BRPI0613005A2 - conjugado, composiÇço e uso de um conjugado ou composiÇço - Google Patents

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Abstract

Patente de Invençâo: CONJUGADO, COMPOSIÇçO E USO DE UM CONJUGADO OU COMPOSIÇçO. A presente invenção refere-se a conjugados compreendendo veículos selecionados do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentos biologicamente ativos dos mesmos e um rótulo ou fármaco são descritos. Os referidos conjugados aumentam a potência do fármaco e modificam a farmacocinética do fármaco ou rótulo, O uso desses conjugados no tratamento e diagnóstico de câncer é descrito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGADO, COMPOSIÇÃO E USO DE UM CONJUGADO OU COMPOSIÇÃO".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a veículos conjugados e compo-sições farmacêuticas e seu uso para aumentar a potência de fármacos emodificar a farmacocinética de compostos. Mais particularmente, a presenteinvenção refere-se a conjugados compreendendo o veículo descrito aqui eseu uso no tratamento e diagnóstico de câncer.
Antecedentes da Invenção
A progressão química no tratamento de tumores primáriostem sido lenta e um dos problemas associados a esses tumores é suafraca resposta aos fármacos anticâncer. A eficácia de quimioterapia eimunoterapia tem sido prejudicada pelo fenotipo de resistência a múlti-plos fármacos (MDR) adquirida ou hereditária por células cancerígenas.
Um mecanismo envolvido no fenotipo de MDR é causado pela expressãode P-glicoproteína (P-gp), um transportador na membrana que bombeiavários fármacos anticâncer de células expressando MDR1. P-gp tambémé expressa em um grande número de tecidos secretórios normais, taiscomo rim, fígado e intestino. Essa bomba de efluxo é fortemente expres-sa nos capilares do cérebro, onde sua expressão foi localizada princi-palmente na membrana Iuminal do revestimento de células endoteliaisdessa. Em seres humanos, a P-gp é codificada por dois genes de MDR:MDR1 e MDR3. P-gp codificada pelo gene MDR1 humano confere o fe-notipo de resistência, enquanto que P-gp codificada pelo gene MDR3não-humano. Assim, a P-gp pode ser observada como um guardião quelimita a entrada de fármacos expulsando os mesmos do cérebro ou decélulas cancerígenas, impedindo as mesmas de atingir concentraçõescitotóxicas.
Células cancerígenas que formam metástases cerebrais se ori-ginam principalmente de cânceres de pulmão ou mama, carcinoma colorre-tal, melanoma e tumores do órgão urinário. Essas metástases, as quais fre-qüentemente ocorrem após cirurgia, tratamento com quimioterapia primáriaou radioterapia, são químio-resistentes. Quimioterapia contra metástasescerebrais poderiam ser eficazes apenas se ela foi eficaz para seus tumoresoriginais correspondentes. Por exemplo, foi mostrado que metástases cere-brais originárias de carcinomas de pulmão de células pequenas e célulasgerminativas respondem com taxas similares à metástases em outros locais.
Resistência a fármaco pode ser uma propriedade intrínseca decélulas tumorígenas ou pode ser adquirida após tratamento. A presença dabomba de efluxo de P-gp codificada pelo MDR1 (também aqui referido comoP-glicoproteína, P-gp MDR1 ou MDR1) foi reportada na maioria dos tumorescerebrais primários, onde a maioria dos gliomas e, mais particularmente,células endoteliais de capilares recentemente formados, foram corados posi-tivos para P-gp MDR1. Assim, vários estudos sustentam a idéia de que ofenotipo de resistência a múltiplos fármacos pode ser causado não apenaspela expressão de P-gp em células cancerígenas, mas também a partir desua expressão nas células endoteliais recentemente formadas nos tumores.
Os níveis de MDR1 também foram encontrados significativamente menoresem metástases cerebrais de melanomas e adenocarcinomas de pulmão.
Além disso, foi mostrado que tratamentos antes de cirurgia não têm umgrande impacto sobre os níveis de MDR1 em metástases cerebrais de mela-nomas, uma vez que eles eram idênticos em pacientes que receberam radio-terapia, quimioterapia ou ambos os tratamentos. Em metástases do pulmão,MDR1 foi detectado apenas em pacientes que receberam quimioterapia, in-dicando que esses tratamentos anteriores induziram à sua expressão, resul-tando em um fenotipo de MDR adquirido. A falta de expressão de MDR1 emtumores de pulmão primários e em suas metástases cerebrais correspon-dentes indica também que essas metástases não adquirem os mesmos ní-veis de expressão de P-gp durante seu desenvolvimento que aquelas encon-tradas em tecido cerebral normal. Esses resultados também indicam que osníveis de MDR1 de células endoteliais de capilares em metástases cerebraisdiferiam daqueles de tumores cerebrais primários. A falta de expressão deMDR1 em algumas metástases cerebrais pode explicar, em parte, porquealgumas delas são mais sensíveis a fármacos quimioterapêuticos do quetumores cerebrais primários.
Métodos para transporte de um composto através da barreirasangue-cérebro foram descritos no pedido internacional NPCT/CA2004/000011, publicado em 22 de Julho de 2004 sob a publicaçãoNs W02004060403, o conteúdo total da qual é incorporado aqui por referên-cia. Resumidamente, nesse documento, aprotinina, fragmentos de aprotininae análogos foram apresentados como um sistema de distribuição de fármacopara o sistema nervoso central (CNS) e para tratamento de doenças relacio-nadas ao CNS.
Permanece uma necessidade por aumentar a potência de fár-macos anticâncer.
A presente invenção busca ir de encontro a essas e outras ne-cessidades.
Sumário da Invenção
A presente invenção se refere, em um aspecto da mesma, a umveículo compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do gru-po consistindo da seqüência de aminoácido de aprotinina, um fragmento bio-logicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, deriva-dos ou fragmentos biologicamente ativos dos mesmos. A seqüência de apro-tinina, bem como algumas modalidades exemplificativas de análogos biolo-gicamente ativos, podem ser encontradas no pedido internacional N9PCT/CA2004/000011.
A presente invenção também se refere a um veículo consistindoem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da se-qüência de aminoácido de aprotinina, um fragmento biologicamente ativo deaprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentosbiologicamente ativos dos mesmos.
Modalidades exemplificativas de veículos abrangidos pela pre-sente invenção incluem aquelas as quais podem ser selecionadas, por e-xemplo, do grupo consistindo em:
- aprotinina (SEQ ID Ns: 98),
- um análogo de aprotinina,- um fragmento de aprotinina o qual pode compreender (ou podeconsistir essencialmente de) a seqüência de aminoácido definida em SEQ IDN9: 1,
- um análogo biologicamente ativo de SEQ ID N9: 1,
- um fragmento biologicamente ativo de SEQ ID N9:1, e
- um fragmento biologicamente ativo de um análogo de SEQ IDN9: 1.
Mais particularmente, o veículo pode ser selecionado, por exem-plo, do grupo de:
- um fragmento de aprotinina o qual pode-compreender a se-qüência de aminoácido definida em SEQ ID N9: 1,
- um análogo biologicamente ativo de SEQ ID N9: 1,
- um fragmento biologicamente ativo de SEQ ID Ns: 1, e
- um fragmento biologicamente ativo de um análogo de SEQ IDN9: 1.
De acordo com a presente invenção, o fragmento de aprotininapode consistir da seqüência definida em SEQ ID N9: 1. Ainda de acordo coma presente invenção, o fragmento de aprotinina pode compreender SEQ IDN9: 1 e pode ter um comprimento de cerca de 19 aminoácidos a cerca de 54aminoácidos, por exemplo, de 10 a 50 aminoácidos de comprimento, de 10 a30 aminoácidos de comprimento, etc.
De acordo com a presente invenção, o análogo biologicamenteativo de SEQ ID N9:1 pode ter um comprimento de cerca de 19 aminoácidosa cerca de 54 aminoácidos (por exemplo, incluindo 21 a 23, 25 a 34, 36 a 50e 52 a 54) ou de cerca de 19 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos ou decerca de 19 aminoácidos a cerca de 34 aminoácidos (por exemplo, 19, 20,21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34), de cerca de 19 aminoáci-dos a cerca de 23 aminoácidos ou de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 51aminoácidos.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser amidados,isto é, podem ter uma seqüência de aminoácido amidada.
Um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo (por e-xemplo, de 19 aminoácidos) descrito aqui pode incluir, por exemplo, um poli-peptídeo de cerca de 7, 8, 9 ou 10 to 18 aminoácidos. Portanto, de acordocom a presente invenção, um fragmento biologicamente ativo de SEQ ID Ns:1 ou de um análogo de SEQ ID Ne: 1 pode ter um comprimento de cerca de7 a cerca de 18 aminoácidos ou de cerca de 10 a cerca de 18 aminoácidos.
A patente U.S. N9 5.807.980 descreve um polipeptídeo o qual éidentificado aqui como SEQ ID Ne: 102.
A patente U.S. N5 5.780.265 descreve um polipeptídeo o qual éidentificado aqui como SEQ ID Ns: 103.
A seqüência de aminoácido de aprotinina (SEQ ID N9: 98), a se-qüência de aminoácido de Angiopep-1 (SEQ ID Ne: 67), bem como algumasseqüências de análogos biologicamente ativos podem ser encontradas, porexemplo, no pedido internacional N9 PCT/CA2004/000011 publicado em 22de Julho de 2004, sob a publicação internacional N9 W02004/060403. Adi-cionalmente, a publicação internacional N9 W004/060403 descreve um poli-peptídeo o qual é identificado aqui como SEQ ID Ns: 104.
A patente U.S. N9 5.118.668 descreve polipeptídeos os quaistêm a seqüência ilustrada em SEQ ID N9:105.
Ainda mais particularmente, o veículo pode ser selecionado, porexemplo, do grupo de:
- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 35% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9:1,
- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 40% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9:1,
- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 50% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9:1,
- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 60% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID Ns: 1,
- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 70% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9:1,
- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 80% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID N9:1,- um análogo de SEQ ID N9: 1 o qual pode compreender pelomenos 90% de identidade com a seqüência de aminoácido de SEQ ID Ns: 1 e
- um análogo de SEQ ID Ns: 1 o qual pode compreender pelomenos 95% (isto é, 96%, 97%, 98%, 99% e 100%) de identidade com a se-qüência de aminoácido de SEQ ID N8:1.
Por exemplo, o análogo biologicamente ativo de SEQ ID N9: 1pode compreender uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo em uma seqüência de aminoácido definida em qualquer uma deSEQ ID N9: 2 a SEQ ID N9: 62, SEQ ID N9: 68 a SEQ ID N9: 93 e SEQ ID N9:97, bem como 99, 100 e 101.
Ainda de acordo com a presente invenção, o análogo biologica-mente ativo de SEQ ID N9: 1 pode compreender a seqüência de aminoácidodefinida em SEQ ID N9: 67. Essa seqüência pode, mais particularmente, seramidada.
Por exemplo e sem limitação, conjugados compreendendo pep-tídeos SEQ ID N9: 102, 103, 104 e 105 também são abrangidos pela presen-te invenção.
Ainda de acordo com a presente invenção, o fragmento biologi-camente ativo de SEQ ID N9: 1 ou o fragmento biologicamente ativo de umanálogo de SEQ ID N9: 1 pode compreender pelo menos 9 ou pelo menos10 aminoácidos (consecutivos ou contínuos) de SEQ ID N9: 1 ou do análogode SEQ ID N9: 1.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ter uma seqüên-cia de aminoácido a qual pode compreender de entre 1 a 12 substituições deaminoácido (isto é, SEQ ID N9: 91). Por exemplo, a substituição de aminoá-cido pode ter de entre 1 a 10 substituições de aminoácido ou de 1 a 5 substi-tuições de aminoácido. De acordo com a presente invenção, a substituiçãode aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido não conservativaou uma substituição de aminoácido conservativa.
Por exemplo, quando um polipeptídeo da presente invençãocompreende aminoácidos os quais são idênticos àqueles de SEQ ID N9: 1 eoutros aminoácidos os quais não são idênticos (não-idênticos), aqueles osquais são não-idênticos podem ser uma substituição de aminoácido conser-vativa. A comparação de aminoácidos idênticos e não-idênticos pode serrealizada buscando em uma localização correspondente.
Exemplos de análogo de SEQ ID Ne: 1 os quais podem ter pelomenos 35% de identidade incluem, por exemplo, um polipeptídeo compre-endendo (consistindo em) a seqüência de aminoácido definida em SEQ IDN9: 91 (cerca de 36,8% de identidade, isto é, 7 aminoácidos de 19 aminoáci-dos de SEQ ID Ne: 91 são idênticos à SEQ ID Ne: 1), um polipeptídeo com-preendendo (consistindo em) a seqüência de aminoácido definida em SEQID_N9: 98 (cerca de 68,4% de identidade, isto é, 13 aminoácidos de 19 ami-noácidos são idênticos à SEQ ID Ns: 1), um polipeptídeo compreendendo(consistindo em) a seqüência de aminoácido definida em SEQ ID Ne: 67(cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidossão idênticos à SEQ ID N9: 1), um polipeptídeo compreendendo (consistindoem) a seqüência de aminoácido definida em SEQ ID N9: 76 (cerca de 73,7%de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos àSEQ ID N2:. 1) e um polipeptídeo compreendendo (consistindo em) a se-qüência de aminoácido definida em SEQ ID N9: 5 (cerca de 79% de identi-dade, isto é, 15 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID N9: 1).
Exemplos de análogo de SEQ ID N9: 1 os quais podem ter pelomenos 60% de identidade incluem, por exemplo, um polipeptídeo compre-endendo (consistindo em) a seqüência de aminoácido definida em SEQ IDN9: 98 (cerca de 68.4% de identidade, isto é, 13 aminoácidos de 19 aminoá-cidos são idênticos à SEQ ID N9: 1), um polipeptídeo compreendendo (con-sistindo em) a seqüência de aminoácido definida em SEQ ID Ns: 67 (cercade 73.7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idên-ticos à SEQ ID N9: 1), um polipeptídeo compreendendo (consistindo em) aseqüência de aminoácido definida em SEQ ID N9: 76 (cerca de 73.7% deidentidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQIDN9: 1) e um polipeptídeo compreendendo (consistindo em) a seqüência deaminoácido definida em SEQ ID N9: 5 (cerca de 79% de identidade, isto é,15 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID NO..1).
Exemplos de análogo de SEQ ID NQ: 1 os quais podem ter pelomenos 70% de identidade incluem, por exemplo, um polipeptídeo compre-endendo (consistindo em) a seqüência de aminoácido definida em SEQ IDNs: 67 (cerca de 73,7% de identidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoá-cidos são idênticos à SEQ ID N9: 1), SEQ ID Ns: 76 (cerca de 73,7% de iden-tidade, isto é, 14 aminoácidos de 19 aminoácidos são idênticos à SEQ ID Ne:1), SEQ ID Ns: 5 (cerca de 79% de identidade, isto é, 15 aminoácidos de 19aminoácidos são idênticos à SEQ ID Ne: 1).
De acordo com a presente invenção, o veículo pode, mais parti-cularmente, ser selecionado do grupo consistindo nos peptídeos Nes 5, 67,76, 91 e peptídeo 97 (isto é, SEQ ID NQ: 5, 67, 76, 91 e 97 (Angiopep-2)).
A presente invenção se refere, particularmente, ao uso de umveículo ou da composição farmacêutica descrita aqui para modificação e/ouaperfeiçoamento da farmacocinética (in vivo) de um composto.
De acordo com a presente invenção, o composto pode ser sele-cionado, por exemplo, do grupo consistindo em um rótulo, uma proteína, umpeptídeo e um fármaco de pequena molécula e combinações dos mesmos.
Também de acordo com a presente invenção, o fármaco de pe-quena molécula pode ser, por exemplo, um fármaco anticâncer.
De acordo com a presente invenção, o fármaco anticâncer podeser conjugado com o veículo, desse modo, formando um conjugado. Emuma modalidade exemplificativa da invenção, o conjugado pode compreen-der, por exemplo, pelo menos uma molécula de fármaco anticâncer para ca-da molécula de veículo. Em outra modalidade exemplificativa da invenção, oconjugado pode compreender, por exemplo, pelo menos duas moléculas defármaco anticâncer para cada molécula de veículo. Em ainda outra modali-dade exemplificativa da invenção, o conjugado pode compreender, por e-xemplo, pelo menos três moléculas de fármaco anticâncer para cada molé-cula-veículo.
