KR20070113282A

KR20070113282A - 라파마이신의 39-데스메톡시 유도체

Info

Publication number: KR20070113282A
Application number: KR1020077023040A
Authority: KR
Inventors: 크리스토프 헨드리크 베크만; 스티븐 제임스 모스; 로즈 마리 쉐리단; 밍치앙 장; 배리 윌킨슨
Original assignee: 바이오티카 테크놀로지 리미티드
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2007-11-28
Also published as: US20100081682A1; CR9434A; US20080188511A1; RS53778B1; CA2600640A1; MX2007011131A; CA2600640C; EP1856129B1; NI200700230A; DK1856129T3; CN101175760B; NZ561607A; ES2527530T3; US7648996B2; PL1856129T3; NO20074594L; JP5422788B2; WO2006095185A1; EP1856129B8; RU2391346C2

Abstract

본원 발명은 신규 39-데스메톡시라파마이신 유도체, 그의 제조 방법, 및 그의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응(transplantation rejection), 이식 편대 숙주 질병(graft vs. host disease), 자가면역성 장애(autoimmune disorder), 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료에서, 이러한 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다.

데스메톡시, 라파마이신, 암, 악성 종양

Description

라파마이신의 39-데스메톡시 유도체{39-desmethoxy derivatives of rapamycin}

본원 발명은 신규 39-데스메톡시라파마이신 유도체, 이들의 제조 방법, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응(transplantation rejection), 이식 편대 숙주 질병(graft vs. host disease), 자가면역성 장애(autoimmune disorder), 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료에서, 이러한 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다.

라파마이신(시롤리무스)(도 1)은 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) NRRL 5491에 의해 생성되고(Sehgal et al ., 1975; Vezina et al ., 1975; 미국특허 제3,929,992호; 미국특허 제3,993,749호), 파이프콜릭산(pipecolic acid) 락톤에 연결된 1,2,3-트리카르보닐 모이어티를 갖는, 친유성 매크로라이드(macrolide)이다(Paiva et al ., 1991). 본원 발명의 목적을 위해, 라파마이신은 Findlay et al. (1980) 또는 Chemical Abstracts(제11판, Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS)의 번호 붙이기 약정보다는 오히려 McAlpine et al. (1991)의 번호 붙이기 약정에 의해 기술된다.

라파마이신은 화합물에 의해 나타내어지는 넓은 활성 스펙트럼으로 인하여 유효한 약리학적 가치를 갖고 있다. 라파마이신은 주로 캔디다(candida) 종에 대해 중간 정도의 항균 활성을 보여줄 뿐만 아니라, 곰팡이(filamentous fungi)에 대해 항균 활성을 나타낸다(Baker et al ., 1978; Sehgal et al ., 1975; Vezina et al., 1975; 미국특허 제3,929,992호; 미국특허 제3,993,749호). 라파마이신은 다양한 세포 형태에서 신호 전달 경로를 표적으로 하여, 즉 세포 사이클의 G₁ 단계에서 S 단계로의 진행을 가능하게 하는 신호 전달 경로를 억제하여, 세포 증식을 억제한다(Kuo et al ., 1992). T 세포에서, 라파마이신은 IL-2 수용체로부터의 신호 보냄과 뒤이어 T 세포의 자가증식을 억제하여, 면역 억제를 한다. 라파마이신의 억제 효과는 T 세포에 제한되지 않는데, 왜냐하면 라파마이신은 많은 포유 동물 세포 형태의 증식을 억제하기 때문이다(Brunn et al ., 1996). 따라서, 라파마이신은 기관 동종이식 거부 반응(organ allograft rejection)의 예방과 자가면역성 장애의 치료에서, 입증되었거나 또는 예견되는 치료 용도를 갖는 강력한 면역 억제약이다(Kahan et al ., 1991 ). 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신(SDZ RAD, RAD 001, Certican, 에버롤리무스(everolimus))은 면역 억제 약리 효과를 보여주는 라파마이신의 반-합성(semi-synthetic) 유사체이고, 또한 이것은 항암성 약물로서 연구중에 있다(Sedrani, R. et al ., 1998; Kirchner et al ., 2000; 미국특허 제 5,665,772호, Boulay et al ., 2004). 이 약물의 면역 억제제로서의 승인을 2003년 유럽에서 얻었다. 라파마이신 에스테르 유도체 CCI-779 (Wyeth-Ayerst)는 생체 외에서(in vitro) 세포 성장을 억제하고 생체 내에서(in vivo) 종양 성장을 억제한다(Yu et al., 2001). CCI-779는 현재 강력한 항암제로서 임상 III 단계의 시도 중에 있다. 만성 판성 건선의 치료(Kirby and Griffiths, 2001), PC12 세포에서 신경돌기 증식(neurite outgrowth)의 촉진(Lyons et al ., 1994), 기계적 손상 이후 혈관과 평활근 세포에 의한 사이토카인을 향한 증식 반응의 차단(Gregory et al ., 1993)에서의 라파마이신의 가치와, 동종 이식 섬유증(allograft fibrosis) 예방에서의 라파마이신의 역할이 강도 높게 연구되는 부분이다(Kahan and Camardo, 2001). 최근의 보고서는 라파마이신이 다른 면역 억제 처방 계획에서보다 장-기간의 면역 억제 치료시 기관 동종 이식 환자에서 보다 낮은 암 발생률과 관련되어 있고, 이러한 감소된 암 발생률은 신생 혈관 형성의 억제 때문임을 보여주었다(Guba et al ., 2002). 이뮤노필린 리간드(immunophilin ligand)의 신경영양성(neurotrophic) 활성은 이들의 면역 억제 활성과는 독립적이고(Steiner et al ., 1997), 신경 성장 촉진은 특허 출원 WO 제01/03692호에서 개시된 바와 같이 성숙한 스테로이드 수용체 복합체의 분열(disruption)에 의해 촉진된다고 보고되었다. 고지혈증 및 혈소판 감소증과 같은 부작용뿐만 아니라 강력한 기형아 효과가 보고되었다(Hentges et al ., 2001 ; Kahan and Camardo, 2001).

라파마이신의 폴리케타이드 전체 구조(backbone)는 타입 I 폴리케타이드 합성 효소를 포함하는 매우 큰 복합 작용기성 단백질에 의해서 시키메이트 유래 시클로헥산카르복시산 출발 물질 단위를 만드는, 전체적으로 7개의 프로피오네이트와 7 개의 아세테이트 단위의 머리-대-꼬리(head-to-tail) 축합 반응에 의해 합성된다(rap PKS, Paiva et al ., 1991). L-라이신 유래 아미노산인 파이프콜릭산은 폴리케타이드 전체 구조의 마지막 아세테이트기와 아미드 결합에 의해 축합되고(Paiva et al ., 1993), 그 다음에 락톤형성 반응(lactonisation)에 의해 거대 고리(macrocycle)를 형성하게 된다.

세 개의 라파마이신 PKS 유전자의 각각의 뉴클레오티드 서열, NRPS-코딩하는(NRPS-encoding) 유전자 및 플랭킹 레이트 유전자(flanking late gene) 서열 및 상응하는 폴리펩티드가 Aparicio et al ., 1996과 Schwecke et al ., 1995에 의해 확인되었고, 인증 번호 X86780로 NCBI에 보관되어 있으며, 이 서열의 보정이 최근 WO 04/007709호에서 공개되었다.

라파마이신 생합성 무리 중 첫 번째 효소-없는 생성물(enzyme-free product)은 프리-라파마이신(pre-rapamycin)으로 표시된다(WO 제04/007709호, Gregory et al., 2004). 완전히 공정화된 라파마이신의 생산은 라파마이신 레이트 유전자 RapJ, RapN, RapO, RapM, RapQ 및 Rapl에 의해 코딩되는 효소에 의한 폴리케타이드/NRPS 코어의 추가적인 공정을 필요로 한다.

현재까지 규명된 라파마이신의 약리학적 작용은 FKBP라 불리는 시토졸 수용체와의 상호 작용에 의해 매개될 것으로 믿어지고 있다. 진핵 T-세포에서 주요 세포내 라파마이신 수용체는 FKBP12(DiLeIIa and Craig, 1991)이고, 그 결과 생성되는 복합체가 표적 단백질과 특이적으로 상호 작용하여 세포의 신호 전달 연쇄증폭(signal transduction cascade)을 억제하게 된다.

라파마이신-FKBP12 복합체의 표적은 이스트에서는 TOR(라파마이신의 표적, target of rapamycin)라고 규명되었고(Alarcon et al ., 1999), 포유 동물의 단백질은 FRAP((FKBP-rapamycin associated protein) 또는 mTOR(mammalian target of rapamycin)라고 알려져 있다(Brown et al ., 1994).

뉴런에서 mTOR 신호 보냄(signalling)과 국소화된 단백질 합성 간의 관계; 번역 조절에 관련되는 단백질의 인산화 반응 상태에 대한 효과; 전사와 번역 수준에서 번역 장치(transitional machinery) 구성 요소의 풍부함; 아미노산 투과 효소 활성의 조절, 및 대사 경로에 관련되는 많은 효소의 전사의 공동 작용이 기술되어 있다(Raught et al ., 2001 ). 또한, 라파마이신 민감성 신호보냄 경로는 태아의 뇌 발달, 학습 및 기억 형성에서 중요한 역활을 하는 것 같다(Tang et al ., 2002). 또한, 이스트에서 TOR 단백질에 대한 연구는 영양소에 민감한(nutrient-sensitive) 신호 보냄 경로를 조절함에 있어 그 역할을 보여주었다(Hardwick et al ., 1999). 마찬가지로, mTOR은 단백질 키나제 B(akt)의 작용을 위한 직접적인 표적으로 확인되었고, 인슐린 신호 보냄에서 핵심적인 역할을 갖는 것으로 확인되었다(Shepherd et al ., 1998; Nave et al ., 1999). 또한, 포유 동물 TOR은 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 분극과 전사 개시 조절에 관련되어 있다(Alarcon et al ., 1999). mTOR과 같은 포스파티딜이노시톨 3-키나제는 세포-사이클 진행, 부착, 세포 생존 및 신생 혈관 형성과 같은, 종양의 여러 형태의 발병 기전에서 작용한다(Roymans and Siegers, 2001).

라파마이신과 라파마이신 유사체에 대한 약동력학적 연구는 용액에서 더 안 정할 수 있고, 대사 공격(metabolic attack)에 대해 더 저항성이 있으며 및/또는 개선된 세포막 투과성과 감소된 배출을 가질 수 있어, 개선된 경구 생체-이용가능성(bio-availability)을 나타낼 수 있는, 신규 라파마이신 화합물의 개발에 대한 필요성을 입증하였다.

분자의 화학적으로 이용가능한 부위를 사용한, 상당한 범위의 합성된 라파마이신 유사체가 보고되었다. 하기 화합물의 설명은 도 1에서 기술된 라파마이신 분자의 번호 붙이기 시스템에 적합하도록 하였다. 유도체화 또는 치환을 위한 분자 내에 있는 화학적으로 이용가능한 부위로는 C40 및 C28 히드록시기(예를 들면, 미국특허 제5,665,772호; 미국특허 제5,362,718호), C39 및 C16 메톡시기(예를 들면, WO 제96/41807호; 미국특허 제5,728,710호), C32, C26 및 C9 케토기(예를 들면, 미국특허 제5,378,836호; 미국특허 제5,138,051호; 미국특허 제5,665,772호)를 포함한다. 트리엔을 목적으로 하여, C17, C19 및/또는 C21에서 수소화반응은 항균 활성을 보유하지만, 비교적 낮은 면역 억제를 산출하였다(예를 들면, 미국특허 제5,391,730호; 미국특허 제5,023,262호). 분자 안정성에 대한 상당한 개선(예를 들면, C32, C40 및/또는 C28에서 옥심의 형성, 미국특허 제5,563,145호, 미국특허 제5,446,048호), 대사 공격에 대한 저항성에 대한 상당한 개선(예를 들면, 미국특허 제5,912,253호), 생체 이용가능성에 대한 상당한 개선(예를 들면, 미국특허 제5,221,670호; 미국특허 제5,955,457호; WO 제98/04279호) 및 프로드럭의 생성(예를 들면, 미국특허 제6,015,815호; 미국특허 제5,432,183호)이 유도체화를 통해 달성되었다.

그러나, 개선된 대사 안정성(metabolic stability), 개선된 세포막 투과성 및/또는 감소된 배출율(rate of efflux)을 갖는, 보다 넓은 범위의 라파마이신 유도체를 위한 필요성이 남아있다. 이러한 라파마이신 유도체는 광범위한 상태의 치료에서 큰 유용성을 가질 것이다. 본원 발명은 개선된 대사 안정성, 개선된 세포막 투과성 및/또는 감소된 배출율 및/또는 라파마이신과는 다른 세포 억제 프로파일을 갖는 소정 범위의 39-데스메톡시라파마이신 유도체를 제공한다. 이러한 화합물은 의약, 특히 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료에서 유용하다.

발명의 요약

본원 발명은 라파마이신의 39-데스메톡시 유도체, 이러한 화합물의 제조 방법, 제조 방법에서의 중간체, 및 이러한 화합물의 의약에서의 사용 방법을 제공한다.

가장 넓은 실시 형태에서, 본원 발명은 40-히드록시 위치가 카르복시산 에스테르로서, 에테르로서, 포스페이트 에스테르로서, 포스피네이트 에스테르로서, 아세탈로서 또는 글리코실로서 유도체화되어 있는 것을 특징으로 하는 라파마이신의 39-데스메톡시 유도체를 제공한다.

본원 발명 화합물의 대사 안정성, 세포막 투과성, 배출 및 생체 이용가능성은 하기에서 설명된 바에 따라 테스트될 수 있다.

39-데스메톡시라파마이신이 카르복시산 에스테르, 에테르, 또는 아세탈로 유도체화될 때, 유도체화기(derivatising group)는 바람직하게는 12개 이하의 탄소 원자를 포함한다(특히 7개 또는 더 적은, 구체적으로 5개 또는 더 적은 탄소 원자). 바람직하게는, 유도체화기는 -CF₂PO(OH)₂, -PO(OH)₂, -COOH, -OH 및 -NH₂로부터 선택되는, 구체적으로 -COOH 및 -OH로부터 선택되는, 더 구체적으로는 -OH인 한 개 이상의 작용기(특히 두 개 이상의 작용기)를 포함한다.

39-데스메톡시라파마이신이 글리코실기로부터 유래되는 아세탈로 유도체화될 때, 바람직하게는 각각의 글리코실은 바람직하게는 12개 이하의 탄소 원자(특히 7개 또는 더 적은, 구체적으로 6개 또는 더 적은 탄소 원자)를 포함하는 당으로부터 또는 글리코시드로부터 형성된다. 실시예는 모노 및 디사카라이드, 구체적으로 5원(5-membered) 및 6원 고리를 형성하는 모노사카라이드를 포함한다. 바람직하게는 이것은 -COOH, -OH 및 -NH₂로부터 선택되는, 구체적으로 -NH₂ 및 -OH로부터 선택되는, 더 구체적으로는 -OH인 하나 이상의 작용기(특히 두 개 이상의 작용기)를 포함한다.

39-데스메톡시라파마이신이 포스페이트 에스테르로 유도체화될 때, 바람직하게는 알킬기는 4개 이하의 탄소 원자를 포함한다.

39-데스메톡시라파마이신이 포스피네이트 에스테르로 유도체화될 때, 바람직하게는 알킬기는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하고, 실시예는 포스핀산(phosphinic acid)으로 형성된 에스테르이다.

유도체화한 모이어티의 특정 실시예가 하기에서 제공된다.

