JP2008532525A - リジン含量が相乗的に増強されたトウモロコシ種子 - Google Patents
リジン含量が相乗的に増強されたトウモロコシ種子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008532525A JP2008532525A JP2008501019A JP2008501019A JP2008532525A JP 2008532525 A JP2008532525 A JP 2008532525A JP 2008501019 A JP2008501019 A JP 2008501019A JP 2008501019 A JP2008501019 A JP 2008501019A JP 2008532525 A JP2008532525 A JP 2008532525A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysine
- sequence
- zein
- corn plant
- transgenic corn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 211
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 title claims abstract description 211
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims abstract description 48
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims abstract description 44
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 135
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 claims abstract description 107
- 239000005019 zein Substances 0.000 claims abstract description 106
- 229940093612 zein Drugs 0.000 claims abstract description 106
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 claims abstract description 87
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 102
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 61
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 32
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 178
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 175
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 108
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 62
- 102000002774 saccharopine dehydrogenase Human genes 0.000 description 35
- 108020000318 saccharopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 35
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 22
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 18
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 17
- ZDGJAHTZVHVLOT-YUMQZZPRSA-N L-saccharopine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCN[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ZDGJAHTZVHVLOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 13
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 11
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 11
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 11
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZDGJAHTZVHVLOT-UHFFFAOYSA-N L-Saccharopine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(C(O)=O)CCC(O)=O ZDGJAHTZVHVLOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 7
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 6
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 5
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000020985 whole grains Nutrition 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 101150091511 glb-1 gene Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 4
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N hexane Substances CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VEASIOSTNPNFHD-YFKPBYRVSA-N (2s)-6-amino-2-hydrazinylhexanoic acid Chemical class NCCCC[C@H](NN)C(O)=O VEASIOSTNPNFHD-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101000779367 Escherichia coli (strain K12) Lysine-sensitive aspartokinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXWFZIRWWNPPOV-UHFFFAOYSA-N 2-aminobenzaldehyde Chemical compound NC1=CC=CC=C1C=O FXWFZIRWWNPPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 101710186901 Globulin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HOSWPDPVFBCLSY-VKHMYHEASA-N L-aspartic 4-semialdehyde Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CC=O HOSWPDPVFBCLSY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N Norphytane Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 101710089395 Oleosin Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007456 Peroxiredoxin Human genes 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101150098704 SDH gene Proteins 0.000 description 1
