BRPI0608580A2 - semente de milho com teor de lisina sinergisticamente intensificado - Google Patents

Abstract

SEMENTE DE MILHO COM TEOR DE LISINA SINERGISTICAMENTE INTENSIFICADO. A presente invenção proporciona uma planta de milho transgênica tendo em seu genoma DNA transgênico incluindo seqúência para redução zeina e seqúência para biossíntese de usina, pelo que expressão do DNA transgênico resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado de semente da planta de milho transgênico. A invenção ainda proporciona um método para proporcionar semente de milho com teor de usina sinergisticamente aumentado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEMENTE DE MILHO COM TEOR DE LISINA SINERGISTICAMENTE INTENSIFICADO".

O presente pedido incorpora, por referência, o Pedido U.S. Ne 11/077.089, depositado em 10 de Março de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

São descritas aqui sementes para milho transgênico tendo níveis elevados de aminoácido, particularmente de lisina, constructos de DNA re-combinante para supressão de gene, métodos de fabricação e uso de tais estruturas e organismos transgênicos, incluindo plantas, expressando tais estruturas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Zea mays, comumente conhecido como amido ou milho, é um grão importante como alimento humano ou ração para animal. Sementes ou grãos de milho têm um teor naturalmente baixo de lisina em virtude de sua composição de proteína. A maioria das proteínas de semente de milho são as zeínas ou prolaminas, as quais são encontradas no endosperma e somam mais de metade das proteínas totais na semente. Zeínas ou prolaminas são ricas em prolina, alanina e glutamina, mas quase completamente desprovidas dos aminoácidos essenciais lisina e triptofano. Em virtude da relativa abundância de zeínas, a contribuição da lisina e triptofano de outras proteínas da semente é diluída. Lisina exógena é freqüentemente adicionada à ração para animal como um suplemento necessário. Portanto, é de interesse aumentar o nível de lisina na semente de milho.

Os níveis de aminoácido em plantas transgênicas podem ser manipulados através de várias técnicas genéticas incluindo, mas não limitado a, modificação de expressão do gene endógeno e/ou expressão de DNA recombinante exógeno na planta transgênica. Diminuição e aumento coordenados de expressão de gene de mais de um gene usando constructos transgênicos é descrita na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2004/0126845. Métodos e constructos de DNA recombinante úteis para produção de RNA orientado anti-sentido para supressão de gene em organismos transgênicos são descritos no Pedido de Patente U.S. Nõ 11/057.062. OPedido de Patente Provisório U.S. N9 60/638.256 descrevem cassetes de DNA para supressão de pelo menos um gene em uma célula de um eucario-ta, tais cassetes de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um DNA passível de transcrição incluindo pelo menos um íntron, um sinal de poliadenilação e um sítio de poliadenilação, onde é incrustado no íntron DNA heterólogo o qual é derivado de pelo menos um gene objetivado à supressão e o qual é passível de transcrição em RNA capaz de supressão de pelo menos um gene. Todos esses pedidos de patente e publicações mencionados são incorporados por referência em sua totalidade aqui.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve uma planta de milho transgênica tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina, pelo que expressão do DNA transgênico resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente da planta de milho transgênica. Em um aspecto da presente invenção, a seqüência para redução de zeína inclui seqüência para supressão de gene de pelo menos um gene de síntese de zeína. Em outro aspecto da presente invenção, a seqüência para biossíntese de lisina inclui um gene de síntese de lisina exógeno. Em um outro aspecto da presente invenção, a seqüência para a biossíntese de lisina inclui seqüência para supressão de gene de uma enzima catabólica de lisina endógena à planta de milho transgênica. Plantas transgênicas transformadas primárias e sua descendentes transgênica são descritas e reivindicadas pela presente invenção.

A invenção também proporciona um método para proporcionar semente de milho com teor de lisina sinergisticamente aumentado incluindo:

(a) fornecimento de uma planta de milho transgênica tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina,

(b) expressão do DNA transgênico em semente da planta de milho transgênica, a expressão resultando em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente, e

(c) colheita da semente com teor de lisina sinergisticamente aumentado.Modalidades do método da invenção incluem fornecimento de uma planta de milho transgênica através de transformação, bem como fornecimento de uma planta de milho transgênica através de técnicas de cruzamento genético. Outras modalidades específicas da invenção são descritas na descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 a representa análises de espectro de massa por tempo-de-vôo através de ionização por desabsorção a laser matriz-assistida de semente com uma primeira planta de milho transgênica precursora PQ015/PQ 15.0001 e PQ071/PQ71.0014 as quais têm, em seu genoma, uma seqüência para redução de zeína, mostrando a redução em alfa-zeínas de 19-quiloDáltons comparado com a linhagem de milho do tipo selvagem 90DJD28/91INH2.0002, a qual tem um genótipo substancialmente similar às primeiras plantas de milho transgênicas, mas carece da seqüência para redução de zeína. Veja Exemplo 1. O eixo X é mostrado como as proporções m/z (massa para carga). O eixo Y é mostrado como intensidade percentual. Os espectros de massa foram normalizados através de um pico de proteína padrão, [CA+H]+ (anidrase carbônica), próximo de 29.000 m/z. Acredita-se quê o pico de 15.615 Dáltons entre [CA+H]2+ e beta-zeína de 15 quiloDáltons seja um contaminante de anidrase carbônica. Figura 1b representa o teor de lisina total das primeiras plantas de milho transgênicas precursoras PQ015/PQ15.0001 e PQ071/PQ71.0014 comparado com linhagens de milho do tipo selvagem 90DJD28/91INH2 e 90DJD28/91 INH2.0002. As barras de erro sobre os teores totais de lisina de PQ015/PQ15, PQ071/PQ71 e >v25 90DJD28/91INH2 representam os intervalos de confidencia (alfa = 0,05, n = 20).

Figuras 2a-d representam os resultados de ensaios de caracterização de semente de M27908+.0028, representativa de uma segunda planta de milho transgênica precursora (M27908+) tendo, em seu genoma, DNA 30 transgênico incluindo seqüência para biossíntese de lisina (cordapA) e semente de M27908-.0006, representativa da linhagem de milho do tipo selvagem M27908- a qual tem um genótipo substancialmente a M27908+, mascarece da seqüência para biossíntese de lisina. Veja Exemplo 1. Figura 2a representa os resultados de análises de lisina livre. As barras de erro são os desvios padrão das espigas irmãs. Figura 2b representa os resultados de análise de Western de cordapA de grãos maduros individuais. Uma expressão embrião-específica de Cordapa foi observada e a homozigosidade da espiga, M27908+.0028, foi confirmada. Figura 2c representa resultados de ELISA de Cordapa, os quais ainda confirmaram o acúmulo embrião-específico de Cordapa. As barras de erro são os desvios padrão de réplicas experimentais. Figura 2d representa os resultados de um ensaio de atividade de DHDPS insensível à lisina. A concentração de lisina usada no ensaio de atividade de DHDPS foi de 1 milimolar.

Figura 3 representa análises de espectro de massa por tempo-de-vôo através de ionização por desabsorção a laser matriz-assistida representativas de semente de plantas de milho transgênicas de descendentes F1 PQ15/Cordapa e PQ71/Cordapa, mostrando perfis de zeína similares às respectivas plantas de milho transgênicas precursoras PQ015/PQ15.0001 ("PQ15") e PQ071/PQ71.0014 ("PQ71") as quais têm, em seu genoma, uma seqüência para redução de zeína. Veja Exemplo 1. Espectros de massa de sementes de Cordãpã e Controle são comparáveis a 90DJD28/91INH2.0002. O eixo X é mostrado como proporções m/z (massa para carga). O eixo Y é mostrado como intensidade percentual.

Figura 4 representa os resultados de ELISA de Cordapa para semente dissecada de plantas de milho transgênicas de descendentes F1, PQ15/Cordapa e PQ71/Cordapa, confirmando a expressão embriãoespecífica da seqüência para biossíntese de lisina, cordapA. Veja Exemplo 1. Em PQ15/Cordapa e PQ71/Cordapa, a expressão de Cordapa é maior do que no controle F1, Cordapa, o qual carece da seqüência para redução de zeína. As barras de erro representam os intervalos de confidencia (alfa = 0,05, n>20). N. D., não detectado. Figuras 5a-e representam correlações de Pearson entre a lisina livre e outros componentes da via de biossíntese de lisina nas plantas de milho transgênicas de descendentes F1, PQ15/Cordapa e PQ71/Cordapa ea planta transgênica precursora Cordapa. Veja Exemplo 1, Tabela 3. Figura 5a mostra a correlação entre a lisina livre e aspartato livre. Figura 5b mostra a correlação entre lisina livre e asparagina livre. Figura 5c mostra a correlação entre lisina livre e glutamato livre. Figura 5d mostra a correlação entre lisina livre e sacaropina livre. Figura 5e mostra a correlação entre lisina livre e expressão de Cordapa. Cada ponto de dados representa espigas trituradas crescidas coletados de um lote e duas plotagens para cada uma das três F1s são usadas. Números dentro de cada gráfico correspondem aos valores r2 de regressões lineares seguido pelos níveis de significância (F).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Geralmente, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos de fabricação ou laboratório descritos abaixo são bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Métodos convencionais são usados para esses procedimentos, tais como aqueles fornecidos na técnica e várias referências gerais. Onde um termo é proporcionado no singular, os inventores também consideram aspectos da invenção descritos pelo plural desse termo. A nomenclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Onde existem discrepâncias em termos e definições usados nas referências que são incorporadas por referência, os termos usados no presente pedido terão as definições fornecidas aqui. Outros termos técnicos usados aqui têm seu significado comum na técnica que eles são usados, conforme exemplificado por uma variedade de dicionários técnicos. Os inventores não pretendem estar limitados a um mecanismo ou modo de ação. Referência aos mesmos é fornecida para fins ilustrativos apenas. Plantas Transqênicas A presente invenção proporciona uma planta de milho transgênica tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina, pelo que expressão doDNA transgênico resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente da planta de milho transgênica.

O DNA transgênico pode ser introduzido no genoma de uma planta de milho através de qualquer um ou mais meios adequados incluindo, mas não limitado a, distribuição direta de DNA, tal como transformação PEG-mediada de protoplastas, eletroporação, agitação com fibras de carbureto de silício, transformação Agrobacterium-meàiada, aceleração de partículas revestidas de DNA e outros métodos semelhantes conhecidos na técnica. Células de milho, bem como aquelas de virtualmente quaisquer outras espécies de planta, podem ser estavelmente transformadas através de tais métodos e essas células desenvolvidas em plantas transgênicas da invenção, métodos preferidos de transformação de planta incluem, mas não estão limitados a, bombardeamento de microprojétil conforme ilustrado, por exemplo, nas Patentes U.S. N— 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865 e transformação Agrobacterium-meóiaúa conforme ilustrado, por exemplo, nas Patentes U.S. N- 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616, 5.981.840 e 6.384.301, todas as quais são incorporadas por referência em sua totalidade aqui.