De acordo com a presente invenção, o veículo pode promover oacúmulo do fármaco em um tecido tal como, por exemplo, um rim (tecidorenal), um fígado (tecido hepático), um olho (tecido do olho) e os pulmões(tecido pulmonar) de um indivíduo.
Ainda de acordo com a presente invenção, o veículo tambémpode mudar a distribuição (usual) tecidual do composto.
De acordo com a presente invenção, o veículo também podepromover o acúmulo do fármaco no cérebro (tecido cerebral) de um indivíduo.
De acordo com a presente invenção, o cérebro pode ser um cé-rebro com tumor.
Ainda de acordo com a presente invenção, o cérebro pode com-preender uma célula de câncer de pulmão.
Também de acordo com a presente invenção, o veículo podepromover o acúmulo do fármaco em uma célula cancerígena (por exemplo,acúmulo intracelular do fármaco na célula cancerígena).
Conforme usado aqui, o termo "cérebro com tumor" se refere aum cérebro o qual compreende um tumor, quer um tumor primário ou umametástase originária de um órgão diferente tal como, sem limitação, umametástase originária de um tumor de pulmão, um tumor de mama, de ummelanoma, de um tumor colorretal, de um tumor de um órgão urinário ououtro. Exemplos de células de cérebro com tumor incluem, assim, por exem-plo, glioblastomas e células metastáticas originárias, por exemplo, do pul-mão, mama, cólon, trato urinário ou de melanoma.
De acordo com a presente invenção, o veículo pode, assim, serusado, por exemplo, para redução da dose de um fármaco necessária paraobter o mesmo efeito terapêutico (por exemplo, obter uma redução no cres-cimento de célula tumorígena, etc.).
A presente invenção ainda se refere ao uso de um veículo sele-cionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamenteativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, análogos, derivados ou frag-mentos biologicamente ativos e combinações dos mesmos para transportede um composto a um local-alvo desejado, um tecido-alvo desejado ou umacélula-alvo desejada.Exemplos de um fármaco de pequena molécula o qual pode serconjugado ao veículo da presente invenção e os quais são abrangidos pelamesma incluem, por exemplo e sem limitação, Taxol1 um derivado de Taxol,vinblastina, vincristina, etoposídeo, doxorrubicina, ciclofosfamida, Taxotero,melphalan, clorambucil, sais farmaceuticamente aceitáveis, etc. e combina-ções dos mesmos, bem como qualquer fármaco o qual possa ser um subs-trato para P-gp.
Outros fármacos de pequena molécula abrangidos pela presenteinvenção podem incluir, por exemplo, um fármaco tendo um grupo que per-mite sua conjugação ao veículo da presente invenção.
De acordo com a presente invenção, modalidades exemplificati-vas de derivados de Taxol (ou análogos) incluem, por exemplo, derivadosdescritos e referidos na Patente U.S. Ns 6.911.549 emitida em 28 de Junhode 2005, os conteúdos totais da qual são incorporados aqui por referência.
Exemplos de rótulos os quais podem ser conjugados ao veículoda presente invenção e os quais são abrangidos pela mesma incluem, porexemplo e sem limitação, um isótopo, um rótulo fluorescente (por exemplo,rodamina), uma molécula repórter (por exemplo, biotina), etc.
Exemplos de proteínas as quais podem ser conjugadas ao veí-culo da presente invenção e as quais são abrangidas pela mesma incluem,sem limitação, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um fármaco base-ado em proteína ou peptídeo (por exemplo, um modulador farmacológicopositivo (agonista) ou um inibidor farmacológico (antagonista)), etc.
A presente invenção também proporciona o uso de um veículoselecionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologica-mente ativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, análogos, derivados oufragmentos biologicamente ativos e combinações dos mesmos para aumen-tar a potência de um fármaco. Mais particularmente, o veículo pode ser usa-do para aumentar, por exemplo, a potência de um fármaco o qual pode serum substrato para P-gp ou fármacos os quais são expulsos (isto é, expeli-dos, ejetados de uma célula, etc.) pela P-gp ou proteína relacionada à P-gp(por exemplo, uma variante alélica de P-gp humana ou de mamífero, porexemplo, as isoformas mdrla e/ou mdrlb de um roedor, etc.).
De acordo com a presente invenção, o veículo pode aumentar,por exemplo, a potência de um fármaco anticâncer, por exemplo, um fárma-co anticâncer o qual pode ser um substrato para P-gp.
Em ainda outro aspecto adicional, a presente invenção se refere,mais particularmente, ao uso de um veículo, conjugado ou da composiçãofarmacêutica descrita aqui para aumento (otimização) de um efeito de cres-cimento antitumor de um fármaco anticâncer.
A presente invenção ainda proporciona o uso de um veículo se-lecionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamenteativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, análogos, derivados ou frag-mentos biologicamente ativos e combinações dos mesmos para transportede um fármaco ou rótulo em ou a um local-alvo desejado ou para transportede um fármaco ou um rótulo dentro de uma célula-alvo e/ou para promoçãodo acúmulo de um fármaco ou um rótulo dentro de uma célula tal como, porexemplo, uma célula a qual expressa P-gp em sua superfície ou uma célulaa qual é capaz de expressar P-gp (em sua superfície).
O veículo pode ser usado, por exemplo, para promoção do acú-mulo, dentro de uma célula, de um fármaco o qual pode compreender a ca-racterística de ser expulso (isto é, expelido, transportado para fora de umacélula, ejetado) pela P-gp ou uma proteína relacionada à P-gp.
De acordo com a presente invenção, o local desejado pode ser,por exemplo e sem limitação, o cérebro ou outros locais fora do cérebro (porexemplo, um local extracraniano) tal como, por exemplo, o rim, o fígado, opâncreas, o cólon, os olhos, os pulmões e combinações dos mesmos. Por-tanto, o local-alvo desejado pode ser um ou mais locais selecionados dogrupo consistindo do cérebro, do rim, do fígado, do pâncreas, do cólon, dosolhos, dos pulmões e combinações dos mesmos.
De acordo com uma modalidade particular da presente inven-çâo, um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, uma célula ou tecidocerebral.
De acordo com outra modalidade particular da presente inven-ção, um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, uma célula ou tecidohepático.
De acordo com uma outra modalidade particular da presenteinvenção, um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, uma célula ou teci-do renal.
De acordo com ainda uma outra modalidade particular da presente invenção,um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, uma célula ou tecido pancre-ático.
De acordo com outra modalidade particular da presente inven-ção, um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, uma célula ou tecido docólon.
De acordo com ainda outra modalidade particular da presenteinvenção, um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, olho ou uma célulado olho.
De acordo com uma outra modalidade particular da presenteinvenção, um local-alvo desejado pode ser, por exemplo, uma célula ou teci-do pulmonar.
Ainda de acordo com a presente invenção, o local desejado po-de ser um local o qual compreende uma célula expressando um receptorveículo ou transportador, por exemplo, uma célula expressando um receptorrelacionado à lipoproteína de baixa densidade (LRP). A célula pode tambémser uma célula a qual co-expressa P-gp ou uma proteína relacionada à P-gp.
A célula pode ser, por exemplo, uma célula normal, uma célula tumorígenaou uma célula metastática. O veículo da presente invenção pode, assim, serusado para objetivar uma célula cerebral, uma célula hepática, uma célularenal, uma célula de pâncreas, uma célula de cólon, uma célula de olho,uma célula pulmonar e combinações das mesmas (normais ou tumorígenas).
A presente invenção também se refere, em um aspecto maisparticular da mesma, ao uso de um veículo descrito aqui (por exemplo, oqual pode ser selecionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmentobiologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, de-rivados ou fragmentos biologicamente ativos dos mesmos) ou da composi-ção farmacêutica ou do conjugado descrito aqui para promoção de acúmulointracelular de um composto (isto é, promoção do acúmulo do compostodentro de uma célula).
De acordo com uma modalidade da presente invenção, o com-posto pode ser selecionado, por exemplo, do grupo consistindo em um rótu-lo, uma proteína, um peptídeo e um fármaco de pequena molécula.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, acélula pode ser uma célula a qual é capaz de expressar P-gp ou a qual ex-pressa P-gp. Mais particularmente, a célula pode expressar P-gp (MDR1) nasuperfície celular.
A célula pode ser, por exemplo, uma célula tumorígena. A célulatumorígena pode se originar, por exemplo e sem limitação, de um tumor ce-rebral, um tumor pulmonar, um tumor de mama, um tumor renal, um tumorno olho, um tumor hepático, um tumor colorretal, um tumor de um órgão uri-nário, etc.
De acordo com a presente invenção, a célula pode estar locali-zada foram do cérebro de um indivíduo (mamífero, animal, etc.). Por exem-plo, a célula pode ser uma célula tumorígena a qual pode estar localizadaforam do cérebro de um indivíduo (mamífero, animal, etc.).
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, acélula pode estar localizada dentro do cérebro de um indivíduo. A célula po-de ser, por exemplo, uma célula tumorígena a qual pode estar localizadadentro do cérebro de um indivíduo (mamífero, animal, etc.).
Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, acélula tumorígena pode ser uma célula de tumor cerebral. Por exemplo, acélula de tumor cerebral pode se originar de um glioblastoma ou pode serum glioblastoma.
Em outra modalidade exemplificativa da presente invenção, acélula tumorígena pode ser uma célula de tumor de pulmão.
A presente invenção também se refere, em um aspecto adicionalda mesma, ao uso do veículo, do conjugado ou da composição farmacêuticadescrita aqui para redução ou eliminação de um fármaco de dentro de umacélula tal como, por exemplo, uma célula a qual pode ser capaz de expres-sar P-gp (MDR1) ou a qual expressa P-gp. De acordo com a presente inven-ção, o fármaco pode ser um substrato para a P-gp.
Também de acordo com a presente invenção, a célula pode seruma célula cancerígena resistente a múltiplos fármacos.
Em ainda um aspecto adicional da mesma, a presente invençãose refere ao uso de um veículo, do conjugado ou da composição farmacêuti-ca descrita aqui para redução do crescimento de uma célula. Para essa fina-lidade, o veículo pode ser conjugado a um fármaco o qual pode ser capaz dereduzir o crescimento de uma célula.
De acordo com uma modalidade exemplificativa não-limitativa dainvenção, o veículo, o conjugado assim formado ou a composição farmacêu-tica pode ser usada para reduzir o crescimento de uma célula tumorígena ouuma célula endotelial.
Em uma modalidade particular da invenção, a célula tumorígenapode ser capaz de expressar ou expressa P-gp (MDR1).
Em uma modalidade exemplificativa da invenção, a célula tumo-rígena pode ser uma célula de tumor cerebral. Mais especificamente, a célu-la de tumor cerebral pode se originar de um glioblastoma ou pode ser umglioblastoma.
Em outra modalidade exemplificativa da invenção, a célula tumo-rígena pode ser uma célula de tumor de pulmão.
Em outra modalidade exemplificativa da invenção, a célula tu-morígena pode ser uma célula de tumor de mama.
Em uma outra modalidade exemplificativa da invenção, a célulatumorígena pode ser uma célula de tumor renal.
Em ainda uma outra modalidade exemplificativa da invenção, acélula tumorígena pode ser uma célula de tumor do olho.
Em uma modalidade adicional da invenção, a célula tumorígenapode ser de um câncer colorretal.
Em outra modalidade adicional da invenção, a célula tumorígenapode ser de um tumor de órgão urinário.Em uma modalidade particular da invenção, o fármaco anticân-cer pode, mais especificamente, ser Taxol, Taxotero ou um derivado de Ta-xol ou Taxotero.
De acordo com outra modalidade da presente invenção, o fár-maco anticâncer pode ser, por exemplo, vinblastina.
De acordo com ainda outra modalidade da presente invenção, ofármaco anticâncer pode ser, por exemplo, vincristina.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, ofármaco anticâncer pode ser, por exemplo, etoposídeo.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, ofármaco anticâncer pode ser, por exemplo, doxorrubicina.
De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção,o fármaco anticâncer pode ser, por exemplo, ciclofosfamida.
De acordo com ainda uma modalidade adicional da presente in-venção, o fármaco anticâncer pode ser, por exemplo, melphalan.
De acordo com ainda outra modalidade da presente invenção, ofármaco anticâncer pode ser, por exemplo, clorambucil.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de umveículo descrito aqui na fabricação de uma composição farmacêutica ou me-dicamento para modificação da farmacocinética do fármaco de pequena mo-lécula.
Mais particularmente, o veículo pode ser usado para redução docrescimento de uma célula.
Também mais particularmente, o veículo pode ser usado parapromoção do acúmulo do fármaco de pequena molécula dentro de uma célula.
Além disso, o veículo pode ser usado para redução da elimina-ção do fármaco de pequena molécula de dentro de uma célula.
Também, o veículo pode ser usado para aumento de um efeitode crescimento antitumor do fármaco de pequena molécula.
Além disso, o veículo pode ser usado para melhorar a biodispo-nibilidade do fármaco de pequena molécula.Além disso e de acordo com a presente invenção, o veículo po-de ser usado para alterar a distribuição tecidual (usual) do fármaco de pe-quena molécula.
Além disso, a presente invenção se refere ao uso de um veículoselecionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologica-mente ativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, um análogo biologica-mente ativo e combinações dos mesmos para o tratamento de câncer, cân-cer metastático e/ou metástase. De acordo com a presente invenção, umametástase exemplificativa pode compreender, sem limitação, uma metástasea qual pode se originar de um tumor de mama, um tumor de pulmão, um me-lanoma, etc.
A presente invenção também se refere ao uso de um veículo se-lecionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamenteativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, análogos, derivados ou frag-mentos biologicamente ativos e combinações dos mesmos para a detecçãode uma célula-alvo desejada.
A presente invenção ainda proporciona o uso de um veículo se-lecionado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamenteativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, análogos, derivados ou frag-mentos biologicamente ativos e combinações dos mesmos para o diagnósti-co de um câncer, um câncer metastático e/ou metástase.
A presente invenção, adicionalmente, se refere, em um outroaspecto, a uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica)compreendendo um veículo (e/ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo) da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção, em um aspecto adicional, se refere a umconjugado e/ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. O conjugadopode compreender, por exemplo, um veículo conforme descrito aqui e umfármaco, um rótulo ou uma proteína, o veículo pode ser covalentemente pre-so ao fármaco, rótulo, proteína ou peptídeo.
Mais particularmente, o conjugado pode compreender, por e-xemplo, um veículo selecionado do grupo consistindo em aprotinina, umfragmento biologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2, aná-logos, derivados ou fragmentos biologicamente ativos e combinações dosmesmos e um composto selecionado do grupo consistindo em um fármaco,um rótulo, uma proteína e combinações dos mesmos. De acordo com a pre-sente invenção, o conjugado pode compreender uma ou mais moléculas defármaco.
Também de acordo com a presente invenção, o composto podeou não ser liberado do veículo. O composto pode, portanto, ser liberável doconjugado (ou do veículo).
De acordo com a presente invenção, o conjugado pode-compre-ender a fórmula R-L-M, em que R é uma classe de moléculas relacionadas àaprotinina (por exemplo, aprotinina, fragmento de aprotinina, Angiopep-1,Angiopep-2, análogos, derivados ou fragmentos), L pode ser um Iigante ouuma ligação e M pode ser um agente ou um fármaco selecionado do grupoconsistindo em um fármaco (por exemplo, um fármaco de pequena molécu-la), um rótulo, uma proteína (um anticorpo, um fragmento de anticorpo) e umpolipeptídeo. Deve ser compreendido aqui que a fórmula R-L-M não se des-tina a estar restrita a uma ordem específica ou proporção específica. Con-forme exemplificado aqui, M pode ser encontrado em várias proporções comrelação a R.
