BRPI0613153A2 - métodos para alterar a reatividade de paredes celulares de plantas - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA ALTERAR A REATIVIDADE DE PAREDES CELULARES DE PLANTAS. A presente invenção refere-se a métodos e meios para a modificação da reatividade de paredes celulares de planta, particularmente, como podem ser encontradas em fibras naturais de plantas produtoras de fibra por inclusão de oligossacarídeos ou polissacarkieos positivamente carregados na parede celular. Isto pode ser convenientemente obtido ao expressar um gene quimérico que codifica uma N-acetilglicosamina transferase, particularmente uma N-acetilglicosamina transferase, capaz de ser marcada nas membranas do aparelho de Golgi em células de uma planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA ALTERAR A REATIVIDADE DE PAREDES CELULARES DEPLANTAS"

A presente invenção refere-se à modificação da reatividade deparedes celulares de plantas, inclusive paredes celulares de plantas secun-dárias, particularmente conforme são encontradas em fibras naturais deplantas produtoras de fibras. Em particular, a presente invenção refere-se àsfibras de algodão com reatividade alterada. A reatividade modificada poderiaser aplicada em métodos para tingir material derivado de planta dotada deparede celular tal como fibras naturais, utilizando corantes reativos à fibra,para aperfeiçoar, por exemplo, durabilidade de cor ou para reduzir os volu-mes de efluentes usados durante o processo de tingimento. A reatividademodificada também poderia ser aplicada para aperfeiçoar a reatividade dasfibras naturais com reagentes tais como retardantes de chama, água, óleo erepelentes de sujeira, agentes antidobra, amaciantes, agentes antiestáticos,agentes de branqueamento fluorescente etc..

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As fibras naturais, inclusive, fibras naturais dotadas de celulosede plantas, tais como, algodão e linho, vêm sendo usadas pela humanidadehá mais de 5000 anos. As fibras dotadas de celulose natural, entretanto, nãopossuem a versatilidade química de fibras sintéticas, devido à natureza iner-te relativa da celulose que consiste em monômeros de glicose β-1 -4 ligados.

Esta natureza inerte relativa é, por exemplo, visível durante oprocesso de tingimento de fibras de algodão e tecidos. Geralmente dois tiposde corantes são usados para tingir algodão: corantes diretos e corantes rea-tivos à fibra, sendo que ambos são moléculas aniônicas. O próprio algodãodesenvolve uma carga aniônica em água, de modo que, sem tratamento es-pecial, a absorção de corante pela fibra ou tecido seja bastante elaborada.

Os corantes diretos criam uma ligação de hidrogênio relativa-mente fraca com o polímero de celulose formando uma ligação semiperma-nente. Os corantes diretos são fáceis de se utilizar e menos dispendiosos doque os corantes reativos à fibra, porém não resistem bem à lavagem. Oscorantes reativos à fibra são moléculas que combinam cromóforos com umgrupo reativo que forma fortes ligações covalentes com a fibra por meio dareação com grupos hidroxila. As ligações covalentes proporcionam uma boaresistência da fibra tingida à lavagem. A durabilidade de cor pode ser aper-feiçoada utilizando fixadores catiônicos.

Durante o processo de tingimento, grandes quantidades de ele-trólitos são necessárias para proteger os corantes aniônicos contra as car-gas aniônicas da fibra. Os corantes não-reagidos (até 40%) precisam serremovidos através de uma etapa de lavagem conhecida como areamento,gerando grandes volumes de efluentes, que também contêm os eletrólitosmencionados acima.

Proporcionar a fibra de celulose com uma carga elétrica positiva,por exemplo, através da incorporação de compostos químicos positivamentecarregados, poderia, portanto, aperfeiçoar a capacidade de coloração defibras de celulose natural, bem como aperfeiçoar qualquer reação químicada fibra de celulose modificada com compostos químicos negativamente car-regados. Também poderia fazer uso de possíveis corantes acídicos.

Diversas publicações descreveram a incorporação ou revesti-mento de oligômeros de quitosana em fibras de celulose para fazer misturasde quitosana/celulose, fios ou tecidos. A quitosana é um polímero positiva-mente carregado de glicosamina, que pode ser obtida por desacetilação dequitina, por exemplo, por tratamentos alcalinos. A própria quitina é um polí-mero de N-acetilglicosamina ligada a β-1-4 (GIcNAc).

O pedido de patente U.S. US2003/0134120 descreve o revesti-mento de fibras naturais com quitosana.

Liu et al. (Carbohydrate Polymers 44(2003) 233-238) descreveum método para revestir fibras de algodão com quitosana, por oxidação dofio de algodão com periodato de potássio a 60°C em água e tratamento sub-seqüente com uma solução de quitosana em ácido acético aquoso. Com orevestimento de quitosana, a superfície de fibra de algodão se torna fisioló-gica e biologicamente ativa. Uma vez que a reatividade química do grupoamina é maior do que o grupo hidroxila de monômeros de celulose, a fibrapossui mais potencial para modificação química adicional. Ademais, a super-fície lisa da fibra de algodão se torna áspera, sugerindo um maior potencialpara absorção de fármaco e liberação controlada desta.

Baseado na função fisiológica de quitosana para inibir, por e-xemplo, dermatófitos, diversas roupas, tecidos e fibras funcionais empregamfibras com mistura de celulose-quitosana, conjugados de fibra de celulose-quitosana e tecidos revestidos com resinas dotadas de quitosana.

WO 00/09729 descreve a expressão de quitina sintase e genesde quitina desacetilase em plantas para alterar a parede celular para usosindustriais e resistência à doença aperfeiçoada. Os usos especificamentecitados são: proporcionar uma única fonte de planta de celulose, quitina equitosana, para aumentar a resistência à tração e aumentar a ruptura frágil.

Os genes de quitina sintase especificamente sugeridos são derivados deorganismos fungosos. Nenhum dado experimental é proporcionado atravésda produção de quitina ou quitosana em plantas, nem através da incorpora-ção desta em paredes celulares de plantas.

A técnica interior, assim, permanece deficiente no desenvolvi-mento de métodos para obter plantas das quais as paredes celulares deplantas, particularmente paredes de célula secundária, tais como, fibras na-turais, podem ser isoladas contendo grupos químicos positivamente carre-gados e/ou grupos químicos que são mais reativos do que os grupos hidroxi-Ia de celulose. A técnica anterior também permanece deficiente no desen-volvimento de fibras que podem ser diretamente colhidas de plantas e quecontêm grupos químicos positivamente carregados e/ou grupos que sãomais reativos do que os grupos hidroxila de celulose, que podem ser direta-mente usados sem a necessidade de tratamento químico adicional para in-troduzir tais grupos químicos. Estes e outros problemas são solucionadoscomo descrito adiante nas diferentes modalidades, exemplos e reivindicações.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Brevemente, em uma modalidade, a invenção proporciona ummétodo para aumentar a quantidade de oligossacarídeos ou polissacarídeospositivamente carregados na parede celular, particularmente na parede decélula secundária de uma célula da planta, que compreende introduzir umgene químico na célula da planta, por meio disto o gene químico compreen-de um promotor exprimível por planta ligado de forma operável a uma regiãode DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase, de preferência,onde a N-acetilglicosamina transferase é marcada nas membranas do apa-relho de Golgi; e uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

Em uma modalidade particular, a planta é algodão, e os oligossacarídeos oupolissacarídeos positivamente carregados são incorporados nas paredes decélula secundária que constituem a fibra de algodão.

Em outra modalidade da invenção, proporciona-se um métodopara aumentar a quantidade de oligossacarídeos ou polissacarídeos positi-vamente carregados na parede celular, particularmente, a parede de célulasecundária de uma célula de planta que compreende introduzir um genequimérico na célula de planta, sendo que o gene quimérico compreende umpromotor exprimível por planta ligado de forma operável a uma região deDNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC; e umaterminação de transcrição e região de poliadenilação. Novamente, em umamodalidade específica, a planta é algodão, e os oligossacarídeos ou polissa-carídeos positivamente carregados são incorporados nas paredes de célulasecundária que constituem a fibra de algodão.

Ainda em outra modalidade da invenção, proporciona-se um mé-todo para aumentar a quantidade de oligossacarídeos ou polissacarídeospositivamente carregados na parede celular, particularmente, a parede decélula secundária de uma célula de planta, sendo que o método compreende

i. introduzir um gene quimérico na célula de planta, sendo que odito gene quimérico compreende os seguintes fragmentos de DNA ligadosde forma operável:

1. um promotor exprimível por planta;

2. uma região de DNA que codifica quitina sintase; e

3. uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

ii. aplicar à célula de planta transgênica uma quantidade eficazde N-acetilglicosamina, glicosamina-6-fosfato, N-acetliglicosamina-6-fosfato,N-acetilglicosamina-1 -fosfato ou UDP-N-acetilglicosamina.

A invenção também proporciona paredes celulares de planta,que compreende uma quantidade aumentada de polissacarídeos ou oligos-sacarídeos, particularmente, oligossacarídeos positivamente carregados, taiscomo, oligo-N acetilglicosaminas ou oligo-glicosaminas, de preferência, oli-gômeros de N-acetilglicosamina ou glicosamina com um grau de polimeriza-ção entre 3 e 10, particularmente, entre 3 e 5. Tais paredes celulares deplanta são obteníveis através dos métodos da invenção. Estas paredes celu-lares de planta podem ser submetidas à modificação química adicional.

Em uma modalidade específica, a invenção proporciona fibrasde algodão que compreendem uma quantidade aumentada dos oligossaca-rídeos positivamente carregados mencionados aqui, e fios, tecidos que com-preendem tais fibras de algodão. As fibras de algodão podem ser usadascomo tais e podem ser submetidas à modificação química adicional, inclusi-ve tingimento. Estas fibras de algodão podem ser identificadas, por exemplo,através de sua ligação aumentada de corantes aniônicos, inclusive vermelhocongo, através de sua ligação aumentada de aglutinina de germe de trigo ouatravés de sua reatividade aumentada com corantes reativos à amina quan-do comparados com fibras de algodão obtidas a partir de plantas de algodãode uma linhagem isogênica que não contém um gene quimérico da N-acetilglicosamina transferase como descrito aqui. A presença e/ou a quanti-dade de oligossacarídeos nas fibras de algodão também pode ser direta-mente determinada através de, por exemplo, cromatografia em camada finade alta eficiência (HPTLC).

Em outra modalidade, a invenção se refere ao uso de uma regi-ão de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase capaz de sermarcada no aparelho de Golgi de uma célula de planta para aumentar aquantidade de oligossacarídeos positivamente carregados na parede de cé-lula de uma célula de planta ou para aumentar a reatividade de paredes ce-lulares de planta para modificações químicas de tais paredes celulares deplanta.A invenção também proporciona genes quiméricos que compre-endem as seguintes regiões de DNA ligadas de forma operável: um promo-tor exprimível por planta; uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase, sendo que a dita N-acetilglicosamina transfe-rase quando expressa em uma célula de planta, é marcada no aparelho deGolgi da dita célula de planta; e uma terminação de transcrição e região depoliadenilação. A N-acetilglicosamina transferase pode ser uma N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC ou também poderia ser uma qui-tina sintase, particularmente, uma quitina sintase que foi ligada de forma o-perável a um sinal de retenção de Golgi.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: alinhamento da seqüência de aminoácido de proteínasNODC diferentes. Os resíduos de aminoácido conservados em todas as pro-teínas estão indicados em negrito. ROT_NODC_RHILP: proteína NODC deRhizobium Ieguminosarum (biovar phaseoli); ROT_NODC_BRAJA: proteínaNODC de Bradyrhizobium japonicum (SEQ ID No..); proteína NODCR0T_N0DC_RHIS3 de Rhizobium sp. (cepa N33); ROT_NODC_RHISN:proteína NODC de Rhizobium sp; ROT_NODC_RHILV: proteína NODC deRhizobium Ieguminosarum (biovar viciae) e ROT_NODC_AZOCA: proteínaNODC de Azorhizobium caulinodans.

Figura 2: alinhamento da seqüência de aminoácido de proteínasNODC diferentes. Os resíduos de aminoácido conservados em todas as pro-teínas estão indicados em negrito. ROT_NODC_BRAJA: proteína NODC deBradyrhizobium japonicum (SEQ ID No..); proteína NODCR0T_N0DC_RHIS3 de Rhizobium sp. (cepa N33); ROT_NODC_RHISN:proteína NODC de Rhizobium sp-, ROT_NODC_RHILV: proteína NODC deRhizobium Ieguminosarum (biovar viciae) e ROT_NODC_AZOCA: proteínaNODC de Azorhizobium caulinodans.

Figura 3: fotografias de microscopia fluorescente realizada emcélulas ciliadas radiculares de células pilosas que contêm o gene quimérico35S::NodC.

Painel A. corte óptico de uma célula ciliada radicular maculadacom Calcoflúor; Β: corte óptico de uma célula ciliada radicular maculada deforma imunoistoquímica na presença de N-acetilglicosamina; C: sobreposi-ção dos cortes ópticos de painel A e painel B.

Figura 4: fotografias de microscopia fluorescente realizada sobrecélulas ciliadas radiculares de células pilosas que contêm o gene quimérico35S::NODC-EGFP.

Painel A. sobreposição dos cortes ópticos de painéis B, C e D.B: Corte óptico de uma célula ciliada radicular maculada com Calcoflúor; C:corte óptico de uma célula ciliada radicular para visualizar o aparelho deGolgi; D: corte óptico de uma célula ciliada radicular que visualiza a fluores-cência através de EGFP.

Figura 5: fotografias de microscopia fluorescente realizada sobrecélulas ciliadas radiculares de células pilosas que contêm o gene quimérico35S::quitina sintase.

Painel A: corte óptico de uma raiz fasciculada cultivada na pre-sença de 50 mM de N-acetilglicosamina, maculada na presença de N-acetílglicosamina; Painel B: corte óptico de uma raiz fasciculada cultivadasem a presença de nenhuma N-acetilglicosamina extra, maculada na pre-sença de N-acetilglicosamina na parede celular.

Figura 6: cromatografia em camada fina de alta eficiência de qui-tooligômeros de material de parede celular isolado de raízes fasciculadasArabidopsis.

As amostras das duas outras vias de acesso (1, 12) são solu-ções padrão de N-acetilglicosamina, quitobiose, quitotriose, quitotetraose equitopentaose. Vias de acesso 2 a 5: material de parede celular extraído deculturas de raiz fasciculada iniciadas por Agrobacterium rhizogenes com umgene quimérico que compreende um promotor CaMV35S ligado a uma regi-ão codificadora nodC; vias de acesso 6 a 9: material de parede celular extra-ído das culturas de raiz fasciculada iniciadas por Agrobacterium rhizogenescom um gene quimérico que compreende um promotor CaMV35S ligado auma região codificadora nodC unida a eGFP; vias de acesso 10 e 11, mate-rial de parede celular extraído das culturas de raiz fasciculada iniciadas porAgrobacterium rhizogenes com um gene quimérico que compreende umpromotor CaMV35S ligado a um região codificadora de fosfinotricina acetil-transferase. TLC foi realizada em acetonitrila (76): água (24): 0,5% de ácidobórico(10).

Figura 7: HPTLC bidimensional sobre o material de parede celu-lar isolado de raízes fasciculadas Arabidopsis que foi submetido à digestãode quitinase.

O material de parede celular de controle (painel esquerdo) foiextraído de culturas de raiz fasciculada iniciadas por Agrobacterium rhizoge-nes com um gene quimérico que compreende um promotor CaMV35S ligadoa uma região codificadora de fosfinotricina acetiltransferase; o material deparede celular experimental (painel direito) foi extraído de culturas de raizfasciculada iniciadas por Agrobacterium rhizogenes com um gene quiméricoque compreende um promotor CaMV35S ligado a uma região codificadoranodC unida a eGFP. Os monômeros sacarídeos (N-acetilglicosamina) e dí-meros quitossacarídeos (quitobiose) podem ser detectados no material ex-perimental, porém não no material de controle. TLC foi realizada em acetoni-trila (76): água (24): 0,5% de ácido bórico (10).

Figura 8: HPTLC do material de parede celular isolado de plan-tas transgênicas Arabidopsis.

Via de acesso 1: solução padrão de quitooligosacarídeos; Lane2 : 0,1 glicosamina; lanes 3 e 4: 4μΙ e 8μΙ, respectivamente de material deparede celular isolado de partes aéreas de Arabidopsis de controle; lanes 5e 6: 4μΙ e 8μΙ, respectivamente de material de parede celular isolado de par-tes aéreas de Arabidopsis transgênica que compreendem um gene quiméri-co CaMV35S::nodC; lanes 7 e 8 : 4μΙ e 8μΙ, respectivamente de material deparede celular isolado de partes aéreas de Arabidopsis transgênica quecompreende um gene quimérico CaMV35S::nodC-eGFP. A linha pontilhadaindica a quantidade aumentada de quitotriose particularmente em vias deacesso 5 e 6.

Figura 9: microscopia de fluorescência de fibras de algodão rea-gidas com aglutinina de germe de trigo (WGA) conjugada com Alexa flúor555.

Painel esquerdo: fibras de algodão de plantas de algodão trans-gênicas que contêm um gene CaMV35S::NodC. Painel direito: fibras de al-godão de plantas de algodão de controle. Sob luz UV1 uma fluorescênciabrilhante pode ser observada nas fibras das plantas de algodão transgêni-cas, indicando a presença de quitooligômeros nestas fibras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES DIFERENTES DAS INVENÇÕES

A presente invenção se baseia na descoberta que a expressãode N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC em células de planta resul-ta na incorporação de oligômeros de N-acetilglicosamina em paredes celula-res de planta. Os oligômeros GIcNAc foram inesperadamente associadosmuito estreitamente com a parede celular e não foram dissolvidos a partirdaquela parede celular através de diversos tratamentos. Surpreendentemen-te, a síntese dos oligômeros GIcNAc não requerem a adição externa de Glc-NAc ao meio de crescimento, conforme foi observado com outras quitinasintases. Além disto e igualmente surpreendente, a proteína NODC tambémfoi estreitamente associada com as membranas do aparelho de Golgi alémda associação com a membrana celular conforme esperado. Quando a N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC foi expressa em plantas de al-godão, os oligômeros GIcNAc foram incorporados nas fibras de algodão,resultando em fibras de algodão mais reativas.

Desta maneira, em uma primeira modalidade da invenção, pro-porciona-se um método para aumentar a quantidade de oligossacarídeospositivamente carregados na parede celular, particularmente, a parede decélula secundária de uma célula de planta, onde o método compreende aetapa de introduzir um gene quimérico na célula de planta, e o gene quiméri-co que compreende os seguintes fragmentos de DNA ligados de forma operável:

- um promotor exprimível por planta

- uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosaminatransferase, onde a N-acetilglicosamina transferase é do tipo NODC; e- uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

A proteína de nodulação C ("proteína NODC") e seu gene decodificação estão envolvidos na síntese dos sinais de lipoquitooligosaccarí-deo ou quitooligômeros acetilados (fatores Nod) que resultam na formaçãode nódulo típica da simbiose entre Rhizobiaceae e plantas leguminosas.

Os produtos de gene nod mais cruciais requeridos para a síntese des-tes lipoquitooligossacarídeos são NODA, NODB e NODC. Na ausência deoutros produtos de gene nod estes podem formar um sinal de núcleo queconsiste em oligômeros de quatro ou cinco resíduos de N-acetilglicosaminaque transportam um grupo acila ligado por Ν. A função de cada uma destasproteínas na síntese de fatores de nodulação é bem-conhecida: NODC éuma N-acetilglicosaminil transferase que produz a cadeia quitooligossacarí-deo; o grupo N-acetil do resíduo de N-acetilglicosamina de não-redução dacadeia quitooligossacarídeo é removido por NODB, que atua como uma qui-tina oligossacarídeo desacetilase; NODA está envolvida na ligação da ca-deia acila ao grupo amina livre gerado pela ação de NODB. Outros fatoresNod, codificados por outros genes nod, proporcionam qualquer um dos gru-pos químicos que discriminam os diferentes fatores de nodulação. Para ospropósitos da presente invenção, apenas as proteínas NODC e genes decodificação são relevantes.

A proteína NODC é uma proteína bem caracterizada (para análi-se veja Kamst and Spaink, 1999, Trends in Glycoscience and Glycotechno-Iogy, 11, pp 187-199). Esta pertence a uma família de proteínas β-polissacarídeo sintase que estão envolvidas na síntese de polissacarídeoslineares que contêm resíduos de monossacarídeo ligados por β. As enzimasque são de forma estrutural mais estreitamente relacionadas com NODC sãotransferases envolvidas na síntese de quitina (N-acetilglicosaminas ligadaspor β-1-4); celulose (o polímero de resíduos de glucose ligados por β-1-4);ácido hialurônico (um copolímero de N-acetilglicosamina e ácido glucurôni-co) e oligossacarídeos de quitina produzidos durante o desenvolvimentoprecoce de embriões de peixe-zebra. Seis regiões curtas conservadas entreestas proteínas podem ser identificadas. Para proteínas NODC, estas se-qüências curtas correspondem a:

1) um resíduo K na posição 23 de SEQ ID No 1 (NODC de Azo-rhizobium caulinodans)]

2) a seqüência DDG na posição 86-88 de SEQ ID No 1

3) a seqüência VDSDT na posição 137-141 de SEQ ID No 1

4) a seqüência GPCAMYR na posição 207-213 de SEQ ID No 1

5) a seqüência GEDRHL na posição 237-242 de SEQ ID No 1; e

6) a seqüência QQLRW na posição 274-278 de SEQ ID No 1

Entretanto, é importante perceber que algumas proteínas NODCou variantes destas podem ocorrer onde uma ou mais das seqüências con-senso mencionadas acima não estão absolutamente conservadas.

As proteínas NODC também são freqüentemente caracterizadaspor estiramentos hidrofóbicos de resíduos de aminoácido que representamdomínios transmembranares (Barney et al. 1996, Molecular Microbiology 19,pp 443-453). O domínio hidrofóbico N-terminal atravessa a membrana bacte-riana em uma orientação N0Ut-Cin, com o domínio hidrofóbico amplo adjacen-te que fica exposto ao citoplasma bacteriano. Esta orientação parece serdependente da presença da(s) região(ões) hidrofóbica(s) próxima(s) à termi-nação C, que contém potencialmente três pares de membrana, de modo quea terminação C de NODC fique normalmente localizada no periplasma bacteriano.