O DNA transgênico inclui seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina, seqüências as quais são diferentes uma da outra e podem ser introduzidas no genoma da planta transgênica por meio de uma ou mais estruturas de ácido nucléico (isto é, introduzidas simultaneamente em uma estrutura ou individualmente usando mais de uma estrutura, separadamente ou em paralelo). De preferência, a seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina são expressas primariamente na semente da planta transgênica, por exemplo, através do uso de um promotor semente-específico na estrutura ou estruturas, tais como promotores para genes de semente tais como, mas não limitado a, napina (Patente U.S. Ne 5.420.034), oleosina L3 de milho (Patente U.S. Ne 6.433.252), zeína Z27 e glutelina 1 (Russell e outros (1997) Transgenic Res., 6: 157-166), globulina 1 (Belanger e outros (1991) Genetics, 129: 863-872) e antioxidante de peroxiredoxina (Perl) (Stacy e outros (1996) Plant Mol Biol,31: 1205-1216), todos os quais são incorporados por referência aqui. Expressão do DNA transgênico resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente da planta de milho transgênica. O teor de lisina sinergisticamente aumentado é um aumento no teor de lisina que é maior do que a soma do aumento na lisina em virtude do efeito individual da seqüência para redução de zeína e do aumento na lisina em virtude do efeito individual da seqüência para biossíntese de lisina. Expressão da seqüência para redução de zeína e da seqüência para biossíntese de lisina, de preferência, não resulta em traços indesejáveis (por exemplo, menores rendimentos, suscetibilidade aumentada a pestes, doenças ou estresse ambiental e processamento de semente ou qualidades de armazenamento diminuídas).

A seqüência para redução de zeína pode incluir qualquer seqüência que resulta na redução ou diminuição de uma ou mais zeínas na semente de milho, tal como uma seqüência para supressão genética de pelo menos um gene de síntese de zeína. Em uma modalidade não-limitativa, a seqüência para redução de zeína inclui uma seqüência para redução (por exemplo, através de supressão genética) dos níveis de uma alfa-zeína na semente, tal como alfa-zeína de 19 quiloDáltons ou uma alfa-zeína de 22 quiloDáltons. Em outras modalidades, a seqüência para redução de zeína pode incluir uma seqüência para redução dos níveis, na semente, de qualquer uma ou mais das proteínas zeína de interesse, tais como as alfa-, beta-, gama- e delta-zeínas.

Redução dos níveis de zeína na semente pode ser através de qualquer mecanismo incluindo, mas não limitado a, supressão genética de um ou mais genes endógenos de síntese de zeína ou deleção ou mutação de um ou mais genes endógenos de síntese de zeína ou substituição de um ou mais genes endógenos de síntese de zeína por um gene não-endógeno de síntese de zeína ou homólogo genético que resulta em níveis substancialmente diminuídos de zeína na semente ou supressão transcricional de expressão do gene de síntese de zeína. Supressão genética inclui, mas não está limitada a, qualquer um dos métodos bem conhecidos para supressão de um transcrito de RNA ou produção de proteína traduzida a partir de umtranscrito de RNA, incluindo supressão de gene pós-transcricional e supressão transcricional (veja, por exemplo, Matzke e outros (2001) Curr. Opin. Gen. Dev., 11: 221-227 (2001) e Meister & Tuschl (2004) Nature, 431: 343-349). Métodos não-limitativos para efetuar supressão genética incluem supressão genética mediada através de inserção de um constructo de DNA recombinante com DNA orientado anti-sentido (veja, por exemplo, Patentes U.S. N- 5.107.065 e 5.759.829); supressão genética através de integração de DNA disposto como uma repetição invertida resultante de co-inserção de várias cópias de um DNA de transferência em plantas através de transformação Agrobacterium-medlaàa (veja, por exemplo, Redenbaugh e outros em "Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr Savr™ Tomato, CRC Press, Inc. (1992), Stam e outros (1997) PlantJ., 12: 63-82 e Sanders e Hiatt (2005) Nature Biotechnol, 23: 287-289); supressão genética através de inserção de um constructo de DNA recombinante com DNA sentido-orientado (veja, por exemplo, Patentes U.S. N- 5.283.184 e 5.231.020), supressão genética através de transcrição de RNA a partir de um DNA orientado sentido e anti-sentido usando duas unidades de transcrição distintas (veja, por exemplo, Patente U.S. N- 5.107.065); supressão genética através de fornecimento de constructos de transformação que são capazes de geração de um RNA que pode formar RNA filamento duplo ao longo de pelo menos parte de seu comprimento (veja, por exemplo, Pedido de Patente Européia Publicado EP 0426195 A1, Sijen e outros (1996) The Plant Cell, 8: 2277-2294, Publicações de Patente Internacional N— WO98/53083, WO 99/53050, WO 99/49029 e Publicações de Pedido de Patente U. S. N— 2003/0175965, 2003/0036197, 2003/0018993 e 2002/0048814); e supressão genética através de supressão transcricional, tal como supressão com promotor trans (veja, por exemplo, Mette e outros (1999) EMBO J., 18: 241-148 e Mette e outros (2000) EMBO J., 19: 5194-5201). supressão genética também pode ser obtida por meio de uma seqüência que codifica um aptâmero de DNA ou RNA, conforme é conhecido na técnica (veja, por exemplo, Toulme e outros (2004) FEBS Lett, 567: 55-62, Lee e outros (2004) Nucleic Acids Res., 32: 95-100 e Nimjee e outros (2005) Ann. Rev. Med., 56: 555-583). Todas aspatentes, pedidos de patente e publicações citados acima descrevendo supressão genética são incorporados por referência em sua totalidade aqui.

Um constructo de DNA recombinante útil na introdução da seqüência para redução de zeína na planta transgênica da invenção é descrita em um trecho do Pedido de Patente U.S. Ne 11/057.062 e incorporado por referência em sua totalidade aqui. Em uma modalidade não-limitativa, a seqüência para redução de zeína pode incluir um constructo de DNA recombinante para supressão de pelo menos um gene de zeína a qual inclui, na ordem 5' para 3", um elemento promotor operavelmente ligado a um elemento de DNA orientado anti-sentido do pelo menos um gene de zeína e um elemento de DNA sentido-orientado, em que o elemento de DNA sentido-orientado é mais curto do que o elemento de DNA orientado anti-sentido e o RNA sentido-orientado transcrito pelo elemento de DNA sentido-orientado é complementar à extremidade mais 5' do RNA orientado anti-sentido transcrito pelo elemento de DNA orientado anti-sentido, em que o RNA transcrito forma um "loop" de RNA orientado anti-sentido para supressão do pelo menos um gene de zeína. Em outra modalidade, a seqüência para redução de zeína pode ser introduzida na planta transgênica da invenção através de fornecimento, em células da planta transgênica, de um constructo de DNA a qual é transcrito pelo RNA que forma um "loop" de RNA orientado anti-sentido para supressão de pelo menos um gene de zeína.

A seqüência para biossíntese de lisina pode incluir seqüência para qualquer gene ou genes que conferem um aumento nos níveis de lisina na planta transgênica da invenção. Assim, a seqüência para biossíntese de lisina pode incluir uma seqüência de gene exógena para síntese de lisina que codifica enzimas para a síntese de lisina ou seus precursores e/ou uma seqüência para supressão genética de uma enzima catabólica de lisina en-dógena à planta de milho transgênica. Genes de síntese de lisina incluem genes que codificam ou controlam a expressão de enzimas para a síntese de lisina ou seus precursores, tais como quinase de aspartato (AK) e sintase de ácido dihidrodipicolínico (DHDPS) e homólogos desses genes. Genes catabólicos de lisina incluem, mas não estão limitados a, o gene LKR/SDHde milho que codifica reductase de lisina-cetoglutarato (LKR) e dehidrogena-se de sacaropina (SDH) e seus homólogos. Homólogos úteis desses genes catabólicos ou de síntese de lisina podem ser identificados a partir de bancos de dados de seqüência de proteína ou ácido nucléico, por exemplo, a-través de uso de ferramentas de comparação conhecidas por aqueles versados na técnica tais como, mas não limitado a, algoritmos tal como o BLAST (Altschul e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, o qual é incorporado por referência aqui).

Em uma modalidade preferida, a seqüência para biossíntese de lisina inclui seqüência para pelo menos um gene de síntese de lisina exóge-no, de preferência um gene de síntese de lisina substancialmente insensível a feedback. Genes de síntese de lisina substancialmente insensíveis a feedback incluem, mas não estão limitados a, uma quinase de aspartato que é substancialmente insensível à inibição pela lisina, tal como um AKIII de E. coli (veja Patentes U.S. N- 6.459.019 e 5.773.691 e Publicação de Pedido de Patente U.S. Ns 2003/0056242) ou uma sintase de ácido dihidrodipicolíni-co que é substancialmente insensível à inibição pela lisina, tal como DHDPS de E. coli (veja Patentes U.S. N— 5.288.300, 6.459.019 e 5.773.691 e Publicação de Pedido de Patente U.S. N9 2003/0056242) ou um DHDPS de Corynebacterium ou cordapA (veja Patentes U.S. N- 6.459.019 e 5.773.691 e Publicação de Pedido de Patente U.S. Ne 2003/0056242); todas essas patentes e pedidos de patente citados são incorporados por referência em sua totalidade aqui. Veja também Pedido de Patente U.S. N8 11/004.221 para Dizigan e outros, "High Lysine Maize Compositions and Methods for Detecti-on Thereof", depositado em 2 de Dezembro de 2004, o qual é incorporado por referência em sua totalidade aqui e o qual divulga DHDPS de Corynebacterium ou cordapA, o qual seria um gene de síntese de lisina substancialmente insensível a feedback adequado.

Em outra modalidade preferida, a seqüência para biossíntese de lisina inclui seqüência para supressão genética de pelo menos uma enzima catabólica de lisina endógena à referida planta de milho transgênica, tal como uma seqüência para supressão genética das enzimas LKR ou SDH en-dógenas à planta de milho. Em ainda outra modalidade preferida, a seqüência para biossíntese de lisina inclui seqüência para pelo menos um gene de síntese de lisina exógeno e seqüência para supressão genética de pelo menos uma enzima catabólica de lisina endógena à referida planta de milho transgênica. Em ainda outra modalidade preferida, a seqüência para biossíntese de lisina inclui seqüência de codificação de uma enzima sintética de lisina substancialmente insensível a feedback e uma seqüência para supressão genética de uma enzima catabólica de lisina endógena à planta de milho transgênica.

Os constructos e métodos descritos no Pedido de Patente Provisório U.S. N9 60/638,256 e incorporado por referência em sua totalidade a-qui, são particularmente úteis na introdução da seqüência para biossíntese de lisina em uma planta transgênica da presente invenção. Em uma modalidade específica e particularmente preferida, a planta transgênica da invenção tem, em seu genoma, uma seqüência para biossíntese de lisina incluindo (a) seqüência de íntron dentro da qual está incrustada uma seqüência para supressão genética de pelo menos uma enzima catabólica de lisina endógena à referida planta de milho transgênica e opcionalmente (b) seqüência que codifica uma enzima sintética de lisina substancialmente insensível a feedback.