A presente invenção se refere, em um outro aspecto, ao uso deum conjugado o qual pode compreender:
a) um veículo o qual pode ser selecionado do grupo consistindoem aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1,Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentos biologicamente ativos dosmesmos; e
b) pelo menos um fármaco de pequena molécula ou rótulo paramodificação da farmacocinética (in vivo) do fármaco ou rótulo o qual é presoao mesmo.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, o conju-gado pode ser, mais particularmente, usado para redução do crescimento deuma célula.Ainda de acordo com a presente invenção, o conjugado pode serusado para promoção do acúmulo do fármaco de pequena molécula ou rótu-lo dentro de uma célula.
Também de acordo com a presente invenção, o conjugado podetambém ser usado para redução da eliminação do fármaco de pequena mo-lécula ou rótulo de dentro de uma célula.
Ainda de acordo com a presente invenção, o conjugado pode serusado para aumento de um efeito de crescimento antitumor do fármaco depequena molécula.
Também de acordo com a presente invenção, o conjugado podemelhorar a biodisponibilidade do composto.
Ainda de acordo com a presente invenção, o conjugado também pode alterara distribuição tecidual do composto.
Em uma modalidade da invenção, o fármaco de pequena molé-cuia pode ser capaz de reduzir o crescimento de uma célula.
A presente invenção também proporciona, em um aspecto adi-cional da mesma, o uso de um conjugado o qual pode compreender:
a) um veículo o qual pode ser selecionado, por exemplo, do gru-po consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aproti-nina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentos biologi-camente ativos dos mesmos; e
b) pelo menos um fármaco de pequena molécula para fazer (fa-bricação) de uma composição farmacêutica ou medicamento para modifica-ção da farmacocinética do fármaco de pequena molécula.
A presente invenção também se refere ao uso do veículo na fa-bricação de uma composição ou medicamento para o tratamento de umacondição tal como câncer, câncer metastático e/ou metástase.
A presente invenção também proporciona, em um aspecto adi-cional da mesma, o uso de um conjugado o qual pode compreender:
a) um veículo o qual pode ser selecionado, por exemplo, do gru-po consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aproti-nina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentos biologi-camente ativos dos mesmos; e
b) pelo menos um rótulo, para a detecção de uma célula a qualpode ser selecionada, por exemplo, do grupo consistindo em uma célula doolho, uma célula cerebral, uma célula de mama, uma célula hepática, umacélula renal, uma célula de órgão urinário, uma célula de cólon, uma célulado reto e uma célula pulmonar.
Em uma modalidade particular da presente invenção, a célula aqual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célula do olho.
Em outra modalidade particular da presente invenção, a célula aqual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célula cerebral.
Em uma modalidade adicional particular da presente invenção, acélula a qual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célula cerebral.
Em uma modalidade adicional particular da presente invenção, acélula a qual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célula hepática.
Em ainda uma modalidade adicional particular da presente in-venção, a célula a qual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célu-la de mama.
Em outra modalidade particular da presente invenção, a célula aqual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célula renal.
Em ainda outra modalidade particular da presente invenção, acélula a qual pode ser detectada pode ser, por exemplo, uma célula pulmonar.
A presente invenção se refere, adicionalmente, a uma composi-ção (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo um conjugadoda presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
A composição farmacêutica descrita aqui pode ser usada, porexemplo, no tratamento ou detecção de câncer, um câncer metastático e/oumetástase.
A presente invenção proporciona, em um aspecto particular damesma, uma composição farmacêutica a qual pode ser capaz, por exemplo,de reduzir o crescimento de uma célula ou para a detecção de uma célula, acomposição farmacêutica pode compreender:
a) um conjugado o qual pode compreender um veículo selecio-nado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamente ativode aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentosbiologicamente ativos dos mesmos e um rótulo ou um fármaco de pequenamolécula capaz de reduzir o crescimento de uma célula; e
b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção também proporciona, em um outro aspectoda mesma, uma composição farmacêutica a qual pode compreender:
a) um conjugado o qual pode compreender um veículo selecio-nado do grupo consistindo em aprotinina, um fragmento biologicamente ativode aprotinina, Angiopep-1, Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentosbiologicamente ativos dos mesmos e um fármaco de pequena molécula ouum rótulo;
b) um veículo farmaceuticamente aceitável; e
c) um solubilizante.
De acordo com a presente invenção, o solubilizante pode ser,por exemplo, um éster de polioxietileno de ácido graxo. Solubilizantes a-brangidos pela presente invenção incluem, por exemplo, Solutol® HS-15.
Uma modalidade exemplificativa da presente invenção, um solu-bilizante pode compreender, sem limitação, um éster de polioxietileno deácido graxo tal como, por exemplo, Solutol® HS-15.
De acordo com uma modalidade da invenção, a composiçãofarmacêutica pode ser usada, mais especificamente, para modificação dafarmacocinética de um composto, para redução do crescimento de uma célu-la tumorígena ou para a detecção de uma célula tumorígena, etc.
A presente invenção ainda se refere ao uso de pelo menos umconjugado da presente invenção para tratamento de câncer, câncer metastá-tico e/ou metástase. De acordo com a presente invenção, uma metástaseexemplificativa a qual pode ser tratada usando o conjugado da presente in-venção é uma metástase a qual pode se originar, por exemplo e sem limita-ção, de um tumor de mama, um tumor de pulmão, um melanoma, etc.A presente invenção também proporciona, em outro aspecto damesma, um método para tratamento de um câncer (tal como, por exemplo,um tumor primário ou um câncer metastático e/ou uma metástase) ou paradetecção de uma célula cancerígena, o método podendo compreender ad-ministração, a um indivíduo, de uma composição farmacêutica descrita aquiou um conjugado o qual pode compreender:
a) um veículo o qual pode ser selecionado do grupo consistindoem aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1,Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentos biologicamente ativos dosmesmos; e
b) um fármaco anticâncer ou um rótulo.
De acordo com a presente invenção, o indivíduo pode ter, porexemplo, um tumor extracraniano, um tumor cerebral primário ou um tumorcerebral de origem metastática.
O método pode também compreender uma etapa de avaliaçãose o tumor do indivíduo compreende uma célula tumorígena resistente amúltiplos fármacos ou, por exemplo, uma célula expressando P-gp (MDR1)ou determinação se o tumor pode ter ou tem um fenotipo de resistência amúltiplos fármacos.
O indivíduo pode ser um o qual tem um tumor. O indivíduo podetambém ser um o qual recebeu ou o qual receberá quimioterapia ou radiote-rapia ou ambos. O indivíduo também pode ser um que tenha sofrido umacirurgia. Além disso, o indivíduo pode ser um que tem um tumor cerebral oupode também ser um que tem um tumor em outro local que não o cérebro (éisento de um tumor cerebral). Um indivíduo que precisa pode ser também,por exemplo, um indivíduo o qual apresenta ou está em risco de apresentarum fenotipo de resistência a múltiplos fármacos (MDR) a pelo menos umfármaco.
Mais particularmente e de acordo com a presente invenção, oindivíduo pode ter, por exemplo, um tumor extracraniano.
De acordo com a presente invenção, o tumor extracerebral podeser, por exemplo, um tumor de pulmão.Também de acordo com a presente invenção, o tumor extracra-niano pode ser, por exemplo, uma metástase extracraniana de um tumorcerebral. Em uma modalidade específica da presente invenção, o tumor ce-rebral extracraniano pode ser, por exemplo, um glioblastoma (metástase ex-tracraniana de glioblastoma).
Em outra modalidade particular da presente invenção, o indiví-duo pode ter um tumor cerebral de origem metastática. O tumor cerebral deorigem metastática pode se originar, por exemplo, de um tumor de pulmão.O tumor cerebral de origem metastática também pode se originar, por exem-pio, de um.tumor de mama. Adicionalmente, o tumor cerebral de origem me-tastática pode também se originar, por exemplo, de um melanoma. Alémdisso e conforme descrito aqui, o tumor cerebral de origem metastática tam-bém pode se originar, por exemplo, de um câncer colorretal. Além disso, otumor cerebral de origem metastática também pode se originar, por exemplo,de um tumor de órgão urinário.
De acordo com a presente invenção, o tumor pode compreenderuma célula tumorígena a qual pode ser capaz de expressar P-gp ou a qualexpressa P-gp.
De acordo com a presente invenção, o tumor pode compreenderuma célula tumorígena a qual pode ser capaz de expressar LRP ou a qualexpressa LRP.
De acordo com a presente invenção, a célula tumorígena podecompreender uma célula tumorígena a qual pode ser capaz de co-expressarP-gp e LRP ou a qual co-expressa P-gp e LRP. P-gp e LRP podem estarlocalizadas, por exemplo, em uma superfície celular.
Mais particularmente, a presente invenção, em um aspecto damesma, se refere a um método de promoção do acúmulo de um fármaco nocérebro de um indivíduo tendo uma metástase. O método pode compreenderadministração de um veículo ou conjugado conforme descrito aqui a um indi-víduo tendo uma metástase cerebral. De acordo com a presente invenção, ametástase pode se originar de um câncer de pulmão, etc.
A presente invenção proporciona, em um aspecto adicional damesma, um método para promoção do acúmulo intracelular de um compostoselecionado do grupo consistindo em um rótulo, uma proteína, um peptídeoe um fármaco de pequena molécula.
O método pode compreender a etapa de contato da célula oufornecimento, à célula, de um conjugado o qual pode compreender:
a) um veículo o qual pode ser selecionado do grupo consistindoem aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1,Angiopep-2 e análogos, derivados ou fragmentos biologicamente ativos dosmesmos; e
b) o composto desejado.
De acordo com a presente invenção, a célula pode ser, por e-xemplo, uma célula expressando P-gp.
Ainda de acordo com a presente invenção, a célula pode ser, porexemplo, uma célula cerebral, uma célula pulmonar, uma célula de mama,uma célula renal, uma célula do olho ou uma célula hepática.
Também de acordo com a presente invenção, a célula pode ser,por exemplo, uma célula tumorígena a qual pode estar localizada foram docérebro de um indivíduo (mamífero, animal, etc.).
A presente invenção também proporciona, em um aspecto adi-cional, um método para redução da eliminação de um fármaco de dentro deuma célula a qual é capaz de expressar ou a qual expressa P-gp (MDR1).
O método pode compreender conjugação do fármaco a um veí-culo descrito aqui, desse modo, formando um conjugado e proporcionando àcélula o conjugado.
Em uma modalidade exemplificativa da invenção, a célula podeser uma célula cancerígena resistente a múltiplos fármacos.
Em uma outra modalidade exemplificativa da invenção, a célulapode estar compreendida dentro de um tumor extracraniano de um indivíduo.
Em uma modalidade exemplificativa adicional da invenção, acélula pode estar compreendida dentro do cérebro de um indivíduo. A célulapode ser uma célula tumorígena tal como, por exemplo, uma célula de tumorcerebral (primário) ou uma célula de tumor cerebral metastático.
Meios para proporcionar a uma célula um conjugado são, porexemplo, proporcionar o conjugado a um indivíduo que compreende umacélula resistente a múltiplos fármacos ou uma célula tumorígena resistente amúltiplos fármacos (por exemplo, uma célula a qual expressa MDR1).
De acordo com a presente invenção, o método pode ser usadopara reduzir a eliminação de um fármaco o qual é um substrato para a P-gpou o qual pode ser um substrato para a P-gp.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um métodopara redução do crescimento de uma célula. O método pode compreendercontato da célula com um conjugado o qual pode compreender:
a) um veículo o qual pode ser selecionado do grupo consistindoem aprotinina, um fragmento biologicamente ativo de aprotinina, Angiopep-1,Angiopep-2 e análogos, derivados biologicamente ativos; e
b) um fármaco capaz de reduzir o crescimento de uma célula oua composição farmacêutica descrita aqui.
De acordo com a presente invenção, o veículo pode ser usadopara aumentar a potência (eficiência, eficácia) do fármaco de pequena molé-cula.
De acordo com a presente invenção, conjugação do fármaco depequena molécula com o veículo pode ser obtida através de vários meios osquais podem incluir uso de um Iigante (por exemplo, um Iigante capaz degerar uma ligação de éster) o qual pode permitir a associação do fármacoatravés de um átomo adequado, por exemplo, através de um átomo de oxi-gênio.
Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona ummétodo para modificação da farmacocinética de um composto o qual podeser selecionado, por exemplo, do grupo consistindo em um rótulo, uma pro-teína, um peptídeo e um fármaco de pequena molécula, o método podendocompreender a etapa de conjugação do composto com um veículo descritoaqui, desse modo, formando um conjugado e fornecimento do conjugado aum indivíduo que precisa.De acordo com a presente invenção, uma proporção de umamolécula do composto para cada molécula de veículo pode ser usada para aetapa de conjugação.
Ainda de acordo com a presente invenção, uma proporção depelo menos duas moléculas do composto para cada molécula de veículopode ser usada para a etapa de conjugação.
Também de acordo com a presente invenção, uma proporção depelo menos três moléculas do composto para cada molécula de veículo podeser usada para a etapa de conjugação.
Em uma modalidade particular da invenção, o composto podeser, por exemplo, um fármaco de pequena molécula.
Em outra modalidade particular da invenção, o composto podeser, por exemplo, um rótulo.
De acordo com a presente invenção, o indivíduo que precisa po-de ser, mais particularmente, um indivíduo tendo um tumor. Por exemplo, oindivíduo pode ter um tumor cerebral. De acordo com a presente invenção, otumor cerebral pode ser, por exemplo, um tumor cerebral primário. Tambémde acordo com a presente invenção, o tumor cerebral pode ser, por exemplo,originário de um tecido diferente do tecido cerebral.
Em uma modalidade exemplificativa da invenção, o tumor cere-bral do indivíduo pode ser, por exemplo, um tumor cerebral extracraniano.
De acordo com a presente invenção, o tumor pode compreenderuma célula tumorígena expressando ou o qual é capaz de expressar P-gp(MDR1).
O tumor cerebral pode se originar, por exemplo, de um tumorpulmonar. O tumor cerebral também pode se originar, por exemplo, de umtumor de mama. Também, por exemplo, o tumor cerebral pode se originar deum melanoma.
De acordo com uma modalidade particular da presente inven-çâo, o método pode aumentar (otimizar), por exemplo, um efeito de cresci-mento de antitumor de um fármaco anticâncer (quando comparado com umfármaco não conjugado).De acordo com outra modalidade particular da presente inven-ção, o método pode promover, por exemplo, o acúmulo do composto dentrode uma célula (isto é, no interior de uma célula).
De acordo com ainda outra modalidade particular da presenteinvenção, o método pode permitir uma redução na eliminação do fármaco depequena molécula do interior de uma célula (por exemplo, uma célula ex-pressando P-gp).
De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção,O método pode permitir uma redução do crescimento celular (por exemplo,redução do crescimento de célula tumorígena). -
Além disso, o método pode permitir um aperfeiçoamento na bio-disponibilidade do fármaco de pequena de molécula.
Além disso e de acordo com a presente invenção, o método po-de ser usado para alterar a distribuição tecidüal (usual) do fármaco de pe-quena molécula.
Em ainda um outro aspecto, a presente invenção proporciona ouso de um veículo, conjugado ou composição farmacêutica conforme descri-to aqui para redução do acúmulo LRP-dependente de RAP e para reduçãode um evento ou efeito celular RAP-dependente (por exemplo, intracelular).
Para fins da presente invenção, os termos a seguir são definidosabaixo.
O termo "Angiopep", conforme usado aqui, se refere a Angiopep-1 e Angiopep-2.
Os termos "Taxol-Angiopep" e "TxlAn" são usados permutavel-mente e se referem a Taxol-Angiopep-1 e Taxol-Angiopep-2, compreenden-do 1, 2 ou 3 moléculas de Taxol.
Os termos 'Taxol-Angiopep-1" e 'TxIAnI" são usados permuta-velmente e se referem a Taxol-Angiopep-1 compreendendo 1, 2 ou 3 molé-culas de Taxol.
Os termos 'Taxol-Angiopep-2" e 'TxlAn2" são usados permuta-velmente e se referem a Taxol-Angiopep-2 compreendendo 1, 2 ou 3 molé-culas de Taxol.O termo 'TxIAnI (2:1)" se refere à proporção das moléculas deTaxol com relação ao Angiopep-1 em um determinado conjugado. Por e-xemplo, o termo 'TxIAnI (2:1) se refere a um conjugado tendo 2 molécula deTaxol associadas a uma molécula de Angiopep-1. Além disso, o termo 'T-xlAnl (3:1)" se refere a um conjugado tendo 3 molécula de Taxol associadasa uma molécula de Angiopep-1.