A extensa alça hidrofílica de NODC também possui outra simila-ridade estrutural às regiões similares nas outras β-glicosil transferases. Estaregião foi proposta para constituir um domínio A (que se estende de cerca deresíduo 45 a 140 na seqüência de SEQ ID No 4) que consiste em alternarfolhas-β e α-hélices, e um domínio B (que corresponde a resíduos 215-280de SEQ ID No 4) considerado o responsável pela processividade de NODC.No domínio A, dois resíduos separados são conservados (resíduos 88 e 139de SEQ ID No. 4); no domínio B, um resíduo de aspartato e o motivo QX-XRW (resíduo 240 e 276-280 de SEQ ID No 4) também são conservados econsiderados fundamentais para atividade catalítica.

Quando proteínas NODC diferentes forem comparadas com elasmesmas, as seqüências de aminoácido que estão mais conservadas sãoreveladas. A Figura 1 representa um alinhamento de proteínas NODC dife-rentes de SEQ ID No 1, 2, 8, 4, 7, 5 e indica inúmeros resíduos conservadosentre as proteínas NODC diferentes que incluem (em ordem):

- a seqüência PXVDVIXPXXNE

- a seqüência VDDGSXN

- a seqüência GDXXLDVDSDTXXXXDV

- a seqüência GXXMGQ

- a seqüência DMEYWLACNEERXXQXRFGXVMXCXGXCXMYR

- a seqüência FRTXYXPXAXAXTXVP

- a seqüência YLXQQLRWARSTXRXTXL

- a seqüência QNXGXXLL

- a seqüência RFXFXXXHXXXNXXXLXPLKXYALXT

A Figura 2 representa um alinhamento de um subconjunto deproteínas NODC diferentes, que mostra resíduos ainda mais conservados,tais como:

- a seqüência WLTRLIDMEYWLACNEERXXQXRFGXVMCC-CGPCAMYRRS

- a seqüência LXXYEXQXFXGXPSXFGEDRHLTILMLXAGFRT-XYV PXAXAXTXV P

- a seqüência YLRQQLRWARSTXRDTXLA

O comprimento da cadeia principal de oligossacarídeo em oli-gossacarídeos de Iipoquitina produzidos por Rhizobiaceae diferente variaentre dois e seis resíduos. Foi mostrado que a proteína de nodulação NODCé um determinante importante do comprimento de cadeia de oligossacarídeode quitina na síntese da cadeia quitooligossacarídeo (Kamst et al., 1997,Journal of Bacteriology 179, ρ 2103-2108).

As regiões codificadoras que codificam uma N-acetilglicosaminatransferase do tipo NODC podem ser diretamente obtidas a partir de bacté-rias que pertencem aos gêneros Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium,Mesorhizobium, Ralstonia, Cupriavidus, Streptomyces, Burkholderia ou Sino-rhizobium. Entretanto, ficará imediatamente claro que tais regiões codificado-ras também podem ser feitas sinteticamente, mesmo com uso de códon a-daptado à planta, particularmente a planta produtora de fibra na qual o genequimérico que superexpressa a proteína tipo NODC é introduzido.

As seqüências diferentes de proteínas NODC estão disponíveisjunto aos bancos de dados tais como as seqüências de proteína identifica-das pelos seguintes números de acesso: CAA67139, CAA608779, CA-Α51774, CAA51773, CAA25811, CAA25810, CAA25814, CAA68619, CA-A2350, CAD31533, CAC05896, CAH04369, CAB56055, NP_629203,P26024, P17862, BAB524500, AAX30050, AAX30049, E38180, JQ0396,ZZZRC4, ZZZRCL, A95321, C23766, C26813, NP_659761, NP_443883,NP_106714, NP_768667, NP_435719, BAC47292, AAU11365, AAU11364,AAU11363, AAU11362, AAU11361, AAU11360, AAU11359, AAU11358,AAU11357, AAU11356, AAU11355, AAU11354, AAU11353, AAU11352,AAU11351, AAU11350, AAU114349, AAU11348, AAU11347, AAU11346,AAU11345, AAU11344, AAU11343, AAU11342, AAU11341, AAU11340,AAU11339, AAU11338, AAK65131, AAS91748, P04679_2, P04679_1,P04679, P72334, Q53513, P50357, P04678, P50536, P53417, Q07755,P04341, P04340, P24151, P04677, CAD90588, CAD90587, CAD90586,CAD90585, CAD90584, CAD90583, CAD90257, CAD43933, AAM54775,AAN62903, S34305, S09522, S07304, AAL88670, CAD29957, CAD29956,CAD29955, CAD29954, CAD29953, CAD 29952, CAD29951, CAD29950,CAD29949, CAC42489, AAK53549, AAK53548, AAK50872, AAK39967, A-AK39966, AAK39965, AAK39964, AAK39963, AAK39962, AAK39961, A-AK39960, AAK39959, AAK39958, AAK39957, AAK39956, AAG44125, A-AK00157, AAG60998, AAB71694, AAB16897, AAV80567, AAB95329, BA-A24092, BAA06089, BAA06086, BAA06085, BAA06083, BAA06090, BA-A06082, BAA06087, BAA06088, BAA06084, AAB91695, AAB51164, A-AB47353, AAB34509, AAB24745, 1615305E, 1615305D, 165305C, CA-A26311, CAA26310.CAA3731 ,AAA63602 ou 26226 (incorporados aqui àguisa de referência).

Outras entradas nos bancos de dados UNIPROT que se referemàs proteínas NODC de comprimento total estão resumidas na Tabela 1. To-das as seqüências de aminoácido mencionadas referidas pelo número deacesso estão incorporadas aqui à guisa de referência.

Tabela 1: proteínas NODC de comprimento total

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Entretanto, ficará evidente que variantes de proteínas NODC1onde um ou mais resíduos de aminoácido foram deletados, substituídos ouinseridos, que podem ser deduzidos a partir das seqüências de aminoácidomencionadas acima, também podem ser usadas para atingir o mesmo efeitonos métodos de acordo com a invenção, ficando estabelecido que a ativida-de enzimática não foi alterada. Estas proteínas NODC variantes podem pos-suir cerca de 95% de identidade de seqüência com qualquer uma das prote-ínas NODC mencionadas aqui. Um método para determinar atividade enzi-mática de proteínas NODC in vitro foi descrito, por exemplo, por Kamst et al.,1997 Journal of Bacteriology, 179, p2103-2108.

Desta maneira, como usado aqui, uma "N-acetilglicosaminatransferase que é do tipo NODC" é uma N-açetilglicosamina transferase quecatalisa a transferência da porção GIcNAc de UDP-GIcNAc até um oligossa-carídeo de quitina nascente. De preferência, a proteína contém as regiõesconservadas que podem ser encontradas ao comparar as diferentes proteí-nas NODC.

As proteínas particularmente adequadas para os métodos estãolistadas na SEQ ID No 1 a SEQ ID No 9, particularmente a proteína listadana SEQ ID No 1, e os fragmentos de DNA que codificam tal proteína.

Foi observado (ver seção experimental) que as proteínas NODCquando expressas em células de plantas estão co-localizadas com as mem-branas do aparelho de Golgi, além da co-localização com o plasmalema.

Para chegar na incorporação de quitooligossacarídeos na parede celular deplanta, nenhuma alimentação com GIcNAc é requerida. Entretanto, quandoas quitina sintases de origem fungosa forem usadas, estas proteínas nãoestão co-localizadas com as membranas do aparelho de Golgi, e alimenta-ção com GIcNAc é requerida para chegar na incorporação significativa dequitooligossacarídeos nas paredes celulares. Sem a intenção de limitar ainvenção a um modo particular de ação, acredita-se que os domínios detransposição de transmembrana de proteínas NODC podem ser mais apro-priados para inserção nas membranas do aparelho de Golgi do que aquelesdo plasmalema e que a localização destas proteínas envolve a necessidadede alimentação externa com GIcNAc. A modificação de proteínas quitina sin-tase, tal como uma quitina sintase de origem fungosa, por exemplo, umaquitina sintase de Neurospora crassa, para relocalizar as quitina sintasesnas membranas do aparelho de Golgi é suficiente para abolir a necessidadede alimentação externa com GIcNAc. Tal relocalização foi obtida ao ligar aproteína quitina sintase a um peptídeo âncora sinal que marca a proteínaligada em membranas do aparelho de Golgi.

Desta maneira, em outra modalidade da invenção, proporciona-se um método para aumentar a quantidade de oligossacarídeos positiva-mente carregados na parede celular, particularmente a parede de célula se-cundária de uma célula de planta, que compreende a etapa de introduzir umgene quimérico na célula de planta, sendo que o dito gene quimérico com-preende

- um promotor exprimível por planta

- uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosaminatransferase, onde a N-acetilglicosamina transferase é marcada nas membra-nas do aparelho de Golgi; e

- uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

Como usado aqui, a N-acetilglicosamina transferase não se limi-ta às proteínas tipo NODC, porém também inclui quitina sintases (QuitinaUDP-acetil-glicosaminil transferases), tais como as quitina sintases de ori-gem fungosa. Exemplos de seqüências de aminoácido de tais quitina sinta-ses podem ser encontrados nos diferentes bancos de dados que incluem asseqüências de aminoácido com os seguintes identificadores (números deacesso): CHS1_AJECA (P30576) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (quitina sintase 1 de Classe-I) de Ajel-Iomyces capsulata (Histoplasma capsulatum); CHS1_AJEDE (P30579) Qui-tina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1)(quitina sintase 1 de Classe-I) de Ajellomyces dermatitidis (Blastomycesdermatitidis); CHS1_ASPNG (P30581) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Qui-tina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (quitina sintase 1 de Classe-I) deAspergillus niger; CHS1_B0TCI (P49603) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16)(Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (quitina sintase 1 de Classe-I)de Botrytis cinerea (fungo da podridão nobre) (Botryotinia fuckeliana);CHS1_CANAL (P23316) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) de Candida albicans (Levedura); CHS1_CRYNV(013356) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminiltransferase 1) (quitina sintase 1 de Classe-IV). {GENE: Nome=CHSI} - Cryp-tococcus neoformans var. grubii (Filobasidiella neoformans var. grubii);

CHS1_EMENI (P30583) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (quitina sintase 1 de Classe-I) (Fragmento). {GE-NE: Nome=ChsI} - Emericella nidulans (Aspergillus nidulans);CHS1_EX0DE (P30600) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (quitina sintase 1 de Classe-ll). {GENE: No-me=CHS1} - Exophiala dermatitidis (Wangiella dermatitidis); CHS1_EX0JE(P30585) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminiltransferase 1) (Quitina sintase 1 de Classe-I) (Fragmento). {GENE: No-me=CHS1} - Exophiala jeanselmei; CHS1_NEUCR (P29070) Quitina sintase1 (EC 2.4.1.16) (Quitína-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (quitina sinta-se 3 de Classe-lll). {GENE: Nome=chs-1; ORFNomes=B11 H24.170,NCU03611.1} - Neurospora crassa ; CHS1_PHAEX (P30590); Quitina sinta-se 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (Fragmen-to). {GENE: Nome=CHSI} - Phaeococcomyces exophialae; CHS1_PHYBL(P87073) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminiltransferase 1) (Quitina sintase 1 de Classe-ll). {GENE: Nome=chs1} - Phy-comyces blakesleeanus; CHS1_RHIAT (P30592) Quitina sintase 1 (EC2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (Quitina sintase 1 deClasse-I) (Fragmento). {GENE: Nome=CHSI} - Rhinocladiella atrovirens;CHS1_RHI0L (P30594) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1). {GENE: Nome=CHSI} - Rhizopus oligosporus;CHS1_RHIRA (Q12632) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (Quitina sintase 1 de Classe-ll). {GENE: No-me=CHS1} - Rhizomucor racemosus (Mucor circinelloides f. lusitanicus);CHS1_SCHC0 (P30596); Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP ace-til-glicosaminil transferase 1) (Fragmento). {GENE: Nome=CHSI} - Schizo-phyllum commune (fungo Bracket); CHS1_SCHP0 (P30597) Quitina sintase1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1). {GENE: No-me=chs1; ORFNomes=SPACI3G6.12c, SPAC24B11.01c} - Schizosaccha-romyces pombe (levedura de fissão); CHS1_TUBUN (P55003) Quitina sinta-se 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (Fragmen-to). {GENE: Nome=CHSI} - Tuber uncinatum (Burgundy truffle);

CHS1JJSTMA (P30598) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (Fragmento). {GENE: Nome=CHSI} - Ustilagomaydis (fungo Smut); CHS1_XYLBA (P30603) Quitina sintase 1 (EC2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1) (Fragmento). {GE-NE: Nome=CHSI} - Xylohypha bantiana; CHS1_YEAST (P08004) Quitinasintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1). {GE-NE: Nome=CHSI; Saccharomyces cerevisiae (levedura de Baker);CHS2_AJECA (P30577) Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quitina sintase 2 de Classe-III) Ajellomyces cap-sulata (Histoplasma capsulatum); CHS2_AJEDE (P30580) Quitina sintase 2(EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quitina sintase2 de Classe-ll) {GENE: Nome=CHS2} - Ajellomyces dermatitidis (Blastomy-ces dermatitidis) CHS2_ASPNG (P30582); Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16)(Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quitina sintase 2 de Classe-ll) (Fragmento). {GENE: Nome=chs2} - Aspergillus niger; CHS2_CANAL(P30572) Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminiltransferase 2). {GENE: Nome=CHS2} - Candida albicans (Levedura);CHS2 EXODE (P30601) Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quitina sintase 2 de Classe-I). {GENE: No-me=CHS2} - Exophiala dermatitidis (Wangiella dermatitidis); CHS2_EX0JE(P30586) Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminiltransferase 2) (Fragmento). {GENE: Nome=CHS2} - Exophiala jeanselmei;CHS2JMEUCR (P30589) ; Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP ace-til-glicosaminil transferase 2). {GENE: Nome=chs-2; ORFNo-mes=NCU05239.1} - Neurospora crassa ; CHS2_PARBR (Q92444) Quitinasintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quiti-na sintase 2 de Classe-ll). {GENE: Nome=CHS2} - Paracoccidioides brasili-ensis; CHS2_PHAEX (P30591); Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quitina sintase 2 de Classe-II) (Frag-mento). {GENE: Nome=CHS2} - Phaeococcomyces exophialae;CHS2_RHIAT (P30593) Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quitina sintase 2 de Classe-lll) (Fragmento).

{GENE: Nome=CHS2} - Rhinocladiella atrovirens; CHS2_RHI0L (P30595)Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase2). {GENE: Nome=CHS2} - Rhizopus oligosporus; CHS2_SCHP0 (074756)proteína 2 tipo quitina sintase. {GENE: Nome=chs2; ORF No-mes=SPBC1709.01, SPBC1734.17} - Schizosaccharomyces pombe (levedu-ra de fissão); CHS2JJSTMA (P30599) Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Qui-tina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (Fragmento). {GENE: No-me=CHS2} - Ustilago maydis (fungo Smut); CHS2_XYLBA (P30604) Quitinasintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2) (quiti-na sintase 2 de Classe-ll) (Fragmento). {GENE: Nome=CHS2} - Xylohyphabantiana ; CHS2_YEAST (P14180); Quitina sintase 2 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2). {GENE: Nome=CHS2; OrderedLo-cusNomes=YBR038W; ORF Nomes=YBR0407} - Saccharomyces cerevisiae(levedura de Baker); CHS3_AJECA (P30578) Quitina sintase 3 (EC 2.4.1.16)(Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 3) (quitina sintase 3 de Classe-II) (Fragmento). {GENE: Nóme=CHS3} - Ajellomyces capsulata (Histoplasmacapsulatum); CHS3_CANAL (P30573) Quitina sintase 3 (EC 2.4.1.16) (Quiti-na-UDP acetil-glicosaminil transferase 3) (quitina sintase 3 de Classe-IV).{GENE: Nome=CHS3} - Candida albicans (Levedura); CHS3_EX0DE(P30602) Quitina sintase 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminiltransferase 3) (quitina sintase 3 de Classe-lll). {GENE: Nome=CHS3} - Exo-phiala dermatitidis (Wangiella dermatitidis); CHS3_EX0JE (P30587); Quitinasintase 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 3) (quiti-na sintase 3 de Classe-lll) (Fragmento). {GENE: Nome=CHS3} - Exophialajeanselmei; CHS3_NEUCR (P30588) Quitina sintase 3 (EC 2.4.1.16) (Quiti-na-UDP acetil-glicosaminil transferase 3). {GENE: Nome=chs-3; ORFNo-mes=G65A3.040} - Neurospora crassa; CHS3_YEAST (P29465) Quitina sin-tase 3 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 3) (quitinasintase 3 de Classe-IV). {GENE: Nome=CHS3; Sinônimos=CAL1, CSD2,DIT101, KIT2; Ordered Locus Nomes=YBR023C; ORFNomes=YBR0305} -Saccharomyces eerevisiae (levedura de Baker); CHS4_MAGGR (013353);

Quitina sintase 4 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase4) (quitina sintase 4 de Classe-IV). {GENE: Nome=CHS4} - Magnaporthegrisea (fungo Riee blast) (Pyricularia grisea); CHS4_NEUCR (Q01285) Quiti-na sintase 4 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase 4)(quitina sintase 4 de Classe-IV). {GENE: Nome=chs-4; ORFNo-mes=NCU09324.1} - Neurospora crassa; CHS5_USTMA (013394) Quitinasintase 5 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase 5) (quiti-na sintase 5 de Classe-IV). {GENE: Nome=CHS5} - Ustilago maydis (Smutfungus); CHS6JJSTMA (013395) Quitina sintase 6 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase 6) (quitina sintase 6 de Classe-V). {GE-NE: Nome=CHS6} - Ustilago maydis (Smut fungus); CHSA_AMPQU(Q12564); Quitina sintase A (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminiltransferase A) (quitina sintase A de Classe-I). {GENE: Nome=CHSAJ - Am-pelomyces quisqualis; CHSA_EMENI (P30584) Quitina sintase A (EC2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase A) (quitina sintase A deClasse-ll). {GENE: Nome=ChsA; Synonyms=chs2} - Emericella nidulans (As-pergillus nidulans); CHSB_EMENI (Q00757) Quitina sintase B (EC 2.4.1.16)(Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase B) (quitina sintase B de Classe-III). {GENE: Nome=chsB} - Emerieella nidulans (Aspergillus nidulans);CHSC_ASPFU (Q92197) Quitina sintase C (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aee-til-glieosaminil transferase C) (quitina sintase C de Classe-lll). {GENE: No-me=chsC} - Aspergillus fumigatus (Sartorya fumigata); CHSD_ASPFU(P78746) Quitina sintase D (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminiltransferase D) (quitina sintase D de Classe-VI). {GENE: Nome=ChsDJ - As-pergillus fumigatus (Sartorya fumigata); CHSD_EMENI (P78611) Quitina sin-tase D (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase D) (quitinasintase D de Classe-V). {GENE: Nome=ChsD; Sinonimos=ChsEJ - Emericellanidulans (Aspergillus nidulans); CHSG_ASPFU (P54267); Quitina sintase G(EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP aeetil-glieosaminil transferase G) (quitina sintaseG de Classe-lll). {GENE: Nome=chsG} - Aspergillus fumigatus (Sartorya fu-migata); CHSX_USTMA (Q99126) Quitina sintase 1 (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 1). {GENE: Nome=CHSI} - Ustilagomaydis (fungo Smut); CHSY_USTMA (Q99127) Quitina sintase 2 (EC2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase 2). {GENE: No-me=CHS2} - Ustilago maydis (Smut fungus) ou CHS_SAPMO (P48017) Qui-tina sintase (EC 2.4.1.16) (Quitina-UDP acetil-glicosaminil transferase).{GENE: Nome=CHSJ - Saprolegnia monoica. Todas as seqüências estãoincorporadas aqui à guisa de referência.

As quitina sintases deveriam ser, de preferência, equipadas comseqüências âncora sinal (heterólogas) que marcam a quitina sintase nasmembranas do aparelho de Golgi. Tais seqüências são conhecidas na técni-ca, incluindo as seqüências dentro e adjacentes ao segmento de transmem-brana de a-2,6-sialiltransferase (particularmente, os primeiros 44 ou 52 ami-noácidos destas; Munro et al. 1991, EMBO Journal, 10: 3577-3588); a se-qüência âncora sinal de galactosil transferase humana (particularmente, osprimeiros 60 aminoácidos destas) ou a seqüência âncora sinal do homólogoArabidopsis do receptor (AtERD2) de levedura HDEL (Saint-Jore et al., 2002,The Plant Journal, 29: 661-678), a seqüência âncora sinal de proteína β1,2-xilosiltransferase (particularmente, os primeiros 36 aminoácidos desta;Pagny et al., 2003, The Plant Journal 33: 189-203) ou as seqüências âncorasinal de N-acetil-glicosaminil transferase I (particularmente, os primeiros 77aminoácidos destas; Essl et al. 1999, FEBS Lett. 453:169-173) (toda a publi-cação está incorporada aqui à guisa de referência). Outros sinais de marca-ção de Golgi que serão empregados por fusão na terminação C da N-acetilglicosamina transferase incluem a seqüência de aminoácido "YYHDL"como pode ser encontrado na proteína DAGAT1 Arabidopsis ou "LKLEI"como pode ser encontrado em DAGAT2Arabidopsis. A fusão de tais se-qüências âncora sinal com quitina sintases ao ligar fragmentos de DNA quecodificam os respectivos polipeptídeos pode ser obtida utilizando técnicasDNA recombinante padrão. N-acetiiglicosamina transferases do tipo NODCtambém pode ser ligada de forma operável a seqüências âncora sinal quemarcam o aparelho de Golgi.

Em outra modalidade da invenção, proporciona-se um métodopara aumentar a quantidade de oligossacarídeos positivamente carregadosna parede celular, particularmente a parede de célula secundária de umacélula de planta, que compreende a etapa de introduzir um gene quiméricona célula de planta, onde o gene quimérico compreende os seguintes frag-mentos de DNA ligados de forma operável

- um promotor exprimível por planta;

- uma região de DNA que codifica quitina sintase (quitina UDP-acetilglucosamine transferase), de preferência, de origem fungosa; e

- uma terminação de transcrição e região de poliadenilação

e compreende adicionalmente a etapa de aplicar uma quantidade eficaz deN-acetilglicosamina ou N-acetilglicosamina-1 -fosfato ou N-acetilglicosamina-6-fosfato ou glicosamina-6-fosfato à célula de planta ou à planta.