A presente invenção considera e reivindica plantas de milho diretamente regeneradas de células as quais tenham sido transformadas com DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e/ou seqüência para biossíntese de lisina, bem como descendentes de tais plantas, por e-xemplo, descendentes endógama e descendentes híbrida de plantas de milho transformadas. A presente invenção considera plantas de milho transgênicas produzidas através de transformação direta com DNA transgênico, incluindo seqüência para redução de zeína e/ou seqüência para biossíntese de lisina e plantas transgênicas feitas através de cruzamento de uma planta tendo DNA transgênico da invenção com uma segunda planta carecendo do constructo. Em uma modalidade da presente invenção, a planta de milho transgênica pode incluir uma planta de milho transgênica de descendentesde cruzamento genético de uma primeira planta de milho transgênica precursora tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e uma segunda planta de milho transgênica precursora tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para biossín-tese de lisina, em que a planta de milho transgênica de descendentes do cruzamento genético tem, em seu genoma, a seqüência para redução de zeína e a seqüência para biossíntese de lisina; semente da planta de milho transgênica de descendentes tem um teor de lisina sinergisticamente aumentado quando comparado com sementes das primeira e segunda plantas de milho transgenicas precursoras.

Em uma modalidade preferida, semente da primeira planta de milho transgênica precursora tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína tem um teor de lisina maior do que semente de uma planta de milho com um genótipo substancialmente similar à primeira planta de milho transgênica, mas carecendo da seqüência para redução de zeína e semente da segunda planta de milho transgênica precursora tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para biossíntese de lisina também tem um teor de lisina maior do que semente de uma planta de milho com um genótipo substancialmente similar à primeira planta de milho transgênica, mas carecendo da seqüência para biossíntese de lisina. Semente da planta de milho transgênica de descendentes tem um teor de lisina sinergisticamente aumentado quando comparado com semente das primeira e segunda plantas de milho transgenicas precursoras.

Em outra modalidade, sementes de plantas de milho transgenicas da presente invenção podem ser colhidas de plantas transgenicas férteis e ser usadas para desenvolver gerações de descendentes de plantas de milho transgenicas da presente invenção, incluindo linhagens de planta híbridas ou endógamas que contêm, em seu genoma, o DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina e que produzem semente com um teor de lisina sinergisticamente aumentado.Método Para Proporcionar Semente de Milho Com Elevado Teor de Lisina

A presente invenção descreve e reivindica um método para proporcionar semente de milho com teor de lisina sinergisticamente aumentado, incluindo:

(a) fornecimento de uma planta de milho transgênica tendo, em seu geno-ma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina;

(b) expressão do DNA transgênico em sementes da planta de milho transgênica, a expressão resultando em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente; e

(c) coleta da semente com teor de lisina sinergisticamente aumentado.

A planta de milho transgênica útil no método da invenção é descrito acima em um trecho sob o cabeçalho "Plantas Transgênicas". Preparação de constructos de ácido nucléico para transformação de células de planta e produção da planta transgênica faz uso de métodos bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as metodologias descritas em Sambrook e Rus-sell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, incorporada por referência aqui. Aqueles versados na técnica estarão familiarizados com técnicas para transformação de células de planta para proporcionar uma planta transgênica útil no método da invenção. Veja, por exemplo, métodos de bombardeamento de micro-projétil, conforme descrito nas Patentes U.S. N- 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208 e 6.399.861 e métodos de transformação Agrobacterium-mediada, conforme descrito na Patente U.S. Ne 5.591.616, todas as quais são incorporadas aqui por referência. Técnicas úteis para transformação de células de planta usando integração sítio-específica incluem o sistema cre-lox descrito na Patente U.S. Ne 4.959.317 e o sistema FLP-FRT descrito na Patente U.S. N9 5.527.695, ambas as quais são incorporadas por referência aqui.

Transformação de células de planta para proporcionar plantas transgênicas úteis no método da invenção é, de preferência, praticada em cultura tecidual sobre meio e em um ambiente controlado. Métodos de transformação prática e materiais para fabricação de plantas transgênicas úteisno método da presente invenção, por exemplo, vários meios e células-alvo recipientes, transformação de embriões imaturos e subseqüente regeneração de plantas transgênicas férteis, são descritos nas Patentes U.S. N— 6.194.636 e 6.232.526, as quais são incorporadas aqui por referência.

Após distribuição do DNA transgenico às células de planta recipientes, células transformadas são, geralmente, identificadas para cultura e regeneração de planta adicionais. Para melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se empregar um gene marcador selecionável ou passível de triagem, onde a população de célula potencialmente transformada pode ser avaliada através de exposição das células a um agente ou agentes seletivos ou selecionada com relação ao traço do gene marcador desejado. Exemplos não-limitativos de marcadores selecionáveis incluem um gene que expressa uma proteína colorida ou fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP) ou luciferase ou um gene que expressa um gene de beta-glucuronidase ou uidA (GUS) para os quais vários substratos cromogênicos são conhecidos. Exemplos não-limitativos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antibióticos, tais como canamicina e paromomicina {nptlf), higromicina B (aph IV) e gentamicina (aac3 e aacCA) ou resistência a herbicidas, tais como glufosinato {bar ou par) e glifosato (a-roA ou EPSPS); exemplos particularmente úteis de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas Patentes U.S. N- 5.550.318, 5.633.435, 5.780.708 e 6.118.047, todas as quais são incorporadas por referência aqui.

O método da invenção pode proporcionar a planta de milho transgenica através de cruzamento genético de uma primeira planta de milho transgenica precursora tendo, em seu genoma, DNA transgenico incluindo seqüência para redução de zeína e uma segunda planta de milho transgenica precursora tendo, em seu genoma, DNA transgenico incluindo seqüência para biossíntese de lisina, em que o cruzamento genético resulta em uma planta de milho transgenica de descendentes tendo, em seu genoma, a seqüência para redução de zeína e a seqüência para biossíntese de lisina.

Expressão do DNA transgenico está, de preferência, substancialmente localizada na semente da planta de milho transgenica, por exemplo,substancialmente localizada no embrião, no endosperma ou no embrião e no endosperma usando, por exemplo, promotores descritos acima sob o cabe-çalho "Plantas Transgênicas". Tal expressão resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente, mais preferivelmente um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente no momento de colheita da semente da planta de milho transgênica. A semente pode ser colhida e usada para qualquer finalidade de interesse incluindo, por exemplo, para fins de plantio ou para processamento em produtos alimentícios para seres humanos, produtos de ração para animal, óleos, amidos, produtos farmacêuticos e vários produtos industriais. Discussões exemplificativas dos usos de milho podem ser encontradas, por exemplo, nas Patentes U.S. N— 6.194.636, 6.207.879, 6.232.526, 6.426.446, 6.429.357, 6.433.252, 6.437.217 e 6.583.338 e Publicações PCT WO 95/06128 e WO 02/057471, cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade aqui.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Esse exemplo não-limitativo ilustra um método da invenção para proporcionar semente de milho com teor de lisina sinergisticamente aumentado e ainda ilustra uma planta de milho transgênica da invenção tendo, em seu genoma, DNA transgênico incluindo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina, pelo que expressão do DNA transgênico resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da semente da planta de milho transgênica. Mais especificamente, esse exemplo, descreve o cruzamento genético de primeiras plantas de milho transgênicas precursoras (linhagens com redução de zeína PQ15 e PQ71 as quais têm, em seu genoma, uma seqüência para redução de zeína e mostram redução no acúmulo de lisina) e segundas plantas de milho transgênicas precursoras (linhagem M27908+ com alto teor de lisina a qual tem, em seu genoma, uma seqüência para biossíntese de lisina e mostra lisina livre elevada causada pela expressão de um gene cordapA exógeno). Esses cruzamentos genéticos demonstraram que teor de lisina sinergisticamente aumentado poderia ser obtido em semente de milho de uma planta de milho transgênica exemplifi-cativa da invenção. PLANTAS TRANSGÊNICAS Linhagens com Redução de Zeína

Um vetor projetado para reduzir zeína foi construído e usado para transformação, conforme descrito em detalhes por Huang e outros (2004) J. Agric. Food Chem., 52: 1958-1964, o qual é incorporado por referência em sua totalidade aqui. Resumidamente, um fragmento de DNA contendo os nucleotídeos 965 - 868 (na orientação anti-sentido) do gene de alfazema de 19 quiloDáltons de milho, Z4 (acesso ao GenBank N9 V01472 ), foi isolado através de PCR. Esse fragmento com região de codificação do gene de zeína foi inserido, na orientação anti-sentido, em um cassete de expressão que também continha o promotor de gama-zeínaA (correspondendo aos nucleotídeos 19 - 1118 da seqüência com acesso ao GenBank Ne S78780) para acionar síntese com elevado teor de mRNA e a região não traduzida 3' do gene de sintase de nopalina de Agrobacterium tumefaciens, para proporcionar uma seqüência de poliadenilação. Esses cassetes de expressão foram introduzidos em embriões de milho imaturos através de bombardeamento de microprojétil.

Plantas transgênicas RO regeneradas foram polinizadas com pólen do tipo selvagem para produzir sementes F1, as quais foram selecionadas para o fenotipo opaco e analisadas através de géis de SDS-PAGE para examinar seus perfis de zeína. Dentre as linhagens RO que se verificou mostram um fenotipo de redução de alfa-zeína de 19 quiloDáltons, duas linhagens RO, "PQ15" e "PQ71" (contendo 3 cópias e 6 cópias, respectivamente, do transgene) foram usadas no estudo de cruzamento genético. As espigas selecionadas para esse estudo, PQ015/PQ15.0001 e PQ071/PQ71.0014, exibiam espectros de massa por MALDI-TOF (tempo-de-vôo através de ionização por desabsorção a laser matriz-assistida) que eram representativos de PQ15 e PQ71 (veja Figura 1a). PQ15 tem a redução mais dramática em alfa-zeínas de 19 quiloDáltons e um ligeiro aumento em alfa-zeínas de 22 quiloDáltons, enquanto que PQ71 mantém uma redução modesta em alfa-zeínas de 19 quiloDáltons, com um grande aumento em alfa-zeínas de 22 quiloDáltons. Ambas as espigas selecionadas também têm maior teor de lisina total do que as espigas do tipo selvagem (veja Figura 1b).

Linhagens com Alto Teor de Lisina

Plasmídeos binários foram projetados para expressar cordapA, a sintase de ácido dihidrodipicolínico lisina-insensível (DHDPS) de Corynebac-terium glutamicum (veja Patente U. S. NQ 5.773.691, a qual é incorporada por referência). Construção e uso desses plasmídeos binários é descrita em detalhes por Huang e outros (2004) Transgenic Res., 13: 451-461, o qual é incorporado por referência em sua totalidade aqui. Resumidamente, os plasmídeos binários continham as regiões de borda de T-DNA direita e esquerda que flanqueiam um cassete de expressão que incluía o promotor gibi de milho, um íntron de actina de arroz, a região de codificação de cordapA com um peptídeo líder de DHDPS de milho e o terminador gibi de milho. Esse cassete de expressão é designado para expressão embrião-específica de cordapA. Os plasmídeos binários também incluíam um marcador selecionável que confere resistência ao glifosato, epsps-cp4 (sintase de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaci-ens). Convencionalmente, o marcador selecionável (epsps-cp4) estaria, tipicamente, colocado adjacente ao gene de interesse (cordapA), permitindo que o cassete de expressão de cordapA e o marcador selecionável epsps-cp4 estivessem co-integrados quando transformados em uma célula de planta, assim, intensificando a recuperação de plantas contendo o transgene cordapA através de seleção sob glifosato. Antes, vetores binários alternativos foram construídos (veja Figura 3 em Huang e outros (2004) Transgenic Res., 13: 451-461), onde o marcador epsps-cp4 estava (1) colocado onde normalmente seria considerada a "estrutura principal" do vetor, ao invés de dentro da região de T-DNA e adjacente ao gene de interesse, cordapA (vetores pMON65178 e pMON65179) ou (2) localizado entre um segundo conjunto de regiões de borda de T-DNA esquerda e direita (vetor pMON65180).

Plantas RO que foram identificadas como positivas para cordapA foram avaliadas através de Southern blot para determinar a freqüência deplantas contendo cordapA não relacionada ao marcador selecionável, epsps-cp4. O vetor que produziu o maior percentual (35,6%) de eventos não-relacionados foi pMON65178, o qual continha epsps-cp4 na estrutura principal do vetor e adjacente ao cassete de expressão cordapA. Mudas R1 derivadas de plantas RO com inserções não-relacionadas foram testadas com relação à segregação de epsps-cp4 e cordapA através de PCR.

Segregantes isentos de marcador que eram corotep-4-positivos e epsps-cp4-negativos foram identificados de 93% de eventos não-relacionados transformados por pMON65178. pMON65178 incluía as seqüências de borda direita e esquerda que flanqueiam um cassete de expressão contendo o promotor gibi de milho, um íntron de actina de arroz, a região de codificação de cordapA (nucleotídeos 3 a 903 da seqüência descrita como SEQ ID NO: 6 na Patente U. S. Ns 6.459.019, a qual é incorporada por referência aqui) com um peptídeo líder DHDPS de milho e o terminador gibi de milho, com o marcador epsps-cp4 colocado na "estrutura principal" do plasmídeo e adjacente à região de T-DNA. Outros genes de cordapA funcionais poderiam ser usados tais como, mas não limitado a, a seqüência de 917 pares de base de comprimento total descrita como SEQ ID NO: 6 na Patente U. S. Ne 6.459.019 ou a seqüência do gene dapA de Corynebacterium publicada por Bonnassie e outros (1990) Nucleic Acids Res., 18: 6421, ambos os quais são incorporados aqui por referência ou homólogos lisina-insensíveis desses genes os quais podem ser identificados através de ferramentas de comparação de seqüência conhecidas na técnica, por exemplo, um algoritmo BLAST. Uma das linhagens transgenicas cordapA isenta de marcador gerada por essa abordagem era M27908. Sementes derivadas desse evento têm um teor médio de 2505 ppm de lisina livre em sementes de seu segre-gante do tipo selvagem, o qual contém uma média de 71 ppm de lisina livre.

Linhagens transgenicas M27908+.0028 e M27908-.0006 foram usadas como o controle de cordapA e do tipo selvagem no experimento de cruzamento, as quais contém níveis de lisina livre de 2706 e 64 ppm, respectivamente (Figura 2a). A expressão embrião-específica de cordapA foi confirmada através de Western blots e ensaios ELISA (Figura 2b e Figura 2c).Embriões M27908+.0028 transgênicos também mostraram atividade de DHDPS elevada, mesmo na presença de lisina (Figura 2d). Cruzamento Genético de Linhagens de Milho com Teor Reduzido de Zeína e Alto Teor de Lisina

Cruzamento genético foi realizado com primeiras plantas de milho transgênicas precursoras (linhagens com redução de zeína, PQ15 e PQ71 as quais têm, em seu genoma, uma seqüência para redução de zeína) e segundas plantas de milho transgênicas precursoras (linhagem M27908+ com alto teor de lisina a qual tem, em seu genoma, uma seqüência para bi-ossíntese de lisina). As linhagens com redução de zeína, PQ15, PQ71 e seu controle do tipo selvagem, 90DJD28/91INH2, foram usadas como fêmeas e polinizadas com a linhagem com alto teor de lisina, M27908+, e seu controle do tipo selvagem, M27908-, no campo. A Tabela 1 lista os seis diferentes genotipos F1 resultantes, suas designações e os números de espigas colhidas e analisadas. Todos os grãos transgênicos que resultaram dos cruzamentos de precursores transgênicos homólogos eram hemizigóticos. Mais de vinte espigas F1 de dois lotes diferentes de cada cruzamento foram colhidas e analisadas; apenas espigas com cerca de 150 a cerca de 400 grãos por espiga foram selecionadas para análise. Tabela 1

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ANÁLISES:

Dissecacão de Grãos

Para facilitar a dissecção de grãos, grãos secos maduros foram submersos em água e armazenados a 4 graus Celsius durante a noite. Cin-qüenta grãos por espiga foram dissecados e liofilizados para remover a á-gua. Após registrar os pesos secos do embrião e endosperma preparados, as amostras foram trituradas até um pó. Verificou-se que embebimento em água não afeta significativamente as análises aproximadas e de aminoácido posteriores.

Ensaio de Atividade e Extração de Cordapa

Pós de embrião e endosperma seco foram extraídos com uma proporção a 1:3 de tecido para hexano várias vezes a 50 a 55 graus Celsius durante 3 á 10 minutos. Após extração com hexano, o pó foi liofilizado e armazenado a 4 a 6 graus Celsius. Cordapa e DHDPS nativo foram extraídos com Tris-HCI a 20 milimolares, pH de 8,0, KCI a 100 milimolares e piruvato de sódio a 10 milimolares. Uma proporção de 1:5 de tecido para tampão de extração de Cordapa foi usada com agitação durante 1 hora a 4 graus Celsius. O extrato foi microcentrifugado durante 5 minutos a 14.000 x g. Para o ensaio (adotado de Frisch e outros (1991) Plant Physiol., 96: 444-452, o qual é incorporado através de referência), o sobrenadante do extrato foi ainda diluído seis vezes em tampão de extração. Vinte microlitros de extrato diluído foram adicionados às cavidades de uma microlâmina. Para começar a reação, 180 microlitros de tampão de reação foram adicionados, o qual continha Tris-HCI a 200 milimolares, pH de 8,0, piruvato de sódio a 16 milimolares, ASA a 1 milimolar (ácido L-aspártico-trifluoroacetato de hidrato de beta-semialdeídeo) e mais ou menos cloridrato de lisina a 1 milimolar. O ASA foi obtido da Gateway Chemical Technology, St. Louis e dissolvido em HCI a 4N para proporcionar uma solução de estoque a 140 milimolares. Antes de uso, o estoque de ASA a 140 milimolares foi diluído para 14 milimolares através de adição de 100 microlitros do estoque de ASA a 140 milimolares a 100 microlitros de Tris-HCI a 1 molar, pH de 8,0 e 800 microlitros de NaOH a 1N. A reação foi deixada processar durante 1 hora a 37 graus Celsius e, então, cessada através da adição de 100 microlitros de reagente colorimetrico de ponto de virada ("endpoint"). Esse reagente foi feito através de dissolução de 20 miligramas de orto-aminobenzaldeído em 0,3 mililitro de etanol os quais foram, então, adicionados a 11,7 mililitros de tampão de citrato a 0,22 molar-fosfato a 0,55 molar, pH de 5,5. A cor foi deixada desenvolver durante 10 minutos em temperatura ambiente e a absorbância lida a 520 nanômetros com um leitor para microlâmina SpectraMax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Western Blot de Cordapa

Vinte miligramas de endosperma ou embrião triturado foram incubados em 200 microlitros de tampão de SDS-borato (Na2B4O7"10 H20 a 60 milimolares, pH de 10, SDS a 4%, 1,5 miligramas/mililitros de ditiotreitol) a 65 graus Celsius durante 1,5 hora. Amostras foram centrifugadas a 14000 rpm durante 5 minutos e 60 microlitros de sobrenadante transferidos para uma lâmina de PCR com 96 cavidades contendo 30 microlitros de 3X tampão de carregamento SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA). A lâmina com amostra foi aquecida a 98 graus Celsius durante 10 minutos, então, esfriada e armazenada a 4 graus Celsius até carregamento. Vinte e quatro géis de SDS-PAGE bem pré-fundidos (4-20%) (Bio-Rad) foram carregados com 13 microlitros de amostra, cada um junto com Cordapa recombinante purificado e padrão de MW pré-corado (Bio-Rad) para referência. Os géis foram operados em uma tensão constante (90 volts) até que o corante atingisse o fundo do gel; os géis foram, então, transferidos para uma membrana de PVDF (Bio-Rad). O anticorpo anti-Cordapa de cabra foi produzido através de imunização de cabras contra Cordapa recombinante E. co//-expresso. O Kit de Ensaio Immun-Blot contendo conjugado de fosfatase alcalina/lgG anticabra de coelho (Bio-Rad) foi usado para detecção seguindo os protocolos do fabricante.

ELISA de Cordapa

Cem miligramas de pó de embrião ou endosperma dissecado seco foram analisados. Após adição de 2,5 mililitros de tampão de extração gelado (Na2B4O7"10 H20 a 50 milimolares, KCI a 0,75 molares, Tween20 a 0,2% v/v, NaOH a 36 milimolares e ácido L-ascórbico a 10 milimolares), a amostra foi vigorosamente agitada a 4 graus Celsius durante 30 minutos. Os extratos foram filtrados e alíquotas de amostras foram armazenadas a -20 graus Celsius. Uma série de diluições (1/10, 1/100, 1/1000,1/5000) foi feita eusada para a análise. Cem microlitros de anticorpo primário diluído (2,4 mi-crogramas/mililitro) foram adicionados a cada cavidade de uma lâmina Nunc Immuno (VWR, West Chester, PA) e incubados a 4 graus Celsius. As lâminas foram lavadas 3 vezes com PBST (NaCI a 137 milimolares, Na2HP04'7H20 a 8,1 milimolares, KH2P04a 1,5 milimolares, KCI a 2,7 milimolares e Tween20 a 0,05% v/v) e incubadas durante 1 hora a 37 graus Celsius com 100 microlitros de TBA (Tris a 100 milimolares, Na2B4O7'10H2O a 100 milimolares, pH de 7,8, MgCI2 a 5 M, Tween20 a 0,05% v/v e ácido L-ascórbico a 0,2% (v/v)) com leite em pó a 0,1% para bloquear contra adsor-ção de proteína não-específica, então, lavadas novamente 3 vezes com PBST. Diluições seriais de proteína Cordapa em TBA foram feitas (1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05 nanogramas/mililitros) como padrões. Cem microlitros de cada padrão e diluições de amostra foram carregados em triplicata sobre as lâminas e incubados durante 1 hora a 37 graus Celsius. Após lavagem 3 vezes com PBST, 100 microlitros de diluição a 1:10000 em TBA de anticorpo primário anti-Cordapa de cabra Biotina-conjugada foram adicionados a cada cavidade e as lâminas incubadas durante 1 hora a 37 graus Celsius. Após lavagem 3 vezes com PBST, uma segunda incubação com uma diluição a 1:10000 de IgG anticabra de camundongo conjugado com Neutravidina-HRP (KPL Inc., Gaithersburg, MD) foi adicionada. Após lavagem 3 vezes com PBST, uma incubação de dez minutos com 100 microlitros de substrato de TMB/H202 (1:1) (VWR) foi seguida e a reação foi cessada através da adição de 100 microlitros de H3P04 a 6M. A absorbância foi lida a 450 nanômetros usando um leitor para microlâmina SpectraMax Plus (Molecular Devices). Espectrometria de Massa com Tempo-de-vôo através de lonizacão por De-sabsorção a Laser Matriz-assistida

Grãos individuais foram triturados e extraídos com um tampão de etanol (etanol a 70%, hidróxido de amônio a 25 milimolares e ditiotreitol a 10 milimolares) em uma proporção de 40 miligramas de pó de grãos para 1 mililitro de tampão. As amostras foram incubadas durante 1 hora em um banho de água a 60 graus Celsius, com agitação periódica e centrifugadas durante 15 minutos a 1000 rpm. Um microlitro de cada amostra foi, então, mis-turado com 8 microlitros de matriz (10,4 miligrama/mililitro de ácido 2-(4'-hidroxiazobenzeno)-benzóico (HABA) em acetonitrila a 70% com ácido triflu-oroacético a 0,3%) usando um robô SymBiot™ I da Applied Biosystems (Framingham, MA). A partir dessa mistura, 0,6 microlitro foram depositados sobre uma lâmina alvo MALDI de 384-posições (Applied Biosystems). Ani-drase carbônica (Sigma, St. Louis, MO) foi incluída na mistura de matriz (1 milimolar) como um padrão interno para normalizar os espectros. Análise por Espectrometria de massa com tempo-de-vôo através de ionização por de-sabsorção a laser matriz-assistida (MALDI-TOF MS) foi realizada usando um Applied Biosystems Voyager-DETM PRO Biospectrometry™ Workstation com um laser de nitrogênio de 337 nanômetros. Uma descrição detalhada do método de MALDI-TOF MS para análise de proteínas de zeína foi publicada por Adams e outros (2004) J. Agric. Food Chem., 52: 1842-1849, o qual é incorporado aqui por referência. Análise de Aminoácido

Amostras de farelo triturado (50 miligramas) de reservatórios de grãos inteiros ou embrião ou endosperma dissecado foram extraídas com TCA a 5% a 4 graus Celsius durante a noite. Extratos foram filtrados, diluídos se necessário e analisados com relação aos aminoácidos livres através do método OPA, o qual usa orto-ftaldialdeído para derivatizar amostras antes de injeção sobre uma coluna de HPLC de fase reversa C18 (Zorbax E-clipse-AAA, XDB C-18, 4,6 milímetros x 75 milímetros, 3,5 micrometros, Agilent Technologies, Paio Alto, CA) seguido por uma coluna de proteção (Zorbax Eclipse-AAA, 4,6 milímetros x 12,5 milímetros, 5 micrometros, Agilent Technologies, Paio Alto, CA). Foi também usado um Agilent HPLC (modelo 1100) equipado com um detector de fluorescência. Para análise de aminoácido total, hidrólise de proteína foi realizada antes de derivatização com O-PA. Amostras (60 miligramas) foram hidrolisadas com 10 mililitros de HCI a 6 N e 10 microlitros de fenol a 110 graus Celsius durante 24 horas sob argô-nio. Alíquotas foram secas e redissolvidas em HCI a 0,1 N para derivatização com OPA e subseqüente análise por HPLC. Medições de lisina foram repetidas através de LC-MS/MS. Os metabólitos de lisina, delta-semialdeído alfa-aminoadípica ("AAA") e sacaropina ("Sac") também foram medidos. Análise de Composição

Os teores aproximados de grãos crescidos de cada espiga na Tabela 2 foram determinados através de análise por transmissão próximo do infra-vermelho (NIT) (conforme descrito por Dyer e Feng (1997) Feedstuffs, 69: 16-25, o qual é incorporado por referência) usando um Analisador de grãos Infratec 1221 (Foss, Eden Prairie, MN). O teor de proteína total do embrião e endosperma dissecado apresentado na Tabela 2 foi determinado com um Determinador de Proteína/Nitrogênio FP-528 (LECO, St. Joseph, Ml) seguindo o método oficial Ba 4f-00 da AOCS (American Oil Chemical Society).

Ensaio de Atividade e Extração de LKR/SDH

Esse procedimento de preparação de extrato foi adaptado e modificado de Goncalves-Butruile e outros (1996) Plant Physiol., 110: 765-771, Gaziola e outros (1999) J. Agric. Food Chem., 47: 1268-1275 e Kemper e outros (1998) Eur. J. Biochem., 253: 720-729, todos os quais são incorporados por referência aqui. Grãos de milho triturados congelados frescos dos germplasmas de interesse (300-600 miligramas) foram colocados em um tubo de 2 mililitros com Lysing Matrix E (Q-Biogen, Irvine, CA) pré-misturada com 150 microlitros (volume seco) de polivinilpirrolidona. Um volume de 625 microlitros de tampão de extrato (KH2P04:K2HP04 a 50 milimolares, pH de 7,4, NaCI a 125 milimolares, MgCI2a 2,0 milimolares, EDTA a 1,0 milimolar, CaCI2a 250 micromolares, Glicerol a 10%, CHAPS a 0,1%, NaF a 8 milimolares, DTT a 4 milimolares e um comprimido completo de protease (Roche, Indianápolis, IN) foi adicionado por cima dos grãos triturados e matriz. As amostras foram homogeneizadas usando uma máquina Fast Prep (Q-Biogen). Os homogenatos foram colocados sobre gelo, com mistura/agitação ocasional, durante 15-20 minutos antes de centrifugação a 14.000 x g durante 15 minutos. O sobrenadante (550 a 625 microlitros) foi removido dos resíduos acondicionados e colocado em um tubo distinto. Essa amostra foi fra-cionada através de precipitação com PEG (PEG 8000 a 50% peso/v em á-gua) a 7,5 e 15%. O pélete a 15% (a qual continha a atividade de LKR eSDH) foi ressuspenso em tampão de extrato fresco (150-300 microlitros) e a atividade de LKR e SDH analisada. Todos os procedimentos foram realizados a 4 graus Celsius ou sobre gelo (exceto homogeneização em temperatura ambiente).

Atividade de LKR e SDH foram analisadas espectrofotometrica-mente (veja, por exemplo, protocolos descritos por Goncalves-Butruile e outros (1996)) durante 10 a 20 minutos observando-se a taxa de oxidação de NADPH ou a taxa de redução de NAD+, respectivamente, a 340 nanômetros e 30 graus Celsius em um Tecan Safire2 (Tecan US, Research Triangle Park, NC). O volume de reação era 200 microlitros para ambos os ensaios. Os ensaios de LKR continham lisina a 25 milimolares, ácido alfa-cetoglutárico a 13,3 milimolares, NADPH a 325 micromolares e 10 a 30 microlitros de extrato em KH2P04:K2HP04a 100 milimolares, pH de 7,0, EDTA a 1 milimolar e MgCI2 a 10 milimolares. Controles negativos continham todos esses, exceto ácido alfa-cetoglutárico. Os ensaios de SDH continham L-sacaropina a 2,15 milimolares, NAD+ a 2,5 milimolares e 10 a 30 microlitros de extrato em KH2P04:K2HP04 a 100 milimolares, pH de 8,4, TAPS a 20 milimolares e EDTA a 1 milimolar. Controles negativos continham todos esses, exceto L-sacaropina. As atividades específicas são reportadas em na-nomols de NADPH oxidado ou NAD+ reduzido por minuto por miligrama de proteína. As concentrações de proteína foram determinadas usando o rea-gente de Bradford da Bio-Rad.

RESULTADOS

Análise de Zeína por Espectro de Massa

Uma vez que os precursores dos cruzamentos F1 eram homozi-góticos para seus respectivos transgenes, os grãos F1 eram uniformemente hemizigoticos para ambos os loci transgenicos. Para assegurar a expressão dos loci transgênico na geração F1, a composição de zeína de grãos individuais foi examinada através de análise espectral por MALDI-TOF. Descobriu-se que os espectros representativos para grãos F1 de cada cruzamento eram similares às linhagens com redução de zeína a partir das quais eles se originaram (Figura 3). Além disso, todas as F1s contendo Cordapa retiveramexpressão embrião-específica de Cordapa (Figura 4). Embora a presença do transgene Cordapa não alterasse os perfis de zeína nessas F1s, sua expressão é perceptivelmente maior nas F1s com redução de zeína. Análises Aproximadas de Grãos Inteiros

A Tabela 2 proporciona os resultados de análises aproximadas por transmissão próxima do infra-vermelho (NIT) e tamanho de grãos crescidos produzidos por espigas transgênicas e do tipo selvagem. Os dados a-presentados são as médias mais ou mais intervalos de confidencia (alfa = 0,05). Os tamanhos foram medidos em pesos em gramas de 100 grãos. Os pesos de proteína total são apresentados como pesos de proteína total de 100 grãos em gramas, os quais foram calculados multiplicando-se o teor de proteína pelo tamanho de 100 grãos. As diferenças relativamente pequenas entre PQ15/Cordapa e PQ15, PQlMCordapa e PQ71 e Cordapa e Controle, sugeriam que Cordapa não contribui para qualquer alteração significativa na composição aproximada dos grãos. Por outro lado, o impacto da redução de zeína na composição aproximada dos grãos era detectável. Os materiais PQ^5/Cordapa e PQ15 que pareciam ter a redução mais dramática em proteínas zeína também pareciam ter menor teor de proteína, menor densidade de semente e menor tamanho de semente. Quando o peso de proteína por 100 grãos foi calculado, PQ15/Cordapa e PQ15 tinham uma redução média de 25% comparado com suas contra-partes sem redução de zeína, Cordapa e Controle. Os teores de proteína ligeiramente maiores dos materiais PQlMCordapa e PQ71 foram compensados por seus tamanhos menores e seus pesos de proteína por 100 grãos eram indistinguíveis daqueles de Cordapa e Controle. O teor de óleo das sementes PQ15/Cordapa e PQ15 era perceptivelmente maior do que outras (consistente com observações para a geração anterior), embora não estivesse claro se isso foi causado pela redução de zeína, uma vez que a outra linhagem com redução de zeína, PQ71, tinha um teor normal de óleo.Tabela 2

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Análise de Metabólito de Lisina e Administração Livre no Grão Inteiro

Os resultados de análise de aminoácido livre do grão inteiro são fornecidos na Tabela 3, com os dados em partes por milhão (ppm) e apresentados como a média de duas plotagens mais ou menos um desvio padrão. Os níveis de lisina e seus metabólitos, delta-semialdeído alfa-aminoadípico (AAA) e sacaropina (Sac), conforme medido através de LC-MS/MS, são também fornecidos.

Tabela 3

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*medido através de LC-MS/MS

O teor de lisina livre do grão inteiro de todos os materiais F1 contendo o transgene Cordapa era muito alto e era acompanhado de aumentos nos metabólitos de lisina, delta-semialdeído alfa-aminoadípico e sa-caropina. Inesperadamente, redução de zeína parecia aumentar sinergisti-camente o acúmulo de lisina livre causado pela expressão de Cordapa (2908 e 2498 ppm em PQ15/Cordapa e PQClVCordapa vs. 1838 ppm em Cordapa). Outros aminoácidos que não lisina, dentre os examinados, asparagina, aspartato, glutamato e glutamina tinham aumentos significativos nas linhagens PQ15 e PQ71. Contudo, quando combinado com Cordapa, conforme em PQ15/Cordapa e PQ71 /Cordapa, os níveis desses aminoácidos se assemelhavam àqueles no material de Controle. Análise de Aminoácido Total no Grão Inteiro

Os resultados de análise de aminoácido total no grão inteiro são fornecidos na Tabela 4, com os dados em partes por milhão (ppm) e apre-sentados como as médias de duas plotagens mais ou menos um desvio padrão. Asparagina e aspartato são combinados ("Asx"); glutamina e glutamato são combinados ("Glx").Tabela 4

<table>table see original document page 31</column></row><table>Conforme mostrado na Tabela 4, as diferenças mais significativas observadas entre os aminoácidos quantificados em grãos F1 inteiros analisados eram nos teores de lisina. Descobriu-se que PQ15 e PQ71 têm níveis elevados de lisina total quando comparado com o Controle. Além disso, após a subtração de seus teores de lisina livre, os teores de lisina total de PQ15/Cordapa, PQlMCordapa e Cordapa eram similares àqueles em PQ15, PQ71 e Controle, respectivamente (veja Tabela 3). Embrião e Endosperma Dissecados - Análise de Metabólito de Lisina e Ami-noácido Livre

Os resultados de análise de aminoácido livre para embriões e endospermas dissecados são fornecidos na Tabela 5, com os dados em partes por milhão (ppm) e apresentados como as médias de duas plotagens mais ou menos um desvio padrão. Amostras foram empoçadas em uma quantidade igual de grãos triturados de cada espiga coletada de um lote. Os níveis de lisina e seus metabólitos, delta-semialdeído alfa-aminoadípico (A-AA) e sacaropina (Sac), conforme medido através de LC-MS/MS, são também fornecidos.Tabela 5

<table>table see original document page 33</column></row><table>Tabela 5 (continuação)

<table>table see original document page 34</column></row><table>Conforme mostrado na Tabela 5, os resultados dos tecidos de embrião e endosperma dissecados eram similares aos dados da análise de grãos inteiros. Materiais F1 abrigando Cordapa tinham aumentos na lisina e metabólitos de lisina e as F1s com redução de zeína tinham maior teor de asparagina, aspartato e glutamato. Em geral, amjnoácidos livres eram mais concentrados (em ppm) nos embriões, o que levou á uma amplificação de algumas das diferenças menores as quais, de outro modo, seriam estatisticamente insignificantes quando examinado através dos grãos intactos. Por exemplo, a expressão de Cordapa também reduziu alanina e se ri na ema-proximadamente 50% em tecidos de embrião (comparando PQ151 Cordapa, PQlMCordapa e Cordapa to PQ15, PQ71 e Controle). Por outro lado, a maioria dos aumentos de asparagina, aspartato e glutamato nas linhagens com redução de zeína foram encontrados no endosperma (comparando PQ15 e PQ71 com Controle).

Embrião e Endosperma Dissecados - Análise de Aminoácido Total

Os resultados de análise de aminoácido total do grão inteiro são fornecidos na Tabela 6, com os dados em partes por milhão (ppm) e apresentados como as médias de duas plotagens mais ou menos um desvio padrão. Asparagina e aspartato são combinados ("Asx"); glutamina e glutamato são combinados ("Glx").Tabela 6

<table>table see original document page 36</column></row><table>Tabela 6 (continuação)

<table>table see original document page 37</column></row><table>Comparando PQ\bl Cordapa com PQ15, PQlVCordapa com PQ71 e Cordapa com Controle, a expressão de Cordapa reduziu ligeiramente os acúmulos de aminoácido total no endosperma. No embrião, histidina e lisina eram os únicos aminoácidos que mostraram aumentos consistentes nas F1s contendo Cordap. Com relação ao impacto da redução de zeína sobre vários níveis de aminoácido total, PQ71, mas não PQ15, tinham maiores teores totais de aminoácido comparado com Controle. Contudo, o aumento na lisina total, o qual ocorreu apenas no endosperma, era consistente em ambos os eventos.

Embrião e Endosperma Dissecado—teor de Proteína e Peso Seco Os resultados de análises do teor de proteína e peso seco para embriões e endospérmas dissecados são fornecidos na Tabela 7, apresentados como a média mais ou menos intervalos de confidencia (alfa = 0,05). Os pesos secos são fornecidos como as médias de somas de 50 embriões ou endospérmas dissecados em gramas.Tabela 7

<table>table see original document page 39</column></row><table>Em todas as três comparações aos pares, PQ15/Cordapa vs. PQ15, PQ71 /Cordapa vs. PQ71 e Cordapa vs. Controle, o teor de proteína parecia aumentar ligeiramente no endosperma com relação ao embrião, sem afetar o peso seco proporcional. Isso era consistente com os dados mostrados na Tabela 6, onde os aminoácidos totais eram maiores em tecidos de embrião e menores em tecidos do endosperma em materiais trazendo o transgene Cordapa. Com relação ao impacto da redução de zeína, comparado com o Controle, PQ15 tinha teores similares de proteína, mas pesos significativamente reduzidos, enquanto que PQ71 tinha teores maiores de proteína e apenas uma pequena redução nos pesos, no embrião e no endosperma.

Atividades de LKR/SDH de Grãos em DesenvolvimentoFI

As atividades específicas de LKR e SDH medidas nos grãos em desenvolvimento F1 são apresentados na Tabela 8. Dados são mostrados como a média mais ou menos o desvio padrão (n = 3). Cada amostra foi preparada a partir de grãos de uma espiga em desenvolvimento a 25 dias após polinização (DAP) e foi avaliada em triplicata. Três espigas em desenvolvimento por F1 foram usadas. Atividades específicas para LKR e SDH são reportadas em nanomoles de NADPH oxidado ou NAD+ reduzido por minuto por miligrama de proteína. Tabela 8

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Atividades específicas de LKR e SDH nos grãos em desenvolvimento F1 estavam entre 14,15 a 29,88 nanomoles de NADPH oxidado por minuto por miligrama de proteína e 3,78 a 6,01 NAD+ reduzido por minutopor miligrama de proteína, respectivamente. As atividades específicas de LKR eram 5- a 10-vezes maiores do que tinha sido anteriormente reportado para endosperma em desenvolvimento de milho. Veja, por exemplo, Azevedo e outros (2004) J. Agríc. Food Chem., 52: 4865-4871, Gaziola e outros (1999) J. Agríc. Food Chem., 47: 1268-1275 e Kemper e outros (1999) Plant Cell, 11: 1981-1993, todos os quais são incorporados por referência aqui. Diferente dos mutantes opacos, a redução de zeína através da abordagem transgênica não-diminui as atividades específicas de LKR e SDH nessas F1s. grãos em desenvolvimento de todas as F1s com redução de zeína (PQ15/Cordapa, PQ15, PQJMCordapa e PQ71) tinham atividades específicas de LKR e SDH similares ou maiores do que aquelas de F1s com níveis normais de zeína, Cordapa e Controle. A concentração elevada de lisina não parece aumentar as atividades específicas de LKR e SDH (comparar PQ-\5/Cordapa com PQ15, PQ71 /Cordapa com PQ71 e Cordapa com Controle). As proporções de LKR/SDH oscilavam de 3,46 a 5,72 e também eram várias vezes maiores do que previamente reportado, consistente com o a-cúmulo de sacaropina encontrado em F1s com elevado teor de lisina.

DISCUSSÃO

As sementes F1 mostraram fenotipos similares aos precursores homozigóticos. Os descendentes F1 contendo o transgene Cordapa tinha maior lisina livre (Tabela 3) e sementes F1 derivadas de PQ15 e PQ71 mostraram redução de zeínas (Figura 3) e teores elevados de lisina total (Tabela 4). Combinação de redução de zeína e expressão Cordapa, conforme nos cruzamentos PQ15/Cordapa e PQ71 /Cordapa, resultou em um aumento substancial (cerca de uma duplicação) do teor total de lisina observado no material de Controle (Tabela 4).

Um efeito sinergístico Corc/apa-dependente inesperado sobre o acúmulo de lisina livre foi observado. Os descendentes F1 Cordapa acumulou 1838 ppm de lisina livre, um aumento maior do que 40 vezes com relação ao Controle de 43 ppm (Tabela 3). Redução de zeína aumentou siner-gisticamente os níveis de lisina livre derivados de expressão de Cordapa, conforme observado nas combinações de PQ15/Cordapa e PQ7MCordapa,os quais tinham teor ainda maior de lisina livre, 2908 e 2498 ppm, respectivamente. F1s com redução de zeína apenas (PQ15 e PQ71) tinham níveis de Controle de lisina livre, o que indicou que a redução de zeína intensificou a biossíntese de lisina de um modo sinergístico na presença de Cordapa. Contudo, lisina livre elevada não contribui para aumentos na lisina proteína-ligada causados pela redução de zeína. Quase todo o aumento na lisina total foi encontrado no endosperma, uma vez que grandes quantidades das zeí-nas pobres em lisina são reduzidas no endosperma de sementes transgênicas (Tabela 6).

Foi proposto que o alto teor de lisina do mutante opaco-2 (Mertz e outros (1964) Science, 145: 279-280) é em virtude da redução de zeínas pobre em lisina e um aumento pleiotrópico nas proteínas de não-zeína ricas em lisina. Veja, por exemplo, Damerval e Devienne (1993) Heredity, 70: 38-51, Habben e outros (1993) Plant Mol. Bioi, 23: 825-838 e Lopez-Valenzuela e outros (2004), Plant Physiol., 135: 1784-1797, todos os quais são incorporados aqui referência aqui. Os aumentos na lisina livre causados pela redução de zeína e expressão de Cordapa em PQ15/Cordapa e PQ7MCordapa foram calculados a partir da Tabela 3, proporcionando valores calculados de lisina livre de 2865 (2908 - 43) ppm em PQ15/Cordapa e 2454 (2498 - 43) ppm em P07M Cordapa, respectivamente. Adicionando os aumentos na lisina livre à lisina total de PQ15 e PQ71 mostrados na Tabela 4, os teores totais de lisina esperados para PQ15/Cordapa e PQlMCordapa foram estimados como sendo 5975 e 5784 ppm. Essas estimativas não eram significativamente diferentes das medições reais de 6160 ± 354 e 5475 ± 375 ppm (Tabela 4). Assim, em contraste às hipóteses anteriores, maior lisina livre não estimula a síntese de proteínas nâo-zeinas ricas em Lisina nas linhagens transgênicas com redução de zeína. Embora PQ15 tivesse um teor de proteína similar ao Controle, seus menores grãos (e, assim, menor endosperma) levam a mesma a conter menos proteína global em uma base por grão (Tabela 2 e Tabela 7), sugerindo que a redução de zeína em PQ15 tinha pouco efeito sobre a síntese de proteínas de não-zeína ricas em lisina. Por outro lado, PQ71 tinha menores grãos, mas um maior teor de proteína e,assim, a quantidade de proteína global é comparável ao Controle (Tabela 2 e Tabela 7). Todos juntos, o maior teor de lisina total observado em PQ15 refletia meramente a redução dé zeína, enquanto que o aumento no teor total de lisina em PQ71 foi provavelmente causado pela síntese de proteínas de não-zeína ricas em lisina.

Descobriu-se que a redução de zeína aumenta, inesperadamente, o suprimento de aminoácidos precursores para biossíntese de lisina Cor-c/apa-intensificada, resultando em um aumento sinergístico na lisina. Nas F1s com redução de zeína (PQ15 e PQ71), três aminoácidos livres, aspara-gina, aspartato e glutamato, tinham aumentos mais perceptíveis dentro todos os aminoácidos livres medidos (Tabela 3). A introdução de Çordapa às linhagens com zeína reduzida intensificou sinergisticamente a biossíntese de lisina e, concomitantemente, reduziu a asparagina, aspartato e glutamato (PQ15/Cordapa, PQ7MCordapa na Tabela 2). Em plantas, acredita-se que a lisina seja sintetizada a partir do aspartato através do ramo de lisina da via da família Asp; o aspartato, por sua vez, pode ser sintetizado a partir de glutamato ou asparaginas. Veja, por exemplo, Galili (2002) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 53: 27-43, o qual é incorporado por referência aqui. As alterações inesperadas no aspartato, asparagina e glutamato que foram detectadas nas F1s com redução de zeína e F1s com redução de zeína/ Cordapa F1s indicam adicionalmente a importância desses aminoácidos na intensificação da biossíntese de lisina. Exemplo 2

Esse exemplo não-limitativo descreve um constructo de DNA útil na introdução de seqüência para redução de zeína na planta transgênica da invenção, o uso de tal constructo é descrito de modo geral no Pedido de Patente U.S. N9 11/057.062 e incorporado por referência em sua totalidade a-qui. Mais especificamente, esse exemplo descreve o uso de um "loop" fechado de RNA orientado anti-sentido para supressão de pelo menos um gene de zeína (por exemplo, qualquer um ou mais dos genes para alfa-, beta-, gama- e delta-zeínas). O constructo de DNA recombinante para supressão de pelo menos um gene de zeína pode incluir, na ordem 5' para 3', um ele-mento promotor operavelmente ligado a um elemento de DNA orientado anti-sentido do pelo menos um gene de zeína e um elemento de DNA sentido-orientado, em que o elemento de DNA sentido-orientado é mais curto do que o elemento de DNA orientado anti-sentido e RNA sentido-orientado transcrito pelo elemento de DNA sentido-orientado é complementar à extremidade mais 5' de RNA orientado anti-sentido transcrito pelo elemento de DNA orientado anti-sentido, em que o RNA transcrito forma um "loop" de RNA orientado anti-sentido para supressão do pelo menos um gene de zeína. Em outra modalidade, a seqüência para redução de zeína pode ser introduzida na planta transgênica da invenção através de fornecimento, em células da planta transgênica, de um constructo de DNA recombinante a qual é transcrita em RNA que forma um "loop" de RNA orientado anti-sentido para supressão de pelo menos um gene de zeína. Exemplo 3

Esse exemplo descreve constructos não-limitativos úteis na obtenção de plantas de milho transgênicas da invenção. Cassetes de expressão contendo DNA heterólogos para supressão genética incrustados em um íntron são descritos em detalhes no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Ne 60/638,256 e incorporado por referência em sua totalidade aqui. Cassetes de expressão similares úteis na prática da presente invenção são evidentes para aqueles versados na técnica. Por exemplo, um vetor a-dequado útil na obtenção de uma planta transgênica da invenção inclui um cassete de expressão contendo um promotor semente-específico e líder, operavelmente ligados a um íntron de proteína de choque térmico de milho na qual é incrustada uma seqüência (tal como uma repetição invertida de DNA) para supressão de pelo menos uma enzima catabólica de lisina endó-gena (por exemplo, LKR de milho), seguido por seqüência de objetivação e seqüência que codifica um gene de síntese de lisina (por exemplo, uma AKIII de E. coliou um DHDPS de Corynebacterium) e finalmente DNA com sinal e sítio de poliadenilação. O vetor pode, adicionalmente, conter um marcador selecionável ou passível de triagem, por exemplo, um gene que codifica resistência ao herbicida glifosato.Todos os materiais e métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e usados sem experimentação indevida conforme instruído pela descrição acima. Embora os materiais e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas e exemplos i-5 lustrativos, será evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas aos materiais e métodos descritos aqui sem se desviar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos de tais substituintes e modificações similares evidentes para aqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, 10 conforme definido pelas reivindicações em anexo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> MALVAR, THOMAS <110> HUANG, SHIHSHIEH <110> LUETHY, MICHAEL

<120> DNA RECOMBINANTE PARA SUPRESSÃO DE GENE

<130> MONS:088WO

<140> DESCONHECIDA

<141> 10/03/2006

<150> 11/077.089

<151> 10/03/2005

<160> 2

<170> Patentln versão 3.2

<210> 1

<211> 8590

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Constructo de DNA recombinante em plasmídeo entre bordas de

Agrobacterium

<400> 1

<210> 2

<211> 7794

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Constructo de DNA recombinante em plasmídeo entre bordas de

Agrobacterium

<400> 2

aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagç cacagcagcc 60 cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120 gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc 180 actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 240ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 300 gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat 360 ccccatcaag cttactcgag gtcattcata tgcttgagaa gagagtcggg atagtccaaa 420 ataaaacaaa ggtaagatta cctggtcaaa. agtgaaaaca tcagttaaaa ggtggtataa 480 agtaaaatat cggtaataaa aggtggccca aagtgaaatt tactcttttc tactattata 540 aaaattgagg atgtttttgt cggtactttg atacgtcatt tttgtatgaa ttggttttta 600 agtttattcg cttttggaaa tgcatatctg tatttgagtc gggttttaag ttcgtttgct 660 tttgtaaata cagagggatt tgtataagaa atatctttag aaaaacccat atgctaattt 720 gaeataattt ttgagaaaaa tatatattca ggcgaattct cacaatgaac aataataaga 780 ttaaaatagc tttcccccgt tgcagcgcat gggtattttt tçtagtaaaa ataaaagata 840 aacttagact caaaacattt acaaaaacaa cccctaaagt tcctaaagcc caaagtgcta 900 tccacgatcc atagcaagcc cagcccaacc caacccaacc caacccaccc cagtccagcc 960 aactggacaa tagtctccac acccccccac tatcaccgtg agttgtccgc acgcaccgca 1020 cgtctcgcag ccaaaaaaaa aaagaaagaa aaaaaagaaa aagaaaaaac agcaggtggg 1080 tccgggtcgt gggggccgga aacgcgagga ggatcgcgag ccagcgacga ggccggccct 1140 ccctccgctt ccaaagaaac gccccccatc gccactatat acataccccc ccctctcctc 1200 ccatcccccc aaccctacca ccaccaccac cacçacctcc acctcctccc ccctcgctgc 1260 cggacgacga gctcctcccc cctccccctc cgccgccgcc gcgccggtaa ccaccccgcc 1320 cctctcctct ttctttctcc gttttttttt ccgtctcggt ctcgatcttt ggccttggta 1380 gtttgggtgg gcgagaggcg gcttcgtgcg cgcccagatc ggtgcgcggg aggggcggga 1440 tctcgcggct ggggctctcg ccggcgtgga tccggcccgg atctcgcggg gaatggggct 1500 ctcggatgta gatctgcgat ccgccgttgt tgggggagat gatggggggt ttaaaatttc 1560 cgccgtgcta aacaagatca ggaagagggg aaaagggcac tatggtttat atttttatat 1620 atttctgctg cttcgtcagg cttagatgtg ctagatcttt ctttcttctt tttgtgggta 1680 gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttcatgatt tgtgacaaat 1740 gcagcctcgt gcggagcttt tttgtaggta gaagtgatca accatggcgc aagttagcag 1800 aatctgcaat ggtgtgcaga acccatctct tatctccaat ctctcgaaat ccagtcaacg 1860 caaatctccc ttatcggttt ctctgaagac gcagcagcat ccacgagctt atccgatttc 1920 gtcgtcgtgg ggattgaaga agagtgggat gacgttaatt ggctctgagc ttcgtcctct 1980 taaggtcatg tcttctgttt ccacggcgtg catgcttcac ggtgcaagca gccggcccgc 2040 aaccgcccgc aaatcctctg gcctttccgg aaccgtccgc attcccggcg acaagtcgat 2100 ctcccaccgg tccttcatgt tcggcggtct cgcgagcggt gaaacgcgca tcaccggcct 2160tctggaaggc gaggacgtca tcaatacggg ccgtaaggaa ggcgacacct ggatcatcga tgaggcgccg ctcgatttcg gcaatgccgc cggggtctac gatttcgaca gcaccttcat gggccgcgtg ttgaacccgc tgcgcgaaat ccgtcttccc gttaccttgc gcgggccgaa gatggcctcc gcacaggtga agtccgccgt cacgacggtc atcgagccga tcatgacgcg tggcgccaac cttaccgtcg agacggatgc ccgcggcaag ctcaccggcc aagtcatcga cccgctggtt gcggccctgc ttgttccggg gaaccccacc cgcaccggcc tcatcctgac catcaacccg cgccttgccg gcggcgaaga gctgaagggc gtcacggtgc cggaagaccg tctcgctgtc gccgccgcct tcgcggaagg ccgcgtcaag gaaagcgacc gcctctcggc ggattgcgat gagggcgaga cgtcgctcgt cggcaacgcc tcgggcgccg ccgtcgccac cctcgtcatg ggcctcgtgt cggaaaaccc cacgagcttc ccggagttca tggacctgat cgatacgaag gctgcctgat gagctcgaat tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta tatgattaga gtcccgcaat tatacattta aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc ccactagtga tatccgtcga ctggtaccta agcggccgct tcgagtggct gcaggtcgat ataaaatgca ttaaaaaata ttttcatact tataaagcaa tgattagaat ctgacaagga aaatgtctaa aacacaagag gacatacttg ctgaaaatat atttgttgcc tagtgaataa cctcatatta acttcggtca ttagaggcca

caaggccatg caggcgatgg gcgcccgcat 2220 tggcgtcggc aatggcggcc tcctggcgcc 2280 cacgggctgc cgcctgacga tgggcctcgt 2340 cggcgacgcc tcgctcacaa agcgcccgat 2400 gggcgtgcag gtgaaatcgg aagacggtga 2460 gacgccgacg ccgatcacct accgcgtgcc 2520 gctgctcgcc ggcctcaaca cgcccggcat 258Ó cgatcatacg gaáaagatgc tgcagggctt 2640 ggacggcgtg cgcaccatcc gcctggaagg 2700 cgtgccgggc gacccgtcct cgacggcctt 2760 ctccgacgtc accatcctca acgtgctgat 2820 gctgcaggaa atgggcgccg acatcgaagt 2880 cgtggcggac ctgcgcgttc gctcctccac 2940 cgcgccttcg atgatcgacg aatatccgat 3000 ggcgaccgtg atgaacggtc tggaagaact 306Ó cgtcgccaat ggcctcaagc tcaatggcgt 3120 cgtgcgtggc cgccctgacg gcaaggggct 3180 ccatctcgat caccgcatcg ccatgagctt 3240 tgtcacggtg gacgatgcca cgatgatcgc 3300 ggccgggctg ggcgcgaaga tcgaactctc 3360 tcccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 3420 tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa 3480 atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 3540 atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 3600 atctatgtta ctagatcggg gatgggggat 3660 cgcgtagcta gcccgggcgc gccttaatta 3720 tgatgcatgt tgtcaatcaa ttggcaagtc 3780 caactacaaa tccatgagta taactataat 3840 ttctggaaaa ttacataaag gaaagttcat 3900 tattcagtaa catttgcagc ttttctaggt 3960 gcataatggt acaactacaa gtgttttact 4020 cgatttgaca catttttact caaaacaaaa 4080tgtttgcata tctcttataa tttcaaattc aatattaatt tgagaatgaa caaaaggacc tccatttcac agttcgatag cgaaaaccga aaatggtaca agaaaaacag ttttcccaat gtgtgtgcgc aatgaaactg atgcattgaa gaacgaaagc tgaattccta gctggctgaa aggagagttc aatgctgtca gttggttgaa tagctggctg aatggtagtt gttgttgttg ttggttgaat ggaagâaact gctgttgctg ttgttgtagt tgttgtgccc tgatgttttg taatagggct gatgattgtt ggaggaacaa tgcctgttat gcataaagat ggcacctcca aaagagaact ggttgtatgg çagcaattgt gggttagcca ctgccaatgg attaagtaac tttgacacag ccagttggtt gaatggaagc acagctagct gagtcagagc tggtacaatt ggtgggcccg ctaccaagat attagccctc acaaatgcgt tcattattcc acagtgctca ctcccaccag ttacttcaat gggcttcgaa ctagcgcttg cggcgagcgc cttacaacaa gcacatctaa ccctacaaac cattgcaacg ctgagccacc tagccgtggt gaaccctgtc aacccacttg ctctggcgaa cgtagctgca atgccagtgc tcagtcaact agccatggtg tctagcccgc tcgcggtggg caatgcacct attgtaccag ctctgactca gctagctgtg cttccattca accaactggc tgtgtcaaac ttacttaatc cattggcagt ggctaaccca caattgctgc catacaacca gttctctttg ggaggtgcca tctttaccgg taacaggcaa tgttcctcca acaatcatca gccctattac aaaacatcag ggcacaacaa ctacaacaac

aacacacaac aaataagaga aaaaacaaat 4140 atatcattca ttaactcttc tccatccatt 4200 ataaaaaaca cagtaaatta caagcacaac 4260 gccataatac tcaaactcag taggattctg 4320 cttgacgaac gttgtcgaaa ccgatgatac 4380 tggtagtagt tgttgctgct gtaaataagc 4440 tggaagaaat tgctgggggt aggcagcaga 4500 caaataagaa gcagagttca atgcagctag 4560 agagtaggca gcaaggtttg ctagcacaag 4620 tgccaataaa tgcaccaaag gtaactgctg 4680 gggtgataaa ggtaagatgc cagctgcgat 4740 acgafcgggtt gctgcaaggc agggttcatc 4800 tgttgctgct gcaggaaggt agcgaccaat 4860 tgttgtcgct gttgtaggta cgcagcagag 4920 aactgttgta agtaggcagc agggtttgcc 4980 tgttgcagca actgttgttg taggtacgta 5040 cttgcgcttc ttgccctttt agtgagcgca 5100 cttgctccta gtgccagtat tccacagttc 5160 catccagccg tgcaagccta caggctacaa 5220 ccaattgccc aattgcaaca acaatccttg 5280 caacaacaac aacaacagtt tctgccatca 5340 acctacttgc aacagcagct gcttgcatcc 5400 taccagcaac aacaacagct gcaacagttt 5460 aaccctgccg tctacctaca actactttca 5520 acgtacctac aacaacagtt gctgcaacaa 5580 gcaaaccctg ctgcctactt acaacagttg 5640 tctgctgcgt acctacaaca gcgacaacag 5700 ttggtcgcta ccttcctgca gcagcaacaa 5760 atgaaccctg ccttgcagca acccatcgtt 5820 tcgcagctgg catcttacct ttatcaccct 5880 agcagttacc tttggtgcat ttattggcac 5940 ttgtgctagc aaaccttgct gcctactctc 6000agcaacaaca gtttcttcca ttcaaccaac aacaacaaca actaccattc agccagctat tcaaccaact gacagctttg aactctcctg tcagccagct agggatccgg taccgggttc gtctgaagac ccagtggtgg tgatggagaa tttgattaat taacacaatt tcttgtgttc catggtttct tgccaaatgt atatgactcg catctggaat cattctgtac ttctgcgtgg atctacgtaa aacgaattag atttagcttg ctttacacgt caaggatttt tgtcctgtcc tgtaatgcaa tatgagttgt ttgtaatgtc gtatgatctc ggcatgactc accgtgtttc ttcttaccca atacccttga cgtgcaattt caacaaattc ttggagcttt acatgccaát aggacttata cggttgcacc tggatgatcg tattcaattt tgactaggaa gagatttaat gcgaacaagt tttttatttg gataccctct tgcactagtt atatgcccgt gcattgctac tatatatata tgatatatga taaattttgt ggttgtgtga atatggagcc aacaaccaat attttgtaca taaactctct tattatagta attataaaga aatgtaggag ttttttaata ttgttaacgc ggccgcatcg atcgtgaagt tgtagacacg tcgaaataaa gatttccgaa taaatacgac ggatcgtaat ttgtcgtttt ctgcggacat ctacattttt gaattgaaaa atattgacca tcatactcat tgctgatcca aattgaatat atcctgccgc cgctgccgct ctacgcagaa ctgagccggt taggcagata ttccccccaa cacggtgagc gacggggcaa

tagctgcatt gaactctgct tcttatttgc 6060 ctgctgccta cccccagcaa tttcttccat 6120 cttatttaca gcagcaacaa ctactaccat 6180 ttctgcgctc tggagtagat aaagctaatg 6240 gtgcacaggc atgcgagcgt tatttatagc 6300 ttatgccacc gagacggctg taggcagctt 6360 tcactctctt tacgtagcac gtcgatggtt 6420 ctcagttttg ttgccttcta caggttgttg 6480 acatatggct ttttttttgt tgtaaattta 6540 ggcctatttt atttttcatg aaacgatctt 6600 ttgtgagctg taagcatgta tatcagatga 6660 tttgcacaca gagaggattt gtttgattgt 6720 tggttgatgt tctgtgagtt gttaaggata 6780 gcatggttgt ttcgtgttcc tcaccacttt 6840 aaggggattg ggagagatta aatctccttc 690Ò cgtttccaac ccctttcgat ccagaçgtaa 6960 tattcatctt aatacacaca tgtattaagt 7020 ggtttatata tatatatata tatatgtata 7080 tttaataaaa catatgtttt ctattgatta 7140 atccagaaca cttatacata atttcacctt 7200 gtagagaaga gattataaga gtgcgggttg 7260 atattgacgc gggacaagct tactagtagc 7320 ttctcatcta agcccccatt tggacgtgaa 7380 ttagaataat ttgtttattg ctttcgccta 7440 atcaaaatgt actttcattt tataataacg 7500 aaaattggta attactcttt ctttttctcc 7560 tgtagatttc ccggacatga agccatttac 7620 ttgcacccgg tggagcttgc atgttggttt 7680 atttccattg agaactgagc catgtgcacc 7740 cggagtgatc cacatgggac tttt 7794

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Planta de milho transgênico tendo em seu genoma DNA transgênico compreendendo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de usina, pelo que expressão do referido DNA transgênico resulta em um teor de lisina sinergisticamente aumentado de semente da referida planta de milho transgênico.

2. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida seqüência para redução de zeína compreende seqüência para supressão de gene de pelo menos um gene de síntese de zeína.

3. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida seqüência para biossíntese de lisina compreende um gene de síntese de lisina exógeno.

4. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 3, em que o referido gene de síntese de lisina exógeno compreende um gene que codifica uma enzima sintética de lisina substancialmente insensível a retroalimentação.

5. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida seqüência para biossíntese de lisina compreende uma seqüência para supressão de gene de uma enzima catabólica de lisina en-dógena à referida planta de milho transgênico.

6. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida seqüência para biossíntese de lisina compreende um gene de síntese de lisina exógeno e uma seqüência para supressão de gene de uma enzima catabólica de lisina endógena à referida planta de milho transgênico.

7. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 6, em que o referido gene de síntese de lisina exógeno compreende um gene que codifica uma enzima sintética de lisina substancialmente insensível a feedback.

8. Planta de milho transgênico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida planta de milho transgênico compreende uma planta de milho transgênico de prole de cruzamento genético de uma primeira plantade milho transgênico precursora tendo em seu genoma DNA transgênico compreendendo uma seqüência para redução de zeína e uma segunda planta de milho transgênico precursora tendo em seu genoma DNA transgênico compreendendo uma seqüência para biossíntese de lisina, em que a referida 5 planta de milho transgênico de prole do referido cruzamento genético tem em seu genoma a referida seqüência para redução de zeína e a referida seqüência para biossíntese de lisina.

9. Método para proporcionar semente de milho com teor de lisina sinergisticamente aumentado compreendendo:10 (a) fornecimento de uma planta de milho transgênico tendo emseu genoma DNA transgênico compreendendo seqüência para redução de zeína e seqüência para biossíntese de lisina,(b) expressão do referido DNA transgênico em semente da referida planta de milho transgênico, a referida expressão resultando em um teor de lisina sinergisticamente aumentado da referida semente e(c) colheita da referida semente com teor de lisina sinergisticamente aumentado.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida seqüência para redução de zeína compreende seqüência para supressão de gene de pelo menos um gene de síntese de zeína.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida seqüência para biossíntese de lisina compreende um gene de síntese de lisina exógeno.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o referido *25 gene de síntese de lisina exógeno compreende um gene que codifica umaenzima sintética de lisina substancialmente insensível a feedback.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida seqüência para biossíntese de lisina compreende uma seqüência para supressão de gene de uma enzima catabólica de lisina endógena à referida planta de milho transgênico.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida seqüência para biossíntese de lisina compreende um gene de síntese delisina exógeno e uma seqüência para supressão de gene de uma enzima catabólica de lisina endógena à referida planta de milho transgenico.

15, Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido gene de síntese de lisina exógeno compreende um gene que codifica uma enzima sintética de lisina substancialmente insensível a feedback.

16. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido fornecimento compreende cruzamento genético de uma primeira planta de milho transgenico precursora tendo em seu genoma DNA transgenico compreendendo uma seqüência para redução de zeína e uma segunda planta de10 milho transgenico precursora tendo em seu genoma DNA transgenico compreendendo uma seqüência para biossíntese de lisina, em que o referido cruzamento genético resulta em uma planta de milho transgenico de prole tendo em seu genoma a referida seqüência para redução de zeína e a referida seqüência para biossíntese de lisina.