Similarmente, o termo "TxlAn2 (2:1)" se refere à proporção demoléculas de Taxol com relação ao Angiopep-2 em um determinado conju-gado. Por exemplo, o termo 'TxlAn2 (2:1)" se refere a um conjugado tendo 2moléculas de Taxol associadas a uma molécula de Angiopep-2. Além disso,o termo 'TxlAn2 (3:1)" se refere a um conjugado tendo 3 moléculas de Taxolassociadas a uma molécula de Angiopep-2.
O termo "veículo" ou "vetor" se destina a significar um compostoou molécula que é capaz de transportar uma molécula em um local ou célu-la-alvo desejada. Um veículo pode ser preso a (covalentemente ou não) ouconjugado a outro composto ou agente e, desse modo, ser capaz de trans-portar o outro composto ou agente para um local-alvo desejado. O veículopode ser, mas não está limitado a, uma proteína, um peptídeo ou um pepti-domimético e pode ocorrer naturalmente ou ser produzido através de síntesequímica ou tecnologia genética recombinante (engenharia genética).
A expressão "fármaco de pequena molécula" se destina a significar um fár-maco tendo um peso molecular de 1000 g/mol ou menos ou entre 300 e 700g/mol.
Os termos "tratamento", "tratar" e semelhantes se destinam asignificar obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado, porexemplo, inibição do crescimento de células cancerígenas, morte de umacélula cancerígena ou alívio de uma condição ou doença neurológica. O efei-to pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de umadoença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de umacura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível àdoença. 'Tratamento", conforme usado aqui, abrange qualquer tratamentode uma doença em um mamífero, particularmente um ser humano, e inclui:(a) impedir que uma doença (por exemplo, prevenção de câncer) ou condi-ção ocorra em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ain-da não foi diagnosticado como tendo a mesma; (b) inibição de uma doença(por exemplo, interrupção de seu desenvolvimento); ou (c) alívio de uma do-ença (por exemplo, redução dos sintomas associados a uma doença). 'Tra-tamento", conforme usado aqui, abrange qualquer administração de um a-gente farmacêutico ou composto a um indivíduo para tratar, curar, aliviar,melhorar, diminuir ou inibir uma condição no indivíduo incluindo, sem limita-ção, administração de um fármaco compreendendo um veículo descrito aquiou um conjugado a um indivíduo que precisa do mesmo.
O termo "câncer" se destina a significar qualquer malignidadecelular cujo único traço é a perda de controles normais, o que resulta emcrescimento desregulado, falta de diferenciação e capacidade de invadir te-cidos locais e metastatizar. Câncer pode se desenvolver em qualquer tecidode qualquer órgão. Mais especificamente, câncer se destina a incluir, semlimitação, câncer cerebral.
Os termos "administração" e "administrar" se destinam a signifi-car um modo de distribuição incluindo, sem limitação, intra-arterialmente,intra-nasalmente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscular-mente, subcutaneamente, transdermicamente ou per os. Uma dosagem diá-ria pode ser dividida em uma, duas ou mais doses em uma forma adequadaa ser administrada uma, duas ou mais vezes no decorrer de um período detempo.
O termo "terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" se des-tina a significar uma quantidade de um composto suficiente para melhorarsubstancialmente algum sintoma associado a uma doença ou condição mé-dica. Por exemplo, no tratamento de câncer, um agente ou composto o qualdiminui, previne, retarda, suprime ou interrompe qualquer sintoma da doençaou condição seria terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de um agente ou composto não é requerida para curar uma doençaou condição, mas proporcionará um tratamento para uma doença ou condi-ção de modo que o início da doença ou condição é retardado, impedido ouinterrompido ou os sintomas da doença ou condição são aliviados ou asconseqüências da doença ou condição são alteradas ou, por exemplo, sãomenos graves ou a recuperação é acelerada em um indivíduo.
O veículo e conjugado da presente invenção podem ser usadosem combinação com métodos convencionais de tratamento e/ou terapia oupodem ser usados separadamente de métodos convencionais de tratamentoe/ou terapia.
Quando os conjugados da presente invenção são administradosem terapias combinadas com outros agentes, elés podem ser administradosseqüencial ou çoncorrentemente a um indivíduo.
Alternativamente, composições farmacêuticas de acordo com apresente invenção podem ser compreendidas de uma combinação de umconjugado de veículo-agente da presente invenção em associação com umveículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente farmaceuticamente acei-tável, conforme descrito aqui, e outro agente terapêutico ou profilático co-nhecido na técnica.
Sais de ácido (adição) farmaceuticamente aceitáveis podem serpreparados através de métodos conhecidos e usados na técnica.
Conforme usado aqui, "composição farmacêutica" significa quan-tidades terapeuticamente eficazes do agente junto com diluentes, conser-vantes, solubilizantes, emulsificantes, adjuvantes e/ou veículos farmaceuti-camente aceitáveis. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz", conformeusado aqui, se refere àquela quantidade a qual proporciona um efeito tera-pêutico para uma determinada condição e regime de administração. Taiscomposições são líquidas ou Iiofilizadas ou, de outro modo, formulações se-cas e incluem diluentes de vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCI,acetato, fosfato), pH e resistência iônica, aditivos, tais como albumina ougelatina, para impedir absorção à superfícies, detergentes (por exemplo,Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácido biliar). Agentes de solubili-zação (por exemplo, glicerol, polietileno glicerol), anti-oxidantes (por exem-plo, ácido ascórbico, metabi-sulfito de sódio), conservantes (por exemplo,timerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias para composição de vo-lume ou modificadores de tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), fixaçãocovalente de polímeros, tal como polietileno glicol à proteína, formação decomplexo com íons de metal ou incorporação do material em ou sobre pre-parados em partículas de compostos poliméricos, tais como ácido poliláctico,ácido poliglicólico, hidrogéis, etc. ou em lipossomas, microemulsões, mice-las, vesículas unilamelares ou multilamelares, eritrócitos ou esferoplastas.
Tais composições influenciarão o estado físico, solubilidade, estabilidade,taxa de liberação in vivo e taxa de eliminação in vivo. Composições com libe-ração controlada ou sustentada incluem formulação em depósitos Iipofílicos(por exemplo, ácidos graxos, ceras, óleos). Também compreendidas pelainvenção são composições em partículas revestidas com polímeros (por e-xemplo, poloxâmeros ou poloxaminas). Outras modalidades das composi-ções da invenção incorporam formas em partículas de revestimentos prote-tores, inibidores de protease ou intensificadores de permeação para diversasvias de administração, incluindo as vias parenteral, pulmonar, nasal, oral,vaginal, retal. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é adminis-trada parenteralmente, paracanceralmente, transmucosalmente, transdermi-camente, intramuscularmente, intravenosamente, intradermicamente, subcu-taneamente, intraperitonealmente, intraventricularmente, intracranialmente eintratumoralmente.
Ainda, conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitá-vel" ou "veículo farmacêutico" são conhecidos na técnica e incluem, mas nãoestão limitados a, tampão de fosfato a 0,01-0,1 M ou 0,05 M ou solução sali-na a 0,8%. Adicionalmente, tais veículos farmaceuticamente aceitáveis po-dem ser um tampão, uma solução aquosa ou não aquosa, suspensões eemulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polieti-leno glicol, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetá-veis, tal como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções,emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina emeios tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de só-dio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer Iactada ou óleosfixos. Veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repo-sitores de eletrólito, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer esemelhantes. Conservantes e outros aditivos também podem estar presen-tes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de com-binação, gases inertes e semelhantes.
Um "fragmento" deve ser compreendido aqui como um polipeptí-deo originário de (abrangendo) uma parte de uma seqüência original ou pre-cursora. Fragmentos abrangem polipeptídeos tendo truncamentos de um oumais aminoácidos, em que o truncamento pode se originar do amino término(N-término), carbóxi término (C-término) ou do interior da proteína. Um frag-mento pode compreender a mesma seqüência que a porção correspondenteda seqüência original. Fragmentos biologicamente ativos do veículo descri-tos aqui são abrangidos pela presente invenção.
Um "derivado", no contexto de proteínas ou peptídeos, deve sercompreendido aqui como um polipeptídeo originário de uma seqüência origi-nal ou de uma porção de uma seqüência original e o qual pode compreenderuma ou mais modificações; por exemplo, uma ou mais modificações em umaseqüência de aminoácido (por exemplo, uma adição, deleção, inserção,substituição de aminoácido, etc.) e uma ou mais modificações na parte prin-cipal ou cadeia lateral de um ou mais aminoácidos ou uma adição de umgrupo ou outra molécula a um ou mais aminoácidos (cadeias laterais ou par-te principal). Derivados biologicamente ativos do veículo descritos aqui sãoabrangidos pela presente invenção.
Um "análogo", no contexto de proteínas ou peptídeos, deve sercompreendido aqui como uma molécula tendo uma atividade biológica e es-trutura química similar àquela de um polipeptídeo descrito aqui. Um análogocompreende um polipeptídeo o qual pode ter, por exemplo, uma ou maisinserções de aminoácido, em uma ou ambas as extremidades do polipeptí-deo e/ou dentro de uma seqüência de aminoácido do polipeptídeo.
Um "análogo" pode ter similaridade de seqüência com aquela deuma seqüência original ou uma porção de uma seqüência original e podetambém ter uma modificação de sua estrutura, conforme discutido aqui. Porexemplo, um "análogo" pode ter pelo menos 90% de similaridade de se-qüência com uma seqüência original ou uma porção de uma seqüência ori-ginal. Um "análogo" também pode ter, por exemplo, pelo menos 70% oumesmo 50% de similaridade de seqüência com uma seqüência original ouuma porção de uma seqüência original. Um "análogo" pode ter, por exemplo,50%, 70%, 80% ou 90% de similaridade de seqüência a uma seqüência ori-ginal com uma combinação de uma ou mais modificações em uma parteprincipal ou cadeia lateral de um aminoácido ou uma adição de um grupo ououtra molécula, etc. Aminoácidos os quais se destinam a ser similares (umaminoácido conservativo) a outros são conhecidos na técnica e incluem, porexemplo, aqueles Iistados na Tabela 1.
Além disso, um "análogo" pode ter pelo menos 50%, 70%, 80%ou 90% de identidade de seqüência com uma seqüência original ou umaporção de uma seqüência original. Também, um "análogo" pode ter, por e-xemplo, 50%, 70%, 80% ou 90% de identidade de seqüência a uma seqüên-cia original com uma combinação de uma ou mais modificações em umaparte principal ou cadeia lateral de um aminoácido ou uma adição de umgrupo ou outra molécula, etc.
Similaridade ou identidade pode ser comparada, por exemplo,sobre uma região de 2, 3, 4, 5, 10, 19, 20 aminoácidos ou mais (e qualquernúmero entre esses). Identidade pode incluir aqui aminoácidos os quais sãoidênticos ao peptídeo original e os quais podem ocupar a mesma ou umaposição similar quando comparado com o polipeptídeo original. Um análogoo qual tem, por exemplo, 50% de identidade com um polipeptídeo originalpode incluir, por exemplo, um análogo compreendendo 50% dos aminoáci-dos do polipeptídeo original e similaridade com outros percentuais. Deve sercompreendido aqui que gaps podem ser encontrados entre os aminoácidosde um análogo os quais são idênticos ou similares aos aminoácidos do pep-tídeo original. Os gaps podem incluir nenhum aminoácidos, um ou mais ami-noácidos os quais não são idênticos ou similares ao peptídeo original. Aná-logos biologicamente ativos do veículo da presente invenção são abrangidosaqui.
Assim, polipeptídeos biologicamente ativos na forma dos poli-peptídeos originais, fragmentos (modificados ou não), análogos (modificadosou não), derivados (modificados ou não), homólogos (modificados ou não)do veículo descrito aqui são abrangidos pela presente invenção.
Portanto, qualquer polipeptídeo tendo uma modificação compa-rado com um polipeptídeo original o qual não destrói significativamente umaatividade biológica desejada é abrangido aqui. É bem sabido na técnica queuma série de modificações podem ser feitas nos polipeptídeos da presenteinvenção sem afetar prejudicialmente sua atividade biológica. Essas modifi-cações podem, por outro lado manter ou aumentar a atividade biológica dopolipeptídeo original ou podem otimizar uma ou mais das particularidades(por exemplo, estabilidade, biodisponibilidade, etc.) dos polipeptídeos dapresente invenção o que, em alguns casos, poderia ser necessário ou dese-jável. Polipeptídeos da presente invenção compreendem, por exemplo, a-queles contendo seqüências de aminoácido modificadas através de proces-sos naturais, tal como processamento pós-traducional, ou através de méto-dos de modificação química os quais são conhecidos na técnica. Modifica-ções podem ocorrer em qualquer parte em um polipeptídeo, incluindo a parteprincipal de um polipeptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e o amino-ou carbóxi-término. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação podeestar presente nos mesmos ou em graus variados em vários locais em umdeterminado polipeptídeo. Também, um determinado polipeptídeo pode con-ter muitos tipos de modificação. Polipeptídeos podem ser ramificados comoum resultado de ubiquitinação e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramifi-cação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem re-sultar de processos naturais pós-traducionais ou podem ser feitos através demétodos sintéticos. Modificações compreendem, por exemplo, sem limita-ção, peguilação, acetilação, acilação, adição de um grupo acetamidometila(Acm), ADP-ribosilação, alquilação, amidação, biotinilação, carbamoilação,carbóxietilação, esterificação, fixação covalente à flavina, fixação covalente auma porção heme, fixação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nu-cleotídeo, fixação covalente de fármaco, fixação covalente de um marcador(por exemplo, fluorescente, radioativo, etc.), fixação covalente de um lipídioou derivado de lipídio, fixação covalente de fosfatidil inositol, ligação cruza-da, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação deligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de pirogluta-mato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora deGPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processa-mento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfa-tação, adição de aminoácidos transferência de RNA-mediada à proteínas,tais como arginilação e ubiquitinação, etc. Deve ser compreendido aqui quemais de uma modificação aos polipeptídeos descritos aqui são abrangidaspela presente invenção até o ponto em que a atividade biológica seja similarao polipeptídeo original (precursor).
Conforme discutido acima, modificação de polipeptídeo podecompreender, por exemplo, inserção (isto é, adição), deleção e substituição(isto é, reposição) de aminoácido, quer conservativa ou não conservativa(por exemplo, D-aminoácidos, desaminoácidos) na seqüência do polipeptí-deo onde tais alterações não mudam substancialmente a atividade biológicaglobal do polipeptídeo.
Exemplos de substituições podem ser aquelas as quais são con-servativas (isto é, em que um resíduo é substituído por outro do mesmo tipoou grupo geral) ou quando desejado, não-conservativa (isto é, em que umresíduo é substituído por um aminoácido de outro tipo). Além disso, um ami-noácido que não ocorre naturalmente pode substituir um aminoácido queocorre naturalmente (isto é, substituição de aminoácido conservativa quenão ocorre naturalmente ou uma substituição de aminoácido não-conservativa que não ocorre naturalmente).
Conforme é compreendido, aminoácidos que ocorrem natural-mente podem ser subclassificados como ácidos, básicos, neutros e polaresou neutros e não-polares. Além disso, três dos aminoácidos codificados sãoaromáticos. Pode ser de uso que polipeptídeos codificados diferindo do poli-peptídeo determinado da presente invenção contenham códons substituídospara aminoácidos os quais são do mesmo tipo ou grupo conforme aquelesdo aminoácido a ser substituído. Assim, em alguns casos, os aminoácidosbásicos Lys, Arg e His podem ser permutáveis; os aminoácidos ácidos Asp eGlu podem ser permutáveis; os aminoácidos polares neutros Ser, Thr, Cys,Gln e Asn podem ser permutáveis; os aminoácidos alifáticos não polaresGly1 Ala, Vai, Ile e Leu são permutáveis mas, em virtude do tamanho, Gly eAla são mais proximamente relacionados e Vai, Ile e Leu são mais proxima-mente relacionados uns aos outros e os aminoácidos aromáticos, Phe, Trp eTyr podem ser permutáveis.
