BRPI0607441A2 - derivado de 39-desmetóxi de rapamicina, composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição farmacêutica, métodos para o tratamento de doenças ou infecções fúngicas e para o tratamento do cáncer ou malignidades de célula b, uso de um composto, processo para a preparação de um composto, e, composição ou kit de partes - Google Patents

Abstract

DERIVADO DE 39-DESMETOXI DE RAPAMICINA, COMPOSTO OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITáVEL DO MESMO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENçAS OU INFECçõES FUNGICAS E PARA O TRATAMENTO DO CáNCER OU MALIGNIDADES DE CéLULA B, USO DE UM COMPOSTO, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE UM COMPOSTO, E, COMPOSIçãO OU KIT DE PARTES. A presente invenção diz respeito a novos derivados de 39-desmetóxi-rapamicina, métodos para a sua produção, e usos destes. Em um outro aspecto a presente invenção fornece o uso destes derivados de 39-desmetóxi-rapamicina no tratamento de câncer e/ou malignidades de célula B, a indução ou manutenção da imunossupressão, o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, a estimulação da regeneração neuronal ou o tratamento de infecções fúngicas.

Description

"DERIVADO DE 39-DESMETÓXI DE RAPAMICINA, COMPOSTO OUUM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DO MESMO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA O TRATAMENTODE DOENÇAS OU INFECÇÕES FÚNGICAS E PARA O TRATAMENTODO CÂNCER OU MALIGNIDADES DE CÉLULA B, USO DE UMCOMPOSTO, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO,E, COMPOSIÇÃO OU KIT DE PARTES"

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a novos derivados de 39-desmetóxi-rapamicina, métodos para a sua produção, e usos destes. Em umoutro aspecto a presente invenção fornece o uso destes derivados de 39-desmetóxi-rapamicina no tratamento de câncer e/ou malignidades de célula B,na indução ou manutenção da imunossupressão, no tratamento de rejeição atransplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doençasde inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, na estimulação daregeneração neuronal ou no tratamento de infecções fúngicas.

Fundamentos da Invenção

A rapamicina (sirolimus) (Figura 1) é um macrolídeo lipofílicoproduzido pelo Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 (Sehgal et al., 1975;Vezina et al, 1975; U.S. 3.929.992; U.S. 3.993.749) com uma porção de1,2,3-tricarbonila ligada a uma ácido pipecólico lactona (Paiva et al, 1991).Para o propósito desta invenção a rapamicina é descrita pela convenção denumeração de McAlpine et al.. (1991) em preferência às convenções denumeração de Findlay et al. (1980) ou Chemical Abstracts (llth CumulativeIndex, 1982-1986 p60719CS).

A rapamicina tem valor farmacológico significante devido aoamplo espectro de atividades exibido pelo composto. A rapamicina mostraatividade antifungica moderada, principalmente contra a espécie Cândida mastambém contra fungos filamentosos (Baker et al., 1978; Sehgal et al, 1975;Vezina et al, 1975; U.S. 3.929.992; U.S. 3.993.749). A rapamicina inibe aproliferação celular pelo alvejamento dos trajetos da transdução de sinal emuma variedade de tipos de célula, por exemplo, pela inibição dos trajetos desinalização que possibilitam a progressão da fase Gi para a S do ciclo celular(Kuo et al, 1992). Nas células T a rapamicina inibe a sinalização do receptorde IL-2 e a autoproliferação subseqüente das células T resultando naimunossupressão. Os efeitos inibitórios da rapamicina não são limitados àscélulas T, visto que a rapamicina inibe a proliferação de muitos tipos de célulamamífera (Brunn et al, 1996). A rapamicina é, portanto, um potente imunossupressor com aplicações terapêuticas estabelecidas ou prognosticadasna prevenção de rejeição de aloenxerto de órgão e no tratamento de doençasautoimunes (Kahan et al, 1991). 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina (SDZ RAD,RAD 001, Certican, everolimus) é um análogo semi-sintético da rapamicinaque mostra efeitos farmacológicos imunossupressivos e também está sobinvestigação como um agente anticâncer (Sedrani, R. et al, 1998; Kirchner etal, 2000; U.S. 5.665.772, Boulay et al, 2004). A aprovação para estemedicamento como um imunossupressor foi obtida para a Europa em 2003. Oderivado éster de rapamicina CCI-779 (Wyeth-Ayerst) inibe o crescimento decélula in vitro e inibe o crescimento de tumor in vivo (Yu et al, 2001).

OCCI-779 está atualmente em testes clínicos de Fase III como um agenteanticâncer potencial. O valor da rapamicina no tratamento da psoríase deplaca crônica (Kirby e Griffiths, 2001), o uso potencial de efeitos tais como aestimulação do crescimento de neurite em células PC 12 (Lyons et al, 1994),o bloqueio das respostas proliferativas às citocinas pelas células do músculovascular e liso depois da lesão mecânica (Gregory et al, 1993) e o seu papelna prevenção de fibrose de enxerto (Waller e Nicholson, 2001) são áreas depesquisa intensa (Kahan e Camardo, 2001). Relatos recentes revelam que arapamicina está associada com uma incidência mais baixa de câncer empacientes com aloenxerto de órgão na terapia imunossupressiva de longaduração do que aqueles em outros regimes imunossupressivos, e que estaincidência de câncer reduzida é devido à inibição da angiogênese (Guba et al.,2002). Foi relatado que as atividades neurotrópicas de ligandos de imunofilinasão independentes da sua atividade imunossupressiva (Steiner et al, 1997) eque a estimulação do crescimento de nervo é promovida pelo rompimento docomplexo do receptor de esteróide maduro como descrito no pedido depatente WO 01/03692. Efeitos colaterais tais como hiperlipidemia etrombocitopenia assim como efeitos teratogênicos potenciais foram relatados(Hentges et al, 2001; Kahan e Camardo, 2001).

A cadeia principal de policetídeo de rapamicina é sintetizadapela condensação de cabeça-cauda de um total de sete unidades de propionatoe sete de acetato a um unidade iniciadora de ácido cicloexanocarboxílicoderivado de shikimato pelas proteínas muito grandes, multifuncionais quecompreendem a policetídeo sintase do Tipo I (rap PKS, Paiva et al, 1991). Oaminoácido derivado de L-lisina, ácido pipecólico, é condensado porintermédio de uma ligação de amida no último acetato da cadeia principal depolicetídeo (Paiva et al., 1993) e é seguido pela lactonização para formar omacrociclo.

As seqüências de nucleotídeo para cada um dos três genesPKS de rapamicina, as seqüências do gene que codifica NRPS e o último geneflanqueador e os polipeptídeos correspondentes, foram identificados porAparicio et al., 1996, e Schwecke et al., 1995 e foram depositados com aNCBI sob o número de acesso X86780, e as correções para esta seqüênciaforam recentemente publicadas na WO 04/007709.

O primeiro produto isento de enzima do grupo biossintético darapamicina foi designado pré-rapamicina (WO 04/007709, Gregory et al.,2004). A produção da rapamicina totalmente processada requerprocessamento adicional do núcleo de policetídeo/NRPS pelas enzimascodificadas pelos últimos genes da rapamicina, RapJ, RapN, RapO, RapM,RapQ e Rapl.

Acredita-se que as ações farmacológicas de rapamicinacaracterizadas até agora sejam mediadas pela interação com receptorescitossólicos chamados FKBPs. O receptor da rapamicina intracelular principalem células T eucarióticas é FKBP12 (DiLella e Craig, 1991) e o complexoresultante interage especificamente com proteínas alvo para inibir a cascata detransdução de sinal da célula.

O alvo do complexo rapamicina-FKBP12 foi identificado emlevedura como TOR (alvo de rapamicina) (Alarcon et al., 1999) e a proteínamamífera é conhecido como FRAP (Proteína associada com FKBP-rapamicina) ou mTOR (alvo mamífero de rapamicina) (Brown et al., 1994).

Uma ligação entre a sinalização de mTOR e a síntese deproteína localizada em neurônios; seu efeito no estado de fosforilação deproteínas envolvidas no controle traducional; a abundância de componentesdo mecanismo de tradução aos níveis transcricionais e traducionais; o controleda atividade da aminoácido permease e a coordenação da transcrição demuitas enzimas envolvidas em trajetos metabólicos foram descritos (Raughtet al., 2001). Os trajetos de sinalização sensíveis à rapamicina tambémparecem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cérebroembrionário, aprendizagem e formação da memória (Tang et ai, 2002). Apesquisa nas proteínas TOR em levedura também revelaram seus papéis namodulação de trajetos de sinalização sensíveis a nutriente (Hardwick et ai,1999). Similarmente, mTOR foi identificado como um alvo direto para a açãoda proteína quinase B (akt) e de ter um papel chave na sinalização da insulina(Shepherd et ai, 1998; Nave et ai, 1999). O TOR de mamífero também foiimplicado na polarização do citoesqueleto de actina e a regulagem dainiciação traducional (Alarcon et al., 1999). As fosfatidilinositol 3-quinases,tais como mTOR, são funcionais em diversos aspectos da patogênese detumores tais como a progressão do ciclo celular, adesão, sobrevivência decélula e angiogênese (Roymans e Slegers, 2001).

Os estudos farmacocinéticos de rapamicina e análogos derapamicina têm demonstrado a necessidade quanto ao desenvolvimento denovos compostos de rapamicina que podem ser mais estáveis em solução,mais resistentes ao ataque metabólico e/ou têm permeabilidade de membranacelular melhorada e efluxo diminuído e que portanto podem exibirbiodisponibilidade oral melhorada.

Uma faixa de análogos de rapamicina sintetizados usando ossítios quimicamente disponíveis da molécula fora relatados. A descrição dos seguintes compostos foi adaptada ao sistema de numeração da molécula derapamicina descrita na Figura 1. Os sítios quimicamente disponíveis namolécula para a derivação ou substituição incluem grupos hidroxila C40 eC28 (por exemplo, U.S. 5.665.772, U.S. 5.362.718), grupos metóxi C39 eC16 (por exemplo, WO 96/41807; U.S. 5.728.710), grupos ceto C32, C26 eC9 (por exemplo, U.S. 5.378.836; U.S. 5.138.051; U.S. 5.665.772). Ahidrogenação a Cl7, C19 e/ou C21, alvejando o trieno, resultou na retençãoda atividade antifungica mas na perda relativa de imunossupressão (porexemplo, U.S. 5.391.730; U.S. 5.023.262). As melhoras significantes naestabilidade da molécula (por exemplo, formação de oximas em C32, C40e/ou C28, U.S. 5.563.145, U.S. 5.446.048), resistência ao ataque metabólico(por exemplo, U.S. 5.912.253), biodisponibilidade (por exemplo, U.S.5.221.670; U.S. 5.955.457; WO 98/04279) e a produção de pró medicamentos(por exemplo, U.S. 6.015.815; U.S. 5.432.183) foram obtidos através daderivação.

Entretanto, permanece uma necessidade quanto a uma faixamaior de derivados de rapamicina com estabilidade metabólica melhorada,permeabilidade de membrana celular melhorada e/ou uma taxa diminuída deefluxo. Tais derivados de rapamicina podem ter utilidade maior no tratamentode uma ampla faixa de condições. A presente invenção fornece uma faixa dederivados de 39-desmetóxi-rapamicina com estabilidade metabólicamelhorada, permeabilidade de membrana celular melhorada e/ou uma taxadiminuída de efluxo e/ou um perfil inibitório de célula diferente para arapamicina. Tais compostos são úteis na medicina, em particular para otratamento de câncer e/ou malignidades de célula B, a indução ou manutençãode íon imunossupressor, o tratamento de rejeição a transplante, doença doenxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doençavascular e doenças fibróticas, a estimulação da regeneração neuronal ou otratamento de infecções fúngicas.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece derivados 39-desmetóxi derapamicina, métodos para a preparação destes compostos, intermediáriosdestes e métodos para o uso destes compostos na medicina.

Em seu aspecto mais amplo a presente invenção fornecederivados 39-desmetóxi de rapamicina caracterizados em que a posição 40-hidróxi é derivada como um éster do ácido carboxílico, como um éter, comoum fosfato éster, como um fosfinato éster, como um acetal ou como umglicosila.

A estabilidade metabólica, a permeabilidade de membranacelular, o efluxo e a biodisponibilidade dos compostos da invenção podem sertestados como apresentado abaixo.

Quando 39-desmetóxi-rapamicina é derivada como um ésterdo ácido carboxílico, como um éter ou como um acetal o grupo de derivaçãopreferivelmente contém não mais do que 12 átomos de carbono(especialmente 7 ou menos particularmente 5 ou menos átomos de carbono).Preferivelmente ela contém pelo menos um grupo funcional (especialmentepelo menos dois grupos funcionais) selecionados de -CF2PO(OH)2, -PO(OH)2, -COOH, -OH e -NH2 particularmente selecionados de -COOH e -OH mais particularmente -OH.Quando 39-desmetóxi-rapamicina é derivada como um acetalderivado de um grupo glicosila preferivelmente cada glicosila é formada apartir de um açúcar ou um glicosídeo que preferivelmente contém não maisdo que 12 átomos de carbono (especialmente 7 ou menos, particularmente 6ou menos átomos de carbono). Os exemplos incluem mono e dissacarídeos,particularmente monossacarídeos que formam anéis de 5 e 6 membros.Preferivelmente ela contém pelo menos um grupo funcional (especialmentepelo menos dois grupos funcionais) selecionados de -COOH, -OH e -NH2particularmente selecionados de -NH2 e -OH mais particularmente -OH.

Quando 39-desmetóxi-rapamicina é derivada como um fosfatoéster preferivelmente os grupos alquila contém não mais do que 4 átomos decarbono.

Quando 39-desmetóxi-rapamicina é derivada como umfosfinato éster preferivelmente os grupos alquila preferivelmente contém nãomais do que 4 átomos de carbono, um exemplo é o éster formado com ácidofosfinico.

Os exemplos específicos de porções de derivação são dadasabaixo.