- 101100214703 Salmonella sp aacC4 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241001185310 Symbiotes <prokaryote> Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 101150008094 per1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108030002458 peroxiredoxin Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000035903 transrepression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
- C12N15/8254—Tryptophan or lysine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
アミノ酸、特に、リジンのレベル上昇を有するトランスジェニックトウモロコシのための種子、遺伝子抑制用の組換えDNA構築体、かかる構築体を作成および使用する方法、ならびにかかる構築体を発現する、植物を含めた形質変換体が本明細書に開示される。
(a)ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有するトランスジェニックトウモロコシ植物を提供し、
(b)そのトランスジェニックトウモロコシ植物の種子中でその遺伝子組換えDNAを発現させ、ここに、その発現がその種子のリジン含量を相乗的に増加させ、
(c)相乗的に増加したリジン含量を持つその種子を収穫する
ことを含む相乗的に増加したリジン含量を持つトウモロコシ種子を提供する方法を提供する。
図1aは、第1のトランスジェニックトウモロコシ植物に実質的に類似する遺伝子型を有するが、ゼイン低下用配列を欠く野生型のトウモロコシ系統90DJD28/91INH2.0002と比較して、19-キロダルトンアルファ-ゼインにおける低下を示すゼイン低下用配列をそのゲノムに有する第1の親トランスジェニックトウモロコシPQ015/PQ15.0001およびPQ071/PQ71.0014からの種子のマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量スペクトル分析を示す。実施例1参照。X軸は、m/z(質量−対−電荷)比を示す。Y軸は、パーセント強度を示す。質量スペクトルは、標準蛋白質ピーク[CA+H]+ (炭酸脱水酵素)、約29,000m/zにより正規化された。[CA+H]2+と15-キロダルトンのベータゼインとの間のその15,615ダルトンのピークは、炭酸脱水酵素からの夾雑物であると考えられた。図1bは、野生型トウモロコシ系統90DJD28/91INH2および90DJD28/91INH2.0002と比較した第1の親トランスジェニックトウモロコシPQ015/PQ15.0001およびPQ071/PQ71.0014の合計リジン含量を示す。Q015/PQ15、PQ071/PQ71および90DJD28/91INH2の合計リジン含量に関するその誤差バーは、信頼区間(アルファ=0.05、n=20)を表す。
特記されない限りは、本明細書に用いた技術的および科学的な全ての用語は本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。一般的に、本明細書に用いた命名法および後記の製造または実験の手順はよく知られ、当該技術分野に一般的に使用される。当該技術分野および種々の一般的な参考文献において提供されるもののごとき従来の方法は、これらの手順のために使用される。また、用語が単数で提供される場合、発明者らは複数のその用語により記載された本発明の態様を考える。本明細書に用いた命名法および後記の実験手順は当該技術分野においてよく知られ、一般的に使用されるものである。引用により本願の一部とみなされる参考文献に用いた用語および定義に矛盾がある場合、本願に用いた用語は本明細書に与えた定義を有するものとする。本明細書に用いた他の技術用語は、種々の技術的な辞書によって例示されるような、それらを用いる技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。発明者らは作用の機序または様式に限定することを意図するものではない。それらへの参照は、例示の目的だけに提供される。
本発明は、ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有し、それにより該遺伝子組換えDNAの発現が、トランスジェニックトウモロコシ植物の種子のリジン含量を相乗的に増加させることを特徴とするトランスジェニックトウモロコシ植物を提供する。
本発明は、
(a)ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有するトランスジェニックトウモロコシ植物を提供し、
(b)そのトランスジェニックトウモロコシ植物の種子中で該遺伝子組換えDNAを発現させ、ここに、その発現が該種子のリジン含量を相乗的に増加させ、次いで
(c)相乗的に増加したリジン含量を持つ種子を収穫する
ことを含む、相乗的に増加したリジン含量を持つトウモロコシ種子を提供する方法を開示および特許請求する。
この非限定の実施例は、相乗的に増加したリジン含量を持つトウモロコシ種子を提供する本発明方法を示し、さらに、ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有し、それによりその遺伝子組換えDNAの発現が、トランスジェニックトウモロコシ植物の種子のリジン含量を相乗的に増加させる本発明のトランスジェニックトウモロコシ植物を示す。より詳細には、この実施例は、第1の親トランスジェニックトウモロコシ植物(ゼイン低下系統PQ15およびPQ71、それらはゼイン低下用配列をそれらのゲノムに有し、ゼイン蓄積における低下を示す)および第2の親トランスジェニックトランスジェニック植物(高リジン系統M27908+、それはリジン生合成用配列をそのゲノムに有し、外来性cordapA遺伝子の発現によって引き起こされた遊離リジンの上昇を示す)の遺伝交配を記載する。これらの遺伝交配は、相乗的に増加したリジン含量を、本発明の典型的なトランスジェニックトウモロコシ植物からのトウモロコシ種子において得ることができることを示した。
ゼイン低下系統
ゼインを低下させるように設計されたベクターを構築し、Huangら (2004) J. Agric. Food Chem., 52:1958-1964(ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす)により詳細に記載された形質転換のために用いた。略言すると、(アンチセンス配向における)トウモロコシ19-キロダルトンアルファゼイン遺伝子のヌクレオチド 965−868、Z4(GenBank受入番号V01472)を含むDNAフラグメントをPCRにより単離した。このゼイン遺伝子コード領域フラグメントをアンチセンス配向にて、高mRNA合成を駆動するためのガンマ−ゼインAプロモーター(GenBank受入番号S78780を持つその配列のヌクレオチド19−1118に対応する)、およびポリアデニル化配列を提供するためのAgrobacterium tumefaciens ノパリン合成酵素遺伝子3’非翻訳領域も含有した発現カセットに挿入した。これらの発現カセットを微粒子銃によって未成熟トウモロコシ胚へ導入した。
