uma das seqüências de estrutura de consensohumana receptora descritas em combinação com pelo menos uma dasseqüências de HVR descritas.
Análises de união para clones de anticorpo 3A5 humanizadosselecionados
Vários clones 3A5 humanizados foram selecionados paraexpressão como IgG e caracterizados para união a TAT10772 por meio deBiacore, ELISA de união competitiva e análises de união de célulasOVCAR-3. Resultados das análises ELISA padrão são exibidos na Tabela7 abaixo. Resultados das análises Biacore padrão que medem a união aodomínio 5' TAT10772 a anticorpos IgG variantes 3A5 imobilizados sãoexibidos na Tabela 8 abaixo. Observe-se que todos os anticorpos testadosforam IgG e continham a seqüência de cadeia leve variável exibida nopresente como SEQ ID N° 211. Concluiu-se que mutação para trás deS49Y em VL não apresenta efeito sobre a união e foi incorporada àsvariantes humanizadas finais, pois tirosina é mais comumente encontradanesta posição. A seqüência de cadeia pesada variável do anticorpo éindicada nas Tabelas 7 e 8. Conforme exibido nas Tabelas 7 e 8, váriosclones atenderam ou excederam a afinidade monomérica do anticorpoquimérico conforme resumido.
Tabela 7
<table>table see original document page 278</column></row><table><table>table see original document page 279</column></row><table>
Tabela 8
<table>table see original document page 279</column></row><table>
Vários anticorpos 3A5 humanizados também foram testados emELISA de união competitiva (que mede a união a TAT10772 com domínio 5' eCA125 imobilizados) e análises de união de células OVCAR-3, em que osresultados destas análises são exibidos nas Figuras 23 a 25. Conforme exibidonas Figuras 23 a 25, todos os anticorpos 3A5 humanizados testados sãocapazes de unir-se fortemente ao polipeptídeo alvo TAT10772 e competireficientemente pela união em locais antigênicos sobre aquele polipeptídeo alvo.
Remoção de potencial local de glicosilação em CDR-H2 devariantes 3A5 humanizadas
Para evitar potenciais questões de fabricação, local deglicosilação potencial em CDR-H2 das variantes de 3A5 humanizadas foieliminado utilizando métodos de seleção de fagos para identificar alterações deseqüências apropriadas. Separadamente, N52 e S54 foram ambos totalmentealeatorizadas utilizando o NNS de códon para permitir todas as substituiçõesde aminoácidos possíveis. Estas bibliotecas de fagos com vinte membrospequenas foram selecionadas para união a TAT10772 com domínio 5'. Emboraambos N52 e S54 fossem encontrados, outras substituições foramfreqüentemente observadas nas duas posições, em que as alterações N52S eS54A são as mais abundantes. Certos dados de análises Scatchard padrãosão exibidos na Tabela 9 abaixo, em que os anticorpos são expressos comoIgGs que possuem seqüência de cadeia leve variável exibida no presente comoSEQ ID N° 211 e a seqüência de cadeia pesada variável exibida na Tabela 9.
Quando qualquer das alterações descritas foi incorporada às varianteshumanizadas 3A5.v1 ou 3A5.v4 (vide SEQ ID N° 206 a 209), elas não afetarama afinidade de união para TAT10772.
Tabela 9
<table>table see original document page 280</column></row><table>
Exemplo 10
Preparação de Anticorpos Conjugados a Toxinas que Unem TAT10772
O uso de conjugados de droga e anticorpo (ADC), ou sejaimunoconjugados, para fornecimento local de agentes citotóxicos oucitostáticos, ou seja, drogas para matar ou inibir células tumorosas notratamento de câncer (Payne (2003), Câncer Cell 3: 207-212; Syrigos eEpenetos (2003), Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz eSpringer (1997), Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4.975.278) permite ofornecimento dirigido da porção de droga a tumores e seu acúmulo intracelular,em que a administração sistêmica desses agentes de drogas não conjugadospode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais, bemcomo para as células tumorosas que se busca eliminar (Baldwin et al (1986),Lancet, quinze de março de 1986), págs. 603-05; Thorpe (1985), AntibodyCarríers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review em MonoclonalAntibodies '84: Biológica! and Clinicai Applications, Pinchera et al (eds), págs.475-506). Busca-se por este intermédio eficácia máxima com toxicidademínima. Os esforços para projetar e refinar ADC concentraram-se naseletividade de anticorpos monoclonais (mAbs), bem como propriedades deligação a drogas e liberação de drogas. Tanto anticorpos policlonais quantoanticorpos monoclpnais foram relatados como sendo úteis nestas estratégias(Rowland et al (1986), Câncer Immunol. Immunother. 21: 183-87). As drogasutilizadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato evindesina (Rowland et al (1986), acima). As toxinas utilizadas em conjugadosde anticorpo e toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina de difteria,toxinas vegetais tais como rícino, toxinas de moléculas pequenas tais comogeldanamicina (Mandler et al (2000), J. of the Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002), Bioconjugate Chem. 13: 786-791),maitansinóides (EP 1391213; Liu et al (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93:8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al (1998), Câncer Res. 58: 2928; Hinmanet al (1993), Câncer Res. 53: 3336-3342).
Nos conjugados de anticorpo e droga (ADC) de acordo com apresente invenção, anticorpo (Ab) é conjugado a uma ou mais porções dedroga (D), tal como cerca de uma a cerca de vinte moléculas de droga poranticorpo, por meio de ligante (L). O ADC possui a fórmula:
<formula>formula see original document page 281</formula>
pode ser preparado por vários caminhos, empregando reações de químicaorgânica, condições e reagentes conhecidos dos técnicos no assunto, queincluem: (1) reação de grupo nucleofílico de anticorpo com reagente de ligantebivalente, para formar Ab-L, por meio de união covalente, seguida por reaçãocom porção de droga D; e (2) reação de grupo nucleofílico de porção de drogacom reagente ligante bivalente, para formar D-L, por meio de união covalente,seguida por reação com o grupo nucleofílico de anticorpo. Métodos adicionaisde preparação de ADC são descritos no presente.O ligante pode ser composto de um ou mais componentesligantes. Exemplos de componentes ligantes incluem 6-maleimidocaproíla("MC"), maleimidopropanoíla ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"),alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonila ("PAB"), 4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidila ("SPP"), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 carboxilato de N-succinimidla ("SMCC") e (4-iodo-acetil)aminobenzoato de N-succinimidila ("SIAB"). Componentes ligantes adicionaissão conhecidos na técnica e alguns são descritos no presente.
Em algumas realizações, o ligante pode compreender resíduos deaminoácidos. Exemplos de componentes ligantes de aminoácidos incluemdipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo ou pentapeptídeo. Exemplos dedipeptídeos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina-fenilalanina (af ouala-phe). Exemplos de tripeptídeos incluem: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) eglicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que compreendemcomponente ligante de aminoácido incluem os de ocorrência natural, bemcomo aminoácidos menores e análogos de aminoácidos não de ocorrêncianatural, tais como citrulina. Componentes ligantes de aminoácidos podem serprojetados e otimizados em sua seletividade para divisão enzimática porenzimas específicas, tais como protease associada a tumor, catepsina B, C e Dou protease de plasmina.
Os grupos nucleofílicos sobre anticorpos incluem, mas semlimitar-se a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral,tais como lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, tais como cisteína, e (iv)grupos amino ou hidroxil açúcar em que o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol,hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato dehidrazina e grupos aril hidrazida são nucleofílicos e capazes de reagir paraformar uniões covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções ligantes ereagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS,ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzilatais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.Certos anticorpos possuem dissulfetos intercadeias redutíveis, ou seja, pontesde cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação comreagentes ligantes por meio de tratamento com agente redutor tal como DTT(ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará, portanto, teoricamente, doisnucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem serintroduzidos em anticorpos por meio da reação de lisinas com 2-iminotiolano(reagente de Traut), o que resulta em conversão de amina em tiol. Grupos tiolreativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou seu fragmento) por meio daintrodução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (tal comopreparando anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos deaminoácidos de cisteína não nativos).
Os conjugados de drogas e anticorpos de acordo com a presenteinvenção podem também ser produzidos por meio de modificação do anticorpopara introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintesnucleofílicos sobre o reagente ligante ou droga. Os açúcares de anticorposglicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantes deperiodato, para formar grupos cetona ou aldeído que podem reagir com o grupoamina de reagentes ligantes ou porções de drogas. Os grupos base Schiffimina resultantes podem formar ligação estável ou podem ser reduzidos, porexemplo, por reagentes de boroidreto para formar ligações de amina estáveis.Em uma realização, a reação da porção carboidrato de anticorpo glicosiladocom galactose oxidase ou metaperiodato de sódio pode gerar grupos carbonila(aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos apropriados sobrea droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, asproteínas que contêm resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagircom metaperiodato de sódio, resultando na produção de aldeído no lugar doprimeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5.362.852). Esse aldeído pode ser reagido com porção de droga ounucleófilo ligante.
Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão quecompreende o anticorpo e agente citotoxico, por exemplo, por meio de técnicasrecombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA podecompreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes do conjugado,sejam elas adjacentes entre si ou separadas por região codificadora de peptídeo deligação que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a"receptor" (tal como estreptavidina) para uso em direcionamento prévio detumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado aopaciente, seguido pela remoção de conjugado desunido da circulação,utilizando agente limpante e, em seguida, administração de "ligante" (tal comoavidina) que é conjugado a agente citotoxico (tal como radionucleotídeo).
Métodos específicos de produção de conjugados de anticorpo edroga ligando toxinas a anticorpos purificados são bem conhecidos eempregados rotineiramente na técnica. Conjugação de anticorpo monoclonalpurificado à toxina DM1, por exemplo, pode ser obtida conforme segue.
Anticorpo purificado é derivado com 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidila para introduzir grupos ditiopiridila. Anticorpo (376,0 mg, 8 mg/ml)em 44,7 ml de 50 mM de tampão fosfato de potássio (pH 6,5) contendo NaCI(50 mM) e EDTA (1 mM) é tratado com SPP (5,3 equivalentes molares em 2,3ml de etanol). Após incubação por noventa minutos sob argônio à temperaturaambiente, a mistura de reação é filtrada em gel através de coluna SephadexG25 equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI e 2 mM deEDTA. Frações contendo anticorpos foram reunidas e testadas em seguida.Anticorpo-SPP-Py (337,0 mg com grupos 2-tiopiridina liberáveis) é diluído como tampão de 35 mM de citrato de sódio acima, pH 6,5, até concentração finalde 2,5 mg/ml. DM1 (1,7 equivalentes, 16,1 mol) em 3,0 mM dedimetilacetamida (DMA, 3% v/v na mistura final de reação) é adicionado emseguida à solução de anticorpo. A reação é mantida em processamento àtemperatura ambiente sob argônio por vinte horas. A reação é carregada sobrecoluna de filtragem de gel Sephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77 I)equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI, pH 6,5. Avelocidade de fluxo é de 5,0 ml/min e são recolhidas 65 frações (20,0 ml cada).As frações são reunidas e testadas, em que o número de moléculas de drogaDM1 ligadas por molécula de anticorpo (p') é determinado por meio de mediçãoda absorção a 252 nm e 280 nm.