보다 특정된 실시 형태에서, 본원 발명은 하기 식 (I)에 따른 39-데스메톡시라파마이신 유도체, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

상기에서:

X는 결합 또는 CH₂를 나타내고;

R₁은 케토기 또는 (H,H)를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내고;

R₃은 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

R₄와 R₅는 각각 독립적으로 H 또는 OH를 나타내고;

R₆은 -R₇, -C(O)R₇, -(CH₂)₂-O-[CR₂₁R₂₂-O]_a-C(O)-R₂₃; -CR₂₁R₂₂-O-C(O)-R₂₃; -POR₁₉R₂₀, -PO(OR₁₉)(OR₂₀) 또는 Y-R₁₅를 나타내고;

R₇은 -(CR₈R₉)_m(CR₁₀R₁₁)_pCR₁₂R₁₃R₁₄를 나타내고;

R₈과 R₉는 -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -OH, -COOH 또는 -NH₂로 선택적으로 치환될 수 있는, 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐 또는 C2-C4 알키닐을 나타내거나; 또는 R₈과 R₉는 각각 독립적으로, H, 트리플루오로메틸 또는 F를 나타내고;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃ 및 R₁₄는 -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -OH, -COOH 또는 -NH₂로 선택적으로 치환될 수 있는, 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐 또는 C2-C4 알키닐을 나타내거나; 또는 R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃ 및 R₁₄는 독립적으로 H, -(CR₈R₉)_qNH₂, -(CR₈R₉)_qOH, CF₃, F, COOH로부터 선택될 수 있거나; 또는 R₁₀과 R₁₁ 또는 R₁₂와 R₁₃ 또는 R₁₃과 R₁₄는 이들이 연결되어 있는 상기 탄소와 함께, N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고 선택적으로는 5개 이하의 -(CR₈R₉)_qOH, -(CR₈R₉)_qNH₂ 또는 COOH기로 치환되는, C3-C6 시클로알킬 또는 3원 내지 6원의 헤테로알킬 고리를 형성하고;

Y는 결합, -C(O)-O-; -(CH₂)₂-O-C(O)-O-이고;

R₁₅는

를 나타내고;

R₁₆은 각각 독립적으로 H 또는 OH를 나타내고;

R₁₇은 독립적으로 H, OH 및 NH₂로부터 선택되고;

R₁₈은 독립적으로 H, -CH₃, -CH₂OH 및 -COOH로부터 선택되고; 그러나, R₁₆, R₁₇ 및 R₁₈로부터 선택되는 2개 이하의 기는 H 또는 CH₃을 나타내고;

R₁₉와 R₂₀은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬을 나타내고 또는 R₁₉와 R₂₀은 함께 =CH₂를 나타내고;

R₂₁은 독립적으로 H, CH₃으로부터 선택되고;

R₂₂는 독립적으로 H, -CH₃, -CH=CH₂, -CH₂Cl, -CHCl₂, -CCl₃, -CH(OH)Me, -CH₂OH, -CH₂CH₃, -CH(Cl)Me로부터 선택되고;

R₂₃은 OH, F, Cl, Br, NO₂ 및 NH₂로부터 선택되는 1개 내지 3개의 기로 선택적으로 치환된, 독립적으로 R₇, Y-R₁₅ 또는 5원 내지 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;

a는 O 또는 1을 나타내고;

m, p 및 q는 각각 독립적으로 0-4의 정수를 나타내고;

그러나 상기 R₇ 모이어티는 12개보다 많은 탄소 원자를 포함하지 않고, -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -COOH, OH 또는 NH₂로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함한다.

상기 구조는 대표적인 호변이체(tautomer)를 보여주고, 본원 발명은 예를 들면 에놀 화합물이 설명될 때 케토 화합물, 및 그 역이 성립하는, 식 (I)의 화합물의 모든 호변이체를 포함한다.

특정 입체이성질체가 특별히 지적되지 않는다면(예를 들면, 구조식에 있는 관련 입체센터에서 볼드 결합(bolded bond) 또는 점선 결합(dashed bond)으로, 구조식에서 E 또는 Z 배열(configuration)을 갖는 이중 결합의 표시에 의해, 또는 입체화학을 나타내는 명명법을 사용함으로써), 모든 입체이성질체는 순수한 화합물뿐만 아니라 그의 혼합물로서 본원 발명의 범위에 포함되어 있다. 달리 지적되지 않는다면, 개개 에난티오머, 부분입체이성질체(diastereomer), 기하 이성질체, 및 이들의 배합 또는 혼합물은 본원 발명에 모두 포함된다. 또한, 다형성(Polymorphic) 결정형 형태, 용매화물 및 수화물이 본원 발명의 범위에 포함된다.

또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 의약품으로서의 사용을 위해, 식 (I)의 화합물과 같은 39-데스메톡시라파마이신 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

정의

관사 "하나의(a)"와 "하나의( an )"는 관사의 문법적 객체들 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하도록 본원 명세서에서 사용되었다. 예를 들면, "하나의 유사체"는 한 개의 유사체 또는 한 개 이상의 유사체를 의미한다.

용어 "유사체(들)"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 또 다른 화합물과 구조적으로 유사하지만, 조성에 있어서 약간 다른 화합물을 지칭한다(또 다른 원자에 의해 한 원자가 치환되는 경우, 또는 특정 작용기가 존재 또는 부재하는 경우와 같음).

특히, 용어 "39- 데스메톡시라파마이신 유사체"는 WO 제2004/007709호의 제조 방법에 의해 제조되고 및/또는 식 (II)에 의해 보여지는 바와 같은 39-데스메톡시라파마이신 화합물을 지칭한다. 또한, 이러한 화합물은 "모체 화합물( parent compound)"로 지칭되고 이러한 용어는 본원 출원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본원 출원에서 용어 "39-데스메톡시라파마이신 유사체"는 그 자체로 39-데스메톡시라파마이신의 언급을 포함한다.

용어 "유도체(들)"가 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 반-합성 유기 화학에 의해서 이들의 모체 화합물로부터 변형되는 화합물을 지칭한다.

특히, 용어 "39- 데스메톡시라파마이신 유도체"는 39-데스메톡시라파마이신 유사체의 반-합성 변경에 의해 생성되는, 상기 식 (I)에 따른 39-데스메톡시라파마이신 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다. 또한, 이러한 화합물은 "본원 발명의 화합물" 또는 " 라파마이신의 39- 데스메톡시 유도체"로 지칭되고, 이러한 용어는 본원 출원에서 상호 교환적으로 사용된다.

용어 " 자가면역성 장애(들)"가 사용될 때, 이것은 제한 없이 계통성 홍반성 낭창(systemic lupus erythrematosis, SLE), 류마티즘성 관절염, 중증 근무력증 및 다발성 경화증을 포함한다.

용어 "염증성 질환"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 제한 없이 건선, 피부염, 습진, 지루, 염증성 장 질환(궤양성 대장염과 크론씨병을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아님), 폐 염증(pulmonary inflammation)(천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 급성 호흡 곤란 증, 및 기관지염을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아님), 류마티즘성 관절염 및 눈 포도막염(eye uveitis)을 포함한다.

용어 "암"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 피부 또는 신체 기관, 예를 들면 제한 없이, 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장(bowel)에 있는 세포의 악성 성장을 지칭한다. 암은 인접하고 있는 조직으로 스며들어 멀리 떨어져 있는 기관, 예를 들면 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 퍼져나가는(전이되는) 경향이 있다. 용어 암이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 제한되지는 않지만, 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 및 비만세포종과 같은 전이 종양 세포 형태와, 제한되지는 않지만 직장 암, 전립선암, 작은 세포 폐암(small cell lung cancer)과 작지 않은 세포 폐암(non-small cell lung cancer), 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 아교모세포종, 원발성 간암(primary liver cancer), 및 난소암과 같은 조직 종양의 형태 모두를 포함한다.

용어 "B-세포 악성 종양"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia, CLL), 다발성 골수종, 및 비호즈킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)을 포함하는 질환의 무리를 포함한다. 이들은 혈액 및 혈액 형성 기관의 종양 질환이다. 이들은 골수와 면역 시스템의 기능 장애를 일으키고, 이로 인해 숙주가 감염 및 출혈에 매우 민감하도록 만든다.

용어 "혈관 질환"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 제한 없이 과증식성(hyperproliferative) 혈관 질환(예를 들면, 재협착과 혈관 폐색증(vascular occlusion)), 혈관 이식편 죽상 동맥 경화증(graft vascular atherosclerosis), 심장혈관 질환, 뇌혈관 질환 및 말초 혈관 질환(예를 들면, 심장 동맥 질환, 동맥경화증, 죽상 동맥 경화증, 비죽종성(nonatheromatous) 동맥 경화증 또는 혈관 벽 손상)을 포함한다.

용어 "신경 재생"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 신경 세포 성장의 촉진을 지칭하고, 신경돌기 증식과 신경 세포의 기능상 회복을 포함한다. 신경 재생이 유효한 치료상 도움이 될 수 있는 질환과 질병으로는 제한 없이, 물리적 손상(예를 들면, 척수 손상 또는 외상성 신경증, 좌골 또는 안면 신경 병변 또는 손상), 또는 질병 상태(예를 들면, 당뇨병)에 의해 유발되었는지 관계없이, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병, 근위축성 측색 경화증, 3차 신경통, 설인 신경통, 안면 신경 마비, 근육성 이양증, 발작, 진행성 근 위축증, 진행성 구형 유전성 근육 위축증(progressive bulbar inherited muscular atrophy), 경추 굳음증(cervical spondylosis), 갈리안 바레 증후군(Gullain-Barre syndrome), 치매, 말초 신경병증(peripheral neuropathies) 및 말초 신경 손상을 포함한다.

용어 "섬유성 질환"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 세포외 기질(extracellular matrix)의 과다 생성과 관련되는 질환을 지칭하고, (제한 없이) 사르코이도시스(sarcoidosis), 켈로이드(keloid), 사구체 신염, 말기 신질환, 간 섬유종(경화증, 알코올성 간 질환 및 지방성 간염(steato-hepatitis)을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아님), 만성 이식 신장병(chronic graft nephropathy), 수술 협착, 혈관병증, 심장 섬유증(cardiac fibrosis), 폐 섬유증(특발성 폐 섬유증과 잠재성 섬유화 폐포염(cryptogenic fibrosing alveolitis)을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아님), 황반 변성, 망막과 유리체의 망막병증, 및 화학치료 또는 방사선으로-유도된 섬유증을 포함한다.

용어 "이식 편대 숙주 질병"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 동종이계(allogeneic) 줄기 세포/골수 이식 후에 관찰되는 합병증을 지칭한다. 이것은 공여자에게서 나온 감염과-싸우는(infection-fighting) 세포가 환자의 신체를 서로 다른 것으로 또는 이종이라고 인식할 때 일어나게 된다. 그런 다음, 이러한 감염과-싸우는 세포는 이들이 감염을 공격하는 것처럼 환자의 신체에 있는 조직을 공격하게 된다. 이식 편대 숙주 질병은 이식한 후 처음 100일 이내에 일어날 때 급성으로 분류되고, 이식하고 100일 이상이 지난 후에 일어나면 만성이라고 분류된다. 통상적으로, 관련되는 조직으로는 간, 위장관, 및 피부를 포함한다. 만성 이식 편대 숙주 질병은 줄기 세포/골수를 이식한 후 환자 중 대략 10-40 퍼센트에서 일어난다.

용어 "생체 이용가능성"이 본원 명세서에서 사용될 때, 이것은 투여한 후 약물 또는 기타 물질이 흡수되거나 또는 생물학적 활성 부위에서 이용가능하게 되는 정도 또는 비율을 지칭한다. 이러한 특징은 화합물의 용해도, 소화관에서 흡수 비율, 단백질 결합 정도 및 대사 등을 포함하는 수많은 요소에 의존한다. 당해 분야의 당업자에게 익숙한 생체 이용가능성을 위한 다양한 테스트가 본원 명세서에서 기술되어 있다(또한, Trepanier et al ., 1998, Gallant-Haidner et al ., 2000을 참조한다).

용어 "수(水) 용해도"가 본원 출원에서 사용될 때, 이것은 수성 매질, 예를 들면 pH 7.4에 있는 포스페이트로 완충된 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에서 용해도를 지칭한다.

식 (I)의 화합물과 같은 본원 발명 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기산 또는 유기산 또는 염기로부터 형성되는 통상적인 염뿐만 아니라 4차 암모늄 산 부가염을 포함한다. 적절한 산 염의 보다 구체적인 예로는 염산염, 브롬화 수소산염, 황산염, 인산염, 질산염, 과염소산염, 푸마르산염, 아세트산염, 프로피온산염, 숙신산염, 글리콜산염, 포름산염, 젖산염, 말레산염, 타르타르산염, 시트르산염, 팔모익산(palmoic acid) 염, 말론산염, 히드록시말레산염, 페닐아세트산염, 글루탐산염, 벤조산염, 살리실산염, 푸마르산염, 톨루엔술폰산염, 메탄술폰산염, 나프탈렌-2-술폰산염, 벤젠술폰산염, 히드록시나프토익산염, 요오드화 수소산염, 말산염, 스테로익산(steroic acid) 염, 타닌산 염 및 그 등가물을 포함한다. 옥살산과 같은 기타 산들은 그 자체로는 약제학적으로 허용가능하지 않지만, 본원 발명의 화합물과 그들의 약제학적으로 허용가능한 염을 얻을 때 중간체로서 유용한 염의 제조에서 유용할 수 있다. 적절한 염기 염의 보다 구체적인 예로는 소듐, 리튬, 포타슘, 마그네슘, 알루미늄, 칼슘, 아연, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민 및 프로카인 염을 포함한다. 본원 발명에 따른 화합물에 대한 하기의 언급에는 식 (I)의 화합물과 그의 약제학적으로 허용가능한 염 모두를 포함한다.

알킬기, 알케닐기 및 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄가 될 수 있다.

C1-C4 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 및 n-부틸을 포함한다.

C2-C4 알케닐기의 예로는 에테닐과 2-프로페닐을 포함한다.

C2-C4 알키닐기의 예로는 에티닐을 포함한다.

C3-C6 시클로알킬기는 3개-6개 탄소 원자를 포함하고 선택적으로 분지형이 될 수 있는 시클로알킬 고리를 지칭한다. 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 메틸-시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실을 포함한다.

N, O 및 S로부터 선택되는 한 개 이상의 헤테로원자를 포함하는 3원 내지 6원 헤테로알킬 고리는 한 개 또는 두 개의 헤테로원자, 특히 한 개의 헤테로원자를 포함하는 고리를 포함한다. 예로는 푸란, 피란, 옥세탄, 옥시란, 피페리딘, 피롤리딘, 아제티딘, 아지리딘, 티란(thiirane), 티에탄(thiirane), 티오펜, 티오피란 및 모르폴린을 포함한다.

3원 내지 6원 헤테로알킬 고리를 위한 선택적인 치환체의 예로는 -OH, - CH₂OH, NH₂, CH₂NH₂ 및 COOH를 포함한다. 통상적으로, 3원 내지 6원 헤테로알킬 고리는 비치환되거나 또는 한 개 또는 두 개의 치환체, 예를 들면 한 개의 치환체에 의해 치환될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본원 발명은 상기에서 규정된 바와 같이 39-데스메톡시라파마이신 유도체, 이러한 화합물의 제조 방법, 제조 방법에서의 중간체, 및 이러한 화합물의 의약에서의 사용 방법을 제공한다.

바람직하게는 R₇은 7개 또는 더 적은 특히 5개 또는 더 적은 탄소 원자를 포함한다.

R₇은 바람직하게는 -PO(OH)₂, -OH, -COOH 및 -NH₂로부터 선택되는 한 개 이상의 작용기, 더 바람직하게는 -OH, -COOH 또는 -NH₂로부터 선택되는, 특히 -COOH 및 OH로부터 선택되는, 가장 바람직하게는 OH인 작용기를 포함한다. 바람직하게는 R₇은 2개 또는 2개 이상의 치환체, 예를 들면 2개의 -OH 기를 포함한다.

적절하게는 X는 CH₂를 나타내고;

적절하게는 a는 O을 나타낸다.

적절하게는 p는 O 또는 1을 나타낸다.

적절하게는 m은 O 또는 1을 나타낸다.

적절하게는 q는 O, 1 또는 2를 나타낸다.

적절하게는 R₁₁은 H를 나타낸다. 적절하게는 R₁₂는 H를 나타낸다.

적절하게는 R₁₃은 H 또는 OH를 나타낸다.

p가 1을 나타낼 때, 적절하게는 R₁₀은 Me, OH 또는 CH₂OH를 나타낸다.

p가 1을 나타낼 때, 적절하게는 R₁₁은 Me, H 또는 CH₂OH를 나타낸다.

m과 p 모두 0을 나타낼 때, 적절하게는 R₁₂와 R₁₃ 모두 H를 나타내고, R₁₄는 q가 0 또는 1이고 R₈과 R₉ 모두 H를 나타내는 -(CR₈R₉)_q-OH를 나타낸다.

p가 1을 나타내고 m이 0을 나타낼 때, 적절하게는 R₁₀과 R₁₁ 모두 H를 나타내고, R₁₂는 H를 나타내고, R₁₃은 H, OH 또는 NH₂를 나타내고, R₁₄는 q가 0 또는 1이고 R₈과 R₉ 모두 H를 나타내는 -(CR₈R₉)_q-OH를 나타낸다.

R₆이 -POR₁₅R₁₆을 나타낼 때, 적절하게는 R₁₅와 R₁₆ 모두 CH₃를 나타내거나 또는 모두 CH₂CH₃를 나타낸다.

적절하게는 R₆은 히드록시 아세트산, 3-히드록시-2,2-디메틸프로피온산, 2,3-디히드록시프로피온산, 3-히드록시-2-히드록시메틸프로피온산 또는 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산을 가지고 에스테르를 형성하는 것으로부터 유래된 잔기(residue)를 나타낸다.

화합물 중 하나의 실시예 세트에서, R₆은 C(O)R₇을 나타낸다.

바람직하게는 R₇은 히드록시 아세트산, 3-히드록시-2,2-디메틸프로피온산, 2,3-디히드록시프로피온산, 3-히드록시-2-히드록시메틸프로피온산 및 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산으로 이루어진 목록으로부터 선택되는 산, 특히 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산과 거대 고리형(macrocyclic) 알코올과의 축합 반응에 의해 형성된 모이어티이다.

R₁₅가

을 나타낼 때, 이러한 모이어티의 예로는 (i) 글루코스(즉, R₁₈이 CH₂OH를 나타내고, 각각 R₁₆과 R₁₇이 OH를 나타냄), 예를 들면 D-글루코스, (ii) 글루코사민(즉, R₁₈이 CH₂OH를 나타내고, 각각 R₁₆은 OH를 나타내고, R₁₇은 NH₂를 나타냄), 예를 들면, D-글루코사민, (iii) 글루쿠론산(즉, R₁₈이 COOH를 나타내고, 각각 R₁₆과 R₁₇이 OH를 나타냄), 예를 들면 D-글루쿠론산 및 (iv) 아라비노스(즉, R₁₈이 H를 나타내고, 각각 R₁₆과 R₁₇이 OH를 나타냄), 예를 들면 D-아라비노스와 아세탈을 형성함으로써 형성되는 모이어티를 포함한다.

R₁₅가

를 나타낼 때, 이러한 모이어티의 예로는 프럭토오스(즉, 각각의 R₁₆이 OH를 나타냄), 예를 들면 D-프럭토오스의 잔기와 아세탈을 형성함으로써 형성되는 모이어티를 포함한다.

R₁₅가

를 나타낼 때, 이러한 모이어티의 예로는 글루쿠론산(즉, 각각의 R₁₆이 OH를 나타냄), 예를 들면 D-글루쿠론산의 잔기와 에스테르를 형성함으로써 형성되는 모이어티를 포함한다.

일반적으로, 본원 발명의 화합물은 하기 식 (II)의 39-데스메톡시라파마이신의 반-합성 유도체화에 의해 제조된다.

따라서, 식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조 방법은

(a) R_A가 H 또는 (CH₂)₂-OH를 나타내는 하기 식 (II)의 39-데스메톡시라파마이신 유사체 또는 그의 보호된 유도체와,

하기 식 (III)의 화합물 또는 R₆의 활성화된 유도체를 반응시키는 단계;

(b) 식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 식 (I)의 또 다른 화합물 또는 그의 또 다른 약제학적으로 허용가능한 염으로 전환시키는 단계; 또는

(c) 식 (I)의 보호된 화합물을 탈보호하는 단계를 포함한다.

상기에서 사용된 용어 "활성화된 유도체"는 (예를 들지만, 제한이 없음) 다음을 지칭한다: 에스테르의 경우에는 - 카르복시산, 아실 할라이드, 혼합된 무수물(mixed anhydride), 대칭성(symmetrical) 무수물 또는 카르복시 에스테르; 에테르의 경우에는 - 알킬 할라이드, 알킬 메실레이트, 알킬 트리플레이트, 알킬 토실레이트 또는 다른 적절하게 활성화된 알킬 유도체; 포스페이트와 포스포네이트의 경우에는 - 클로로포스페이트, 디알킬 시아노포스페이트, 디알킬 디알킬포스포르아미데이트 또는 클로로포스파이트; 또는 글리코실기로부터 유래되는 아세탈의 경우에는, 글리코실 공여체 예를 들면 글리코실 할라이드, 티오글리코시드, 1-O-아실 글리코시드, 오르토 에스테르, 1-O 또는 1-S 카보네이트, 트리클로로이미데이트, 4-펜테닐 글리코시드, 글리코실 포스페이트 에스테르, 1-O-술포닐 또는 1-O-실릴화된(silylated) 글리코시드.

단계 (a)에서, 식 (II)의 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 WO 제2004/007709호에서 기술된 바에 따라 및 본원 명세서의 실시예에서 추가로 규정된 바에 따라 제조될 수 있다.

본원 명세서에서 제공된 특정 방법과 참조 문헌뿐만 아니라, 당해 분야의 당업자는 또한 합성 방법을 위한 표준 교과서 참조 문헌을 찾아볼 수 있고, 참조 문헌으로는 Vogel's textbook of practical organic chemistry (Furniss et al ., 1989)과 March's advanced organic chemistry (Smith and March, 2001 )을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

추가적으로, 존재하는 히드록시기는 당해 분야의 당업자에게 이용가능한 수많은 표준적인 히드록시 보호 방법 중 하나에 의해 보호될 수 있다. 히드록시기는 에테르를 형성함으로써 보호될 수 있고, 에테르로는 치환된 알킬 에테르, 치환된 벤질 에테르 및 실릴 에테르를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 실릴 에테르는 실란의 활성화된 형태(실릴 클로라이드 또는 실릴 트리플레이트를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아님)와 39-데스메톡시라파마이신을, 적절한 염기 존재 하에서 반응시킴으로써 형성되고, 실릴 에테르로는 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, t-부틸디메틸실릴 에테르 및 t-부틸디페닐실릴 에테르를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 그런 다음, 보호기는 산 가수분해 또는 플루오라이드에 의해 도움을 받는 개열(cleavage)에 의해 제거될 수 있다. 1,2-디올은 아세톤 유도체의 축합 반응에 기초하여, 아세토니드로 보호될 수 있다. 이것은 산 촉매에 의해 제거될 수 있다.

식 (II)의 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 추가로 반-합성을 위한 템플레이트(template)로서 사용될 수 있다(즉, 단계 (a)). C-40에 매달려 있는 히드록시기는 당해 분야의 당업자에게 알려져 있는 수많은 합성 변환을 통하여 예를 들면 아실레이션, 알킬레이션, 글리코실레이션 또는 포스포릴레이션에 의해 작용기화될 수 있다(functionalize).

단계 (a)에서, R₆이 식 -C(O)R₇, 또는 R₁₅가

을 나타내고 Y 결합인 Y-R₁₅의 모이어티를 나타낼 때, 히드록시 에스테르의 형성 또는 O-아실레이션은 식 (II)의 화합물의 히드록시기와, 상응하는 카르복시산 바람직하게는 활성화된 형태 예를 들면 W가 친핵성 공격에 대해 카르복시산을 활성화시키는 기(group)인 하기 식 (IIIAi) 또는 (IIIAii)의 화합물

또는 하기 식 (IIIB)의 화합물과의 반응에 의해 매개될 수 있다.

카르복시산은 예를 들지만 제한 없이, 아실 할라이드(예를 들면, W = Cl), 혼합된 무수물(즉, W = OC(O)R'), 대칭성 무수물(W = OC(O)R₇) 또는 카르복시 에스테르(즉, W = OR')의 형성에 의해 활성화될 수 있다.

식 (IIIAi), (IIIAii) 또는 (IIIB)의 화합물은 당해 분야의 당업자에게 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 상업적으로 입수가능한 카르복시산으로부터 제조될 수 있고, 특정 실시 형태에서, R₇이 (CR₈R₉)_m(CR₁₀R₁₁)_pCR₁₂R₁₃R₁₄인 식 (IIIAi)에 따른 화합물은 미국특허 제5,362,718호, 미국특허 제5,665,772호 또는 유럽특허 제O 663 916호에서 기술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

바람직하게는, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 유기 매질에서 산 염화물 또는 혼합된 무수물과 함께 염기 존재 하에서 반응하게 된다. 사용될 수 있는 염기로는 피리딘, 4,4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 2,6-루티딘, 2,6-디-터트-부틸피리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 기타 트리알킬아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU) 또는 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔(DBN)을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본원 명세서에서 기술된 특정 실시예에서, 39-데스메톡시라파마이신은 혼합된 무수물과 DMAP 존재 하에서 반응하게 된다.

단계 (a)에서, R₆이 식 -C(O)R₇, 또는 R₁₅가

을 나타내고, Y가 -C(O)O- 또는 -(CH₂)₂-OC(O)O-인 식 Y-R₁₅의 모이어티를 나타낼 때, 이러한 히드록시 에스테르의 형성은 식 (II)의 화합물 또는 식 40-O-(히드록시에틸)-식 II의 화합물의 히드록시기와, T = 결합 또는 -O(CH₂)₂-이고 R₂₄가 알킬기 또는 아릴기 바람직하게는 아릴기 특히 파라-니트로페닐기인 하기 식 (IV)의 화합물과 같은 활성화된 카보네이트를 형성하는 시약과의 반응을 필요로 한다.

(IV)

이때, 식 IV의 화합물은 식 III의 화합물과 반응하여, 카보네이트 링커(carbonate linker)를 통해 R₆이 40-히드록시 또는 40-O-(히드록시에틸)기에 붙어 있는 화합물을 생성할 수 있다(WO 제2004/101583호).

마찬가지로, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는, 상기 39-데스메톡시라파마이신 유사체를 선택된 적절하게 활성화된 알킬 유도체와 반응시킴으로써, C-40에서 다양한 히드록시 에테르로 유도체화되어 40-O-알킬-39-데스메톡시라파마이신 유도체를 형성할 수 있다. 활성화된 알킬기는 많은 방법 중 어느 하나에 의해 활성화되는 알킬기를 지칭하는데, 상기 방법으로는 알킬 할라이드(RCl, RI, RBr), 알킬 메실레이트(ROS(O)₂CH₃), 알킬 트리플레이트(ROS(O)₂CF₃), 알킬 토실레이트(ROS(O)₂PhMe)의 형성을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아니다. 그런 다음, 활성화된 알킬기는 유기성 매질에서 적절한 염기 존재 하에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체와 반응할 수 있다. 다른 반응성 위치에서 알킬레이션을 피하기 위하여, 반응 조건을 최적화하는 표준 방법이 당해 분야의 당업자들에 의해 사용될 수 있다.

마찬가지로, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 인산화될 수 있고, 포스페이트 에스테르의 탈보호 후에, 이것은 40-O-포스포-39-데스메톡시라파마이신 유도체 또는 40-O-디알킬포스포-39-데스메톡시라파마이신 유도체, 및 당해 분야의 당업자에게 알려져 있는 방법에 의해 만들어진 이들 유도체의 염을 산출할 수 있다. 포스페이트 에스테르는 직접적으로 생성될 수 있고, 또는 3가(trivalent) 포스파이트가 5가(pentavalent) 포스페이트로 산화되는(바람직하게는 mCPBA와 같은 과산(peracid)과의 반응에 의하지만, 이에 제한되는 것은 아님) O-포스파이트(즉, (R'O)₂POR)를 경유하여 간접적으로 생성될 수 있다. 직접적인 인산화 방법은 39-데스메톡시라파마이신 유사체와 보호된 클로로포스페이트(예를 들면, (BnO)₂P(O)Cl, (알킬O)₂P(O)Cl)와의 반응 바람직하게는 DMAP 존재 하에서 유기성 매질에서의 반응, 또는 트리에틸아민과 같은 염기 존재 하에서, 39-데스메톡시라파마이신 유사체와 포스포러스 옥시클로라이드(POCl₃)와 반응시킨 다음에, 뒤이어 그 결과물인 O-디클로로포스페이트(즉, ROP(O)Cl₂)를 산 가수분해시키거나, 또는 디알킬 시아노포스페이트와 커플링시키는 것을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다(WO 제 01/81355호). 디알킬 또는 디아릴 클로로포스페이트는 염기 존재 하에서 디알킬 또는 디아릴 포스파이트(즉, (RO)₂P(O)H)와 사염화탄소와의 반응에 의해 인 시투(in situ)로 생성될 수 있다. O-포스파이트(O-포스페이트로 산화시키기 위함)를 생성하는 방법은 염기(바람직하게는 테트라졸) 존재 하에서 39-데스메톡시라파마이신 유사체를 디알킬 디알킬포스포르아미데이트(바람직하게는, 디알킬 디이소프로필포스포릴아미데이트)와 커플링시키는 단계, 또는 염기 존재 하에서 클로로포스파이트를 사용하여 커플링시키는 단계를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다(Evans et al ., 1992). 보호기의 선택이 중요하고, 포스페이트의 에틸 에스테르와 메틸 에스테르는 산성 또는 염기성 조건 하에서 쉽게 가수분해될 수 없다. 바람직하게는, 보호기는 벤질 에스테르(소듐 아이오디드/클로로트리메틸실란 촉매되는 가수분해를 통해 제거됨, (WO 제01/81355호)), 또는 2-시아노에틸 에스테르(약한 염기로 촉매되는 개열(cleavage)에 의해 제거됨)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 마찬가지로, 40-O-디알킬포스포노-39-데스메톡시라파마이신 유도체는 39-데스메톡시라파마이신 유사체와, 적절하게 활성화된(상기에서 기술한 바와 같음) 디알킬포스포네이트 또는 디알킬포스파이트와 반응시킴으로써 생성될 수 있다.

단계 (a)에서, R₁₅가 식

또는

의 모이어티를 나타낼 때, 글리코시딕 결합(glycosidic linkage)의 형성 또는 O-글리코실레이션은 히드록시기와, 상응하는 글리코실 공여체 바람직하게는 활성화된 형태(Toshima and Tatsuta (1993)를 참조한다) 예를 들면 하기 식 (IIIC)의 화합물

또는 하기 식 (IIID)의 화합물과의 반응에 의해 매개될 수 있다.

'글리코실 공여체'를 사용하여, 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 유기성 매질에서, 바람직하게는 활성화제(루이스 산 또는 중금속 염과 같은 것, Toshima and Tatsuta, 1993를 참조한다) 존재 하에서 글리코실화될 수 있고, 상기 글리코실 공여체로는 글리코실 할라이드(Z = F, Cl, Br), 티오글리코시드(Z = SMe, Set, SPh, SPy, SCN), 1-O-아실 글리코시드(Z = OC(O)R), 오르토 에스테르(Z = 0C(Me)(R)(식(IIIC/IIID)의 0-C2), 1-0 또는 1-S 카보네이트(Z = OC(S)SMe, Z = OC(O)이미다졸, Z = OC(S)이미다졸, Z = SC(S)OEt), 트리클로로이미데이트(Z = 0C(=NH)CCl₃), 4-펜테닐 글리코시드(Z = OCH₂CH₂CH₂CH=CH₂), 포스페이트 에스테르(예를 들면, Z = OP(O)(OPh)₂), 1-O-술포닐 (Z = 토실), 또는 1-0-실릴화된 글리코시드(Z = OTMS 또는 OTBS)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 사용된 특정 글리코실 공여체와 반응 조건은 알파 또는 베타 글리코시드가 형성되는지 여부를 결정할 것이다. 아실레이션 하기 전에, 모체 화합물에 존재하는 소정의 히드록시기는 보호되거나 또는 가려져서(masked), 글리코실 공여체 1 당량을 사용하여 40-O-아실레이션을 하게 할 것이다. 글리코실 공여체에 남아있는 히드록시는 예를 들면 O-아세테이트, O-벤조에이트, 1,2-아세토니드로 보호되어야만 하고, 그래서 추가적인 탈보호가 필요할 것이다. 또한, 글리칼(glycal)과 같은 2-데옥시글리코실 공여체가 사용되어(환원 단계가 또한 필요함) 2'-데옥시-39-데스메톡시라파마이신 글리코시드를 제조할 수 있고, 2,6-안히드로-2-티오슈가(2,6-anhydro-2-thiosugar)와 같은 2,6-디데옥시글리코실 공여체가 사용되어, 2',6'-디데옥시-39-데스메톡시라파마이신 글리코시드를 제조할 수 있다.

단계 (b)에서, 염 형성과 교환은 당해 분야에서 당업자에 의해 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 식 (I)의 화합물의 상호 변환은 공지된 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들면 히드록시기와 케토기는 본원 명세서에서 기술된 바에 따라 산화/환원에 의해 상호 변환될 수 있다. R₆이 -PO(OH)₂를 나타내는 식 (I)의 화합물은 R₆이 OH를 나타내는 상응하는 식 (I)의 화합물을 인산화시킴으로써 제조될 수 있다. 적절한 조건은 본원 명세서에서 제공되어 있다.

단계 (a)와 (c)에서, 보호기의 실시예와 이들의 제거 방법은 T W Greene "Protective Groups in Organic Synthesis" (J Wiley and Sons, 1991 )에서 발견될 수 있다. 적절한 히드록시 보호기는 가수분해에 의해 제거될 수 있는 알킬(예를 들면 메틸), 아세탈(예를 들면 아세토니드) 및 아실(예를 들면 아세틸 또는 벤조일), 및 촉매 가수분해에 의해 제거될 수 있는 아릴알킬(예를 들면 벤질), 또는 산성 가수분해 또는 플루오라이드에 의해 도움을 받는 개열에 의해 제거될 수 있는 실릴 에테르를 포함한다.

단계 (a)에서 뿐만 아니라, R₆이 R₇을 나타내는 식 (I)의 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 리파제에 의해 촉매되는 에스테르교환 반응에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면 제한되지는 않지만, 식 (II)의 39-데스메톡시라파마이신 유사체는 Gu et al ., (2005)에서 기술되고 본원 명세서의 실시예에서 추가로 규정된 반응 조건 하에서, 리파제 PS-C "아마노(Amano)" II 존재 하에서, 하기 식 (V)의 비닐 에스테르와 반응할 수 있다. 이러한 방법은 비닐 에스테르의 사용에 제한되지 않고, 에스테르 교환 반응은 다른 리파제 또는 에스테라제에 의해 촉매될 수 있다.

본원 발명의 다른 화합물은 본래 알려져 있는 방법에 의해서 또는 상기 기술된 방법과 유사한 방법에 의해서 제조될 수 있다.

신규 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 직접적으로, 및 면역 억제제, 항진균제, 항암제, 항염증제, 신경 재생제(neuroregenerative agent) 또는 조직이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 혈관 질환 및/또는 섬유성 질환의 치료를 위한 물질로서 유용한 화합물을 생성하기 위한 추가적인 반-합성 또는 생물학적 변환(bioconversion)을 위한 템플레이트로서 유용하다. 라파마이신과 그의 유사체의 반합성 유도체화 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면 미국특허 제5,665,772호;미국특허 제5,362,718호, WO 제96/41807호;미국특허 제5,728,710호, 미국특허 제5,378,836호;미국특허 제5,138,051호;미국특허 제5,665,772호, 미국특허 제5,391,730호;미국특허 제5,023,262호, 미국특허 제5,563,145호, 미국특허 제5,446,048호, 미국특허 제5,912,253호, 미국특허 제 5,221,670호;미국특허 제5,955,457호; WO 제98/04279호, 미국특허 제6,015,815호 및 미국특허 5,432,183호에서 기술된 변형을 포함한다(이들에 제한되는 것은 아님).

상기 중간체(예를 들면, 식 (II)의 화합물)의 구조는 호변이체화(tautomerisation)를 할 수 있고, 대표적인 호변이체가 설명될 때, 예를 들면 에놀 화합물이 설명될 때 케토 화합물 및 그 역이 성립하는 모든 호변이체가 언급되어 있음은 이해될 것이다.

또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 의약에서의 용도를 제공한다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 면역 억제의 유도 또는 유지, 신경 재생의 촉진 또는 암, B-세포 악성 종양, 진균 감염, 조직이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료를 위한 의약 또는 창상 치유의 조절에서 사용하기 위한 물질의 제조에서, 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다.

다 약제 내성(Multi-Drug Resistance, MDR)은 암과 B-세포 악성 종양의 치료에서 중요한 문제이다. 이것은 많은 암에서 약제 내성의 개발 뒤에 있는 주요한 이유이다(Persidis A, 1999). MDR은 아데노신 트리포스페이트 결합하는 카세트(cassette) 트랜스포터(transporter)(ABC 트랜스포터)의 증가된 수준, 특히 P-당단백질(P-glycoprotein, P-gp)을 코딩하는 MDR1 유전자 또는 MRP1을 코딩하는 MRP1 유전자 발현의 증가와 관련되어 있다. MDR1 유전자의 발현 수준은 다양한 암-유래된(cancer-derived) 세포 주에서 광범위하게 변화하고, 소정의 세포주에서는 검출될 수 없는 반면에, 다른 세포주에서는 표준 대조군에 비해 10배 또는 100배까지 증가된 발현을 보여줄 수 있다.

따라서, 본원 발명의 또 다른 실시 형태는 MDR 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 P-gp-발현하는(P-gp-expressing) 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다. 또 다른 보다 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 매우 P-gp를 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다. 특히, 매우 P-gp를 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양은 대조군 수준에 비하여 2배, 5배, 20배, 25배, 50배, 또는 100배 증가된 발현을 가질 수 있다. 적절한 대조군은 P-gp를 발현하지 않는 세포이고, 이들은 P-gp의 낮은 발현 수준을 가지고 있거나 또는 낮은 MDR 기능을 가지고 있으며, 당해 분야의 당업자는 그러한 세포주를 인식하거나 또는 확인할 수 있다: 예를 들면(그러나, 이들에 제한되는 것은 아님), 적절한 세포주로는 다음을 포함한다: MDA435/LCC6, SBC-3/CDDP, MCF7, NCI-H23, NCI-H522, A549/ATCC, EKVX, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, HOP-18, HOP-92, LXFL 529, DMS 114, DMS 273, HT29, HCC-2998, HCT-116, COLO 205, KM12, KM20L2, MDA-MB-231/ATCC, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T-47D, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, IGROV1, SK-OV-3, K-562, MOLT-4, HL-60(TB), RPMI-8226, SR, SN12C, RXF-631, 786-0, TK-10, LOX IMVI, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, M14, UACC-62, UACC-257, PC-3, DU-145, SNB-19, SNB-75, SNB-78, U251 , SF-268, SF-539, XF 498.

또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 MDR 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본원 발명은 P-gp-발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다. 또 다른 보다 바람직한 실시 형태에서, 본원 발명은 매우 P-gp를 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용도를 제공한다. 특히 매우 P-gp를 발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양은 대조군의 수준에 비하여 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배 또는 100배 증가된 발현을 가질 수 있다. 적절한 대조군은 상기에서 기술되어 있다.

시료에서 P-gp의 발현 수준을 결정하는 방법은 본원 명세서에서 추가로 논의된다.

따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명은 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, P-gp-발현하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 방법을 제공한다. 특정 암 형태에서 P-당단백질(P-gp)의 발현 수준은 이들에 제한되는 것은 아니지만, 실시간 RT-PCR(Szakacs et al., 2004; Stein et al ., 2002; Langmann et al ., 2003, Alvarez et al ., 1995, Boyd et al ., 1995)에 의해, 면역 조직 화학에 의해(Stein et al ., 2002) 또는 마이크로어레이를 사용하는 것을(Lee et al ., 2003) 포함하는 기법을 사용하여 당해 분야의 당업자에 의해 측정될 수 있다.

당해 분야의 당업자는 보통의 실험에 의해 이러한 화합물이 진균 성장을 억제하는 능력을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Baker, H., et al ., 1978; NCCLS 이스트를 위한 배양액 희석 항진균 민감도 테스트를 위한 참조 방법: Approved standard M27-A, 17(9). 1997). 또한, 당해 분야의 당업자는 보통의 실험에 의해 이러한 화합물이 종양 세포 성장을 억제하는 능력을 결정할 수 있을 것이다(Dudkin, L., et al ., 2001 ; Yu et al ., 2001을 참조한다). 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명의 화합물은 면역억제를 유도하는데 유용하고, 이러한 부문에서 화합물의 효능을 결정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들지만 제한되지 않지만, 면역 억제 활성 - Warner, LM., et al ., 1992, Kahan et al., (1991) & Kahan & Camardo, 2001); 동종 이식편 - Fishbein, T.M., et al ., 2002, Kirchner et al ., 2000; 자가면역/항염증/천식 - RP. et al ., 1993, Powell, N. et al., 2001; 제 I형 당뇨병 - Rabinovitch, A. et al., 2002; 건선 - Reitamo, S. et al ., 2001; 류마티즘성 관절염 - Foey, A., et al ., 2002; 섬유증 - Zhu, J. et al ., 1999, Jain, S., et al ., 2001, Gregory et al ., 1993을 포함한다.

본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 면역 억제를 유도하는 능력은 이러한 목적을 위해 사용되는 표준 상태에서 입증될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 항섬유화(antifibrotic), 신경 재생 및 항혈관신생 메카니즘과 관련하여 유용하고, 당해 분야의 당업자는 보통의 실험에 의하여 이러한 화합물이 신생 혈관 형성을 막는 능력을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Guba, M., et al ., 2002). 당해 분야의 당업자는 보통의 실험에 의해 이러한 화합물이 혈관의 과다 증식 질환, 예를 들면 약물 용출성 스텐트(drug-eluting stent)에서 혈관의 과다 증식 질환을 치료하는 용도를 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Morice, M. C, et al ., 2002). 또한, 당해 분야의 당업자는 보통의 실험에 의해서 이러한 화합물의 신경재생 능력을 결정할 수 있을 것이다(예를 들면, Myckatyn, T.M., et al ., 2002, Steiner et al ., 1997).

또한, 본원 발명은 약제학적으로 허용가능한 캐리어(carrier)와 함께, 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

라파마이신과, CCI-779 및 RAD001과 같이 임상 시도에 있거나 또는 있어 온 관련 화합물은 좋지 못한 약리학적 프로파일, 좋지 못한 수 용해도 및 좋지 못한 생체 이용가능성을 갖고 있다. 본원 발명은 개선된 안정성 및/또는 증가된 세포막 투과성과 같은 개선된 특징을 갖는 39-데스메톡시라파마이신 유도체를 제공한다. 당해 분야의 당업자는 표준 방법을 사용하여 제공된 화합물의 용해도를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 대표적인 방법은 본원 명세서에서 실시예에서 보여지고 있다.

또한 당해 분야의 당업자는 당해 분야의 당업자에게 알려져 있는 생체 내 및 생체 외 방법을 사용하여 본원 발명 화합물의 약동력학과 생체 이용가능성을 결정할 수 있을 것이고, 이러한 방법으로는 하기 및 실시예에서 기술된 방법을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아니고, 택일적인 분석법이 당해 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이러한 분석법으로는 하기에서 기술된 것과 Gallant-Haidner et al ., 2000 및 Trepanier et al ., 1998 및 본원 명세서의 참조 문헌에서 기술된 것을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 화합물의 생체 이용가능성은 수많은 요소(예를 들면, 수 용해도, 소화관에서 흡수율, 단백질 결합 정도 및 대사)에 의해 결정되고, 이들 각각은 하기에서 기술된 생체 외 테스트에 의해 결정될 수 있고, 이러한 요소들 중 하나 이상의 개선이 화합물의 생체 이용가능성의 개선을 이끌 수 있음은 당해 분야의 당업자들에 의해 인식되고 있을 것이다. 택일적으로, 화합물의 생체 이용가능성은 하기에서 보다 상세하게 기술된 생체 내 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

Caco -2 투과성 분석

예를 들면 In Vitro Technologies Inc.(IVT Inc., Baltimore, Maryland, USA)에 의해 제공되는 바와 같이, 24 웰 Corning Costar Transwell 포맷에 있는 집합성 Caco-2 세포(Li, A.P., 1992; Grass, G. M., et al ., 1992, Volpe, D.A., et al., 2001 )가 사용될 수 있다. 첨부 챔버(apical chamber)는 0.15 mL 행크의 균형맞춘 완충 용액(Hank's balanced buffer solution, HBBS) pH 7.4, 1 % DMSO, 0.1 mM 루시페르 옐로우(Lucifer Yellow)를 포함한다. 바닥 챔버(basal chamber)는 0.6 mL HBBS pH 7.4, 1% DMSO를 포함한다. 그런 다음, 대조군과 테스트 시료를 가습 배양기에서 37℃에서 배양하였고, 130 rpm에서 1시간 동안 흔들어준다. 루시페르 옐로우는 세포사이(paracellular)(꽉 뀌는 접합 사이) 경로를 통해서만 투과하고, 루시페르 옐로우의 높은 겉보기 투과도(Apparent Permeability Papp)는 분석하는 동안 세포 손상을 나타내고, 그러한 모든 웰은 제거되었다. 프로파놀올(공지된 트랜스포터 효과가 없는, 좋은 수동적 투과)과 아세부탈올(acebutalol)(P-당단백질에 의한 능동적 배출에 의해 약화된, 좋지 못한 수동적 투과)이 표준 화합물로 사용된다. 화합물은 첨부 챔버 또는 바닥 챔버에 화합물을 적용함으로써(0.01 mM에서), 일 방향 및 이 방향 포맷에서 테스트될 수 있다. 첨부 챔버 또는 바닥 챔버에 있는 화합물은 HPLC-MS에 의해 분석된다. 그 결과는 겉보기 투과도, Papp, (nm/s)와 플럭스 비율(Flux Ratio)(A 대 B와 B 대 A에 대하여)로서 표현된다.

용적 수용체(Volume Acceptor): 0.6 ml (A>B) 및 0.15 ml(B>A)

단일층 면적: 0.33 cm²

△시간: 60분

플럭스 비율의 양의 값은 세포의 첨부 표면(apical surface)으로부터 능동적 배출을 나타낸다.

인간의 간 마이크로좀 ( Human Liver Microsomal , HLM ) 안정성 분석

간 균질 현탁액(homogenate)은 화합물의, CYP450(예를 들면, CYP2C8, CYP2D6, CYP1A, CYP3A4, CYP2E1), 에스테라제, 아미다제, 및 플라빈 모노옥시게나제(FMO)를 포함하는, 단계 I(산화) 효소에 대해 본질적인 약한 정도의 측정값을 제공한다.

테스트 화합물의 반감기(T1/2)는 인간 간 마이크로좀에 대한 노출에서, LC-MS에 의해서 시간에 따른 소멸을 모니터함으로써 결정될 수 있다. 0.001 mM에서 화합물은 0.25 mg/mL 단백질의 인간의 간 마이크로좀 세포 이하의(sub-cellular) 부분 및 보인자로서 포화 수준의 NADPH와 함께 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4에서 40분 동안 37℃에서 유지된다. 정기적인 간격으로, 단백질을 침전시키고 대사를 중단시키기 위해 아세토니트릴이 테스트 시료에 첨가된다. 시료를 원심 분리하였고, HPLC-MS에 의하여 모체 화합물을 위해 분석된다.

생체 내( in vivo ) 생체이용가능성 분석

또한, 생체 내 분석은 화합물의 생체 이용가능성을 측정하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Crowe et al ., 1999을 참조한다). 일반적으로, 화합물은 테스트 동물(예를 들면, 마우스 또는 랫트)에게 복막속으로(i.p.) 또는 정맥내로(i.v.) 및 경구로(p.o.) 두 개의 방법으로 투여되고, 정기적인 간격으로 혈액 샘플이 채취되어 약물의 혈장 농도가 시간에 따라 어떻게 변화하는지를 조사하게 된다. 시간에 따른 혈장 농도의 시간 추세가 사용되어 표준 모델을 사용하여 화합물의 절대적인 생체 이용가능성을 퍼센트로 계산할 수 있다. 통상적인 프로토콜의 예는 하기에서 기술되어 있다.

마우스에게 본원 발명의 화합물 또는 모체 화합물 3 mg/kg을 i.v.로 또는 본원 발명의 화합물 또는 모체 화합물 10 mg/kg을 p.o.로 투여한다. 혈액 샘플이 5분, 15분, 1시간, 4시간, 및 24시간 간격에서 채취되고, 본원 발명의 화합물 또는 모체 화합물의 시료에서의 농도가 HPLC를 통해 결정된다. 그런 다음, 혈장 농도의 시간-추세가 사용되어 혈장 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC-이것은 대순환에 도달하는 변하지 않은 약물의 전체량과 직접적으로 비례한다), 최대(피크) 혈장 약물 농도, 최대 혈장 약물 농도가 일어나는 시간(피크 시간)과 같은 핵심적인 파라미터를 도출해내는데 사용될 수 있고, 생체 이용가능성의 정확한 결정에서 사용되는 추가적인 요소는 화합물의 최종 반감기(terminal half life), 전체 채내 소실(total body clearance), 안정-상태의 분배 부피 및 F％를 포함한다. 그런 다음, 이러한 파라미터들은 비-구획적인(non-compartmental) 또는 구획적인(compartmental) 방법에 의해 분석되어 계산된 퍼세트 생체 이용가능성을 제공하고, 이러한 방법의 형태의 예로서 Gallant-Haidner et al ., 2000 및 Trepanier et al ., 1998 및 본원 명세서의 참조 문헌을 참고한다.

상기 언급된 본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체 또는 그의 제제는 소정의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있고, 예를 들지만 제한 없이 이들은 비경구로, 경구로, 국소로(볼 부위, 혀 밑, 또는 경피를 포함), 의료 장치를 통해(예를 들면, 스텐트), 흡입에 의해 또는 주사를 통해(피하 또는 근육내) 투여될 수 있다. 치료는 일정 시간에 걸쳐 단일 투여 또는 복수회의 투여로 구성될 수 있다.

본원 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 하나 이상의 허용가능한 캐리어와 함께, 약제학적 제제로서 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 캐리어(들)는 본원 발명의 화합물과 양립가능하다는 의미에서 "허용되어야만" 하고, 그 복용자에게 해로워서는 않 된다. 적절한 캐리어의 예가 하기에서 보다 상세하게 기술되어 있다.

본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 단독으로 또는 다른 치료제와 병행하여 투여될 수 있고, 두 개(또는 그 이상) 물질의 동시-투여는 각각이 사용되는 것에 비해 상당히 더 낮은 투여량을 허용하고, 따라서 관찰되는 부작용을 감소시킨다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애 또는 염증성 질환의 치료를 위한 또 다른 제제와 함께 동시-투여되는데, 바람직한 제제로는 예를 들면, 아자티오프린(azathioprine), 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, FK506, 미코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil), OKT-3 및 ATG와 같은 면역 조절제를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

택일적인 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료를 위해 또 다른 치료제와 함께 동시-투여되는데, 바람직한 제제로는 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프리니손(prenisone), 블레오마이신, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜( toremifene), 메게스트롤(megestrol) 아세테이트, 아나스트로졸(anastrozole), 고세렐린(goserelin), 항-HER2 모노클로날 항체(anti-HER2 monoclonal antibody)(예를 들면, Herceptin^TM), 카페시타빈, 랄록시펜 히드로클로라이드, EGFR 억제제(예를 들면, Iressa^®, Tarceva^TM, Erbitux^TM), VEGF 억제제(예를 들면, Avastin^TM), 프로테아좀 억제제(예를 들면, Velcade^TM), Glivec^® 또는 hsp90 억제제(예를 들면, 17-AAG)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 방사선 치료 또는 외과 수술을 포함하는 다른 치료법과 병행하여 투여될 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 혈관 질환의 치료를 위해 또 다른 치료제와 함께 동시-투여되고, 바람직한 제제로는 ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 안타고니스트, 피브르산(fibric acid) 유도체, HMG-CoA 환원효소 억제제, 베타 아드레날린성 차단제(beta adrenergic blocking agent), 칼슘 채널 차단제, 항산화제, 항응고제 및 혈소판 억제제(platelet inhibitor)(예를 들면, Plavix^TM)를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 신경 재생의 촉진을 위해 또 다른 치료제와 함께 동시-투여되고, 바람직한 제제로는 신경영양성 인자 예를 들면 신경 성장 인자, 신경교세포 유래 성장 인자, 뇌 유래 성장 인자, 섬모 신경영양성 인자 및 뉴로트로핀(neurotrophin) 3을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

하나의 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 진균 감염의 치료를 위해 또 다른 치료제와 동시-투여되고; 바람직한 제제로는 암포테리신 B, 플루시토신, 에치노칸딘(echinocandin)(예를 들면, 카스포푼진(caspofungin), 아니둘라푼진(anidulafungin) 또는 미타푼진(micafungin)), 그리세오풀빈, 이미다졸 또는 트리아졸 항진균제(예를 들면, 클로트리마졸, 미코나졸, 케토코나졸, 에코나졸, 부토코나졸, 옥시코나졸, 테르코나졸(terconazole), 이트라코나졸, 플루코나졸 또는 보리코나졸)을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

당업자들에게 명백한 바와 같이, 동시-투여에는 치료 방법의 일 부분으로서 환자에게 두 개 이상의 치료제를 전달하는 소정의 방법이 포함된다. 두 개 이상의 제제가 단일한 제제에서 동시에 투여될 수 있지만, 이것이 필수적인 것은 아니다. 제제는 다른 제제로 및 다른 횟수로 투여될 수 있다.

제제는 단일 투여 제형으로 손쉽게 제시될 수 있고, 약학 분야에서 잘 알려져 있는 소정의 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법으로는 한 개 이상의 부수적인 성분을 구성하는 캐리어와 함께, 활성 성분(본원 발명의 화합물)의 회합(association)을 초래하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 액체형 캐리어 또는 미세하게 나누어진 고체형 캐리어 또는 이들 모두와 함께, 활성 성분의 회합을 균일하게 및 직접적으로 초래함으로써, 그런 다음, 필요하다면, 제품으로 형태를 만듬으로써 제조된다.

본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 보통 활성 성분으로 포함하는 약제학적 제제의 제형으로, 선택적으로는 독성이 없고 유기성 또는 무기성인 산 또는 염기 부가염의 제형으로, 약제학적으로 허용가능한 투여 제형으로, 경구로 또는 소정의 비경구 경로에 의해 투여될 것이다. 질환 및 치료될 환자뿐만 아니라, 투여 경로에 의존하여, 조성물은 투여량을 변화시키면서 투여될 수 있다.

예를 들면, 본원 발명의 화합물은 경구로, 볼 내로, 또는 혀 밑으로, 감미제 또는 착색제를 포함할 수 있는 정제, 캡슐, 밑씨(ovule), 엘릭시르, 액제 또는 현탁제의 제형으로, 즉시 방출성(immediate-release), 지연 방출성(delayed-release) 또는 제어 방출성(controlled-release) 적용을 위해 투여될 수 있다.

경구 투여를 위해 적절한 39-데스메톡시라파마이신 유도체의 용액 또는 현탁제는 또한 부형제 예를 들면 N,N-디메틸아세트아미드, 분산제 예를 들면 폴르소르베이트 80, 계면 활성제, 및 가용화제 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 포살 50 PG(Phosal 50 PG)(포스파티딜콜린, 대두 지방산, 에탄올, 모노/디글리세라이드, 프로필렌 글리콜 및 아스코르빌 팔미테이트로 구성됨)를 포함할 수 있다.

이러한 정제는 미세결정 셀룰로오스, 락토오스(예를 들면, 락토오스 일수화물, 또는 무수 락토오스), 소듐 시트레이트, 칼슘 카보네이트, 2가 염기성(dibasic) 칼슘 포스페이트 및 글리신, 스타치(바람직하게는 콘, 포테이토 또는 타피오카 스타치), 소듐 스타치 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 소듐 및 소정의 복합체 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리피닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 히드록시-프로필셀룰로오스(HPC), 마크로골 8000, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립화 결합제(granulation binder)를 포함할 수 있다. 또한, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트(behenate) 및 탈크와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.

또한, 유사한 형태의 고형 조성물이 젤라틴 캡슐에서 충진 물질로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 바람직한 부형제는 락토오스, 스타치, 셀룰로오스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁제 및/또는 엘릭시르를 위해서, 본원 발명의 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료와 함께, 유화제 및/또는 현탁제와 함께, 및 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와 함께, 및 이들의 배합물과 함께 혼합될 수 있다.

정제는 선택적으로는 한 개 이상의 부수적인 성분과 함께, 압착 또는 몰딩(moulding)에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 선택적으로는 결합제(예를 들면, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸셀룰로오스), 윤활제, 비활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들면, 소듐 스타치 글리콜레이트, 가교 결합된 폴리돈, 가교 결합된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 표면-활성 또는 분산제와 함께 혼합시켜, 분말 또는 과립과 같은 자유롭게-유동하는 제형으로 된 활성 성분을 적절한 기계에서 압착함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 습윤 상태로 된 분말형 화합물과 비활성 액체형 희석제의 혼합물을 적절한 기계에서 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로는 코팅되거나 또는 겹으로 될(scored) 수 있고, 제제화되어, 본원 명세서에서 활성 성분의 서 방출 또는 제어 방출을 제공할 수 있고, 예를 들면, 다양한 비율로 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 사용하여 바람직한 방출 프로파일을 제공할 수 있다.

경구 투여를 위해 적절한, 본원 발명에 따른 제제는 각각이 미리 정해진 함량의 활성 성분을 포함하는, 캡슐, 교갑(cachet) 또는 정제와 같은 분리된 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비-수성 액체 상태의 액제 또는 현탁제로서; 또는 수중유(oil-in-water) 액체형 에멀젼 또는 유중수(water-in-oil) 액체형 에멀젼으로서 제시될 수 있다. 또한, 활성 성분은 큰 환약(bolus), 연약(electuary), 또는 페이스트(paste)로서 제시될 수 있다.

입 국소 투여를 위해 적절한 제제는 감미된 성분, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거컨스에 활성 성분을 포함하는 로젠지(lozenge); 젤라틴과 글리세린, 또는 수크로스와 아카시아와 같은 비활성 성분에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적절한 액체형 캐리어에 활성 성분을 포함하는 구강-세척액을 포함한다.

상기에서 특별히 언급된 성분들뿐만 아니라, 본원 발명의 제제는 해결이 되는 제제의 형태를 고려하여 당해 분야에서 통상적인 기타 물질을 포함할 수 있고, 예를 들면, 경구 투여를 위해 적절한 제제로는 감미제를 포함할 수 있다.

국소 투여를 위해 개조된 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁제, 로션, 분말, 액제, 페이스트, 겔, 약물이 스며든 드레싱, 스프레이, 에어로졸 또는 오일, 경피용 장치, 살포용 분말, 및 그 등가물로서 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 활성 성분을 포함하여, 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 이들은 또한 방부제, 약물 침투를 도와주는 용매, 크림 또는 연고에서는 연화제(emollient), 및 로션을 위해서는 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은, 양립가능한 통상적인 캐리어와 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 캐리어는 조성물 중 약 1％ 내지 약 98％까지 존재할 수 있다. 더 일반적으로는, 이들은 조성물의 약 80％까지 형성할 것이다. 단지 설명으로서만, 크림 또는 연고는 화합물의 약 5-10 중량％를 포함하는, 충분한 양의 친수성 물질과 물과 혼합함으로써, 목표로 하는 일관성을 갖는 크림 또는 연고를 생산하는 충분한 함량으로 제조된다.

경피 투여를 위해 개조된 약제학적 조성물은 연장된 시간 동안 복용자의 표피와 직접적으로 접촉하도록 하는 분리된 패치로 제시될 수 있다. 예를 들면, 활성 성분은 이온토포레시스(iontophoresis)에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.

외부 조직, 예를 들면 입과 피부에 적용하기 위해서, 조성물은 바람직하게는 국소용 연고 또는 크림으로 적용된다. 연고로 제제화될 때, 활성 성분은 파라핀성(paraffinic) 또는 수-혼화성(water-miscible) 연고 성분과 함께 사용될 수 있다.

택일적으로, 활성 성분은 수중유 크림 성분 또는 유중수 성분과 함께 크림으로 제제화될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 유동성 단위 투여 제형(fluid unit dosage form)은 활성 성분과 멸균된 비히클(vehicle)을 사용하여 제조되고, 비히클로는 예를 들면, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 물이 바람직하다. 사용된 비히클과 농도에 의존하여, 활성 성분은 비히클 내에서 현탁되거나 또는 용해될 수 있다. 액제를 제조할 때, 활성 성분은 적절한 바이알 또는 앰풀에 채우고 밀봉하기 전에 주사용 물에 용해되고 여과로 멸균될 수 있다.

유리하게는, 국소 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 제제가 비히클에 용해될 수 있다. 안정성을 높이기 위해, 조성물은 바이알에 채워진 후 동결될 수 있고 물은 진공 하에서 제거될 수 있다. 그런 다음, 건조 상태의 동결 건조된 분말은 바이알에서 밀봉되고, 주사용 물을 수반한 바이알이 공급되어, 사용하기 전에 액체를 재구성할 수 있다.

비경구용 현탁제는 활성 성분이 비히클에서 용해되는 대신에 현탁되고 여과에 의해 멸균이 수행될 수 없다는 것을 제외하고는, 액제와 실질적으로 동일한 방식으로 제조된다. 활성 성분은 멸균된 비히클에 현탁하기 전에, 에틸렌 옥시드에 노출시킴으로써 멸균될 수 있다. 유리하게는, 계면 활성제 또는 습윤제가 조성물에 포함되어 활성 성분의 균일한 분배를 용이하게 한다.

또한, 본원 발명의 화합물은 당해 분야에서 공지된 의료 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시 형태에서, 본원 발명의 조성물은 미국특허 제5,399,163호; 미국특허 제5,383,851호; 미국특허 제5,312,335호; 미국특허 제5,064,413호; 미국특허 제4,941,880호; 미국특허 제4,790,824호; 또는 미국특허 제4,596,556호에서 개시된 장치와 같은, 바늘이 없는 피하 주사 장치를 가지고 투여될 수 있다. 본원 발명에서 유용한 잘-알려져 있는 임플란트와 모듈(module)의 예로는 다음을 포함한다: 제어된 속도에서 약물을 분산시키기 위한 매몰식 미세-주입 펌프를 개시하고 있는 미국특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하고 있는 미국특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도에서 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하고 있는 미국특허 제4,447,233호; 연속적인 약물 전달을 위한 변동 가능한 흐름 매몰식 주입 장치를 개시하고 있는 미국특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획을 갖는 삼투압식 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국특허 제4,447,224호; 삼투압식 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국특허 제4,475,196호. 특정 실시 형태에서, 39-데스메톡시라파마이신 유도체는 약물 방출 스텐트, 예를 들면 WO 제01/87263호와 관련된 공개 출원에서 개시된 것과 상응하는 것 또는 Perin (Perin, EC, 2005)에 의해 기술된 것과 상응하는 것을 사용하여 투여될 수 있다. 기타 많은 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당해 분야의 당업자에게 알려져 있다.

본원 발명의 39-데스메톡시라파마이신 유도체가 투여될 투여량은 특정 화합물, 관련되는 질환, 객체, 및 질환의 성질과 심각성, 및 객체의 신체적 조건, 및 선택된 투여 경로에 따라서 변화할 것이다. 적절한 투여량은 당해 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

조성물은 투여 방법에 의존하여, 본원 발명의 화합물 0.1 중량％부터, 바람직하게는 5-60 중량％, 더 바람직하게는 10-30 중량％를 포함할 수 있다.

본원 발명 화합물의 개별적인 투여 제형의 최적 함량 및 투여 간격은 치료될 상태의 성질 및 정도, 투여 제형, 경로 및 부위, 및 치료될 특정 객체의 나이와 상태에 의해 결정될 것이고, 의사는 궁극적으로 사용될 적절한 투여 제형을 결정할 것이라는 것은 당해 분야의 당업자에 의해 인식될 것이다. 이러한 투여 제형은 적절할 만큼 자주 반복될 수 있다. 부작용이 생긴다면, 보통의 임상 연습에 따라서, 투여 제형의 함량 및/또는 빈도가 변경되거나 또는 감소될 수 있다.

도 1: 라파마이신의 구조를 보여준다.

도 2: 39-데스메톡시라파마이신의 분열 경로(fragmentation pathway)를 보여준다.

도 3: 39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신의 분열 경로를 보여준다.

도 4: 39-데스메톡시-40-O-[2-히드록시에틸 3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]라파마이신의 분열 경로를 보여준다.

도 5: 27-O-데스메틸-39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오 닐]라파마이신의 분열 경로를 보여준다.

도 6: 라파마이신(채워진 사각형)과 비교되는, 39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신(A-채워진 삼각형)과 39-데스메톡시-40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신(B-채워진 삼각형)의 mTOR 억제 활성을 보여준다.

일반적인 방법과 재료

재료:

모든 시약을 상업적인 공급원으로부터 얻었고, 달리 기술하지 않는다면, 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

배양:

에스 히그로스코피쿠스(S. hygroscopicus) MG2-10 [IJMNOQLhis](WO 제04/007709호; Gregory et al ., 2004)을 배지 1 아가 플레이트(하기를 참조한다)에서 28℃에서 유지하였다. 배지 1에서 성장시킨 후에, 세포 스톡(spore stock)을 제조하였고, 증류수에 넣은 20％ w/v 글리세롤; 10％ w/v 락토오스에서 유지하였고, -80℃에서 보관하였다. 250 ml 플라스크에서, 동결시킨 스톡 0.1 ml를 50 ml 배지 2(하기를 참조한다)에 접종함으로써, 생장 배양균(vegetative culture)을 제조하였다. 배양균을 36 내지 48시간 동안 28℃에서, 300 rpm에서 배양하였다.

생성 방법:

생장 배양균을 배지 3에 2.5-5％ v/v로 접종하였다. 6-7일 동안, 26℃에서, 300rpm에서 배양을 수행하였다.

주입 절차:

접종한 지 24-48시간 후에, 선택된 카르복시산의 주입/첨가를 수행하였고, 달리 기술하지 않는다면, 1-2 mM로 주입하였다.

배지 1:

그런 다음, 배지를 121℃, 20분에서 오토클레이브시켜 멸균하였다.

배지 2: RapV7 시드 배지(seed medium)

멸균한 후에, 배지 각각 7 mL에 40％ 글루코스 0.16 mL를 첨가한다.

배지 3: MD6 배지(발효 배지)

멸균하기 전에, 시그마 α-아밀라제(BAN 250) 0.4 mL를 배지 1 L에 첨가하였다.

배지를 20분 동안 121℃에서 멸균하였다.

멸균한 후에, 멸균한 40％ 프럭토오스 0.35 ml와 L-라이신(물에서 140 mg/mL, 여과로 멸균됨) 0.10 ml를 각각 7ml에 첨가하였다.

배지 4: RapV7a 시드 배지

그런 다음, 배지를 121℃에서 20분 동안 오토클레이브시켜 멸균하였다.

배지 5: MD6/5-1 배지(발효 배지)

배지를 30분 동안 121℃에서 멸균하였다.

멸균한 후에, 1 L당 프럭토오스 15g을 첨가하였다.

48시간 후에, L-라이신 0.5 g/L를 첨가하였다.

분석 방법

방법 A

주입 부피: 0.005-0.1 mL(감도에 의존하여 요구됨).

이동상 A: 순수한 물에서 0.01％ 포름산

이동상 B: 아세토니트릴에서 0.01％ 포름산

흐름 속도: 1ml/분의 이동상으로 실시하고, Agilent "Spherisorb" "Rapid Resolution" cartridges SB C8, 3 미크론, 30 mm x 2.1 mm에서 HPLC를 수행하였다.

0분에는 5％ B에서 2.5분에는 95％ B로, 4분까지 95％ B를 유지하고, 다음 사이클까지 5％ B로 되돌아오도록 하는, 농도 선형 구배를 사용하였다. 254 nm 에서 UV 흡광도 및/또는 Micromasss Quattro- Micro 장비를 사용하는 질량 분광학 전자 분사 이온화(양의 값 또는 음의 값)에 의해 검출하였다.

방법 B

주입 부피: 0.02 mL.

이동상 A: 아세토니트릴(100 mL), 트리플루오로아세트산(1 mL), 1M 암모늄 아세테이트(10 mL)와 함께 탈 이온수로 1L까지 채움.

이동상 B: 탈이온수(100 mL), 트리플루오로아세트산(1 mL), 1M 암모늄 아세테이트(10 mL)와 함께 아세토니트릴로 1L까지 채움.

흐름 속도 : 1 mL/분

의 이동상으로 실시하고, 50℃에서 유지하였고, 3 미크론 BDS C18 Hypersil (ThermoHypersil-Keystone Ltd) 컬럼, 150 x 4.6 mm에서 HPLC를 수행하였다.

55 ％ B - 95 ％ B의 농도 선형 구배를 10분에 걸쳐 사용하였고, 그 다음에 95％ B로 2분 동안 유지하였고, 0.5분에 걸쳐 55％ B로 만들었고, 추가로 55％ B로 2분 동안 유지하였다. 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 화합물을 검출하였다.

방법 C

HPLC 시스템은 Agilent HP1100을 포함하였고,

이동상 A: 탈이온수.

이동상 B: 아세토니트릴.

흐름 속도: 1 mL/분의 이동상에서 실시하고, 40℃에서 유지하였고, 3 미크론 BDS C18 Hypersil (ThermoHypersil-Keystone Ltd) 컬럼, 150 x 4.6 mm에서 수행하였다.

상기 시스템은 Bruker Daltonics Esquire3000 전자 분사 질량 분광기와 연결되어 있다. 500 내지 1000 달톤의 스캔 범위에 걸쳐, 양의 음의 스위칭(Positive negative switching)을 사용하였다. 55 ％ B - 95 ％ B의 농도 선형 구배를 10분에 걸쳐 사용하였고, 그 다음에 95％ B로 2분 동안 유지하였고, 0.5분에 걸쳐 55％ B로 만들었고, 추가로 55％ B로 2분 동안 유지하였다.

합성 방법

달리 기술하지 않는다면, 상업적으로 입수가능한 물을 제거한 용매를 사용하 여, 모든 반응을 무수 조건 하에서 수행하였다. 전자 분사 급원이 장착되어 있는 Bruker Daltonics Esquire3000+ 질량 분광기와 연결되어 있는 Agilent 1100 HPLC에서, LC-UV-MS에 의해 반응을 모니터하였다. Phenomenex Hyperclone 컬럼, BDS C₁₈ 3u (150 x 4.6 mm)으로, 1 mL/분에서, 10분에 걸쳐 물:아세토니트릴 v:v 30:70 내지 100％ 아세토니트릴, 그 다음에 100％ 아세토니트릴에서 5분에 걸쳐 등용매(isocratic) 기간으로 선형 농도 구배에 따라 분리를 수행하였다.

NMR 스펙트럼을 CDCl₃에서 기록하였고, δ_H와 δ_C 화학적 이동은 용매를 참조로 하였다(각각 7.26 ppm 및 77.0 ppm). 39-데스메톡시라파마이신과 그의 유도체는 구조체(conformer)의 혼합물로 존재하므로, 모든 확인은 주요 구조체에만 따른다.

항암 활성의 생체 외(in vitro) 생물 검정(bioassay)

단일층 증식 분석에서 화합물의 12개의 인간 종양 세포주에서의 항암 활성의 생체 외 평가는 Oncotest Testing Facility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg에서 수행하였다. 선택된 12개의 세포주의 특징을 하기 표 1에서 요약한다.

표 1: 테스트 세포주

Roth et al ., 1999에 의해 기술된 바에 따라, 온코테스트(Oncotest) 세포 주를 인간 종양 이종이식으로부터 만들었다. 공여체 이종이식의 기원은 Fiebig et al., 1999에 의해 기술되어 있다. 다른 세포주들은 NCI (H460, SF-268, OVCAR-3, DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-468)로부터 얻거나 또는 DSMZ, Braunschweig, 독일 (LNCAP)로부터 구입하였다.

달리 특정하지 않는다면, 모든 세포주를 37℃에서 가습된 분위기(95％ 공기, 5％ CO₂)에서, RPMI 1640 배지, 10％ 송아지 혈청(fetal calf serum), 및 0.1 mg/mL 젠타마이신을 포함하는 '혼합-준비가 된(ready-mix)' 배지(PAA, Coibe, 독일)에서 길렀다.

단일층 분석 - 프로토콜 1에 대한 간단한 설명:

변형된 프로피디윰 요오드(propidium iodide) 분석을 사용하여, 12개 인간 종양 세포주의 성장에서 테스트 화합물(들)의 영향을 평가하였다(Dengler et al ., (1995)).

간단하게는, 트립신처리에 의해 기하급수적인 단계의 배양으로부터 세포를 수확하였고, 계수하였고, 세포주에 의존하는 세포 농도로(5-10,000 살아있는 세포/웰) 96-웰 바닥이-평면인(flat-bottomed) 마이크로티터 플레이트에 플레이트하였다. 세포가 다시 기하급수적인 성장을 하도록 24시간이 지나 회수한 후에, 배양 배지(플레이트 당 6개의 대조군 웰) 또는 맥베신(macbecin)을 포함하는 배양 배지 0.01 mL를 웰에 첨가하였다. 각각의 농도를 3배수로 플레이트한다. 화합물을 두 개의 농도로 적용한다(0.001 μM과 0.01 μM). 4일 동안 연속적으로 노출한 다음, 테스트 화합물을 포함한 또는 포함하지 않는 세포 배양 배지를 수성 프로피디윰 요오드(PI) 용액(7 mg/L) 0.2 mL로 대체한다. 살아있는 세포의 비율을 측정하기 위하여, 플레이트를 동결시킴으로써 세포를 투과시킨다. 플레이트를 녹인 후에, Cytofluor 4000 마이크로플레이트 해독기(여기(勵起) 530 nm, 방출 620 nm)를 사용하여 형광을 측정하여, 살아있는 세포의 전체 개수에 대한 직접적인 관계를 얻는다.

성장 억제는 처리된 군/대조군 x 100 (％ T/C)로 표시된다. 활성이 있는 화합물의 경우, 화합물 농도 대 세포 생존도(cell viability)를 플롯팅함으로써 IC₅₀과 IC₇₀ 값을 평가하였다.

실시예 1. 발효와 39- 데스메톡시라파마이신의 분리

하기에서 기술하는 바와 같이, 에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배양균을 기르고 시클로헥산카르복시산(CHCA)을 주입함으로써 39-데스메톡시라파마이신을 제조하였다.

액체 배양

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 생장 배양균을 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 50 mL 튜브에서 7 mL 배지 3으로, 생성 배양균(production culture)을 생장 배양균과 함께 0.5 mL로 접종하였다. 7일 동안, 26℃에서, 300 rpm에서 배양을 수행하였다. 30분 동안 흔들면서 1:1 아세토니트릴로 시료 1 밀리리터를 추출하였고, 10분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하였고, 분석 방법 B(재료와 방법을 참고한다)에 따라 분석하였고 정량하였다. 분석 방법 C(재료와 방법을 참고한다)를 사용하여 질량 분광계에 의해 생성물의 확인을 결정하였다.

하기 규명하에 논의된 분석 데이타에 기초하여, 관찰된 라파마이신 유사체는 목표로 하는 39-데스메톡시라파마이신인 것으로 제안되었다.

발효

에스 히그로스코피쿠스 MG2-10 [IJMNOQLhis]의 배지 4에서의 일차적인 생장 배양균을 본질적으로 재료와 방법에서 기술한 바에 따라 배양하였다. 배지 4에서의 2차적인 생장 배양균을 10％ v/v로, 28℃에서, 250rpm에서, 24시간 동안 접종하였다. 20 L 발효기에서, 생장 배양균을 배지 5(재료와 방법을 참고한다)에 5％ v/v로 접종하였다. 6일 동안, 26℃에서, 0.5 vvm에서 배양을 수행하였다. 임펠라 팁(impeller tip) 속도를 1.18 ms^-1의 최소 팁 속도, 2.75 ms^-1의 최대 팁 속도로 변경함으로써, ≥ 30％ 용존 산소를 유지하였다. 접종한 후 24시간과 48시간이 될 때, 시클로헥산카르복시산을 주입하여 최종 농도 2 mM를 제공하였다.

추출과 정제

발효 배양액(30 L)을 동일 부피의 메탄올과 2시간 동안 교반하였고 그런 다음 원심분리하여(10 분, 3500 rpm) 세포를 펠렛으로 만들었다. 상층액을 Diaion^® HP20 레진(43 g/L)과 함께 1시간 동안 교반하였고 그런 다음 여과하였다. 레진을 아세톤을 가지고 배치식으로(batchwise) 수세하여 라파마이신 유사체를 빼내었고, 용매를 진공에서 제거하였다. 그런 다음, 수성 농축물을 물 2 L로 희석하였고, 에틸 아세테이트로 추출하였다(3 x 2 L). 용매를 진공에서 제거하여 갈색 오일(20.5 g)을 얻었다.

추출액을 아세톤에 녹였고, 실리카에서 물을 제거하였고, 실리카 컬럼(6 x 6.5 cm 직경)에 적용하였고, 아세톤/헥산의 단계적인 농도 구배(20％ - 40％)로 용리하였다. 라파마이신 유사체를 포함하는 분획을 모았고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물(2.6 g)을 추가적으로 Sephadex LH20에서 10:10:1 클로로포름/헵탄/에탄올로 용리하는 크로마토그래피하였다(3개의 배치에서). 반 정도 정제된 라파마이신 유사체(1.7 g)를 Gilson HPLC를 사용하고, 65％ 아세토니트릴/물로 21 mL/분으로 Phenomenex 21.2 x 250 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼으로 용리하는 역상 (C18) 프렙 HPLC에 의해 정제하였다. 가장 순수한 분획(분석 HPLC에 의해 확인함, 방법 B)을 합하였고, 용매를 진공 하에서 제거하여, 39-데스메톡시라파마이신(563 mg)을 얻었다.

규명

39-데스메톡시라파마이신의 ¹H NMR 스펙트럼은 표준 물질(P. Lowden, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 1997)의 스펙트럼과 동일하였다. ¹³C-NMR (125 MHz), δ_c (ppm): 215.75, 208.27, 169.19, 166.71 , 140.13, 135.94, 133.61, 130.10, 129.62, 126.80, 126.33, 98.42, 84.77, 84.37, 75.85, 70.91, 67.10, 59.44, 55.82, 51.21 , 46.50, 44.17, 41.39, 40.70, 40.16, 38.74, 38.37, 35.44, 35.26, 35.08, 33.78, 33.64, 33.04, 32.37, 31.22, 30.41 , 27.24, 27.02, 25.27, 21.48, 20.58, 16.24, 15.95, 15.78, 13.74, 13.00, 10.12.

배양 추출물의 LCMS와 LCMSⁿ 분석은 신규 라파마이신 유사체의 m/z 비율이 라파마이신의 비율보다 낮은 30 원자 질량 단위임을 보여주었고, 이것은 메톡시기가 없음과 일치한다. 관찰된 이온: [M-H]^- 882.3, [M+NH₄]⁺ 901.4, [M+Na]⁺ 906.2, [M+K]⁺ 922.2. 소듐 부가물의 분열(fragmentation)은 이미 확인된 분열 경로와 일치하는, 39-데스메톡시라파마이신의 예상되었던 이온을 제공하였다(도 2)(J. A. Reather, Ph.D. Dissertation, University of Cambridge, 2000). 이러한 질량 분 광 분열 데이타는 시클로헥실 모이어티를 포함하는 단편 C28-C42에서 메톡시기의 손실이 일어나는, 신규 라파마이신 유사체의 영역을 좁혀 준다. 이러한 질량 분광 분열 데이타는 전적으로 39-데스메톡시라파마이신과 일치한다.

실시예 2: 39- 데스메톡시 -40-O-[2,2-비스( 히드록시메틸 ) 프로피오닐 ] 라파마이신

39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신을 하기의 순서에 따라서 39-데스메톡시라파마이신으로부터 합성하였다.

2.1. 39-데스메톡시-28-0-트리메틸실릴 라파마이신의 합성

39-데스메톡시라파마이신(170 mg, 0.17 mmol)과 이미다졸(51 mg, 0.75 mmol)을 에틸 아세테이트 5 ml에서 0℃에서 녹였다. 얻은 이 차가운 용액에, 클로로트리메틸실란(77 mg, 0.09 mL, 0.71 mmol)을 10분에 걸쳐 적가하였다. 교반을 추가로 60분 더 계속하여 28,39-비스-O-트리메틸실릴 에테르의 형성을 완료하였다. 그 기간 후에, 수성 0.5 N 황산 0.4 mL를 첨가하였고, 얻은 혼합물을 2.5 시간 동안 0℃에서 교반하였다. 에틸 아세테이트 20 mL를 첨가하였고, 유기층을 브라인, 포화시킨 소듐 바이카보네이트 용액 및 물로 수세하였다. 소듐 술페이트에서 물을 제거하고, 감압 하에서 농축시켜, 무색의 고체로서 28-O-트리메틸실릴 에테르를 얻었고, 이것은 추가로 정제하지 않고 후속 반응에서 사용하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃), δ(ppm): 4.07 (d, 1H, J=6.5 Hz, C(28)-H), 0.00 (s, 9H, 28-O-TMS).

MS (ESI) m/z 978 [M+Na]⁺

2.2. 2,4,6-트리클로로벤조익 2',2',5'-트리메틸-1',3'-디옥세인(dioxane)-5' 카르복시산 무수물의 합성

아세톤(100 mL)에 넣은 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산(13.5 g, 100 mmol)의 용액에, 2,2-디메톡시프로판(13.5 g, 130 mmol)과 p-톨루엔술폰산 일수화물(100 mg, 0.53 mmol, 0.4 mol％)을 첨가하였다. 얻은 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 그 기간 이후에, 습윤한 소듐 수소 카보네이트를 첨가하였고, 얻은 혼합물을 추가로 5분 동안 더 교반하였다. 상층액에서 물을 제거하였고, 감압 하에서 농축하였다. 그 결과 얻은 고체를 디에틸 에테르(3 x 50 mL)로 처리하였고, 합한 유기성 추출물을 감압 하에서 농축하여 흰색 고체 16.2 g (93％)를 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 4.19 (d, 1H, J=12.0Hz) 3.68 (d, 1H, J=12.0Hz) 1.45 (s, 1H) 1.41 (s, 1H) 1.20 (s, 1H).

그런 다음, 이 물질을 미국특허 제5,362,718호의 방법에 의해, 활성화된 혼합된 무수물로 전환하였다. 따라서, 얻은 아세토니드(1.04 g, 5.98 mmol)를 0℃까지 냉각시킨 THF (20 ml)에 녹였고, 트리에틸아민(0.83 mL, 5.98 mmol)과 2,4,6-트리클로로벤조일 클로라이드(0.93 mL, 5.98 mmol)를 적가 처리하였다. 그런 다음, 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 그 결과 얻은 침전물을 여과하였고, THF (10 mL)로 수세하였다. 합한 여과액을 감압 하에서 부피를 줄여 흰색의 무정형 고체를 얻었고 이것은 추가로 정제하지 않고 사용하였다(하기를 참조한다).

2.3. 2,2,5-트리메틸[1.3-디옥세인]-5-카르복시산을 갖는 39-데스메톡시라파마이신 28-O-트리메틸실릴 에테르의 합성

실시예 2.1로부터 얻은 정제되지 않은 28-O-트리메틸실릴-39-데스메톡시라파마이신(200 mg, 0.17 mmol 39-데스메톡시라파마이신으로부터)을 디클로로메탄 2 mL에 녹였다. 얻은 용액을 0℃까지 냉각하였고 DMAP (102 mg, 0.84 mmol)를 첨가하였다. 그런 다음, 디클로로메탄 1 mL에 넣은 2,4,6-트리클로로벤조익 2',2',5'-트리메틸-1',3'-디옥세인-5'카르복시산 무수물(159 mg, 0.42 mmol)을 10분 기간에 걸쳐 첨가하였다. 얻은 반응 혼합물을 0℃에서 5시간 동안 교반하였고, 전환을 LC/MS에 의해 모니터하였다. 얻은 반응 혼합물을 디클로로메탄 7 mL로 희석하였고, 물 5 mL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 유기층을 분리하였고, 0.5 N 황산, 소듐 바이카보네이트 용액과 물로 연속적으로 수세하였다. 소듐 술페이트로 물을 제거하고 감압 하에서 농축하여, 무색의 포말(foam)로 표제 화합물을 얻었으며, 이것은 추가로 정제하지 않고 즉시 사용하였다.

MS (ESI) m/z 1111 [M-H]^-

2.4. 39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신

실시예 2.3.으로부터 나온 정제되지 않은 2,2,5-트리메틸[1.3-디옥세인]-5-카르복시산을 갖는 39-데스메톡시라파마이신 28-O-트리메틸실릴 에테르를 아세톤 2 mL에 녹였고, 0.5 N 황산 0.5 mL를 첨가하였다. 얻은 반응 혼합물을 5시간 동안 실온에서 교반하였고, 뒤이어 포화시킨 소듐 바이카보네이트 용액 5 mL와 물 5 mL를 첨가하여 중성으로 만들었다. 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였고, 합한 유기층 추출물에서 소듐 술페이트로 물을 제거하였다. 감압 하에서 농축하여 무색의 고체를 얻었고, 이것은 용리액으로서 클로로포름/헵탄/에탄올(v:v:v 10:10:1)을 사용하는 Sephadex LH20에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ(ppm): 4.72 (m, 1 H, C(40)-H), 3.87 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 1.03 (s, 3H); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 175.52, 74.04 (C(40)), 68.73 (2C), 48.90, 17.09.

MS (ESI) m/z 1023 [M+Na]⁺

실시예 3: 39- 데스메톡시 -40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신

3.1. 2-(터트-부틸디메틸실릴)옥시에틸 트리플레이트

디클로로메탄 6 ml에 넣은 2-(터트-부틸디메틸실릴)-에틸렌 글리콜(125 mg, 0.71 mmol)과 2,6-루티딘(0.08 ml, 0.69 mmol)의 용액을 -78℃까지 냉각하였다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물(0.11 ml, 0.65 mmol)을 5분 기간에 걸쳐 첨가하였고, 추가로 15분 동안 -78℃에서 교반을 계속해서 유지하여, 트리플레이트의 생성을 완료하였다. 하기 3.2.에서 기술한 바와 같이, 트리플레이트를 반응을 위해 인시투(in situ)로 사용하였다.

3.2. 40-O-[2-(터트-부틸디메틸실릴)]에틸-39-데스메톡시라파마이신

39-데스메톡시라파마이신(300 mg, 0.34 mmol)과 2,6-디-터트-부틸피리딘(1.5 ml, 6.68 mmol)을 2-(터트-부틸디메틸실릴)옥시에틸 트리플레이트(6 mL 디클로로메탄에서 0.65 mmol)로 실온에서 처리하였다. 얻은 이 용액을 약한 질소 흐름 하에서 원래 부피의 1/3이 될 때까지 농축하였고, 그 결과 얻은 현탁액을 추가로 72시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 기간이 지난 후에, 포화시킨 소듐 바이카보네이트 용액(5 mL)과 물(5 mL)을 첨가하였고, 얻은 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 유기층을 분리하였고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(2 x 5 mL). 합한 유기층 추출물에서 소듐 술페이트로 물을 제거하였고, 감압 하에서 농축하여 무색의 오일을 얻었다. 실리카에서 헥산부터 헥산/아세톤(v:v 1:1)의 농도 구배를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제로 무색의 고체로 생성물을 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 4.16 (d, 1H, J = 6.5 Hz, C(28)-H), 3.73 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 6H); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), δ(ppm): 76.61 (C-40), 69.31 (CH₂), 63.03 (CH₂), 25.92 (3C), 18.36, -5.23 (2C).

MS (ESI) m/z 1065 [M+Na]⁺

3.3. 39-데스메톡시-40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신

아세톤 2 mL에 넣은 40-O-[2-(터트-부틸디메틸실릴)]에틸-39-데스메톡시라파 마이신(160 mg, 0.15 mmol)의 용액을 0.5 N 황산 0.3 mL로 실온에서 처리하였다. 얻은 용액을 실온에서 3시간 동안 방치하였고, 뒤이어 포화시킨 소듐 바이카보네이트 용액 5 mL와 물 10 mL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 수성 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였고(3 x 10 mL), 합한 유기성 추출물에서 소듐 술페이트로 물을 제거하였다. 감압 하에서 농축하여 무색의 고체를 얻었고, 이것은 HPLC(물/아세토니트릴 v:v 20/80)에 의해 추가로 정제하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃), (ppm): 4.16 (d, 1H, J = 6 Hz), 3.70 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.20 (m, 1H, C(40)-H); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃), (ppm): 78.65 (C-40), 77.20 (C-28), 68.93 (CH₂O), 62.10 (CH₂O).

MS (ESI) m/z 951 [M+Na]⁺

실시예 4: 리파제에 의해 촉매되는 39- 데스메톡시라파마이신의 에스테르화 반응을 통한 39- 데스메톡시 -40-O-[2,2-비스( 히드록시메틸 ) 프로피오닐 ] 라파마이신

무수 터트-부틸 메틸 에테르(3.5 mL)에 넣은 39-데스메톡시라파마이신(720 mg, 0.82 mmol), 비닐 2,2,5-트리메틸[1.3-디옥세인]-5-카르복시레이트(244 mg, 1.22 mmol), 리파제 PS-C "아마노(Amano)" II(720 mg) 및 분자체(molecular sieve) 0.5 nm (250 mg)의 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 43℃까지 가열하였다. 48시간이 지난 후에, LC/MS 모니터링은 출발 물질의 완전한 변환을 보여주었다. THF (10 mL)를 첨가하였고, 얻은 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 효소를 THF 로 수세하였고(2 x 10 mL), 합한 유기성 추출액을 감압 하에서 농축하였다. 얻은 잔여물을 THF (50 mL)에 녹였고, H₂SO₄ (15 mL, 0.5 N)를 첨가하였다. 얻은 용액을 실온에서 5시간 동안 방치하였고, 뒤이어 NaHCO₃(50 mL, 5 ％)와 브라인(50 mL)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 수성 혼합물을 EtOAc로 추출하였고(3 x 100 mL), 합한 유기성 추출액에서 MgSO₄로 물을 제거하였다. 용매의 제거로 반-고체로 생성물을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피(헥산/아세톤 1:1)에 의한 정제로 무색 고체로서 생성물을 얻었다.

NMR 데이타는 실시예 2.4.에서의 데이타와 일치한다.

MS (ESI) m/z 1022 [M+Na]⁺ 소듐 부가물의 분열은 도 3에서 보여지는 분열 패턴에 따르면, m/z 850, 728, 693, 614, 560, 545, 441 및 431에서 이온을 생성하였다.

실시예 5: 39- 데스메톡시 -40-O-[2- 히드록시에틸 -3-히드록시-2-( 히드록시메틸 )-2- 메틸프로파노에이트 ] 라파마이신

무수 터트-부틸 메틸 에테르(2 mL)에 넣은 39-데스메톡시-40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신(40 mg, 0.04 mmol), 비닐 2,2,5-트리메틸[1.3-디옥세인]-5-카르복시레이트(25 mg, 0.13 mmol), 리파제 PS-C "아마노" II(40 mg) 및 분자체 0.5 nm (40 mg)의 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 43℃까지 가열하였다. 72시간이 지난 후에, LC/MS 모니터링은 출발 물질의 완전한 변환을 보여주었다. THF (10 mL)를 첨가하였고, 얻은 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 효소를 THF로 수세하 였고(2 x 10 mL), 합한 유기성 추출액을 감압 하에서 농축하였다. 얻은 잔여물을 아세톤 (7.5 mL)에 녹였고, H₂SO₄ (2.5 mL, 0.5 N)를 첨가하였다. 얻은 용액을 실온에서 2시간 동안 방치하였고, 뒤이어 NaHCO₃(10 mL)와 물(10 mL)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 수성 혼합물을 EtOAc로 추출하였고(3 x 10 mL), 합한 유기성 추출액에서 MgSO₄로 물을 제거하였다. 용매의 제거로 노란색의 고체를 얻었다. 15분에 걸쳐 70:30 MeCN/물 내지 100 ％ MeCN의 농도 구배를 사용하고, Phenomenex 21.2 * 50 mm Luna 5 ㎛ C₁₈ BDS 컬럼 상에서 프렙 HPLC에 의한 정제로 무색 고체로서 생성물을 얻었다.

MS (ESI) m/z 1067 [M+Na]⁺ 소듐 부가물의 분열은 도 4에서 보여지는 분열 패턴에 따르면 m/z 894, 772, 738, 614, 604, 589, 475 및 441에서 이온을 생성하였다.

실시예 6: 27-O- 데스메틸 -39- 데스메톡시 -40-O-[2,2-비스( 히드록시메틸 ) 프로피오닐 ] 라파마이신

6.1. 2,2,5-트리메틸[1.3-디옥세인]-5-카르복시산을 갖는 27-O-데스메틸-39-데스메톡시라파마이신

무수 터트-부틸 메틸 에테르(2 mL)에 넣은 27-O-데스메틸-39-데스메톡시 라파마이신(30 mg, 0.034 mmol), 비닐 2,2,5-트리메틸[1.3-디옥세인]-5-카르복시레이트(34 mg, 0.17 mmol), 리파제 PS-C "아마노" II(30 mg) 및 분자체 0.5 nm (30 mg) 의 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 43℃까지 72시간 동안 가열하였다. THF (10 mL)를 첨가하였고, 얻은 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 효소를 THF로 수세하였고(2 x 10 mL), 합한 유기성 추출액을 감압 하에서 농축하여, 노란색의 반-고체를 얻었다. 헥산:아세톤(v:v 2:1)을 사용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의한 정제로 엷은 노란색 고체로 생성물을 얻었다.

MS (ESI) m/z 1049 [M+Na]⁺

6.2. 27-O-데스메틸-39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신

실시예 6.1.로부터 얻은 물질을 아세톤 (6 mL)에 녹였고, H₂SO₄ (2 mL, 0.5 N)를 첨가하였다. 얻은 용액을 실온에서 2시간 동안 방치하였고, 뒤어어 포화시킨 NaHCO3 (10 mL)와 물 (10 mL)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 수성 혼합물을 EtOAc로 추출하였고(3 x 10 mL), 합한 유기성 추출액에서 MgSO₄로 물을 제거하였다. 용매의 제거로 노란색 고체로서 생성물을 얻었다. 15분에 걸쳐 70:30 MeCN/물 내지 100 ％ MeCN의 농도 구배를 사용하고, Phenomenex 21.2 x 50 mm Luna 5 ㎛ C18 BDS 컬럼에서 프렙 HPLC에 의한 정제로 무색의 고체로서 생성물을 얻었다.

MS (ESI) m/z 1009 [M+Na]⁺ 소듐 부가물의 분열은 도 5에서 보여지는 분열 패턴에 따르면 m/z 836, 679, 600, 560, 531, 431, 427에서 이온을 생성하였다. ¹ HNMR (500 MHz CDCl₃) δ ppm 4.73 (m, 1H, C(40)-H), 4.32 (d, J=4.5 Hz, 1H, 0(27J-H), 4.19 (d, J=4.5 Hz, 1H, C(28)-H), 3.89 (m, 2 H), 3.70 (m, 2 H) 1.03 (s, 3 H).

실시예 7: 39- 데스메톡시 -40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신과 39- 데스메톡 시-40-O-[2,2-비스( 히드록시메틸 ) 프로피오닐 ] 라파마이신의 항암 활성의 생체 외 평가

변형된 프로피디윰 요오드 분석을 사용하는 상기 일반적인 방법에서 프로토콜 1로 기술된 바에 따라, 단일층 증식 분석에서 12개의 인간 종양 세포주에 대한 항암 활성을 위해 39-데스메톡시-40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신과 39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신의 생체 외 평가를 수행하였다.

그 결과는 하기 표 3에서 나타내어 진다; 각각의 결과는 2회의 반복 실험의 평균을 나타낸다. 표 4는 참조 물질로서 보여지는 라파마이신과 함께, 테스트된 세포 주에 있어서 화합물의 평균 IC₅₀과 IC₇₀을 보여준다.

<표 3>

<표 4>

＊평균은 데이타가 이용 가능했던 9개의 세포주에 기초하였다.

실시예 8: 생체 외 결합 분석

FKBP12

FKBP12는 화학적 변성제인 구안디니윰 히드로클로라이드(GdnHCl)에서 가역적으로 펼쳐지고, 상기 펼쳐짐은 단백질의 본질적인 형광성의 변화에 의해 모니터될 수 있다(Main et al ., 1998). 특이적으로 결합하여 FKBP12의 본래 상태를 안정화시키는 리간드들은 변성 곡선을 이동시켜, 단백질이 화학적 변성제의 보다 높은 농도에서 펼쳐지게 한다(Main et al ., 1999). 안정성의 차이로부터 리간드-결합 상수를 하기의 식 1을 사용하여 결정할 수 있다.

상기에서 △G _app 는 유리된 형태와 리간드-결합 형태 사이의 펼쳐짐의 자유 에너지의 겉보기 차이이고,

은 유리 상태 단백질의 물에서의 펼쳐짐의 자유 에너지이고, [L]은 리간드의 농도이고, K_d는 단백질-리간드 복합체의 해리 상수이 다(Meiering et al ., 1992). 펼쳐짐의 자유 에너지는 하기의 식을 사용하여 펼쳐진 전이 상태(unfolding transition)의 중앙값과 관련될 수 있다.

상기에서 m _D _-N 은 제공된 단백질과 제공된 변성제에 따른 상수이고 이것은 펼쳐짐에서 잔기의 노출 정도의 변화에 비례하고(Tanford 1968과 Tanford 1970), [D]_50％는 펼쳐짐의 중앙값에 상응하는 변성제의 농도이다. 우리는 (같은 리간드 농도에서)라파마이신과 알려져지 않은 리간에 대한 FKBP12의 안성성의 차이를

로서

으로 정의하고

상기에서 <m _D _-N >은 펼쳐진 전이 상태의 평균 m-값이고, △[D]_50％는 라파마이신-FKBP12 펼쳐진 전이 상태의 중앙값과 알려지지 않은 리간드-FKBP12 복합체의 펼쳐진 전이 상태의 중앙값의 차이이다. [L] > K_d인 조건하에서, △△G _D _-N 은 하기 식 4를 통해 두 개의 화합물의 상대적인 K_d와 관련될 수 있고,

상기에서,

은 라파마이신의 해리 상수이고,

는 알려지지 않은 리간드 X의 해리 상수이다. 따라서,

이 된다.

각각의 변성 곡선을 맞추어 m _D _-N 과 [D]_50％를 위한 값을 산출하고, 이것을 사용하여 평균 m-값, < m _D _-N >, 및 △[D]_50％를 계산할 수 있고, 따라서,

을 계산할 수 있다.

의 문헌적 값인 0.2 nM이 사용된다.

소정의 경우에는, 테스트 화합물의 낮은 용해도로 인하여, 라파마이신 대조군 실험군에서보다 보다 낮은 농도의 테스트 화합물을 사용하였다. 이러한 경우에는, 테스트 화합물 농도와 라파마이신 대조군 농도 간의 차이는 하기 식 6을 사용하여 고려하였다.

<표 5> FKBP12 생체 외 결합 분석 결과

mTOR

mTOR 경로의 대리 마커(surrogate marker)와 p70S6 키나제 및 S6의 인산화반응의 수준의 측정을 통하여, mTOR의 억제를 간접적으로 입증하였다(Brunn et al., 1997; Mothe-Satney et al ., 2000; Tee and Proud, 2002; Huang and Houghton, 2002).

HEK293 세포를 FLAG-태그된(tagged) mTOR과 myc-태그된 랩터(Raptor)로 동시에 트랜스팩션시켰고, 24시간 동안 배양하였고, 그런 다음 혈청을 밤새 주지 않았다. 세포를 100 nM 인슐린으로 촉진하였고 그런 다음 수확하였고, 3회의 동결/녹임 사이클에 의해 세포를 용해하였다. 얻은 용해물을 모았고, 동일한 함량으로 mTOR/랩터 복합체를 위한 FLAG 항체와 함께 면역 침전시켜(immunoprecipitation), 면역 침전을 진행시켰다: 화합물(0.00001 내지 0.003 mM)로 처리한 시료를 FKBP12/라파마이신, FKBP12/39-데스메톡시라파마이신 유도체 또는 비히클(DMSO)과 함께 30분 동안 30℃에서 미리 배양하였고, 처리되지 않은 시료를 키나제 완충 용액에서 배양하였으며, 그런 다음 면역 침전을 3 mM ATP, 10 mM Mn² ⁺ 및 기질인 GST-4E-BP1 존재 하에서, 생체 외 키나제 분석을 하였다. 4배의 시료 완충용액으로 반응을 중지시 켰고, 그런 다음 15％ SDS-PAGE하였고, PVDF 막으로 습윤 상태로 옮겼고, 그런 다음 포스포-4E-BP1 (T37/46)을 위해 프로브(probe)하였다. Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하는 이미지 분석에 의하여 웨스턴 블롯 밴드를 정량하였다. 도 6A는 라파마이신(채워진 사각형)과 39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신(채워진 삼각형)의 투여량-반응 곡선을 보여준다. 도 6B는 라파마이신(채워진 사각형)과 39-데스메톡시-40-O-(2-히드록시)에틸 라파마이신(채워진 삼각형)의 투여량-반응 곡선을 보여준다.

택일적으로는, HEK293 세포를 6 웰 플레이트에 시딩(seeding)하였고, 24시간 동안 미리 배양하였고, 그런 다음 밤새 혈청을 주지 않았다. 세포를 30분 동안 30℃에서 비히클 또는 화합물로 미리 처리하였고, 그런 다음 30분 동안 30℃에서 100 nM 인슐린으로 촉진하였고, 3회의 동결/녹임 사이클에 의해 세포를 용해하였고, 단백질 농도를 분석하였다. 동일한 함량의 단백질을 로딩하였고, SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 습윤 상태로 옮겼고, 그런 다음 포스포-S6 (S235/36) 또는 포스포-p70 S6K (T389)을 위해 프로브하였다. Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하는 이미지 분석에 의해 웨스턴 블롯 밴드를 정량하였다.

참조문헌

Claims

40-히드록시 위치가 카르복시산 에스테르로, 에테르로, 포스페이트 에스테르로, 포스피네이트 에스테르로, 아세탈로 또는 글리코실로 유도체화되는 것을 특징으로 하는, 라파마이신의 39-데스메톡시 유도체.
하기 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염:

상기에서:

X는 결합 또는 CH₂를 나타내고;

R₁은 케토기 또는 (H,H)를 나타내고;

R₂는 OH 또는 OMe를 나타내고;

R₃은 H, OH 또는 OMe를 나타내고;

R₄와 R₅는 각각 독립적으로 H 또는 OH를 나타내고;

R₆은 -R₇, -C(O)R₇, -(CH₂)₂-O-[CR₂₁R₂₂-O]_a-C(O)-R₂₃; -CR₂₁R₂₂-O-C(O)-R₂₃; -POR₁₉R₂₀, -PO(OR₁₉)(OR₂₀) 또는 Y-R₁₅를 나타내고;

R₇은 -(CR₈R₉)_m(CR_1OR₁₁)_pCR₁₂R₁₃R₁₄를 나타내고;

R₈과 R₉는 -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -OH, -COOH 또는 -NH₂로 선택적으로 치환될 수 있는, 각각 독립적으로 C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐 또는 C2-C4 알키닐을 나타내거나; 또는 R₈과 R₉는 각각 독립적으로 H, 트리플루오로메틸 또는 F를 나타내고;

R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃ 및 R₁₄는 각각 독립적으로, -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -OH, -COOH 또는 -NH₂로 선택적으로 치환될 수 있는 C1-C4 알킬, C2-C4 알케닐 또는 C2-C4 알키닐을 나타내거나; 또는 R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃ 및 R₁₄는 H, -(CR₈R₉)_qNH₂, -(CR₈R₉)_qOH, CF₃, F, COOH로부터 독립적으로 선택될 수 있거나; 또는 R₁₀과 R₁₁ 또는 R₁₂와 R₁₃ 또는 R₁₃과 R₁₄는 이들이 결합되어 있는 상기 탄소와 함께, C3-C6 시클로알킬 또는 N, O 및 S로부터 선택되는 한 개 이상의 헤테로원자를 포함하고 5개 이하의 -(CR₈R₉)_qOH, -(CR₈R₉)_qNH₂ 또는 COOH기로 선택적으로 치환되어 있는 3원 내지 6원 헤테로알킬 고리를 형성할 수 있고;

Y는 결합, -C(O)-O-; -(CH₂)₂-O-C(O)-O-이고;

R₁₅는

를 나타내고;

R₁₆은 각각 독립적으로 H 또는 OH이고;

R₁₇은 H, OH 및 NH₂로부터 독립적으로 선택되고;

R₁₈은 H, -CH₃, -CH₂OH 및 -COOH로부터 독립적으로 선택되고;

그러나 R₁₆, R₁₇ 및 R₁₈로부터 선택되는 2개 이하의 기는 H 또는 CH₃을 나타내고;

R₁₉와 R₂₀은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬을 나타내거나 또는 R₁₉와 R₂₀은 함께 =CH₂를 나타내고;

R₂₁은 H, CH₃로부터 독립적으로 선택되고;

R₂₂는 H, -CH₃, -CH=CH₂, -CH₂Cl, -CHCl₂, -CCl₃, -CH(OH)Me, -CH₂OH, -CH₂CH₃, -CH(Cl)Me로부터 독립적으로 선택되고;

R₂₃은 독립적으로 R₇, Y-R₁₅, 또는 OH, F, Cl, Br, NO₂ 및 NH₂로부터 선택되는 한 개 내지 세 개의 기로 선택적으로 치환된 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;

a는 0 또는 1을 나타내고;

m, p 및 q는 각각 독립적으로 0-4의 정수를 나타내고;

그러나, 상기 R₇ 모이어티는 12개보다 많은 탄소 원자를 포함하지 않고 -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -COOH, OH 또는 NH₂로부터 선택되는 한 개 이상의 작용기를 포함한다.
제2항에 있어서, 상기 R₆이 -R₇을 나타내는 것인 화합물.
제2항에 있어서, 상기 R₆이 -C(O)R₇을 나타내는 것인 화합물.
제2항에 있어서, 상기 R₆이 -(CH₂)₂-O-[CR₂₁R₂₂-O]_a-C(O)-R₂₃을 나타내는 것인 화합물.
제5항에 있어서, 상기 R₂₃이 R₇을 나타내는 것인 화합물.
제5항에 있어서, 상기 R₂₃이 Y-R₁₅를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항에 있어서, 상기 R₇이 7개 이하의 탄소 원자를 포함하는 것인 화합물.
제8항에 있어서, 상기 R₇이 5개 이하의 탄소 원자를 포함하는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₇이 -PO(OH)₂, -CF₂PO(OH)₂, -OH, -COOH 및 -NH₂로부터 선택되는 두 개의 기를 포함하는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₇이 -COOH, OH 및 NH₂로부터 선택되는 한 개 이상의 작용기를 포함하는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p는 0 또는 1을 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 m은 0 또는 1을 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 q는 0, 1 또는 2를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁₁은 H를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁₂는 H를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₁₃은 H 또는 OH를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p는 1을 나타내고, 상기 R₁₀은 Me, OH 또는 CH₂OH를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p는 1을 나타내고, 상기 R₁₁은 Me, H 또는 CH₂OH를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 m과 p 모두 0을 나타내고; 상기 R₁₂와 R₁₃ 모두 H를 나타내고 상기 R₁₄는 q가 O 또는 1이고 R₈과 R₉ 모두 H를 나타내는 -(CR₈R₉)_q-OH를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p는 1을 나타내고, 상기 m은 0을 나타내고, 상기 R₁₀과 R₁₁은 모두 H를 나타내고, 상기 R₁₂는 H를 나타내고, 상기 R₁₃은 H, OH 또는 NH₂를 나타내고 상기 R₁₄는 q가 0 또는 1이고 R₈과 R₉ 모두 H를 나타내는 -(CR₈R₉)_q-OH를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₆은 히드록시아세트산, 3-히드록시-2,2-디메틸프로피온산, 2,3-디히드록시프로피온산, 3-히드록시-2-히드록시메틸프로피온산 또는 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산과 에스테르를 형성하는 것으로부터 유래된 잔기(residue)를 나타내는 것인 화합물.
제2항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R₆은 히드록시아세트산, 3-히드록시-2,2-디메틸프로피온산, 2,3-디히드록시프로피온산, 3-히드록시-2-히드록시메틸프로피온산 또는 2,2-비스(히드록시메틸)프로피온산 과 에스테르를 형성하는 것으로부터 유래된 잔기를 나타내는 것인 화합물.
제2항에 있어서, 39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 것인 화합물.
제2항에 있어서, 39-데스메톡시-40-O-(2-히드록시)에틸라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 것인 화합물.
제2항에 있어서, 39-데스메톡시-40-O-[2-히드록시에틸 3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 것인 화합물.
제2항에 있어서, 27-O-데스메틸-39-데스메톡시-40-O-[2,2-비스(히드록시메틸)프로피오닐]라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염인 것인 화합물.
제2항에 있어서, 상기 R₆이 -POR₁₉R_2O을 나타내는 것인 화합물.
제2항에 있어서, 상기 R₆이 -PO(OR₁₉)(OR₂₀)을 나타내는 것인 화합물.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 R₁₉와 R₂₀ 모두 CH₃을 나타내거나 또는 모두 CH₂CH₃을 나타내는 것인 화합물.
제2항에 있어서, 상기 R₆이 Y-R₁₅를 나타내는 것인 화합물.
제31항에 있어서, 상기 R₁₅ 기가

를 나타내는 것인 화합물.
제32항에 있어서, 상기 R₁₅는 글루코스, 글루코사민, 글루쿠론산 또는 아라비노스와 아세탈을 형성함으로써 형성되는 모이어티(moiety)인 것인 화합물.
제32항에 있어서, 상기 R₁₅는 D-글루코스와 아세탈을 형성함으로써 형성되는 모이어티인 것인 화합물.
제32항에 있어서, 상기 R₁₅는 D-글루코사민과 아세탈을 형성함으로써 형성되 는 모이어티인 것인 화합물.
제32항에 있어서, 상기 R₁₅는 D-글루쿠론산과 아세탈을 형성함으로써 형성되는 모이어티인 것인 화합물.
제31항에 있어서, 상기 R₁₅는

를 나타내는 것인 화합물.
제37항에 있어서, 상기 R₁₅는 프럭토오스와 아세탈을 형성함으로써 형성되는 모이어티인 것인 화합물.
제31항에 있어서, 상기 R₁₅는

를 나타내는 것인 화합물.
제39항에 있어서, 상기 R₁₅는 글루쿠론산과 에스테르를 형성함으로써 형성되는 모이어티인 것인 화합물.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y는 결합을 나타내는 것인 화합물.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y는 -(CH₂)₂-O-C(O)-O-를 나타내는 것인 화합물.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y는 -C(O)-O-를 나타내는 것인 화합물.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 의약품으로 사용하기 위한 것인 화합물.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응(transplantation rejection), 이식 편대 숙주 질병(graft vs. host disease), 자가면역성 장애(autoimmune disorder), 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환(fibrotic disease)의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료에서 사용을 위한 것인 화합물.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료에서 의약품으로 사용하기 위한 것인 화합물.
하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어와 함께, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료 방법.
암 및/또는 B-세포 악성 종양의 치료, 면역 억제의 유도 또는 유지, 조직이식 거부반응, 이식 편대 숙주 질병, 자가면역성 장애, 염증성 질환, 혈관 질환 및 섬유성 질환의 치료, 신경 재생의 촉진 또는 진균 감염의 치료를 위한 의약 제조에서 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
제50항에 있어서, 상기 의약이 암 또는 B-세포 악성 종양의 치료를 위한 것인 용도.
(a) R_A가 H 또는 (CH₂)₂-OH를 나타내는 하기 식 (II)의 화합물 또는 그의 보호된 유도체와,

R₆기가 상기 식 (I)의 화합물에 대해 정의되는 바와 같은 또는 그의 보호된 유도체인 하기 식 (III)의 화합물 또는 그의 활성화된 유도체를 반응시키는 단계;또는

(b) 식 (I)의 화합물 또는 그의 염을 식 (I)의 또 다른 화합물 또는 그의 또 다른 약제학적으로 허용가능한 염으로 전환시키는 단계; 또는

(c) 식 (I)의 보호된 화합물을 탈보호하는 단계를 포함하는, 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 식 (I)의 화합물의 제조 방법.
(i) 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 (ii) 하나 이상의 다른 치료적 효능제를 포함하는 조성물 또는 키트.
제53항에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 치료적 효능제(들)는 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프리니손(prenisone), 블레오마이신, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 파클리탁셀, 도세탁셀(docetaxel), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜(toremifene), 메게스트롤(megestrol) 아세테이트, 아나스트로졸(anastrozole), 고세렐린(goserelin), 항-HER2 모노클로날 항체(anti-HER2 monoclonal antibody)(예를 들면, Herceptin^TM), 카페시타빈, 랄록시펜 히드로클로라이드, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 프로테아좀 억제제, hsp90 억제제, 아자티오프린(azathioprine), 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, FK506, 미코페놀레이트 모페틸(Mycophenolate Mofetil), OKT-3, ATG, 암포테리신 B, 플루시토신, 에치노칸딘(echinocandin), 그리세오풀빈, 이미다졸 및 트리아졸 항진균제로 이루어진 군으 로부터 선택되는 것인 조성물 또는 키트.