Em um aspecto mais específico a presente invenção fornecederivados de 39-desmetóxi-rapamicina de acordo com a Fórmula (I) abaixo,ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:em que:

X representa ligação ou CH2;

Ri representa um grupo ceto ou (H,H);

R2 representa OH ou OMe;

R3 representa H, OH ou OMe;

R4 e R5 cada um independentemente representa H ou OH;

Rô representa -R7, -C(0)R7, -(CH2)2-0-[CR2iR22-0]a-C(0)-

R23; -CR21R22-0-C(0)-R23; -POR19R20, -PO(OR19)(OR20) ou Y-R15;

R7 representa -(CR8R9)m(CR1oRii)pCR12R13Ri4;

Rg e R9 cada um independentemente representa alquila C1-C4,alquenila C2-C4 ou alquinila C2-C4, qualquer um de tais grupos pode seropcionalmente substituído com -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -COOH ou -NH2; ou R8 e R9 cada um independentemente representa H, trifluorometila ou F;

Rio, Rn, Ri2, r13 e Ri4 cada um independentemente representaalquila C1-C4, alquenila C2-C4 ou alquinila C2-C4, qualquer um de taisgrupos pode ser opcionalmente substituído com -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -COOH ou -NH2; ou R10, Rn, Ri2, Rn e R14 podem serindependentemente selecionados de H, -(CRsR9)qNH2, -(CRsR9)qOH, CF3, F,COOH; ou Rio e Rn ou Ri2 e R13 ou Ri3 e R14 podem ser quando juntos com ocarbono ao qual estes estão unidos para formar um cicloalquila C3-C6 ou umanel heteroalquila de 3 a 6 membros que contém um ou mais heteroatomosselecionados de N, O e S e que é opcionalmente, substituído com até 5 grupos-(CR8R9)qOH, -(CRgR9)qNH2 ou COOH;

Y = ligação, -C(0)-0-; -(CH2)2-0-C(0)-0-;

<formula>formula see original document page 9</formula>

R16 são cada um independentemente H ou OH;Rn é independentemente selecionado de H, OH e NH2;

Ris é independentemente selecionado de H, -CH3j -CH2OH e - COON;

entretanto contanto que não mais do que 2 grupos selecionadosde Ri6, Rn e Ri8 representem H ou CH3;

Ri9 e R2o cada um independentemente representa H ou alquilaC1-C4 ou R!9 e R2o juntos representam =CH2;

R2i é independentemente selecionado de H, CH3;

R22 é independentemente selecionado de H, -CH3, -CH=CH2, -CH2C1, -CHC12, -CCI3, -CH(OH)Me, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(Cl)Me;

R23 é independentemente R7, Y-R15 ou um anel arila ouheteroarila de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com um a trêsgrupos selecionados de OH, F, Cl, Br, N02 e NH2;

a representa 0 ou 1;

m, p e q cada um independentemente representa um númerointeiro entre 0 e 4;

entretanto contanto que a porção R7 não contenha mais do que12 átomos de carbono e contenha pelo menos um grupo funcional selecionadode -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -COOH, OH ou NH2; ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.

A estrutura acima mostra um tautômero representativo e ainvenção abrange todos os tautômeros dos compostos da fórmula (I) porexemplo, compostos ceto onde os compostos de enol são ilustrados e viceversa.

A menos que estereoisômeros particulares sejamespecificamente indicados (por exemplo, por uma ligação em negrito outracejada em um estereocentro relevante em uma fórmula estrutural, pelarepresentação de uma ligação dupla como tendo a configuração E ou Z emuma fórmula estrutural, ou pelo uso da nomenclatura que designa aestereoquímica), todos os estereoisômeros são incluídos dentro do escopo dainvenção como compostos puros assim como misturas destes. A menos que deoutro modo indicado, enanciômeros, diastereômeros, isômeros geométricosindividuais, e combinações e misturas destes são todos abrangidos pelapresente invenção. As formas cristalinas polimórficas e solvatos e hidratostambém são abrangidos dentro do escopo desta invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece derivadosde 39-desmetóxi-rapamicina tais como os compostos da fórmula (I) ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, para o uso como um produtofarmacêutico.

Definições

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para se referir a umou a mais do que um (isto é, pelo menos um) dos objetos gramaticais doartigo. Por via de exemplo "um análogo" significa um análogo ou mais do queum análogo.

Como aqui usado o termo "análogo(s)" refere-se aoscompostos químicos que são estruturalmente similares entre si mas quediferem levemente na composição (como na substituição de um átomo por umoutro ou na presença ou ausência de um grupo funcional particular).

Em particular, o termo "análogo de 39-desmetóxi-rapamicina"refere-se a um composto de 39-desmetóxi-rapamicina produzido pelosmétodos da WO 2004/007709 e/ou como mostrado pela fórmula (II). Estescompostos também são aludidos como "compostos precursores" e estestermos são usados intercambiavelmente no presente pedido. No presentepedido o termo "análogo de 39-desmetóxi-rapamicina" inclui referência àprópria 39-desmetóxi-rapamicina.

Como aqui usado o termo "derivado(s)" refere-se a compostosquímicos que foram modificados a partir do seu composto precursor pelaquímica orgânica semi-sintética.Em particular, o termo "derivado de 39-desmetóxi-rapamicina" refere-se a um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina de acordocom a Fórmula (I) acima, ou um sal desta farmaceuticamente aceitável,produzidos pela alteração semi-sintética de um análogo de 39-desmetóxi-rapamicina. Estes compostos também são aludidos como "compostos dainvenção" ou "derivados 39-desmetóxi de rapamicina" e estes termos sãousados intercambiavelmente no presente pedido.

Como aqui usado, o termo "distúrbio(s) autoimune(s)" inclui,sem limitação: lupo eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide,miastenia grave e esclerose múltipla.

Como aqui usado, o termo "doenças de inflamação" inclui,sem limitação: psoríase, dermatite, eczema, seborréia, doença do intestinoinflamatório (incluindo mas não limitado à colite ulcerativa e doença deCrohn), inflamação pulmonar (incluindo asma, doença pulmonar obstrutivacrônica, enfisema, síndrome da angústia respiratória aguda e bronquite),artrite reumatóide e uveíte ocular.

Como aqui usado, o termo "câncer" refere-se ao crescimentomaligno de células na pele ou em órgãos do corpo, por exemplo, mas semlimitação, mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago ou intestino. Umcâncer tende a infiltrar no tecido adjacente e espalha-se (metastatiza) paraórgãos distantes, por exemplo, para o osso, fígado, pulmão ou no cérebro.Como aqui usado o termo câncer inclui ambos os tipos de célula de tumormetastático, tais como mas não limitado a, melanoma, linfoma, leucemia,fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e mastocitoma e tipos de carcinoma detecido, tais como mas não limitado a, câncer colorretal, câncer da próstata,câncer pulmonar de célula pequena e câncer pulmonar de célula não pequena,câncer de mama, câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer renal, câncergástrico, glioblastoma, câncer hepático primário e câncer ovariano.

Como aqui usado o termo "malignidades de célula B" incluium grupo de distúrbios que incluem leucemia linfocítica crônica (CLL),mieloma múltiplo, e linfoma de não Hodgkin (NHL). Estas são doençasneoplásticas do sangue e órgãos que forma o sangue. Estes causam disfunçãona medula óssea e no sistema imune, que tornam o hospedeiro altamentesuscetível à infecção e hemorragia.

Como aqui usado, o termo "doença vascular" inclui, semlimitação: distúrbios vasculares hiperproliferativos (por exemplo, restenose eoclusão vascular), aterosclerose vascular de enxerto, doença cardiovascular,doença vascular cerebral e doença vascular periférica (por exemplo, doençada artéria coronária, arteriosclerose, aterosclerose, arteriosclerose nãoateromatosa ou dano à parede vascular).

Como aqui usado o termo "regeneração neuronal" refere-se àestimulação do crescimento de célula neuronal e inclui crescimento de neuritoe recuperação funcional de células neuronais. Doenças e distúrbios onde aregeneração neuronal pode ser de benefício terapêutico signifícante incluem,mas não são limitados a, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, coréia deHuntington, esclerose lateral amiotrófica, neuralgia trigeminal, neuralgiaglossofaríngea, paralisia de Bell, distrofia muscular, acidente vascularcerebral, atrofia muscular progressiva, atrofia muscular herdada bulbar progressiva, espondilose cervical, síndrome de Gullain-Barre, demência,neuropatias periféricas e dano nervoso periférica, seja causada pelo danofísico (por exemplo, dano ou trauma da medula espinal, lesão ou dano donervo ciático ou facial) ou um estado de doença (por exemplo, diabete).

Como aqui usado o termo "doenças fibróticas" refere-se adoenças associadas com a produção em excesso da matriz extracelular e inclui(sem limitação) sarcoidose, quelóides, glomerulonefrite, doença renal emestágio final, fibrose hepática (incluindo mas não limitado a cirrose, doençahepática alcoólica e esteato-hepatite), nefropatia de enxerto crônica, adesõescirúrgicas, vasculopatia, fibrose cardíaca, fibrose pulmonar (incluindo masnão limitado à fibrose pulmonar idiopática e alveolite fibrosantecriptogênica), degeneração macular, retinopatia retinal e vítrea e fibroseinduzida pela quimioterapia ou radiação.

Como aqui usado, o termo "doença do enxerto vs. hospedeiro"refere-se a uma complicação que é observada depois do transplante de célulatronco alogênica / medula óssea. Esta ocorre quando as células que combatema infecção do doador reconhecem o corpo do paciente como sendo diferenteou estranho. Estas células que combatem a infecção atacam então os tecidosno corpo do paciente exatamente como se elas estivessem atacando umainfecção. A doença do enxerto vs. hospedeiro é categorizada como agudaquando a mesma ocorre dentro dos primeiros 100 dias depois do transplante ecrônica se a mesma ocorre a mais do que 100 dias depois do transplante. Ostecidos tipicamente envolvidos incluem o fígado, trato gastrointestinal e pele.A doença do enxerto vs. hospedeiro crônica ocorre aproximadamente em 10 a40 por cento de pacientes depois do transplante de célula tronco / medulaóssea.

Como aqui usado, o termo "biodisponibilidade" refere-se aograu ao qual ou à taxa na qual um medicamento ou outra substância éabsorvida ou torna-se disponível no local de atividade biológica depois daadministração, esta propriedade é dependente de vários fatores incluindo asolubilidade do composto, taxa de absorção no intestino, o grau de ligação emetabolismo de proteína, etc. Vários testes para a biodisponibilidade quepodem ser familiares a uma pessoa de habilidade na técnica são aqui descritos(ver também Trepanier et al, 1998, Gallant-Haidner et ai, 2000).

O termo "solubilidade em água" como usado neste pedidorefere-se à solubilidade em meios aquosos, por exemplo, solução salinatamponada com fosfato (PBS) no pH 7,4.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos dainvenção tais como os compostos da fórmula (I) incluem sais convencionaisformados a partir de ácidos ou bases inorgânicas ou orgânicasfarmaceuticamente aceitáveis assim como sais de adição de ácido de amônioquaternário. Os exemplos mais específicos de sais de ácido adequadosincluem clorídrico, bromídrico, sulfurico, fosfórico, nítrico, perclórico,fumárico, acético, propiônico, succínico, glicólico, fórmico, láctico, maleico,tartárico, cítrico, palmóico, malônico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico,benzóico, salicílico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico,naftaleno-2-sulfônico, benzeno-sulfônico hidroxinaftóico, iodídrico, málico,esteróico, tânico e outros. Outros ácidos tais como oxálico, embora não elespróprios farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de saisúteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus saisfarmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicosadequados incluem os sais de sódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio,cálcio, zinco, N,N'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina,dietanolamina, etilenodiamina, N-metilglicamina e procaína. Referências aseguir a um composto de acordo com a invenção incluem tanto os compostosda fórmula (I) quanto seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Grupos alquila, alquenila e alquinila podem ser de cadeia retaou ramificada.

Os exemplos de grupos alquila C1-C4 incluem metila, etila, n-propila, i-propila e n-butila. Os exemplos de grupos alquenila C2-C4 incluemetenila e 2-propenila.

Os exemplos de grupos alquinila C2-4 incluem etinila.

Os grupos cicloalquila C3-C6 referem-se a um anel decicloalquila incluindo 3 a 6 átomos de carbono que podem ser opcionalmenteramificados. Os exemplos incluem ciclopropila, ciclobutila, metil-ciclobutila,ciclopentila e cicloexila,

Os anéis heteroalquila de 3 a 6 membros contendo um ou maisheteroátomos selecionados de N, O e S incluem anéis contendo um ou doisheteroátomos, especialmente um heteroátomo. Os exemplos incluem furano,pirano, oxetano, oxirano, piperidina, pirrolidina, azetidina, aziridina, tiirano,tietano, tiofeno, tiopirano e morfolina.

O exemplo de substituintes opcionais para os anéis deheteroalquila de 3 a 6 membros incluem -OH, - CH2OH, NH2, CH2NH2 eCOOH. Tipicamente os anéis de heteroalquila de 3 a 6 membros podem sernão substituídos ou substituídos por 1 ou 2, por exemplo, 1 substituinte.

Descrição da Invenção

A presente invenção fornece derivados de 39-desmetóxi-rapamicina, como apresentado acima, métodos para a preparação destescompostos, intermediários destes e métodos para o uso destes compostos namedicina.

Preferivelmente R7 contém 7 ou menos especialmente 5 oumenos átomos de carbono.

R7 preferivelmente contém pelo menos um grupo funcionalselecionado de -PO(OH)2, -OH, -COOH e -NH2> mais preferivelmente -OH, -COOH ou -NH2; especialmente -COOH e OH, o mais especialmente OH.Preferivelmente R7 contém 2 ou mais substituintes, por exemplo, 2 grupos - OH.

Adequadamente X representa CH2;

Adequadamente a representa 0.

Adequadamente p representa 0 ou 1.

Adequadamente m representa 0 ou 1.

Adequadamente q representa 0, 1 ou 2.

Adequadamente Rn representa H. Adequadamente R12 representa H.

Adequadamente Rn representa H ou OH.

Quando p representa 1, adequadamente Ri0 representa Me, OH ou CH2OH.Quando p representa 1, adequadamente Rn representa Me, Hou CH2OH.

Quando m e p ambos representam 0, adequadamente Ri2 e Rj3ambos representam H, Ri4 representa - (CR3R3)q-OH onde q = 0 ou 1 e R8 eR9 ambos representam H.

Quando p representa 1 e m representa 0, adequadamente Ri0 eRn ambos representam H, R12 representa H, Rn representa H, OH ou NH2,Rh representa -(CRsRg^-OH onde q = 0ouleR8eR9 ambos representam H.

Quando R6 representa -POR15R16 adequadamente R15 e Ri6ambos representam CH3 ou ambos representam CH2CH3.

Adequadamente R6 representa o resíduo derivado de formarum éster com ácido hidroxil acético, ácido 3-hidróxi-2,2-dimetilpropiônico,ácido 2,3-diidroxipropiônico, ácido 3-hidróxi-2-hidroximetilpropiônico ouácido 2,2-bis(hidroximetil)propiônico.

Em um conjunto de exemplo de compostos, Rô representa:C(0)R7

Preferivelmente R7 é a porção formada pela condensação doálcool macrocíclico com um ácido selecionado da lista que consiste de ácidohidroxiacético, ácido 3-hidróxi-2,2-dimetilpropiônico, ácido 2,3-diidroxipropiônico, ácido 3-hidróxi-2-hidroximetilpropiônico e ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiônico, especialmente o ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiônico.