Para fins ilustrativos, conjugação de anticorpo monoclonalpurificado à toxina DM1 pode também ser obtida conforme segue. Anticorpopurificado é derivado com 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato desuccinimidila (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc.) para introduzir o liganteSMCC. O anticorpo é tratado a 20 mg/ml em 50 mM fosfato de potássio/50 mMcloreto de sódio/2 mM EDTA, pH 6,5 com 7,5 equivalentes molares de SMCC(20 mM em DMSO, 6,7 mg/ml). Após agitação por duas horas sob argônio àtemperatura ambiente, a mistura de reação é filtrada através de colunaSephadex G25 equilibrada com 50 mM de fosfato de potássio/50 mM de cloretode sódio/2 mM de EDTA, pH 6,5. Frações que contêm anticorpos são reunidase testadas. An ticorpo-SMCC é diluído em seguida com 50 mM fosfato depotássio/50 mM cloreto de sódio/2 mM EDTA, pH 6,5, até concentração final de10 mg/ml, e reagido com 10 mM solução de DM1 (1,7 equivalentes,considerando 5 SMCC/anticorpo, 7,37 mg/ml) em dimetilacetamida. A reação éagitada à temperatura ambiente sob argônio por 16,5 horas. A mistura dereação de conjugação é filtrada em seguida através de coluna de filtragem degel Sephadex G25 (1,5 x 4,9 cm) com 1 x PBS sob pH 6,5. A razão entre DM1e anticorpo (p) é medida em seguida pela absorção a 252 nm e 280 nm.
Além disso, cisteína livre sobre anticorpo selecionado pode sermodificada pelo reagente de bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical),deixando grupo maleimido não reagido sobre a superfície do anticorpo. Issopode ser conseguido por meio de dissolução de BM(PEO)4 em mistura de 50%etanol/água até concentração de 10 mM e adição de excesso molar de dezvezes a uma solução que contém o anticorpo em solução salina tamponadacom fosfato sob concentração de cerca de 1,6 mg/ml (10 micromolar),mantendo-a em reação por uma hora. BM(PEO)4 em excesso é removido pormeio de filtragem com gel em 30 mM de citrato, pH 6 com 150 mM de tampãoNaCI. Excesso molar de cerca de dez vezes DM1 é dissolvido em dimetilacetamida (DMA) e adicionado ao intermediário de anticorpo-BMPEO.Dimetilformamida (DMF) pode também ser empregada para dissolver oreagente de porção de droga. A mistura de reação é mantida em reação poruma noite antes da filtragem de gel ou diálise em PBS para remover droga nãoreagida. Filtragem de gel sobre colunas S200 em PBS é utilizada para removeragregados com alto peso molecular e fornecer conjugado de anticorpo-BMPEO-DM1 purificado.
Drogas citotóxicas foram tipicamente conjugadas a anticorpos pormeio dos freqüentemente numerosos resíduos de lisina do anticorpo.Conjugação através de grupos tiol presentes ou elaborados no anticorpo deinteresse também foi realizada. Resíduos de cisteína, por exemplo, foramintroduzidos em proteínas por meio de métodos de elaboração genética paraformar locais de ligação covalentes para ligantes (Better et al (1994), J. Biol.Chem. 13: 9644-9650; Bernhard et al (1994), Bioconjugate Chem. 5: 126-132;Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1: 247-255; Tu et al (1999),Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 96:4862-4867; Kanno et al (2000), J. ofBiotechnology, 76: 207-214; Chmura et al (2001), Proc. Nat. Acad. Sei. U. S. A.98 (15): 8480-8484; Patente Norte-Americana n° 6.248.564). Desde que existaresíduo de cisteína livre no anticorpo de interesse, toxinas podem ser ligadasàquele local. Os reagentes ligantes de drogas, tais como maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), ou seja, MC-MMAE,maleimidocaproil-monometil auristatina F (MMAF), ou seja MC-MMAF,MC-val-cit-PAB-MMAE ou MC-val-cit-PAB-MMAF, dissolvidos em DMSO, sãodiluídos em acetonitrila e água em concentração conhecida e adicionados aanticorpo derivado de cisteína resfriado em solução salina tamponada comfosfato (PBS). Após cerca de uma hora, maleimida em excesso é adicionadapara resfriar a reação e tampar quaisquer grupos tiol de anticorpos nãoreagidos. A mistura de reação é concentrada por meio de ultrafiltragemcentrífuga e o anticorpo conjugado a toxina é purificado, dessalinizado por meiode eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 msob condições estéreis e congelado para armazenagem.
Além disso, anticorpos anti-TAT de acordo com a presenteinvenção podem ser conjugados a toxinas auristatina e dolostatina (tais comoMMAE e MMAF) utilizando o método a seguir. Anticorpo, dissolvido em 500mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio sob pH 8,0, é tratadocom 100 mM de ditiotreitol (DTT) em excesso. Após incubação a 37 °C porcerca de trinta minutos, o tampão é substituído por meio de eluição sobreresina Sephadex G25 e eluído com PBS com 1 mM de DTPA. O valor detiol/Ab é verificado por meio de determinação da concentração de anticorposreduzida da absorção a 280 nm da solução e da concentração de tiol por meiode reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee Wl) e determinação da absorção a412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é resfriado sobre gelo.
O reagente ligante de droga (1) maleimidocaproil-monometilauristatina E (MMAE), ou seja, MC-MMAE, (2) MC-MMAF, (3) MC-val-cit-PAB-MMAE ou (4) MC-val-cit-PAB-MMAF dissolvido em DMSO é diluído emacetonitrila e água sob concentração conhecida e adicionado ao anticorporeduzido resfriado em PBS. Após cerca de uma hora, maleimida em excesso éadicionada para resfriar a reação e tampar quaisquer grupos tiol de anticorposnão reagidos. A mistura de reação é concentrada por meio de ultrafiltragemcentrífuga e o anticorpo conjugado a toxina é purificado, dessalinizado por meiode eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 msob condições estéreis e congelado para armazenagem.
Exemplo 11
Teste de Morte de Células Tumorosas In Vitro
Células de mamíferos que expressam o polipeptídeo TAT deinteresse podem ser obtidas utilizando métodos de clonagem e vetor deexpressão padrão. Alternativamente, muitas linhagens de células de tumoresque expressam polipeptídeos TAT de intersse são disponíveis ao público, porexemplo, por meio da ATCC e podem ser identificadas rotineiramenteutilizando análise ELISA ou FACS padrão. Anticorpos monoclonais anti-polipeptídeo TAT (e seus derivados conjugados de toxina) podem serempregados em seguida em testes para determinar a capacidade do anticorpode matar células que expressam polipeptídeo TAT in vitro.
Células que expressam o polipeptídeo TAT de interesse, porexemplo, são obtidas conforme descrito acima e colocadas em placas com 96cavidades. Em uma análise, o conjugado de anticorpo e toxina (ou anticorpobruto) é incluído ao longo de toda a incubação celular por período de quatrodias. Em segunda análise independente, as células são incubadas por umahora com o conjugado de anticorpo e toxina (ou anticorpo bruto) e lavadas eincubadas em seguida na ausência de conjugado de anticorpo e toxina porperíodo de quatro dias. A viabilidade celular é medida em seguida utilizando oTeste de Viabilidade de Células Luminescentes CelITiter-GIo da Promega (Cat.N° G7571). Células não tratadas servem de controle negativo.Em primeiro experimento e com relação específica à presenteinvenção, várias concentrações de conjugados de MMAF e MMAE dosanticorpos 3A5 quiméricos e 11D10 quiméricos foram testadas para determinara capacidade de matar (1) a linhagem de células que expressam polipeptídeoTAT10772 OVCAR-3, (2) linhagem de células derivadas de PC3 elaboradaspara expressar de forma estável o polipeptídeo TAT10772 sobre a suasuperfície celular (PC3/A5.3B2) e (3) linhagem de células PC3 que nãoexpressa polipeptídeo TAT10772 (PC3/neo). Os anticorpos 3A5 quiméricosempregados nestas análises continham a seqüência de aminoácidos de cadeialeve variável exibida no presente como SEQ ID N° 211 e a seqüência deaminoácidos de cadeia pesada variável exibida no presente como SEQ ID N°11. Os anticorpos 11D10 quiméricos empregados nestas análises continham aseqüência de aminoácidos de cadeia leve variável exibida no presente comoSEQ ID N° 4 e a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada variável exibidano presente como SEQ ID N° 7. Resultados destes experimentos são exibidosnas Figuras 26 a 31 e demonstraram que cada um dos anticorpos conjugadosa toxinas causou níveis significativos de morte celular nas células OVCAR-3 ePC3/A5.3B2 (ou seja, células que expressam polipeptídeo TAT10772 sobre asuperfície celular), em que nenhuma morte celular significativa foi observadapara nenhum dos anticorpos nas células PC3/neo (que não expressampolipeptídeo TAT10772 sobre a superfície celular). Estes dados demonstramque os anticorpos testados são capazes de unir-se ao polipeptídeo TAT10772sobre a superfície de células que expressam aquele polipeptídeo e causam amorte destas células in vitro.
Exemplo 12
Teste de Morte de Células Tumorosas In VivoModelo de tumor intraperitoneal
Para testar a eficácia dos anticorpos anti-polipeptídeo TAT1077211D10 e 3A5 quiméricos in vivo, 2 x 107 células OVCAR-3/luc por 110camundongos SCI D foram injetadas na cavidade peritoneal e mantidas emcrescimento por vinte dias após a injeção. No vigésimo dia após a injeção, oscamundongos foram segregados em nove grupos diferentes de nove a dezcamundongos por grupo e o volume do tumor foi determinado em cadacamundongo. Nos dias 23, 30, 37 e 44 após a injeção, os camundongos foramtratados conforme segue:
Grupo A - veículo isolado
Grupo B - 2,5 mg/kg de 11D10-MC-vc-PAB-MMAE quimérico
Grupo C - 2,5 mg/kg de 11D10-MC-vc-PAB-MMAF quimérico
Grupo D - 2,5 mg/kg de 11D10-MC-MMAF quiméricoGrupo E - 2,5 mg/kg de 3A5-MC-vc-PAB-MMAE quiméricoGrupo F - 2,5 mg/kg de 3A5-MC-vc-PAB-MMAF quiméricoGrupo G - 2,5 mg/kg de 3A5-MC-MMAF quiméricoGrupo H - 2,5 mg/kg de anti-MC-vc-PAB-MMAE-erva de santiago
Grupo I - 2,5 mg/kg de anti-MC-vc-PAB-MMAF-erva de santiago
O volume do tumor foi medido em cada camundongo nos dias 27,34, 41, 48, 55 e 69 após a injeção para determinar a eficácia de cadatratamento na redução do volume do tumor. Além disso, o percentual desobrevivência dos animais foi determinado diariamente ao longo de 250 diasapós o tratamento.