2成分のプラスミドを、cordapA、Corynebacterium glutamicum からリジン非感受性のジヒドロジピコリン酸合成酵素(DHDPS)を発現するように設計した (ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,773,691号参照)。これらの2成分のプラスミドの構築および使用は、Huangら (2004) Transgenic Res., 13:451-461(ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす)によって詳細に記載されている。略言すると、その2成分のプラスミドは、トウモロコシglb1プロモーター、コメアクチンイントロン、トウモロコシDHDPSリーダーペプチドを持つcordapAコード領域、およびトウモロコシglb1ターミネーターを含む発現カセットの側面に位置する左右のT-DNA境界領域を含んでいた。この発現カセットはcordapAの胚に特異的な発現のために設計されている。また、2成分のプラスミドは、グリホサート耐性を与える選択マーカー、epsps-cp4(Agrobacterium tumefaciens株CP4からの5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素)を含んでいた。通常、選択マーカー(epsps-cp4)は典型的には注目する遺伝子に隣接して配置され、cordapA発現カセットおよびepsps-cp4選択マーカーの双方が、形質転換した場合、植物細胞に共に組み込まれるのを可能とし、かくして、グリホサート下の選択によりcordapA導入遺伝子を含む植物の回収を増強する。あるいは、epsps-cp4マーカーが、(1)T-DNA領域内でおよび注目する遺伝子cordapAに隣接するよりむしろ、通常考えられたベクターの「骨格」内に配置される(ベクターpMON65178およびpMON65179)、または(2)もう一つの組の左右のT-DNA境界領域間に位置した(ベクターpMON65180)のいずれかの代替的な2成分のベクターを構築した。
第1の親トランスジェニックトウモロコシ植物(ゼイン低下系統PQ15およびPQ71、それらはゼイン低下用配列をそれらのゲノムに有する)、ならびに第2の親トランスジェニックトウモロコシ植物(高リジン系統M27908+、それはリジン生合成用配列をそのゲノムに有する)を用いて遺伝交配を行った。圃場において、ゼイン低下系統、PQ15、PQ71およびそれらの野生型対照90DJD28/91INH2を雌として用いて、高リジン系統M27908+およびその野生型対照M27908で受粉した。表1は、収穫および分析された穂の得られた6つの異なるF1遺伝子型、それらの表示および数をリストする。同族のトランスジェニック親の交配に起因した全てのトランスジェニック穀粒はヘミ接合性であった。各交配からの2つの別個の試験区画からの20を超えるF1穂を収穫および分析し;穂当たり約150〜約400個の穀粒を持つ穂だけを分析のために選択した。
穀粒の細断
穀粒の細断を促進するために、成熟した乾燥穀粒を水に沈め、摂氏4度で一晩保存した。1穂当たり50個の穀粒を細断し、凍結乾燥して、水を除去した。分離した胚および内乳の乾燥重量を記録後に、試料を粉末に粉砕した。水吸収は、以下のアミノ酸および近接する分析にかなりには影響しないことが判明した。
乾燥した胚および内乳の粉末を摂氏55〜55℃、3〜10分間にて、数回の1:3の比の組織−対−ヘキサンで抽出した。ヘキサン抽出後に、その粉末を凍結乾燥し、摂氏4〜6度にて保存した。CordapAおよび天然のDHDPSを20ミリモラーのトリス-HCl、pH 8.0、100ミリモラーのKClおよび10ミリモラーのピルビン酸ナトリウムで抽出した。1:5の比率の組織−対−CordapA抽出緩衝液を用い、摂氏4度にて1時間振盪した。抽出物を14,000×gで5分間微量遠心した。(ここに出典明示して本明細書の一部とみなすFrischら (1991) Plant Physiol., 96:444-452から採用した)アッセイについては、抽出物上清をさらに抽出緩衝液中で6倍に希釈した。希釈した抽出物の20マイクロリットルをマイクロプレートのウェルに加えた。反応を開始するために、200ミリモラーのトリス-HCl、pH 8.0、16ミリモラーのピルビン酸ナトリウム、1ミリモラーのASA(L-アスパラギン酸ベータ−セミアルデヒド水和物トリフルオロ酢酸塩)、およびプラスまたはマイナスの1ミリモラーのリジン一塩酸塩を含む反応緩衝液の180マイクロリットルを加えた。ASAはGateway Chemical Technology, St. Louisから得、4規定のHClに溶解して、140ミリモラーのストック溶液を得た。使用前に、140ミリモラーのASAストックを140ミリモラーのASAストックの100マイクロリットルを1モラーのトリス-HCl、pH 8.0の100マイクロリットルおよびに1規定のNaOHの800マイクロリットルに加えることにより、14ミリモラーに希釈した。反応は摂氏37度にて1時間進行させ、次いで終点比色定量試薬の100マイクロリットルの添加によって停止した。この試薬は、0.3ミリリットルのエタノールに20ミリグラムのオルト−アミノベンズアルデヒドを溶解し、次いで、11.7ミリリットルの0.22モラーのクエン酸塩-0.55モラーのリン酸緩衝液pH 5.5に添加することにより調製した。色は室温にて10分間進展させ、吸光度をSpectraMax Plusマイクロプレートリーダ(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で520ナノメーターにて読み取った。
20ミリグラムの粉砕した内乳または胚を摂氏65度にて1.5時間、200マイクロリットルのSDSホウ酸塩緩衝液(60ミリモラーのNa2B4O7・10 H2O pH 10、4% SDS、1.5ミリグラム/ミリリットルのジチオスレイトール)中でインキュベートした。試料を14000rpmにて5分間回転させ、60マイクロリットルの上清を30マイクロリットルの3X SDS-PAGE添加液(Bio-Rad, Hercules, CA)を含む96-ウェルPCRプレートに移した。試料プレートを摂氏98度にて10分間加熱し、次いで冷却し、添加まで摂氏4度にて保存した。24ウェルのプレキャストSDS-PAGE(4-20%)ゲル(Bio-Rad)に、精製された組み換えCordapAおよび参照のための予め染色されたMW標準(Bio-Rad)と共に13マイクロリットルの各試料を負荷した。色素の先端がゲルの底に達するまで、ゲルを一定の電圧(90ボルト)で泳動し;次いで、ゲルをPVDF膜(Bio-Rad)に移した。ヤギ抗CordapA抗体をE. coliを発現した組換えCordapAに対してヤギを免疫にすることにより生成した。ウサギ抗ヤギIgGアルカリフォスファターゼコンジュゲートを含むImmun-Blot Assay Kit(Bio-Rad)を、製造者のプロトコールに従い検出のために用いた。
100ミリグラムの乾燥した細断した胚または内乳粉末を分析した。2.5ミリリットルの冷たい抽出緩衝液(50ミリモラーのNa2B4O7・10 H2O 、0.75モラーのKCl、0.2%v/v Tween20、36ミリモラーのNaOHおよび10ミリモラーのL-アスコルビン酸)を添加した後、試料を摂氏4度にて30分間激しくボルテックスした。抽出物をろ過し、試料のアリコートを摂氏-20度にて保存した。一連の希釈(1/10、1/100、1/1000、1/5000)を行い、分析のために用いた。100マイクロリットルの希釈した一次抗体(2.4マイクログラム/ミリリットル)をNunc Immunoプレート(VWR, West Chester, PA)の各ウェルに添加し、摂氏4度にてインキュベートした。プレートをPBST(137ミリモラーのNaCl、8.1ミリモラーのNa2HPO4・7H2O、1.5ミリモラーのKH2PO4、2.7ミリモラーのKClおよび0.05%v/v Tween20)で3回洗浄し、0.1%乾燥ミルクを含む100マイクロリットルのTBA(100ミリモラーのトリス、100ミリモラーのNa2B4O7・10H2O pH 7.8、5M MgCl2、0.05%v/v Tween20および0.2%(v/v)L-アスコルビン酸)と摂氏37度にて1時間インキュベートして、非特異的な蛋白質吸着をブロックし、次いで、PBSTで再び3回洗浄した。TBA中の連続する希釈のCordapA蛋白質を標準とした(1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05ナノグラム/ミリリットル)。100マイクロリットルの各標準および試料希釈物をプレート上に三連にて負荷し、摂氏37度にて1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄後に、ビオチン標識したヤギ抗CordapA一次抗体のTBA中の1:10000希釈の100マイクロリットルを各ウェルに添加し、プレートを摂氏37度にて1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄後、1:10000希釈のNeutravidin-HRP標識マウス抗ヤギIgG(KPL Inc., Gaithersburg, MD)での第2のインキュベーションを加えた。PBSTで3回洗浄後に、100マイクロリットルのTMB基質/H2O2(1:1)(VWR)での10分間のインキュベートに続いて、反応を100マイクロリットルの6モラーのH3PO4の添加により停止した。SpectraMax Plusマイクロプレートリーダ(Molecular Devices)を用いて吸光度を450ナノメーターにて読み取った。