Os genes quiméricos de acordo com a invenção compreendemum promotor exprimível por planta. Como usado aqui, o termo "promotor" serefere a qualquer DNA que é reconhecido e ligado (direta ou indiretamente)através de um RNA-polimerase dependente de DNA durante o início detranscrição. Um promotor inclui o sítio de início de transcrição, e sítios deligação para fatores de início de transcrição e RNA polimerase, e pode com-preender diversos outros sítios (por exemplo, intensificadores), onde as pro-teínas reguladoras de expressão podem se ligar.

Como usado aqui, o termo "promotor exprimível por planta" serefere a uma seqüência de DNA que é capaz de controlar (iniciar) a transcri-ção em uma célula de planta. Esta inclui qualquer promotor de origem deplanta, porém também qualquer promotor de origem de não-planta que écapaz de conduzir a transcrição em uma célula de planta, ou seja, certospromotores de origem viral ou bacteriana, tais como, CaMV35S, o promotorde vírus trevo-subterrâneo No 4 ou No 7, ou promotores de gene T-DNA esimilares.

Um promotor exprimível por planta que controla o início e manu-tenção de transcrição, de preferência, em células de fibras é um promotorque conduz a transcrição da região de DNA ligada de forma operável até umnível maior em células de fibras e nas células da epiderme subjacentes doque em outras células ou tecidos da planta. Tais promotores incluem o pro-motor de algodão a partir de um gene da tubulina-β específico de fibra (comodescrito em W00210377), o promotor de algodão de um gene actina especí-fico de fibra (como descrito em W00210413), o promotor de um gene deproteína de transferência de lipídeo específico de fibra de algodão (comodescrito em US5792933), um promotor de um gene expansina de algodão(W09830698) ou um promotor de um gene quitinase em algodão(US2003106097) ou os promotores dos genes específicos de fibra descritosem US6259003 ou US6166294.

A invenção proporciona adicionalmente paredes celulares deplanta, que compreendem fibras que incluem tais paredes celulares obtidasde células de plantas que utilizam os métodos de acordo com a invenção.

Tais paredes celulares de planta compreendem oligo ou polissacarídeos po-sitivamente carregados, tais como oligômeros de N-acetilglicosamina ou qui-tina, embutidos na celulose. Estas paredes celulares de planta podem seradicionalmente modificadas, por exemplo, parcial ou completamente desace-tiladas de modo que os oligômeros que compreendem resíduos de glicosa-mina sejam obtidos. O grupo amina das glicosaminas resultantes é quimí-camente mais reativo do que o grupo aminoacetil de N-acetilglicosamina ouo grupo hidroxila de celulose.

A parede celular de planta obtida de acordo com a invenção,particularmente aquelas que foram submetidas a uma etapa de desacetila-ção, pode ser, de forma adicional, quimicamente modificada. Os produtosque contêm tais paredes celulares de planta, tais como fibras, fios ou tecidospossuem qualidades que parecem aquelas das misturas de celulose-quitosana descritas na técnica, inclusive durabilidade de cor aperfeiçoada,inibição aperfeiçoada, por exemplo, de dermatófitos, liberação de fármacocontrolada etc.

Em uma modalidade específica, a invenção proporciona fibrasde algodão obtidas de ou que podem ser obtidas de plantas de algodão deacordo com os métodos da invenção. Em outras palavras, as fibras de algo-dão são proporcionadas de plantas de algodão que compreendem no geno-ma, tal como o genoma nuclear, de suas células um gene quimérico quecompreende um promotor exprimível por planta ligado de forma operável auma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase, ondea N-acetilglicosamina transferase é marcada nas membranas do aparelho deGolgi ou as fibras de algodão são proporcionadas de plantas de algodão quecompreendem no genoma, tal como o genoma nuclear, de suas células umgene quimérico que compreende um promotor exprimível por planta ligadode forma operável a uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC, ou as fibras de algodão sãoproporcionadas de plantas de algodão que compreendem no genoma, talcomo o genoma nuclear, de suas células um gene quimérico que compreen-de um promotor exprimível por planta ligado de forma operável a uma regiãode DNA que codifica uma quitina sintase. Particularmente, no último caso,pode ser vantajoso aplicar nas células de planta ou plantas uma quantidadeeficaz de N-acetilglicosamina ou N-acetilglicosamina-1 -fosfato ou N-acetilglicosamina-6-fosfato ou glicosamina-6-fosfato. As modalidades parti-culares de regiões codificadoras de DNA ou promotores compreendidos nosgenes quiméricos transferidos em plantas de algodão são conforme descritoem outro lugar neste documento.

As fibras de algodão de acordo com a invenção podem ser dis-tinguidas de fibras naturalmente ocorrentes, ou seja, fibras de algodão obti-das de uma linhagem isogênica que não compreende um gene quimérico deacordo com a invenção, através da capacidade de tais fibras com coloraçãoaumentada com corantes aniônicos (inclusive, por exemplo, Vermelho Con-go), através da capacidade de tais fibras com coloração aumentada comcorantes reativos à amina (inclusive, por exemplo, tetrafluorofenil éster). Asfibras de algodão de acordo com a invenção também possuem a capacidadede ligação de aglutinina de germe de trigo que liga quitooligômeros. As fibrasde algodão de acordo com a invenção também podem ser distinguidas defibras naturalmente ocorrentes por detecção direta dos oligômeros de N-acetilglicosamina e GIcNAc, tal como quitobiose, de preferência, após o tra-tamento do material de parede celular de fibra com quitinase. As fibras dealgodão de acordo com a invenção também podem ser distinguidas por seuteor de nitrogênio aumentado.

As fibras de algodão de acordo com a invenção também podemser distinguidas das fibras revestidas com quitosana ou de fios misturadoscom quitosana/celulose, já que os oligômeros positivamente carregados sãomais ou menos uniformemente distribuídos nas paredes celulares de plantasecundária que constituem as fibras. Conseqüentemente, em cortes micros-cópicos de fibras de algodão, maculadas, por exemplo, com WGA ou comvermelho congo ou com tetrafluorofenila como descrito a seguir, os corantesserão distribuídos mais ou menos uniformemente por todas as paredes celu-lares que constituem as fibras de algodão, enquanto que em fibras revesti-das com quitosana, a coloração ficará concentrada na camada de quitosanalocalizada como uma folha na superfície das fibras tratadas.

As fibras de algodão de acordo com a invenção também podemser distinguidas de outras fibras de algodão por detecção da N-acetilglicosamina transferase que compreende genes quiméricos em ácidosnucléicos que permanecem no material de planta associado com fibras dealgodão.

A coloração aumentada do material de parede celular de plantade acordo com a invenção, através de corantes aniônicos tal como verme-Iho-congo pode ser quantificada, por exemplo, ao tingir uma quantidade uni-forme de material sob condições padrão, ao distribuir o material sobre umaárea padronizada (tal como uma cavidade em uma placa com múltiplas cavi-dades) digitalizando uma foto da área na escala de cinza da camada tingidade material. Quanto menos cinza, mais tingido ficará o material de paredecelular de planta. Desta maneira, as fibras de algodão e material de paredecelular de acordo com a invenção mostraram um aumento de pelo menoscerca de 5% na coloração por vermelho-congo comparado com o material deparede celular de controle ou fibras de linhagens isogênicas de planta semum gene codificador de N-acetilglicosamina transferase.A capacidade de as novas fibras de algodão ligarem especifica-mente aglutinina de germe de trigo (detectável pelo grupo flurofórico acopla-do) é uma característica de diferenciação visível das novas fibras de algodãoproporcionadas através das fibras de algodão naturalmente ocorrentes. Ex-ceto em uma fluorescência de fundo muito baixa, as fibras naturalmente o-correntes não maculam/produzem fluorescência quando tratadas com WGA-alexa flúor 488 ou 555. A fluorescência de fibras de algodão aumenta nomínimo 5 vezes quando quitooligômeros estiverem presentes. Consequen-temente, a invenção proporciona fibras de algodão que são capazes de ligarespecificamente aglutinina de germe de trigo, ou WGA acoplado a um fluoró-foro, tal como WGA Alexa 488 ou WGA Alexa 555 ou que, quando tratadascom WGA Alexa 488 ou WGA Alexa 555 proporcionam uma fluorescênciabrilhante sob luz UV. Esta fluorescência não se restringe à superfície da fibrade algodão, porém é distribuída por toda a parede celular das células de fibra.

O material de parede celular de planta de acordo com a inven-ção, que inclui fibras de algodão possui tipicamente quitooligosacarídeos emuma concentração de pelo menos 0,1 Mg/mg de material de parede celular,de preferência, pelo menos 1 pg/mg de material de parede celular, de prefe-rência, pelo menos 5 pg/mg de material de parede celular.

A invenção também proporciona os genes quiméricos conformedescrito aqui, e células de planta ou plantas que contêm tais genes quiméricos.

Quando os métodos da invenção se referirem à introdução deum gene quimérico em uma célula de planta, ficará claro que tais métodostambém podem ser aplicados em casos onde a célula de planta está incor-porada em uma planta madura. Por exemplo, as células transgênicas podemser regeneradas em plantas transgênicas de acordo com métodos estabelecidos.

Os métodos para transformar células de plantas e plantas sãobem-conhecidos na técnica. Os métodos para transformar plantas de algo-dão também são bem-conhecidos na técnica. A transformação mediada poragrobacterium de algodão foi descrita, por exemplo, na patente U.S.5.004.863 ou na patente U.S. 6.483.013 e a transformação de algodão porbombardeio de partículas está divulgada, por exemplo, em WO 92/15675.

Os genes quiméricos podem ser introduzidos por transformaçãoem plantas de algodão das quais calos embriogênicos podem ser derivados,tais como, Coker 312, Coker310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, FiberMax819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991, AcalaGC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa,Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, AcalaB5002, non Acala "picker" Siokra, variedade de "extrator" FC2017, Coker315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77,DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1,CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1,CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2,CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICA-LA, PIMA S6 and ORO BLANCO ΡΙΜΑ, Fibermax® FM5013, FM5015,FM5017, FM989, FM832, FM966 and FM958, FM989, FM958, FM832,FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM5035, FM5044,FM5045, FM5013, FM5015, FM5017 ou FM5024 e plantas com genótiposderivados destes.

"Algodão" como usado aqui inclui Gossypium hirsutum, Gossy-pium barbadense, Gossypium arboreum e Gossypium herbaceum ou progê-nie de cruzamentos entre tais espécies.

Os métodos e meios da presente invenção também podem serempregados em outras espécies de plantas, tais como, cânhamo, juta, Iinhoe plantas lenhosas, inclusive, porém sem caráter limitativo, Pinus spp., Po-puius spp., Picea spp., Eucalyptus spp. etc.

A planta transformada obtida pode ser usada em um esquemade cultivo convencional para produzir mais plantas transformadas com asmesmas características ou para introduzir os genes quiméricos de acordocom a invenção em outras variedades das mesmas espécies de planta ouespécies relacionadas, ou em plantas híbridas. As sementes obtidas dasplantas transformadas contêm os genes quiméricos da invenção como uminserto genômico estável e também são abrangidas pela invenção.

Como usado aqui, "compreende" deve ser interpretado para es-pecificar a presença das características, números inteiros, etapas ou com-ponentes estabelecidos como referido, porém não exclui a presença ou adi-ção de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componen-tes, ou grupos destes. Desta maneira, por exemplo, um ácido nucléico ouproteína que compreende uma seqüência de nucleotídeos ou aminoácidospode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles real-mente citados, ou seja, abrangidos em um ácido nucléico ou proteína maior.

Um gene quimérico que compreende uma região de DNA, que é definido deforma funcional ou estrutural, pode compreender regiões de DNA adicionais etc.

Os seguintes Exemplos não-limitativos descrevem os métodospara alterar as paredes celulares de planta. Salvo determinação em contrárionos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas deacordo com os protocolos padrão como descrito em Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY and in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Cur-rent Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais emétodos padrão para trabalho molecular em plantas estão descritos emPlant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, juntamente publica-do por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, UK.

Durante a descrição e Exemplos, faz-se referência às seguintesseqüências representadas na listagem de seqüência:

SEQ ID No 1: Proteína de nodulação C de Azorhizobium cauli-nodans

SEQ ID No 2: Proteína de nodulação C de Bradyrhizobium japo-nicum

SEQ ID No 3: Proteína de nodulação C de Rhizobium galegaeSEQ ID No 4: Proteína de nodulação C de Rhizobium Iegumino-sarum (biovar viciae)

SEQ ID No 5: Proteína de nodulação C de Rhizobium meliiotiSEQ ID No 6: Proteína de nodulação C de Rhizobium tropiciSEQ ID No 7: Proteína de nodulação C de Rhizobium Iegumino-sarum (biovar phaseoli)

SEQ ID No 8: Proteína de nodulação de Rhizobium sp. Cepa N33

SEQ ID No 9: Proteína de nodulação de Rhizobium Ioti

SEQ ID No 10: T-DNA de pTGK42

SEQ ID No 11: T-DNA de pTGK44SEQ ID No 12: T-DNA de pTDBI5SEQ ID No 13: T-DNA de pTDBI37SEQ ID No 14: T-DNA de pTDBI50SEQ ID No 15: Quitina sintase sintética ligada a sinal de marca-ção de Golgi.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construção de genes quiméricos exprimíveis por planta que co-dificam uma proteína N-acetilglicosamina transferase.

Ao utilizar técnicas de DNA recombinante padrão, um gene qui-mérico de NODC exprimível por planta foi construído contendo os seguintesfragmentos de DNA ligados de forma operável:

• uma região de promotor 35S de CaMV

• um fragmento de DNA que codifica uma seqüência líder não-traduzida (5'Cab22L)

• um fragmento de DNA que codifica NODC de Azorhizobiumcaulinodans

• um fragmento de DNA de EGFP (proteína verde fluorescenteaumentada) clonado em construção com ORF de codificação de NODC, demodo que uma proteína de fusão seja formada compreendendo NODC eEGFP

• uma terminação de transcrição e sinal de poliadenilação datranscrição 35S de CaMV (3' 35S)

O gene quimérico foi introduzido entre as margens de T-DNA deum vetor de T-DNA juntamente com um gene bar quimérico que proporcionaresistência à fosfinotricina. O vetor de T-DNA resultante foi nomeadopTGK44. A seqüência do T-DNA deste vetor é proporcionada na SEQ ID No11. Este vetor de T-DNA permitiu a análise histoquímica da localização daproteína de fusão NODC-EGFP.

Outro gene quimérico foi construído contendo os seguintesfragmentos de DNA ligados de forma operável:

• uma região de promotor 35S de CaMV

• um fragmento de DNA que codifica uma seqüência líder não-traduzida (5'Cab22L)

• um fragmento de DNA que codifica NODC de Azorhizobiumcaulinodans

• uma terminação de transcrição e sinal de poliadenilação datranscrição 35S de CaMV (3' 35S)

O gene quimérico foi introduzido entre as margens de T-DNA deum vetor de T-DNA juntamente com um gene bar quimérico que proporcionaresistência à fosfinotricina. O vetor de T-DNA resultante foi nomeadopTGK42. A seqüência do T-DNA deste vetor é proporcionada na SEQ ID N910. Este vetor de T-DNA permitiu expressar NODC em células de plantas,analisar se quitooligossacarídeos foram produzidos associados à paredecelular de tais células de plantas.

Um gene quimérico de controle que codifica uma N-acetilglicosamina transferase que é diferente da proteína do tipo NODC tam-bém foi construído contendo os seguintes fragmentos de DNA ligados deforma operável:

• uma região de promotor 35S de CaMV

• um fragmento de DNA que codifica uma seqüência líder não-traduzida (5'Cab22L)

• um fragmento de DNA que codifica quitina sintase de Neuros-pora crassa• uma terminação de transcrição e sinal de poliadenilação datranscrição 35S de CaMV (31 35S)

O gene quimérico foi introduzido entre as margens de T-DNA deum vetor de T-DNA juntamente com um gene bar quimérico que proporcionaresistência à fosfinotricina. O vetor de T-DNA resultante foi nomeadopTGK43. A seqüência do T-DNA deste vetor é proporcionada na SEQ ID No12. Este vetor de T-DNA permitiu expressar quitina sintase em células deplantas, analisar se quitooligossacarídeos foram produzidos associados àparede celular de tais células de plantas.

Os vetores de T-DNA foram introduzidos em Agrobacterium tu-mefaciens C58C1Rif(pEHA101). Para experimentos de controle, um vetor deT-DNA que contém apenas um gene bar quimérico foi introduzido na mesmacepa de Agrobacterium.

As cepas de A. tumefaciens foram subseqüentemente usadaspara gerar culturas de raiz fasciculada de Arabidopsis thaliana por co-transformação de discos foliares com Agrobacterium rhizogenesATCC15834 e as cepas de A. tumefaciens que transportam os diferentesvetores de T-DNA de acordo com o seguinte protocolo.

Os seguintes meios foram usados:

meio de germinação: sais MS/2,vitaminas B5, 1,5% de sacarose,pH 5,8, 0,7% de ágar (Difco)

meio padrão: meio MS, 0,5 g/L de MES, 2% de glucose, pH 5,8,0,7% de ágar (Difco)

meio de indução de calo: meio MS, 0,5 g/L de MES, 2% de glu-cose, pH 5,8, 0,7% de ágar (Difco), 0,2 mg/L 2,4D e 0,2 mg/L de quinetina

meio de prolongamento de raiz fasciculada: meio MS, 2% desacarose, pH 6,2, 0,7% de ágar (Difco)

meio de cultura de raiz: meio B5, 3% de sacarose, pH 5,5.

As partes aéreas de Arabidopsis in vitro foram cultivadas a partirde sementes esterilizadas da seguinte maneira.

As sementes foram tratadas durante 2 minutos com 70% de E-tOH, seguidas por um branqueamento de 10 minutos com 6% de clorina ati-va + 0,05% de Tween 20, e 5 lavagens com água de torneira estéril. As se-mentes foram pré-germinadas na luz (30-50 pEinstein m-2 sec-1) durante 24horas a 24°C em água de torneira estéril (cerca de 10-12mL de água de tor-neira em Placa de Petri Falcon Optilux de 9 cm, nr. 1005).

As sementes pré-germinadas foram colocadas em meio de ger-minação e permitidas para se desenvolver com o seguinte regime de luz: 12horas na luz/12 horas no escuro ou 16 horas na luz/8 horas no escuro (30-50pEinstein m-2 sec-1) a 23 a 24°C durante cerca de 2 a 3 semanas. As cepasde A. rhizogenes se desenvolveram em placas de ágar com meio YEB, en-quanto as cepas de A. tumefaciens se desenvolveram em placas de ágarcom meio minA suplementado com antibióticos apropriados para selecionara manutenção do vetor de T-DNA.

Para transformação, as folhas foram cortadas em duas metadese colocadas em meio de indução de calo. As bactérias A. rhizogenes e A.tumefaciens foram ressuspensas em meio padrão para obter OD6OO de cer-ca de 0,2 a 0,3, misturadas em uma proporção de 1:1 e usadas para incuba-ção das partes de folha durante cerca de 5 minutos. Subseqüentemente, asuspensão bacteriana foi removida e as partes de folha infectadas foramcolocadas em meio padrão e incubadas durante cerca de 3 dias (23 a 24°C;30 pEinstein m-2 sec-1; 12 horas na luz/12 horas no escuro ou 16 horas naluz/8 horas no escuro).

Posteriormente, os explantes de folha foram lavados 3 vezescom "Meio padrão" que contém 500mg/L de tricarcilina (Duchefa) e transferi-dos para (20 a 30 mg/L de glufosinato) "Meio padrão" que contém (20 a 30mg/L de glufosinato e 500mg/L de tricarcilina e adicionalmente cultivadas a23 a 24°C; 30 pEinstein m-2 sec-1; 12 horas na luz/12 horas no escuro ou16 horas na luz/8 horas no escuro.

Os explantes de folha foram transferidos a cada semana parameio fresco. Após 3 a 4 semanas as raízes emergentes foram cortadas etransferidas para "Meio de prolongamento de raiz fasciculada". Quando asraízes possuírem poucos centímetros, uma cultura de raiz fasciculada emerlenmeyers de 250mL que contêm 50mL de "Meio de cultura de raiz" + 250mg/L de tricarcilina foi iniciada. As culturas foram agitadas (110rpm) no escu-ro a 23 a 24°C e subcultivada toda semana. A concentração de tricarcilina foigradualmente reduzida. Quando as raízes estiverem se desenvolvendo bem,as raízes são divididas em partes de cerca de 1,5 cm e os explantes foramdistribuídos sobre diversos erlenmeyers.

As culturas de raiz fasciculada também poderiam ser cultivadasem meio sólido, dessa forma as culturas foram transferidas a cada duas se-manas para "Meio de prolongamento de raiz fasciculada" fresco.

Um protocolo similar pode ser usado para gerar culturas de raizfasciculada de algodão.

Exemplo 2: Análise Histoquímica das culturas de raiz fasciculada.

As raízes fasciculadas das diferentes culturas de raiz fasciculadaobtidas por co-infecção entre A. rhizogenes e A. tumefaciens que transpor-tam os vetores de T-DNA diferentes descritos no Exemplo 1 foram macula-das de forma histoquímica para visualizar compostos diferentes das células,e microscopicamente analisadas.

A localização de proteína de fusão NODC-EGFP pode ser visua-lizada utilizando a fluorescência verde da parte GFP. N-acetilglicosaminapode ser tanto detectada após a reação imunológica com anticorpos mono-clonais IgM em N-acetilglicosamina (BIODESIGN) como utilizar Alexa Fluor488-Aglutinina de Germe de Trigo. O retículo endoplasmático foi maculadoutilizando o corante ER-Tracker Blue White DPX. O aparelho de Golgi foivisualizado utilizando BODIPY-TR. As paredes celulares foram maculadasutilizando Calcoflúor White (Branqueador fluorescente 28). Os núcleos forammaculados utilizando Hoechst 33342.

As células ciliadas radiculares histoquimicamente maculadasforam examinadas por meio de microscopia de fluorescência, utilizando ummicroscópio Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com Apotoma(Zeiss) para permitir os cortes ópticos. Axio Vision 4.2 (Zeiss) foi usado paraprocessamento de imagem.

Os seguintes protocolos foram usados nos diferentes métodoshistoquímicos:A. Coloração com Calcoflúor de paredes celulares.

Calcoflúor White (ou Branqueador Fluorescente 28) é um com-posto orgânico incolor que produz fluorescência em uma cor azulada clarasob radiação ultravioleta (λιτιβχ = 350 nm).

O espécime que será maculado é imerso durante 15 a 30 minu-tos em meio de cultura ou PBS (solução tampão) que compreende Branque-ador Fluorescente 28 em 50pg/mL de concentração final. O espécime é en-tão lavado com meio ou tampão, e as amostras são examinadas utilizandomicroscópio equipado para microscopia de fluorescência utilizando o conjun-to de filtro Zeiss 18. As paredes celulares produzem fluorescência em umacor azulada clara.