Os resultados destas análises in vivo demonstraram quecamundongos que foram tratados somente com veículo (Grupo A) ou com oanticorpo anti-erva de santiago não específico de TAT10772 (Grupos Hei) nãoexibiram redução observável no volume do tumor após o tratamento. De fato,os tumores nestes animais simplesmente continuam a aumentar de tamanhoao longo do tempo. Estes resultados demonstram que anticorpos que sãoincapazes de unir-se a polipeptídeo TAT10772, mesmo se conjugados a toxina,não fornecem efeito terapêutico específico (ou mesmo não específico). Poroutro lado, a maior parte dos animais nos Grupos B a G evidenciou reduçãosignificativa e reproduzível após o tratamento do volume de tumor, o quedemonstra que 11D10 e 3A5 quiméricos fornecem efeito terapêutico in vivoespecífico. De fato, vários dos animais nos Grupos B a G evidenciaramcompleta necrose tumorosa. Estes dados demonstram claramente que os doisanticorpos quiméricos 11D10 e 3A5 fornecem efeito terapêutico in vivosignificativo e reproduzível para o tratamento de tumores que expressam opolipeptídeo TAT10772.
Com relação ao percentual de sobrevivência, todos os animais nosGrupos A, H e I pereceram no dia 125 após o implante. No mesmo momento,entretanto, 90% dos animais no Grupo B, 80% dos animais nos Grupos E e F e55% dos animais nos Grupos C, D e G permaneceram vivos, o que evidencia queos dois anticorpos quiméricos 11D10 e 3A5 fornecem efeito terapêutico in vivoespecífico, significativo e reproduzível para o tratamento de tumores que expressamo polipeptídeo TAT10772. Resultados de modelo de risco proporcional Cox padrãosão exibidos na Tabela 10 abaixo, em que foi determinada razão de risco separada(HR) para cada um dos oito subgrupos não veículos (o Grupo A somente de veículorecebeu arbitrariamente razão de risco de 1,0).
Tabela 10
<table>table see original document page 291</column></row><table>
Modelo de injeção subcutânea, modelo de transporte dealmofadas de gordura de mamíferos e modelos de transplante dexenoenxertos
Os resultados de experimentos in vivo adicionais que medem aeficácia terapêutica de anticorpos quiméricos 3A5 são exibidos nas Figuras 32a 37. Mais especificamente, anticorpos 3A5 quiméricos conjugados a toxinaforam testados para determinar a sua capacidade de reduzir o tamanho dotumor in vivo em uma série de diferentes formatos in vivo que incluem aformação de tumores por meio de injeção subcutânea de células PC3/C5.3B2seguida por vários tratamentos com anticorpos (Figura 32), transplante decélulas OVCAR-3 na almofada de gordura mamaria de camundongos begeSCID seguido por vários tratamentos com anticorpos (Figuras 33 a 35 e 37) etransplante de xenoenxertos de dez milhões de células PC3/A5.3B2 porcamundongo bruto, seguido por vários tratamentos com anticorpos (Figura 36).
Os resultados destes experimentos demonstram que os vários anticorpos anti-TAT10772 testados são eficazes no tratamento terapêutico de tumores queexpressam TAT10772 in vivo.
Exemplo 13
Uso de TAT como Sonda de Hibridizaçào
O método a seguir descreve o uso de seqüência de nucleotídeosque codifica TAT como sonda de hibridização, por exemplo, para o diagnósticoda presença de tumor em mamífero.
DNA que compreende a seqüência de codificação de TAT maduroou de comprimento total conforme descrito no presente pode também serempregado como sonda para a seleção de DNAs homólogos (tais como oscodificadores de variantes de TAT de ocorrência natural) em bibliotecas decDNA de tecido humano ou bibliotecas genômicas de tecido humano.
A hibridização e lavagem de filtros que contêm DNAs de qualquerbiblioteca é realizada sob as condições de alta estringência a seguir. Ahibridização de sondas derivadas de TAT rádio-marcadas para os filtros érealizada em solução de 50% formamida, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,1% pirofosfatode sódio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, 2x solução de Denhardt e 10%sulfato de dextran a 42 °C por vinte horas. A lavagem dos filtros é realizada emsolução aquosa de 0,1 x SSC e 0,1% SDS a 42 °C.
DNAs que possuem identidade de seqüências desejada com oDNA que codifica TAT de seqüência nativa de comprimento total podem seridentificados em seguida utilizando métodos padrão conhecidos na técnica.
Exemplo 14
Expressão de TAT em E. coli
Este exemplo ilustra a preparação de forma não glicosilada deTAT por meio de expressão recombinante em E. coli.
A seqüência de DNA que codifica TAT é inicialmente amplificadautilizando primers de PCR selecionados. Os primers deverão conter locais deenzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas de restriçãosobre o vetor de expressão selecionado. Pode -se empregar uma série devetores de expressão. Exemplo de vetor apropriado é pBR322 (derivado de E.coli; vide Bolívar et al, Gene, 2: 95 (1977)), que contém genes para resistênciaà ampicilina e tetraciclina. O vetor é digerido com enzima de restrição edesfosforilado. As seqüências amplificadas por PCR são ligadas em seguida aovetor. O vetor incluirá preferencialmente seqüências que codificam gene deresistência a antibióticos, promotor trp, líder póli-his (que inclui os seisprimeiros códons STH, seqüência póli-his e local de divisão de enteroquinase),a região de codificação de TAT, terminal de transcrição lambda e gene argU.
A mistura de ligação é utilizada em seguida para transformarlinhagem de E. coli selecionada utilizando os métodos descritos em Sambrooket al, acima. Transformadores são identificados pela sua capacidade decrescimento sobre placas LB e são selecionadas em seguida colôniasresistentes a antibióticos. DNA de plasmídeo pode ser isolado e confirmado pormeio de análise de restrição e seqüenciamento de DNA.
Clones selecionados podem ser cultivados por uma noite em meiode cultivo líquido tal como caldo LB suplementado com antibióticos. O cultivopor uma noite pode ser utilizado em seguida para inocular cultura em maiorescala. As células são cultivadas em seguida até densidade ótica desejada,durante o quê é ligado o promotor de expressão.
Após o cultivo das células por mais várias horas, as células podemser colhidas por meio de centrifugação. A pelota celular obtida por meio dacentrifugação pode ser solubilizada utilizando vários agentes conhecidos na técnicae a proteína TAT solubilizada pode ser purificada em seguida utilizando colunaquelante metálica sob condições que permitam a firme união da proteína.
TAT pode ser expresso em E. coli em forma marcada por poli-His,utilizando o procedimento a seguir. O DNA que codifica TAT é inicialmenteamplificado utilizando primers de PCR selecionados. Os primers conterãolocais de enzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas derestrição sobre o vetor de expressão selecionado e outras seqüências úteis quefornecem início de tradução confiável e eficiente, rápida purificação sobrecoluna de quelação metálica e remoção proteolítica com enteroquinase. Asseqüências marcadas com poli-His e amplificadas por PCR são ligadas emseguida a vetor de expressão, que é utilizado para transformar hospedeiro E.coli com base na linhagem 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts)dpP (laclq). Os transformadores são cultivados em primeiro lugar em LBcontendo 50 mg/ml de carbenicilina a 30 °C com agitação até atingir-se OD 600de 3 a 5. Os cultivos são diluídos em seguida por cinqüenta a cem vezes emmeios CRAP (preparados por meio de mistura de 3,57 g de (NH^SO^ 0,71 gde citrato de sódio-2H20, 1,07 g de KCI, 5,36 g de extrato de levedura Difco,5,36 g de hicase Sheffield SF em 500 ml de água, bem como 110 mM deMPOS, pH 7,3, 0,55% (p/v) glicose e 7 mM de MgS04) e cultivados por cercade vinte a trinta horas a 30 °C com agitação. Amostras são removidas paraverificar a expressão por meio de análise de SDS-PAGE e o cultivo a granel écentrifugado para peletizar as células. As pelotas celulares são congeladas atépurificação e redobra.
Pasta de E. coli de 0,5 a 1 I de fermentações (pelotas de 6 a 10 g)é novamente suspensa em dez volumes (p/v) em 7 M de guanidina, 20 mM de Tris,tampão a pH 8. Adiciona-se sulfite de sódio sólido e tetrationato de sódio parafabricar concentrações finais de 0,1 Me 0,02 M, respectivamente, e a solução éagitada por uma noite a 4 °C. Esta etapa resulta em proteína desnaturada comtodos os resíduos de cisteína bloqueados por meio de sulfitolização. A solução écentrifugada a 40.000 rpm em Ultracentrifugador Beckman por trinta minutos. Osobrenadante é diluído com três a cinco volumes de tampão de coluna de quelatometálico (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) e filtrado através de filtros de0,22 mícron para clarificação. O extrato clarificado é carregado sobre coluna de 5 mlde quelato metálico Qiagen Ni-NTA equilibrada no tampão de coluna de quelatometálico. A coluna é lavada com tampão adicional contendo 50 mM de imidazol(Calbiochem, grau Ultrol), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo 250mM de imidazol. Frações que contêm a proteína desejada são reunidas earmazenadas a 4 °C. Estimou-se a concentração de proteína por meio da suaabsorção a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na suaseqüência de aminoácidos.
As proteínas são redobradas por meio de lenta diluição daamostra em tampão de redobra recém preparado, que consiste de: 20 mM deTris, pH 8,6, 0,3 M de NaCI, 2,5 M de uréia, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicinae 1 mM de EDTA. Os volumes de redobra são selecionados de forma que aconcentração final de proteína seja de 50 a 100 microgramas/ml. A solução deredobra é suavemente agitada a 4 °C por 12 a 36 horas. A reação de redobra éresfriada por meio da adição de TFA até concentração final de 0,4% (pH decerca de 3). Antes da purificação adicional da proteína, a solução é filtradaatravés de filtro de 0,22 mícron e acetonitrila é adicionada até concentraçãofinal de 2 a 10%. A proteína redobrada é cromatografada sobre coluna de fasereversa Poros R1/H, utilizando tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição comgrau de acetonitrila de 10 a 80%. Parcelas de frações com absorção de A280são analisadas sobre géis de SDS poliacrilamida e são reunidas fraçõescontendo proteína redobrada homogênea. Geralmente, as espéciesadequadamente redobradas da maior parte das proteínas são eluídas sobconcentrações mais baixas de acetonitrila, pois essas espécies são as maiscompactas com seus interiores hidrofóbicos protegidos da interação com aresina de fase reversa. As espécies agregadas são normalmente eluídas sobconcentrações mais altas de acetonitrila. Além da resolução de formas maldobradas de proteínas a partir da forma desejada, a etapa de fase reversatambém remove endotoxina das amostras.
Frações que contêm o polipeptídeo TAT dobrado desejado sãoreunidas e a acetonitrila é removida utilizando suave fluxo de nitrogênio dirigidoà solução. As proteínas são formuladas em 20 mM de Hepes, pH 6,8 com 0,14M de cloreto de sódio e manitol a 4% por meio de diálise ou de filtragem degéis, utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão deformulação e filtradas estéreis.
Certos polipeptídeos TAT descritos no presente foram expressose purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 15
Expressão de TAT em Células de Mamíferos
Este exemplo ilustra a preparação de forma potencialmenteglicosilada de TAT por meio de expressão recombinante em células de mamíferos.