Deverá ser ainda notado que se os polipeptídeos são feitos sin-teticamente, substituições por aminoácidos os quais não são naturalmentecodificados pelo DNA (não ocorrem naturalmente ou-aminoácido não natu-ral) também podem ser feitas.
Um aminoácido que não ocorre naturalmente deve ser compre-endido aqui como um aminoácido o qual não é naturalmente produzido ouencontrado em um mamífero. Um aminoácido que não ocorre naturalmentecompreende um D-aminoácido, um aminoácido tendo um grupo acetilami-dometila preso a um átomo de enxofre de uma cisteína, um aminoácido pe-guilado, etc. A inclusão de um aminoácido que não ocorre naturalmente emuma seqüência de polipeptídeo definida, portanto, gerará um derivado dopolipeptídeo original. Aminoácidos que não ocorrem naturalmente (resíduos)incluem também os ômega aminoácidos da fórmula NH2(CH2)nCOOH, emque η é 2-6, aminoácidos não polares neutros, tais como sarcosina, t-butilalanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina, norleucina, etc. Fenilglicina podesubstituir Trp, Tyr ou Phe; citrulina e sulfóxido de metionina são não polaresneutros, ácido cistéico é ácido e ornitina é básico. Prolina pode ser substituí-da por hidroxiprolina e reter a conformação que confere propriedades.
Sabe-se na técnica que análogos podem ser gerados através demutagênese por substituição e retêm a atividade biológica dos polipeptídeosda presente invenção. Esses análogos têm pelo menos um resíduo de ami-noácido na molécula da proteína removido e um resíduo diferente inseridoem seu lugar. Exemplos de substituições identificadas como "substituiçõesconservativas" são mostrados na Tabela 1. Se tais substituições resultamem uma alteração não desejada, então, outros tipos de substituições, deno-minadas "substituições exemplificativas" na Tabela 1 ou conforme aindadescrito aqui em referência à classes de aminoácido, são introduzidas e osprodutos selecionados.
Em alguns casos, pode ser de interesse modificar a atividadebiológica de um polipeptídeo através de substituição, inserção ou deleção deaminoácido. Por exemplo, modificação de um polipeptídeo pode resultar emum aumento na atividade biológica do polipeptídeo, mas modular sua toxici-dade pode resultar em alterações na biodisponibilidade ou na estabilidadeou pode modular sua atividade imunológica ou identidade imunológica. Modi-ficações substanciais na função ou- identidade imunológica são realizadasatravés de seleção de substituições que diferem significativamente quanto aseu efeito sobre a manutenção de (a) a estrutura da parte principal do poli-peptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação emfolha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local-alvoou (c) o grosso da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente sãodivididos em grupos baseado em propriedades em comum da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, metionina (Met), Alanina (Ala), Vali-na (Vai), Leucina (Leu), Isoleucina (IIe)
(2) hidrofílicos neutros: Cisteína (Cys), Serina (Ser), Treonina(Thr)
(3) ácidos: Ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (GIu)
(4) básicos: Asparagina (Asn), Glutamina (Gln), Histidina (His),Lisina (Lys), Arginina (Arg)
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Glicina(Gly), Prolina (Pro); e aromáticos: Triptofano (Trp), Tirosina (Tyr), Fenilalani-na (Phe).
Substituições não-conservativas requererão troca de um mem-bro de uma dessas classes por outro.Tabela 1. Substituição de aminoácido
<table>table see original document page 38</column></row><table>
Um análogo biologicamente ativo pode ser, por exemplo, umanálogo tendo pelo menos uma substituição conservativa de aminoácido naseqüência original. Um análogo biologicamente ativo pode também ser, porexemplo, um análogo tendo uma inserção de um aminoácido.
Por exemplo um análogo de Angiopep-1 pode ter a fórmula I: X1-Angiopep-I-X2
Por exemplo, um análogo de Angiopep-2 pode ter a fórmula Il :XrAngiopep-2-X2
X1 e X2 podem ser independentemente uma seqüência de ami-noácido de entre 0 a cerca de 100 (por exemplo, de entre 0 a cerca de 60)aminoácidos. Xi e X2 podem ser derivados de aminoácidos consecutivos deaprotinina ou análogos de aprotinina (seqüência de aminoácido homóloga)ou podem ser qualquer outra seqüência de aminoácido (seqüência de ami-noácido heteróloga). Um composto de fórmula I ou Il pode também compre-ender uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido dentro de umaseqüência de aminoácido de Angiopep-1 ou Angiopep-2. O análogo, contu-do, será, de preferência, biologicamente ativo, conforme determinado atra-vés de um dos ensaios descritos aqui ou através de quaisquer ensaios simi-lares ou equivalentes.
Exemplos de análogos de aprotinina podem ser encontradosrealizando um blast de proteína (Genebank: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)da seqüência de aprotinina sintética (ou parte da mesma) descrito no pedidointernacional N2 PCT/CA2004/000011. Análogos de aprotinina exemplificati-vos podem ser encontrados, por exemplo, sob os VPs de acesso CAA37967(GL58005), 1405218C (GL3604747), etc.
Um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo (por e-xemplo, de 19 aminoácidos) descrito aqui pode incluir, por exemplo, um poli-peptídeo de cerca de 7, 8, 9 ou 10 a 18 aminoácidos.
Um polipeptídeo biologicamente ativo (por exemplo, veículo) po-de ser identificado usando um dos ensaios ou métodos descritos aqui. Porexemplo, um veículo candidato pode ser produzido através de síntese depeptídeo convencional, conjugado com Taxol conforme descrito aqui e tes-tado em um modelo in vivo, conforme descrito no Exemplo 5. Um veículobiologicamente ativo pode ser identificado, por exemplo, baseado em suaeficácia na redução da carga de tumor comparado com camundongos trata-dos com placebo. Um candidato a fármaco de pequena molécula o qual po-de ser usado na conjugação de um veículo descrito aqui pode ser identifica-do, por exemplo, determinando se o fármaco é ou não expulso de célulassuperexpressando P-gp conforme descrito aqui e avaliando se a conjugaçãoao veículo aumenta seu acúmulo dentro de uma célula desejada.
Exemplos de veículo biologicamente ativo (isto é, análogo biolo-gicamente ativo de Angiopep-1 e/ou Angiopep-2) podem incluir, por exem-pio, peptídeos derivados do domínio de Kunitz, tais como TFFYGGCRG-KRNNFKTKEY, RFKYGGCLGNKNNYLRLKY e TFFYGGCRAKRNNFKRAKY.
Outros exemplos de análogos biologicamente ativos podem serencontrados na Tabela 2 e na Listagem de Seqüência.Tabela 2: Design de 96 peptídeos a partir de um domínio similar em aprotini-na e Angiopep-1 com diferentes cargas e inserções de aminoácido
<table>table see original document page 40</column></row><table>Deve ser compreendido aqui que, se uma "faixa" ou "grupo desubstâncias" é mencionado com relação a uma característica particular (porexemplo, temperatura, concentração, tempo e semelhantes) da presenteinvenção, a presente invenção se refere a e incorpora explicitamente aquicada e todo membro específico e combinação de sub-faixas ou sub-gruposno mesmo, seja como for. Assim, qualquer faixa ou grupo especificado deveser compreendido como uma forma abreviada de se referir a cada e todomembro de uma faixa ou grupo individualmente, bem como cada e todas aspossíveis sub-faixas ou sub-grupos abrangidos nos mesmos; e, similarmen-te, com relação a quaisquer sub-faixas ou sub-grupos nos mesmos. Assim,por exemplo:
- com relação a um comprimento de 19 aminoácidos de compri-mento ou menos, deve ser compreendido como incorporando especifica-mente aqui cada e todo comprimento individual, por exemplo, um compri-mento de 18, 17, 15, 10, 5, etc. Portanto, a menos que especificamentemencionado, cada faixa mencionada aqui deve ser compreendida comosendo inclusiva. Por exemplo, na expressão de 5 a 19 aminoácidos de com-primento, essa deve ser compreendida como incluindo 5 e 19; e
- similarmente, com relação a outros parâmetros, tais como se-qüências, comprimento, concentrações, elementos, etc.
Em particular, deve ser compreendido que as seqüências, regi-ões, porções definidas aqui incluem, cada uma, cada e todas as seqüênciasindividuais, regiões, porções descritas, bem como cada e todas as possíveissub-seqüências, sub-regiões, sub-porções, quer tais sub-seqüências, sub-regiões, sub-porções sejam definidas como incluindo positivamente possibi-lidades particulares, como excluindo possibilidades particulares ou umacombinação dos mesmos; por exemplo, uma definição passível de exclusãopara uma região pode ser lida como segue: "contanto que o referido polipep-tídeo não seja mais curto do que 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos". Ainda, umoutro exemplo de uma limitação negativa é o seguinte: uma seqüência com-preendendo SEQ ID Ns: X com a exclusão de um polipeptídeo de SEQ IDNe: Y; etc. Outros exemplos de limitações negativas exemplificativas são osseguintes: "outro que não câncer de cérebro" ou "outro que não tecido cere-bral" ou "outro que não células cerebrais".Breve Descrição dos Desenhos
Nos desenhos os quais ilustram modalidades exemplificativas dainvenção:
A Figura 1 é uma seqüência de aminoácido de peptídeos deriva-dos de aprotinina;
A Figura 2 é uma representação esquemática da bomba de eflu-xo, P-glicoproteína (P-gp ou MDR1) na superfície celular. A bomba de eflu-xo, P-gp ou MDR1, associada à resistência a múltiplos fármacos, é altamen-te expressa na superfície celular de muitas células cancerígenas e váriostecidos, incluindo a barreira sangue-cérebro;
A Figura 3 é uma representação esquemática de conjugação deum fármaco ao peptídéo veículo da presente invenção;
A Figura 4 é um cromatograma ilustrando a produção, em altaquantidade, de conjugado TxlAn2 (3:1);
A Figura 5 é uma análise por HPLC do pico purificado sobre umacoluna hidrofóbica usando AKTA-explorer;
A Figura 6 é um diagrama ilustrando a perfusão cerebral in situde Angiopep-2 radio-rotulado e o marcador vascular inulina;
A Figura 7 é um histograma ilustrando o volume de distribuiçãoaparente de transferrina, aprotinina e Angiopeps em cérebro total, capilarescerebrais e parênquima cerebral;
A Figura 8 é um diagrama de proliferação celular na presença dofármaco precursor Taxol. Células de glioblastoma (U-87) foram expostas àvárias concentrações de Taxol durante 3 dias. 3H-timidina incorporada emcélulas foi plotada como uma função das concentrações de Taxol;
A Figura 9A é um diagrama representando o acúmulo de váriosfármacos em células MDCK transfectadas com MDR1 na presença ou au-sência (controle) de CsA a 10 uM, um inibidor de P-gp. O experimento foirealizado na presença de DMSO a 1 %;
A Figura 9B é um diagrama representando o acúmulo do conju-gado em células superexpressando P-gp.
As Figuras 10A e 10B são diagramas representando a distribui-ção tecidual de Taxol e conjugado TxIAnI.
A Figura 11 é um diagrama representando a distribuição pulmo-nar de Taxol e TxIAnI.
A Figura 12 é um diagrama representando os níveis de conjuga-do TxIAnI no plasma e pulmão.
A Figura 13 é um diagrama representando o efeito de tratamentocom TxlAn2 sobre o crescimento do tumor glioblastoma subcutâneo (U-87).
- A Figura 14 são fotografias ilustrando a detecção de β-tubulinaem NCI-H460 através de imunofluorescência ou luz visível em células can-cerígenas expostas ao Taxol ou conjugado TxlAn2, como controle, as célu-las foram expostas a DMSO a 1 %.
A Figura 15 são diagramas ilustrando o efeito de Taxol e conju-gado TxlAn2 sobre o ciclo celular de NCI-H460 medido através de FACS. Ascélulas foram expostas durante 24 horas com o veículo (DMSO), Taxol (100nM) ou conjugado TxlAn2 (30 nM, equivalente a 100 nM de Taxol).
As Figuras 16A e 16B são fotos representando a imunodetecçãode LRP em biópsias de tumor de cérebro humano.
A Figura 17A é um diagrama ilustrando o acúmulo de [125IJ-RAPem fibroblastos MEF-1 e PEA-13 na presença de várias concentrações deaprotinina.
A Figura 17B é um diagrama expressando os resultados da Fi-gura 17A, onde o acúmulo LRP-dependente de [125Ij-RAP foi calculado sub-traindo-se os resultados para a captação obtida com células PEA-13 dosresultados com MEF-1 e expresso como uma função das concentrações deaprotinina.
A Figura 18 é um histograma ilustrando o efeito de aprotinina eAngiopep-2 sobre a captação de RAP. O acúmulo de [125Ij-RAP em fibroblas-tos MEF-1 e PEA-13 foi medido na presença de aprotinina a 25 μΜ ou Angi-opep. O acúmulo LRP-dependente de [125Ij-RAP foi calculado subtraindo-seos resultados para a captação obtida com células PEA-13 dos resultadosobtidos com MEF-1.
A Figura 19A é um diagrama ilustrando a cinética no sangue deconjugado TxlAn2 (3:1) em DMSO a 80% após uma injeção de bólus.
A Figura 19B é um diagrama ilustrando a cinética no sangue deconjugado TxlAn2 (3:1) em Solutol® HS 15 a 20% após uma injeção de bó-lus.
A Figura 19C é um diagrama ilustrando a cinética no sangue deTaxol em DMSO a 80% após uma injeção de bólus.
A Figura 20 são diagramas da distribuição tecidual de conjugadoTxlAn2 (3:1) diluído em DMSO (80%) ou Solutol® HS 15 (20%).
A Figura 21A é um histograma ilustrando a distribuição tecidualde Taxol1 TxlAn2 (3:1) e TxlAn2 (2:1) após injeção intravenosa (i.v.) em vá-rios tecidos.
A Figura 21B é um histograma ilustrando a distribuição tecidualde Taxol, TxlAn2 (3:1) e TxlAn2 (2:1) após injeção intravenosa (i.v.) em cé-rebro normal e com tumor.
A Figura 22A é um gráfico ilustrando o volume de tumor apósadministração i.v. de Taxol (10 mg/kg) ou formulação de conjugado TxlAn2(3:1) (20 mg/kg) (em Solutol®) em camundongos com células NCI-H460 im-plantadas em seus flancos direitos.
A Figura 22B é um gráfico ilustrando o volume de tumor apósadministração i.p. de TxlAn2 (2:1) ou formulação de conjugado TxlAn2 (3:1)(Solutol®) em camundongos com células NCI-H460 implantadas em seuflanco direito.
A Figura 23A é um gráfico ilustrando o volume de tumor apósadministração do veículo (controle), Taxol (10 mg/kg) ou formulação de T-xlAn2 (3:1) (20 mg/kg) através de injeções ou infusão i.p. com bombas Alzet(30 mg/kg/14 dias) em camundongos com células NCI-H460 implantadas emseu flanco direito; os tratamentos são indicados pelas setas.
A Figura 23B é um gráfico ilustrando o volume de tumor apósadministração do veículo (controle), Taxol (10 mg/kg) ou formulação de T-xlAn2 (3:1) (20 mg/kg) através de injeções ou infusão i.p. com bombas Alzet(30 mg/kg/14 dias) em camundongos com células U87 implantadas em seuflanco direito; os tratamentos são indicados pelas setas.Descrição Detalhada da Invenção
Angiopep-1 e -2 representam duas modalidades exemplificati-vas não Iimitativas de peptídeos derivados de aprotinina os quais foram tes-tados aqui (Figura 1). Taxol, o qual representa uma modalidade exemplifica-tiva não Iimitativa de uma molécula ou composto conjugado ao veículo dapresente invenção, foi escolhido como um fármaco anticâncer candidato,uma vez que esse composto natural, isolado da casca e espinhos da árvoreTeixo, é um produto quimioterapêutico altamente eficaz. Além disso, essecomposto é aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para câncerovariano, câncer de mama, câncer de pulmão de células não pequenas esarcoma de Kaposi e é um agente anticâncer bem caracterizado.