B. Coloração histoquímica do complexo de Golqi e retículo endoplasmáticoem células vivas

Para macular o complexo de Golgi, as raízes cultivadas durantecerca de 5 dias em meio de cultura líquido de raiz foram usadas. Estas raí-zes foram lavadas com meio de cultura de raiz fresco e incubadas durantecerca de 30 minutos a 4°C com 1μΜ de BODIPY TR C5-ceramida (Sondasmoleculares, Cat Nq B-34400). As raízes foram lavadas poucas vezes commeio de cultura de raiz e incubadas em meio de cultura de raiz fresco emtemperatura ambiente durante 30 minutos com agitação suave. As raízesforam então lavadas com meio de cultura de raiz fresco e examinadas comum microscópio de fluorescência Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Germany) utilizan-do Filterset 00 (excitação: BP530/585; emissão: LP615).

Para coloração de ER1 as raízes cultivadas durante cerca de 5dias em meio de cultura líquido de raiz foram usadas. Estas raízes foramlavadas com meio de cultura de raiz fresco e incubadas com ER-TrackerBlue-White DPX (IOOnM) dissolvido em meio de cultura de raiz durante cer-ca de 2 horas com agitação suave. As raízes foram lavadas poucas vezescom meio de cultura de raiz e examinadas com um microscópio de fluores-cência Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Germany) utilizando Filterset 02 (excitação:G365; emissão: LP420).C. Detecção imunoistoquímica de montagem inteira de N-acetilglicosaminaincorporada na parede celular de raízes (fibras da raiz)

As raízes das diferentes culturas de raiz fasciculada se desen-volveram em cultura líquida durante 6 dias, tanto suplementadas com 50 mMde GIcNAc como sem qualquer suplemento. As raízes foram fixadas e desi-dratadas, re-hidratadas e a parede celular permeabilizada da seguinte maneira.

Quando a amostra for incubada com N-acetilglicosamina o ex-cesso de N-acetilglicosamina é lavado incubando 4 vezes em 10 minutoscom solução PBS.

As amostras foram fixadas por incubação e infiltração à vácuode solução AA (incubação: quatro vezes em 1 h, cada vez seguida por 5 minde infiltração à vácuo). A solução AA contém 50% de EtOH e 5% de ácidoacético.

Em uma próxima etapa, as amostras são desidratadas por lava-gem com 50% de EtOH e lavagem 2 χ em 30 minutos com 50% de EtOH,seguida por 60 minutos de incubação em 70% de EtOH. As amostras podemser armazenadas neste estágio a- 20°C.

Subseqüentemente, as amostras foram submetidas à permeabi-lização de parede celular, por lavagem durante 5 minutos com 50% de E-tOH, lavagem 2 χ em 5 minutos com PBT (PBS com 0,1% de Tween20), la-vagem 2 χ em 5 minutos com PBT + 0,3% de Triton X100 e por fim lavagem2 χ em 5 minutos com PBS (150mM de NaCI; 10mM de Na-tampão fosfato;PH 7,4).

As raízes permeabilizadas são transferidas para uma placa dePetri que contém água-MQ, e montadas sobre uma lâmina de microscópio"tratada com Vectaboin". As lâminas são assadas sobre um leitor de placaTLC durante 45 minutos a 55°C. Uma etapa de bloqueio é realizada ao incu-bar as lâminas durante uma hora com solução de bloqueio (1% de BSA emPBT). Subseqüentemente, 1% de solução de bloqueio é substituído por cer-ca de 400μΙ_ de anticorpo monoclonal IgM para N-acetilglicosamina (1pg/mLem solução de bloqueio; BIODESIGN, Cat No H67108M) e incubada duranteuma hora. As lâminas são subseqüentemente lavadas 3 vezes 5 a 10 minu-tos com solução de bloqueio. A solução de bloqueio é então substituída porcerca de 400μΙ_ de anticorpo IgM de Cabra AntiCamundongo marcado comAlexa Fluor 488 (3Mg/mL em solução de bloqueio; Sondas Moleculares, CatNq A-21042) e incubada durante uma hora. Depois, as lâminas são lavadas5 a 10 minutos com solução de bloqueio, 2 vezes 5 a 10 minutos com PBT epoucas vezes com PBS para remover Tween20. Os resultados são avalia-dos por meio de microscopia de fluorescência com um microscópio Axioplan2 (Zeiss, Jena, Alemanha) utilizando Filterset 38 (excitação: BP470/40; e-missão: BP525/50).

D. Detecção mediada por aqlutinina de germe de trigo de N-acetilglusoamina

As raízes das diferentes culturas de raiz fasciculada se desen-volveram em cultura líquida durante 6 dias, tanto suplementadas com 50 mMde GIcNAc como sem qualquer suplemento. As raízes foram fixadas e desi-dratadas, re-hidratadas e a parede celular permeabilizada como descrito naseção C acima.

A aglutinina de germe de trigo se liga seletivamente a resíduosde N-acetilglicosamina e ácido N-acetilneuramínico. O ácido N-acetilneuramínico não ocorre em plantas. Portanto, em plantas, a aglutininade germe de trigo pode ser usada para detectar especificamente resíduos deN-acetilglicosamina.

As raízes permeabilizadas foram colocadas em Placas de Petride 9 cm dotadas de PBT. As raízes foram, então transferidas para as cavi-dades de placas de cultura de 6 cavidades que contêm cerca de 1,7 pg/mLde Aglutinina de Germe de Trigo marcada com Alexa Fluor 488 (Sondas Mo-leculares, Cat No W-11261) em PBT e incubadas durante uma hora. As a-mostras foram subseqüentemente lavadas 3 χ durante 10 minutos com PBTe duas vezes durante 5 minutos com PBS (para remover Tween20). As a-mostras foram colocadas sobre uma lâmina de microscópio "tratada comVectabond" ou '"Tissue Tack" em uma gota de PBS. Após a remoção damaior parte de PBS a lamínula foi montada. Os resultados foram avaliadospor meio de microscopia de fluorescência utilizando um microscópio de fluo-rescência Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Alemanha) que utiliza Filterset 38 (excita-ção: BP470/40; emissão: BP525/50).

E. Análise de GFP.

A fluorescência de EGFP foi avaliada por meio de microscopiade fluorescência com um microscópio Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Alemanha)utilizando Filterset 38 (excitação: ΒΡ470/40; emissão: BP525/50).

Resultados

1. Localização de N-acetilglicosamina na parede celular

As células ciliadas radiculares que compreendem o gene quimé-rico NODC foram maculadas de forma imunoistoquímica na presença de N-acetilglicosamina e subseqüentemente maculadas com Calcoflúor para visu-alizar as paredes celulares. A Figura 3 mostra um conjunto representativo defotografias de cortes ópticos que utiliza um microscópio de fluorescência, pormeio deste o painel A mostra a fluorescência (azul) que visualiza a paredecelular, e o painel B mostra a fluorescência (verde) que visualiza N-acetilglicosamina. Como pode ser observado a partir da sobreposição deambos os cortes ópticos no painel C, a presença de N-acetilglicosamina éexclusivamente detectada nas paredes celulares das células ciliadas radiculares.

2. Co-localizacão de proteínas NODC e do aparelho de Golgi

As células ciliadas radiculares que compreendem o gene quimé-rico que expressa a proteína de fusão NODC-EGFP foram maculadas paravisualizar o aparelho de Golgi e, subseqüentemente, maculadas com Calco-flúor para visualizar as paredes celulares. A Figura 4 mostra um conjuntorepresentativo de fotografias de cortes ópticos que utiliza um microscópio defluorescência, por meio deste o painel B mostra a fluorescência (azul) quevisualiza a parede celular, o painel C mostra a fluorescência (vermelha) as-sociada ao aparelho de Golgi e o painel D mostra a fluorescência (verde)que visualiza a proteína de fusão NODC-EGFP. Como pode ser observado apartir da sobreposição dos cortes ópticos no painel A, a localização da prote-ína de fusão NODC-EGFP coincide com a localização do aparelho de Golginas células ciliadas radiculares.3. Expressão de quitina sintase em células de plantas requer alimentaçãoexterna com GIcNAc para detectar N-acetilqlicosamina nas paredes celulares.

As raízes que expressam uma quitina sintase quimérica de Neu-rospora crassa foram cultivadas como descrito acima na presença ou au-sência de N-acetilglicosamina externamente adicionada. Após lavagem cui-dadosa, as raízes foram maculadas de forma histoquímica para detectar N-acetilglicosamina. Na Figura 5, o painel A (raízes fasciculadas com alimenta-ção externa de GIcNAc) inúmeros pontos verde fluorescente podem ser de-tectados, enquanto que no painel B (raízes fasciculadas sem alimentaçãoexterna de GIcNAc) muito poucos pontos verde-fluorescente poderiam serdetectados.

Exemplo 3: Demonstração bioquímica de oliqômeros tipo quitina na paredecelular de Arabidopsis p35S::raízes fasciculadas NODC

As raízes fasciculadas transgênicas de Arabidopsis thaliana(CoI-O) de p35S:NODC-p35S:bar, obtidas utilizando o vetor de T-DNApTGK42 e raízes fasciculadas transgênica de controle de Arabidopsis thalia-na (CoI-O) de p35S:bar obtidas utilizando pTC0192 (controle) foram analisa-das na presença de N-acetilglicosamina utilizando o ensaio de Morgan-Elson.

Para esta finalidade, cerca de IOOmg de raízes fasciculadas fo-ram colhidos em cerca de 20pL de tampão (25mM de tampão K-fosfato pH6,0) e moídas com areia do mar, precipitados e o teor de proteína do extratodeterminado (para propósitos de padronização). Os sobrenadantes foramremovidos e as raízes foram ressuspensas em 100μΙ_ de tampão. 1 Unidadede celulase (Cellulase Onozuka R-10" de Trichoderma viride (Serva, Cat N916419): 10U/mL em tampão) ou 1 Unidade de quitinase (Quitinase de Serra-tia marcescens (Sigma, Cat Ng C1650): 10U/mL em tampão) ou ambas fo-ram adicionadas a amostras diferentes e incubadas durante a noite a 25°C.

Um ensaio de Morgan-Elson para medir N-acetilglicosamina foirealizado sobre as amostras na manhã seguinte. No método colorimétricoempregado, que se baseia na reação de Morgan-Elson, a extremidade deredução de N-acetil-glicosamina é sucessivamente transformada nos cromo-gênios I e Il sob as condições alcalinas a 100°C. O tratamento subseqüentecom uma mistura de HCI concentrado e ácido sulfúrico concentrado resultana eliminação de água produzindo o cromogênio Ill da reação de Morgan-Elson. Na etapa final da reação, o cromogênio Ill é permitido para reagir comDMAB, p-dimetilaminobenzaldeído (reagente de Ehrlich) para formar umproduto de cor vermelha cuja concentração pode ser determinada ao medir aabsorção a 585nm.

UDP N-acetilglicosamina, e N-acetilglicosamina-1 -fosfato falhamao fornecer o teste a menos que estas sejam anteriormente hidrolisadas comácido. Os nucleotídeos podem ser hidrolisados por aquecimento a 100° em0,01 N de ácido durante 15 minutos, porém o açúcar-fosfato requer condi-ções mais rigorosas, por exemplo, 5 minutos a 100° em 0,1 N de HCI.

Os resultados estão resumidos na Tabela 2.Tabela 2. Valores de OD585 após o ensaio de Morqan-Elson

<table>table see original document page 40</column></row><table>

A partir destes resultados pode-se concluir que os polímeros tipoquitina estão incluídos na parede celular.

Exemplo 4: Análise de quitooliqo e monossacarídeos em material de paredecelular de planta utilizando HPTLC

As paredes celulares das raízes radiculares de Arabidopsis doExemplo 1 (35S::NODC; 35S::NODC_EGFP) e 35S::raízes fasciculadas decontrole bar foram preparadas de acordo com o seguinte protocoloPreparação de paredes celulares

- Colher raízes fasciculadas;

- remover a maior parte do meio com um tecido

- Lavar o tecido com tampão PBS

- Colocar cerca de 1g de tecido em um tubo

- Congelar com nitrogênio líquido- Moer o tecido em um almofariz

- Transferir o tecido moído em um funil com talagarça

- Lavar com poucos litros de água desmineralizada

- Vedar a talagarça e transferir para uma garrafa de 500 mL quecontém 500 mL de etanol

- Lavar durante 15 minutos com 500mL de etanol, refrigerar oetanol e lavar durante outros 15 minutos

- Substituir o etanol por 250 mL de éter e lavar durante 15 minutos.

O material restante é o "material de parede celular". Secar e pe-sar o material de parede celular e transferir o mesmo para um tubo.

Extração de quitooliqos de material de parede celular

- Adicionar 300 pL de água MQ a 10 mg de material de paredecelular (utilizar um tubo de 25 ou 50 ml), ferver durante 3 minutos e incubardurante 2 horas a 80°C (agitar). O material de parede celular pode ser dige-rido com quitinase e mistura enzimática de β-Ν-Acetilglucosaminidase: 0,5 Uquitinase em 50μί 125mM de Na-fosfato - 2mM CaCI2 - pH 6 (QuitinaseSigma C7809 ou C6137 -> digerir (quitooligo) sacarídeos muito rapidamenteem N-acetilglicosamina. Quitinase BioLabs P5206S digerir penta-N-acetilquitose (lentamente) em di e tri-quitooligos);

- Adicionar 100 pL de mistura enzimática a cerca de 5 mg dematerial de parede celular;

- Incubar durante a noite a 25°C;

- O tampão pode ser separado do material de parede celular porcentrifugação.

Após a extração, o tampão que contém os quitooligos é man-chado sobre placas HPTLC (placas HPTLC NH2 (sem indicador fluorescen-te) 10 χ 20 cm (Merck, Art. 12572)) juntamente com uma mistura de soluçãopadrão de quitooligossacarídeo em H20. A solução padrão compreende N-acetilglicosamina, quitobiose, quitotriose, quitotetraose e quitopentaose.

Os seguintes solventes desenvolvidos podem ser usados:

• n-butanol (70): ácido acético (20): H2O (10) (Tampão D)• acetonitrila (76) : H2O (24) : 0,5% de solução aquosa de ácidobórico (10) (Tampão A)

• acetonitrila (10): isopropanol (67): 50mM de KCI (23) (Tampão B)

• n-butanol (50): etanol (30): H2O (20) (Tampão C)Cromatoqrafia

- Limpar as placas por revelação com metanol

- Marcar 1(-2) pL de soluções padrão (15 mm de fundo) e 1 a 5pL de amostras em faixas de cerca de 6 mm de comprimento

- Revelar placas em "CAMAG Câmaras "Twin Through"": 7 a 7,5cm de distância de migração

- Câmaras "Twin Through" para: placas de 10 χ 10 cm 10 mLde solução reveladora

- placas de 20 χ 10 cm 20 mL de solução reveladora

- Secar as placas com ventilador

- Aquecer as placas a cerca de 150°C durante 20 minutos (leitorde placa TLC)

- Visualizar açúcares com UV (366 nm)Cromatoqrafia-2D

- Limpar as placas por revelação com metanol

- Marcar 1 a 5 pL de amostras em faixa de 3 mm: ângulo direitode placa (15 mm de fundo e 15 mm de sítio)

- Revelar placas na primeira direção em "CAMAG Câmaras"Twin Through.....: 7 a 7,5 cm de distância de migração

- Câmaras "Twin Through" para: placas de 10 χ 10 cm -> 10 mLde solução fotoreveladora

- Secas as placas com ventilador

- Desenvolver as placas em outra direção

- Secar as placas com ventilador

- Aquecer as placas a cerca de 150°C durante 20 minutos (leitorde placa TLC)

- Visualizar os açúcares com UV (366 nm).A Figura 6 mostra os resultados de HPTLC unidimensional, pormeio disto o material de parede celular foi extraído, porém não adicional-mente digerido com quitinase. A Figura 7 mostra os resultados de uma HP-TLC bidimensional após digestão com quitinase. Nenhum quitooligômeropode ser detectado nas plantas de controle, porém quantidades significativasde quitooligômeros estão presentes em plantas que compreende um geneda N-acetilglicosamina transferase.

As plantas transgênicas de Arabidopsis também foram geradasutilizando os genes quiméricos descritos no Exemplo 1. Este material é maisuniforme do que as culturas de raiz fasciculada descritas acima. O materialde parede celular foi preparado, os quitooligossacarídeos extraídos comodescrito e HPTLC realizada em Tampão A como descrito aqui. Os resultadossão mostrados na Figura 8.

O material de parede celular de 35S transgênico::NodC partesaéreas de Arabidopsis mostrou uma grande quantidade de quito-triose, esti-mada por comparação com as soluções padrão que possuirão cerca de5pg/mg de material de parede celular ou 0,01% do material de folha fresco.Exemplo 5: Coloração de material de célula de planta de culturas de raizfasciculada de Arabidopsis.

As culturas de raiz fasciculada de Arabidopsis foram geradascomo no Exemplo 1, o material de parede celular destas foi preparado comodescrito no Exemplo 5 e armazenado a -20°C. O material de parede celularfoi maculado com um corante aniônico (Vermelho Congo) ou um corantereativo à amino (Alexa Fluor 488 éster tetrafluorofenila).Coloração com Vermelho Congo

- O material de parede celular armazenado a -20°C de raízesfasciculadas NODC ou plantas de controle foi re-hidratado em tampão aceta-to pH 5 (50 mg de material de parede celular/tubo)

- O material foi maculado com 0,03% de vermelho Congo dissol-vido em tampão acetato pH 5

- O material de parede celular foi lavado com tampão acetato pH5 e com tampão PBS poucas vezes- Todo o material de parede celular foi transferido para as cavi-dades de uma placa de 48 cavidades

- Sob condições de iluminação padrão, imagens digitais foramobtidas a partir de poços individuais e o valor médio de cinza da imagemdigital foi determinado

Resultados:

Amostra 1:

<table>table see original document page 44</column></row><table>

O material de parede celular de raízes fasciculadas que contémum gene quimérico NodC corado de forma reproduzível mais intenso do queo material de parede celular de plantas de controle. Os valores de cinza domaterial de parede celular eram cerca de 5 a 10% menores do que aquelesde plantas de controle.

B. Coloração com Alexa Fluor 488 éster de tetrafIuorofenila

- O material de parede celular armazenado a -20°C de raízesfasciculadas de NODC ou plantas de controle foi re-hidratado em tampãoPBS pH 5 (50 mg de material de parede celular/tubo), e tratado com protei-nase K (100pg/ml) durante a noite a 56°C.

- O material foi intensivamente lavado com tampão PBS e mar-cado com Alexa Fluor 488 éster de tetrafluorofenila. Alexa flúor 488 TFP és-ter está disponível como um kit (Alexa flúor 488 Kit de Marcação de Anticor-po Monoclonal (Sondas Moleculares, A-20181)- O material corado pode ser examinado utilizando microscopiade fluorescência, por exemplo, com filtro de Zeiss 38.

O material de parede celular de raízes fasciculadas que contémum gene quimérico NodC corado de forma reproduzível mais intenso do queo material de parede celular de plantas de controle.

Exemplo 6: Plantas transqênicas de algodão

As plantas transgênicas de algodão que compreendem um genequimérico NODC como descrito no Exemplo 1, ou um gene quimérico NODCsob controle do promotor seletivo por fibra F285 (como descrito emUS2003/106097) são geradas utilizando o método como descrito emUS6483013.

As fibras destas plantas transgênicas de algodão são isoladas, eusadas para produzir fios e tecidos com reatividade aperfeiçoada, tal comodurabilidade de cor aperfeiçoada.

Exemplo 7: Fibras de algodão com reatividade aumentada.

As plantas transgênicas de algodão que compreendem uma re-gião codificadora NodC ligada de forma operável a um promotor CaMV35Sforam geradas como descrito no Exemplo 6. As fibras de algodão madurasforam colhidas destas plantas e coradas com Vermelho Congo ou reagidascom WGA-AIexa flúor 555.

A. Coloração com Vermelho Congo

As fibras de algodão maduras foram colhidas de plantas trans-gênicas de algodão que compreendem um gene quimérico NodC1 bem comode plantas de controle que não compreendem um gene quimérico NodC. Oslipídeos foram removidos das fibras por lavagem com etanol e éter. As fibrasde algodão foram secas.

Vinte e cinco mg de fibras foram rehidratados em tampão de a-cetato de pH 5 e corados com 0,03% de vermelho Congo dissolvido emtampão de acetato de pH 5. O material de parede celular foi lavado comtampão de acetato de pH 5 e com tampão de PBS poucas vezes.

As fibras coradas foram analisadas por microscopia de campoclaro e por microscopia de fluorescência (filtro Zeiss 18). As imagens digitaisde fibras coradas em uma placa de 48 cavidades também foram analisadascomo descrito no Exemplo 5A.

Sob microscopia de campo claro, as fibras de algodão colhidasdas plantas transgênicas de algodão NodC pareceram vermelhas mais in-tensas do que as fibras de algodão das plantas não-transgênicas. Esta dife-rença foi ainda mais evidente quando se analisa as fibras sob microscopiade fluorescência.

Os valores médios de cinza obtidos nas fibras de algodão cora-das de vermelho congo das plantas transgênicas NodC também eram signi-ficativamente menores do que nas fibras de algodão de plantas não-transgênicas, confirmando a coloração mais intensa por corantes aniônicosdas fibras das plantas transgênicas de algodão.

<table>table see original document page 46</column></row><table>

A diferença em coloração foi mantida e ainda intensificadaquando as fibras foram tratadas durante pelo menos uma hora com NaOHquente (60% a 80°C). Este tratamento remove proteínas, substâncias pécti-cas e ceras, e é capaz de desacetilação dos quitooligômeros.

A coloração vermelho congo intensificada foi, além disso, distri-buída uniformemente na parede celular, como pode ser observado quandoforem feitos cortes microscópicos virtuais de células de fibra individuais.

B. Coloração com WGA-AIexa 555

A detecção de oligômeros de N-acetilglicosamina em fibras dealgodão de plantas transgênicas de NodC foi feita essencialmente comodescrito no Exemplo 2. As fibras de algodão não precisam ser desidratadasou permeabilizadas. De preferência, os lipídeos e ceras foram removidos aotratar as fibras 3 vezes durante 10 minutos em uma mistura de clorofórmio:metanol (1:1), seguido por duas vezes por um tratamento de 10 minutos emacetona e duas vezes durante 5 minutos em éter. As fibras foram permitidaspara secagem a ar.