O vetor, pRK5 (vide EP 307.247, publicada em quinze de marçode 1989), é empregado como vetor de expressão. Opcionalmente, o DNA deTAT é ligado a pRK5 com enzimas de restrição selecionadas para permitir ainserção do DNA de TAT utilizando métodos de ligação tais como os descritosem Sambrook et al, acima. O vetor resultante é denominado pRK5-TAT.
Em uma realização, as células hospedeiras selecionadas podemser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são cultivadas até aconfluência em placas de cultivo de tecidos em meio tal como DMEMsuplementado com soro de feto de bezerro e, opcionalmente, comonentesnutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 \ig de DNA de pRK5-TAT sãomisturados com cerca de 1 de DNA que codifica o gene VA RNA(Thimmappaya et al, Cell, 31, 543 (1982)) e dissolvidos em 500 ul de 1 mM deTris-HCI, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCI2. A esta mistura adiciona-se, emgotas, 500 ^l de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCI, 1,5 mM deNaP04 e permite-se a formação de precipitado por dez minutos a 25 °C. Oprecipitado é suspenso e adicionado às células 293 e mantido em deposiçãopor cerca de quatro horas a 37 °C. O meio de cultivo é retirado por meio deaspiração e são adicionados 2 ml de glicerol a 20% em PBS por trintasegundos. As células 293 são lavadas em seguida com meio livre de soro,adiciona-se meio novo e as células são incubadas por cerca de cinco dias.
Cerca de 24 horas após as transfecções, o meio de cultivo éremovido e substituído com meio de cultivo (isolado) ou meio de cultivo quecontém 200 jaCi/ml de 35S-cisteína e 200 ^iCi/ml de 35S-metionina. Apósincubação por doze horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado sobrefiltro de centrifugação e carregado sobre gel de SDS a 15%. O gel processadopode ser seco e exposto a filme por período de tempo selecionado para revelara presença de polipeptídeo TAT. Os cultivos que contêm células transfectadaspodem sofrer incubação adicional (em meio livre de soro) e o meio é testadoem biotestes selecionados.
Em método alternativo, TAT pode ser introduzido em células 293transitoriamente utilizando o método de sulfato de dextran descrito por Somparyracet al, Proc. Natl. Acad. Sei., 12: 7275 (1981). Células 293 são cultivadas atédensidade máxima em frasco centrifugador e adiciona-se 700 ^g de pRK5-TATDNA. As células são concentradas em primeiro lugar a partir do frasco centrifugadorpor meio de centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de DNA e dextran éincubado sobre a pelota celular por quatro horas. As células são tratadas comglicerol a 20%, por noventa segundos, lavadas com meio de cultivo de tecidos ereintroduzidas no frasco centrifugador que contém meio de cultivo de tecidos, 5ng/ml de insulina bovina e 0,1 jag/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatrodias, os meios condicionados são centrifugados e filtrados para remover células efragmentos. A amostra que contém TAT expresso pode ser concentrada epurificada em seguida por meio de qualquer método selecionado, tal como diálisee/ou cromatografia de coluna.
Em outra realização, TAT pode ser expresso em células CHO. OpRK5-TAT pode ser transfectado em células CHO utilizando reagentesconhecidos tais como CaP04 ou DEAE-dextran. Conforme descrito acima, oscultivos celulares podem ser incubados e o meio substituído com meio decultivo (isolado) ou meio que contém radiomarca, tal como 35S-metionina. Apósa determinação da presença de polipeptídeo TAT, o meio de cultivo pode sersubstituído com meio livre de soro. Preferencialmente, os cultivos sãoincubados por cerca de seis dias e, em seguida, o meio condicionado é colhido.
O meio que contém o TAT expresso pode ser concentrado em seguida epurificado por meio de qualquer método selecionado.
TAT marcado com epítopos pode também ser expresso em célulasCHO hospedeiras. O TAT pode ser subclonado fora do vetor pRK5. O inserto desubclone pode sofrer PCR para fusão em quadro com marca de epítoposelecionada tal como marca poli-his em vetor de expressão de bacilovírus. O insertode TAT marcado com póli-his pode ser subclonado em seguida em vetor dirigidopor SV40 que contém marcador de seleção tal como DHFR para a seleção declones estáveis. Por fim, as células CHO podem ser transfectadas (conformedescrito acima) com o vetor dirigido por SV40. Pode-se realizar a marcação,conforme descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultivo que contémo TAT póli-His marcado expresso pode ser concentrado em seguida e purificado pormeio de qualquer método selecionado, tal como por meio de cromatografia deafinidade de quelato de Ni2+.
TAT pode também ser expresso em células CHO e/ou COS pormeio de procedimento de expressão transitória ou em células CHO por meio deoutro procedimento de expressão estável.
A expressão estável em células de CHO é realizada utilizando oprocedimento a seguir. As proteínas são expressas na forma de construção deIgG (imunoadesina), em que as seqüências de codificação para as formassolúveis (tais como os domínios extracelulares) das proteínas correspondentessão fundidas a seqüência de região constante de lgG1 que contém os domíniosde articulação, CH2 e CH2 e/ou é forma póli-His marcada.
Após a amplificação por PCR, os DNAs correspondentes sãosubclonados em vetor de expressão de CHO utilizando métodos padrãoconforme descrito em Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology,Unidade 3.16, John Wiley and Sons (1997). Vetores de expressão de CHO sãoconstruídos de forma a conterem locais de restrição compatíveis 5' e 3' do DNAde interesse para permitir o impulsionamento conveniente de cDNAs. O vetorutilizado na expressão em células CHO é descrito em Lucas et al, Nucl. AcidsRes. 24: 9 (1774-1779 (1996)) e utiliza o promotor/amplificador precoce SV40para dirigir a expressão do cDNA de interesse e di-hidrofolato reductase(DHFR). A expressão de DHFR permite a seleção para manutenção estável doplasmídeo após a transfecção.
Doze microgramas do DNA de plasmídeo desejado sãointroduzidos em cerca de dez milhões de células de CHO utilizando reagentesde transfecção disponíveis comercialmente SUPERFECT® (Quiagen),DOSPER® ou FUGENE (Boehringer Mannheim). As células são cultivadasconforme descrito em Lucas et al, acima. Cerca de 3 x 107 células sãocongeladas em ampola para crescimento e produção adicional, conformedescrito abaixo.
As ampolas que contêm o DNA de plasmídeo são descongeladaspor meio de colocação em banho de água e misturadas por turbilhonamento. Oconteúdo é pipetado em tubo de centrifugação que contém 10 ml de meios ecentrifugado a 1000 rpm por cinco minutos. O sobrenadante é aspirado e ascélulas são novamente suspensas em 10 ml de meios seletivos (0,2 um dePS20 filtrado com soro de feto bovino diafiltrado de 0,2 fim a 5%). As célulassão parceladas em seguida em centrifugador de 100 ml que contém 90 ml de" meios seletivos. Após um a dois dias, as células são transferidas paracentrifugador de 250 ml cheio com 150 ml de meio de cultivo seletivo eincubadas a 37 °C. Após mais dois a três dias, centrifugadoras de 250 ml, 500ml e 2000 ml são semeadas com 3 x 105 células/ml. O meio celular é trocadocom meio novo por centrifugação e re-suspensão em meio de produção.Embora qualquer meio de CHO apropriado possa ser empregado, meio deprodução descrito na Patente Norte-Americana n° 5.122.469, emitida em 16 dejunho de 1992, pode realmente ser utilizado. Centrifugador de produção de trêslitros é semeado a 1,2 x 106 células/ml. No dia 0, é determinado o número depH das células. No dia 1, o centrifugador é amostrado e inicia-se a aspersãocom ar filtrado. No dia 2, o centrifugador é amostrado, a temperatura alterou-separa 33 °C e são tomados 30 ml de 500 g/l de glicose e 0,6 ml de 10%antiespumante (tal como emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, Emulsão GrauMédico Dow Corning 365). Ao longo de toda a produção, o pH é ajustadoconforme o necessário para mantê-lo em cerca de 7,2. Após dez dias, ou até aqueda da viabilidade abaixo de 70% o cultivo celular é colhido por meio decentrifugação e filtragem através de filtro de 0.22 ^m. O filtrado foi armazenadoa 4 °C ou carregado imediatamente sobre colunas para purificação.
Para as construções marcadas com poli-His, as proteínas sãopurificadas utilizando coluna Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazol aos meios condicionados até concentração de 5 mM. O meiocondicionado é bombeado a uma coluna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada em 20mM de Hepes, pH 7,4, tampão contendo 0,3 M de NaCI e 5 mM de imidazol emvelocidade de fluxo de 4 a 5 ml/min a 4 °C. Após o carregamento, a coluna élavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína eluída com tampão deequilíbrio que contém 0,25 M de imidazol. A proteína altamente purificada ésubseqüentemente dessalinizada em tampão de armazenagem que contém 10mM de Hepes, 0,14 M de NaCI e manitol a 4%, pH 6,8, com coluna de 25 ml deG25 Superfine (Pharmacia) e armazenada a -80 °C.
Construções de imunoadesina (que contém Fc) são purificadas apartir dos meios condicionados conforme segue. O meio condicionado ébombeado sobre coluna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que havia sidoequilibrada em 20 mM de tampão fosfato de Na, pH 6,8. Após o carregamento,a coluna é extensivamente lavada com tampão de equilíbrio antes da eluiçãocom 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamenteneutralizada recolhendo-se frações de 1 ml em tubos que contêm 275 jal de 1 Mtampão Tris, pH 9. A proteína altamente purificada é subseqüentementedessalinizada em tampão de armazenagem conforme descrito acima para asproteínas marcadas com póli-His. A homogeneidade é determinada por géis deSDS poliacrilamida e por seqüenciamento de aminoácidos N-terminais pormeio de degradação de Edman.
Certos polipeptídeos TAT descritos no presente foram expressose purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 16
Expressão de TAT em LeveduraO método a seguir descreve a expressão recombinante de TAT
em levedura.
Em primeiro lugar, vetores de expressão de leveduras sãoconstruídos para a produção intracelular ou secreção de TAT a partir dopromotor ADH2/GAPDH. DNA que codifica TAT e o promotor é inserido emlocais de enzimas de restrição apropriados no plasmídeo selecionado paradirigir a expressão intracelular de TAT. Para secreção, DNA que codifica TATpode ser clonado no plasmídeo selecionado, junto com DNA que codifica opromotor ADH2/GAPDH, peptídeo de sinal TAT nativo ou outro peptídeo desinal de mamífero ou, por exemplo, fator alfa de levedura ou seqüêncialíder/sinal de secreção de intervase e seqüências ligantes (se necessário) paraa expressão de TAT.
Células de leveduras, tais como linhagem de levedura AB110,podem ser transformadas em seguida com os plasmídeos de expressãodescritos acima e cultivados em meios de fermentação selecionados. Ossobrenadantes de levedura transformados podem ser analisados por meio deprecipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação por SDS-PAGE,seguidos por manchas dos géis com manchas de Azul de Coomassie.
TAT recombinante pode ser isolado em seguida e purificado pormeio de remoção das células de leveduras do meio de fermentação porcentrifugação e concentração do meio em seguida utilizando filtros de cartuchoselecionados. O concentrado que contém TAT pode ser adicionalmentepurificado utilizando resinas de cromatografia de coluna selecionadas.