Exemplos
Ensaio de Proliferação Celular
Para o ensaio de proliferação celular in vitro, entre 2,5 e 5 X 104células U87 ou A549 foram cultivadas em uma microlâmina de cultura teci-dual com 24 cavidades em um volume final de 1 ml de meio com soro a 10%e incubadas durante 24 horas a 37°C e 5% de CO2. O meio foi, então, subs-tituído por meio isento de soro e incubado durante a noite. Na manhã se-guinte, o fármaco foi recentemente dissolvido em sulfóxido de dimetila (DM-SO) e o meio foi substituído por meio completo contendo o fármaco em dife-rentes concentrações em triplicata. A concentração final de DMSO era de0,1%. O controle usado é uma cavidade de microlâmina com células e semfármaco. As células foram incubadas durante 48 a 72 horas a 37°C e 5% deCO2. Após a incubação, o meio foi trocado e substituído por 1 ml de meiocompleto contendo [3H]-timidina (1 pCi/ensaio). A lâmina foi incubada a 37°Ce 5% de CO2 durante 4 horas. O meio foi removido e as células lavadas comPBS aquecidas a 37°C. As células foram fixadas com uma mistura de eta-nol:ácido acético (3:1), então, lavadas com água e precipitadas 3 vezes comTCA gelado a 10% (ácido tricloroacético). Finalmente, 500 μΙ de PCA (ácidoperclórico) foram adicionados às cavidades e as microlâminas foram aqueci-das durante 30 min a 65°C e 30 min a 75°C. Os conteúdos de cada cavidadeforam, então, transferidos para um frasco de cintilação com 10 ml de coque-tel de cintilação e a atividade foi medida em COM (contagem por minuto)sobre um contador de cintilação de líquido Tri-Carb da Packard.lodinacão de Peptídeos
Peptídeos foram iodinados com procedimentos usando iodo-glóbulos da Sigma. Angiopep-1 e Angiopep-2 foram diluídos em tampão defosfato a 0,1 M, pH de 6,5 (PB). Dois iodo-glóbulos foram usados para cadaproteína. Esses glóbulos foram lavados duas vezes com 3 ml de PB sobreum filtro Whatman e ressuspensos em 60 μΙ de PB. PB. 125I (1 mCi) da A-mersham-Pharmacia Biotech foram adicionados a uma suspensão de glóbu-lo durante 5 min em temperatura ambiente. Cada iodinação foi iniciada atra-vés da adição de peptídeo (100 μg). Após uma incubação de 10 min emtemperatura ambiente, o iodo livre foi removido através de HPLC.
Implante Subcutáneo
De forma a estimar a eficácia dos conjugados e formulações deTaxol sobre o crescimento de tumor, desenvolveu-se um modelo subcutáneode glioblastomas. Nesse modelo, 2,5 χ 106 células em 100 μΙ de meio paracélula sem soro contendo metilcelulose a 1% foram subcutaneamente inje-tadas no flanco dos camundongos. O tumor era claramente visível e pôdeser medido usando um calibrador Vernier. O volume estimado do tumor foi,então, plotado como uma função do tempo.
Perfusão em cérebro de camundonqo in situ
A captação de [125l]-peptídeos ao lado Iuminal de capilares decérebro de camundongo foi medida usando o método de perfusão cerebral insitu adaptado em nosso laboratório para o estudo de captação de fármacono cérebro de camundongo. Resumidamente, a carótida comum direita decamundongos anestesiados com cetamina/xilazina (140/8 mg/kg i.p.) foi ex-posta e ligada ao nível da bifurcação da carótida comum, rostral à artériaoccipital. A carótida comum foi, então, cateterizada rostralmente com tubula-ção de polietileno cheia de heparina (25 U/ml) e montada sobre uma agulhade 26-gauge. A seringa contendo o fluido de perfusão ([125l]-peptídeos ou[14C]-inulina em tampão de Krebs/bicarbonato em um pH de 7,4 gaseificadocom 95% de O2 e 5% de CO2) foi colocada em uma bomba de infusão(bomba Harvard PHD 2000; Harvard Apparatus) conectada ao cateter. Antesda perfusão, a contribuição do fluxo sangüíneo contra-lateral foi eliminadaatravés de separação dos ventrículos cardíacos. O cérebro foi perfundidodurante 60 s com tampão de Krebs, para lavar o excesso de [125l]-proteínas.Os camundongos foram, então, decapitados para terminar a perfusão e ohemisfério direito foi isolado sobre gelo antes de ser submetido à depleçãocapilar. Alíquotas de homogenatos, sobrenadantes, péletes e perfusatos fo-ram tomados para medir seus teores de [125l]-conjugados através de precipi-tação com TCA e avaliar o volume evidente de distribuição.
Exemplo 1
Preparo de conjugados
Uma vez que a resistência a vários fármacos, tais como vincris-tina, etoposídeo e doxorrubicina, é mediada através de superexpressão deP-gp (MDR1) (Figura 2), quaisquer métodos para ultrapassar essa bomba deefluxo pode potencializar a ação desses fármacos sobre vários tipos de cân-cer. A superação de P-gp pode, portanto, ser útil para aumentar a potênciade fármacos os quais estão associados à resistência mediada pela P-gp.Veículos descritos aqui foram, portanto, testados com relação à sua capaci-dade de superar a P-gp.
A conjugação de um fármaco ao veículo descrito aqui é ilustradana Figura 3. Finalmente, de forma da conjugar o Taxol ao veículo Angiopep-1 ou Angiopep-2, Taxol foi primeiro ativado em um derivado de N-succinimida (2'-NHS-Txl). Então, aminas encontradas, por exemplo, em umresíduo de Iisina ou amino-término de Angiopep-1 ou Angiopep-2, reagiramsobre esse Taxol ativado através de formação de uma ligação peptídica (li-gação de amida). Em Angiopep-1 ou Angiopep-2, o amino-término (na posi-ção 1) e as Iisinas (nas posições 10 e 15) foi capaz de reagir com o Taxolativado. Portanto, verificou-se que múltiplas combinações de conjugadosocorriam através da adição de 1, 2 ou 3 Taxols ao peptídeo, dependendo daproporção molar usada (Figura 3). A conjugação toda foi analisada atravésde HPLC e conjugação foi confirmada através de Espectros de Massa (Mal-di-Tof). Descobriu-se que o Taxol era liberável do veículo através de cliva-gem da ligação de éster por esterases. Os conjugados foram, portanto, efi-cazmente produzidos através de combinação do veículo com um fármacoanticâncer.
Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, aprodução do conjugado TxlAn2 (3:1) foi realizada através de adição direta de1 equivalente molar de Angiopep-2 a uma solução de 2,5 equivalentes mola-res de 2'-NHS-Taxol. A reação foi realizada em DMSO a 68% em solução deRinger (pH de 7,3) durante uma hora a 12°C e, após remoção do banho ge-lado, durante cerca de 22 horas em temperatura ambiente (Figura 4). Conju-gado Angiopep-2,2'-NHS-Taxol e TxlAn2 (3:1) são mostrados sobre o cro-matograma através de setas. Alíquotas da reação foram coletadas e anali-sadas através de HPLC após 25 minutos, duas horas e 15 minutos, 5 horase 23 horas, conforme indicado na Figura 4. Os picos de conjugado Angio-pep-2,2'-NHS-Taxol e TxlAn2 (3:1) são mostrados pela seta sobre O croma-tograma. Os resultados da Figura 4 ilustram o desaparecimento de Angio-pep-2 e 2'-NHS-Taxol durante a reação, principalmente ao proveito do con-jugado TxlAn2 (3:1).
Essa mistura de produtos foi separada através de cromatografiahidrofóbica sobre uma coluna RPC 300 mm com uma taxa de fluxo a 4ml/min usando um AKTA-explorer (Figura 5). Para o pico que correspondeao conjugado TxlAn2 (3:1), frações foram empoçadas, analisadas através deHPLC e MS. Na Figura 5, o cromatograma superior corresponde à reação deoperação a t = 23 horas, enquanto que aquele inferior corresponde ao con-jugado TxlAn2 (3:1), o qual foi confirmado através de espectrometria demassa (MW 5107) após purificação no AKTA.
Exemplo 2
Perfusão cerebral in situ de conjugados de Taxol-AnaiopeD-2
Para avaliar a captação cerebral de Angiopep in vivo, a taxa ini-cial de transporte para [125Ij-Angiopep no parênquima cerebral de camun-dongo foi medida usando perfusão cerebral in situ conforme descrito aqui. Océrebro do camundongo foi perfundido durante os tempos indicados com[125l]-Angiopep-2 ou [14C]-inulina. Após perfusão, o cérebro foi ainda perfun-dido durante 60 s com solução de Ringer para lavar o excesso de moléculasradio-rotuladas e, então, o hemisfério direito foi isolado sobre gelo antes deser submetido à depleção capilar. Alíquotas de homogenatos, sobrenadan-tes, péletes e perfusatos foram tomados para medir seus teores em [125I]-Angiopep-2 ou [14C]-inulina. Os resultados obtidos para o acúmulo para es-sas moléculas no parênquima cerebral são ilustrados na Figura 6. O acúmu-lo de [125l]-Angiopep-2 aumentou como uma função do tempo e é maior doque aquela do marcador vascular, [14C]-inulina.
Ainda comparou-se a captação cerebral inicial após uma perfu-são de 5 min para [125l]-aprotinina, [125l]-transferrina e [1251]-Angiopeps (Figu-ra 7) (1:1). Os resultados mostram que Angiopep e aprotinina têm uma taxade transporte inicial maior do que a transferriná.
Exemplo 3
Efeito de conjugados sobre o crescimento celular
Em um ensaio in vitro, foi mostrado aqui que Taxol (não conju-gado) bloqueia a proliferação de células de glioblastoma (U-87) com um va-lor de IC5O em torno de 10 nM (Figura 8). O efeito do Taxol conjugado com oveículo descrito aqui sobre a proliferação de várias linhagens de célula foi,então, avaliado e comparado com o Taxol não conjugado (referido como Ta-xol). Conforme mostrado na Tabela 3, os valores de IC50 obtidos para o con-jugado Taxol-Angiopep-2 (TxlAn2) eram muito similares àqueles do Taxolnão conjugado em muitas células cancerígenas. Células endoteliais de cére-bro de rato (RBE4) eram menos sensíveis do que as linhagens de célulacancerígena testadas. Em geral, esses resultados indicam que a potênciados conjugados de bloquear a proliferação celular in vitro é similar ao Taxolnão conjugado. Para fins de comparação, os resultados obtidos foram ex-pressos em termos da concentração de Taxol.Tabela 3. Efeito do conjugado sobre a proliferação celularLinhagens de célula IC50 (nM)
<table>table see original document page 50</column></row><table>
A maioria dessas células (U-87, U-118, NCI-H460, A549) ex-pressa LRP. Esses dados, contudo, estão indisponíveis para células RBE4.
Exemplo 4
Superação de P-gp pelos conjugados
De forma a determinar se os conjugados da presente invençãoeram substratos para P-gp ou não, células MDCK foram estavelmente trans-fectadas com MDR1 humano (MDCK-MDR1) e foram subseqüentementeincubadas com fármaco anticâncer não-conjugado ou com os conjugados dapresente invenção. Em um primeiro experimento, células MDCK-MDR1 fo-ram incubadas com 3H-VinbIastina (3H-VBL)1 rodamina, 3H-TaxoI, 125I-TaxoI-Angiopep-1 (125I-TxIAnI), 125l-Taxol-Angiopep-2 (125l-TxlAn2) durante 1 horaa 37°C na presença ou ausência de ciclosporina A a 10 μΜ (CsA); um inibi-dor competitivo de P-gp (Figura 9A). Após a incubação, as células foram Ia-vadas e o acúmulo de radioatividade dentro das células ou fluorescênciaintracelular foi quantificada. O aumento no acúmulo desses fármacos é ex-presso em termos de x-vezes comparado com seu respectivo controle medi-do na ausência de CsA. Assim, o valor de controle para cada fármaco foiajustado em 1 -vez.
Em outro experimento, a capacidade dos conjugados de seacumular em células superexpressando P-gp foi monitorada (Figura 9B).células MDCK-MDR1 foram incubadas com 50 nM de 3H-TaxoI, 125I-TaxoI-Angiopep-1 (125I-TxIAn1) ou 125I -Taxol-Angiopep-2 (125l-TxlAn2) durante duas horas a 37°C. Após a incubação, as células foram lavadas e a ra-dioatividade acumulada em células foi quantificada. Os resultados foram ex-pressos como acúmulo de fármaco em pmol/120 min.
Conforme mostrado na Figura 9A, o acúmulo de [3HJ-TaxoI au-mentou em 15-vezes na presença do inibidor competitivo de P-gp; ciclospo-rina A (CsA). O acúmulo de rodamina e [3H] -vinblastina também aumentouem 7,5-vezes e 10-vezes, respectivamente, na presença de CsA. Esses re-sultados mostram que Taxol, rodamina e vinblastina são substratos para P-gp. Contudo, a falta de efeito da CsA sobre o acúmulo de conjugados [125I]-Taxol-Angiopep-1 e [125l]-Taxol- Angiopep-2 indica que eles não são substra-tos para P-gp. O acúmulo de ambos os conjugados, na ausência de CsÁ,era pelo menos 11-vezes maior do que aquele do [3Hj-TaxoI (Figura 9B).Esses últimos resultados confirmam fortemente que ambos os conjugadossuperam a ação da P-gp, uma vez que a P-gp não é capaz de expulsá-losdas células. Esses resultados demonstram, adicionalmente, que a presençade um veículo na conjugação com um fármaco anticâncer aumenta a potên-cia do fármaco. Portanto, os veículos descritos aqui são úteis para o trans-porte de fármacos os quais são usualmente expulsos pela P-gp (isto é, fár-macos os quais são substratos para a P-gp).
Exemplo 5
Distribuição e farmacocinética dos conjugados
O impacto da conjugação do fármaco ao veículo sobre a distribu-ição de fármaco foi avaliado através de administração de 3H-TaxoI (5 mg/kg)ou 125I-TaxoI-Angiopep-I (TxlAn-1) (10 mg/kg, equivalente a 5 mg de Ta-xol/kg) a camundongos. O fármaco anticâncer não conjugado e os conjuga-dos foram injetados intravenosamente (i.v.) em camundongos como um bó-lus. Tecidos foram coletados em diferentes tempos (0,25, 0,5, 1 e 4 horas) ehomogeneizados. De forma a quantificar a quantidade de 3H-TaxoI, homo-genatos teciduais foram digeridos com solubilizante de tecido (solúvel) e 10ml de cintilador de líquido foram, então, adicionados às amostras. A quanti-dade de conjugado 125I- rotulado, nos diferentes tecidos, foi medida apósprecipitação com TCA. A radioatividade associada aos tecidos foi, portanto,quantificada. A área sob a curva (AUC6-4) foi estimada usando o softwarePrism e foi plotada para os diferentes tecidos (Figura 10). Os resultados daFigura 10A indicam que os valores de AUC0-4 obtidos para o conjugado sãomaiores do que aqueles do Taxol em vários tecidos, incluindo o cérebro, rim,fígado e olhos, o que indica um maior acúmulo do conjugado nesses tecidoscomparado com o fármaco não conjugado. Mais particularmente, os resulta-dos apresentados na Figura 10B indicam que o acúmulo do conjugado émuito maior do que o fármaco não conjugado no pulmão.
Resultados de uma experimentação similar conduzida com con-jugado Taxol-angiopep-2 são resumidos na Tabela 4 abaixo. Embora hajauma diferença com os resultados obtidos para o conjugado TxlAn-1, o con-jugado da Tabela 4 também se acumula nos pulmões, cérebro e fígado maiseficazmente do que o Taxol não conjugado.
Tabela 4
<table>table see original document page 52</column></row><table>
Tratamentos equivalentes a 5 mg/kg de Taxol
A cinética do Taxol e acúmulo de Taxol-Angiopep-1 no pulmãotambém são apresentados na Figura 11. Os resultados mostram claramenteque a quantidade do conjugado medida nos pulmões em diferentes tempos émuito maior do que para o fármaco não conjugado. Além disso, observou-seque o acúmulo do conjugado no pulmão também é muito maior do que suaconcentração no soro (plasma) em vários tempos (Figura 12). Os resultadosapresentados nas Figuras 10, 11 e 12 indicam fortemente que a conjugaçãode um fármaco anticâncer (por exemplo, Taxol) ao veículo da presente in-venção (por exemplo, Angiopep-1 ou 2) modifica a biodistribuição do fárma-co anticâncer e sua farmacocinética.