As fibras foram coradas tanto com WGA-Alexa555, WGA-Alexa488 como WGA-tetrametilrodamina.

As fibras foram colocadas em solução de bloqueio (150 mM deNaCL, 10 mM de tampão de fosfato de sódio pH 7,4; 0,1% de Tween 20 e1% de albumina de soro bovino) e incubadas durante uma hora. Posterior-mente, o tampão foi substituído pelo mesmo tampão que contém WGA-fluorocromo e incubado durante 4 h. A solução de WGA-fluorocromo foisubstituída por solução de bloqueio, lavada durante 10 minutos, seguido por3 vezes durante 10 minutos, lavagem com solução bloqueio sem BSA, e 2vezes durante 5 minutos, lavagem com solução de bloqueio sem BSA e semTween. As fibras coradas foram montadas sobre uma lamina de microscópioe avaliadas por meio de microscopia de fluorescência (Axioplan 2 (Zeiss,Jena, Alemanha) utilizando Filterset 38 (excitação: BP470/40; emissão:BP525/50 ) para conjugado de Alexa flúor 488 ou Filterset 20 (excitação:BP546/12; emissão: BP575-640) pra conjugado de Alexa flúor 555 ou tetra-metilrodamina.

Considerando-se que nenhuma fluorescência específica poderiaser detectada em fibras de algodão de plantas não-transgênicas, uma fluo-rescência brilhante foi detectável em fibras de algodão de gene quiméricoNodC que compreende plantas de algodão (vide Figura 9). Os cortes mi-croscópicos virtuais das fibras de algodão indicaram que WGA-fluor555 éuniformemente distribuído por toda a parede de célula secundária das célu-las de fibra de algodão.

Exemplo 9: Reatividade de paredes celulares de raízes fasciculadas de Ara-bidopsis que compreendem uma quitina sintase de Neurospora crassa comsinal de marcação de Goloi.

Utilizando-se técnicas de DNA recombinante padrão, uma N-acetilglicosamina transferase exprimível por planta que compreende umaseqüência de sinal heteróloga de marcação de Golgi, foi construída com osseguintes fragmentos de DNA ligados de forma operável:

uma região de promotor 35S de CaMV

• um fragmento de DNA que codifica uma seqüência líder não-traduzida (5'Cab22L)• um fragmento de DNA que codifica os 35 aminoácidos N-terminal de β-1,2- xilosiltransferase de Arabidopsis thaliana

• um fragmento de DNA que codifica CHS2 (quitina sintase) deNeurospora crassa clonado em estrutura com o fragmento de DNA anterior

• uma terminação de transcrição e sinal de poliadenilação datranscrição 35S de CaMV (3' 35S).

O gene quimérico foi introduzido entre as margens de T-DNA deum vetor de T-DNA juntamente com um gene quimérico bar que proporcionaresistência à fosfinotricina. O vetor de T-DNA resultante foi nomeado pTD-BI37. A seqüência do T-DNA deste vetor é proporcionada na SEQ ID No 13.

Os vetores de T-DNA foram introduzidos em A. tumefaciens eusados para gerar culturas de raiz fasciculada como descrito no Exemplo 1.

Os oligômeros de N-acetilglicosamina poderiam ser detectadosna parede celular das culturas de raiz fasciculada após a incubação comdomínio de ligação de quitina conjugado com fluoresceína, por microscopiade fluorescência.

Os oligômeros de N-acetilglicosamina também poderiam ser de-tectados na parede celular das culturas de raiz fasciculada utilizando WGA-Alexa555 como descrito no Exemplo 2. Ademais, a fluorescência tambémpoderia ser observada com glóbulos no citoplasma, correspondente ao apa-relho de Golgi.

Exemplo 9: Determinação do teor de nitrogênio de fibras de algodão.

As bolas de algodão maduro foram colhidas das plantas de al-godão transgênicas do Exemplo 7. De cada bola, 20 mg de fibras clonadasforam analisados. Para este fim, os lipídeos e ceras foram removidos dasfibras por lavagem 3 vezes durante 20 minutos em uma mistura de clorofór-mio : metanol (1:1); 2 vezes durante 20 minutos em acetona; 2 vezes duran-te 5 minutos em éter e permitidos para secagem a ar.

O nitrogênio total na superfície de fibras foi medido utilizando okit de análise de "Nitrogênio Total" e Fotômetro C214 Multiparameter Benchde HANNA Instruments (Rhode Island, USA).

Os seguintes resultados foram obtidos:<table>table see original document page 49</column></row><table>

As fibras das bolas de algodão das linhas transgênicas conti-nham nitrogênio estatisticamente mais significativo na superfície do que asfibras de bolas de algodão tipo selvagem.

Exemplo 10: Expressão específica de fibra de uma auitina sintase em alqodão.

Utilizando-se técnicas de DNA recombinante padrão, uma N-acetilglicosamina transferase exprimível por planta que compreende umaseqüência de sinal de marcação heteróloga, foi construída com os seguintesfragmentos de DNA ligados de forma operável:

uma região de promotor específica de fibra de algodão

• um fragmento de DNA que codifica uma seqüência líder não-traduzida (5'Cab22L)

• um fragmento de DNA que codifica os 35 aminoácidos N-terminal de β-1,2-xilosiltransferase de Arabidopsis thaliana

.um fragmento de DNA que codifica CHS2 (quitina sintase) deNeurospora crassa clonado em estrutura com o fragmento de DNA anterior

• uma terminação de transcrição e sinal de poliadenilação datranscrição 35S de CaMV (3' 35S).

O gene quimérico foi introduzido entre as margens de T-DNA deum vetor de T-DNA juntamente com um gene quimérico bar que proporcionaresistência à fosfinotricina. O vetor de T-DNA resultante foi nomeado pTD-BI50. A seqüência do T-DNA deste vetor é proporcionado na SEQ ID N9 14.

Os vetores de T-DNA são introduzidos em A. tumefaciens e u-sados para gerar algodão transgênico. As fibras isoladas de bolas de algo-dão de plantas transgênicas possuem uma quantidade aumentada de oligô-meros de N-acetilglicosamina, mais ou menos uniformemente distribuídaspor toda a parede celular.LISTAGEM DE SEQÜENCIA<110> Bayer BioScience N.V.

De Bloek, MareMeulewaeter, FrankKoeh, Rainhard

Essigmann, Bernd

<120> MÉTODOS PARA ALTERAR A REATIVIDADE DE PAREDES CELULARES DE PLANTAS

<130> BCS 05-2Ol6-WOl

<150> EP 05076488.5

<151> 2005-06-24

<150> US 60/698182

<151> 2005-07-11

<150> EP 06008463.9

<151> 2006-04-25

<160> 15

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1<211> 395

<212> PRT

<213> Azorhizobium eaulinodans

<400> 1

Met Ser Val Val Asp.Val Ile Gly Leu Leu Ala Thr Ala Ala Tyr Val1 5 10 15

25 Thr Leu Ala Ser Ala Tyr Lys Val Val Gln Phe Ile Asn Val Ser Ser20 25 30

Val Thr Asp Val Ala Gly Leu Glu Ser Asp Ala Leu Pro Leu Thr Pro

35 40 45

Arg Val Asp Val Ile Val Pro Thr Phe Asn Glu Asn Ser Ser Thr Leu

50 55 60

Leu Glu Cys Val Ala Ser Ile Cys Ala Gln Asp Tyr Arg Gly Pro Ile65 70 75 80Thr Ile Val Val Val Asp Asp Gly Ser Thr Asn Lys Thr Ser Phe His

85 90 95

Ala Val Cys Asp Lys Tyr Ala Ser Asp Glu Arg Phe Ile Phe Val Glu

100 105 HO

Leu Asp Gln Asn Lys Gly Thr Ala Ala Gln Met Glu Ala Ile Arg Arg

115 120 125

Thr Asp Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Val Ile Asp

130 135 140

Lys Asp Val Val Thr Lys Leu Ala Ser Ser Met Arg Ala Pro Asn Val145 150 155 160

Gly Gly Val Met Gly Gln Leu Val Ala Lys Asn Arg Glu Arg Ser Trp

165 170 175

Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn Glu Glu

180 185 190

Arg Ile Ala Gln Ser Arg Phe Gly Ser Val Met Cys Cys Cys Gly Pro

195 200 205

Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Ile Thr Pro Leu Leu Ala Glu Tyr

210 215 220

Glu His Gln Thr Phe Leu Gly Arg Pro Ser Asn Phe Gly Glu Asp Arg225 230 235 240

His Leu Thr Ile Leu Met Leu.Lys Ala Gly Phe Arg Thr Gly Tyr Val

245 250 255

Pro Ser Ala Val Ala Arg Thr Leu Val Pro Asp Gly Ser Pro Tyr Leu

260 265 270

Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Tyr Arg Asp Thr Ala Leu

275 280 285

Ala Leu Arg Ile Lys Lys Asn Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Phe Glu Ile

290 295 300

Cys Ala Gln Asn Leu Gly Thr Ala Leu Leu Leu Val Met Thr Met Ile305 310 315 320

Ser Leu Ser Leu Thr Thr Ser Gly Ser Gln Thr Pro Val Ile Ile Leu325 330 335Gly Val Val Val Gly Met Ser Ile Ile Arg Cys Cys Ser Val Ala Leu

340 345 350

Ile Ala Lys Asp Phe Arg Phe Leu Tyr Phe Ile Val His Ser Ala Leu

355 360 365

Asn Val Leu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Leu Tyr Ala Leu Leu Thr Ile

370 375 380

Arg Asp Ser Arg Trp Leu Ser Arg Glu Ser Ser385 390 395

<210> 2<211> 485

<212> PRT

<213> Bradyrhizobium japonicum

<400> 2

Met Asp Leu Leu Ala Thr Thr Ser Ala Ala Ala Val Ser Ser Tyr Ala1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Ile Tyr Lys Ser Val Gln Ala Leu Tyr Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Ile Asn Ser Ser Leu Asp Asn Leu Gly Gln Ala Glu Val Val Val

35 40 45

Pro Ala Val Asp Val Ile Val Pro Cys Phe Asn Glu Asn Pro Asn Thr

50 55 60

Leu Ala GluCys Leu Glu Ser Ile Ala Ser Gln Asp Tyr Ala Gly Lys65 .70 75 80

Met Gln Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asn Arg Asp Val Val

85 90 95

Ala Pro Val His Arg Ile Tyr Ala Ser Asp Pro Arg Phe Ser Phe Ile

100 105 HO

Leu Leu Ala Asn Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Arg Ser Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile

130 135 140

Leu Ala Ala Asp Val Val Thr Lys Leu Val Leu Lys Met His Asp Pro145 150 155 160

Gly Ile Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Ile Ala Ser Asn Arg Asn Gln

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Ala Leu Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Glu Ala Gln Phe Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Asp Ala Ile Ala Ala Thr Val Val Pro His Ser Leu Arg260 265 270

Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp

275 280 285

Thr Phe Leu Ala Trp Arg Leu Leu Pro Glu Leu Asp Gly Tyr Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Ala Ile Ser305 310 315 320

Ser Leu Ala Ala Leu Ala Gln Leu Leu Ile Asp Gly Ser Ile Pro Trp

325 330 335

Trp Thr Gly Leu Thr Ile Ala Ala Met Thr Thr Val Arg Cys Cys Val

340 345 350

Ala Ala Leu Arg Ala Arg Glu Leu Arg Phe Ile Gly Phe Ser Leu His

355 360 365

Thr Pro Ile Asn Ile Cys Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Lys Val Thr Asp Met385 390 395 400

Pro Thr Glu Glu Gly Lys Gln Pro Vai, Ile Leu His Pro Asn Ala Gly405 410 415

Arg Ser Pro Ala Gly Val Gly Gly Arg Leu Leu Leu Phe Val Arg Arg

420 425 430

Arg Tyr Arg Ser Leu His Arg Ala Trp Arg Arg Arg Arg Val Phe Pro

435 440 445

Val Ala Ile Val Arg Leu Ser Thr Asn Lys Trp Ser Ala Asp Asp Ser

450 455 460

Gly Arg Lys Pro Ser Val Ile Arg Ala Arg Val Gly Cys Arg Arg Pro465 470 475 480

Val Ala Pro Arg His485

<210> 3

<211> 433

<212> PRT

<213> Rhizobium galegae

<400> 3

Met Thr Leu Leu Glu Thr Ile Gly Ile Ala Ala Val Thr Leu His Ala15 10 15

Leu Leu Ser Ala Ile Tyr Lys Ser Met Gln Ala Phe Tyr Ala Arg Lys

20 25 30

Ala Ser Gly Ser Gln Pro Arg Ser Lys Asp Ile Asp Pro Ala Ala Leu

35 40 45

Pro Ser Val Asp Ile Ile Val Pro Cys Phe Asn Glu Asp Pro Ala Ile

50 55 60

Leu Ser Ala Cys Leu Ser Ser Leu Ala Gly Gln Asp Tyr Gly Gly Lys65 70 75 80

Leu Arg Ile Tyr Met Val Asp Asp Gly Ser Cys Asn Arg Glu Ala Ile

85 90 95

Leu Pro Val His Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Pro Arg Phe Glu Phe Leu

100 105 110

Leu Leu Ser Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile115 120 125Glu Arg Ser Cys Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ser

130 135 140

Ile Ala Ser Asp Val Val Thr Leu Leu Val Glu Lys Met Arg Asp Ser145 150 155 160

Asp Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Lys Ala Ser Asn Arg Asp Lys

165 170 175

Asn Leu Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Asp Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Gln Thr Gln Leu Tyr Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Ser Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Glu Ala Ile Ala Lys Thr Val Val Pro Asp Arg Met Gly

260 265 270

Ser Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp

275 280 285

Thr Leu Leu Ala Leu Pro Leu Leu Pro Ser His Asn Arg Phe Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Ala Ile His Gln Asn Ile Gly Pro Leu Leu Leu Ala Val Ser305 310 315 320

Ser Ala Thr Gly Ile Thr Gln Phe Ile Leu Thr Ala Thr Val Pro Gly

325 330 335

Trp Thr Ile Ile Ile Ile Ala Ser Met Thr Met Val Arg Cys Ser Val

340 345 350

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Gln Ile Arg Phe Leu Ala Phe Ser Leu His

355 360 365

Thr Leu Ile Asn Leu Phe Met Leu Ile Pro Leu Lys Gly Phe Ala Leu370 375 380Leu Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Gly Ser Thr Thr Asp385 390 395 400

Gly Pro Ala Ile Ala Glu Ser Asn Ala Ala Ser Asn Glu Ala Glu Ile

405 410 415

Val Ala Ser Ala Ser Pro Phe Gly Gly Gly Thr Ser Trp Arg Phe Arg420 425 430

Arg

<210> 4

<211> 424

<212> PRT

<213> Rhizobium leguminosarum

<400> 4

Met Thr Leu Leu Ala Thr Thr Ser Ile Ala Ala Ile Ser Leu Tyr Ala1 5 10 15

Met Leu Ser Thr Val Tyr Lys Ser Ala Gln Val Phe His Ala Arg Arg

20 25 30

Thr Thr Ile Ser Thr Thr Pro Ala Lys Asp Ile Glu Thr Asn Pro Val

35 40 45

Pro Ser Val Asp Val Ile Val Pro Cys Phe Asn Glu Asp Pro Ile Val

50 55 60

Leu Ser Glu Cys Leu Ala Ser Leu Ala Glu Gln Asp Tyr Ala Gly Lys65 70 75 80

Leu Arg Ile Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Lys Asn Arg Asp Ala Val

85 90 95

Val Ala Gln Arg Ala Ala Tyr Ala Asp Asp Glu Arg Phe Asn Phe Thr

100 105 110

Ile Leu Pro Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Ile Ala Ala Ile Thr

115 120 125

Gln Ser Ser Gly Asp Leu Ile Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Thr Ile

130 135 140

Ala Pro Asp Val Val Ser Lys Leu Ala His Lys Met Arg Asp Pro Ala145 150 155 160

Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Met Lys Ala Ser Asn Gln Ala Asp Thr

165 170 175

Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn Glu

180 185 190

Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys Gly

195 200 205

Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ala Met Leu Ser Leu Leu Asp Gln

210 215 220

Tyr Glu Thr Gln Leu Tyr Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu Asp225 230 235 240

Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Ser Ala Gly Phe Arg Thr Glu Tyr

245 250 255

Val Pro Ser Ala Ile Ala Ala Thr Val Val Pro Asp Thr Met Gly Val

260 265 270

Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp Thr

275 280 285

Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Pro Gly Leu Asp Arg Tyr Leu Thr Leu

290 295 300

Asp Ala Ile Gly Gln Asn Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala.Leu Ser Val305 310 315 320

Leu Thr Gly Ile Gly Gln Phe Ala Leu Thr Ala Thr Leu Pro Trp Trp

325 330 335

Thr Ile Leu Val Ile Gly Ser Met Thr Leu Val Arg Cys Ser Val Ala

340 345 350

Ala Tyr Arg Ala Arg Glu Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ala Leu His Thr

355 360 365

Leu Val Asn Ile Phe Leu Leu Ile Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu Cys

370 375 380

Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Gly Ser Val Ala Ile Ala385 390 395 400

Pro Thr Val Gly Gln Gln Gly Ala Thr Lys Met Pro Gly Arg Ala Thr405 410 415

Ser Glu Ile Ala Tyr Ser Gly Glu420

<210> 5

<211> 426

<212> PRT

<213> Rhizobium meliloti

<400> 5

Met Tyr Leu Leu Asp Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ile Ser Ile Tyr Ala1 5 10 15

Leu Leu Leu Thr Ala Tyr Arg Ser Met Gln Val Leu Tyr Ala Arg Pro

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Ala Val Ala Ala Glu Pro Val Glu Thr Arg Pro Leu

35 40 45

Pro Ala Val Asp Val Ile Val Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Gly Ile

50 55 60

Leu Ser Ala Cys Leu Ala Ser Ile Ala Asp Gln Asp Tyr Pro Gly Glu65 70 75 80

Leu Arg Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Arg Asn Arg Glu Ala Ile

85 90 95

Val Arg Val Arg Ala Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Arg Phe Ser Phe Ile

100 105 HO

Leu Leu Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Gly Gln Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Ser Thr

130 135 140

Ile Ala Phe Asp Val Val Ser Lys Leu Ala Ser Lys Met Arg Asp Pro145 150 155 160

Glu Val Gly Ala Val Met Gly Gln Leu Thr Ala Ser Asn Ser Gly Asp

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Lys Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn180 185 190Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ser Arg195 200

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg

210 215

Gln Tyr Glu Thr Gln Leu Phe Arg225 230

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met245

Tyr Val Pro Asp Ala Ile Val Ala260

Pro Tyr

Thr Phe290

Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys205

Ser Ala Leu Ala Ser Leu Leu Asp220

Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu235 240

Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu

250 255

Thr Val Val Pro Asp Thr Leu Lys265 270

Thr Phe Arg Asp285

Pro Phe Leu Ala

Leu Arg Gln Gln Leu275

Leu Ala Leu Pro Leu295

Arg Trp Ala Arg Ser280

Leu Arg Gly Leu Ser300

Phe Asp Ala Val Gly Gln Asn Ile Gly Gln Leu Leu Leu Ala Leu Ser305 310 315 320

Val Val Thr Gly Leu Ala His Leu Ile Met Thr Ala Thr Val Pro Trp

325 330 335

Trp Thr Ile Leu Ile Ile Ala Cys Met Thr Ile Ile Arg Cys Ser Val

340 345 350

Val Ala Leu His Ala Arg GlnLeu Arg Phe Leu Gly Phe Val Leu His

355 360 365

Thr Pro Ile Asn Leu Phe Leu Ile Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Glu385 390 395 400

Val Pro Val Ser Gly Gly Lys Gln Thr Pro Ile Gln Thr Ser Gly Arg

405 410 415

Val Thr Pro Asp Cys Thr Cys Ser Gly Glu

420 425

<210> 6<211> 452<212> PRT

<213> Rhizobium tropici

<400> 6

Met Asn Leu Leu Asp Ala Thr Ser Thr Ala Ala Ile Ser Leu Tyr Ala1 5 10 15

Met Leu Ser Thr Ala Tyr Lys Ser Met Gln Val Val Tyr Ala Arg Pro

20 25 30

Ile Glu Glu Pro Ser Thr Ser Ala Glu Pro Ile Ala Ser Ala Gln Trp

35 40 45

Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Gly Thr

50 55 60

Leu Trp Asp Cys Leu Glu Ser Ile Ala His Glu Glu Tyr Ala Gly Asp65 70 75 80

Leu Asn Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ser Asn Arg Asp Ala Ile

85 90 95

Thr Pro Val His Thr Ala Phe Ala Arg Asp Pro Arg Phe Thr Phe Ile

100 105 HO

Leu Leu Arg Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Arg Arg Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile

130 135 140

Leu Ala Pro Asp Val Val Val Lys Leu Ala Leu Lys Met Gln Asp Pro145 150 155 160

Ala Ile Gly Ala Ala Met. Gly Gln Leu Ala Ala Ser Asn Arg His Glu

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Thr Ala Leu Thr Met Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Glu Thr Gln Met Phe Arg Gly Lys Arg Ser Asp Phe Gly Glu225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Thr Ala Ile Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Lys Leu Arg

260 265 270

Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp

275 280 285

Thr Leu Leu Ala Met Asn Leu Leu Pro Gly Leu Asp Arg Phe Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ser305 310 315 320

Val Leu Thr Gly Leu Ala Gln Phe Ala Leu Thr Gly Thr Val Pro Trp

325 330 335

Trp Thr Cys Leu Met Ile Ala Ser Met Thr Met Ile Arg Cys Ser Val

340 345 350

Ala Ala Val Arg Ala Arg Gln Phe Arg Phe Ile Gly Phe Ser Leu His

355 360 365

Thr Phe Ile Asn Ile Phe Phe Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Gly Ser Ala Ala Lys385 390 395 400

Ala Thr Gly Lys Gly Gly Lys Leu Asp Ala Ile Gln Asp Pro Val Ala

405 410 415

Ala Ser Ser Pro Arg Glu Ser Gln Glu Asn Glu Ala Pro Leu Arg Arg

420 425 430

His Asn Leu Ala Arg Asp Ala Thr Arg Ser Met Ala Tyr Asp Gly Ile

435 440 445

Cys Thr Asp Gln450

<210> 7

<211> 428

<212> PRT<213> Rhizobium leguminosarum

<400> 7

Met Thr Met Leu Asp Thr Thr Ser Thr Val Ala Val Ser Leu Tyr Ala1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Ala Tyr Lys Ser Met Gln Ala Val Tyr Ser Leu Pro

20 25 30

Thr Asp Val Ser Leu Ala Ser His Gly Leu Gly Gly Phe Asp Glu Leu

35 40 45

Pro Ser Val Asp Val Ile Val Pro Ser Phe Asn Glu Asp Pro Arg Thr

50 55 60

Leu Ser Glu Cys Leu Ala Ser Ile Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Arg65 70 75 80

Leu Gln Val Tyr Leu Val Asp Asp Gly Ser Glu Asn Arg Glu Ala Leu

85 90 95

Arg Leu Val His Glu Ala Phe Ala Arg Asp Pro Arg Phe Asn Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Pro Gln Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Asp Arg Cys Asp

115 120 125

Gln Arg Ser Ala Gly Asp Met Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile

130 135 140

Leu Ala Ser Asp Val Ile Arg Lys Leu Val Pro Lys Asn Ala Arg Val145 150 155 160

Ala Val Gly Arg Met. Gly Gln Leu Thr Gly Pro Gln Pro Lys Arg Gln

165 170 175

Leu Ala Asp Pro Phe Asp Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn Glu

180 185 190

Glu Arg Ser Gln Gln Ala Arg Phe Gly Cys Val Met Phe Cys Ser Gly

195 200 205

Ser Cys Val Met Tyr Arg Leu Val Ser Ala Ser Leu Leu Asp Gln Tyr

210 215 220

Asp Ala Gln Tyr Phe Arg Lys Gln Arg Phe Gly Glu Ile Asp Ile His225 230 235 240Leu Ser His Ala Glu Gly Ser Phe Arg Thr Glu Tyr Arg Pro Ser Ala

245 250 255

His Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Lys Leu Gly Pro Tyr Leu Gly Gln

260 265 270

Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Thr Thr Leu Leu Gly Ala

275 280 285

Pro Leu Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Met Leu Asp Val Val Gly Gln

290 295 300

Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Asp His Ser Val Leu Thr Gly Leu Ala305 310 315 320

Gln Leu Ala Leu Thr Gly Thr Ala Pro Trp Leu Ala Ala Leu Met Ile

325 330 335

Val Ala Met Thr Ile Asp Arg Cys Ser Val Val Ala Leu Arg Ala Arg

340 345 350

Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ser Leu His Thr Phe Ile Asn Ile Phe

355 360 365

Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu Cys Thr Leu Ser Asn Ile

370 375 380

Ala Trp Leu Ser Ser Leu Leu Cys Trp Gln Leu Glu Ser Thr Ser Thr385 390 395 400

Ala Asp Ala Arg Thr Thr Glu Cys Ser Asp Met Arg Thr Ala Ser Lys

405 410 415

Leu Ser Pro Pro Pro Ser Cys Gln Ala Asn Asp Val420 425

<210> 8<211> 450

<212> PRT

<213> Rhizobium sp.