Certos polipeptídeos TAT descritos no presente foram expressose purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 17
Expressão de TAT em Células de Insetos Infectadas com Bacilovírus
O método a seguir descreve a expressão recombinante de TATem células de insetos infectadas com bacilovírus.
A codificação de seqüências para TAT é fundida acima no fluxode marca de epítopo contida em vetor de expressão de bacilovírus. Essasmarcas de epítopos incluem marcas poli-his e marcas de imunoglobulina (comoregiões Fc de IgG). Pode-se empregar uma série de plasmídeos, que incluemplasmídeos derivados de plasmídeos disponíveis comercialmente tais comopVL1393 (Novagen). Resumidamente, a seqüência que codifica TAT ou a partedesejada da seqüência de codificação de TAT tal como a seqüência quecodifica domínio extracelular de proteína transmembrana ou a seqüência quecodifica a proteína madura caso a proteína seja extracelular é amplificada porPCR com primers complementares às regiões 5' e 3'. O primer 5' podeincorporar locais de enzimas de restrição ladeadores (selecionados). O produtoé digerido em seguida com as enzimas de restrição selecionadas e subclonadono vetor de expressão.
Bacilovírus recombinante é gerado por meio de cotransfecção doplasmídeo acima e DNA de vírus BaculoGold® (Pharmingen) em células deSpodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina(disponíveis comercialmente por meio da GIBCO-BRL). Após quatro a cincodias de incubação a 28 °C, os vírus liberados são colhidos e utilizados paraamplificações adicionais. Expressão de proteínas e infecções virais sãorealizadas conforme descrito por 0'Reilley et al, Baculovirus ExpressionVectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
TAT marcado com póli-his expresso pode ser purificado emseguida, por exemplo, por meio de cromatografia de afinidade de quelato deNi2+ conforme segue. Extratos são preparados a partir de células Sf9 infectadaspor vírus recombinante conforme descrito por Rupert et al, Nature, 362: 175-179 (1993). Resumidamente, células Sf9 são lavadas, novamente suspensasem tampão de sonicação (25 ml de Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI2; 0,1 mMde EDTA; 10% glicerol; 0,4% NP-40; 0,4 M de KCI) e sonicados por duas vezespor vinte segundos sobre gelo. Os sonicados são liberados por meio decentrifugação e o sobrenadante é diluído por cinqüenta vezes em tampão decarregamento (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCI, 10% glicerol, pH 7,8) efiltrados através de filtro de 0,45 um. Coluna de Ni2+-NTA agarose (disponívelcomercialmente por meio da Qiagen) é preparada com volume de leito de 5 ml,lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão decarregamento. O extrato celular filtrado é carregado sobre a coluna a 0,5 ml porminuto. A coluna é lavada até a linha base A280 com tampão de carga, pontoem que se inicia a coleta de frações. Em seguida, a coluna é lavada comtampão de lavagem secundário (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI, 10%glicerol, pH 6,0), que elui proteína unida não especificamente. Após atingir-senovamente a linha base A28o, a coluna é desenvolvida com gradiente de 0 arecolhidas e analisadas por meio de SDS-PAGE e manchas de prata ouWestern Blot com Ni2+-NTA conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Fraçõesque contêm o TAT marcado com Hisio eluído são reunidas e dialisadas contratampão de carregamento.
Alternativamente, a purificação do TAT marcado com IgG (oumarcado com Fc) pode ser realizada utilizando técnicas de cromatografiaconhecidas, que incluem, por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína Aou Proteína G.
Certos polipeptídeos TAT descritos no presente foram expressose purificados com sucesso utilizando esta(s) técnica(s).
Exemplo 18
Publicação de Polipeptídeos TAT Utilizando Anticorpos Específicos
Polipeptídeos TAT nativos ou recombinantes podem serpurificados por meio de uma série de métodos padrão na técnica de purificaçãode proteínas. Polipeptídeo pro-TAT, polipeptídeo TAT maduro ou polipeptídeopré-TAT, por exemplo, é purificado por meio de cromatografia deimunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipeptídeo TAT deinteresse. De forma geral, coluna de imunoafinidade é construída por meio deacoplamento covalente do anticorpo anti-polipeptídeo TAT a resinacromatográfica ativada.
Imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soro imunepor meio de precipitação com sulfato de amônio ou por meio de purificaçãosobre Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway NJ).
De forma similar, anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluido deascite de camundongo por meio de precipitação com sulfato de amônio oucromatografia sobre Proteína A imobilizada. Imunoglobulina parcialmentepurificada é ligada covalentemente a resina cromatográfica tal comoSEPHAROSE® ativada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpoé acoplado à resina, a resina é bloqueada e a resina derivada é lavada deacordo com as instruções do fabricante.
Essa coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação depolipeptídeo TAT por meio da preparação de fração de células que contêmpolipeptídeo TAT em forma solúvel. Esta preparação é derivada por meio desolubilização da célula inteira ou de fração subcelular obtida por meio decentrifugação diferencial por adição de detergente ou outros métodos bemconhecidos na técnica. Alternativamente, polipeptídeo TAT solúvel que contémseqüência de sinal pode ser secretado em quantidade útil para o meio no qualas células são cultivadas.
Preparação que contém polipeptídeo TAT solúvel é passadasobre a coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições quepermitem a absorção preferencial de polipeptídeo TAT (tal como tampões comalta resistência iônica na presença de detergente). Em seguida, a coluna éeluída sob condições que rompem a união de anticorpo e polipeptídeo TAT (talcomo tampão com baixo pH como cerca de pH 2 a 3 ou alta concentração decaotropo tal como uréia ou íon de tiocianato) e é recolhido polipeptídeo TAT.
Depósito de Material
Os materiais a seguir foram depositados na Coleção Norte-
Americana de Cultivos de Tipos, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110-2209, Estados Unidos (ATCC):
Tabela 11
Material Dep. ATCC n° Data de Depósito
Linhagem de células de hibridoma 3A5.3 PTA-6695 4 de maio, 2005
Linhagem de células de hibridoma 11 D10.1.14 PTA-6696 4 de maio, 2005
Estes depósitos foram feitos com base nas disposições do Tratado deBudapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismospara Fins de Procedimento de Patentes e suas Regulamentações (Tratado deBudapeste). Isso garante a manutenção de cultivo viável do depósito por trinta anosa partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC com basenos termos do Tratado de Budapeste e sujeito a acordo entre a Genentech, Inc. e aATCC, que garante a disponibilidade permanente e irrestrita da prole do cultivo dodepósito ao público mediante emissão da patente norte-americana correspondenteou mediante a abertura ao público de qualquer pedido de patente norte-americanoou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da prole às partesdeterminadas pelo Comissário Norte-Americano de Patentes e Marcas Comerciaiscomo autorizado a tal, de acordo com 35 USC § 122 e as normas relativas doComissário (incluindo 37 CFR § 1.14, com referência específica a 886 OG 638).
O cessionário do presente pedido concordou que, se um cultivodos materiais em depósito morrer ou for perdido ou destruído quando cultivadosob condições apropriadas, os materiais serão imediatamente substituídosmediante notificação com outro idêntico. A disponibilidade do materialdepositado não deve ser considerada licença para a prática da presenteinvenção em contravenção aos direitos concedidos com base na autoridade dequalquer governo de acordo com as suas leis de patentes.
O relatório descritivo acima é considerado suficiente para permitirque os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presenteinvenção não deve ter seu escopo limitado pela construção depositada, pois arealização depositada destina-se a ilustração isolada de certos aspectos dapresente invenção e quaisquer construções que são funcionalmenteequivalentes encontram-se dentro do escopo da presente invenção. O depósitode material do presente não constitui aceitação de que o relatório descritivocontido no presente é inadequado para permitir a prática de qualquer aspectoda presente invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser consideradolimitador do escopo das reivindicações às ilustrações específicas querepresenta. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além dasexibidas e descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos noassunto a partir do relatório descritivo acima e se encontrarão dentro do escopodas reivindicações anexas.Listagem de Seqüência
;110> Genentech, Inc.Mark S. DennisWilliam MalletPaul Polakis
:120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE
;130> P5040R1-PCT
;140> PCT/US2006/023099;141> 14-06-2006
;150> US 60/793,951cl51> 21-04-2006
:150> US 60/692,092cl51> 20-06-2005
:160> 211
:210> 1:211> 21112:212> DNA
;213> Homo sapiens:400> 1
cctgtgactt ctcttctcac ccctggcctg gtgataacca cagacaggat 50
gggcataagc agagaacctg gaaccagttc cacttcaaat ttgagcagca 100
cctcccatga gagactgacc actttggaag acactgtaga tacagaagcc 150
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ccacatctcc aatgggtacc acctacacca tgggggaaac gagtgtttcc 300
atatccactt ctgacttctt tgagaccagc agaattcaga tagaaccaac 350
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gctcagccac agagggaagc actgtccttt ctgaagtgcc cagtggtgct 450
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gtcagggcct gatcagttca ccatatcacc agacatctct actgaagcga 550
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atcactattg agacaggttc tcctggggct acatcagagg gtaccctcac 650
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ctccaggatt ttcacactca gagatgacca ctcttatgag tagaactcct 750
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ccagctcagt cacaccaaca aatacacctt cttctcctgg gtccactcac 5700
cttttacaga gttccaagac tgatttcacc tcttctgcaa aaacatcatc 5750
cccagactgg cctccagcct cacagtatac tgaaattcca gtggacataa 5800
t^accccctt taatgcttct ccatctatta cggagtccac tgggataacc 5850
tccttcccag aatccaggtt tactatgtct gtaacagaaa gtactcatca 5900
tctgagtaca gatttgctgc cttcagctga gactatttcc actggcacag 5950
tgatgccttc tctatcagag gccatgactt catttgccac cactggagtt 6000
ccacgagcca tctcaggttc aggtagtcca ttctctagga cagagtcagg 6050
ccctggggat gctactctgt ccaccattgc agagagcctg ccttcatcca 6100
ctcctgtgcc attctcctct tcaaccttca ctaccactga ttcttcaacc 6150
atcccagccc tccatgagat aacttcctct tcagctaccc catatagagt 6200
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cctaccagtt ggtggacatc catgtgacag aaatggagtc atcagtttat 20400
caaccaacaa gcagctccag cacccagcac ttctacctga atttcaccat 20450
caccaaccta ccatattccc aggacaaagc ccagccaggc accaccaatt 20500
accagaggaa caaaaggaat attgaggatg cgctcaacca actcttccga 20550
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cgccactggc tcggagagta gacagagttg ccatctatga ggaatttctg 20700
cggatgaccc ggaatggtac ccagctgcag aacttcaccc tggacaggag 2 0750
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ggaattctga ccttcccttc tgggctgtca tcctcatcgg cttggcagga 20850
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ggcagaaata aaccatattg gtcggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 21100aaaaaaaaaa aa 21112
:210> 2:211> 6995:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 2
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Arg Met Gly lie Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn20 25 30
Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr35 40 45
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Leu Ser Asp Ser Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr80 85 90Thr Tyr Thr Met Gly Glu Thr Ser Vai Ser lie Ser Thr Ser Asp95 100 105
Phe Phe Glu Thr Ser Arg lie Gln lie Glu Pro Thr Ser Ser Leu110 115 120
Thr Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg lie Ser Ser125 130 135
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Thr Thr Glu Vai Ser Arg Thr Glu Vai lie Ser Ser Arg Gly Thr155 160 165
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Thr Ser Glu Gly Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe215 220 225
Trp Ser Gly Thr His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser230 235 240
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Pro Ser Leu Pro Ser Vai Glu Glu Ala Ser Ser Vai Ser Ser Ser260 265 270
Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Ser Thr Ser Phe Phe Ser Thr Leu275 280 285
Pro Glu Ser lie Ser Ser Ser Pro His Pro Vai Thr Ala Leu Leu290 295 300
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Glu lie Leu Ala Thr Ser Glu Vai Thr Lys Asp Arg Glu Lys lie335 340 345
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Tyr Lys His Leu Ser Pro Ser Ser Vai Leu Ala Asp Leu Vai Thr365 370 375
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Thr Ser Gln Glu Thr Ser Ser Ala Thr Glu Arg Ser Ala Ser Leu425 430 435
Ser Gly Met Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Vai Ser Arg Thr Glu440 445 450
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Thr lie Ser Pro Glu lie Ser Thr Glu Thr lie Thr Arg lie Ser470 475 480
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Lys Thr Gly His Ser Gly Ala Ser Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu500 505 510
Ãsp Thr Ser Ser Arg Ala Ser Trp Pro Gly Thr His Ser Ala Ala515 520 525
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Gly Pro Glu Asp Vai Ser Trp Pro Ser Arg Pro Ser Vai Glu Lys545 550 555
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Ser Tyr Pro Gly Leu Pro Glu Pro Ser Lys Vai Thr Ser Pro Vai665 670 675
Vai Thr Ser Ser Thr lie Lys Asp lie Vai Ser Thr Thr lie Pro680 685 690Ala Ser Ser Glu lie Thr Arg lie Glu Met Glu Ser Thr Ser Thr695 700 705
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lie Leu Ala Thr Thr Glu Vai Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu920 925 930