Exemplo 6
Inibição de crescimento de tumor in vivo (U-87)
A capacidade do conjugado de inibir o crescimento de tumor foi,em seguida, avaliado em um modelo in vivo (Figura 13). Células U-87 foram,portanto, subcutaneamente implantadas no flanco direito de camundongos e,no dia 3 pós-implante, os camundongos foram injetados com veículo (DM-SO/Ringer: 80/20; controle), Taxol (5 mg/kg) ou Taxol-Angiopep-2 (10 mg/kg;equivalente a 5 mg de Taxol/kg (3 Taxol : 1 Angiopep-2)). Observou-se quea inibição de crescimento de tumor era mais pronunciada em camundongostratados com o conjugado do que em camundongos tratados com o fármacoanticâncer não conjugado.
Na verdade, no dia 17 pós-implante, o crescimento do tumor foiinibido em mais de 75% pelo conjugado, enquanto que o crescimento dotumor foi inibidor em apenas 34% usando o fármaco não conjugado (Tabela5). Esses resultados mostram que os conjugados descritos aqui são maiseficazes do que o Taxol não conjugado na inibição de crescimento de tumorin vivo. Em geral, um nível de inibição de crescimento de tumor de 2,2-vezesfoi medido para o conjugado comparado com o fármaco não conjugado.
<table>table see original document page 53</column></row><table>Tratamento equivalente a 5 mg/kg de Taxol
* corresponde a 3 dias pós-implante (primeiro tratamento)
** corresponde a 17 dias pós-implante (após 4 tratamentos)
Exemplo 7
Mecanismo de ação de conjugados
Na Figura 14, células de câncer de pulmão (NCI-H460) foramincubadas durante 24 horas com Taxol livre (30 nM) ou conjugado TxlAn2(10 nM; equivalente a 30 nM de Taxol). Depois, as células foram rotuladaspara β-tubulina usando um secundo anticorpo ligado a FITC. Fotos foramtiradas nos modos visível e fluorescente. Esses resultados indicam que Ta-xol e conjugado Taxol-Angiopep têm efeito similar sobre a β-tubulina, levan-do à sua polimerização. Além disso, conforme indicado na Figura 15, a adi-ção de Taxol e conjugado Taxol-Angiopep induz a um bloqueio de célulaNCI-H460 na fase G2/M. Os resultados obtidos para a polimerização de β-tubulina e ciclo celular sugerem que o conjugado TxIAn tem um mecanismode ação similar ao Taxol sobre células cancerígenas.
Exemplo 8
Efeito sobre acúmulo de RAP LRP-mediado
Foi anteriormente mostrado no pedido de patente internacionalNs PCT/CA2004/00011, que a proteína receptor-associada (RAP) inibiu atranscitose de aprotinina em um modelo in vitro da barreira sangue-cérebro.
De acordo com esses dados, propôs-se que o receptor relacionado à Iipo-proteína de baixa densidade (LRP) está envolvido na penetração deaprotinina no cérebro. Inibição similar de transporte de Angiopep através deum modelo in vitro da barreira sangue-cérebro também foi obtida (dados nãomostrados) sugerindo que a transcitose de Angiopep através de células en-doteliais do cérebro também envolvia LRP. LRP é um receptor na membranaheterodimérica de 600 kDa composto de duas subunidades; a subunidade-a(515 kDa) e a subunidade-β (85 kDa). Imunodetecção de LRP foi, então, rea-lizada para avaliar se esse receptor é expresso em tumores cerebrais primá-rios humanos, tais como glioblastomas e em metástase cerebral humana decânceres de mama, pulmão e melanoma (Figura 16). Resumidamente, umaquantidade igual de homogenatos de proteína de tumores cerebrais primá-rios humanos (glioblastomas) ou metástase cerebral humana foi separadaatravés de eletroforese em gel. Após eletroforese, as proteínas foram trans-feridas para membranas de PVDF e LRP foi imunodetectada usando um an-ticorpo monoclonal dirigido contra a subunidade-α obtido da Cedarlane La-boratories (Hornby, ON1 Canadá). LRP foi visualizada por um anticorpo se-cundário dirigido contra IgG de camundongo ligado à peroxidase de armorá-cia e reagentes de quimioluminescência.
Sob as condições experimentais usadas, a subunidade α daLRP foi imunodetectada a 515 kDa em células U-87 de glioblastoma. LRPtambém foi detectada em todos os tumores cerebrais primários humanos emetástases cerebrais humanas (Figura 16). Em contraste, megalina (LRP2)foi detectada em apenas uma metástase cerebral do pulmão (não mostrado).A expressão da LRP nas biópsias de diferentes pacientes pode explicar, emparte, porque observou-se anteriormente um maior acúmulo de conjugadode Taxol-aprotinina em tumores cerebrais. Em geral, uma vez que a LRPpode estar envolvida no transporte do veículo descrito aqui, esses resultadosindicam que os conjugados também podem objetivar células e tumores osquais expressam esse receptor.
De forma a determinar se transcitose de aprotinina e Angiopeppoderia envolver a LRP, seu impacto sobre a captação da proteína receptor-associada (RAP), um Iigante endógeno para LRP, foi determinado (Figura17A). A captação de RAP foi medida em fibroblastos expressando LRP(MEF-1) e em fibroblastos que não expressam LRP (PEA-13) (Figura 17A e17B). A adição de aprotinina inibiu o transporte de [125Ij-RAP em célulasLRP-positivas de uma maneira dose-dependente. Em contraste, a captaçãode RAP em células LRP-negativas foi quase inalterada por essas concentra-ções de aprotinina. Na Figura 17B, a diferença entre a captação de [125Ij-RAP medida em MEF-1 e PEA-13 foi calculada e plotada como uma funçãode concentração de aprotinina. Esses resultados mostram que uma parte dacaptação LRP-dependente da RAP pôde ser reduzida pela aprotinina, indi-cando que a aprotinina poderia interagir com esse receptor. Em um experi-mento diferente (Figura 18), a captação de [125IJ-RAP também foi medida napresença de um excesso de aprotinina e Angiopep. Os resultados mostramque aprotinina e Angiopep afetam o acúmulo LRP-dependente de [125IJ-RAP.
Em resumo, os dados obtidos para os conjugados descritos aquiindicam que a conjugação de fármacos anticâncer ao veículo permite que ofármaco anticâncer escape da ação da P-gp e, portanto, aumentam sua po-tência (quando conjugado ao veículo). Esses conjugados são ativos in vitrona inibição da proliferação de células cancerígenas. Além disso, os resulta-dos obtidos sobre o crescimento de tumor in vivo indicam que a conjugaçãode fármaco anticâncer_ao veículo pode aumentar sua eficácia ultrapassandoa P-gp, possivelmente objetivando o receptor de LRP ou através de modifi-cação da farmacocinética ou biodisponibilidade do fármaco não conjugado.
Tomados juntos, os dados descritos aqui indicam que os conju-gados podem ser usados contra tumores primários, incluindo cânceres demama, pulmão e pele, bem como metástases originárias de tumores primá-rios.
Exemplo 9
Formulação aperfeiçoada de conjugados de Taxol-Anaiopep
Ensaios preliminares realizados para avaliar a solubilidade dediferentes conjugados de TxIAn indicaram que todos os conjugados tinhamuma baixa solubilidade em solução aquosa (por exemplo, em solução deRinger/Hepes) em virtude da natureza altamente hidrofóbica do Taxol. Con-tudo, todos os conjugados eram muito solúveis em sulfóxido de dimetila(DMSO)/Ringer (80%/20%). Diferentes estratégias foram, assim, avaliadaspara aumentar sua solubilidade e reduzir a quantidade de DMSO necessáriapara sua solubilização. De modo interessante, foi capaz de remover comple-tamente o DMSO da formulação usando o agente solubilizante Solutol® HS15 (BASF). Por exemplo, TxlAn2 (3:1) a 5 mg/ml foi eficazmente solubilizadoem Solutol® HS 15 a 20% e solução de Ringer/Hepes, pH de 5,5. Uma vezque esse agente foi aprovado para várias aplicações de fármaco para admi-nistração intravenosa (i.v.) e intraperitoneal (i.p.), seu uso proporciona umavantagem comercial às formulações da presente invenção.Formulações da presente invenção podem, assim, compreender,por exemplo, a) conjugados de Taxol-Angiopep, b) Solutol® HS 15 e c) umasolução aquosa ou tampão (por exemplo, solução de Ringer/Hepes em umpH de 5 a 7). A concentração de Solutol® HS15 na formulação pode atingir,por exemplo, 30%. Concentrações maiores do que 30% também podem serúteis. A concentração de conjugado pode ser determinada baseado na doserequerida para tratar eficazmente um paciente.
Exemplo 10
Cinética no sangue das formulações aperfeiçoadas
Para distribuição tecidual e estudos de cinética no sangue, con-jugados iodinados [125I] (isto é, conjugados [125Ij-TxIAn) e [3Hj-TaxoI foramusados. Resumidamente, conjugados TxlAn2 (1 mg) foram radio-rotuladosusando iodo-glóbulos e Txl-[125l]-An2. O conjugado é, então, purificadousando uma coluna contendo resina Resourcé RPC. O iodo livre foi removi-do através de lavagem da coluna totalmente com acetonitrilo a 20%. Duranteas lavagens da coluna, a radioatividade foi contada para avaliar o grau deiodo livre. O conjugado Txl-[125lj-An2 foi, então, arrastado através de umalavagem com acetonitrilo a 100%. O acetonitrilo foi, então, evaporado e oconjugado iodinado foi diluído em DMSO a 100% (100 jxL). Uma alíquota doconjugado radioiodinado foi, então, injetada em HPLC e as frações foramcoletadas para verificar se a radioatividade estava associada às frações cor-respondendo aos conjugados.
Cinética no sangue foi avaliada após injeções intravenosas (i.v.na veia caudal), intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.) realizadas em ca-mundongos despertos (Figura 19). Resumidamente, conjugado TxlAn2 (3:1)foi diluído em DMSO/ Ringer-Hepes (80/20) ou em Solutol®/Ringer-Hepes(20/80), Txl-[125l]-An2. Injeções de camundongos CD-1 com as formulaçõesforam, então, realizada para obter uma concentração de 10 mg/kg. Após in-jeções, frações do sangue (50 |iL) foram coletadas na extremidade da caudae a radioatividade foi diretamente avaliada. Usando o mesmo protocolo, acinética do Taxol no sangue também foi determinada usando [3Hj-TaxoI. Ta-xol foi dissolvido em DMSO/Ringer-Hepes (80/20) em uma concentraçãopermitindo uma injeção de 5 mg/kg e [3HJ-TaxoI foi, então, adicionado (2,5MCi/injeção). Após injeções, as frações de sangue foram coletadas na ex-tremidade da cauda, coquetel de cintilação foi adicionado e a radioatividadefoi contada em um contador Packard. Os resultados desse experimento sãoilustrados nas Figura 19A, Figura 19B e na Figura 19C e são resumidos naTabela 6 abaixo.
Em resumo, os resultados da Figura 19 e Tabela 6 mostram quea biodisponibilidade de TxlAn2 é muito maior do que a biodisponibilidade doTaxol. Por exemplo, a AUC (0-24 horas) do TxlAn2/AUC (0-24 horas) de Taxol éde 169 (isto é, 203,3/1,2).
Em termos do Taxol, a AUC (0-24 horas) do TxlAn2/AUC (o-24 ho-ras) do Taxol é de 84,7 (isto é, 101,65/1,2). Uma vez que existem três molé-culas de Taxol sobre cada molécula de Angiopep-2, a quantidade de Taxolrepresenta cerca de 0,5 do peso molecular do Angiopep (isto é, 3 x 854/5301). Portanto, a AUC do conjugado (isto é, 203) tem de ser multiplicadapor 0,5 de forma a ser expressa em termos de Taxol.
Além disso, a biodisponibilidade no sangue de conjugados deTxlAn2 é equivalente após injeções intravenosa e intraperitoneal, enquantoque esse não é o caso para Taxol. Finalmente, os resultados da Figura 19 eTabela 6 indicam que a biodisponibilidade no sangue do TxlAn2 é maiorquando Solutol® é usado como solubilizante comparado com DMSO.
Tabela 6. Área sob as curvas de 0 a 24 horas foram calculadas usando soft-ware GraphPad
<table>table see original document page 58</column></row><table>
Exemplo 11
Distribuição tecidual
A distribuição tecidual de TxlAn2 foi avaliada em camundongosCD-1 normais após injeção intravenosa na veia caudal de 10 mg/kg de T-xlAn2 solubilizado em Solutol®/Ringer-Hepes (20%/80%) ou em DM-SO/Ringer-Hepes (80/20). Resumidamente, camundongos CD-1 foram inje-tados, via a veia caudal, com uma formulação de TxlAn2 solubilizada emSolutol® ou DMSO e também contendo Txl-[125l]-An2. Em pontos de tempopredeterminados, uma amostra de sangue foi coletada e camundongos a-nestesiados foram perfundidos com PBS gelado. Os tecidos foram, então,excisados e a radioatividade foi contada em um contador gama.
Os resultados da Figura 20 mostram que o uso de Solutol® per-mite uma maior distribuição de conjugado TxlAn2 (3:1) na maioria dos tecidos.
Exemplo 12
Distribuição em tumores cerebrais
Em uma tentativa de avaliar a distribuição de conjugado TxlAn2(3:1) em um modelo de tumor cerebral, camundongos nus foram intra-cerebralmente implantados com células de câncer de pulmão NCI-H460.Dez dias após implante, a perda de peso dos camundongos foi significativa,indicando que os tumores no cérebro estavam bem estabelecidos. As distri-buições teciduais de Taxol, TxlAn2 (3:1) e TxlAn2 (2:1) foram avaliadas (Fi-gura 21), conforme previamente descrito.
Aos camundongos foi, assim, fornecida uma injeção intravenosade Taxol (5mg/kg) solubilizada em DMSO ou TxlAn2 (3:1) (10 mg/kg) ou T-xlAn2 (2:1) (12,5 mg/kg), cada um solubilizado em Solutol®. Após 10 minu-tos, os camundongos foram perfundidos sobre gelo usando PBS gelado, osórgãos foram coletados e a radioatividade foi medida. Para avaliar a diferen-ça de acúmulo entre o cérebro normal e tumor no cérebro, os cérebros foramcortados ao meio com o hemisfério direito (lado de injeção das células tumo-rígenas) correspondendo ao cérebro com tumor e o hemisfério esquerdo aocérebro normal.
Os resultados das Figuras 21A e Figura 21B mostram que osconjugados TxlAn2 (3:1) apresentam uma maior distribuição no tumor cere-bral comparado ao cérebro normal (aumento de duas vezes), enquanto quenenhuma diferença é observada para a distribuição de Taxol entre o cérebronormal e com tumor. A distribuição de conjugado TxlAn2 (3:1) é muito maiordo que a distribuição de Taxol em tumor no cérebro (aumento de 10 vezes) etambém era maior do que a distribuição de TxlAn2 (2:1) (4,5-vezes).
Exemplo 13
Efeito de formulação aperfeiçoada de conjugados de TaxoI-AnQiopep sobrecrescimento de tumor s.c.
Estudos in vivo foram conduzidos para determinar se a formula-ção aperfeiçoada compreendendo o conjugado de Taxol-Angiopep poderiainibir o crescimento de células de câncer de pulmão (NCI-H460) ou cresci-mento de células de glioblastoma (U87) em um modelo in vivo de camun-dongos subcutaneamente implantados com essas células cancerígenas.