<400> 8

Met Asp Leu Leu Thr Thr Thr Ser Thr Val Ala Val Ala Cys Tyr Ala1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Val Tyr Lys Gly Met Gln Ala Val Tyr Ser Leu Pro20 25 30

Pro Thr Val Ala Pro Ala Ser Glu Asp Leu Val Gly Ser Asp Leu Trp

35 40 45

Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Cys Tyr Asn Glu Gly Pro Leu Thr

50 55 60

Leu Ser Ala Cys Leu Asp Ser Ile Ala Asn Gln Glu Tyr Ala Gly Lys65 70 75 80

Leu Arg Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Gly Asn Arg Asp Ala Val

85 90 95

Ile Pro Ile His Asp Asn Tyr Ala Gly Asp Pro Arg Phe Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Leu Pro Glu Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Arg Arg Ser Ser Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Thr

130 135 140

Leu Ala Ser Asp Val Ile Arg Lys Leu Ala Arg Lys Met Gln Asp Pro145 150 155 160

Ala Ile Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Thr Ala Ser Asn Arg Ser Asp

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Glu Glu Arg.Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala Met Tyr Arg Arg Ser Ser Leu Leu Ser Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Glu Thr Gln Met Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Glu Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Asp Ala Ile Ala Val Thr Val Val Pro Asp Arg Leu Gly

260 265 270

Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp275 280 285

Thr Leu Leu Ala Leu Arg Leu Leu Pro Gly Leu Asp Arg Tyr Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Val Val Gly Gln Asn Leu Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ser305 310 315 320

Val Ile Ala Gly Ile Ala Gln Phe Ala Leu Thr Ala Thr Leu Pro Trp

325 330 335

Pro Thr Ile Leu Val Ile Ala Ala Met Thr Ile Ile Arg Cys Thr Val

340 345 350

Thr Ala Cys Arg Ala Arg Gln Ala Arg Phe Ile Gly Phe Ser Leu His

355 360 365

Thr Phe Ile Asn Ile Phe Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Lys Thr Ala Thr Leu385 390 395 400

Pro Asn Ala Asp Lys Lys Gln Ile Ile Val Ala Asn Pro Ile Ala Gly

405 410 415

Val Gly Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ala Glu Ala Ile Arg Arg Thr Asp

420 425 430

Leu Pro Arg Asp Ser Ser Lys Leu Val Asn Ala Asp Ser Val Cys Ser435 440 445

Ala Glu450

<210> 9

<211> 424

<212> PRT

<213> Rhizobium Ioti

<400> 9

Met Asn Leu Phe Ala Ser Ala Ser Thr Val Ala Ile Cys Ser Tyr Ala1 5 10 15

Leu Leu Ser Thr Val Tyr Lys Thr Ala Gln Val Phe Tyr Thr Leu Pro20 25 30Thr Asn Val Pro Pro Thr Ser Gly Asp Pro Pro Ser Gly Glu Pro Trp

35 40 45

Pro Ser Val Asp Val Ile Ile Pro Cys Tyr Asn Glu Ala Pro Arg Thr

50 55 60

Leu Ser Asp Cys Leu Ala Ser Ile Ala Ser Gln Asp Tyr Ala Gly Lys65 70 75 80

Leu Gln Val Tyr Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Asn Arg Asp Ala Leu

85 90 95

Val Gly Val His Glu Glu Tyr Ala Gly Asp Pro Arg Phe Asn Phe Val

100 105 110

Ala Leu Pro Lys Asn Val Gly Lys Arg Lys Ala Gln Ile Ala Ala Ile

115 120 125

Arg Arg Ser Cys Gly Asp Leu Val Leu Asn Val Asp Ser Asp Thr Ile

130 135 140

Leu Ala Pro Asp Val Ile Thr Arg Leu Ala Leu Lys Met Gln Asp Gln145 150 155 160

Ala Val Gly Ala Ala Met Gly Gln Leu Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu

165 170 175

Thr Trp Leu Thr Arg Leu Ile Asp Met Glu Tyr Trp Leu Ala Cys Asn

180 185 190

Glu Glu Arg Ala Ala Gln Ala Arg Phe Gly Ala Val Met Cys Cys Cys

195 200 205

Gly Pro Cys Ala MetTyr Arg Arg Ser Ala Leu Val Ser Leu Leu Asp

210 215 220

Gln Tyr Glu Thr Gln Arg Phe Arg Gly Lys Pro Ser Asp Phe Gly Glu225 230 235 240

Asp Arg His Leu Thr Ile Leu Met Leu Lys Ala Gly Phe Arg Thr Glu

245 250 255

Tyr Val Pro Glu Ala Val Ala Ala Thr Val Val Pro Asn Ser Met Gly

260 265 270

Pro Tyr Leu Arg Gln Gln Leu Arg Trp Ala Arg Ser Thr Phe Arg Asp275 280 285Thr Leu Leu Ala Phe Gln Leu Leu Arg Gly Leu Asn Ile Tyr Leu Thr

290 295 300

Leu Asp Val Ile Gly Gln Asn Ile Gly Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ser305 310 315 320

Ile Leu Ala Gly Leu Ala Gln Phe Val Thr Thr Gly Thr Val Pro Trp

325 330 335

Thr Ala Cys Leu Met Ile Ala Ala Met Thr Ile Val Arg Cys Ser Val

340 345 350

Ala Ala Phe Arg Ala Arg Gln Leu Arg Phe Leu Gly Phe Ser Leu His355 360 365

Thr Leu Ile Asn Ile Phe Leu Leu Leu Pro Leu Lys Ala Tyr Ala Leu

370 375 380

Cys Thr Leu Ser Asn Ser Asp Trp Leu Ser Arg Ser Ser Ala Ala Asn385 390 395 400

Val Gln Asp Thr Gly Asp Ala Leu Pro Lys Pro Asn Leu Val Gly Ser

405 410 415

Asp Ala Ala Tyr Ser Glu. Gln Gln 420

<210> 10<211> 3900

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> : T-DNA de pTGK42

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> Margem esquerda de T-DNA (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (56).. (316)

<223> 3' UTR a partir do gene nopalina sintase de T-DNA pTIT37 (com-plemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (336)..(887)

<223> CDS de fosfinotrecina acetil transferase de Streptomyces hygro-scopicus (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (888)..(1720)

<223> região promotora do gene CaMV 35S (complemento)<220>

<221> misc_feature.

<222> (1172) .. (2297)

<223> região promotora P35S2 do gene CaMV35S<220>

<221> misc_feature

<222> (2303) .. (2359)

<223> Seqüência condutora 5' Cab22L·<220>

<221> misc_feature

<222> (2369) .. (3562)

<223> região de codificação de A. caulinodans<220>

<221> misc_feature

<222> (3575) .. (3795)

<223> terminador 3' 35S<220>

<221> misc_feature

<222> (3879) . . (3855)

<223> margem direita de T-DNA (sintético) (complemento)<400> 10

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120

ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180

taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240

gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300

tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480

atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540

gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660

gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720

cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 7 80

aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840

gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900

gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960

ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020

cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080

ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140

gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200

ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260

ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320

ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380

tgagtcgta:a aagactctgt atgaactgtt cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440

cctcgatttg 'aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500

25 gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560

ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620

ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680

ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740

cccgggcata tggcgcgcca tatgcaccat acatggagtc aaaaattcag atcgaggatc 1800

taacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta cgaetcaatg 1860

acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 1920

tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 1980cgggaaacct cctcggattc cattgcccagaaaaggaagg tggcacctac aaatgccatcatgcctctgc cgacagtggt cccaaagatgaagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagctaagggatga cgcacaatcc cactatccttcatttcattt ggagaggact cgagctcatttcttttctct tcttattaaa ccaaaaccatgactgcagcc tacgtgacgt tggcgagcgcgagcgtaacg gatgtcgctg gtctcgaaagcgttatcgtg ccgacattca atgagaactcatgcgcacaa gactaccgcg gaccaataaccaaaacatca tttcacgcag tatgcgacaacgaacttgat caaaacaagg ggaagcgcgccggagacctg atactaaacg tagactcggagcttgcgtcg tccatgagag ccccgaatgtgaatcgagaa agatcttggc ttaccagattcgaggagcgc attgcgcagt cgaggtttggcatgtataga agatctgcaa ttacgccactagggcgtccg agcaactttg gtgaggatcgatttcggacc gggtacgtcc caggtgccgtgccgtacctg cgccagcaac tccgctgggccttacgtata aagaaaaatc taagcaaatagggtacggct ctcttacttg tgatgaccatgcaaacgccc gttatcattc tgggtgtcgttgtcgccctt atagcgaaag attttcggtttgttctaatt ttaacgccgt taaaactctagctatcacgc gagagttcct aagctagcaatctacaaatc tatctctctc tattttctccggaattaggg ttcctatagg gtttcgctcagtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaaagtactaaaa tccagatcat gcatggtacacgacggccga gtactggcag gatatatacc

ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 2040

attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 2100

gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 2160

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 2220

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 2280

tctctattac ttcagccata acaaaagaac 2340

gagtgtcgta gatgtgatcg gtttgcttgc 2400

atacaaggtg gtccagttca ttaacgtgtc 2460

tgatgctttg ccgctcactc caagggttga 2520

cagcacattg ctcgagtgcg tcgcttctat 2580

gattgtcgtg gtagacgatg ggtcgaccaa 2640

gtacgcgagc gacgaaaggt tcatatttgt 2700

cgcgcaaatg gaggccatca ggagaacaga 2760

cacggttata gataaggatg ttgttacaaa 2820

cggtggtgtc atggggcagc tcgttgcaaa 2880

aatcgatatg gagtactggc ttgcgtgtaa 2940

ctccgtgatg tgttgttgtg ggccgtgcgc 3000

attggcagaa tatgagcacc agacattcct 3060

ccatctcaca atcctgatgc tgaaggcggg 3120

agcgaggacg ttggttccgg atgggctggc 3180

ccgcagcact tatcgcgaca ccgccctcgc 3240

tatcaccttt gagatatgcg cacagaattt 3300

gatttcgctt tcgctgacta catcagggtc 3360

tgtggggatg tctataataa gatgttgttc 3420

tctatacttc atcgttcact cagcgttgaa 3480

tgccctgtta accattcggg atagtcggtg 3540

gcttggacac gctgaaatca ccagtctctc 3600

ataataatgt gtgagtagtt cccagataag 3660

tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat 3720

taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc 3780

gcggccaatt gccaattccg gggtaccggt 3840

gttgtaattt gtcgcgtgtg aataagtcgc 3900<210> 11

<211> 4680

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA de pTGK44<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> Margem esquerda de T-DNA (sintético) (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(316)

<223> 3' UTR a partir do gene nopalina sintase de T-DNA pTIT37 (com-plemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (336)..(887)

<223> CDS de fosfinotrecina acetil transferase de Streptomyces hygro-scopicus (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (888)..(1720)

<223> : região promotora P35S3 do gene CaMV

<220>

<221> misc_feature

<222> (1172)..(2297)

<223> região promotora P35S2 do gene CaMV35S<220>

<221> misc_feature

<222> (2303) . . (2359)

<223> Seqüência condutora 5' Cab22L<220>

<221> misc_feature

<222> (2369)..(3558)

<220>

<222> (3560) .. (4279)

<220>

<222> (4304)..(4524)

<220>

<222> (4608)..(4584)

<223> Margem direita de T-DNA (sintético)

<400> 11

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60

tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120

ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180

taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240

gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300

tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480

atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540

gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660

gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720

cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780

aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840

gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960

ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020

cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080

ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140

gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200

ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260

ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320

ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380

tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440

cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500

gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560

ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620

ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680

ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740

cccgggcata tggcgcgcca tatgcaccat acatggagtc aaaaattcag atcgaggatc 1800

taacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca .gagtctttta cgactcaatg 1860

acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 1920

tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 1980

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 2040

aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 2100

atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 2160

aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 2220

taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 2280

catttcattt "ggagaggact cgagctcatt tctctattac ttcagccata acaaaagaac 2340

tcttttctct tcttattaaa ccaaaaccat gagtgtcgta gatgtgatcg gtttgcttgc 2400

gactgcagcc tacgtgacgt tggcgagcgc atacaaggtg gtccagttca ttaacgtgtc 2460

gagcgtaacg gatgtcgctg gtctcgaaag tgatgctttg ccgctcactc caagggttga 2520

cgttatcgtg ccgacattca atgagaactc cagcacattg ctcgagtgcg tcgcttctat. 2580

atgcgcacaa gactaccgcg gaccaataac gattgtcgtg gtagacgatg ggtcgaccaa 2640

caaaacatca tttcacgcag tatgcgacaa gtacgcgagc gacgaaaggt tcatatttgt 2700

cgaacttgat caaaacaagg ggaagcgcgc cgcgcaaatg gaggccatca ggagaacaga 2760

cggagacctg atactaaacg tagactcgga cacggttata gataaggatg ttgttacaaa 2820gcttgcgtcg tccatgagag ccccgaatgt cggtggtgtc atggggcagc tcgttgcaaa 2880

gaatcgagaa agatcttggc ttaccagatt aatcgatatg gagtactggc ttgcgtgtaa 2940

cgaggagcgc attgcgcagt cgaggtttgg ctccgtgatg tgttgttgtg ggccgtgcgc 3000

catgtataga agatctgcaa ttacgccact attggcagaa tatgagcacc agacattcct 3060

agggcgtccg agcaactttg gtgaggatcg ccatctcaca atcctgatgc tgaaggcggg 3120

atttcggacc gggtacgtcc caggtgccgt agcgaggacg ttggttccgg atgggctggc 3180

gccgtacctg cgccagcaac tccgctgggc ccgcagcact tatcgcgaca ccgccctcgc 3240

cttacgtata aagaaaaatc taagcaaata tatcaccttt gagatatgcg cacagaattt 3300

gggtacggct ctcttacttg tgatgaccat gatttcgctt tcgctgacta catcagggtc 3360

gcaaacgccc gttatcattc tgggtgtcgt tgtggggatg tctataataa gatgttgttc 3420

tgtcgccctt atagcgaaag attttcggtt tctatacttc atcgttcact cagcgttgaa 3480

tgttctaatt ttaacgccgt taaaactcta tgccctgtta accattcggg atagtcggtg 3540

gctatcacgc gagagttcca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 3 600

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 3660

cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct 3720

gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg 3780

ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt 3 840

ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa 3 900

gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 3960

cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat 402 0

ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga 4080

cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt 4140

gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga 4200

gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 4260

ggacgagctg tacaagtaaa gcggccgcga ctctagcaag cttggacacg ctgaaatcac 4320

cagtctctct ctacaaatct atctctctct attttctcca taataatgtg tgagtagttc 4380

ccagataagg gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca tataagaaac 4440

ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta attcctaaaa 4500

ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcatg catggtacag cggccaattg ccaattccgg 4560

ggtaccggtc gacggccgag tactggcagg atatataccg ttgtaatttg tcgcgtgtga 4620

ataagtcgct gtgtatgttt gtttgattgt ttctgttgga gtgcagccca tttcaccgga 4680<210> 12<211> 5490

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> T-DNA de pTDBI5<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> Margem esquerda de T-DNA (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (56).. (316)

<223> 3' nos: 3' UTR a partir do gene nopalina sintase de T-DNA pTIT37(complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (887)..(336)

<223> bar: seqüência codificada de fosfinotrecina acetil transferasede Streptomyces hygroscopicus (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (888)..(1720)

<223> P35S3: região promotora do gene CaMV 35S (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (1796) .. (2303)

<223> região promotora P35S2 do gene CaMV35S<220>

<221> misc_feature

<222> (2304)..(2368)

<223> 5'cab22L: seqüência condudtora não-traduzida de gene cab22L dePetunia<220>

<221> misc_feature

<222> (2369) .. (3992)

<223> chs2exonl: exon 1 de gene quitina sintase 2 de Neurospora crassa<220>

<221> misc_feature

<222> (3993) .. (5203)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5205) . . (5453)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5488) .. (5512)

<400> 12

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60

tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120

ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180

taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240

gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300

tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480

atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540

gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660

gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720

cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780

aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggggagatagatt tatagagaga gactggtgatttccttatat agaggaaggg tcttgcgaagcagtggagat gtcacatcaa tccacttgctccacgatgct cctcgtgggt gggggtccatgaatgatagc ctttccttta tcgcaatgatctgtcctttc gatgaagtga cagatagctgttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagcccttttggagta gaccagagtg tcgtgctccatgagtcgtaa aagactctgt atgaactgttcctcgatttg aatcttagac tccatgcatggagactccaa tctctattac ttgccttggtggaatagtac ttctgatctt gagaaatatgctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttcttactcgggt agatcgtctt gatgagacctcccgggcata tggcgcgcca tatgcaccattaacagaact cgccgtgaag actggcgaacacaagaagaa aatcttcgtc aacatggtggtcaaagatac agtctcagaa gaccaaagggcgggaaacct cctcggattc cattgcccagaaaaggaagg tggcacctac aaatgccatcatgcctctgc cgacagtggt cccaaagatgaagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagctaagggatga cgcacaatcc cactatccttcatttcattt ggagaggact cgagctcatttcttttctct tcttattaaa ccaaaaccatttccgccaca aggacggtac gagccttcaggggatcgagt tacggaaatg cgaggcgacccaatagccca agtcgcgcag cgagtcattacgtgacagtt agcatgggac cggacgacgatctcagcgaa acgcgccacc tcáacgacgccagcgaagat ccccacggca cccacgcgcg

cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900

ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960

gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020

ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080

ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140

ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200

ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260

tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320

ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380

cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440

gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500

ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560

tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620

ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680

gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740

acatggagtc aaaaattcag atcgaggatc 1800

agttcataca gagtctttta cgactcaatg 1860

agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 1920

ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 1980

ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 2040

attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 2100

gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 2160

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 2220

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 2280

tctctattac ttcagccata acaaaagaac 2340

ggagtccaga atcagcaacc ggttatcgag 2400

aaatcgatgt catgccaggc cagggacacc 2460

gcttccctcg gcaccagcgc ctttacacta 2520

tccacggtac catggaggtt atgcggacga 2580

tcgtacagat atctttggcc ccgaaaccga 2640

atacgggttt cggtcatccc agatcaccct 2700

ttcccggtac gacgacgaag acgatgtgag 2760caccacttat tcctccaaca cgggcaccagcggtcccatt ccggaggaag gcaagcacgagaggaaggaa gtccagctca tcaacggcgaattgtattcg tttttgccca ggagagacgacgtcacttgt gaccctgatg actttgttgctcgtaccgcc agggagacgg agctgttcatcggattcaca cggactatgc acgcagtcatcaagagtagg acgtggggag cggatgggtgtggacgagag atcattcacc cccggaccttgcacggtatc gccaagaact ttgtcaaccacacgacacaa gtgtctctgg acagcgacctgccctgccag atgatttttt gcttgaaggaatggttcttc aacgcctttg gcaaagccttcggcacccgc cccggcggca caagtctctacaacgtggcg ggggcctgcg gggaaatcaagctcaaccct ctggtggcta gtcagaacttaccgttggag tcggtgtttg ggtacatcacgtaccatgcg ctgcagaacg atgagacgggcgagacgctc catgggcagc acgcggatgtccgaattctg tgttgggagt tggtggccaagaaggggtgt acgggtgaga cggatgtgcctcgtcgttgg ctcaacggtg ccttcttcgcaatctggaaa accgaccaca cctttatgcgccacctcctg caactcctct tçacctacttctttatcgcc ggcggtctcg ccgatccccacgcgcgcatc atcttcaaca tcctccgctacatcttgtcc ctcggcaacc gtccgcagggcatctacgcc gtcatcatgg tgtacaccacaatccaaccc tctcaaaaat ccgacgacaacaccaacctg atcgtctccg tggctagtacctatctcgac ccctggcaca tgttcacctcctacatctgc acgctccaga tctacgcctt

cgcttcaggt gtcgacaagt tcgagcatta 2820

gcggcgcggc gtgcgaccac cacagatgtc 2880

actcgttctc gagtgcaaga ttccgactat 2940

agtggagttt acgcacatgc ggtacacagc 3000

caggggttac aagttgcgcc agaatatcgg 3060

ctgcgtgacc atgtacaacg aggacgagtt 3120

gaagaacatt tcgcattttt gttcccgaaa 3180

gcagaagatt gtggtctgtg tggtttcgga 3240

ggacgccctc gcagccatgg gcgtttacca 3300

gaaggcggtg caggcccacg tttacgagta 3360

caagttcaag ggcgccgaga agggcatcgt 3420

gaagaaccaa aagaaactca actcgcatag 3480

gaacccgaat gtgtgtatcc tcctagacgt 3 540

ccatctctgg aaagccttcg acacggattc 3600

agcgatgaag gggcggtttg gcgggaattt 3660

tgagtacaag atgagcaata ttctggacaa 3720

ggtgttgccg ggcgccttgt cggcgtatcg 3780

ccatgggccg ttgagtcagt atttcaaggg 3840

gtttacggcg aacatgtact tggccgagga 3900

gaggggtgag aggtgggtgt tgaagtatgt 3960

tgacaccgtc ccggaattcg tctcgcaacg 4020

cgccgtctac tccctcgtcc actttcgaca 4080

caaagccctt ctccacgtcg aattcctcta 4140

ctccctggcc aacttctacc tcgccttcta 4200

cgtcgaccct tttaactcgg acggccacgt 4260

cgtctgcgtc ctgctgatct gcacacaatt 4320

tgccaaaaga atgtatctcg catccatgat 4380

cttcgccacc atcttcatcg tcgtgcgaca 4440

gcccgacctc gaactcggca acaacgtctt 4500

cctcgggctc tacttcgtca tgtcctttct 4560

ggccatccag tactttgtcc tgctgccttc 4620

ttgcaacacc cacgacgtca catggggcac 4680caaaggcgaccgaactggaataatctccgcggattactacgctggccatggcggtttatcgtttgcggcgtatgaaagggtgaggggttgcgctgaaatçtgtgagtagtcatataagaataattcctaatccggggtac<210><211><212><213><220><223><220><221><222><223><220><221><222><223>

cggaggcgcccatcgactcgcgttcccgtgggtggtgtcgcgattcggaaggcgctgtttcgtggagggcgtggggggatggcgaggcggctatctctctgttcctatagtttgtaaaatatccagatca

attggcaaggggatacgacgtccgaggacctggatggtggattggggataagagcgttggagggtcaggcgcggatgtgatgagctagcactattttctcggtttcgctcacttctatcatgcatggtac

gaagcaccgtaatgtctacgagctgcagcaccaacgcgacatttttacttggtcgacgactgaggttgaaagggcaagttagcttggacacataataatgatgtgttgagataaaatttcagcggccaat