個々の穀粒を粉砕し、40ミリグラムの穀粒粉末−対−1ミリリットルの緩衝液の比率にて、エタノール緩衝液(70%エタノール、25ミリモラーの水酸化アンモニウムおよび10ミリモラーのジチオスレイトール)で抽出した。試料を周期的に振盪させつつ、摂氏60度の水浴中で1時間インキュベートし、1000rpmにて15分間遠心した。次いで、1マイクロリットルの各試料をApplied Biosystems (Framingham, MA) SymBiotTM Iロボットを用いて8マイクロリットルのマトリックス(0.3%トリフルオロ酢酸を含む70%アセトニトリル中の10.4ミリグラム/ミリリットルの2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)-安息香酸(HABA))と混合した。この混合物からの0.6マイクロリットルを、384-ポジションMALDI標的プレート(Applied Biosystems)上に置いた。炭酸脱水酵素(Sigma, St. Louis, MO)を内部標準としてマトリックス混合物(1ミリモラー)中に含ませ、スペクトルを標準化した。マトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)を337ナノメーターの窒素レーザーを備えたApplied Biosystems Voyager-DETM PRO BiospectrometryTM Workstationを用いて行った。ゼイン蛋白質を分析するためのMALDI-TOF MS法の詳細な記載は、Adamsら (2004) J. Agric. Food Chem., 52:1842-1849(ここに出典明示して本明細書の一部とみなす)により公表されている。
全体の穀粒または細断した胚および内乳のプールからの粉砕されたミール試料(50ミリグラム)を摂氏4度にて一晩5%TCAで抽出した。抽出物をろ過し、必要ならば希釈し、OPA法により遊離アミノ酸を分析した。その方法は、オルト−フタルジアルデヒドを用いて、試料を誘導体化した後、C18の逆相HPLCカラム(Zorbax Eclipse-AAA, XDB C-18, 4.6ミリメートル×75ミリメートル, 3.5マイクロメートル, Agilent Technologies, Palo Alto, CA)に続いて、ガードカラム(Zorbax Eclipse-AAA, 4.6ミリメートル×12.5ミリメートル, 5マイクロメートル, Agilent Technologies, Palo Alto, CA)に注入する。発明者らは、蛍光検出器を装備したAgilent HPLC(モデル1100)を用いた。合計のアミノ酸分析については、蛋白質加水分解をOPA誘導に先立って行った。試料(60ミリグラム)をアルゴン下で摂氏110度にて24時間、10ミリリットルの6規定のHClおよび10マイクロリットルのフェノールで加水分解した。アリコートを乾燥させ、OPA誘導および引き続いてのHPLC分析ために0.1規定のHClに再溶解した。リジン測定をLC-MS/MSにより繰り返した。また、リジン代謝物質、アルファ-アミノアジピン酸デルタセミアルデヒド(「AAA」)およびサッカロピン(「Sac」)を測定した。
表2における各穂からの大きくなった(bulked)穀粒の近似の含量をInfratec 1221 Grain Analyzer (Foss, Eden Prairie, MN)を用いて(ここに出典明示して本明細書の一部とみなすDyerおよびFeng (1997) Feedstuffs, 69:16-25に記載された)近赤外線透過(NIT)分析により決定した。表2に示した細断した胚および内乳の合計の蛋白質含量をFP-528 Protein/Nitrogen Determinator (LECO, St. Joseph, MI) に続いて、AOCS (American Oil Chemical Society)オフィシャル法 Ba 4f-00で決定した。
Goncalves-Butruile ら (1996) Plant Physiol., 110:765-771, Gaziolaら (1999) J. Agric. Food Chem., 47:1268-1275,および Kemperら (1998) Eur. J. Biochem., 253:720-729(それらの全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす)からのこの抽出物調製手順を採用し、修飾した。注目する生殖質の新鮮な凍結し粉砕されたトウモロコシ穀粒(300-600ミリグラム)を、150マイクロリットル(乾燥容量)のポリビニルピロリドンと予め混合したLysing matrix E (Q-Biogen, Irvine, CA)を含む2ミリリットルチューブに入れた。625マイクロリットルの体積の抽出緩衝液(50ミリモラーのKH2PO4:K2HPO4 pH 7.4、125ミリモラーのNaCl、2.0ミリモラーのMgCl2、1.0ミリモラーのEDTA、250マイクロモラーのCaCl2、10%グリセロール、CHAPS 0.1%、8ミリモラーのNaF、4ミリモラーのDTT、および1つの完全なプロテアーゼタブレット(Roche, Indianapolis, IN)を粉砕した穀粒およびマトリックスの頂部に添加した。試料をFast Prep machine (Q-Biogen)を用いてホモジナイズした。ホモジネートを時々混合/振盪しつつ、15-20分間氷上に置いた後、14,000×gにて15分間遠心した。上清(550〜625マイクロリットル)を密集した残渣から取り出し、個別のチューブに入れた。この試料を7.5および15%にて、PEG沈降反応(水中のPEG 8000 50%w/v)により分画した。15%ペレット(LKRおよびSDH活性を含んだ)を新たな抽出緩衝液(150-300マイクロリットル)に再懸濁し、LKRおよびSDH活性を分析した。全ての手順は(室温でのホモジナイゼーションを除いて)摂氏4度にてまたは氷上で行った。
質量スペクトルゼイン分析
F1交配の親がそれらの各導入遺伝子につきホモ接合性であったので、F1穀粒は双方の組換え遺伝子座に一様にホモ接合性であった。F1生成における組換え遺伝子座の発現を保証するために、個々の穀粒のゼイン組成をMALDI-TOF質量スペクトル分析によって検討した。各交配からのF1穀粒についてのその代表的なスペクトルは、それらを起源とするゼイン低下系統に類似することが判明した(図3)。加えて、複数のF1を含む全てのCordapAは、CordapAの胚に特異的な発現を保持した(図4)。CordapA 導入遺伝子の存在がこれらの複数のF1におけるゼインプロフィールを変化させなかったが、その発現はゼイン低下の複数のF1において顕著に高かった。
表2は、トランスジェニックおよび野生型の穂により生成された、近赤外線透過(NIT)近似分析および大きくなった穀粒サイズの結果を与える。示したデータは、平均プラスまたはマイナスの信頼区間を意味する(アルファ=0.05)。サイズはグラム単位で100-穀粒重量にて測定した。合計の蛋白質重量は、グラム単位での100-穀粒の合計の蛋白質重量として示され、蛋白質含量に100-穀粒サイズを掛けることにより計算した。PQ15/CordapAおよびPQ15、PQ71/CordapAおよびPQ71、ならびにCordapAおよび対照の間で観察された比較的に小さな差は、CordapAが穀粒の近似の組成におけるいずれのかなりの変化にも寄与しないことを示唆した。他方、穀粒の近似の組成におけるゼイン低下の衝撃は検出できる。また、ゼイン蛋白質の最も劇的な低下を有するように見えたPQ15/CordapAおよびPQ15材料は、より低い蛋白質含量、より低い種子密度およびより小さな種子サイズを有するように見えた。100の穀粒当たりの蛋白質重量が計算した場合、PQ15/CordapAおよびPQ15は、それらの非ゼイン低下相当物、CordapAおよび対照と比較して、平均25%の低下を有した。PQ71/CordapAおよびPQ71材料のわずかに高い蛋白質含量は、それらのわずかに小さなサイズによって相殺され、100の穀粒当たりのそれらの蛋白質重量はCordapAおよび対照のものと区別できなかった。PQ15/CordapAおよびPQ15種子の油含量は、他のものより著しく高かった(先の生成についての観察と一致する)が、これは、他のゼイン低下系統PQ71が通常の油含量を有したので、ゼイン低下によって引き起こされたかは不明瞭であった。
全体穀粒の遊離アミノ酸分析の結果を表3に示し、そのデータは、100万分の1(ppm)で、2試験区画の平均±標準偏差として示した。また、LC-MS/MSにより測定したリジンおよびその代謝物質、アルファ-アミノアジピンデルタセミアルデヒド(AAA)およびサッカロピン(Sac)のレベルを与える。
