CN102085157B - 扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法，该扇贝抗氧化肽纳米脂质体通过pH梯度法由扇贝抗氧化肽、大豆卵磷脂、胆固醇和吐温80制备而成。本发明扇贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高，使用性能稳定，粒子直径平均分布在200nm以下，符合化妆品的透皮吸收要求，可直接作为化妆品材料应用。

Description

扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于海洋生物化妆品领域，特别是涉及一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法。

背景技术

脂质体自1962年发现以来，以其独特的结构和功能在化妆品、医药领域逐渐推广。在化妆品领域中，脂质体作为活性成分的载体，利用磷脂双层膜与皮肤细胞的亲和性，可以将一些有效营养物质传递至皮肤深层，从而促进了吸收，减少了刺激性。继1986年Dior首次开发了商品名为Capture的脂质体化妆品以来，国外对脂质体在皮肤学和化妆品学中的应用进行了大量的研究：将保湿剂、维生素制成脂质体，可以利用其缓释特点，延长功效时间；将防晒剂制成脂质体，可以增加渗透性，还具有防水效果。美国开发的GAI脂质体产品，贮藏12个月后仍然保持有90％的标准活性，85％的脂质体保持稳定。在日本，神经酰胺及其脂质体技术的研究和应用成果申请了大批的专利。在国内，北京同仁堂公司引进德国专利技术，成功制备了质量稳定的纳米脂质体化妆品，为脂质体的大规模市场化迈出了坚实的一步。

抗氧化肽在护肤品中的应用也被认为是最有开拓希望的新领域，抗氧化肽的共同特性是具有俘获各种反应所产生的活性高的自由基，使之成为惰性化合物。因此，抗氧化肽应用于体外可抵抗紫外线对皮肤造成的老损，从而保护其结构功能；尤其作为特效添加剂应用于各种高档日化产品中而风靡全球，堪称发展最快、效益最好的新兴产业，受到国内外研究机构、制造厂商的重视。前期研究表明扇贝抗氧化肽是海洋活性多肽的一种，不仅具有清除羟自由基和超氧阴离子的能力，还能延缓自然衰老动物皮肤老化。应用研究还表明，该扇贝抗氧化肽能对抗紫外线和60Co-「射线对淋巴细胞的辐射损伤，有免疫增强作用等，美容防晒效果显著。由于多肽对皮肤的修复和美白效果需要深入皮肤深层，才能被真皮层吸收，对皮肤黑色素形成的关键酶才能起到抑制性作用。因此，选择合理有效的方法，对多肽进行保护，使其达到作用的关键部位，成为最大限度的发挥其活性的关键。脂质体的发现，为扇贝抗氧化肽的深入开发提供了思路。如果利用脂质体技术将多肽包裹起来，能够渗入皮肤表层达到相应作用部位并维持一定时间，就能最大限度的发挥其活性，提高其利用率。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术有在不足，提供一种脂质体形态均一，粒径200nm以下，包封率高，渗透率低，符合化妆品的透皮吸收要求的扇贝抗氧化肽纳米脂质体(或称PCF纳米脂质体)及其制备方法。

本发明提供的扇贝抗氧化肽的纳米脂质体，其特征在于由下列pH梯度法制备扇贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高达97.29％，粒子直径平均分布在200nm以下，总含量在85％以上，平均Zeta电位为-21.3mV，稳定性较强，包封率在4℃下一个月内基本保持稳定；

所述pH梯度法制备扇贝抗氧化肽纳米脂质体，包括下列步骤：

①空白脂质体的制备。

取大豆卵磷脂(卵磷脂)、胆固醇和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)溶解于乙醚溶剂中，大豆卵磷脂重量配比为150-250份，优选为200份，胆固醇重量配比为30-90份，优选为50份，吐温80重量配比为20-100份，优选为60份，恒温50℃减压旋转蒸发掉有机溶剂，使大豆卵磷脂在蒸发溶器底形成一层薄膜后，加入适量0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其中乙醚溶剂与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比1∶1到5∶1，优选为3∶1，调节pH1-4，继续旋转蒸发水合20-40分钟，优选为30分钟后，用0.45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液；

②扇贝抗氧化肽脂质体的制备

在步骤①的空白脂质体溶液中加入扇贝抗氧化肽干粉(见中国专利公开号CN1660892制)，添加重量配比为5-40份，优选为20份，混合均匀后，再使用饱和Na₂HPO₄溶液将pH调高3，pH梯度3-6后进行超声5-10分钟，得扇贝抗氧化肽纳米脂质体，4℃放置保存。