Quando R]5 representa:

<formula>formula see original document page 17</formula>

exemplos desta porção incluem a porção formada pelaformação de um acetal com (i) glicose (isto é, R]8 representa CH2OH e cadaRi6 e Rn representa OH), por exemplo, D-glicose (ii) glicosamina (isto é, Ri8representa CH2OH, cada Ri6 representa OH e R17 representa NH2) porexemplo, D-glicosamina, (iii) ácido glicurônico (isto é, R\s representa COOHe cada R16 e R!7 representa OH) por exemplo, ácido D-glicurônico e (iv)arabinose (isto é, Ri8 representa H e cada Ri6 e R17 representa OH) porexemplo, D-arabinose.

Quando Ri5 representa:

<formula>formula see original document page 18</formula>

exemplos desta porção incluem a porção formada pelaformação de um acetal com frutose (isto é, cada Ri6 representa OH), porexemplo, o resíduo de D-frutose.

Quando RJ5 representa:

<formula>formula see original document page 18</formula>

exemplos desta porção incluem a porção formada pelaformação de um éster com ácido glicurônico (isto é, cada Ri6 representa OH),por exemplo, o resíduo do ácido D-glicurônico.

No geral, os compostos da invenção são preparados peladerivação semi-sintética de um análogo de 39-desmetóxi-rapamicina dafórmula (II).

Assim um processo para preparar um composto da fórmula (I)ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo compreende:

(a) reagir um análogo de 39-desmetóxi-rapamicina da fórmula (II):<formula>formula see original document page 19</formula>

ou um derivado ativado de R^;

(b) converter um composto da fórmula (I) ou um sal deste aum outro composto da fórmula (I) ou um outro sal deste farmaceuticamenteaceitáveis; ou

(c) desproteger um composto protegido da fórmula (I).

O termo "derivado ativado" como usado acima refere-se a (porexemplo, mas sem limitação): no caso de ésteres - ácidos carboxílicos, haletosde acila, anidridos mistos, anidridos simétricos ou éteres carboxílicos; no casode éteres - haletos de alquila, mesilatos de alquila, triflatos de alquila,tosilatos de alquila ou outros derivados de alquila adequadamente ativados; nocaso de fosfatos e fosfonatos - clorofosfatos, cianofosfatos de dialquila,dialquilfosforamidatos ou clorofosfitos de dialquila; ou no caso de acetaisderivados de grupos glicosila - usando um doador de glicosila por exemplo,haletos de glicosila, tioglicosídeos, 1-O-acil glicosídeos, orto ésteres,carbonates l-O ou 1-S, tricloroimidatos, 4-pentenil glicosídeos, fosfatoésteres de glicosila, 1-O-sulfonilas ou glicosídeos 1-O-sililados.

No processo (a), análogos de 39-desmetóxi-rapamicina dafórmula (II) podem ser preparados como descrito na WO 2004/007709 ecomo ainda apresentado nos exemplos neste.

Além dos métodos e referências específicos aqui fornecidosuma pessoa de habilidade na técnica também pode consultar referências em livro texto padrão quanto aos métodos sintéticos, incluindo, mas não limitadosa VogePs textbook of practical organic chemistry (Furniss et al., 1989) eMarch's advanced organic chemistry (Smith e March, 2001).

Os grupos hidroxila adicionalmente presentes podem serprotegidos por uma de muitas estratégias de proteção de hidróxi padrãodisponíveis a uma pessoa habilitada na técnica. Os grupos hidroxila podemser protegidos pela formação de éteres, incluindo, mas não limitado a, éteresalquílicos substituídos, éteres benzílicos substituídos e éteres silílicos.Preferivelmente um éter silílico, incluindo, mas não limitado a, trimetilsilila,trietilsilila, t-butildimetilsilila e t-butildifenil-silila, o éter é formado reagindo-se uma forma ativada do silano (incluindo, mas não limitado a, cloreto desilila ou triflato de silila) com 39-desmetóxi-rapamicina na presença de umabase adequada. O grupo de proteção pode ser depois removido pela hidróliseácida ou clivagem auxiliada por fluoreto. 1,2-Dióis podem ser protegidoscomo acetonidas, com base na condensação de um derivado de acetona. Estas podem ser removidas pela catalise ácida.

Os análogos de 39-desmetóxi-rapamicina da fórmula (II)podem ser usados como padrões para outra semi-síntese (isto é, o processo(a)). O grupo hidroxila pendente em C-40 pode ser funcionalizado porexemplo, pela acilação, alquilação, glicosilação ou fosforilação porintermédio de várias transformações sintéticas conhecidas a uma pessoahabilitada na técnica.

No processo (a), quando R$ representa um porção da fórmula -C(0)R7 ou Y-Ri5 onde R15 representa<formula>formula see original document page 21</formula>

e Y = ligação, a formação de um hidróxi éster, ou O-acilação,pode ser mediada pela reação do grupo hidroxila dos compostos da fórmula(II) com um ácido carboxílico correspondente preferivelmente na formaativada, por exemplo um composto da fórmula (IIIAI) ou (IIIAII):

<formula>formula see original document page 21</formula>

ou com um composto da fórmula (IIIB):

<formula>formula see original document page 21</formula>

onde W é um grupo que ativa um ácido carboxílico para oataque nucleofilico. Os ácidos carboxílicos podem ser ativados pela formaçãopor exemplo mas sem limitação, de haletos de acila (por exemplo, W = Cl),anidridos mistos (isto é, W = OC(0)R'), anidridos simétricos (W = OC(0)R7)ou ésteres carboxílicos (isto é, W = OR').

Os compostos da fórmula (IIIAI), (IIIAII) ou (IIIB) podem serpreparados a partir dos seus ácidos carboxílicos comercialmente disponíveisusando métodos padrão conhecidos por uma pessoa de habilidade na técnica,e em um aspecto específico, os compostos de acordo com a Fórmula (IIIAI)em que R7 é -(CRgRç^CRioRiOp CR12R13R14 podem ser preparados usandométodos como descritos na US 5.362.718, US 5.665.772 ou EP 0 663 916.

Preferivelmente um análogo de 39-desmetóxi-rapamicina éreagido em meios orgânicos com um cloreto ácido ou anidrido misto napresença de uma base. As bases que podem ser usadas incluem, mas não sãolimitadas a, piridina, 4,4-dimetilaminopiridina (DMAP), 2,6-lutidina, 2,6-di-terc-butilpiridina, trietilamina, diisopropiletilamina, outras trialquilaminas,l,8-diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno (DBU) ou l,5-diaza-biciclo[4,3,0]non-5-eno (DBN). Em exemplos específicos aqui descritos, a 39-desmetóxi-rapamicina é reagida com um anidrido misto na presença de DMAP.

No processo (a), quando representa uma porção da fórmula-C(0)R7 ou Y-R]5 onde Ri5 representa

<formula>formula see original document page 22</formula>

e Y = -C(0)0- ou -(CH2)2-OC(0)0- a formação destes hidróxiésteres, requer a reação do grupo hidroxila dos compostos da fórmula (II) ouum composto que é 40-O-(hidroxietil)-fórmula II com um reagente queformará um carbonato ativado tal como um composto da fórmula IV

<formula>formula see original document page 22</formula>

onde T = ligação ou -0(CH2)2- e R24 é um grupo alquila ouarila, preferivelmente um grupo arila, especialmente grupo para-nitrofenila.

O composto da fórmula IV pode depois reagir com umcomposto da fórmula III, para gerar compostos com R<$ ligado ao grupo 40-hidroxila, ou grupo 40-O-(hidroxietil) por intermédio de um ligador decarbonato (WO 2004/101583).

Do mesmo modo um análogo de 39-desmetóxi-rapamicinapode ser derivado com hidróxi éteres diferentes em C-40, pela reação doanálogo de 39-desmetóxi-rapamicina com um derivado de alquilaadequadamente ativado de escolha, para formar um derivado de 40-O-alquil-39-desmetóxi-rapamicina. Os grupos alquila ativados referem-se a um grupo alquila que foi ativado por um de muitos métodos, incluindo, mas nãolimitado à formação de haletos de alquila (RC1, RI, RBr), mesilatos de alquila(ROS(0)2CH3), triflatos de alquila (ROS(0)2CF3), tosilatos de alquila(ROS(0)2PhMe). O grupo alquila ativado pode ser depois reagido com umanálogo de 39-desmetóxi-rapamicina em meios orgânicos na presença de uma base adequada. Os métodos padrão para otimizar as condições de reaçãopodem ser utilizados por uma pessoa de habilidade na técnica para evitar aalquilação em outras posições reativas.

Do mesmo modo um análogo de 39-desmetóxi-rapamicinapode ser fosforilado, e depois da desproteção dos ésteres de fosfato o mesmo pode produzir um derivado de 40-O-fosfo-39-desmetóxi-rapamicina ou umderivado de 40-O-dialquilfosfo-39-desmetóxi-rapamicina, e sais destesderivados fabricados pelos métodos conhecidos por uma pessoa habilitada natécnica. Os fosfato ésteres podem ser formados direta ou indiretamente porintermédio de um O-fosfito (isto é, (R'0)2POR) em que o fosfito trivalente éoxidado (preferivelmente pela ação de um perácido, tal como mas nãolimitado a mCPBA) ao fosfato pentavalente. Os métodos de fosforilaçãodireta incluem, mas não são limitados à reação de um análogo de 39-desmetóxi-rapamicina com um clorofosfato protegido (por exemplo,(BnO)2P(0)Cl, (Alquila-0)2P(0)C1), preferivelmente na presença de DMAPem meios orgânicos, ou a reação de um análogo de 39-desmetóxi-rapamicinacom oxicloreto de fósforo (POCl3), na presença de uma base tal comotrietilamina, seguida pela hidrólise ácida do O-diclorofosfato resultante (istoé, ROP(0)Cl2), ou ligação a um cianofosfato de dialquila (WO 01/81355). Oclorofosfato de dialquila ou diarila pode ser gerado in situ pela reação de umfosfito de dialquila ou diarila (isto é, (RO)2P(0)H) com tetracloreto decarbono na presença de base. Os métodos de formar o O-fosfito (para aoxidação ao O-fosfato) incluem, mas não são limitados à ligação de umanálogo de 39-desmetóxi-rapamicina com um dialquil-fosforamidato dedialquila (preferivelmente diisopropilfosforilamidato de dialquila), napresença de base (preferivelmente tetrazol), ou ligação usando um clorofosfítona presença de base (Evans et ai, 1992). A escolha do grupo de proteção éimportante, os ésteres de etila e metila de fosfatos não são facilmentehidrolisáveis sob condições ácidas ou básicas. Preferivelmente os grupos deproteção incluem, mas não são limitados a, ésteres benzílicos (clivados porintermédio da hidrólise promovida pelo iodeto de sódio / clorotrimetilsilano,(WO 01/81355)) ou ésteres 2-cianoetílicos (clivados por intermédio daclivagem catalisada por base branda). Similarmente 40-O-dialquilfosfono-39-desmetóxi-rapamicina podem ser gerados pela reação de um análogo de 39- desmetóxi-rapamicina com um dialquilfosfonato ou dialquilfosfito ativadosadequados (como descrito acima).

No processo (a), quando R15 representa uma porção da fórmula

<formula>formula see original document page 214</formula>

a formação de uma ligação glicosídica, ou O-glicosilação,pode ser mediada pela reação do grupo hidroxila com um doador de glicosila correspondente, preferivelmente na forma ativada, (ver Toshima e Tatsuta(1993)) por exemplo um composto da fórmula (IIIC):

<formula>formula see original document page 214</formula>

ou um composto da fórmula (IIID):<formula>formula see original document page 25</formula>

Usando um 'doador de glicosila', incluindo, mas não limitadoa, haletos de glicosila (Z = F, Cl, Br), tioglicosídeos (Z = SMe, Set, SPh, SPy,SCN), 1-O-acil glicosídeos (Z = OC(O)R), orto ésteres (Z = OC(Me)(R)(0-C2 da fórmula (IIIC/IIID)), carbonatos l-O ou 1-S (Z = OC(S)SMe, Z =OC(0)imidazol, Z = OC(S)imidazol, Z = SC(S)OEt), tricloroimidatos (Z =OC(=NH)CCl3), 4-pentenil glicosídeos (Z = OCH2CH2CH2CH=CH2), fosfatoésteres (por exemplo, Z = OP(0)(OPh)2), 1-O-sulfonilas (Z = tosila), ouglicosídeos 1-O-sililados (Z = OTMS ou OTBS), o análogo de 39-desmetóxi-rapamicina pode ser glicosilado em meios orgânicos, preferencialmente napresença de um ativador (tal como um ácido de Lewis ou sal de metal pesado,ver Toshima e Tatsuta, 1993)). O doador de glicosila específico usado e ascondições de reação determinarão se um alfa ou beta glicosídeo é formado.Como antes para a acilação, quaisquer grupos hidroxila presentes nocomposto precursor podem ser protegidos ou mascarados tal que usando umequivalente de doador de glicosila resultará na 40-O-acilação. As hidroxilasremanescentes no doador de glicosila devem ser protegidas, como porexemplo, O-acetatos, O-benzoatos, 1,2-acetonidas, de modo que umadesproteção será necessária. Além disso, os doadores de 2-desoxiglicosilastais como glicais podem ser usados (uma etapa redutiva também é requerida)para preparar glicosídeos de 2'-desóxi-39-desmetóxi-rapamicina e doadoresde 2,6-didesoxiglicosila tais como 2,6-anidro-2-tioaçúcares podem ser usadospara preparar glicosídeos de 2',6'-didesóxi-39-desmetóxi-rapamicina.

No processo (b), a formação de sal e a troca podem serrealizadas por métodos convencionais conhecidos por uma pessoa dehabilidade na técnica. As interconversões de compostos da fórmula (I) podemser realizadas pelos processos conhecidos por exemplo grupos hidróxi e cetopodem ser interconvertidos pela oxidação/redução como aqui descrito emoutro lugar. Os compostos da fórmula (I) em que R$ representa -PO(OH)2podem ser preparados pela fosforilação de um composto correspondente dafórmula (I) em que representa OH. As condições adequadas são aquifornecidas em outro lugar.

Nos processos (a) e (c), os exemplos de grupos de proteção e omeio para a sua remoção podem ser encontrados em T W Greene "ProtectiveGroups in Organic Synthesis" (J Wiley and Sons, 1991). Os grupos deproteção de hidroxila adequados incluem alquila (por exemplo, metila), acetal(por exemplo, acetonida) e acila (por exemplo, acetila ou benzoíla) quepodem ser removidos pela hidrólise, e arilalquila (por exemplo, benzila) quepodem ser removido pela hidrólise catalítica, ou éter silílico, que pode serremovido pela hidrólise ácida ou clivagem auxiliada pelo íon fluoreto.

Além do processo (a), os análogos de 39-desmetóxi-rapamicina da fórmula (I) onde Pv6 representa R7 podem ser sintetizados pelatransesterificação catalisada por Lipase. Por exemplo, mas sem limitação, umanálogo de 39-desmetóxi-rapamicina da fórmula (II) pode ser reagido com uméster vinílico da fórmula (V) na presença de lipase PS-C "Amano" II sob ascondições de reação descritas por Gu et al (2005) e como ainda aquiapresentado nos exemplos. Esta metodologia não é limitada ao uso de ésteresvinílicos e a transesterificação pode ser catalisada por outras lipases ouesterases.