Met Thr Asn Vai Vai Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser935 940 945
Ser Vai Leu Ala Asp Ser Vai Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met950 955 960
Gly lie Thr Tyr Pro Thr Gly Asp Thr Asn Vai Leu Thr Ser Thr965 970 975
Pro Ala Phe Ser Asp Thr Ser Arg lie Gln Thr Lys Ser Lys Leu980 985 990Ser Leu Thr Pro Gly Leu Met Glu Thr Ser lie Ser Glu Glu Thr995 1000 1005
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Gly Ala Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr1085 1090 1095
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Ser Trp Pro Ser Pro Leu Ser Vai Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser1130 1135 1140
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Ser Leu Phe Thr Ser lie Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp1175 1180 1185
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Glu Ala lie His Vai Phe Glu Asn Thr Ala Ala Ser His Vai Glu1220 1225 1230
Thr Thr Ser Ala Thr Glu Glu Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Gly Phe1235 1240 1245
Ser Glu Pro Thr Lys Vai lie Ser Pro Vai Vai Thr Ser Ser Ser1250 1255 1260
lie Arg Asp Asn Met Vai Ser Thr Thr Met Pro Gly Ser Ser Gly1265 1270 1275
lie Thr Arg lie Glu lie Glu Ser Met Ser Ser Leu Thr Pro Gly1280 1285 1290Leu Arg Glu Thr Arg Thr Ser Gln Asp lie Thr Ser Ser Thr Glu1295 1300 1305
Thr Ser Thr Vai Leu Tyr Lys Met Pro Ser Gly Ala Thr Pro Glu1310 1315 1320
Vai Ser Arg Thr Glu Vai Met Pro Ser Ser Arg Thr Ser lie Pro1325 1330 1335
Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Leu Asp lie Ser Asp Glu Vai1340 1345 1350
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lie Thr lie Thr Thr Gln Thr Gly Tyr Ser Leu Ala Thr Ser Gln1370 1375 1380
Vai Thr Leu Pro Leu Gly Thr Ser Met Thr Phe Leu Ser Gly Thr1385 1390 1395
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Leu Met Ser Arg Gly Pro Glu Ser Leu Ser Trp Thr Ser Pro Arg1415 1420 1425
Phe Vai Glu Thr Thr Arg Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro1430 1435 1440
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Ser Pro Ser Ser Pro Leu Pro Vai Thr Ser Leu lie Leu Pro Gly1460 1465 1470
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Thr Ser Ser Ser Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Vai Glu lie Pro1490 1495 1500
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Ser Asn Thr Ala Vai Ala Lys Vai Arg Thr Ser Ser Ser Vai His1520 1525 1530
Glu Ser His Ser Ser Vai Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr lie Thr1535 1540 1545
lie Pro Ser Met Gly lie Thr Ser Ala Vai Glu Asp Thr Thr Vai1550 1555 1560
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Lys lie His Pro Ser Ser Ser Met Ala Vai Thr Asn Vai Gly Thr1805 1810 1815
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Phe Ser Arg Thr Glu Ser Gly Pro Gly Asp Ala Thr Leu Ser Thr2015 2020 2025
lie Ala Glu Ser Leu Pro Ser Ser Thr Pro Vai Pro Phe Ser Ser2030 2035 2040
Ser Thr Phe Thr Thr Thr Asp Ser Ser Thr lie Pro Ala Leu His2045 2050 2055
Glu lie Thr Ser Ser Ser Ala Thr Pro Tyr Arg Vai Asp Thr Ser2060 2065 2070
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Ser Thr Leu Asp Thr Ser Ser Gln Pro Gly Arg Thr Ser Ser Ser2090 2095 2100
Pro lie Leu Asp Thr Arg Met Thr Glu Ser Vai Glu Leu Gly Thr2105 2110 2115
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Ala Ala His Arg Gly Thr lie Arg Pro Vai Lys Gly Pro Gln Thr2150 2155 2160
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lie Leu Thr Leu Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met
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Ala Thr Ser His Gly Vai Glu Ala Ser Ser Ala Vai Leu Thr Vai
2840 2845 2850
Ser Pro Glu Vai Pro Gly Met Vai Thr Phe Leu Vai Thr Ser Ser
2855 2860 2865
Arg Ala Vai Thr Ser Thr Thr lie Pro Thr Leu Thr lie Ser Ser
2870 2875 2880
Asp Glu Pro Glu Thr Thr Thr Ser Leu Vai Thr His Ser Glu Ala
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Lys Met lie Ser Ala lie Pro Thr Leu Gly Vai Ser Pro Thr Vai
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Gln Gly Leu Vai Thr Ser Leu Vai Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr
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Ser Ala Phe Ser Asn Leu Thr Vai Ala Ser Ser Gln Pro Glu Thr
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lie Asp Ser Trp Vai Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Vai
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b
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:213> Homo sapiens:400> 3
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45
Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu95 100 105
lie Lys Arg
:210> 4:211> 109:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 4
Asp lie Vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Leu15 10 15
Gly Glu Arg Vai Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Vai Ser20 25 30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro35 40 45
Lys Leu Trp lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro50 55 60
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr65 70 75
lie Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His80 85 90
Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai95 100 105Glu lie Lys Arg
:210> 5:211> 109:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 5
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai
15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Vai Ser
20 25 30
Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75
lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His
80 85 90
Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai
95 100 105
Glu lie Lys Arg
:210> 6:211> 113:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 6
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Vai Ser Vai lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln95 100 105Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110
<210> 7<211> 120<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 7
Glu Vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys20 25 30
Asp Thr Tyr Met His Trp Vai Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu35 40 45
Glu Trp lie Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr50 55 60
Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser65 70 75
Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Phe Cys Vai Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr95 100 105
Gly Phe Ala Phe Cys Asp Gln Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ala110 115 120
<210> 8<211> 120<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 8
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys20 25 30
Asp Thr Tyr Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45
Glu Trp Vai Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr50 55 60
Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Vai Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr95 100 105Gly Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115 120
<210> 9<211> 107<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 9
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Phe Leu Ser Vai Ser Leu1 5 10 15
Gly Gly Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu lie His20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg35 40 45
Leu Leu lie Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Ser lie65 70 75
Ala Ser Leu Gln Thr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105
lie Lys
<210> 10<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 10
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai
15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu lie His
20 25 30
Ãsn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu lie Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu95 100 105lie Lys Arg
<210> 11<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 11
Asp Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Asn Pro Ser15 10 15
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Thr Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp lie Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys35 40 45
Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Gln Phe Phe Leu His Leu Asn Ser Vai Thr Thr Glu Asp80 85 90
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala110 115
;210> 12;211> 116;212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 12
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr95 100 105Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 14<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 14
Thr Ala Ser Ser Ser Vai Ser Ser Ser Tyr Leu His
5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Thr Gln Arg Thr Ser Vai Lys Arg Ser Tyr lie Ser
5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Thr Pro Arg Gly Arg Vai Arg Ser Ser Tyr Leu Ser
5 10<210> 17<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> Incerto<222> 4
<223> Amino ácido desconhecido<400> 17
Pro Glu Cys Xaa Ser Leu Gly Thr lie Tyr Leu His
5 10
<210> 18<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 18
S®r Ala Ser Ser Ser Vai Asn Ser Thr Tyr Leu His
5 10
<2110> 19<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 19
Thr Ala Ser Thr Ala Vai Gly Ser Ser Tyr Leu His
5 10
<210> 20<211> 11<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 20
Asn Ser Arg Ser Vai Ser Thr Arg Tyr Leu His
5 10
<210> 21<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 21
Asn Thr Thr Arg Ser Vai Ser Thr Gly Tyr Leu His
5 10
<210> 22<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Thr Ala Ser Ser Arg Vai Thr Ser Thr Tyr Leu His
5 10<210> 23<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Asn Thr Pro Thr Gly Vai Asn Pro Vai Tyr Leu His
5 10
<210> 24<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ala Ala Ser Ser Asp Vai lie Gly Ser Tyr Vai His
5 10
<210> 25<211> 12<2'i2> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Gly Leu Ser Thr Ser Vai Asn Ser Ser Tyr Met His
5 10
<210> 26<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> Incerto<222> 10
<223> Amino ácido desconhecido
<400> 26
Asn Ala Lys Ser Gly Vai Arg Ser Ser Xaa Vai His
5 10
<210> 27<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Asn Ser Asn Gly Ser Vai Ser Ser Lys Tyr lie His
5 10
<210> 28<211> 12<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Thr Pro Ser Arg lie Vai Ser Gly Ser Tyr Leu Ser
5 10:210> 29:211> 12:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 29
Asn Pro Ser Arg Arg Vai Thr Gly His Tyr Vai Ser
5 10
:210> 30:211> 12:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 30
Thr Ser Ser Ser Ala Vai Ser Gly Ser Tyr Vai Ser
5 10
:210> 31:211> 12:212> PRT
:213> Homo sapiens:\0Q> 31
Thr Ser Thr Thr lie Vai Arg Gly Arg Tyr Vai Ser
5 10
:210> 32:211> 12:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 32
Thr Ala Ser Ser Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Thr
5 10
:210> 33:211> 12:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 33
Thr Pro Thr Gly Ser lie Ser Arg Arg Tyr Leu Ser
5 10
:210> 34:211> 12:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 34
Thr Ala Gly Ser Lys Ala Asn Ser Ser Tyr lie His
5 10
:210> 35:211> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 35
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser5
:210> 36:211> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 36
Tyr Ser Thr Ser His Phe Ala Ser
5
:210> 37:211> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 37
Tyr Ser Ala Ser Asn Vai Pro Ser
5
:210> 38:?JL1> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 38
Tyr Ser Thr lie Asn Leu Ala Thr
5
:210> 39:211> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 39
Tyr Ser Thr Ser Lys Vai Ala Asn
5
:210> 40:211> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 40
Tyr Ser Thr Thr Asn Leu Ala Ser
5
:210> 41:211> 8:212> PRT
213> Homo sapiens400> 41
Tyr Ser Thr Asn His Leu Ala Ser
5
210> 42<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Tyr Ser Thr Asn Asn Leu Ala Ser
5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43Tyr Ser Thr lie His Pro Ala Ser
5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<2i3> Homo sapiens
<400> 44Tjyr Ser Thr Ser His Leu Ser Tyr
5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
400> 45
Tyr Ser Thr Arg Thr Met Ala Ser
5
210> 46211> 8212> PRT
213> Homo sapiens220>
221> Incerto222> 5
223> Amino ácido desconhecido400> 46
Tyr Ser Thr Ser Xaa Leu Phe Ser
5
210> 47211> 8212> PRT
213> Homo sapiens400> 47
Tyr Asn Thr Ser Asn Arg Ala Ser
5
210> 48211> 8212> PRT
213> Rana catesbeiana:400> 48
Tyr Gly Thr Ser His Leu Ala Ser5
:210> 49:211> 8:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 49
Tyr Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ser
5
:210> 50:211> 8:212> PRT
:2-13> Homo sapiens:400> 50
Tyr Ser Thr Asn Lys Leu Ala Arg
5
:210> 51:211> 8:212> PRT
213> Homo sapiens:400> 51
Tyr Ser Thr Ser Gln Leu Gly Arg
5
:210> 52:211> 8212> PRT
213> Homo sapiens400> 52
Tyr Ser Thr Ser Asn Vai Pro Gln
5
210> 53211> 8212> PRT
213> Homo sapiens400> 53
Tyr Gly Thr Tyr Asn Leu Pro lie
5
210> 54211> 8212> PRT
213> Homo sapiens
400> 54Tyr Gly Ser Asn Asn Arg Ala Tyr
5
<210> 55<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<220>
<221> Incerto<222> 7
<223> Amino ácido desconhecido
<400> 55Tyr Ser Ser Ser Asn Thr Xaa Ser
5
<210> 56<211> 8<212> PRT
<2"13> Homo sapiens
<400> 56Tyr Ser Ala Asn Lys Leu Ala Ser
5
<210> 57<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57Tyr Ser Ala Thr Arg Arg Ala Ser
5
<210> 58<211> 8<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 58
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Ala Arg
5
<210> 59<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 59
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Thr
5
<210> 60<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Lys
5
<210> 61<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 61
His Gln Tyr His Arg Thr Pro Tyr Lys
5
<210> 62<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 62
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Gly
5