全体穀粒の合計遊離アミノ酸分析の結果を表4に示し、そのデータは、100万分の1(ppm)で、2試験区画の平均±標準偏差として示した。アスパラギンおよびアスパラギン酸塩を組み合わせ(「Asx」);グルタミンおよびグルタミン酸塩を組み合わせている(「Glx」)。
細断した胚および内乳についての遊離アミノ酸分析の結果を表5に示し、そのデータは、100万分の1(ppm)で、2試験区画の平均±標準偏差として示した。試料は、試験区画から収穫した各穂からの等量の粉砕したミルによりプールした。また、LC-MS/MSにより測定したリジンおよびその代謝物質、アルファ-アミノアジピンデルタセミアルデヒド(AAA)およびサッカロピン(Sac)のレベルを与えた。
全体穀粒の合計遊離アミノ酸分析の結果を表6に示し、そのデータは、100万分の1(ppm)で、2試験区画の平均±標準偏差として示した。アスパラギンおよびアスパラギン酸塩を組み合わせ(「Asx」);グルタミンおよびグルタミン酸塩を組み合わせている(「Glx」)。
細断した胚および内乳についての蛋白質含量および乾燥重量分析結果を表7に与え、平均±信頼区間として示した(アルファ=0.05)。乾燥重量をグラム単位で、50個の細断した胚あるいは内乳の合計の平均として与えた。
F1成長穀粒において測定されたLKRおよびSDHに特異的な活性を表7に示す。データは、平均±標準偏差として示される(n=3)。各試料を受粉(DAP)後25日に発生する穂の穀粒から調製し、三連にて分析した。F1当たり3つの成長している穂を用いた。LKRおよびSDHに特異的な活性は、ミリグラム蛋白質当たり毎分、ナノモルでの酸化したNADPHあるいは低下されたNAD+で報告している。
F1種子は、ホモ接合性の親に類似した発現型を示した。CordapA 導入遺伝子を含むF1子孫はより高い遊離リジン(表3)を有し、PQ15およびPQ71に由来したF1種子は、ゼインの低下(図3)を示し、合計リジン含量(表4)を上昇させた。PQ15/CordapAおよびPQ71/CordapA交配におけるごときゼイン低下およびCordapA発現を組み合わせる結果、対照材料において観察された合計リジン含量を実質的に増加(約倍増)させた(表4)。
この非限定の実施例は、本発明のトランスジェニック植物にゼイン低下用配列を導入するのに有用な組換えDNA構築体を記載し、その構築体の使用は、米国特許出願11/057,062号(ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす)に一般的に記載されている。より詳細には、この実施例は、少なくとも1つのゼイン遺伝子(例えば、アルファ-、ベータ-、ガンマ-およびデルタ-ゼインについてのいずれかの1以上の遺伝子)を抑制するためのアンチセンス配向のRNAの閉ループの使用を記載する。少なくとも1つのゼイン遺伝子を抑制するための組換えDNA構築体は、5'から3'の順序で、少なくとも1つのゼイン遺伝子からのアンチセンス配向のDNAエレメントに作動可能に連結したプロモーターエレメント、およびセンス配向のDNAエレメントを含むことができ、ここに、センス配向のDNAエレメントはアンチセンス配向のDNAエレメントより短く、センス配向のDNAエレメントによって転写されたセンス配向のRNAは、アンチセンス配向のDNAエレメントにより転写されたアンチセンス配向のRNAによって転写されたアンチセンス配向のRNAの5'最端に相補的であり、ここに、その転写されたRNAは、少なくとも1つのゼイン遺伝子を抑制するアンチセンス配向のRNAのループを形成する。もう一つの具体例において、ゼイン低下用配列は、少なくとも1つのゼイン遺伝子を抑制するためのアンチセンス配向のRNAのループを形成するRNAに転写される組換えDNA構築体をトランスジェニック植物の細胞に供することにより、本発明のトランスジェニック植物中に導入できる。
この実施例は、本発明のトランスジェニックトウモロコシ植物を得るのに有用な非限定の構築体を記載する。イントロンに埋め込まれた遺伝子抑制用の非相同性のDNAを含む発現カセットは、米国仮特許出願第60/638,256号(ここに出典明示してそれらの全てを本明細書の一部とみなす)に詳細に記載されている。本発明の実施に有用な同様の発現カセットは、当業者に明らかである。例えば、本発明のトランスジェニック植物を得るのに有用な適当なベクターは、少なくとも1つのゼイン合成遺伝子を抑制するために埋め込まれた配列(例えば、DNAの逆反復)であるトウモロコシ熱ショック蛋白質イントロンに作動可能に連結した、種子特異的なプロモーターおよびリーダー、および所望により、少なくとも1つの内因性リジン異化酵素(例えば、トウモロコシLKR)を抑制するための配列に続いて、標的配列およびリジン合成遺伝子をコードする配列(例えば、E. coli AKIII、またはCorynebacterium DHDPS)、ならびに最後に、ポリアデニル化シグナルおよびサイトを持つDNAを含有する発現カセットを含む。ベクターはさらに選択またはスクリーニングのマーカー、例えば、グリホサート除草剤耐性をコードする遺伝子を含むことができる。
Claims (16)
- ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有し、それにより該遺伝子組換えDNAの発現が、該トランスジェニックトウモロコシ植物の種子のリジン含量を相乗的に増加させることを特徴とするトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該ゼイン低下用配列が、少なくとも1つのゼイン合成遺伝子の遺伝子抑制用配列を含む請求項1記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該リジン生合成用配列が外来性リジン合成遺伝子を含む請求項1記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該外来性リジン合成遺伝子が、実質的にフィードバック非感受性のリジン合成酵素をコードする遺伝子を含む請求項3記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該リジン生合成用配列が、該トランスジェニックトウモロコシ植物に内因性のリジン異化酵素の遺伝子抑制用配列を含む請求項1記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該リジン生合成用配列が、該トランスジェニックトウモロコシ植物に外来性のリジン合成遺伝子および内因性のリジン異化酵素の遺伝子抑制用配列を含む請求項1記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該外来性のリジン合成遺伝子が、実質的にフィードバック非感受性のリジン合成酵素をコードする遺伝子を含む請求項6記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 該トランスジェニックトウモロコシ植物が、ゼイン低下用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有する第1の親トランスジェニックトウモロコシ植物、およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有する第2の親トランスジェニックトウモロコシ植物の遺伝交配からの子孫トランスジェニックトウモロコシ植物を含み、該遺伝交配からの該子孫トランスジェニックトウモロコシ植物が、ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列をそのゲノムに有することを特徴とする請求項1記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- (a)ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有するトランスジェニックトウモロコシ植物を提供し、
(b)該トランスジェニックトウモロコシ植物の種子中で該遺伝子組換えDNAを発現させ、ここに、該発現が該種子のリジン含量を相乗的に増加させ、次いで
(c)相乗的に増加したリジン含量を持つ該種子を収穫する
ことを特徴とする相乗的に増加したリジン含量を持つトウモロコシ種子を提供する方法。 - 該ゼイン低下用配列が、少なくとも1つのゼイン合成遺伝子の遺伝子抑制用配列を含むことを特徴とする請求項9記載の方法。
- 該リジン生合成用配列が、外来性リジン合成遺伝子を含むことを特徴とする請求項9記載の方法。
- 該外来性リジン合成遺伝子が、実質的にフィードバック非感受性のリジン合成酵素をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項11記載の方法。