Resumidamente, os camundongos receberam uma injeção sub-cutânea de 2,5 x 106 células de glioma U87 humano ou células NCI-H460.Quando crescimento do tumor foi observado, os camundongos receberamtratamento com Taxol livre, conjugados de Taxol-Angiopep ou veículo atra-vés de injeções i.v. ou i.p. Os tratamentos foram, então, administrados duasvezes por semana até que os animais fosses sacrificados. Os camundongosforam monitorados a cada dia com relação aos sintomas clínicos e perda depeso. O volume do tumor foi estimado com um calibrador e a seguinte equa-ção (volume de tumor = tt/2 x (comprimento (mm) x largura2 (mm)).
No primeiro estudo de crescimento de tumor subcutâneo, célulasNCI-H460 foram implantadas no flanco direito de camundongos (Figura22A). Os camundongos receberam o veículo, Taxol ou formulação de conju-gado de Taxol-Angiopep-2 (3:1) através de injeções i.v. nà veia caudal ouinjeções i.p. Conjugados foram administrados em um equivalente de 10mg/kg de Taxol. Os resultados apresentados na Figura 22 mostram que aformulação aperfeiçoada de conjugado TxlAn2 (3:1) contendo Solutol® HS15 a 20% em solução de Ringer/Hepes (pH de 5,5) causou uma inibiçãomuito mais forte de crescimento de tumor NCI-H460 do que o Taxol.
Esses resultados também são resumidos na Tabela 7 abaixo.Tabela 7
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Esses resultados indicam que os conjugados de TxIAn são maispotentes do que o Taxol na inibição de crescimento de tumor em um ambi-ente in vivo. Além disso, resultados similares foram obtidos, quer o conjuga-do fosse administrado i.v. ou i.p. Finalmente, resultados similares tambémforam obtidos com conjugados de TxIAn compreendendo 2 ou 3 moléculasde Taxol.
Exemplo 14
Efeito de formulação aperfeiçoada de conjugados de Taxol-Anqiopep sobrecrescimento de tumor s.c.
Em um outro estudo, o efeito das formulações de conjugado T-xlAn2 (3:1) sobre o crescimento de NCI-H460 ou U87 s.c. foi avaliado. Oscamundongos foram tratados através de injeções i.p. com a formulação a-perfeiçoada a 20 mg/kg/dia durante cinco dias consecutivos ou através deinfusão com o implante de uma bomba miniosmótica Alzet em uma dose de2 mg/kg/dia durante 14 dias. Conforme mostrado nas Figuras 23A e 23B, aresposta de camundongos à formulação de conjugado TxlAn2 (3:1) era mai-or quando os camundongos receberam a formulação aperfeiçoada atravésde infusão.
Esses experimentos in vivo mostram claramente a eficácia daformulação aperfeiçoada contra crescimento de tumor de glioblastoma oucélulas de câncer de pulmão. Experimentos similares também indicam a efi-cácia dessas formulações aperfeiçoadas ao prolongar a sobrevivência deanimais (dados não mostrados).
O teor de cada publicação, patente e pedido de patente mencio-nado no presente pedido é incorporado aqui por referência.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhesaqui e ilustrada nos desenhos em anexo, deve ser compreendido que a in-venção não está limitada às modalidades descritas aqui e que várias altera-ções e modificações podem ser realizadas sem se desviar do escopo ou es-pírito da presente invenção.
Listagem de Seqüência
<110> Angiochem Inc.
Béliveau, RichardDemeule, MichelChé, ChristianRégina, Anthony<120> Potenciação de agentes anticâncer<130> 11217-020<150> US 60/699,375<151> 2005-07-15<150> US 60/758,532<151> 2006-01-13<160> 106
<170> Versão de Patente 3.3<210> 1<211> 19<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> polipetideo<400> 1
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<223> polipetídeo<400> 2
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<223> polipetídeo<400> 3
Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 4
Ser Phe Tyr Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn Asn Tyr Leu Arg1 5 10 15
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<223> polipetídeo<400> 5
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<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo
<400> 6
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<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> 7
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<223> polipetídeo<400> 8
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Ala Lys Tyr
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial-
<220>
<223> polipetídeo<400> 9
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<223> polipetídeo<400> 10
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<223> polipetídeo<400> 11
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<223> polipetídeo
<400> 12
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Ala Lys Tyr
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 13
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Ala Lys Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 14Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Gly Asn Asn Tyr Lys Arg1 5 10 15
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<223> polipetídeo<400> 15
Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Leu Arg1 5 10 15
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<223> polipetídeo<400> 16
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Glu Lys Tyr
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> 17
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<223> polipetídeo<400> 18
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<223> polipetídeo<400> 19
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<223> polipetídeo<400> 20
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<223> polipetídeo<400> 21
Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Ala Asn Arg Asri Asn Phe Lys Arg1 5 10 15
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<223> polipetídeo<400> 22
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Ala Lys Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 23
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Ala Lys Tyr
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<211> 19
<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 24
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Ala Lys Tyr
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<211> 19
<212> PRT-
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 25
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<223> polipetídeo<400> 26
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<212> PRT
<213> Artificial
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<223> polipetídeo<400> 28
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<223> polipetídeo<400> 29
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Ala Lys Tyr<210> 30<211> 19<212> PRT<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 30Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Lys Asn Asn Phe Asp Arg1 5 10 15
Glu Lys Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> -31
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Glu Lys Glu
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 32
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<223> polipetídeo<400> 34
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Ala Lys Tyr
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<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> 35
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 36
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<223> polipetídeo<400> 37
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<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
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<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 39
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<223> polipetídeo<400> 40
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<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 41
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> 42
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<212> PRT
<213> Artificial
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<223> polipetídeo<400> 44
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<223> polipetídeo<400> 45
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<223> polipetídeo<400> 47
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<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 48
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<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> 49
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<223> polipetídeo<400> 50
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<213> Artificial
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Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Asn Phe Leu Arg1 5 10 15
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<223> polipetídeo<400> 53
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Arg1 5 10 15
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<223> polipetídeo<400> 54
Ser Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Arg
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 55
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Leu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Arg
15 10 15
Glu Lys Tyr
<210> 56
<211> 19
<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 56
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Gly Asn Asn Phe Val Thr
1 5 10 15
Ala Glu Tyr
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 57
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Lys Gly Asn Asn Phe Val Ser1 5 10 15
Ala Glu Tyr<210> 58<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 58
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Arg
15 10 15
Ala Glu Tyr
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220><223> polipetídeo<400> 59
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe Leu Arg1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 60<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220> ""<223> polipetídeo<400> 60
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn Asn Tyr Leu Arg1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 61<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 61
Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Tyr Leu Arg1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 62<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 62Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Asn Arg Asn Asn Tyr Leu Arg15 10 15
Glu Glu Tyr<210> 63<211> 19
<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 63
Met Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Val1 5 10 15
Ala Arg Ile<210> 64
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 64
Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln1 5 10 15
Thr Phe Val Tyr Gly20
<210> 65<211> 22<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 65Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Tyr Lys Ser Ala Glu Asp1 5 10 15
Cys Met Arg Thr Cys Gly20
<210> 66<211> 22<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 66
Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Val Ala Arg1 5 10 15
Xle Ile Arg Tyr Phe Tyr20
<210> 67<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220> <223> polipetídeo<400> 67
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 68<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 68Lys Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 69
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 69
Thr Phe Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg. Asn Asn Tyr Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 70<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 70
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 71
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<40Ó> 71
Cys Thr Phe Phe Tyr Gly Cys Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys1 5 10 15Thr Glu Glu Tyr20
<210> 72<211> 20<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 72
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys20
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 73
Cys Thr Phe Phe Tyr Gly Ser Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys1 5 10 15
Thr Glu Glu Tyr20
<210> 74<211> 20<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 74Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr Cys20
<210> 75<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetideo<400> 75
Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 76
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetideo<400> 76
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Lys Glu Tyr
<210> 77
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetideo<400> 77Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Lys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 78
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo
<400> 78
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Lys Arg Tyr<210> 79<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 79
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Lys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Ala Glú Tyr<210> 80<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 80
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Lys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15Ala Gly Tyr<210> 81<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 81
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Lys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Arg1 5 10 15
Glu Lys Tyr<210> 82<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 82
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Lys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Arg1 5 10 15
Ala Lys Tyr<210> 83<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 83
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 84<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 84
Thr Phe Phe Tyr Gly Cys Gly Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 85
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 85
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Arg Cys Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr<210> 86<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 86
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Asp Thr1 5 10 15
Glu Glu Glu
<210> 87
<211> 19
<212> PRT<213> Artificial<22 0>
<223> polipetídeo<400> 87
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Glu Glu Tyr<210> 88<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 88
Tyr Asn Lys Glu Phe Gly Thr Phe Asn Thr Lys Gly Cys Glu Arg Gly
1 5 10 15
Tyr Arg Phe
<210> 89
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 89
Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr
15 10 15
Leu Glu Glu
<210> 90
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220><223> polipetídeo<400> 90
Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn Asn Phe Leu Arg
1 5 10 15
Leu Lys Tyr
<210> 91
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 91
Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn Asn Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Leu Lys Tyr
<210> 92
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 92
Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu1 5 10 15
Glu Ile Phe Lys Asn Tyr20
<210> 93<211> 15<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 93
Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr1 5 10 15
<210> 94<211> 17<212> PRT<213> Artificial<22 0>
<223> polipetídeo<400> 94
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr Gly1 5 10 15
Arg
<210> 95<211> 10<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 95
Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe
1 5 10
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 96
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys15 10 15
<210> 97<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 97
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 98
<211> 59
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 98
Met Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Val1 5 10 15
Ala Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln
20 25 30
Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser
35 40 45
Ala Glii Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala
50 55
<210> 99<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<400> 99Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Lys Glu Tyr
<210> 100
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> polipetídeo<400> 100
Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Lys Asn Asn Tyr Leu Arg1 5 10 15
Leu Lys Tyr
<210> 101<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> polipetideo
<400> 101
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Arg1 5 10 15
Ala Lys Tyr
<210> 102
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<300>
<310> US 5,807,980<311> 1993-07-01<312> 1998-09-15<400> 102
Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Leu1 5 10 15
Ala Lys Arg Asn Asn Phe Glu Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys20 25 30
Gly Gly Ala35
<210> 103<211> 24<212> PRT<213> Artificial<220> <223> polipetídeo<300> <310> US 5,780,265<311> 1995-07-05<312> 1998-07-14<400> 103
Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp1 5 10 15
Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala20
<210> 104<211> 22<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<300>
<310> W004/060403<311> 2004-01-05<312> 2004-06-22<400> 104
Gly Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn1 5 10 15
Asn Phe Lys Ser Ala Glu20
<210> 105<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial<220>
<223> polipetídeo<300>
<310> US 5,118,668<311> 1988-07-20<312> 1992-06-02<400> 105
Leu Cys Gln Thr Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Ala Lys Arg Asn Asn1 5 10 15
Phe Lys Ser Ala20
<210> 106<211> 180<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> constructo sintético<300>
<308> X04666<309> 1993-09-13<313> (217).. (396)<400> 106
atgagaccag atttctgcctcgttacttct acaatgcaaagctaagcgta acaacttcaa
cgagccgccg tacactgggcggcaggcctg tgtcagacctatccgcggaa gactgcatgc
cctgcaaagc tcgtatcatctcgtatacgg cggctgcagagtacttgcgg tggtgcttag

Claims (30)

1. Conjugado, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,caracterizado pelo fato de que o referido conjugado compreende:(a) um veículo compreendendo um análogo biologicamente ativode Angiopep-1 tendo uma seqüência de aminoácido em pelo menos 80%idêntica à seqüência de Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67), o referido análogotendo pelo menos uma substituição de aminoácido na seqüência de Angio-pep-1; e(b) um composto, em que o referido composto é conjugado aoreferido veículo.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a referida substituição de aminoácido é uma substituição deaminoácido de cisteína-toserina.
3. Conjugado, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,caracterizado pelo fato de que o referido conjugado compreende:(a) um veículo compreendendo uma seqüência de aminoácidotendo pelo menos 80% de identidade à seqüência de Angiopep-2, em que oreferido veículo não compreende a seqüência de Angiopep-1; e(b) um composto, em que o referido composto é conjugado aoreferido veículo.
4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste da seqüência deAngiopep-2 (SEQ ID NO: 97).
5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:(a) um conjugado, ou sal farmaceuticamente aceitável do mes-mo, o referido conjugado compreendendo:(i) um veículo compreendendo uma seqüência de amino-ácido em pelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos de qualqueruma das SEQ ID NOS: 1-105, ou um fragmento biologicamente ativo dasmesmas; e(ii) um composto conjugado ao referido polipeptídeo; e(b) um éster de polioxietileno de um ácido graxo.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que o referido polipeptídeo compreende ou consiste da seqüên-cia de Angiopep-1 (SEQ ID NO: 67) ou Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97).
7. Composição de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri-zada pelo fato de que o referido éster de polioxietileno é Solutol® HS15.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-5 a 7, caracterizada pelo fato de que ainda compreende manitol ou um tam-pão.
9. Conjugado ou composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizados pelo fato de que o referido veículo com-preende uma seqüência de aminoácido menor do que 50 aminoácidos nocomprimento.
10. Conjugado ou composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, caracterizados pelo fato de que ainda compreende umveículo farmaceuticamente aceitável.
11. Conjugado ou composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizados pelo fato de que o referido agente éselecionado do grupo que consiste em um fármaco de molécula pequena,uma proteína, um peptídeo, e um marcador.
12. Conjugado ou composição de acordo com a reivindicação-11, caracterizados pelo fato de que o referido agente é um fármaco anticân-cer.
13. Conjugado ou composição de acordo com a reivindicação-12, caracterizados pelo fato de que o referido agente anticâncer é seleciona-do do grupo que consiste em Taxol, um derivado de Taxol, vinblastina, vin-cristina, etoposídeo, doxorrubicina, ciclofosfamida, taxotere, melphalan, echlorambucil, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
14. Conjugado ou composição de acordo com a reivindicação-13, caracterizados pelo fato de que o referido agente anticâncer é Taxol, ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
15. Conjugado ou composição de acordo com a reivindicação-13, caracterizados pelo fato de que o referido agente anticâncer é etoposí-deo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
16. Conjugado ou composição de acordo com a reivindicação-13, caracterizados pelo fato de que o referido agente anticâncer é doxorrubi-cina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
17. Conjugado ou composição de acordo com a reivindicação 11ou 12, caracterizados pelo fato de que a referida proteína é um anticorpo,um fragmento de anticorpo, ou um fármaco baseado em proteína, ou um salfarmaceuticamente aceitável dos mesmos.
18. Uso de um conjugado ou composição como definidos emqualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que épara o tratamento de um câncer.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que o referido câncer é um tumor cerebral primário ou um tumor ce-rebral de origem metastática.
20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelofato de que o referido câncer é uma metástase cerebral, um glioblastoma, ouum glioma.
21. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que o referido câncer está no lado externo do cérebro.
22. Uso de um conjugado para tratar um câncer no lado externodo cérebro, caracterizado pelo fato de que o referido conjugado compreende:(a) um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido empelo menos 70% idêntica à seqüência de aminoácidos de qualquer uma dasSEQ ID NOS: 1-105, ou um fragmento biologicamente ativo das mesmas; e(b) uma proteína ou um agente anticâncer conjugado ao referidopolipeptídeo.
23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelofato de que o referido polipeptídeo compreende ou consiste da seqüência deAngiopep-1 (SEQ ID NO: 67) ou Angiopep-2 (SEQ ID NO: 97).
24. Uso de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizadopelo fato de que o referido polipeptídeo é de cerca de 19 a cerca de 50 ami-noácidos em comprimento.
25. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o referido agente anticâncer é Taxol1 umderivado de Taxol1 vinblastina, vincristina, etoposídeo, doxorrubicina, ciclo-fosfamida, taxotere, melphalan, ou chlorambucil, ou um sal farmaceutica-mente aceitável dos mesmos.
26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que o referido agente anticâncer é Taxol1 doxorrubicina, ou etoposí-deo, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
27. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que a referida proteína é um anticorpo oufragmento de anticorpo.
28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é um tumor pulmonar,um tumor de mama, um tumor de rim, um tumor de olho, um tumor de fíga-do, um tumor colorretal, um tumor de um órgão urinário, ou um câncer me-tastático de um tumor de mama, um tumor pulmonar, um melanoma, ou umtumor cerebral.
29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que o referido câncer inclui uma célula ex-pressando P-glicoproteína.
30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é resistente à múltiplosfármacos.
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