<210> 63<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 63
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Asn
5
<210> 64<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 64
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr Ser
5
<210> 65<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 65
His Gln Tyr Tyr Arg Ser Pro Tyr Thr
5
<210> 66<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 66
His Gln Tyr Tyr Arg Thr Pro Tyr Ser
5
<210> 67<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 67
His Gln Tyr Gln Arg Ser Pro Tyr Thr
5
<210> 68<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 68
His Gln Tyr Gln Arg Ser Pro Tyr Arg
5
<210> 69<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 69
His Gln Tyr Asn Arg Ser Pro Tyr Ala
5
<210> 70<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 70
His Gln Tyr His Arg Thr Pro Tyr Thr
5
<210> 71<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 71
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Tyr lie
5
<210> 72<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 72
His Gln Tyr His Arg Arg Pro Tyr Arg
5
<210> 73<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73His Gln Tyr His Arg Asn Pro Tyr lie
5
;210> 74:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 74
Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr Met His
5 10
:210> 75:211> 10;212> PRT
;213> Homo sapiens:400> 75
Ala Phe Asn lie Ala Asp Thr Tyr lie His
5 10
:210> 76:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 76
Arg Phe Arg lie Lys Asp Thr Tyr Vai His
5 10
:210> 77:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 77
Arg Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr lie His
5 10
:210> 78:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 78
Ser Phe Gln lie Asn Asp Thr Tyr lie His
5 10
:210> 79:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 79
Ser Phe Gln Met Ser Asp Thr Tyr Vai His
5 10
210> 80211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 80
Asp Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr lie His
5 10
:210> 81:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 81
Gly Phe Asn lie lie Asp Thr Tyr lie His
5 10
:210> 82:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 82
Gly Leu Gln lie Vai Asp Thr Tyr lie His
5 10
:210> 83:211> 10:212> PRT
213> Homo sapiens:400> 83
Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr Leu His
5 10
:210> 84
:211> 10
212> PRT
213> Homo sapiens
400> 84
Gly Phe Asn lie Gln Asp Leu Tyr Leu His
5 10
210> 85211> 10212> PRT
213> Homo sapiens400> 85
Gly Phe Asn lie lie Asp Thr Tyr Met His
5 10
210> 86211> 10212> PRT
213> Homo sapiens
400> 86Gly Trp Lys Met Thr Asp Thr Tyr Met His
5 10
:210> 87:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 87
Glu Phe Lys lie Lys Asp Thr Tyr Vai His
5 10
:210> 88:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 88
Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr Tyr Vai His
5 10
:210> 89:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 89
Gly Phe Tyr lie Ser Asn Thr Tyr lie His
5 10
:210> 90:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 90
Gly Phe Asn lie Lys Asn Thr Tyr Leu His
5 10
:210> 91:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 91
Gly Phe Ser lie Glu Asn Thr Tyr Met His
5 10
:210> 92:211> 10:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 92
Gly Phe Asn lie Lys Asn Thr Tyr Met His
5 10
210> 93211> 10<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 93
Asp Phe Lys Ile Glu Asn Thr Tyr Vai His
5 10
<210> 94<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 94
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 95<2ll> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 95
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys15 10 15
Vai Arg Gly
<210> 96
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Leu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
<210> 97<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 97
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Glu Ile Lys Ser His Pro Ile15 10 15
Phe Gln Gly
<210> 98<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens400> 98
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Glu Asp Arg Gln15 10 15
Phe Gln Gly
;210> 99;211> 18;212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 99
Gly Arg Vai Asp Pro Glu Tyr Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
;210> 100;2-ll> 18:212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 100
Gly Arg Leu Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
:210> 101:211> 18:212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 101
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
c210> 102:211> 18:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 102
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys1 5 10 15
Phe Gln Gly
210> 103211> 18212> PRT
213> Homo sapiens400> 103
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Leu Thr Lys Tyr Asn Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
;210> 104;211> 18;212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 104
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
:210> 105:2\L1> 18;212> PRT
;213> Homo sapiens:400> 105
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
210> 106211> 18212> PRT213> Homo
sapiens
:400> 106
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Tyr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
:210> 107:211> 18:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 107
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Gln Gly
210> 108211> 18212> PRT
213> Homo sapiens400> 108
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp His Arg15 10 15
Phe Gln Gly
;210> 109;211> 18=212> PRT
í213> Homo sapiensc400> 109
Gly Arg Vai Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys15 10 15
Phe Arg Gly
;210> 110;211> 18í212> PRT
=213> Homo sapiens=400> 110
Gly Arg Vai Asp Pro Ser Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Gly Lys15 10 15
Phe Asn Gly
;210> 111;211> 18í212> PRT
;213> Homo sapiens:400> 111
Gly Arg Vai Asp Pro Vai Asp Gly Lys Thr Lys Tyr Asn Pro Gln1 5 10 15
lie Gln Gly
:210> 112:211> 18:2l2> PRT
:213> Homo sapiens:400> 112
Gly Arg Vai Asp Pro Ala His Gly Asn lie Lys Tyr Asp Pro Gln15 10 15
lie Met Gly
210> 113211> 13212> PRT
213> Homo sapiens;400> 113
Vai Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Ala Phe
5 10
;210> 114;211> 13í212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 114
Vai Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gln Pro
5 10
;210> 115;211> 13;212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 115
Ala Arg Asp Asn Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gly Phe
5 10
;210> 116;211> 13;212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 116
Vai Arg Asp Thr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr
5 10
;210> 117;211> 13:212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 117
Vai Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gly Tyr
5 10
:210> 118:211> 13:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 118
Vai Arg Asp Tyr Tyr Gly His Thr Tyr Gly Phe Gly Vai
5 10
:210> 119:211> 11:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 119
Lys Ala Ser Asp Leu lie His Asn Trp Leu Ala
5 10
210> 120<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
5
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<2-13> Homo sapiens
<400> 122Gln Gln Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr
5
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Gly Tyr Ser lie Thr Asn Asp Tyr Ala Trp Asn
5 10
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 126<211> 17<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 126
Gly Tyr lie Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 127<211> 17<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 127
Gly Tyr lie Ser Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu15 10 15
Lys Ser
<210> 128<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 129<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Thr Asn
5
<210> 130<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 131<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 132<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 132
Ala Arg Trp Glu Ala Gly Leu Asn His
5
<210> 133<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 133
Ala Arg Trp Glu Ala Gly Leu Asn Tyr
5
<210> 134<211> 9<212> PRT
<2<13> Homo sapiens<400> 134
Ala Arg Trp Met Ala Gly Leu Ser Asp
5
<210> 135<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 135
Ala Arg Trp Ser Ala Gly Leu Asp His
5
<210> 136<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 136
Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Asp Tyr
5
<210> 137<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 137
Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Thr His
5
<210> 138<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138Ala Arg Trp Vai Ala Gly Leu Thr Asn
5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139Ala Arg Trp Ala Gly Gly Leu Glu Asn
5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140Ala Arg Trp Asp Gly Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141Ala Arg Trp Asp Arg Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser His
5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Asn
5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 145<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Thr His
5
<210> 146<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 146
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Thr Asn
5
<210> 147<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 147
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Lys Tyr
5
<210> 148<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 148
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Asn Tyr
5
<210> 149<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 149
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Ser Ser
5
<210> 150<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 150
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Ser Vai
5
<210> 151<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Ser Tyr
5
<210> 152<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 152
Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 153<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 153
Ala Arg Trp Glu Ser Gly Leu Ser His
5
<210> 154<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 154
Ala Arg Trp Glu Ser Gly Leu Ser Vai
5
<210> 155<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 155
Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 156<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 156
Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Glu Tyr
5
<210> 157<211> 9<212> PRT
<213> Rana catesbeiana<400> 157
Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Asp Phe
5
<210> 158<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 159<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Glu Ser
5
<210> 160<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160Ala Arg Trp Leu Ser Gly Leu Ser Asp
5
<210> 161<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 161Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu His
5
<210> 162<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 162
Ala Arg Trp Ser Ser Gly Leu Asn Tyr
5
<210> 163<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 163
Ala Arg Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 164<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 164Ala Arg Trp Thr Ser Gly Met Asp Ser
5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 166<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166Ala Arg Trp Asp Thr Gly Leu Thr Tyr
5
<210> 167<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Asp His
5
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168Ala Arg Trp Ala Ala Gly Leu Asp Ser
5
<210> 169<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169Ala Arg Trp Leu Ala Gly Leu Ser Asn
5
<210> 170<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 170Ala Arg Trp Thr Ala Gly Leu Asp Gln
5
<210> 171<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp His
5
<210> 172<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 172
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Asn
5
<210> 173<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 173
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 174<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 174
Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr
5
<210> 175<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 175
Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Thr
5
<210> 176<211> 9<212> PRT
<213> Rana catesbeiana<400> 175
Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Gly Pro
5
<210> 177<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177Ala Arg Trp Met Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu Ser
5
<210> 179<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179Ala Arg Trp Arg Ser Gly Leu Glu Tyr
5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 180
Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Ser
5
<210> 181<211> 9<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Thr
5
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 182
Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Vai
5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 183
Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr
5
<210> 184<211> 87<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 184
Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30
Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg35 40 45
Vai Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser80 85
<210> 185<211> 81<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 185
Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Trp Vai Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Vai Thr Vai Ser Ser80
<210> 186<211> 80<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 186
Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Trp Vai Arg Gln Ala20 25 30Pro Gly Gln Gly Leu35