- 該リジン生合成用配列が、該トランスジェニックトウモロコシ植物に内因性のリジン異化酵素の遺伝子抑制用配列を含むことを特徴とする請求項9記載の方法。
- 該リジン生合成用配列が、該トランスジェニックトウモロコシ植物に外来性のリジン合成遺伝子および内因性のリジン異化酵素の遺伝子抑制用配列を含むことを特徴とする請求項9記載の方法。
- 該外来性リジン合成遺伝子が、実質的にフィードバック非感受性のリジン合成酵素をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項14記載の方法。
- 該提供が、ゼイン低下用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有する第1の親トランスジェニックトウモロコシ植物、およびリジン生合成用配列を含む遺伝子組換えDNAをそのゲノムに有する第2の親トランスジェニックトウモロコシ植物の遺伝交配を含み、該遺伝交配が、ゼイン低下用配列およびリジン生合成用配列をそのゲノムに有する子孫トランスジェニックトウモロコシ植物を生じさせることを特徴とする請求項9記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11/077,089 US7683237B2 (en) | 2004-02-10 | 2005-03-10 | Maize seed with synergistically enhanced lysine content |
US11/077,089 | 2005-03-10 | ||
PCT/US2006/008812 WO2006099249A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-03-10 | Maize seed with synergistically enhanced lysine content |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008532525A true JP2008532525A (ja) | 2008-08-21 |
JP4909983B2 JP4909983B2 (ja) | 2012-04-04 |
Family
ID=36910847
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008501019A Active JP4909983B2 (ja) | 2005-03-10 | 2006-03-10 | リジン含量が相乗的に増強されたトウモロコシ種子 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7683237B2 (ja) |
EP (1) | EP1859045B1 (ja) |
JP (1) | JP4909983B2 (ja) |
CN (1) | CN101175857A (ja) |
AR (1) | AR052605A1 (ja) |
AU (1) | AU2006223217B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0608580A2 (ja) |
CA (1) | CA2600428C (ja) |
MX (1) | MX2007011078A (ja) |
WO (1) | WO2006099249A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200707782B (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7855323B2 (en) | 2004-02-10 | 2010-12-21 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA for gene suppression |
CN101128588A (zh) | 2004-08-11 | 2008-02-20 | 孟山都技术有限公司 | 转基因玉米种子中增强的玉米醇溶蛋白减少 |
CA2624255C (en) * | 2005-10-03 | 2015-02-10 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plant seed with increased lysine |
CA2653231C (en) | 2006-05-12 | 2016-04-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants |
WO2009123946A1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-10-08 | Monsanto Technology Llc | Novel opaque modifiers in corn and related methods |
US20120128837A1 (en) * | 2008-06-06 | 2012-05-24 | Renessen Llc | Solvent extracted high lysine corn |
US7709710B1 (en) | 2009-04-06 | 2010-05-04 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety CV016780 |
US9074234B2 (en) | 2011-03-07 | 2015-07-07 | Syngenta Participations Ag | Method of predicting crop yield using metabolic profiling |
WO2012122199A1 (en) * | 2011-03-07 | 2012-09-13 | Syngenta Participations Ag | Methods of predicting yield in plants and applications of use thereof |
CN102517326B (zh) * | 2012-01-14 | 2013-03-27 | 云南省农业科学院粮食作物研究所 | 一种用玉米醇溶蛋白基因RNAi载体提高玉米赖氨酸含量的方法 |
CN102517314B (zh) * | 2012-01-14 | 2013-04-10 | 云南省农业科学院粮食作物研究所 | 一种玉米醇溶蛋白基因RNAi载体 |
WO2018005752A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Cold Spring Harbor Laboratory | Control of meiotic crossover in maize |
CN113637677A (zh) * | 2020-12-02 | 2021-11-12 | 上海大学 | 能降低玉米中α醇溶蛋白的靶点基因及其应用 |
CN116042696B (zh) * | 2022-12-28 | 2023-09-22 | 南京林业大学 | 一种春兰MIR156a基因在调控植物果实发育中的应用 |
Family Cites Families (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5420034A (en) | 1986-07-31 | 1995-05-30 | Calgene, Inc. | Seed-specific transcriptional regulation |
CA1293460C (en) | 1985-10-07 | 1991-12-24 | Brian Lee Sauer | Site-specific recombination of dna in yeast |
US5107065A (en) * | 1986-03-28 | 1992-04-21 | Calgene, Inc. | Anti-sense regulation of gene expression in plant cells |
US5453566A (en) * | 1986-03-28 | 1995-09-26 | Calgene, Inc. | Antisense regulation of gene expression in plant/cells |
US5015580A (en) | 1987-07-29 | 1991-05-14 | Agracetus | Particle-mediated transformation of soybean plants and lines |