按照本发明提供的扇贝抗氧化肽脂质体(简称脂质体)的制备方法中，所述扇贝抗氧化肽脂质体的包封率按下列方法测定。

取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。

取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的扇贝抗氧化肽(PCF)总量，计算包封率。

包封率的计算：将脂质体与游离PCF分离，测定游离的PCF量，根据下式计算脂质体包埋率(EE)：EE＝(Ct-Cf)×100％/Ct。其中Cf是游离PCF含量，Ct是总PCF含量。

本发明提供的PCF纳米脂质体及其制备方法中，多种因素对脂质体包埋效果都具有一定影响。

PCF载量对脂质体包埋效果的影响。

从图1中可以看出，随着PCF载量的提高，PCF纳米脂质体的包封率出现了下降的趋势。当多肽添加重量配比小于20份时，包封率维持在一个很高的水平(超过90％)，但多肽添加重量配比大于20份时，包封率便出现了下降的趋势，包封率随着载量的增加反而会下降，PCF纳米脂质体的多肽添加重量配比为5-40份，优选为20份。

胆固醇对PCF纳米脂质体包埋效果的影响

PCF纳米脂质体双分子层一般是由卵磷脂和胆固醇分子相互间隔、定向排列的双分子层所组成。当胆固醇嵌在脂双层中时，疏水部分夹在脂双层的“栅栏”之间，头部却在极性区，可以调节双分子层的流动性和通透性。胆固醇具有调节膜流动性及稳定卵磷脂双分子膜的功能，能够适当提高的包封率和稳定性。固定卵磷脂的加量为200份，改变胆固醇添加量可以影响脂质体的包封率，结果如图2所示。PCF纳米脂质体的包封率随着胆固醇的量的增加出现了先增加后减少的趋势，胆固醇嵌入到脂质膜中增强了膜的刚性和致密度，水合过程中提高了PCF纳米脂质体膜的稳定性，使得PCF纳米脂质体的包封率增加。但当胆固醇的嵌入量超过一定范围后，胆固醇会干扰脂双分子层结构，使胶液的相变温度降低，使囊泡内容物快速渗出，降低了包封率。当胆固醇添加重量配比为30-90份，优选为50份，卵磷脂重量配比为200份时，PCF纳米脂质体的包封率最高，达到了91.9％。

吐温80对PCF纳米脂质体包埋效果的影响

表面活性剂能使PCF纳米脂质体混悬液中存在胶团和乳剂，其疏水端插入双分子膜，亲水端使PCF纳米脂质体高度亲水，防止PCF纳米脂质体间相互聚集融合和沉淀，它还改变了PCF纳米脂质体卵磷脂分子的排列方式和运动方式，导致膜纵向有序性(卵磷脂分子碳氢链间的紧密情况)增大，流动性降低，稳定性提高。结果如图3所示。在一定范围内提高吐温80的含量可以提高PCF纳米脂质体的包封率，但当吐温80的浓度达到一定值时，卵磷脂将被逐渐增溶成混合胶束，PCF纳米脂质体的双分子层结构遭到破坏。考虑到吐温80在工业中添加有一定的限制，如果胆固醇添加重量配比为30-90份，优选为50份，卵磷脂重量配比为200份时，吐温80的添加量为20-100份，优选为60份。

乙醚与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比对PCF纳米脂质体包埋效果的影响

有机溶剂可以溶解卵磷脂和胆固醇，使其易于成膜，但有机溶剂的用量会影响PCF纳米脂质膜的形成以及PCF纳米脂质体贮藏过程的稳定性，乙醚与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比对PCF纳米脂质体包封率的影响结果如图4所示。乙醚的用量在一定范围内时，乙醚能够溶解卵磷脂以及胆固醇，促进脂质膜的形成，提高膜的通透性，使PCF易于进入膜内，对包封率的提高具有促进作用。但乙醚用量大，体系中残留的乙醚就会多，残留的乙醚会破坏脂质体膜，使得包容物容易泄露，而且乙醚用量过多对人体也会造成伤害。乙醚与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比从1∶1到5∶1，优选为3∶1。

pH梯度对PCF纳米脂质体包埋效果的影响

根据Henderson-Hasselbalch理论，每个pH单位的变化会产生浓度10倍之差。如果制造PCF纳米脂质体内外pH梯度差为3个单位时，理论上就会造成内外浓度的1000倍之差。不同pH梯度(pH1-4，pH2-5，pH3-6，pH4-7)对PCF纳米脂质体包封率的影响，发现pH4-7梯度制备的PCF纳米脂质体都具有较高的包封率，为91.39％，而pH3-6梯度的包封率为88.27％。但是pH4-7梯度制得的PCF纳米脂质体稳定性较差，容易分层，因而确定制备PCF纳米脂质体的pH梯度范围为pH3-6。