47404800486049204980504051005160522052805340540054605490

<220><221><222>

aacgtgatgc gcaccgatctatgccttcgg accaactcgagatcgcgtca tggtccctgcaagtcggtgc gcacgtacatgcggtctcgg aagcgtatggctgtgggcgg tggcggccctattaatctgg tgagtgctcttttaggtgga ttaaggagaaggggatcggg cgagggggttaccagtctct ctctacaaattcccagataa gggaattaggacccttagta tgtatttgtaaaccaaaatc cagtactaaaggtcgacggc cgagtactgg13

5606DNA

ArtificialT-DNA de ppTDBI37

misc_feature(1)..(25)

Margem esquerda de T-DNA (complemento)

misc_feature(56)..(316)

3' nos: 3' UTR a partir do gene nopalina sintase de T-DNA pTlT37(complemento)

misc_feature(336)..(887)<223> bar: seqüência codificada de fosfinotrecina acetil transferasede Streptomyces hygroscopicus (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (888)..(1720)

<223> P35S3: região promotora do gene CaMV 35S transcrita (complemen-to)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1769) . . (2303)

<223> P35S2: região promotora P35S2 do gene CaMV35S<220>

<221> misc_feature

<222> (2304)..(2368)

<223> 5'cab22L: seqüência condudtora de gene cab22L de Petunia<220>

<221> misc_feature

<222> (2373)..(2477)

<223> XylT: sinal de marcação Golgi a partir da proteína beta 1,2-xiIosiltransferase<220>

<221> misc_feature

<222> (2487)..(5321)

<223> codigo de região quitina sintase 2 de Neurospora crassa (exon 1e exon 2)<220>

<221> misc_feature

<222> (5323)..(5571)

<223> 3'35S: 3' UTR fragment of the CaMV 35S transcript

<220>

<221> misc_feature

<222> (5630)..(5606)<223> RB: Margem direita de T-DNA (sintético) (complemento)

<400> 13

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60

tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120

ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180

taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240

gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300

tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480

atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540

gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660

gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 72 0 cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780

aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840

gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900

gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960

ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020

cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080

ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140

gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200

ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260

ttatcctttg 'ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320

ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 1380

tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440

cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500

gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560

ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620

ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680

ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740

cccgggcata tggcgcgcca tatgcaccat acatggagtc aaaaattcag atcgaggatc 1800taacagaact cgccgtgaag actggcgaacacaagaagaa aatcttcgtc aacatggtggtcaaagatac agtctcagaa gaccaaagggcgggaaacct cctcggattc cattgcccagaaaaggaagg tggcacctac aaatgccatcatgcctctgc cgacagtggt cccaaagatgaagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagctaagggatga cgcacaatcc cactatccttcatttcattt ggagaggact cgagctcatttcttttctct tcttattaaa ccaaaaccatagatttttct gtatatgtta cttctcaactactcatcgtc gttttcagcc aaaaccatggccgccacaag gacggtacga gccttcagaagatcgagtta cggaaatgcg aggcgaccgcatagcccaag tcgcgcagcg agtcattatctgacagttag catgggaccg gacgacgatctcagcgaaac gcgccacctc aacgacgcatgcgaagatcc ccacggcacc cacgcgcgttccacttattc ctccaacacg ggcaccagcggtcccattcc ggaggaaggc aagcacgagcggaaggaagt ccagctcatc aacggcgaactgtattcgtt tttgcccagg agagacgaagtcacttgtga ccctgatgac tttgttgccagtaccgccag ggagacggag ctgttcatctgattcacacg gactatgcac gcagtcatgaagagtaggac gtggggagcg gatgggtggcgacgagagat cattcacccc cggaccttggacggtatcgc caagaacttt gtcaaccagacgacacaagt gtctctggac agcgacctcacctgccagat gattttttgc ttgaaggagaggttcttcaa cgcctttggc aaagccttgagcacccgccc cggcggcaca agtctctacc

agttcataca gagtctttta cgactcaatg 1860agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 1920ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 1980ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 2040

attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 2100

gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 2160

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 2220

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 2280

tctctattac ttcagccata acaaaagaac 2340

ggatgagtaa acggaatccg aagattctga 2400

ctctctttct catcatctac ttcgtttttc 2460

agtccagaat cagcaaccgg ttatcgagtt 2520

atcgatgtca tgccaggcca gggacaccgg 2580

ttccctcggc accagcgcct ttacactaca 2640

cacggtacca tggaggttat gcggacgacg 2700

gtacagatat ctttggcccc gaaaccgatc 2760

acgggtttcg gtcatcccag atcaccctca 2820

cccggtacga cgacgaagac gatgtgagca 2880

cttcaggtgt cgacaagttc gagcattacg 2940

ggcgcggcgt gcgaccacca cagatgtcga 3000

tcgttctcga gtgcaagatt ccgactatat 3060

tggagtttac gcacatgcgg tacacagccg 3120

ggggttacaa gttgcgccag aatatcggtc 3180

gcgtgaccat gtacaacgag gacgagttcg 3240

agaacatttc gcatttttgt tcccgaaaca 3300

agaagattgt ggtctgtgtg gtttcggatg 3360

acgccctcgc agccatgggc gtttaccagc 3420

aggcggtgca ggcccacgtt tacgagtaca 3480

agttcaaggg cgccgagaag ggcatcgtgc 3540

agaaccaaaa gaaactcaac tcgcatagat 3600

acccgaatgt gtgtatcctc ctagacgtcg 3660

atctctggaa agccttcgac acggattcca 3720acgtggcggg ggcctgcggg gaaatcaaag cgatgaaggg gcggtttggc gggaatttgc 3780

tcaaccctct ggtggctagt cagaactttg agtacaagat gagcaatatt ctggacaaac 3840

cgttggagtc ggtgtttggg tacatcacgg tgttgccggg cgccttgtcg gcgtatcggt 3900

accatgcgct gcagaacgat gagacgggcc atgggccgtt gagtcagtat ttcaagggcg 3960

agacgctcca tgggcagcac gcggatgtgt ttacggcgaa catgtacttg gccgaggacc 4020

gaattctgtg ttgggagttg gtggccaaga ggggtgagag gtgggtgttg aagtatgtga 4080

aggggtgtac gggtgagacg gatgtgcctg acaccgtocc ggaattcgtc tcgcaacgtc 4140

gtcgttggct caacggtgcc ttcttcgccg ccgtctactc cctcgtccac tttcgacaaa 4200

tctggaaaac cgaccacacc tttatgcgca aagcccttct ccacgtcgaa ttcctctacc 4260

acctcctgca actcctcttc acctacttct ccctggccaa cttctacctc gccttctact 4320

ttatcgccgg cggtctcgcc gatccccacg tcgacccttt taactcggac ggccacgtcg 4380

cgcgcatcat cttcàacatc ctccgctacg tctgcgtcct gctgatctgc acacaattca 4440

tcttgtccct cggcaaccgt ccgcagggtg ccaaaagaat gtatctcgca tccatgatca 4500

tctacgccgt catcatggtg tacaccacct tcgccaccat cttcatcgtc gtgcgacaaa 4560

tccaaccctc tcaaaaatcc gacgacaagc ccgacctcga actcggcaac aacgtcttca 4620

ccaacctgat cgtctccgtg gctagtaccc tcgggctcta cttcgtcatg tcctttctct 4680

atctcgaccc ctggcacatg ttcacctcgg ccatccagta ctttgtcctg ctgccttcct 4740

acatctgcac gctccagatc tacgcctttt gcaacaccca cgacgtcaca tggggcacca 4800

aaggcgacaa cgtgatgcgc accgatctcg gaggcgccat tggcaaggga agcaccgtcg 4860

aactggaaat gccttcggac caactcgaca tcgactcggg atacgacgaa tgtctacgta 4920

atctccgcga tcgcgtcatg gtccctgccg ttcccgtgtc cgaggaccag ctgcagcagg 4980

attactacaa gtcggtgcgc acgtacatgg tggtgtcgtg gatggtggcc aacgcgacgc 5040

tggccatggc ggtctcggaa gcgtatggcg attcggaaat tggggataat ttttacttgc 5100

ggtttatcct gtgggcggtg gcggccctgg cgctgtttag agcgttgggg tcgacgacgt 5160

ttgcggcgat taatctggtg agtgctctcg tggagggcag ggtcaggctg aggttgaata 5220

tgaaagggtt taggtggatt aaggagaagt ggggggatgc ggatgtgaag ggcaagtttg 5280

aggggttggg ggatcgggcg agggggttgg cgaggcggtg agctagcaag cttggacacg 5340

ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct attttctcca taataatgtg. 5400

tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcctataggg tttcgctcat gtgttgagca 5460

tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat aaaatttcta 5520

attcctaaaa ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcatg catggtacag cggccaattc 5580

cggggtacgg tcgacggccg agtact 5606<210> 14

<211> 6464

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> T-DNA Of pTDBI50<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> LB: Margem esquerda de T-DNA (sintético) (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(316)

<223> 3'nos: 3' UTR a partir do gene nopalina sintase de T-DNA pTIT37(complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (336)..(887)

<223> bar: CDS de fosfinotrecina acetil transferase de Streptomyces

hygroscopicus (complemento)<220>

<221> misc_feature

<222> (888)..(1720)

<223> P35S3: região promotora transcrita (complemento)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1766) .. (3173)

<223> F286: região promotora específica de fibra<220>

<221> misc_feature<222> . (3189)..(3250)

<223> 5' cab22L: 5'cab22L: seqüência condudtora de gene cab22L de Pe-tunia

<220>

<221> misc_feature

<222> (3255)..(3359)

<223> XylT: Golgi targeting signal of the beta 1,2 xylosyltransferaseprotein

<220>

<221> misc_feature

<222> (3369) .. (6203)

<223> CHS2: gene quitina sintase 2 de Neurospora crassa

<220>

<221> misc_feature

<222> (3369) .. (6203)

<223> 3' 35S: fragmento de 3' YTR transcrito CaMV 35Ξ

<220>

<221> misc_feature

<222> (6488)..(6464)

<223> RB: Margem direita de T-DNA (sintético) (complemento)

<400> 14

cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atctgcgatc 60tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 120ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 180taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 240gataatcatc 'gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 300tgaacgatct gcttcggatc ctagaacgcg tgatctcaga tctcggtgac gggcaggacc 360ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 420ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 480atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 540gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 600cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 660gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 720cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 780aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 840

gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggtccatggt tatagagaga 900

gagatagatt tatagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 960

ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga ttgtgcgtca tcccttacgt 1020

cagtggagat gtcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt 1080

ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt 1140

gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcta 1200

ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa 1260

ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgacat 1320

ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat 13 80

tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt.cgcçagtctt cacggcgagt tctgttagat 1440

cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg gccttagatt cagtaggaac taccttttta 1500

gagactccaa tctctattac ttgccttggt ttatgaagca agccttgaat cgtccatact 1560

ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg tctttctctg tgttcttgat gcaattagtc 1620

ctgaatcttt tgactgcatc tttaaccttc ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg 1680

ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct gctgcgtagg aacgcggccg ctgtacaggg 1740

cccgggcata tggcgcgccg gtacccaacc tctcgagctg ccatattggg tttttcacta 1800

cccacctctt cattaaatgt atcttcaacc tctcaactcc tttcaccacc agacgaatct 1860

tctttagcaa aatcaaaatg accttatgaa aatttagcac gtccacctcc agattcaaag 1920

gctgtgaatc cccaacttcg gaaattgttc atctccacat tcaagaataa tgagttcctc 1980

aatttgtttt aaçtgattag ccgatattaa gcgagttaga ctccatggaa ataaaatcac 2040

cctaataaat agcaacgctt ttgaacgtct ctaggttcca agcgtgctaa ggagcgccag 2100

taacttcaat ccaagttgtg cgaaaacgta tgaaatggaa ctgagaccag cgttcaacat 2160

cgatgaaaat ttgttttaac aatgagaact gcaaatcctc catagtcttc taacatttca 2220

acattcgaaa tctcgaaaag aaattggctt gatatgattt atttagggtg ttaattttat 2280

gtattataat aatgcacaaa ttgatatttt atgcatcaca tttaatattt ttaaagtata 2340

taatatcaaa tcattttatg aaaataaaaa taccaaataa tacataaatt gatagttcaa 2400

gtatttcatt aaaaattttc aaaatataaa tatcatattg aaacatttta taaaagaata 2460

gataccaaat atgacatcat cccctgttga gagtaaccaa acactgtttt catccagccc 2520

atgagaagta tttggcccaa aagcaaaagt ttcagtacaa tgaattatga atcccaaaaa 2580

aaccccaagt ggtccaggtc caagccagtc tagggctgag gaaagaaatg gaaaaattga 2640

aaagtaattc cagggtctga ttcaatttta ttaaatttag tttgattttg gtttcggttc 2700ataaatttaa aaataatttt aaaatgttataataatctaa aacgataaaa atggcgatttaaaattatct catccagaac tgattaaaacgtgtgcagag taagaataga acatcaacattaagaagcat aaaacgcaag caaaacttgaatcaaccctg aaaatcgccc ttcccctaatctgcagcact caaaaacatt cgccgaatctactccaaacc caaaccacga ccaccacattcgggagctca tttctctatt acttcagccaaaccaaaacc atggatgagt aaacggaatctacttctcaa ctctctcttt ctcatcatctccaaaaccat ggagtccaga atcagcaaccgagccttcag aaatcgatgt catgccaggccgaggcgacc gcttccctcg gcaccagcgccgagtcatta tccacggtac catggaggttcggacgacga tcgtacagat atctttggcctcaacgacgc atacgggttt cggtcatccccccacgcgcg ttcccggtac gacgacgaagcgggcaccag cgcttcaggt gtcgacaagtgcaagcacga gcggcgcggc gtgcgaccactcaacggcga actcgttctc gagtgcaagaggagagacga agtggagttt acgcãcatgcactttgttgc caggggttac aagttgcgccagctgttcat ctgcgtgacc atgtacaacgacgcagtcat gaagaacatt tcgcatttttcggatgggtg gcagaagatt gtggtctgtgcccggacctt ggacgccctc gcagccatggttgtcaacca gaaggcggtg caggcccacgacagcgacct caagttcaag ggcgccgagagcttgaagga gaagaaccaa aagaaactcagcaaagcctt gaacccgaat gtgtgtatcccaagtctcta ccatctctgg aaagccttcg

ataaaactgt tttttaaaaa taaattaatc 2760gaattaagct catattttga aaaaaaaata 2820cgaaccgatg aatcctagaa gccaagccaa 2880tttgctttaa gcttttcgtt gcttgcactc 2940cactagtgtg agtgtgagtg cccatcattc 3000

cagttctaac ctcactttct aacactttca 3060

ttactataaa ctcccagtgt tggtttctcc 3120

ttgcttcgta tctttgatat ctagatctcc 3180

taacaaaaga actcttttct cttcttatta 3240

cgaagattct gaagattttt ctgtatatgt 3300

acttcgtttt tcactcatcg tcgttttcag 3360

ggttatcgag ttccgccaca aggacggtac 3420

cagggacacc gggatcgagt tacggaaatg 3480

ctttacacta caatagccca agtcgcgcag 3 540

atgcggacga cgtgacagtt agcatgggac 3600

ccgaaaccga tctcagcgaa acgcgccacc 3 660

agatcaccct cagcgaagat ccccacggca 3720

acgatgtgag caccacttat tcctccaaca 3780

tcgagcatta cggtcccatt ccggaggaag 3840

cacagatgtc gaggaaggaa gtccagctca 3900

ttccgactat attgtattcg tttttgccca 3960

ggtacacagc cgtcacttgt gaccctgatg 4020

agaatatcgg tcgtaccgcc agggagacgg 4080

aggacgagtt cggattcaca cggactatgc 4140

gttcccgaaa caagagtagg acgtggggag 4200

tggtttcgga tggacgagag atcattcacc 4260

gcgtttacca gcacggtatc gccaagaact 4320

tttacgagta cacgacacaa gtgtctctgg. 4380

agggcatcgt gccctgccag atgatttttt 4440

actcgcatag atggttcttc aacgcctttg 4500

tcctagacgt cggcacccgc cccggcggca 4560

acacggattc caacgtggcg ggggcctgcg 4620gggaaatcaa agcgatgaag gggcggtttggtcagaactt tgagtacaag atgagcaataggtacatcac ggtgttgccg ggcgccttgtatgagacggg ccatgggccg ttgagtcagtacgcggatgt gtttacggcg aacatgtacttggtggccaa gaggggtgag aggtgggtgtcggatgtgcc tgacaccgtc ccggaattcgccttcttcgc cgccgtctac tccctcgtcccctttatgcg caaagccctt ctccacgtcgtcacctactt ctccctggcc aacttctaccccgatcccca cgtcgaccct tttaactcggtcctccgcta cgtctgcgtc ctgctgatctgtccgcaggg tgccaaaaga atgtatctcgtgtacaccac cttcgccacc atcttcatcgccgacgacaa gcccgacctc gaactcggcatggctagtac cctcgggctc tacttcgtcatgttcacctc ggccatccag tactttgtcctctacgcctt ttgcaacacc cacgacgtcagcaccgatct cggaggcgcc attggcaaggaccaactcga catcgactcg ggatacgacgtggtccctgc cgttcccgtg tccgaggaccgcacgtacat ggtggtgtcg tggatggtggaagcgtatgg cgattcggaa attggggatatggcggccct ggcgctgttt agagcgttggtgagtgctct cgtggagggc agggtcaggcttaaggagaa gtggggggat gcggatgtgacgagggggtt ggcgaggcgg tgagctagcactctacaaat ctatctctct ctattttctcgggaattagg gttcctatag ggtttcgctctgtatttgta tttgtaaaat acttctatcacagtactaaa atccagatca tgcatggtac<210> 15

gcgggaattt gctcaaccct ctggtggcta 4680

ttctggacaa accgttggag tcggtgtttg 4740

cggcgtatcg gtaccatgcg ctgcagaacg 4800

atttcaaggg cgagacgctc catgggcagc 4860

tggccgagga ccgaattctg tgttgggagt 4920

tgaagtatgt gaaggggtgt acgggtgaga 4980

tctcgcaacg tcgtcgttgg ctcaacggtg 5040

actttcgaca aatctggaaa accgaccaca 5100

aattcctcta ccacctcctg caactcctct 5160

tcgccttcta ctttatcgcc ggcggtctcg 5220

acggccacgt cgcgcgcatc atcttcaaca 52 80

gcacacaatt catcttgtcc ctcggcaacc 5340

catccatgat catctacgcc gtcatcatgg 5400

tcgtgcgaca aatccaaccc tctcaaaaat 5460

acaacgtctt caccaacctg atcgtctccg 5520

tgtcctttct ctatctcgac ccctggcaca 5580

tgctgccttc ctacatctgc acgctccaga 5640

catggggcac caaaggcgac aacgtgatgc 5700

gaagcaccgt cgaactggaa atgccttcgg 5760

aatgtctacg taatctccgc gatcgcgtca 5820

agctgcagca ggattactac aagtcggtgc 5880

ccaacgcgac gctggccatg gcggtctcgg 5940

atttttactt gcggtttatc ctgtgggcgg 6000

ggtcgacgac gtttgcggcg attaatctgg 6060

tgaggttgaa tatgaaaggg tttaggtgga 6120

agggcaagtt tgaggggttg ggggatcggg 6180

agcttggaca cgctgaaatc accagtctct 6240

cataataatg tgtgagtagt tcccagataa 6300

atgtgttgag catataagaa acccttagta 6360

ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc 6420

agcggccgcg ttct 6464<211> 982

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Quitina sintase operavelmente ligada ao sinal de marcação XylTgolgi<400> 15