US5258300A (en) * | 1988-06-09 | 1993-11-02 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Method of inducing lysine overproduction in plants |
US5416011A (en) | 1988-07-22 | 1995-05-16 | Monsanto Company | Method for soybean transformation and regeneration |
SE465280B (sv) | 1989-03-06 | 1991-08-19 | Swedoor Ab | Anordning vid gaangjaern |
US5231020A (en) * | 1989-03-30 | 1993-07-27 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US5550318A (en) | 1990-04-17 | 1996-08-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
HUT57265A (en) | 1989-11-03 | 1991-11-28 | Zaadunie Bv | Process for producing plants of diminished infection-sensitivity |
JP3209744B2 (ja) * | 1990-01-22 | 2001-09-17 | デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション | 結実能力のある遺伝子変換コーン |
US5484956A (en) | 1990-01-22 | 1996-01-16 | Dekalb Genetics Corporation | Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin |
US6329574B1 (en) * | 1990-01-22 | 2001-12-11 | Dekalb Genetics Corporation | High lysine fertile transgenic corn plants |
US6777589B1 (en) * | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
US6403865B1 (en) | 1990-08-24 | 2002-06-11 | Syngenta Investment Corp. | Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes |
US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
DE4133175A1 (de) | 1991-10-07 | 1993-04-08 | Thermoplast Technik Ges Fuer K | Verfahren zur herstellung einer filterkassette, nach diesem verfahren hergestellte filterkassette und filter mit einer solchen filterkassette |
US5773691A (en) * | 1992-03-19 | 1998-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants |
ATE398679T1 (de) | 1992-07-07 | 2008-07-15 | Japan Tobacco Inc | Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze |
US5527695A (en) | 1993-01-29 | 1996-06-18 | Purdue Research Foundation | Controlled modification of eukaryotic genomes |
US5545545A (en) * | 1993-04-27 | 1996-08-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Lysine-insensitive maize dihydrodipicolinic acid synthase |
US6326527B1 (en) * | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
US5635055A (en) | 1994-07-19 | 1997-06-03 | Exxon Research & Engineering Company | Membrane process for increasing conversion of catalytic cracking or thermal cracking units (law011) |
JPH08101861A (ja) | 1994-09-30 | 1996-04-16 | Toshiba Corp | 論理回路合成装置 |
US5981840A (en) | 1997-01-24 | 1999-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for agrobacterium-mediated transformation |
GB9710475D0 (en) * | 1997-05-21 | 1997-07-16 | Zeneca Ltd | Gene silencing |
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
NZ547283A (en) | 1998-03-20 | 2008-06-30 | Commw Scient Ind Res Org | Control of gene expression |
WO1999053050A1 (en) | 1998-04-08 | 1999-10-21 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods and means for obtaining modified phenotypes |
US6307123B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-23 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for transgene identification |
WO2000042207A2 (en) | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Monsanto Technology Llc | Soybean transformation method |
US6207879B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-03-27 | Dekalb Genetics Corporation | Maize RS81 promoter and methods for use thereof |
US6429357B1 (en) | 1999-05-14 | 2002-08-06 | Dekalb Genetics Corp. | Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof |
US6194636B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-02-27 | Dekalb Genetics Corp. | Maize RS324 promoter and methods for use thereof |
US6232526B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-05-15 | Dekalb Genetics Corp. | Maize A3 promoter and methods for use thereof |
US6326193B1 (en) * | 1999-11-05 | 2001-12-04 | Cambria Biosciences, Llc | Insect control agent |