此外PCF纳米脂质体的制备过程中，需要控制水合温度高于卵磷脂的相变温度，这样才能使其在水溶液中分散均匀。经试验确定，水合温度定为50℃较合适，低于50℃时制备的PCF纳米脂质体包封率迅速降低，而高于50℃时，卵磷脂容易氧化水解。

在制备PCF纳米脂质体的过程中，通常需要通过外加能量使体系中的粒子再分散，以获得粒径小且分布均匀的PCF纳米脂质体，增加体系的稳定性，本发明采用超声处理，超声处理可以减小PCF纳米脂质体的颗粒度，使其分散更加均匀，有利于肽的跨膜运动，提高包封率，但是超声强度过大会破坏PCF纳米脂质体膜从而引起芯材的泄露，会产生大量的热，也容易引起磷脂的氧化。因此，超声强度确定为200W，超声时间为5-10min(间歇超声)。

本发明提供了PCF纳米脂质体及其制备方法，优选确定了pH梯度法制备脂质体工艺和配方为：胆固醇重量配比为50份，卵磷脂重量配比为200份，吐温80重量配比为60份，海洋PCF添加重量配比为20份，乙醚与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比3∶1，旋转蒸发温度50℃，水合时间30min，pH梯度3-6，超声时间5min。按照上述配方和工艺制得的海洋活性PCF脂质体的包封率能达到97.29％，所制得脂质体为圆球形单室脂质体(图5)，由马尔文电位仪Nano-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，结果显示，优化工艺所得脂质体的粒径平均分布在200nm以下，Zeta电位结果表明，抗氧化肽脂质体带负电荷，平均Zeta电位为-21.3mV，具有较强的稳定性。粒径小于200nm，占总含量的85％以上(图6)，作为化妆品的活性成分符合透皮吸收的要求，可以直接作为化妆品原料作用。将扇贝抗氧化肽脂质体分别置于室温和低温环境下(4～6℃)，每隔一段时间测量其包封率。一般来说，长期存放后的脂质体局部会形成较大的膜块，在贮存过程中，脂质体会发生絮凝，所包容的活性成分也会逐渐泄漏。但低温环境可以延缓这一变化，故包封率的衰减得到明显控制(图7)，稳定性有所加强，本发明中的扇贝抗氧化肽脂质体在4℃下一个月内基本保持稳定，包封率保持在95％以上。

本发明提供了一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法，采用本发明获得的扇贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高达97.29％，粒子直径平均分布在200nm以下，总含量在85％以上，平均Zeta电位为-21.3mV，稳定性较强，包封率在4℃下一个月内基本保持稳定。

附图说明

图1为PCF载量对脂质体包埋效果的影响

图2为胆固醇加量对脂质体包封率的影响

图3为吐温80对脂质体包封率的影响

图4为乙醚与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比对脂质体包封率的影响

图5为扇贝抗氧化肽脂质体的单层膜结构电镜图像

图6为扇贝抗氧化肽脂质体的粒径分布图

图7扇贝抗氧化肽脂质体的稳定性

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明保护范围并非限于下列实施例。

实施例1

取大豆卵磷脂200mg、胆固醇50mg和吐温8060mg，溶解于30ml乙醚中，恒温50℃减压旋转蒸发掉有机溶剂，使磷脂在蒸发瓶底形成一层薄膜。加入0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝3)10ml，继续旋转蒸发水合30min后，使用0.45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液。

取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。

在空白脂质体溶液中加入PCF干粉，添加量为20mg，混合均匀，使用饱和Na2HPO4溶液将pH调高3，使pH到6，超声5min左右，即得PCF纳米脂质体样品，4℃放置保存。