Thr Ser Thr Ser Thr50
Glu Trp Met Arg Vai40
Ala Tyr Met Glu Leu55
Thr lie Thr Ala Asp45
Ser Ser Leu Arg Ser60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Vai Thr Vai Ser Ser80
<210> 187<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 187
Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly15 10 15
Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Trp Vai Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai65 70 75
Thr Vai Ser Ser
<210> 188
<211> 87
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 188Gln Vai Gln1
Gln Thr Leu
Leu Gln Glu5
Ser Leu Thr20
Ser Gly ProCys Thr Vai
Gly Leu Vai10
Ser Gly Gly25
Lys Pro Ser15
Ser Vai Ser30
Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg35 40 45
Vai Thr lie Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys50 55 60
Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala65 70 75
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser80 85c210> 189=211> 81c212> PRT
c213> Homo sapiensc400> 189
Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Trp lie Arg Gln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75
Leu Vai Thr Vai Ser Ser80
;210> 190;211> 80;212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 190
Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Trp lie Arg Gln Pro20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu65 70 75
Vai Thr Vai Ser Ser80
:210> 191:211> 79:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 191
Gln Vai Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser.15 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Trp lie Arg Gln Pro20 25 30Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Vai Thr lie Ser Vai Asp35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala50 55 60
Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai65 70 75
Thr Vai Ser Ser
<210> 192<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 192
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Vai Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai65 70 75
Thr Vai Ser Ser
<210> 193<211> 79<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 193
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Vai Arg Gln Ala20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai65 70 75
Thr Vai Ser Ser210> 194211> 80212> PRT
213> Homo sapiens
:400> 194
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly20 25 30
Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly35 40 45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln50 55 60
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr Lys65 70 75
Vai Glu lie Lys Arg80
210> 195211> 80212> PRT
213> Homo sapiens
:400> 195
Asp lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro
15 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
20 25 30
Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Vai
50 55 60
Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr
65 70 75
Lys Vai Glu lie Lys80
210> 196211> 80212> PRT
213> Homo sapiens
400> 196Glu lie Vai1
Gly Glu Arg
Leu Thr Gln5
Ala Thr Leu20
Ser Pro GlySer Cys Trp
Thr Leu Ser10
Tyr Gln Gln25
Leu Ser Pro15
Lys Pro Gly30Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Vai Glu lie Lys80
210> 197211> 80212> PRT213> Homo
sapiens
400> 197
Asp lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu15 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly20 25 30
Gln Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu50 55 60
Gln Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Phe Gly Gln Gly Thr65 70 75
Lys Vai Glu lie Lys80
210> 198211> 116212> PRT
213> Homo sapiens
400> 198
Glu Vai Gln Leu Vai1 5
Gly Ser Leu Arg Leu20
Glu Ser Gly Gly Gly10
Ser Cys Ala Ala Ser25
Leu Vai Gln Pro Gly15
Gly Tyr Ser lie Thr30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 199<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 199
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser His95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 200<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 200
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Ser Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 201<211> 116<212> PRT<213> Momo sapiens
<400> 201
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 202<211> 116<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 202
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ala Gly Leu Thr Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser
110 115
<210> 203<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 203
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Ser Gly Leu Thr Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser
110 115
<210> 204<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 204
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 . 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Lys Ser Gly Leu Asp Ser95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
;210> 205;211> 116;212> PRT
;213> Homo sapiens=400> 205
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Ser95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
:210> 206:211> 116:212> PRT
:213> Homo sapiens:400> 206
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 207<211> 116<212> PRT<213> Homo sapiens
<400> 207
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 208<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 208
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 209<211> 116<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 209
Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser lie Thr20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45
Leu Glu Trp Vai Gly Tyr lie Asn Tyr Ala Gly Tyr Thr Thr Tyr50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser110 115
<210> 210<211> 108<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 210
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu lie His20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45
Leu Leu lie Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp80
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr95
lie Lys Arg
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu
100 105
;210> 211;211> 108:212> PRT
;213> Homo sapiens;400> 211
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai
15 10 15
Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu lie His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu lie Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu
95 100 105
lie Lys Arg

Claims (36)

1. ANTICORPO ISOLADO, que compreende pelo menos umaseqüência de HVR selecionada a partir do grupo que consiste de:(a) seqüência de HVR-L1 de acordo com qualquer dos SEQ IDN°14a34;(b) seqüência de HVR-L2 de acordo com qualquer dos SEQ IDN° 35 a 58;(c) seqüência de HVR-L3 de acordo com qualquer dos SEQ IDN° 59 a 73;(d) seqüência de HVR-H1 de acordo com qualquer dos SEQ IDN° 74 a 93;(e) seqüência de HVR-H2 de acordo com qualquer dos SEQ IDN°94a112;e(f) seqüência de HVR-H3 de acordo com qualquer dos SEQ IDN°113a118.
2. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1,que compreende adicionalmente estrutura de consenso humano receptora deHV de acordo com qualquer dentre SEQ ID N° 184 a 193.
3. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1que compreende adicionalmente estrutura de consenso humano receptora deHL de acordo com qualquer dentre SEQ ID N° 194 a 197.
4. ANTICORPO ISOLADO, de acordo com a reivindicação 1,que compreende adicionalmente seqüência de estrutura de consenso humanoreceptora de HV de acordo com qualquer dentre SEQ ID N° 184 a 193 eseqüência de estrutura de consenso humano receptora de HL de acordo comqualquer dentre SEQ ID N° 194 a 197.
5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que éfragmento de anticorpo.
6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que éanticorpo humanizado ou quimérico.
7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que éconjugado a agente inibidor do crescimento.
8. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que éconjugado a agente citotóxico.
9. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, em que oagente citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de toxinas,antibióticos, isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.
10. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 8, em que oagenteci^icoétoxin,
11. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10, em que atoxina é selecionada a partir do grupo que consiste de maitansinóide ecaliqueamicina.
12. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 10, em que atoxina é maitansinóide.
13. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que éproduzido em bactéria.
14. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que éproduzido em células de CHO.
15. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que induza morte de célula à qual se une.
16. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 15, em que amencionada célula é célula de câncer do ovário.
17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, que émarcado de forma detectável.
18. ANTICORPO ISOLADO, que compreende pelo menos umadas regiões de determinação de complementaridade de qualquer anticorpoproduzido por qualquer das linhagens de células de hibridoma exibidas naTabela 11.
19. ANTICORPO MONOCLONAL, produzido por qualquer dascélulas de hibridoma exibidas na Tabela 11.
20. CÉLULA DE HIBRIDOMA, que produz anticorpomonoclonal que se une a polipeptídeo TAT10772.
21. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO, de primeiro anticorpo, quese une a epítopo antigênico TAT10772 unido por segundo anticorpo, em que omencionado segundo anticorpo é anticorpo de acordo com qualquer dasreivindicações 1, 18 ou 19, o mencionado método compreende a determinaçãoda capacidade do mencionado primeiro anticorpo de bloquear a união domencionado segundo anticorpo a polipeptídeo TAT10772, em que acapacidade do mencionado primeiro anticorpo de bloquear a união domencionado segundo anticorpo ao mencionado polipeptídeo TAT10772 empelo menos 40% e em concentrações iguais de anticorpo indica que omencionado primeiro anticorpo é capaz de unir-se a epítopo unido pelomencionado segundo anticorpo.
22. MÉTODO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULA,que expressa proteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQID N° 2, em que o mencionado método compreende o contato da mencionadacélula com anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 18 ou 19,em que a união do mencionado anticorpo à mencionada proteína causainibição do crescimento da mencionada célula.
23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, em que amencionada célula é célula de câncer do ovário.
24. MÉTODO DE TRATAMENTO TERAPÊUTICO, demamíferos que possuem tumor canceroso que compreende células queexpressam proteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ IDN° 2, em que o mencionado método compreende a administração aomencionado mamífero de quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo deacordo com qualquer das reivindicações 1, 18 ou 19, de forma a tratarefetivamente o mencionado mamífero.
25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, em que omencionado tumor canceroso é tumor do ovário.
26. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DEPROTEÍNA, TAT10772 em amostra supeita de conter a mencionada proteína,em que o mencionado método compreende a exposição da mencionadaamostra a anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 18 ou 19 edeterminação da união do mencionado anticorpo à mencionada proteína namencionada amostra, em que a união do anticorpo à mencionada proteínaindica a presença da mencionada proteína na mencionada amostra.
27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, em que amencionada amostra compreende célula suspeita de expressar a mencionadaproteína.
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, em que amencionada célula é célula de câncer do ovário.
29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, em que omencionado anticorpo é marcado de forma detectável.
30. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DA PRESENÇA DETUMOR, em mamíferos, em que o mencionado método compreende adeterminação do nível de expressão de gene que codifica proteína quecompreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N° 2 em amostra de testede células de tecido obtidas a partir do mencionado mamífero e em amostra decontrole de células normais conhecidas da mesma origem de tecido, em quenível de expressão mais alto da mencionada proteína nã amostra de teste emcomparação com a amostra controle indica a presença de tumor no mamíferodo qual foi obtida a amostra de teste.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, em que aetapa de determinação do nível de expressão de gene que codifica amencionada proteína compreende o emprego de oligonucleotídeo emhibridização in situ ou análise RT-PCR.
32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, em que aetapa de determinação do nível de expressão de gene que codifica amencionada proteína compreende o emprego de anticorpo em análise deimunohistoquímica ou Western Blot.
33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, em que omencionado tumor é tumor do ovário, mama ou pâncreas.
34. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DA PRESENÇA DETUMOR, em mamífero em que o mencionado método compreende o contatode amostra de teste de células de tecido obtidas do mencionado mamífero comanticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 18 ou 19 e detecçãoda formação de complexo entre o mencionado anticorpo e proteína TAT10772na amostra de teste, em que a formação de complexo indica a presença detumor no mencionado mamífero.
35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, em que amencionada amostra de teste de células de tecido é obtida a partir de indivíduosuspeito de ter tumor canceroso.
36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, em que omencionado tumor canceroso é tumor do ovário, mama ou pâncreas.
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