Met Ser Lys Arg Asn Pro Lys Ile Leu Lys Ile Phe Leu Tyr Met Leu1 5 10 15

Leu Leu Asn Ser Leu Phe Leu Ile Ile Tyr Phe Val Phe His Ser Ser

20 25 30

Ser Phe Ser Ala Lys Thr Met Glu Ser Arg Ile Ser Asn Arg Leu Ser

35 40 45

Ser Ser Ala Thr Arg Thr Val Arg Ala Phe Arg Asn Arg Cys His Ala

50 55 60

Arg Pro Gly Thr Piro Gly Seir Seir Tyir Gly Asn Ala Airg Airg Piro Leu65 70 75 80

Pro Ser Ala Pro Ala Pro Leu His Tyr Asn Ser Pro Ser Arg Ala Ala

85 90 95

Ser His Tyr Pro Arg Tyr His Gly Gly Tyr Ala Asp Asp Val Thr Val

100 105 110

Ser Met Gly Pro Asp Asp Asp Arg Thr Asp Ile Phe Gly Pro Glu Thr

115 120 125

Asp Leu Sei Glu Thr Arg His Leu Asn Asp Ala Tyr Gly Phe Arg Ser

130 135 140

Ser Gln Ile Thr Leu Ser Glu Asp Pro His Gly Thr His Ala Arg Ser145 150 155 160

Arg Tyr Asp Asp Glu Asp Asp Val Ser Thr Thr Tyr Ser Ser Asn Thr

165 170 175

Gly Thr Ser Ala Ser Gly Val Asp Lys Phe Glu His Tyr Gly Pro Ile

180 185 190

Pro Glu Glu Gly Lys His Glu Arg Arg Gly Val Arg Pro Pro Gln Met195 200 205

Ser Arg Lys Glu Val Gln Leu Ile Asn Gly Glu Leu Val Leu Glu Cys

210 215 220

Lys Ile Pro Thr Ile Leu Tyr Ser Phe Leu Pro Arg Arg Asp Glu Val225 230 235 240

Glu Phe Thr His Met Arg Tyr Thr Ala Val Thr Cys Asp Pro Asp Asp

245 250 255

Phe Val Ala Arg Gly Tyr Lys Leu Arg Gln Asn Ile Gly Arg Thr Ala

260 265 270

Arg Glu Thr Glu Leu Phe Ile Cys Val Thr Met Tyr Asn Glu Asp Glu

275 280 285

Phe Gly Phe Thr Arg Thr Met His Ala Val Met Lys Asn Ile Ser His

290 295 300

Phe Cys Ser Arg Asn Lys Ser Arg Thr Trp Gly Ala Asp Gly Trp Gln305 310 315 320

Lys Ile Val Val Cys Val Val Ser Asp Gly Arg Glu Ile Ile His Pro

325 330 335

Arg Thr Leu Asp Ala Leu Ala Ala Met Gly Val Tyr Gln His Gly Ile

340 345 350

Ala Lys Asn Phe Val Asn Gln Lys Ala Val Gln Ala His Val Tyr Glu

355 360 365

Tyr Thr Thr Gln Val Ser Leu Asp Ser Asp Leu Lys Phe Lys Gly Ala

370 375 380

Glu Lys Gly Ile Val Pro Cys Gln Met Ile Phe Cys Leu Lys Glu Lys385 390 395 400

Asn Gln Lys Lys Leu Asn Ser His Arg Trp Phe Phe Asn Ala Phe Gly

405 410 415

Lys Ala Leu Asn Pro Asn Val Cys Ile Leu Leu Asp Val Gly Thr Arg

420 425 430

Pro Gly Gly Thr Ser Leu Tyr His Leu Trp Lys Ala Phe Asp Thr Asp

435 440 445

Ser Asn Val Ala Gly Ala Cys Gly Glu Ile Lys Ala Met Lys Gly Arg450 455 460

Phe Gly Gly Asn Leu Leu Asn Pro Leu Val Ala Ser Gln Asn Phe Glu465 470 475 480

Tyr Lys Met Ser Asn Ile Leu Asp Lys Pro Leu Glu Ser Val Phe Gly

485 490 495

Tyr Ile Thr Val Leu Pro Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Arg Tyr His Ala

500 505 510

Leu Gln Asn Asp Glu Thr Gly His Gly Pro Leu Ser Gln Tyr Phe Lys

515 520 525

Gly Glu Thr Leu His Gly Gln His Ala Asp Val Phe Thr Ala Asn Met

530 535 540

Tyr Leu Ala Glu Asp Arg Ile Leu Cys Trp Glu Leu Val Ala Lys Arg545 550 555 560

Gly Glu Arg Trp Val Leu Lys Tyr Val Lys Gly Cys Thr Gly Glu Thr

565 570 575

Asp Val Pro Asp Thr Val Pro Glu Phe Val Ser Gln Arg Arg Arg Trp

580 585 590

Leu Asn Gly Ala Phe Phe Ala Ala Val Tyr Ser Leu Val His Phe Arg

595 600 605

Gln Ile Trp Lys Thr Asp His Thr Phe Met Arg Lys Ala Leu Leu His

610 615 620

Val Glu Phe Leu Tyr His Leu Leu Gln Leu Leu Phe Thr Tyr Phe Ser625 630 635 640

Leu Ala Asil Phe Tyr Leu Ala Phe Tyr Phe Ile Ala Gly Gly Leu Ala

645 650 655

Asp Pro His Val Asp Pro Phe Asn Ser Asp Gly His Val Ala Arg Ile

660 665 670

Ile Phe Asn Ile Leu Arg Tyr Val Cys Val Leu Leu Ile Cys Thr Gln

675 680 685

Phe Ile Leu Ser Leu Gly Asn Arg Pro Gln Gly Ala Lys Arg Met Tyr

690 695 700

Leu Ala Ser Met Ile Ile Tyr Ala Val Ile Met Val Tyr Thr Thr Phe705 710 715 720

Ala Thr Ile Phe Ile Val Val Arg Gln Ile Gln Pro Ser Gln Lys Ser

725 730 735

Asp Asp Lys Pro Asp Leu Glu Leu Gly Asn Asn Val Phe Thr Asn Leu

740 745 750

Ile Val Ser Val Ala Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Phe Val Met Ser Phe

755 760 765

Leu Tyr Leu Asp Pro Trp His Met Phe Thr Ser Ala Ile Gln Tyr Phe

770 775 780

Val Leu Leu Pro Ser Tyr Ile Cys Thr Leu Gln Ile Tyr Ala Phe Cys785 790 795 800

Asn Thr His Asp Val Thr Trp Gly Thr Lys Gly Asp Asn Val Met Arg

805 810 815

Thr Asp Leu Gly Gly Ala Ile Gly Lys Gly Ser Thr Val Glu Leu Glu

820 825 830

Met Pro Ser Asp Gln Leu Asp Ile Asp Ser Gly Tyr Asp Glu Cys Leu

83 5 840 845

Arg Asn Leu Arg Asp Arg Val Met Val Pro Ala Val Pro Val Ser Glu

850 855 860

Asp Gln Leu Gln Gln Asp Tyr Tyr Lys Ser Val Arg Thr Tyr Met Val865 870 875 880

Val Ser Trp Met Val Ala Asn Ala Thr Leu Ala Met Ala Val Ser Glu

885 890 895

Ala Tyr Gly Asp Ser Glu Ile Gly Asp Asn Phe Tyr Leu Arg Phe Ile

900 905 910

Leu Trp Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Phe Arg Ala Leu Gly Ser Thr

915 920 925

Thr Phe Ala Ala Ile Asn Leu Val Ser Ala Leu Val Glu Gly Arg Val

930 935 940

Arg Leu Arg Leu Asn Met Lys Gly Phe Arg Trp Ile Lys Glu Lys Trp945 950 955 960

Gly Asp Ala Asp Val Lys Gly Lys Phe Glu Gly Leu Gly Asp Arg Ala965 970 975

Arg Gly Leu Ala Arg Arg980

Claims (43)

1. Método para aumentar a quantidade de oligossacarídeos oupolissacarídeos positivamente carregados na parede celular, particularmen-te, a parede de célula secundária de uma célula de planta, sendo que o ditométodo compreendei. introduzir ou proporcionar um gene quimérico na célula deplanta, sendo que o dito gene quimérico compreende:- 1. um promotor exprimível por planta;- 2. uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosaminatransferase, em que a dita N-acetilglicosamina transferase pode ser marcadanas membranas do aparelho de Golgi; e- 3. uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita N-acetilglicosamina transferase compreende uma seqüência âncora sinal sele-cionada da seqüência âncora sinal de uma sialil transferase de rato, a se-qüência âncora sinal de uma galactosil transferase humana, a seqüênciaâncora sinal do homólogo de Arabidopsis do receptor HDEL de levedura (A-tERD2), a seqüência âncora sinal da a-2,6-sialiltransferase, a seqüência ân-cora sinal de β-1,2-xilosiltransferase de Arabidopsis thaliana, a seqüênciaâncora sinal de N-acetílgluosoaminil transferase I de tabaco ou a seqüênciade aminoácido YYHDL ou LKLEI.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a dita N-acetilglicosamina transferase compreende a seqüência de aminoácido deSEQ ID Ne 15 da posição 1 à posição 35.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,em que a dita N-acetilglicosamina transferase compreende a seqüência deaminoácido de SEQ ID Ns 15.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito méto-do compreendei. introduzir ou proporcionar um gene quimérico na célula deplanta, sendo que o dito gene quimérico compreende:- 1. um promotor exprimível por planta;- 2. uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosaminatransferase do tipo NODC; e- 3. uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que os ditos oli-gossacarídeos positivamente carregados consistem em β- N-acetilglicosaminas 1-4 ligadas que compreendem 1 a 10 monômeros.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, que compreendeadicionalmente a etapa de tratar a dita parede celular com uma solução álca-li, durante um tempo suficiente para desactetilar o dito oligossacarídeo queconsiste em monômeros de N-acetilglicosamina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que a dita região de DNA codifica uma N-acetilglicosamina transferasetipo NODC obtenível de uma espécie fíhizobium, uma espécie Azorhizobi-um, uma espécie Bradyrhizobium, uma espécie Mesorhizobium, uma espé-cie Ralstonia, uma espécie Streptomyces, uma espécie Burkholderia, umaespécie Cupriavidus ou uma espécie Sinorhizobium.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o dito NODC compreende a seqüência de aminoácido de SEQ IDN9 1, SEQ ID N9 2, SEQ ID N2 3, SEQ ID N2 4, SEQ ID N9 5, SEQ ID N9 6,SEQ ID N9 7, SEQ ID Ns 8, SEQ ID Ns 9, CAA67139, CAA608779, CA-A51774, CAA51773, CAA25811, CAA25810, CAA25814, CAA68619, CA-A2350, CAD31533, CAC05896, CAH04369, CAB56055, NP_629203,P26024, P17862, BAB524500, AAX30050, AAX30049, E38180, JQ0396,ZZZRC4, ZZZRCL, A95321, C23766, C26813, NP_659761, NP_443883,NP_106714, NP_768667, NP_435719, BAC47292, AAU11365, AAU11364,AAU11363, AAU11362, AAU11361, AAU11360, AAU11359, AAU11358,AAU11357, AAU11356, AAU11355, AAU11354, AAU11353, AAU11352,AAU11351, AAU11350, AAU114349, AAU11348, AAU11347, AAU11346,AAU11345, AAU11344, AAU11343, AAU11342, AAU11341, AAU11340,AAU11339, AAU11338, AAK65131, AAS91748, P04679_2, P04679_1,P04679, P72334, Q53513, P50357, P04678, P50536, P53417, Q07755,P04341, P04340, P24151, P04677, CAD90588, CAD90587, CAD90586,CAD90585, CAD90584, CAD90583, CAD90257, CAD43933, ΑΑΜ54775,ΑΑΝ62903, S34305, S09522, S07304, AAL88670, CAD29957, CAD29956,CAD29955, CAD29954, CAD29953, CAD 29952, CAD29951, CAD29950,CAD29949, CAC42489, ΑΑΚ53549, ΑΑΚ53548, ΑΑΚ50872, ΑΑΚ39967, A-ΑΚ39966, ΑΑΚ39965, ΑΑΚ39964, ΑΑΚ39963, ΑΑΚ39962, ΑΑΚ39961, A-ΑΚ39960, ΑΑΚ39959, ΑΑΚ39958, ΑΑΚ39957, ΑΑΚ39956, AAG44125, A-ΑΚ00157, AAG60998, ΑΑΒ71694, ΑΑΒ16897, AAV80567, ΑΑΒ95329, BA-Α24092, ΒΑΑ06089, ΒΑΑ06086, ΒΑΑ06085, ΒΑΑ06083, ΒΑΑ06090, BA-Α06082, ΒΑΑ06087, ΒΑΑ06088, ΒΑΑ06084, ΑΑΒ91695, ΑΑΒ51164, A-ΑΒ47353, ΑΑΒ34509, ΑΑΒ24745, 1615305Ε, 1615305D, 165305C, CA-Α26311, CAΑ26310,CΑΑ3731,AAΑ63602 ou 26226.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-9, em que o dito exprimível por planta é um promotor selecionado do promo-tor específico de fibra de um gene beta tubulina de algodão, um promotorespecífico de fibra de um gene actina de algodão, um promotor específico defibra de um gene de proteína de transferência de lipídeo de algodão, um pro-motor de um gene expansina de algodão ou um promotor de um gene quiti-nase em algodão.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-9, em que a dita planta é selecionada de algodão, cânhamo ou linho.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-10, em que a dita planta é algodão e de preferência, a dita parede celular deplanta está compreendida dentro de uma fibra.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, que compreende adicionalmente a etapa de isolar a dita parede celularde planta ou dita fibra.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, em que a dita parede celular de planta é uma parede de célula secundá-ria.

15. Parede celular de planta que compreende uma quantidadeaumentada de polissacarídeos ou oligossacarídeos, particularmente oligos-sacarídeos positivamente carregados, tais como oligo-N acetilglicosaminasou oligoglicosaminas, de preferência, oligômeros de N-acetilglicosamina ouglicosamina com um grau de polimerização entre 3 e 10, particularmenteentre 3 e 5.

16. Parede celular de planta obtenível através dos métodos co-mo definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

17. Parede celular de planta de acordo com a reivindicação 15,que é obtenível a partir de uma célula radicular ou uma célula de fibra.

18. Célula de planta secundária que é capaz de ligar especifica-mente aglutinina de germe de trigo.

19. Fibra de algodão obtenível através do método como definidona reivindicação 13.

20. Fibra de algodão que é capaz de ligar especificamente aglu-tinina de germe de trigo.

21. Fibra de algodão de acordo com a reivindicação 20, em quea dita WGA ligada é uniformemente distribuída por toda a parede de célulasecundária de dita fibra.

22. Fio ou tecido feito a partir das paredes celulares de planta,como definidas em qualquer uma das reivindicações 15 a 18 ou uma fibra dealgodão como definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 21.

23. Célula de planta que compreende um gene quimérico, comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

24. Planta que consiste essencialmente nas células de plantacomo definidas na reivindicação 23.

25. Planta, de acordo com a reivindicação 24, que é algodão.

26. Uso da parede celular de planta como definida em qualqueruma das reivindicações 15 a 18, da fibra de algodão como definida em qual-quer uma das reivindicações 19 a 21, ou do fio ou tecido como definido nareivindicação 22a. para a liberação controlada de um composto medicinal;b. para a produção de um dispositivo floculento em purificaçãode efluente;c. como um estabilizador em indústria alimentícia, particularmen-te para aumentar a estabilidade ao congelamento-descongelamento;d. como um fluido de congelamento em perfuração;e. para a produção de panos funcionais com ação higiênica;f. para a produção de tecido para cicatrização de feridas; oug. para a produção de papel.

27. Uso de uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase capaz de ser marcada no aparelho de Golgi deuma célula de planta para aumentar a quantidade de oligossacarídeos posi-tivamente carregados na parede celular de uma célula de planta ou paraaumentar a reatividade de paredes celulares de planta para modificaçõesquímicas de tais paredes celulares de planta.

28. Uso de uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC para aumentar a quantidade deoligossacarídeos positivamente carregados na parede de célula de uma cé-lula de planta.

29. Uso de uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC para aumentar a reatividade deparedes celulares de planta para modificações químicas de tais paredes ce-lulares de planta.

30. Uso de uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC para obter paredes celulares deplanta com liberação controlada aperfeiçoada de substâncias, tais comofármacos.

31. Gene quimérico que compreende as seguintes regiões deDNA ligadas de forma operável:a. um promotor exprimível por planta;b. uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosaminatransferase, a dita N-acetilglicosamina transferase quando expressa em umacélula de planta, pode ser marcada no aparelho de Golgi de dita célula deplanta; ec. uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.

32. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 31, em que adita N-acetilglicosamina transferase é ligada a uma seqüência de sinal hete-róloga que marca a dita N-acetilglicosamina transferase no aparelho de Gol-gi da dita célula de planta.

33. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 32, em que adita N-acetilglicosamina transferase compreende uma seqüência âncora desinal selecionada a partir da seqüência âncora de sinal de uma sialil transfe-rase de rato, a seqüência âncora sinal de uma galactosil transferase huma-na, a seqüência âncora sinal do homólogo de Arabidopsis do receptor HDELde levedura (AtERD2), a seqüência âncora sinal da oc-2,6-sialiltransferase, aseqüência âncora sinal de β-1,2-xilosiltransferase de Arabidopsis thaliana, aseqüência âncora sinal de N-acetilgluosoaminil transferase I de tabaco ou aseqüência de aminoácido YYHDL ou LKLEI.

34. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 32, em que adita N-acetilglicosamina transferase compreende a seqüência de aminoácidode SEQ ID Nq 15 da posição 1 à posição 35.

35. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 32, em quea dita N-acetilglicosamina transferase compreende a seqüência de aminoá-cido de SEQ ID No. 15.

36. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 31, em quea dita N-acetilglicosamina transferase é uma N-acetilglicosamina transferasedo tipo NODC.

37. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 36, onde adita N-acetilglicosamina transferase tipo NODC é obtenível de uma espécieRhizobium, uma espécie Azorhizobium, uma espécie Bradyrhizobiuml umaespécie Mesorhizobium, uma espécie Raistonia, uma espécie Streptomyces,uma espécie Burkholderia ou uma espécie Sinorhizobium.

38. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 36, em que adita N-acetilglicosamina transferase do tipo NODC compreende a seqüênciade aminoácido de SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4,SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, CA-A67139, CAA608779, CAA51774, CAA51773, CAA25811, CAA25810, CA-A25814, CAA68619, CAA2350, CAD31533, CAC05896, CAH04369,CAB56055, ΝΡ_629203, Ρ26024, Ρ17862, ΒΑΒ524500, ΑΑΧ30050, A-ΑΧ30049, Ε38180, JQ0396, ZZZRC4, ZZZRCL, Α95321, C23766, C26813,ΝΡ_659761, ΝΡ_443883, ΝΡ_106714, ΝΡ_768667, ΝΡ_435719,BAC47292, AAU11365, AAU11364, AAU11363, AAU11362, AAU11361,AAU11360, AAU11359, AAU11358, AAU11357, AAU11356, AAU11355,AAU11354, AAU11353, AAU11352, AAU11351, AAU11350, AAU114349,AAU11348, AAU11347, AAU11346, AAU11345, AAU11344, AAU11343,AAU11342, AAU11341, AAU11340, AAU11339, AAU11338, ΑΑΚ65131,AAS91748, Ρ04679_2, Ρ04679_1, Ρ04679, Ρ72334, Q53513, Ρ50357,Ρ04678, Ρ50536, Ρ53417, Q07755, Ρ04341, Ρ04340, Ρ24151, Ρ04677,CAD90588, CAD90587, CAD90586, CAD90585, CAD90584, CAD90583,CAD90257, CAD43933, ΑΑΜ54775, ΑΑΝ62903, S34305, S09522, S07304,AAL88670, CAD29957, CAD29956, CAD29955, CAD29954, CAD29953,CAD 29952, CAD29951, CAD29950, CAD29949, CAC42489, ΑΑΚ53549,ΑΑΚ53548, ΑΑΚ50872, ΑΑΚ39967, ΑΑΚ39966, ΑΑΚ39965, ΑΑΚ39964, A-ΑΚ39963, ΑΑΚ39962, ΑΑΚ39961, ΑΑΚ39960, ΑΑΚ39959, ΑΑΚ39958, A-ΑΚ39957, ΑΑΚ39956, AAG44125, ΑΑΚ00157, AAG60998, ΑΑΒ71694, A-ΑΒ16897, AAV80567, ΑΑΒ95329, ΒΑΑ24092, ΒΑΑ06089, ΒΑΑ06086, BA-Α06085, ΒΑΑ06083, ΒΑΑ06090, ΒΑΑ06082, ΒΑΑ06087, ΒΑΑ06088, BA-Α06084, ΑΑΒ91695, ΑΑΒ51164, ΑΑΒ47353, ΑΑΒ34509, ΑΑΒ24745,1615305Ε, 1615305D, 165305C, CAA26311, CA-Α26310.CAA3731 ,ΑΑΑ63602 ou 26226.

39. Gene quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 31 a 38, em que o dito promotor é um promotor seletivo de fibra, par-ticularmente, o promotor seletivo de fibra selecionado do promotor específicode fibra de um gene beta tubulina de algodão, um promotor específico defibra de um gene actina de algodão, um promotor específico de fibra de umgene de proteína de transferência de lipídeo de algodão, um promotor de umgene expansina de algodão ou um promotor de um gene quitinase em algodão.

40. Uso de uma parede celular de planta, como definida emqualquer uma das reivindicações 16 a 18, ou uma fibra, como definida emqualquer uma das reivindicações 19 a 21, para modificação química adicio-nal da dita parede celular de planta ou dita fibra.

41. Método para aumentar a quantidade de oligossacarídeos oupolissacarídeos positivamente carregados, particularmente a parede de célu-la secundária de uma célula de planta, sendo que o dito método compreendei. introduzir um gene quimérico na célula de planta, sendo que odito gene quimérico compreende os seguintes fragmentos de DNA ligadosde forma operável:- 1. um promotor exprimível por planta;- 2. uma região de DNA que codifica quitina sintase; e- 3. uma terminação de transcrição e região de poliadenilação.ii. aplicar na dita célula de planta uma quantidade eficaz de N-acetilglicosamina, glicosamina-6-fosfato, N-acetilglicosamina-6-fosfato, N-acetilglicosamina-1-fosfato ou UDP-N-acetilglicosamina.

42. Uso de uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase para aumentar a reatividade de paredes celula-res de planta para modificações químicas de tais paredes celulares de plan-ta.

43. Uso de uma região de DNA que codifica uma N-acetilglicosamina transferase para aumentar a reatividade de fibras de algo-dão para modificações químicas de tais fibras de algodão.