取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的PCF总量，计算包封率为97.29％，使用马尔文电位仪Nano-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，粒子直径平均为194nm，带负电位，具有较强稳定性，4℃下贮存包封率在一个月内维持在95％以上。

实施例2

取大豆卵磷脂150mg、胆固醇30mg和吐温80为20mg，溶解于30ml乙醚中，恒温50℃减压旋转蒸发掉有机溶剂，使磷脂在蒸发瓶底形成一层薄膜。加入0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝3)10ml，继续旋转蒸发水合30min后，使用0.45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液。

取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。

在空白脂质体溶液中加入PCF干粉，添加量10mg，混合均匀，使用饱和Na2HPO4溶液将pH调高3，使pH到6，超声5min左右，即得PCF纳米脂质体样品，4℃放置保存。

取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的PCF总量，计算包封率为90.33％，使用马尔文电位仪Nano-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，粒子直径平均为205nm，带负电位，具有较强稳定性，4℃下贮存包封率在一个月内维持在85％以上。

实施例3

取大豆卵磷脂250mg、胆固醇90mg和吐温80100mg，溶解于30ml乙醚中，恒温50℃减压旋转蒸发掉有机溶剂，使磷脂在蒸发瓶底形成一层薄膜。加入0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝4)10ml，继续旋转蒸发水合30min后，使用0.45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液。

取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。

在空白脂质体溶液中加入PCF干粉，添加量为40mg，混合均匀，使用饱和Na2HPO4溶液将pH调高3，使pH到7，超声5min左右，即得PCF纳米脂质体样品，4℃放置保存。

取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的PCF总量，计算包封率为77.21％，使用马尔文电位仪Nano-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，粒子直径平均为218nm，带负电位，具有较强稳定性，4℃下贮存包封率在一个月内维持在75％以上。

Claims (3)

1.一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体，其特征在于由下列pH梯度法制备扇贝抗氧化肽的纳米脂质体，扇贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高达97.29％，粒子直径平均分布在200nm以下，总含量在85％以上，平均Zeta电位为-21.3mV，稳定性较强，包封率在4℃下一个月内基本保持稳定；

所述pH梯度法制备扇贝抗氧化肽纳米脂质体，包括下列步骤：

①空白脂质体的制备

取大豆卵磷脂、胆固醇和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯溶解于乙醚溶剂中，大豆卵磷脂重量配比为150-250份，胆固醇重量配比为30-90份，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯重量配比为20-100份，恒温50℃减压旋转蒸发掉有机溶剂，使大豆卵磷脂在蒸发溶器底形成一层薄膜后，加入适量0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙醚溶剂与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比从1∶1到5∶1，调节pH1-4，继续旋转蒸发水合20-40分钟后，用0.45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液；

②扇贝抗氧化肽脂质体的制备

在步骤①的空白脂质体溶液中加入扇贝抗氧化肽干粉重量配比为5-40份，混合均匀后，再使用饱和Na₂HPO₄溶液将pH调高3，pH梯度为3-6，后进行超声5-10分钟，得扇贝抗氧化肽纳米脂质体，4℃放置保存。

2.根据权利要求1的扇贝抗氧化肽纳米脂质体，其特征在于所述乙醚溶剂与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为3∶1，大豆卵磷脂重量配比为200份，胆固醇重量配比为50份，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯重量配比为60份，扇贝抗氧化肽重量配比为20份。

3.权利要求1或2的扇贝抗氧化肽纳米脂质体的制备方法，其特征在于pH梯度法制备扇贝抗氧化肽纳米脂质体包括下列步骤：

①空白脂质体的制备

取大豆卵磷脂、胆固醇和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯溶解于乙醚溶剂中，大豆卵磷脂重量配比为150-250份，胆固醇重量配比为30-90份，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯重量配比为20-100份，恒温50℃减压旋转蒸发掉有机溶剂，使大豆卵磷脂在蒸发溶器底形成一层薄膜后，加入适量0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙醚溶剂与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比从1∶1到5∶1，调节pH1-4，继续旋转蒸发水合20-40分钟后，用0.45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液；

②扇贝抗氧化肽脂质体的制备

在步骤①的空白脂质体溶液中加入扇贝抗氧化肽干粉重量配比为5-40份，混合均匀后，再使用饱和Na₂HPO₄溶液将pH调高3，pH梯度为3-6，后进行超声5-10分钟，得扇贝抗氧化肽纳米脂质体，4℃放置保存。 

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