<formula>formula see original document page 26</formula>

Outros compostos da invenção podem ser preparados pelosmétodos conhecido por si ou pelos métodos análogos a aqueles descritosacima.

Os novos derivados de 39-desmetóxi-rapamicina são úteisdiretamente, e como padrões para outra semi-síntese ou bioconversão, paraproduzir compostos úteis como imunossupressores, agentes antifúngicos,agentes anticâncer, agentes anti-inflamatórios, agentes neuro-regenerativos ouagentes para o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs.hospedeiro, distúrbios autoimunes, doença vascular e/ou doenças fibróticas.Métodos para a derivação semi-sintética de rapamicina e análogos desta sãobem conhecidos na técnica e incluem (mas não são limitados a) aquelasmodificações descritas por exemplo, na U.S. 5.665.772; U.S. 5.362.718. WO96/41807; U.S. 5.728.710. U.S. 5.378.836; U.S. 5.138.051; U.S. 5.665.772.U.S. 5.391.730; U.S. 5.023.262. U.S. 5.563.145. U.S. 5.446.048. U.S.5.912.253. U.S. 5.221.670; U.S. 5.955.457; WO 98/04279. U.S. 6.015.815 eU.S. 5.432.183.

As estruturas acima de intermediários (por exemplo,compostos da fórmula (II) podem ser submetidas à tautomerização e onde umtautômero representativo é ilustrado será entendido que todos os tautômerospor exemplo compostos ceto onde compostos enol são ilustrados e vice versasão intencionados a serem aludidos também.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece o uso dosderivados de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção na medicina. Em umoutro aspecto a presente invenção fornece o uso de derivados de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção na preparação de um medicamento para aindução ou manutenção da imunossupressão, na estimulação da regeneraçãoneuronal ou no tratamento de câncer, malignidades de célula B, infecçõesfüngicas, rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbiosautoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas ouagentes para o uso na regulagem da cicatrização de ferimento.

A Resistência a Multi-Medicamento (MDR) é um problemasignificante no tratamento de câncer e malignidades de célula B. Esta é arazão fundamental por detrás do desenvolvimento da resistência amedicamento em muitos cânceres (Persidis A, 1999). A MDR está associadacom os níveis aumentados de transportadores do cassete de ligação detrifosfato de adenosina (transportadores ABC), em particular um aumento naexpressão do gene da MDRi que codifica a glicoproteína P (P-gp) ou o genede MRP1 que codifica a MRP1. O nível de expressão do gene MDRi variaamplamente através de linhagens de célula derivadas de câncer diferentes, emalgumas linhagens de célula é indetectável, ao passo que em outras podemmostra até uma expressão 10 ou 100 vezes aumentada em relação aoscontroles padrão.

Portanto, um outro aspecto da invenção fornece o uso de umderivado de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção no tratamento de cânceresde MDR ou malignidades de célula B. Em um aspecto específico a presenteinvenção fornece o uso de derivados de 39-desmetóxi-rapamicina notratamento de cânceres que expressam P-gp ou malignidades de célula B. Emuma forma de realização ainda mais preferida a presente invenção fornece ouso de um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção no tratamentode cânceres que expressam P-gp alta ou malignidades de célula B.Particularmente, os cânceres que expressam P-gp alta ou malignidades decélula B podem ter a expressão 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes,50 vezes ou 100 vezes aumentada em relação aos níveis de controle. Oscontroles adequados são células que não expressam P-gp, que tenham umnível de expressão baixo de P-gp ou que tenham função de MDR baixa, umapessoa de habilidade na técnica está ciente de ou pode identificar taislinhagens de célula; por via de exemplo (mas sem limitação) as linhagens decélula adequadas incluem: MDA435/LCC6, SBC-3/CDDP, MCF7, NCI-H23,NCI-H522, A549/ATCC, EKVX, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, HOP-18, HOP-92, LXFL 529, DMS 114, DMS 273, HT29, HCC-2998, HCT-116,COLO 205, KM12, KM20L2, MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T-47D, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, IGROVI,SK-OV-3, K-562, MOLT-4, HL-60(TB), RPMI-8226, SR, SN12C, RXF-631,786-0, TK-10, LOX IMVI, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, M14, UACC-62, UACC-257, PC-3, DU-145, SNB-19, SNB-75, SNB-78,0251, SF-268, SF-539, XF 498.

Em um aspecto alternativo a presente invenção fornece o usode um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção na preparação deum medicamento para o uso no tratamento de cânceres de MDR oumalignidades de célula B. Em um aspecto específico a presente invençãofornece o uso de um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção napreparação de um medicamento para o uso no tratamento de cânceres queexpressam P-gp ou malignidades de célula B. Em um forma de realizaçãoainda mis preferida a presente invenção fornece o uso de um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina na preparação de um medicamento para o uso notratamento de cânceres que expressam P-gp alto ou malignidades de célula B.Particularmente, os cânceres que expressam P-gp alto ou malignidades decélula B podem ter a expressão 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes,50 vezes ou 100 vezes aumentada em relação aos níveis de controle. Oscontroles adequados são descritos acima.

Os métodos for determinar o nível de expressão de P-gp emuma amostra são ainda debatidos aqui.

Portanto, em um outro aspecto a presente invenção fornece ummétodo para o tratamento de cânceres que expressam P-gp ou malignidadesde célula B compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção. O nível deexpressão de glicoproteína P (P-gp) em um tipo de câncer particular pode serdeterminado por uma pessoa de habilidade na técnica usando técnicasincluindo mas não limitadas à RT-PCR em tempo real (Szakâcs et al, 2004;Stein et al, 2002; Langmann et ai; 2003, Alvarez et ai, 1995, Boyd et al,1995), pela imunoistoquímica (Stein et al, 2002) ou usando microsséries (Leeet al, 2003), estes métodos são fornecidos apenas como exemplos, outrosmétodos adequados ocorrerão a uma pessoa de habilidade na técnica.Uma pessoa habilitada na técnica pode ser capaz pelaexperimentação de rotina determinar a capacidade destes compostos parainibir o crescimento fungico (por exemplo, Baker, H., et ai, 1978; NCCLSReference method for broth dilution antifungal susceptibility testing foryeasts: Approved standard M27-A, 17(9), 1997). Adicionalmente, uma pessoahabilitada na técnica pode ser capaz pela experimentação de rotina determinara capacidade destes compostos para inibir o crescimento de célula de tumor,(ver Dudkin, L., et ai, 2001; Yu et ai, 2001). Em um outro aspecto oscompostos desta invenção são úteis para induzir a imunossupressão, osensaios para determinar uma eficácia do composto nestas áreas são bemconhecidos por aqueles de habilidade na técnica, por exemplo mas semlimitação: Imunossupressor activity - Warner, L. M., et ai, 1992, Kahan etal, (1991) & Kahan & Camardo, 2001); Allografts - Fishbein, T. M., et ai,2002, Kirchner et ai.. 2000; Autoimmune / Inflammatory / Asthma - Carlson,R. P. et ai, 1993, Powell, N. et ai, 2001; Diabetes I - Rabinovitch, A. et ai,2002; Psoriasis - Reitamo, S. et ai, 2001; Rheumatoid Artritis - Foey, A., etai, 2002; Fibrosis - Zhu, J. et ai, 1999, Jain, S., et ai, 2001, Gregory et ai.1993.

A capacidade dos derivados de 39-desmetóxi-rapamicina dainvenção para induzir a imunossupressão pode ser demonstrada em testespadrão usados para este propósito. Em um outro aspecto os derivados de 39-desmetóxi-rapamicina desta invenção são úteis em relação aos mecanismosantifibróticos, neuro-regenerativos e anti-angiogênicos, uma pessoa habilitadana técnica pode ser capaz pela experimentação de rotina determinar acapacidade destes compostos para prevenir a angiogênese (por exemplo,Guba, M., et ai, 2002). Uma pessoa de habilidade na técnica pode ser capazpela experimentação de rotina determinar a utilidade estes compostos paratratar doença hiperproliferativa vascular, por exemplo em sondas de eluiçãode medicamento (por exemplo, Morice, M. C, et ai, 2002). Adicionalmente,uma pessoa de habilidade na técnica pode ser capaz pela experimentação derotina determinar a capacidade neurorregenerativa destes compostos (porexemplo, Myckatyn, T. M., et al, 2002, Steiner et al, 1997).

A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina dainvenção, junto com um carreador farmaceuticamente aceitável.

A rapamicina e os compostos relacionados que estão ouestavam em testes clínicos, tais como CCI-779 e RAD001 têm perfisfarmacológicos deficientes, solubilidade deficiente em água e biodisponibilidade deficiente. A presente invenção fornece derivados de 39-desmetóxi-rapamicina que têm propriedades melhoradas tais comoestabilidade melhorada e/ou permeabilidade de membrana celular aumentada.Uma pessoa de habilidade na técnica será capaz de determinar facilmente asolubilidade de um dado composto da invenção usando métodos padrão. Um método representativo é mostrado nos exemplos aqui.

Adicionalmente, uma pessoa de habilidade na técnica serácapaz de determinar as farmacocinéticas e biodisponibilidade de umcomposto da invenção usando métodos in vivo e in vitro conhecidos por umapessoa de habilidade na técnica, incluindo mas não limitado àqueles descritosabaixo e nos exemplos, os ensaios alternativos são bem conhecidos por umapessoa de habilidade na técnica incluindo mas não limitado àqueles descritosabaixo e em Gallant-Haidner et al, 2000 e Trepanier et al, 1998 e referênciasnestes. A biodisponibilidade de um composto é determinada por váriosfatores, (por exemplo, solubilidade em água, taxa de absorção no intestino, ograu de ligação e metabolismo de proteína) cada um dos quais pode serdeterminado pelos testes in vitro como descritos abaixo, será avaliado poruma pessoa de habilidade na técnica que uma melhora em um ou mais destesfatores levará a uma melhora na biodisponibilidade de um composto.Alternativamente, a biodisponibilidade de um composto pode ser medidausando métodos in vivo como descritos em mais detalhes abaixo.Ensaio de permeação de Caco-2

Células Caco-2 confluentes (Li, A. P., 1992; Grass, G. M., etai, 1992, Volpe, D. A., et ai, 2001) em um formato Corning CostarTranswell de 24 reservatórios podem ser usadas, por exemplo, comofornecidas pela In Vitro Technologies Inc. (IVT Inc., Baltimore, Mariland,USA). A câmara apical contém 0,15 ml de solução tampão balanceada deHank (HBBS) pH 7,4, 1 % de DMSO, 0,1 mM de Amarelo Lúcifer. A câmarabasal contém 0,6 ml de HBBS pH 7,4, 1 % de DMSO. Os controles e testes são depois incubados a 37°C em um incubador umidificado e agitado a 130rpm por 1 hora. O Amarelo de Lúcifer permeia apenas por intermédio da viaparacelular (entre as junções firmes), uma Permeabilidade Aparente (Papp)alta para o Amarelo de Lúcifer indica dano celular durante o ensaio e todos detais reservatórios foram rejeitados. Propranolol (boa permeação passiva semnenhum efeito transportador conhecido) & acebutalol (permeação passivadeficiente atenuado pelo efluxo ativo pela P-glicoproteína) são usados comocompostos de referência. Os compostos podem ser testados em um formatouni- e bi-direcional pela aplicação de composto às câmaras apical ou basal (a0,01 mM). Os compostos nas câmaras apical ou basal são analisados pelaHPLC-MS. Os resultados são expressados como Permeabilidade Aparente,Papp, (nm/s) e como a Razão de Fluxo (A para B versus B para A).

<formula>formula see original document page 32</formula>

Volume de Aceitador: 0,6 ml (A > B) e 0,15 ml (B > A)Área da monocamada: 0,33 cm2Atempo: 60 min

Um valor positivo para a Razão de Fluxo indica efluxo ativo apartir da superfície apical das células.

Ensaio de estabilidade de Microssoma Hepático Humano I (HLM)

Homogenados hepáticos fornecem uma medida de umavulnerabilidade inerente dos compostos às enzimas de Fase I (oxidativa),incluindo CYP450s (por exemplo, CYP2C8, CYP2D6, CYP1A, CYP3A4,CYP2E1), esterases, amidases e monooxigenases de flavina (FMOs).

A meia vida (Tl/2) de compostos de teste podem serdeterminadas, na exposição aos Microssomas hepáticos humanos, pelamonitoração do seu desaparecimento com o tempo pela LC-MS. Oscompostos a 0,001 mM são incubados por 40 min a 37°C, 0,1 M Tris-HCl,pH 7,4 com fração sub-celular microssômica humana de fígado a 0,25 mg/mlde proteína e níveis de saturação de NADPH como co-fator. Em intervalos detempo, acetonitrila é adicionada às amostras de teste para precipitar a proteínae deter o metabolismo. As amostras são centrifugadas e analisadas quanto aocomposto precursor pela HPLC-MS.

Ensaios de biodisponibilidade in vivo

Os ensaios in vivo também podem ser usados para medir abiodisponibilidade de um composto (ver por exemplo, Crowe et al., 1999).No geral, um composto é administrado a um animal de teste (por exemplo,camundongo ou rato) tanto intraperitonealmente (i.p.) ou intravenosamente(i.v.) quanto oralmente (p.o.) e amostras de sangue são tomadas em intervalosregulares para examinar como a concentração de plasma do medicamentovaria com o tempo. O curso de tempo da concentração plasmática com otempo pode ser usado para calcular a biodisponibilidade absoluta docomposto como uma porcentagem usando modelos padrão. Um exemplo deum protocolo típico é descrito abaixo.

Os camundongos são dosados com 3 mg/kg do composto dainvenção ou do composto precursor i.v. ou 10 mg/kg de um composto dainvenção do composto precursor p.o. As amostras de sangue são tiradas emintervalos de 5 minutos, 15 minutos, 1 h, 4 h e 24 h e a concentração docomposto da invenção ou composto precursor na amostra é determinada porintermédio da HPLC. O curso de tempo de concentrações plasmáticas podemser depois usadas para derivar parâmetros chave tais como a área sob a curvaconcentração plasmática-tempo (AUC - que é diretamente proporcional àquantidade total de medicamento não mudado que atinge a circulaçãosistêmica), a concentração de medicamento plasmática máxima (pico), otempo no qual a concentração de medicamento plasmática máxima ocorre(tempo de pico), fatores adicionais que são usados na determinação exata dabiodisponibilidade incluem: a meia vida terminal do composto, a depuraçãodo corpo total, volume de estado constante de distribuição e F %. Estesparâmetros são depois analisados pelos métodos não compartimentais oucompartimentais para dar uma biodisponibilidade porcentual calculada, paraum exemplo deste tipo de método ver Gallant-Haidner et al., 2000 e Trepanieret al, 1998 e referências nestes.

Os derivados de 39-desmetóxi-rapamicina anteriormentemencionados da invenção ou uma formulação destes podem ser administradospor qualquer método convencional por exemplo mas sem limitação elespodem ser administrados parenteral, oral, topicamente (incluindo bucal,sublingual ou transdérmica), por intermédio de um dispositivo médico (porexemplo, uma sonda), pela inalação ou por intermédio de injeção (subcutâneaou intramuscular). O tratamento pode consistir de uma dose única ou umapluralidade de doses em um período de tempo.

Embora seja possível para um composto da invenção seradministrado sozinho, é preferível apresentá-lo como uma formulaçãofarmacêutica, junto com um ou mais carreadores aceitáveis. O(s)carreador(es) deve(m) ser "aceitável(is)" no sentido de ser(em) compatível(is)com o composto da invenção e não deletério aos seus receptores. Osexemplos de carreadores adequados são descritos em mais detalhes abaixo.

Os derivados de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção podemser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentesterapêuticos, a co-administração de dois (ou mais) agentes possibilitam quedoses significantemente mais baixa de cada um sejam usadas, reduzindo destemodo os efeitos colaterais observados.

Em uma forma de realização, um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina é co-administrado com um outro agente terapêutico para a induçãoou manutenção da imunossupressão, para o tratamento de rejeição atransplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes oudoenças de inflamação, os agentes preferidos incluem, mas não são limitadosa, agentes imunorregulatórios por exemplo, azatioprina, corticosteróides,ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, Micofenolato Mofetila, OKT-3 eATG.

Em uma forma de realização alternativa, um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina é co-administrado com um outro agente terapêuticopara o tratamento de câncer ou malignidades de célula B, os agentespreferidos incluem, mas não são limitados a, metotrexato, leucovorin,adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracila,paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorrelbina, doxorubicina,tamoxifen, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpomonoclonal anti-HER2 (por exemplo, Herceptin®), capecitabina, cloridreto deraloxifeno, inibidores de EGFR (por exemplo, Iressa®, Tarceva®, Erbitux®),inibidores de VEGF (por exemplo, Avastin®), inibidores de proteassoma (porexemplo, Velcade®), Glivec® ou inibidores de hsp90 (por exemplo, 17-AAG).Adicionalmente, um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina pode seradministrado em combinação com outras terapias incluindo, mas não limitadoa, raditerapia ou cirurgia.

Em uma forma de realização, um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina é co-administrado com um outro agente terapêutico para otratamento de doença vascular, os agentes preferidos incluem, mas não sãolimitados a, inibidores de ACE, antagonistas do receptor de angiotensina II,derivados do ácido fíbrico, inibidores da FDVIGCoA redutase, agentesbloqueadores beta adrenérgicos, bloqueadores do canal de cálcio,antioxidantes, anticoagulantes e inibidores de plaqueta (por exemplo,Plavix®).

Em uma forma de realização, um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina é co-administrado com um outro agente terapêutico para aestimulação da regeneração neuronal, os agentes preferidos incluem, mas nãosão limitados a, fatores neurotróficos por exemplo, fator de crescimento denervo, fator de crescimento derivado de glial, fator de crescimento derivadode cérebro, fator neurotrófico ciliar e neurotrofina-3.

Em uma forma de realização, um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina é co-administrado com um outro agente terapêutico para otratamento de infecções fungicas; os agentes preferidos incluem, mas não sãolimitados a, anfotericina B, flucitosina, equinocandinas (por exemplo,caspofungina, anidulafungina ou micafungina), griseofulvina, um agenteantifungico de imidazol ou um de triazol (por exemplo, clotrimazol,miconazol, cetoconazol, econazol, butoconazol, oxiconazol, terconazol,itraconazol, fluconazol ou voriconazol).

Pela co-administração é incluído qualquer meio de liberar doisou mais agentes terapêuticos ao paciente como parte do mesmo regime detratamento, como estará evidente à pessoa habilitada. Embora os dois ou maisagentes possam ser administrados simultaneamente em uma única formulaçãoisto não é essencial. Os agentes podem ser administrados em formulaçõesdiferentes e em tempos diferentes.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas naforma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dosmétodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Tais métodos incluem aetapa de levar em associação o ingrediente ativo (composto da invenção) como carreador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. No geral asformulações são preparadas levando-se uniforme e intimamente emassociação o ingrediente ativo com carreadores líquidos ou carreadoressólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, dar forma aoproduto.

Os derivados de 39-desmetóxi-rapamicina da invençãonormalmente serão administrados oralmente ou por qualquer via parenteral,na forma de uma formulação farmacêutica compreendendo o ingredienteativo, opcionalmente na forma de um sal de adição de ácido ou base, orgânicoou inorgânico, não tóxico, em uma forma de dosagem farmaceuticamenteaceitável. Dependendo do distúrbio e do paciente a ser tratado, assim como da via de administração, as composições podem ser administradas em dosesvariáveis.

Por exemplo, os compostos da invenção podem seradministrados oral, bucal ou sublingualmente na forma de tabletes, cápsulas,óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes flavorizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, demorada oucontrolada.

As soluções ou suspensões de derivados de 39-desmetóxi-rapamicina adequadas para a administração oral também podem conterexcipientes por exemplo, N,N-dimetilacetamida, dispersantes por exemplo,polissorbato 80, tensoativos, e solubilisadores, por exemplo, polietilenoglicol, Phosal 50 PG (que consiste de fosfatidilcolina, ácidos graxos de soja,etanol, mono/diglicerídeos, propileno glicol e palmitato de ascorbila).

Tais tabletes podem conter excipientes tais como celulosemicrocristalina, lactose (por exemplo, lactose monoidratada ou lactose anidra), citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico eglicina, desintegrantes tais como amido (preferivelmente amido de milho,batata ou tapioca), amido glicolato de sódio, croscarmelose sódica e certossilicatos complexos, e aglutinantes de granulação tais comopolivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidróxi-propilcelulose (HPC), macrogol 8000, sacarose, gelatina e acácia.Adicionalmente, agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácidoesteárico, beenato de glicerila e talco podem ser incluídos.

As composições sólidas de um tipo similar também podem serutilizadas como cargas em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferidos aeste respeito incluem lactose, amido, uma celulose, lactose ou polietilenoglicóis de peso molecular alto. Para as suspensões aquosas e/ou elixires, oscompostos da invenção podem ser combinados com vários agentes adoçantesou flavorizantes, matéria corante ou pigmentos, com agentes de emulsificaçãoe/ou suspensão e com diluentes tais como água, etanol, propileno glicol eglicerina, e combinações destes.

Um tablete pode ser fabricado pela compressão ou moldagem,opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os tabletescomprimidos podem ser preparados pela compressão em uma máquinaadequada do ingrediente ativo em uma forma de fluxo livre tal como um póou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante (por exemplo,povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte,conservante, desintegrante (por exemplo, amido glicolato de sódio, povidonareticulada, carboximetil celulose sódica reticulada), agente ativo na superfícieou dispersante. Os tabletes moldados podem ser fabricados pela moldagemem uma máquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecidocom um diluente líquido inerte. Os tabletes podem ser opcionalmenterevestidos ou marcados e podem ser formulados de modo a fornecer liberaçãolenta ou controlada do ingrediente ativo neles usando, por exemplo,hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para fornecer o perfil deliberação desejado.

As formulações de acordo com a presente invenção adequadaspara a administração oral podem ser apresentadas como unidades separadastais como cápsulas, comprimidos ou tabletes, cada uma contendo umaquantidade pré determinada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos;como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquidonão aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsãolíquida de água em óleo. O ingrediente ativo também pode ser apresentadocomo um bolo, electuário ou pasta.

As formulações adequadas para a administração tópica na bocaincluem comprimidos compreendendo o ingrediente ativo em uma basearomatizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhascompreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina eglicerina, ou sacarose e acácia; e enxágües bucais compreendendo oingrediente ativo em um carreador líquido adequado.

Deve ser entendido que além dos ingredientes particularmentemencionados acima as formulações desta invenção podem incluir outrosagentes convencionais na técnica considerando-se o tipo da formulação emquestão, por exemplo aqueles adequados para a administração oral podemincluir agentes flavorizantes.

As composições farmacêuticas adaptadas para a administraçãotópica podem ser formuladas como ungüentos, cremes, suspensões, loções,pós, soluções, pastas, géis, curativos impregnados, pulverizações, aerossóis ouóleos, dispositivos transdérmicos, pós de empoamento, e outros. Estascomposições podem ser preparadas por intermédio de métodos convencionaiscontendo o agente ativo. Assim, estes também podem compreendercarreadores e aditivos convencionais compatíveis, tais como conservantes,solventes para ajudar na penetração de medicamento, emoliente em cremes ouungüentos e etanol ou álcool oleílico para loções. Tais carreadores podemestar presentes como de cerca de 1 % até cerca de 98 % da composição. Maisusualmente estes formarão até cerca de 80 % da composição. Apenas comouma ilustração, um creme ou ungüento é preparado misturando-sequantidades suficientes de material hidrofilico e água, contendo de cerca de 5a 10 % em peso do composto, em quantidades suficientes para produzir umcreme ou ungüento tendo a consistência desejada.

As composições farmacêuticas adaptadas para a administraçãotransdérmica podem ser apresentadas como emplastros separadosintencionados para permanecer em contato íntimo com a epiderme do receptorpor um período prolongado de tempo. Por exemplo, o agente ativo pode serliberado do emplastro pela iontoforese.

Para aplicações aos tecidos externos, por exemplo à boca epele, as composições são preferivelmente aplicadas como um ungüento oucreme tópicos. Quando formulado em um ungüento, o agente ativo podem serutilizado com uma base de ungüento parafínica ou uma miscível em água.

Alternativamente, o agente ativo pode ser formulado em umcreme com uma base de creme de óleo em água ou uma base de água em óleo.

Para a administração parenteral, as formas de dosagem unitáriafluida são preparadas utilizando o ingrediente ativo e um veículo estéril, porexemplo mas sem limitação água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, aágua sendo preferida. O ingrediente ativo, dependendo do veículo econcentração usados, pode ser colocado em suspensão ou dissolvido noveículo. Na preparação de soluções, o ingrediente ativo pode ser dissolvidoem água para injeção e esterilizada em filtro antes do enchimento em umfrasco ou ampola adequados e selagem.

Vantajosamente, agentes tais como anestésicos locais,conservantes e agentes de tamponização podem ser dissolvidos no veículo.Para realçar a estabilidade, a composição pode ser congelada depois de encherno frasco e a água removida sob vácuo. O pó liofilizado seco é depois seladono frasco e um frasco associado de água para injeção pode ser fornecido parareconstituir o líquido antes do uso.

As suspensões parenterais são preparadas substancialmente damesma maneira como as soluções, exceto que o ingrediente ativo é colocadoem suspensão no veículo ao invés de ser dissolvido e a esterilização não pode ser realizada pela filtração. O ingrediente ativo pode ser esterilizado pela exposição ao oxido de etileno antes de colocar em suspensão no veículo estéril. Vantajosamente, um tensoativo ou agente de umectação são incluídos na composição para facilitar a distribuição uniforme do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção também podem ser administrados usando dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma forma de realização, uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica isento de agulha, tal como os dispositivos divulgados na U.S. 5.399.163; U.S. 5.383.851; U.S. 5.312.335; U.S. 5.064.413; U.S. 4.941.880; U.S. 4.790.824; ou U.S. 4.596.556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: a US 4.487.603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; a US 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; a US 4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; a US 4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a liberação de medicamento contínua; a US 4.439.196, que divulga um sistema de liberação de medicamento osmótico tendo compartimentos de câmara múltipla; e a US 4.475.196, que divulga um sistema de liberação de medicamento osmótico. Em uma forma de realização específica o derivado de 39-desmetóxi-rapamicina pode ser administrado usando uma sonda de eluição de medicamento, por exemplo que corresponda àquela descrita na WO 01/87263 e publicações relacionadas ou aquela descrita por Perin (Perin, EC, 2005). Muitos outros de tais implantes, sistemas de liberação, e módulos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

A dosagem a ser administrada de um derivado de 39-desmetóxi-rapamicina da invenção variará de acordo com o compostoparticular, as doenças envolvidas, o paciente, e a natureza e severidade dadoença e a condição física do paciente, e a via selecionada de administração.

A dosagem apropriada pode ser facilmente determinada por uma pessoahabilitada na técnica.

As composições podem conter de 0,1 % empeso, prefenvelmente de 5 a 60 %, mais prefenvelmente de 10 a 30 %em peso, de um composto da invenção, dependendo do método deadministração.

Será reconhecido por uma pessoa de habilidade na técnica quea quantidade ótima e o espaçamento de dosagens individuais de um compostoda invenção serão determinados pela natureza e extensão da condição que étratada, da forma, via e local de administração, e da idade e condição dopaciente particular que é tratado, e que um médico por fim determinará asapropriadas a serem usadas. Esta dosagem podem ser repetida tãofreqüentemente quanto apropriado. Se efeitos colaterais se desenvolvem aquantidade e/ou freqüência da dosagem podem ser alteradas ou reduzidas, deacordo com a prática clínica normal.

Descrição Resumida dos Desenhos

Figura 1: mostra a estrutura da rapamicina

Figura 2: mostra o trajeto da fragmentação para a 39-desmetóxi-rapamicina

Figura 3: mostra o trajeto da fragmentação para a 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]rapamicina.

Figura 4: mostra o trajeto da fragmentação para 39-desmetóxi-40-O-[2-hidroxietil 3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato] rapamicina

Figura 5: mostra o trajeto da fragmentação para 27-0-desmetil-39-desmetóxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)propionil] rapamicina

Figura 6: mostra a atividade inibidora de mTOR da 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]rapamicina (A - triânguloscheios) e 39-desmetóxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina (B - triânguloscheios) comparadas com a rapamicina (quadrados cheios).

EXEMPLOS

Métodos Gerais e Materiais

Materiais

Todos os reagentes foram obtidos a partir de fontescomerciais, e usados sem outra purificação a menos que de outro modoestabelecido.

Cultura

S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] (WO 04/007709;Gregory et ai., 2004) foi mantido em placas de ágar com meio 1 (ver abaixo)a 28°C. Os estoques de esporo foram preparados depois do cultivo em meio 1,preservados em 20 % p/v de glicerol:10 % p/v de lactose em água destilada earmazenados a -80°C. As culturas vegetativas foram preparadas pela inoculaçãode 0,1 ml de estoque congelado em 50 ml de meio 2 (ver abaixo) em frasco de250 ml. A cultura foi incubada por 36 a 48 horas a 28°C, 300 rpm.

Método de Produção:

As culturas vegetativas foram inoculadas de 2,5 a 5 % v/v emmeio 3. O cultivo foi realizado por 6 a 7 dias, 26°C, 300 rpm.

Procedimento de alimentação:

A alimentação/adição do ácido carboxílico selecionado foirealizada 24 a 48 horas depois da inoculação e foi alimentado de 1 a 2 mM amenos que de outro modo estabelecido.

Meio 1:

<table>table see original document page 43</column></row><table>Os meios foram depois esterilizados pela autoclavagem a121°C, 20 min.

Meio 2: Meio de semente RapV7

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Os meios foram depois esterilizados pela autoclavagem a121°C,20min.

Depois da esterilização 0,16 ml de glicose a 40 % é adicionadoa cada 7 ml de meio.

Meio 3: Meio MD6 (Meio de Fermentação)

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Antes da esterilização 0,4 ml de ot-amilase Sigma (BAN 250)foi adicionada a 1 L de meio. O meio foi esterilizado por 20 min a 121°C.

Depois da esterilização 0,35 ml de frutose a 40 % estéril e 0,10ml de L-lisina (140 mg/ml em água, esterilizada em filtro) foi adicionada acada 7 ml.Meio 4: Meio de semente RapV7a

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Os meios foram depois esterilizados pela autoclavagem a121 °C, 20 min.

Meio 5: Meio MD6/5-1 (Meio de Fermentação) _

<table>table see original document page 45</column></row><table>

O meio foi esterilizado por 30 min a 121°C.

Depois da esterilização 15 g de Frutose por L foramadicionados. Depois de 48 h 0,5 g/L de L-lisina foi adicionado.

Métodos Analíticos

Método A

Volume de injeção: 0,005 a 0,1 ml (como requeridodependendo da sensibilidade). A HPLC foi realizada em cartuchos"Spherisorb" "Resolução Rápida" SB C8 da Agilent, 3 mícrons, 30 mm x 2,1mm, conduzindo uma fase móvel de:

Fase móvel A: 0,01 % de Ácido fórmico em água puraFase móvel B: 0,01 % de Ácido fórmico em AcetonitrilaVazão: 1 ml/minuto.

Gradiente linear foi usado, de 5 % de B a 0 min a95 % de B a 2,5 min mantendo a 95 % de B até 4 min retornando a5 % de B até o ciclo seguinte. A detecção foi pela absorbância em UV a254 nm e/ou pela ionização de eletropulverização da espectrometria demassa (positivo ou negativo) usando um instrumento Micromass Quattro-Micro.

Método B

Volume de injeção: 0,02 ml. A HPLC foi realizada em colunaBDS Cl8 Hypersil de 3 mícrons (ThermoHypersil-Keystone Ltd), 150 x 4,6mm, mantida a 50°C, conduzindo uma fase móvel de:

Fase móvel A: Acetonitrila (100 ml), ácido trifluoracético (1ml), acetato de amônio 1 M (10 ml) feito até 1 L com água deionizada.

Fase móvel B: Água deionizada (100 ml), ácidotrifluoracético (1 ml), acetato de amônio 1 M (10 ml) feito até 1 L comacetonitrila.

Vazão 1 ml/minuto.

Um gradiente linear de 55 % de B a 95 % de B foi usado emminutos, seguido por 2 minutos a 95 % de B, 0,5 minuto a 55 % de B e umadicional de 2,5 minutos a 55 % de B. A detecção de composto foi pelaAbsorbância em UV a 280 nm.

Método C

O sistema de HPLC compreendeu um Agilent HP1100 e foirealizado em coluna BDS Cl8 Hypersil de 3 mícrons (ThermoHypersil-Keystone Ltd), 150 x 4,6 mm, mantido a 40°C, conduzindo uma fase móvelde:

Fase móvel A: água deionizada.Fase móvel B: acetonitrila.Vazão 1 ml/minuto.O sistema foi ligado a um espectrômetro de massa deeletropulverização Bruker Daltonics Esquire3000. A mudança depositive negativo foi usada em uma faixa de varredura de 500 a 1000Daltons.

Um gradiente linear de 55 % de B a 95 % de B foi usado em10 minutos, seguido por 2 minutos a 95 % de B, 0,5 minutos a 55 % de B eum adicional de 2,5 minutos a 55 % de B.

Métodos Sintéticos

Todas as reações foram realizadas sob condições anidras amenos que de outro modo estabelecido usando solventes secoscomercialmente disponíveis. As reações foram monitoradas pela LC-UV-MS,em uma HPLC Agilent 1100 ligada a um espectrômetro de massa BrukerDattonics Esquire3000+ equipado com uma fonte de eletropulverização. Aseparação foi obtida em uma coluna Phenomenex Hyperclone, BDS Cig 3 jj,(150 x 4,6 mm) a 1 ml/min, com um gradiente linear de água:acetonitrila v:v30:70 a 100 % de acetonitrila em 10 min seguida por um período isocratico de5 min a 100 % de acetonitrila.

Os espectros de RMN foram registrados em cdci3 e asmudanças químicas 5H e ôc são aludidas ao solvente (7,26 ppm e 77,0 ppm respectivamente). Visto que a 39-desmetóxi-rapamicina e seus derivadosexistem como uma mistura de confôrmeros todas as designaçõescorrespondem apenas ao confôrmero principal.

Bioensaio in vitro quanto a atividade anticâncer

A avaliação in vitro de compostos quanto a atividadeanticâncer em um painel de 12 linhagens de célula de tumor humano em umensaio de proliferação de monocamada foi realizado na Oncotest TestingFacility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg. Ascaracterísticas das 12 linhagens de célula selecionadas estão resumidas naTabela 1.Tabela 1 Linhagens de célula de teste

<table>table see original document page 48</column></row><table>

As linhagens de célula da Oncotest foram estabelecidas a partirde xenoenxertos de tumor humano como descrito por Roth et ai. 1999. Aorigem dos xenoenxertos de doador foi descrita por Fiebig et al.. 1999. Outraslinhagens de célula foram obtidas da NCI (H460, SF-268, OVCAR-3, DU145,MDA-MB-231, MDA-MB-468) ou adquiridas da DSMZ, Braunschweig,Alemanha (LNCAP).

Todas as linhagens de célula, a menos que de outro modoespecificado, são cultivadas a 37°C em um atmosfera umidificada (95 % dear, 5 % de C02) em um meio de 'mistura pronta' contendo meio RPMI 1640,10 % de soro de bezerro fetal, e 0,1 mg/ml de gentamicina (PAA, Cõlbe,Alemanha).

Ensaio de Monocamada - descrição resumida do protocolo 1:

Um ensaio de iodeto de propídio modificado foi usado paraavaliar os efeitos do(s) composto(s) de teste sobre o crescimento de dozelinhagens de célula de tumor humano (Dengler et ai, (1995)).

Em resumo, as células foram colhidas a partir de culturas defase exponenciais pela tripsinização, contadas e plaqueadas em placas demicrotítulo de fundo chato de 96 reservatórios a uma densidade de céluladependente da linhagem de célula (5 a 10.000 células viáveis/reservatório).

Depois de 24 h de recuperação para permitir que as células reassumam ocrescimento exponencial, 0,01 ml de meio de cultura (6 reservatórios decontrole por placa) ou meio de cultura contendo macbecin são adicionadosaos reservatórios. Cada concentração é plaqueada em triplicata. Os compostossão aplicados em duas concentrações (0,001 uM e 0,01 uM). A seguir de 4dias de exposição contínua, o meio de cultura de célula com ou sem compostode teste é substituído por 0,2 ml de uma solução de iodeto de propídio aquosa(PI) (7 mg/L). Para medir a proporção de células vivas, as células sãopermeabilizadas pelo congelamento das placas. Depois de descongelar asplacas, a fluorescência é medida usando a leitora de placa Cytofluor 4000(excitação 530 nm, emissão 620 nm), dando uma relação direta ao númerototal de células viáveis.

A inibição do crescimento é expressada como tratado/controlex 100 (% T/C). Para os compostos ativos, os valores de IC50 & IC70 foramestimados pela plotagem da concentração de composto versus a viabilidade dacélula.

Exemplo 1. Fermentação e isolação de 39-desmetóxi-rapamicina

A 39-desmetóxi-rapamicina foi produzida pelo cultivo deculturas de S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] e alimentando comácido cicloexanocarboxílico (CHCA) como descrito abaixo.

Cultura Líquida

Uma cultura vegetativa de S. hygroscopicus MG2-10[IJMNOQLhis] foi cultivada como descrito em Materiais & Métodos. Asculturas de produção foram inoculadas com a cultura vegetativa a 0,5 ml em 7ml de meio 3 em tubos de 50 ml. O cultivo foi realizado por 7 dias, 26°C, 300rpm. Amostras de um mililitro foram extraídas em acetonitrila 1:1 comagitação por 30 min, centrifugadas 10 min, 13.000 rpm e analisadas equantificadas de acordo com o método de análise B (ver Materiais &Métodos). A confirmação do produto foi determinada pela espectrometria demassa usando o Método de análise C (ver Materiais & Métodos).

O análogo de rapamicina observado foi proposto ser a 39-desmetóxi-rapamicina desejada com base nos dados analíticos debatido sob acaracterização abaixo.

Fermentação

Uma cultura vegetativa primária em Meio 4 de S.hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] foi cultivada essencialmente comodescrito em Materiais & Métodos. Uma cultura vegetativa secundária emMeio 4 foi inoculada a 10 % v/v, 28°C, 250 rpm, por 24 horas. As culturasvegetativas foram inoculadas a 5 % v/v em meio 5 (ver Materiais & Métodos)em um fermentador de 20 L. O cultivo foi realizado por 6 dias a 26°C, 0,5 wm. > 30 % de oxigênio dissolvido foram mantidos pela alteração davelocidade da ponta rotativa, velocidade da ponta mínima de 1,18 ms"1velocidade da ponta máxima de 2,75 ms"1. A alimentação do ácidocicloexanocarboxílico foi realizada em 24 e 48 horas depois da inoculaçãopara dar uma concentração final de 2 mM.

Extração e Purificação

O caldo de fermentação (30 L) foi agitado com um volumeigual de metanol por 2 horas e depois centrifugado para pelotizar as células(10 min, 3500 rpm). O sobrenadante foi agitado com resina Diaion® HP20 (43g/L) por 1 hora e depois filtrados. A resina foi lavada por batelada comacetona para retirar o análogo de rapamicina e o solvente foi removido avácuo. O concentrado aquoso foi depois diluído a 2 L com água e extraídocom acetato de etila (3x2 L). O solvente foi removido a vácuo para dar umóleo marrom (20,5 g).

O extrato foi dissolvido em acetona, secado em sílica, aplicadoa uma coluna de sílica (6 x 6,5 cm de diâmetro) e eluído com um gradienteescalonado de acetona/hexano (20 % a 40 %). As frações contendo o análogode rapamicina foram reunidas e o solvente removido a vácuo. O resíduo (2,6g) foi ainda submetido à cromatografia (em três lotes) em Sephadex LH20,eluindo com 10:10:1 clorofórmio/heptano/ etanol. O análogo de rapamicinasemipurificado (1,7 g) foi purificado pela HPLC preparativa de fase reversa(Cl8) usando um Gilson HPLC, eluindo em uma coluna Phenomenex 21,2 x250 mm Luna 5 fim C18 BDS com 21 ml/min de 65 % de acetonitrila/água. Asfrações mais puras (identificadas pela HPLC analítica, Método B) foramcombinadas e o solvente removido a vácuo para dar a 39-desmetóxi-rapamicina (563 mg).

Caracterização

O espectro de !H RMN da 39-desmetóxi-rapamicina foiequivalente àquele de um padrão (P. Lowden, Ph. D. Dissertation, Universityof Cambridge, 1997). ,3C-RMN (125 MHz), Oc (ppm): 215,75, 208,27,169,19, 166,71, 140,13, 135,94, 133,61, 130,10, 129,62, 126,80, 126,33,98,42, 84,77, 84,37, 75,85, 70,91, 67,10, 59,44, 55,82, 51,21, 46,50, 44,17,41,39, 40,70, 40,16, 38,74, 38,37, 35,44, 35,26, 35,08, 33,78, 33,64, 33,04,32,37, 31,22, 30,41, 27,24, 27,02, 25,27, 21,48, 20,58, 16,24, 15,95, 15,78,13,74, 13,00, 10,12.

As análises de LCMS e LCMS" de extratos de culturamostraram que a razão m/z para o novo análogo de rapamicina é 30 unidadesde massa atômica mais baixo do que para a rapamicina, compatível com aausência de um grupo metóxi. íons observados: [M-H]" 882,3, [M+NH4]+901,4, [M+Na]+ 906,2, [M+K]+ 922,2. A fragmentação do aduto de sódio deuos íons prognosticados para 39desmetóxi-rapamicina seguindo um trajeto defragmentação anteriormente identificado (Figura 2) (J. A. Reather, Ph. D.Dissertation, University of Cambridge, 2000). Estes dados de fragmentaçãopela espectrometria de massa estreita a região dos novos análogos derapamicina onde a perda de um metóxi ocorreu para o fragmento C28-C42que contém a porção cicloexila. Estes dados de fragmentação daespectroscopia de massa está totalmente compatível com a 39-desmetóxi-rapamicina.

Exemplo 2: 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetiI)propionil]-rapamicina

39-Desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propioriil]rapamicina foi sintetizada a partir da 39-desmetóxi-rapamicina de acordo como seguinte procedimento.

2.1 Síntese de 39-desmetóxi-28-0-trimetilasilil rapamicina39-Desmetóxi-rapamicina (170 mg, 0,17 mmol) e imidazol (51mg, 0,75 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de acetato de etila a 0°C. A estasolução fria clorotrimetilsilano (77 mg, 0,09 ml, 0,71 mmol) foi adicionado àsgotas em um período de 10 min. A agitação foi continuada por mais 60minutos para completar a formação do éter 28,39-bis-O-trimetilsilílico.Depois deste período 0,4 ml de ácido sulfurico 0,5 N aquoso foi adicionado ea mistura foi agitada por 2,5 h a 0°C. 20 ml de acetato de etila foramadicionados e a camada orgânica foi lavada com salmoura, solução saturadade hidrogeno carbonato de sódio e água. A secagem em sulfato de sódio e a concentração sob pressão reduzida produziu o éter 28-O-trimetilsilila comoum sólido incolor que foi usado sem outra purificação para a reaçãosubseqüente.

1H-RMN (400 MHz, CDC13), 5 (ppm): 4,07 (d, 1H, J = 6,5 Hz,C(28)-H), 0,00 (s, 9H, 28-O-TMS). MS (ESI) m/z 978 [M+Na]+20 2.2. Síntese de anidrido 2,4,6-triclorobenzóico 2",2",5 '-trimetil-1', 3 '-dioxano-5' carboxílico

2,2-Dimetoxipropano (13,5 g, 130 mmoles) e ácido p-toluenossulfônico monoidratado (100 mg, 0,53 mmol, 0,4 % em mol) foramadicionados a uma solução de ácido 2,2-bis(hidroximetil)-propiônico (13,5 g,100 mmoles) em acetona (100 ml). A mistura de reação foi agitada natemperatura ambiente por 2 h. Depois deste período hidrogeno carbonato desódio úmido foi adicionado e a mistura foi agitada por mais 5 minutos. Osobrenadante foi separado por decantação e concentrado sob pressão reduzida.

O sólido resultante foi tratado com éter dietílico (3 x 50 ml) e os extratosorgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida para produzirum sólido branco, 16,2 g (93 %)

'H-RMN (400 MHz, CDC13), 5 (ppm): 4,19 (d, 1H, J = 12,0Hz) 3,68 (d, 1H, J = 12,0 Hz) 1,45 (s, 1H) 1,41 (s, 1H) 1,20 (s, 1H).

Este material foi depois convertido em um anidrido mistoativado pelo método da US 5.362.718. Assim, a acetonida (1,04 g, 5,98mmoles) foi dissolvida em THF (20 ml) esfriada a 0°C e tratada com a adiçãoàs gotas de trietilamina (0,83 ml, 5,98 mmoles) e cloreto de 2,4,6-triclorobenzoíla (0,93 ml, 5,98 mmoles). A reação foi depois agitada natemperatura ambiente por 5 horas. O precipitado resultante foi filtrado elavado com THF (10 ml). O filtrado combinado foi reduzido a vácuo até umsólido amorfo branco que foi usado (como abaixo) sem outra purificação.

2.3. Síntese do éter 28-O-trimetilasilílico de 39-desmetóxi-rapamicina, 40-éster com o ácido 2,2,5-trimetil[l,3-dioxano]-5-carboxílico

A 28-0-trimetilasilil-39-desmetóxi-rapamicina bruta (200 mg,a partir de 0,17 mmol de 39-desmetóxi-rapamicina) do exemplo 2.1 foidissolvida em 2 ml de diclorometano. A solução foi esfriada a 0°C e DMAP(102 mg, 0,84 mmol) foi adicionado. Depois, uma solução de anidrido 2,4,6-triclorobenzóico 2',2,,5'-trimetil-r,3'-dioxano-5' carboxílico (159 mg, 0,42mmol) em 1 ml de diclorometano foi adicionada em um período de 10 min. Amistura de reação foi agitada a 0°C por 5 h e a conversão foi monitorada pelaLC/MS. A mistura de reação foi diluída com 7 ml de diclorometano e extintapela adição de 5 ml de água. A camada orgânica foi separada e lavadasucessivamente com ácido sulfurico 0,5 N, solução de hidrogeno carbonato desódio e água. A secagem em sulfato de sódio e a concentração sob pressãoreduzida deram o composto do título como espuma incolor, que foi usadaimediatamente sem outra purificação. MS (ESI) m/z 1111 [M-H]"

2.4. 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionilJrapamicina

O éter 39-desmetóxi-rapamicina-28-0-trimetilasilílico bruto40-éster com o ácido 2,2,5-trimetil[l,3-dioxano]-5-carboxílico do exemplo2.3 foi dissolvido em 2 ml de acetona e 0,5 ml de ácido sulfurico 0,5 N foiadicionado. A mistura de reação foi agitada por 5 h na temperatura ambiente esubseqüentemente neutralizada pela adição de 5 ml de solução saturada dehidrogeno carbonato de sódio e 5 ml de água. A mistura aquosa foi extraídacom acetato de etila e os extratos orgânicos combinados foram secados emsulfato de sódio. A concentração sob pressão reduzida deu um sólido incolorque foi purificado pela cromatografia de exclusão de tamanho em SephadexLH20 usando clorofórmio/heptano/etanol (v:v:v 10:10:1) como eluentes.

1H-RMN (500 MHz, CDC13), S (ppm): 4,72 (m, 1H, C(40)-H),3,87 (m, 2H), 3,69 (m, 2H), 1,03 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDC13), 5(ppm): 175,52, 74,04 (C(40)), 68,73 (2C), 48,90, 17,09. MS (ESI) m/z 1023[M+Na]+

Exemplo 3: 39-desmetóxi-40-O-(2-hidróxi)etil rapamicina

3.1. Triflato de 2-(terc-butildimetilsilil)oxietila

Uma solução de 2-(terc-butildimetilsilil)-etileno glicol (125mg, 0,71 mmol) e 2,6-lutidena (0,08 ml, 0,69 mmol) em 6 ml dediclorometano foi esfriada a -78°C. Anidrido trifluorometanossulfônico (0,11ml, 0,65 mmol) foi adicionado em um período de 5 min e a agitação foicontinuada por adicional de 15 min a -78°C para completar a formação dotriflato. O triflato foi usado in situ para a reação como descrito em 3.2 abaixo.3.2. 40-O-(2-(terc-butildimetilsilil)]etil-39-desmetóxi-rapamicina39-Desmetóxi-rapamicina (300 mg, 0,34 mmol) e 2,6-di-terc-butilpiridina (1,5 ml, 6,68 mmoles) foram tratados com triflato de 2-(terc- butildimetilsilil)oxietila (0,65 mmol em 6 ml de diclorometano) natemperatura ambiente. Esta solução foi concentrada até um terço do seuvolume original com uma corrente suave de nitrogênio e a suspensãoresultante foi agitada por mais 72 h na temperatura ambiente. Depois desteperíodo, solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio (5 ml) e água (5ml) foram adicionados e a mistura foi agitada por 30 min. A camada orgânicafoi separada e a fase aquosa foi extraída com acetato de etila (2x5 ml). Osextratos orgânicos combinados foram secados em sulfato de sódio econcentrados sob pressão reduzida para dar um óleo incolor. A purificaçãopela cromatografia de coluna em sílica usando um gradiente de hexano parahexano/acetona (v:v 1:1) deu o produto como um sólido incolor.

"H-RMN (500 MHz, CDC13), 6 (ppm): 4,16 (d, 1H, J = 6,5 Hz,C(28)-H), 3,73 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 3,52 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 0,89 (s, 9H), 0,06(s, 6H); 13C-RMN (125 MHz, CDC13), 5 (ppm): 76,61 (C-40), 69,31 (CH2),63,03 (CH2), 25,92 (3C), 18,36, -5,23 (2C).

MS (ESI) m/z 1065 [M+Na]+

3.3. 39-Desmetóxi-40-O-(2-hidróxi)etil rapamicina

Uma solução de 40-O-[2-(terc-butildimetilsilil)]etil-39-desmetóxi rapamicina (160 mg, 0,15 mmol) em 2 ml de acetona foi tratadacom 0,3 ml de ácido sulíurico 0,5 N na temperatura ambiente. A solução foideixada repousar na temperatura ambiente por 3 h e foi subseqüentementeextinta pela adição de 5 ml de solução saturada de hidrogeno carbonato desódio e 10 ml de água. A mistura aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram secados em sulfato desódio. A concentração sob pressão reduzida deu um sólido incolor que foiainda purificado pela HPLC (água/acetonitrila v:v 20/80).

1 H-RMN (500 MHz, CDC13), ô (ppm): 4,16 (d, 1H, J = 6 Hz),3,70 (m, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,20 (m, 1H, C(40)-H); ,3C-RMN (125 MHz,CDCI3), 5 (ppm): 78,65 (C-40), 77,20 (C-28), 68,93 (CH20), 62,10 (CH20).

MS (ESI) m/z 951 [M+Na]+

Exemplo 4 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]-rapamicina através da esterificação catalisada pela lipase de 39-desmetóxi-rapamicina

Uma mistura de 39-desmetóxi-rapamicina (720 mg, 0,82mmol), 2,2,5-trimetil[l,3-dioxano]-5-carboxilato de vinila (244 mg, 1,22mmol), lipase PS-C "Amano" II (720 mg) e peneiras moleculares 0,5 nm (250mg) em éter terc-Butil metílico anidro (3,5 ml) foi aquecido a 43°C sob umaatmosfera de argônio. Depois de 48 h o monitoramento pela LC/MS mostroua conversão completa do material de partida. THF (10 ml) foi adicionado e amistura foi filtrada através de uma almofada de celite. A enzima foi lavadacom THF (2x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram concentradossob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em THF (50 ml) e H2SO4 (15ml, 0,5 N) foi adicionado. A solução foi deixada repousar na temperaturaambiente por 5 h e a reação foi subseqüentemente extinta pela adição deNaHCÜ3 (50 ml, 5 %) e salmoura (50 ml). A mistura aquosa foi extraída comEtOAc (3 x 100 ml) e os extratos orgânicos combinados foram secados emMgSC>4. A remoção dos solventes deu o produto como semi-sólido. Apurificação pela cromatografia cintilante (hexano/acetona 1:1) deu o produtocomo um sólido incolor.

Os dados de RMN são idênticos como aqueles do exemplo 2.4

MS (ESI) m/z 1022 [M+Na]+ A fragmentação do aduto desódio deu íons a m/z 850, 728, 693, 614, 560, 545, 441 e 431 de acordo com opadrão de fragmentação mostrado na Figura 3.

Exemplo 5 39-Desmetóxi-40-O-[2-hidroxietil 3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato] rapamicina

Uma mistura de 39-Desmetóxi-40-O-(2-hidróxi)etilrapamicina (40 mg, 0,04 mmol), 2,2,5-trimetil[l,3-dioxano]-5-carboxilato devinila (25 mg, 0,13 mmol), lipase PS-C "Amano" II (40 mg) e peneiramolecular 0,5 nm (40 mg) em éter terc-Butil metílico anidro (2 ml) foiaquecida a 43°C sob uma atmosfera de argônio. Depois de 72 h omonitoramento pela LC/MS mostrou a conversão completa do material departida. THF (10 ml) foi adicionado e a mistura foi filtrada através de umaalmofada de celite. A enzima foi lavada com THF (2x10 ml) e os extratosorgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida. O resíduofoi dissolvido em acetona (7,5 ml) e H2S04 (2,5 ml, 0,5 N) foi adicionado. Asolução foi deixada repousar na temperatura ambiente por 2 h e a reaçãosubseqüentemente extinta pela adição de NaHCC>3 sat. (10 ml) e água (10 ml).

A mistura aquosa foi extraída com EtOAc (3x10 ml) e os extratos orgânicoscombinados foram secados em MgSC>4. A remoção dos solventes deu oproduto como sólido amarelado. A purificação pela HPLC preparativa emuma coluna Phenomenex 21,2 x 50 mm Luna 5 um Cjg BDS usando umgradiente de 70:30 MeCN/água a 100 % de MeCN em 15 min deu o produto como um sólido incolor.

MS (ESI) m/z 1067 [M+Na]+ A fragmentação do aduto desódio deu íons a m/z 894, 772, 738, 614, 604, 589, 475 e 441 de acordo com opadrão de fragmentação mostrado na Figura 4.

Exemplo 6 27-O-desmetil-39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)-propionil] rapamicina

6.1. 27-0-desmetil-39-desmetóxi-rapamicina, 40-éster com ácido 2,2,5-trimetil [1,3-dioxanoJ-5-carboxílico

Uma mistura de 27-Odesmetil-39-desmetóxi rapamicina (30mg, 0,034 mmol), 2,2,5- trimetil[l,3-dioxano]-5-carboxilato de vinila (34 mg,0,17 mmol), lipase PS-C "Amano" II (30 mg) e peneira molecular 0,5 nm (30mg) em éter terc-Butil metílico anidro (2 ml) foi aquecido a 43 °C sob umaatmosfera de argônio por 72 h. THF (10 ml) foi adicionado e a mistura foifiltrada através de uma almofada de celite. A enzima foi lavada com THF (2 x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressãoreduzida para dar um semi-sólido amarelado. A purificação pelacromatografia cintilante usando hexano:acetona (v:v 2:1) deu o produto comoum sólido amarelo claro.

MS (ESI) m/z 1049 [M+Na]+

6.2 27-O-desmetil-39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]-rapamicina

O material de 6.1 foi dissolvido em acetona (6 ml) e H2S04 (2ml, 0,5 N) foi adicionado. A solução foi deixada repousar na temperaturaambiente por 2 h e a reação subseqüentemente extinta pela adição de NaHCC>3sat. (10 ml) e água (10 ml). A mistura aquosa foi extraída com EtOAc (3x10ml) e os extratos orgânicos combinados foram secados em MgSC>4. Aremoção de solventes deu o produto como sólido amarelado. A purificaçãopela HPLC preparativa em uma coluna Phenomenex 21,2 x 50 mm Luna 5um Ci8 BDS usando um gradiente de 70:30 MeCN/água a 100 % de MeCNem 15 min deu o produto como um sólido incolor.

MS (ESI) m/z 1009 [M+Na]+ A fragmentação do aduto desódio deu íons a m/z 836, 679, 600, 560, 531, 431, 427 de acordo com opadrão de fragmentação mostrado na Figura 5 !H RMN (500 MHz,CDC13) 5 ppm 4,73 (m, 1 H, C(40)-H), 4,32 (d, J = 4,5 Hz, 1C(27)-H),4,19 (d, J = 4,5 Hz, 1 H, C(28)-H), 3,89 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H) 1,03 (s, 3 H).

Exemplo 7. Avaliação in vitro da atividade anticâncer de 39-desmetóxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina e 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidróxi-mctil)propion il 1 rapamicina

A avaliação in vitro de 39-desmetóxi-40-O-(2-hidróxi)etilrapamicina e 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]-rapamicinaquanto a atividade anticâncer em um painel de 12 linhagens de célula detumor humanas em um ensaio de proliferação em monocamada foi realizadocomo descrito como Protocolo 1 nos métodos gerais acima usando um ensaiode iodeto de propídio modificado.

Os resultados são demonstrados na Tabela 3 abaixo; cadaresultado representa a média de experimentos em duplicata. A Tabela 4mostra a IC50 e IC70 médias para os compostos através das linhagens de célulatestadas, com rapamicina mostrada como uma referência.Tabela 3

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Exemplo 8. Ensaios de ligação in vitro FKBP12

FKBP12 reversivelmente desdobra no desnaturante químico decloridreto de guanidínio (GdnHCl) e a desdobra pode ser monitorada pelamudança na fluorescência intrínseca da proteína (Main et al., 1998). Ligandosque especificamente ligam e estabilizam o estado nativo de FKBP12 mudam acurva de desnaturação tal que a proteína desdobra nas concentrações maisaltas e desnaturante químico (Main et al, 1999). A partir da diferença naestabilidade, a constante de ligando-ligação pode ser determinada usando aequação 1.<formula>formula see original document page 60</formula>

onde AGapp é a diferença aparente na energia livre da desdobraentre as formas livre e ligada a ligando, aKJ^ é a energia livre de desdobraem água da proteína livre, [L] a concentração de ligando e IQ a constante dedissociação para o complexo de proteína-ligando (Meiering et al., 1992).

A energia livre da desdobra pode estar relacionada com oponto intermediário da transição de desdobra usando a seguinte equação:

<formula>formula see original document page 60</formula>

onde mD_N é uma constante para uma dada proteína e dadodesnaturante e que é proporcional à mudança no grau de exposição deresíduos ma desdobra (Tanford 1968 e Tanford 1970), e [D]50 % é aconcentração de desnaturante que corresponde ao ponto central de desdobra.Foi definido ààG^N a diferença na estabilidade de FKBP12 com rapamicina eligando desconhecido (na mesma concentração de ligando), como:

<formula>formula see original document page 60</formula>

onde < mD.N > é o valor m médio da transição de desdobra eA[D]50 % a diferença nos pontos centrais para a transição de desdobra derapamicina-FKBP12 e transição de desdobra do complexo de ligandodesconhecido-FKBP12. Sob condições onde [L] > IQ, então, AAGd-n, podeser relacionado com KdS relativos dos dois compostos através da equação 4:

<formula>formula see original document page 60</formula>

onde Krapd é a constante de dissociação para a rapamicina e Kxdé a constante de dissociação para o ligando desconhecido X. Portanto,

<formula>formula see original document page 60</formula>

Ajustando cada curva de desnaturação gera valores para mD.N e[D] só o/o, que podem ser usados para calcular um valor m médio, < mD-N >, eA[D]50 %, e por este motivo Kxd. O valor de literatura de Krapd de 0,2 nM éusado.

Em alguns casos, devido à solubilidade baixa do composto deteste, concentrações mais baixas do composto de teste foram usadas do que noexperimento de controle da rapamicina. Nestes casos, as diferenças entre aconcentração do composto de teste e a concentração de controle derapamicina foram levados em conta usando a equação 6 abaixo:

Tabela 5 - Resultados de ensaio de ligação in vitro de FKBP-12

<table>table see original document page 61</column></row><table>

A inibição de mTOR foi estabelecida indiretamente porintermédio da medição do nível de fosforilação dos marcadores substitutos dotrajeto mTOR e p70S6 quinase e S6 (Brunn et ai, 1997; Mothe-Satney et ai,2000; Tee e Proud, 2002; Huang e Houghton, 2002).

As células HEK293 foram co-transfectadas com mTORrotulado com FLAG e Raptor rotulado com myc, cultivado por 24 h depois deprivadas de soro durante a noite. As células foram estimuladas com 100 nMde insulina depois colhidas e lisadas por 3 ciclos de congelamento/descongelamento. Os lisados foram reunidos e quantidades iguais foramimunoprecipitadas com anticorpo FLAG no lugar do complexomTOR/Raptor. Os imunoprecipitados foram processados: as amostras tratadascom composto (0,00001 a 0,003 mM) foram pré-incubadas por 30 min a 30°Ccom FKBP12/rapamicina, FKBP12/derivado de 39-desmetóxi-rapamicina ouveículo (DMSO), as amostras não tratadas foram incubadas em tampão dequinase. Os imunoprecipitados foram depois submetidos ao ensaio de quinasein vitro na presença de 3 mM de ATP, 10 mM de Mn2+ e GST4E-BP1 comosubstrato. As reações foram interrompidas com tampão de amostra 4x depoissubmetidas a 15 % de SDS-PAGE, transferidas úmidas para membrana dePVDF depois sondadas quanto a fosfo-4E-BPl (T37/46). As faixas deWestern blot foram quantificadas pela análise de imagem usando Image J(http://rsb.info.nih.gov/iiA). A Figura 6A mostra curvas de dose-resposta paraa rapamicina (quadrados cheios) e 39-desmetóxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]rapamicina (triângulos cheios). A Figura 6Bmostra curvas de dose-resposta para a rapamicina (quadrados cheios) e 39-desmetóxi-40-O-(2-hidróxi)etil rapamicina (triângulos cheios).

Alternativamente, as células HEK293 foram semeadas emplacas de 6 reservatórios e pré incubadas por 24 h e depois privadas de sorodurante a noite. As células foram pré tratadas com veículo ou composto por30 min a 30°C, depois estimuladas com 100 nM de insulina por 30 min a30°C e lisadas por 3 ciclos de congelamento/descongelamento e ensaiadasquanto a concentração de proteína. Quantidades iguais de proteína foramcarregadas e separadas nos géis de SDS-PAGE. A proteína foi transferidaúmida para membrana de PVDF depois sondada quanto fosfo-S6 (S235/36)ou fosfo-p70 S6K (T389). As faixas de Western blot foram quantificadas pelaanálise de imagem usando Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

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Claims (54)

1. Derivado de 39-desmetóxi de rapamicina, caracterizado pelofato de que a posição 40-hidróxi é derivada como um éster do ácidocarboxílico, como um éter, como um fosfato éster, como um fosfinato éster, como um acetal ou como uma glicosila.

2. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo, caracterizado pelo fato de que está de acordo com a Fórmula (I)abaixo: <formula>formula see original document page 73</formula>R1 representa um grupo ceto ou (H,H);R2 representa OH ou OMe;R3 representa H, OH ou OMe;Rt e R5 cada um independentemente representa H ou OH;Ré representa -R7, -C(0)R7, -(CH2)2-0-[CR2iR22-0]a-C(0)-R23; CR21R22-0-C(0)-R23; POR19R20; -PO(OR19)(OR20) ou Y-R15;R7 representa -(CR8R9)m(CR1oRii)pCR12R13Ri4;R8 e R9 cada um independentemente representa alquila C1-C4,alquenila C2-C4 ou alquinila C2-C4, qualquer um de tais grupos pode seropcionalmente substituído com -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -COOH ou -NH2; ou R8 e R9 cada um independentemente representa H, trifluorometila ou F;Rio, Rn, R12, Rn e Rh cada um independentemente representaalquila C1-C4, alquenila C2-C4 ou alquinila C2-C4, qualquer um de taisgrupos pode ser opcionalmente substituído com -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -COOH ou -NH2; ou R10, Rn, RJ2, Rn e R14 podem serindependentemente selecionados de H, -(CR8R9)qNH2, -(CR8R9)qOH, CF3, F,COOH; ou Rio e Rn ou R12 e Rn ou R]3 e R14 podem ser quando juntos com ocarbono ao qual estes estão unidos para formar um cicloalquila C3-C6 ou umanel heteroalquila de 3 a 6 membros que contém um ou mais heteroátomosselecionados de N, O e S e que é opcionalmente, substituído com até 5 grupos-(CR8R9)qOH, -(CR8R9)qNH2 ou COOH;<formula>formula see original document page 74</formula>R15 representa H ou OH;R16 são cada um independentemente H ou OH;R17 é independentemente selecionado de H, OH e NH2;R18 é independentemente selecionado de H, -CH3) -CH2OH e - COOH;entretanto contanto que não mais do que 2 grupos selecionadosde Ri6, Rn e R18 representa H ou CH3;R19 e R20 cada um independentemente representa H ou alquilaC1-C4 ou R]9 e R20 juntos representam = CH2;R2] é independentemente selecionado de H, CH3;R22 é independentemente selecionado de H, -CH3, -CH = CH2,-CH2C1, -CHC12, -CC13, -CH(OH)Me, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(Cl)Me;R23 é independentemente R7, Y-R]5 ou um anel arila ouheteroarila de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com entre um e trêsgrupos selecionados de OH, F, Cl, Br, N02 e NH2;a representa 0 ou 1;m, p e q cada um independentemente representa um númerointeiro entre 0 e 4;entretanto contanto que a porção R7 não contenha mais do que-12 átomos de carbono e contenha pelo menos um grupo funcional selecionadode -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -COOH, OH ou NH2.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que R6 representa -R7.

4. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que R$ representa -C(0)R7.

5. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que Rg representa -(CH2)2-0-[CR21R22-0]a-C(0)-R23.

6. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que R23 representa R7.

7. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que R23 representa Y-Ri5.

8. Composto de acordo com as reivindicações de 2 a 6,caracterizado pelo fato de que R7 contém 7 ou menos átomos de carbono.

9. Composto de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que R7 contém 5 ou menos átomos de carbono.

10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que R7 contém dois grupos selecionados de -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -COOH e -NH2.

11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 10, caracterizado pelo fato de que R7 contém pelo menos umgrupo funcional selecionado de -COON, OH e NH2.

12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde2a6ou8all, caracterizado pelo fato de que p representa 0 ou 1.

13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 12, caracterizado pelo fato de que m representa 0 ou 1.

14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde2a6ou8al3, caracterizado pelo fato de que q representa 0, 1 ou 2.

15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 14, caracterizado pelo fato de que Ri i representa H.

16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde2a6ou8al5, caracterizado pelo fato de que R12 representa H.

17. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 16, caracterizado pelo fato de que RJ3 representa H ou OH.

18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 17, caracterizado pelo fato de que p representa 1, e R10representa Me, OH ou CH2OH.

19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 17, caracterizado pelo fato de que p representa 1 e Rnrepresenta Me, H ou CH2OH.

20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde2a6ou8all, caracterizado pelo fato de que m e p ambos representam 0;R12 e R]3 ambos representam H e RH representa -(CR8R9)q-OH onde q = 0 ou 1 e R8 e R9 ambos representam H.

21. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 11, caracterizado pelo fato de que p representa 1 e mrepresenta 0, Ri0 e Rn ambos representam H, Ri2 representa H, Ri3 representaH, OH ou NH2 e R,4 representa -(CRgR^q-OH onde q = 0 ou 1 e Rg e R9ambos representam H.

22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 11, caracterizado pelo fato de que representa o resíduoderivado da formação de um éster com ácido hidroxiacético, ácido 3-hidróxi--2,2-dimetilpropiônico, ácido 2,3-diidroxipropiônico, ácido 3-hidróxi-2-hidroximetilpropiônico ou ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiônico.

23. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 2 a 6 ou 8 a 11, caracterizado pelo fato de que representa o resíduoderivado da formação de um éter com ácido hidroxiacético, ácido 3-hidróxi--2,2-dimetilpropiônico, ácido 2,3-diidroxipropiônico, ácido 3-hidróxi-2-hidroximetilpropiônico ou ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiônico.

24. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que é o 39-desmetóxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)propionil- rapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

25. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que é o 39-desmetóxi-40-O-(2-hidróxi)etil rapamicina ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.

26. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é o 39-desmetóxi-40-O-[2-hidroxietil-3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]rapamicina ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo.

27. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que é o 27-O-desmetil-39-desmetóxi-40-O-[2,2- bis(hidróxi- metil)propionil]rapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

28. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que representa -POR19R20.

29. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que R^ representa -PO(ORi9)(OR2o).

30. Composto de acordo com as reivindicações 28 ou 29,caracterizado pelo fato de que R19 e R20 ambos representam CH3 ou ambosrepresenta CH2CH3.

31. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que R^ representa Y-R15.

32. Composto de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o grupo Ri5 representa<formula>formula see original document page 78</formula>

33. Composto de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que R\5 é uma porção formada pela formação de um acetal comglicose, glicosamina, ácido glicurônico ou arabinose.

34. Composto de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que R]5 é uma porção formada pela formação de um acetal comD-glicose.

35. Composto de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que RJ5 é uma porção formada pela formação de um acetal comD-glicosamina.

36. Composto de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que Ri5 é uma porção formada pela formação de um acetal comácido D-glicurônico.

37. Composto de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que Ri5 representa:<formula>formula see original document page 78</formula>pelo fato de que Ri5 é uma porção formada pela formação de um acetal comfrutose.

38. Composto de acordo com a reivindicação 37, caracterizado

39. Composto de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que Ri5 representa:<formula>formula see original document page 79</formula>

40. Composto de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que R15 é uma porção formada pela formação de um éster comácido glicurônico.

41. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 31 a 40, caracterizado pelo fato de que Y representa uma ligação.

42. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 31 a 40, caracterizado pelo fato de que Y representa -(CH2)2-0-C(0)-0-.

43. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 31 a 40, caracterizado pelo fato de que Y representa -C(0)-0.

44. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para o uso como um produtofarmacêutico.

45. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 43, caracterizado pelo fato de que é para o uso no tratamento de câncer e/ou malignidades de célula B, a indução ou manutenção da imunossupressão,o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro,distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doençasfibróticas, a estimulação da regeneração neuronal ou o tratamento deinfecções füngicas.

46. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 43, caracterizado pelo fato de ser para o uso em um produtofarmacêutico no tratamento de câncer ou malignidades de célula B.

47. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 43 junto com um ou mais diluentes ou carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis.

48. Método para o tratamento de doenças ou infecçõesfungicas, as ditas doenças sendo câncer e/ou malignidades de célula B, aindução ou manutenção da imunossupressão, o tratamento de rejeição atransplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doençasde inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, a estimulação daregeneração neuronal, caracterizado pelo fato de que compreende administrara um paciente uma quantidade eficaz de um composto como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 43.

49. Método para o tratamento do câncer ou malignidades decélula B, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a umpaciente uma quantidade eficaz de um composto como definido em qualqueruma das reivindicações de 1 a 43.

50. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 43, caracterizado pelo fato de ser na preparação de ummedicamento para o tratamento de câncer e/ou malignidades de célula B, aindução ou manutenção da imunossupressão, o tratamento de rejeição atransplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doençasde inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, a estimulação daregeneração neuronal ou o tratamento de infecções fungicas.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelofato de que o medicamento é para o tratamento de câncer ou malignidades decélula B.

52. Processo para a preparação de um composto da fórmula (I)como definido em qualquer uma das reivindicações de 2 a 43, caracterizadopelo fato de que compreende:(a) reagir um composto da fórmula (II):<formula>formula see original document page 81</formula>onde RA representa H ou (CH2)2-OH ou um derivado protegidodeste com um composto da fórmula (III):HO-Ré (III)ou um derivado ativado desteem que o grupo é como definido acima para os compostosda fórmula (I) ou um derivado protegido deste; ou(b) converter um composto da fórmula (I) ou um sal deste aum outro composto da fórmula (I) ou um outro sal deste farmaceuticamenteaceitável; ou(c) desproteger um composto protegido da fórmula (I).

53. Composição ou kit de partes, caracterizada(o) pelo fato deque compreendem (i) um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 43 e (ii) um ou mais outros agentes terapeuticamenteeficazes.

54. Composição ou kit de partes de acordo com areivindicação 53, caracterizadaCo) pelo fato de que o um ou mais outrosagentes terapeuticamente eficazes são selecionados do grupo de metotrexato,leucovorin, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracila, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorelbina,doxorubicina, tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol,goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (por exemplo, Herceptina®,capecitabina, cloridreto de raloxifeno, inibidores de EGFR, inibidores deVEGF, inibidores de proteassoma, inibidores de hsp90, azatioprina,corticosteróides, ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, MicofenolatoMofetila, OKT-3, ATG, anfotericina B, flucitosina, equinocandins,griseofulvina, um imidazol e um agente de antifungico de triazol.