BR122013026754B1 (pt) * | 2000-06-22 | 2018-02-27 | Monsanto Company | Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato |
AU2001272977A1 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant constructs and their use in reducing gene expression |
US20020048814A1 (en) * | 2000-08-15 | 2002-04-25 | Dna Plant Technology Corporation | Methods of gene silencing using poly-dT sequences |
US7109393B2 (en) * | 2000-08-15 | 2006-09-19 | Mendel Biotechnology, Inc. | Methods of gene silencing using inverted repeat sequences |
US6858778B1 (en) * | 2000-11-07 | 2005-02-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plants transformed with a DNA construct comprising a nucleic acid molecule encoding an 18 kD α-globulin |
US7151204B2 (en) | 2001-01-09 | 2006-12-19 | Monsanto Technology Llc | Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof |
US7166771B2 (en) | 2002-06-21 | 2007-01-23 | Monsanto Technology Llc | Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs |
AU2003251579B2 (en) * | 2002-06-21 | 2008-04-03 | Monsanto Technology Llc | Intron double stranded RNA constructs and uses thereof |
US7855323B2 (en) * | 2004-02-10 | 2010-12-21 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA for gene suppression |
AR047598A1 (es) * | 2004-02-10 | 2006-01-25 | Monsanto Technology Llc | Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos |
CN101128588A (zh) * | 2004-08-11 | 2008-02-20 | 孟山都技术有限公司 | 转基因玉米种子中增强的玉米醇溶蛋白减少 |
-
2005
- 2005-03-10 US US11/077,089 patent/US7683237B2/en active Active
-
2006
- 2006-03-10 AU AU2006223217A patent/AU2006223217B2/en active Active
- 2006-03-10 BR BRPI0608580-6A patent/BRPI0608580A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-03-10 JP JP2008501019A patent/JP4909983B2/ja active Active
- 2006-03-10 WO PCT/US2006/008812 patent/WO2006099249A2/en active Application Filing
- 2006-03-10 MX MX2007011078A patent/MX2007011078A/es active IP Right Grant
- 2006-03-10 EP EP06748353.7A patent/EP1859045B1/en active Active
- 2006-03-10 CN CNA2006800162724A patent/CN101175857A/zh active Pending
- 2006-03-10 CA CA2600428A patent/CA2600428C/en active Active
- 2006-03-13 AR ARP060100941A patent/AR052605A1/es unknown
-
2007
- 2007-09-11 ZA ZA200707782A patent/ZA200707782B/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BRPI0608580A2 (pt) | 2010-01-12 |
US20060064772A1 (en) | 2006-03-23 |
CN101175857A (zh) | 2008-05-07 |
CA2600428C (en) | 2015-10-20 |
AR052605A1 (es) | 2007-03-21 |
AU2006223217A1 (en) | 2006-09-21 |
US7683237B2 (en) | 2010-03-23 |
AU2006223217B2 (en) | 2010-06-03 |
EP1859045A2 (en) | 2007-11-28 |
CA2600428A1 (en) | 2006-09-21 |
JP4909983B2 (ja) | 2012-04-04 |
WO2006099249A2 (en) | 2006-09-21 |
WO2006099249A3 (en) | 2006-11-30 |
EP1859045B1 (en) | 2014-05-07 |
ZA200707782B (en) | 2008-07-30 |
MX2007011078A (es) | 2007-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4909983B2 (ja) | リジン含量が相乗的に増強されたトウモロコシ種子 | |
US10772276B2 (en) | Enhanced zein reduction in transgenic corn seed | |
US9976139B2 (en) | Recombinant DNA for gene suppression | |
EP1713908B1 (en) | Recombinant dna for gene suppression | |
US9000265B2 (en) | Corn plants and seed enhanced for asparagine and protein | |
EP2137302B1 (en) | Corn plants and seed enhanced for asparagine and protein | |
US20060150286A1 (en) | Gene suppression in transgenic plants using multiple constructs | |
US20060242736A1 (en) | Dissimilar promoters for gene suppression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110906 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20110927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111202 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111227 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120116 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150120 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4909983 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |