PT1856129E - Derivados de 39-desmetoxi de rapamicina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE 39-DESMETOXI DE RAPAMICINA"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a novos derivados de 39-desmetoxi-rapamicina, métodos para a sua produção, e utilizações dos mesmos.

Num outro aspeto, a presente invenção proporciona a utilização destes derivados de 39- desmetoxi-rapamicina no tratamento de cancro e/ou malignidades de células B, na indução ou manutenção da imunossupressão, no tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, na estimulação da regeneração neuronal ou no tratamento de infeções fúngicas. Antecedentes da Invenção A rapamicina (sirolimus) (Figura 1) é um macrólido lipofilico produzido por Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 (Sehgal et al., 1975; Vezina et al. , 1975; documento US 3.929.992; documento US 3.993.749) com uma fração de 1,2,3-tricarbonila ligada a um ácido pipecólico lactona (Paiva et al., 1991) . Para o propósito desta invenção, a rapamicina é descrita pela convenção de numeração de McAlpine et al. (1991) em preferência às convenções de numeração de Findlay et al. . (1980) ou Chemical Abstracts (11th Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS). A rapamicina tem valor farmacológico significativo devido ao amplo espetro de atividades exibido pelo composto. A rapamicina mostra atividade antifúngica moderada, principalmente contra a espécie Candida, mas também contra fungos filamentosos (Baker et al., 1978; Sehgal et al., 1975; Vézina et al., 1975; documento US 3.929.992; documento US 3.993.749). A rapamicina inibe a proliferação celular por meio da utilização das vias de transdução de sinal como alvo numa variedade de tipos de célula, por exemplo, por meio da inibição das vias de sinalização que possibilitam a progressão da fase Gi à S do ciclo celular (Kuo et al., 1992) . Nas células T, a rapamicina inibe a sinalização do recetor de IL-2 e a autoproliferação subsequente das células T resultando na imunossupressão. Os efeitos inibidores da rapamicina não se limitam às células T, visto que a rapamicina inibe a proliferação de muitos tipos de célula de mamíferos (Brunn et al., 1996). A rapamicina é, portanto, um potente imunossupressor com aplicações terapêuticas estabelecidas ou preditas na prevenção de rejeição a aloenxerto de órgão e no tratamento de doenças autoimunes (Kahan et al. , 1991) . 40-0-(2-hidroxi)etil-rapamicina (SDZ RAD, RAD 001, Certican, everolimus) é um análogo semissintético da rapamicina que mostra efeitos farmacológicos imunossupressores e também está sob investigação como um agente anticancro (Sedrani, R. et al., 1998; Kirchner et al., 2000; documento US 5.665.772, Boulay et al., 2004). A aprovação para este medicamento como um imunossupressor foi obtida para a Europa em 2003. O derivado éster de rapamicina CCI-779 (Wyeth-Ayerst) inibe o crescimento de célula in vitro e inibe o crescimento de tumor in vivo (Yu et al. , 2001) . O CCI-779 está atualmente em testes clínicos de Fase III como um agente anticancro potencial. O valor da rapamicina no tratamento da psoríase de placa crónica (Kirby e Griffiths, 2001), a utilização potencial de efeitos tais como a estimulação do crescimento de neurite em células PC12 (Lyons et al., 1994), o bloqueio das respostas proliferativas às citocinas pelas células do músculo vascular e liso depois da lesão mecânica (Gregory et al., 1993) e o seu papel na prevenção de fibrose de enxerto (Waller e Nicholson, 2001) são áreas de pesquisa intensa (Kahan e Camardo, 2001). Relatos recentes revelam que a rapamicina está associada a uma incidência mais baixa de cancro em pacientes com aloenxerto de órgão na terapêutica imunossupressora de longa duração do que aqueles em outros regimes imunossupressores, e que esta incidência reduzida de cancro é devido à inibição da angiogénese (Guba et al. , 2002). Relatou-se que as atividades neurotrópicas de ligandos de imunofilina são independentes da sua atividade imunossupressora (Steiner et al., 1997) e que a estimulação do crescimento neuronal é promovida pela disrupção do complexo do recetor de esteroide maturo como descrito no pedido de patente WO 01/03692. Efeitos secundários tais como hiperlipidemia e trombocitopenia assim como efeitos teratogénicos potenciais foram relatados (Hentges et al., 2001; Kahan e Camardo, 2001). A cadeia principal de policétido de rapamicina é sintetizada pela condensação de cabeça-cauda de um total de sete unidades de propionato e sete de acetato em uma unidade iniciadora de ácido cicloexanocarboxilico derivado de shikimato pelas proteínas muito grandes, multifuncionais que compreendem a policétido sintase do Tipo I (rap PKS, Paiva et al.r 1991). O aminoácido derivado de L-lisina, ácido pipecólico, é condensado via uma ligação de amida no último acetato da cadeia principal de policétido (Paiva et al. , 1993) e é seguido pela lactonização para formar o macrociclo.

As sequências de nucleótido para cada um dos três genes PKS de rapamicina, as sequências do gene que codifica NRPS e o último gene flanqueador e os polipéptidos correspondentes, foram identificados por Aparicio et al. , 1996, e Schwecke et al. , 1995 e foram depositados com a NCBI sob o número de acesso X86780, e as correções para esta sequência foram recentemente publicadas no documento WO 04/007709. O primeiro produto isento de enzima do grupo biossintético da rapamicina foi designado pré-rapamicina (documento WO 04/007709, Gregory et al. , 2004). A produção da rapamicina totalmente processada requer o processamento adicional do núcleo de policétido/NRPS pelas enzimas codificadas pelos últimos genes da rapamicina, RapJ, RapN, RapO, RapM, RapQ e Rapl.

Acredita-se que as ações farmacológicas de rapamicina caraterizadas até agora sejam mediadas pela interação com recetores citossólicos chamados FKBPs. O recetor da rapamicina intracelular principal em células T eucarióticas é FKBP12 (DiLella e Craig, 1991) e o complexo resultante interage especificamente com proteínas alvo para inibir a cascata de transdução de sinal da célula. O alvo do complexo rapamicina-FKBPl2 foi identificado em levedura como TOR (alvo de rapamicina) (Alarcon et al., 1999) e a proteína mamífera é conhecido como FRAP (Proteína associada a FKBP-rapamicina) ou mTOR (alvo mamífero de rapamicina) (Brown et al., 1994).

Uma ligação entre a sinalização de mTOR e a síntese de proteína localizada em neurônios; seu efeito no estado de fosforilação de proteínas envolvidas no controlo traducional; a abundância de componentes do mecanismo de tradução aos níveis transcricionais e traducionais; o controlo da atividade da aminoácido permease e a coordenação da transcrição de muitas enzimas envolvidas em vias metabólicas foram descritas (Raught et al., 2001) . As vias de sinalização sensíveis à rapamicina também parecem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cérebro embrionário, aprendizagem e formação da memória (Tang et al., 2002). A pesquisa nas proteínas TOR em levedura também revelou os seus papéis na modulação de vias de sinalização sensíveis a nutriente (Hardwick et al., 1999) . De maneira similar, mTOR foi identificado como um alvo direto para a ação da proteína quinase B (akt) e de ter um papel chave na sinalização da insulina (Shepherd et al., 1998; Nave et al., 1999). O TOR de mamífero também foi implicado na polarização do citoesqueleto de actina e a regulação da iniciação traducional (Alarcon et al., 1999). As fosfatidilinositol 3-quinases, tais como mTOR, são funcionais em diversos aspetos da patogénese de tumores tais como a progressão do ciclo celular, adesão, sobrevivência de célula e angiogénese (Roymans e Siegers, 2001).

Os estudos farmacocinéticos de rapamicina e análogos de rapamicina têm demonstrado a necessidade quanto ao desenvolvimento de novos compostos de rapamicina que podem ser mais estáveis em solução, mais resistentes ao ataque metabólico e/ou ter permeabilidade de membrana celular melhorada e efluxo diminuído e que, portanto podem exibir biodisponibilidade oral melhorada.

Relatou-se uma série de análogos de rapamicina sintetizados usando os locais quimicamente disponíveis da molécula. A descrição dos seguintes compostos foi adaptada ao sistema de numeração da molécula de rapamicina descrita na Figura 1. Os locais quimicamente disponíveis na molécula para a derivação ou substituição incluem grupos hidroxilo C40 e C28 (por exemplo, documento US 5.665.772, documento US 5.362.718), grupos metoxi C39 e C16 (por exemplo, documento WO 96/41807; documento US 5.728.710), grupos ceto C32, C26 e C9 (por exemplo, documento US 5.378.836; documento US 5.138.051; documento US 5.665.772). A hidrogenação a C17, C19 e/ou C21, tendo o trieno como alvo, resultou na retenção da atividade antifúngica, mas na perda relativa de imunossupressão (por exemplo, documento US 5.391.730; documento US 5.023.262). As melhoras significativas na estabilidade da molécula (por exemplo, formação de oximas em C32, C40 e/ou C28, documento US 5.563.145, documento US 5.446.048), resistência ao ataque metabólico (por exemplo, documento US 5.912.253), biodisponibilidade (por exemplo, documento US 5.221.670; documento US 5.955.457; documento WO 98/04279) e a produção de pró-fármacos (por exemplo, documento US 6.015.815; documento US 5.432.183) foram obtidas através da derivação.

No entanto, permanece uma necessidade de uma série maior de derivados de rapamicina com estabilidade metabólica melhorada, permeabilidade de membrana celular melhorada e/ou uma taxa diminuída de efluxo. Tais derivados de rapamicina podem ter utilidade maior no tratamento de uma ampla série de condições. A presente invenção proporciona uma série de derivados de 39-desmetoxi- rapamicina com estabilidade metabólica melhorada, permeabilidade de membrana celular melhorada e/ou uma taxa diminuída de efluxo e/ou um perfil inibidor de célula diferente para a rapamicina. Tais compostos são úteis na medicina, em particular para o tratamento de cancro e/ou malignidades de células B, a indução ou manutenção da imunossupressão, o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, a estimulação da regeneração neuronal ou o tratamento de infeções fúngicas.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona derivados de 39-desmetoxi de rapamicina, métodos para a preparação destes compostos, intermediários destes e estes compostos para a utilização na medicina. São revelados no presente documento derivados de 39-desmetoxi de rapamicina caraterizados em que a posição 40-hidroxi é derivada como um éster do ácido carboxílico, como um éter, como um éster de fosfato, como um éster de fosfinato, como um acetal ou como um glicosilo. A estabilidade metabólica, a permeabilidade de membrana celular, o efluxo e a biodisponibilidade dos compostos da invenção podem ser testados como apresentado a seguir.

Quando 39-desmetoxi-rapamicina é derivada como um éster do ácido carboxilico, como um éter ou como um acetal o grupo de derivação preferentemente contém não mais do que 12 átomos de carbono (especialmente 7 ou menos particularmente 5 ou menos átomos de carbono) . Preferentemente ela contém pelo menos um grupo funcional (especialmente pelo menos dois grupos funcionais) selecionados de -CF2PO(OH)2, - PO(OH)2, -COOH, -OH e -NH2 particularmente selecionados de -COOH e - OH mais particularmente -OH.

Quando 39-desmetoxi-rapamicina é derivada como um acetal derivado de um grupo glicosilo preferentemente cada glicosilo é formada a partir de um açúcar ou um glicósido que preferentemente contém não mais do que 12 átomos de carbono (especialmente 7 ou menos, particularmente 6 ou menos átomos de carbono). Os exemplos incluem mono e dissacarideos, particularmente monossacarideos que formam anéis de 5 e 6 membros. Preferentemente ela contém pelo menos um grupo funcional (especialmente pelo menos dois grupos funcionais) selecionados de -COOH, -OH e -NH2 particularmente selecionados de -NH2 e -OH mais particularmente -OH.

Quando 39-desmetoxi-rapamicina é derivada como um éster de fosfato preferentemente os grupos alquilo contêm não mais do que 4 átomos de carbono.

Quando 39-desmetoxi-rapamicina é derivada como um éster de fosfinato preferentemente os grupos alquilo preferentemente contêm não mais do que 4 átomos de carbono, um exemplo é o éster formado com ácido fosfinico.

Os exemplos específicos de frações de derivação são dados a seguir.

Um primeiro aspeto da presente invenção proporciona derivados de 39-desmetoxi-rapamicina de acordo com a Fórmula (I) a seguir, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos:

em que: X representa uma ligação ou CH2;

Ri representa um grupo ceto ou (H,H); R2 representa OH ou OMe; R3 representa H, OH ou OMe; R4 e R5 representam, cada um, independentemente H ou OH; R6 representa -R7, -C(0)R7, - (CH2) 2-0- [CR21R22-O] a-C (0) -R23; -CR21R22-O-C (0)-R23; -POR19R20, -PO (OR19) (OR20) ouY-Ri5; R7 representa - (CR8R9) m (CRioRn) pCRnRnRin

Rg e R9 representam, cada um, independentemente C1-C4 alquilo, C2-C4 alcenilo ou C2-C4 alcinilo, qualquer de cujos grupos pode opcionalmente ser substituído com -PO (OH) 2, -CF2PO(OH)2, -0H,-C00H ou -NH2; ou Rg e Rg representam, cada um, independentemente H, trifluorometilo ou F;

Rio, Rn, R12, R13 e R14 representam, cada um, independentemente C1-C4 alquilo, C2-C4 alcenilo ou C2-C4 alcinilo, qualquer de cujos grupos pode opcionalmente ser substituído com -PO (OH) 2, -CF2P0 (OH) 2, -OH, -C00H ou -NH2; ou Rio, R11, R12, R13 e R14 podem ser independentemente selecionados a partir de H, - (CRgRg) qNH2, -(CRgRg)q0H, CF3, F, COOH; ou Rio e Rn ou R12 e R13 ou R13 e Ri4 podem ser tomados juntamente com o carbono ao qual são unidos para formar um C3-C6 cicloalquilo ou um anel heteroalquilo de 3 a 6 membros que contém um ou mais heteroátomos selecionados a partir de N, 0 e S e que é, opcionalmente, substituído com até 5 grupos - (CRsR^qOH, -(CRsR^qNtb ou COOH; Y = ligação, -C(0)-0-; - (CH2) 2-0-C (0) -0-;

Ris representa

Ri6 são, cada um, independentemente H ou OH;

Ri7 é independentemente selecionado a partir de H, OH e NH2;

Ris é independentemente selecionado a partir de H, -CH3, -CH20H e -COOH; contanto que, no entanto, não mais de 2 grupos selecionados a partir de R16, R17 e Ris representem H ou CH3 ;

Rig e R20 representam, cada um, independentemente H ou Cl-C4 alquilo ou Rig e R20 juntos representam =CH2; R21 é independentemente selecionado a partir de H, CH3; R22 é independentemente selecionado a partir de H, -CH3, - CH=CH2, -CH2CI, -CHCI2, -CCI3, - CH (OH) Me, -CH2OH, -CH2CH3, -CH(Cl)Me; R23 é independentemente R7, Y-R15 ou um anel arilo ou heteroarilo de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com entre um e três grupos selecionados a partir de OH, F, Cl, Br, NO2 e NH2; a representa 0 ou 1; m, p e q representam, cada um, independentemente um número inteiro entre 0-4; contanto que, no entanto, a fração R7 não contenha mais de 12 átomos de carbono e contenha pelo menos um grupo funcional selecionado a partir de -P0(0H)2, -CF2P0 (OH) 2, - COOH, OH ou ΝΗ2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo . A estrutura acima mostra um tautómero representativo e a invenção abrange todos os tautómeros dos compostos da fórmula (I) por exemplo, compostos ceto onde os compostos de enol são ilustrados e vice-versa. A não ser que estereoisómeros particulares sejam especificamente indicados (por exemplo, por uma ligação em negrito ou tracejada num estereocentro relevante numa fórmula estrutural, pela representação de uma ligação dupla como tendo a configuração E ou Z numa fórmula estrutural, ou pelo utilização da nomenclatura que designa a estereoquimica), todos os estereoisómeros são incluídos dentro do âmbito da invenção como compostos puros assim como misturas destes. A não ser que de outro modo indicado, enantiómeros, diastereómeros, isómeros geométricos individuais, e combinações e misturas destes são todos abrangidos pela presente invenção. As formas cristalinas polimórficas e solvatos e hidratos também são abrangidos dentro do âmbito desta invenção.

Num outro aspeto, a presente invenção proporciona derivados de 39-desmetoxi-rapamicina tais como os compostos da fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, para a utilização como um agente farmacêutico. Definições

Os artigos "vim" e "uma" são usados no presente documento para referir-se a um ou a mais do que um (isto é, pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Por meio de exemplo "um análogo" significa um análogo ou mais do que um análogo.

Conforme usado no presente documento o termo "análogo(s)" refere-se aos compostos químicos que são estruturalmente similares entre si, mas que diferem levemente na composição (como na substituição de um átomo por um outro ou na presença ou ausência de um grupo funcional particular) .

Em particular, o termo "análogo de 39-desmetoxi-rapamicina" refere-se a um composto de 39-desmetoxi-rapamicina produzido pelos métodos do documento WO 2004/007709 e/ou como mostrado pela fórmula (II). Estes compostos também são aludidos como "compostos precursores" e estes termos são usados de modo intercambiável no presente pedido. No presente pedido, o termo "análogo de 39-desmetoxi-rapamicina" inclui referência à própria 39-desmetoxi-rapamicina.

Conforme usado no presente documento, o termo "derivado(s)" refere-se a compostos químicos que foram modificados a partir do seu composto precursor pela química orgânica semissintética.

Em particular, o termo "derivado de 39-desmetoxi-rapamicina" refere-se a um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina de acordo com a Fórmula (I) acima, ou um sal desta farmaceuticamente aceitável, produzidos pela alteração semissintética de um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina. Estes compostos também são aludidos como "compostos da invenção" ou "derivados de 39-desmetoxi de rapamicina" e estes termos são usados de modo intercambiável no presente pedido.

Conforme usado no presente documento, o termo "distúrbio(s) autoimune(s)" inclui, sem limitação: lúpus eritematoso sistémico (SLE), artrite reumatoide, miastenia grave e esclerose múltipla.

Conforme usado no presente documento, o termo "doenças de inflamação" inclui, sem limitação: psoríase, dermatite, eczema, seborreia, doença inflamatória do intestino (incluindo, mas não limitado à colite ulcerativa e doença de Crohn), inflamação pulmonar (incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, enfisema, síndrome da angústia respiratória aguda e bronquite), artrite reumatoide e uveíte ocular.

Conforme usado no presente documento, o termo "cancro" refere-se ao crescimento maligno de células na pele ou em órgãos do corpo, por exemplo, mas sem limitação, mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago ou intestino. Um cancro tende a infiltrar no tecido adjacente e espalha-se (faz a metástase) para órgãos distantes, por exemplo, para o osso, fígado, pulmão ou no cérebro. Conforme usado no presente documento o termo cancro inclui ambos os tipos de célula de tumor metastático, tais como, mas não limitado a, melanoma, linfoma, leucemia, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e mastocitoma e tipos de carcinoma de tecido, tais como mas não limitado a, cancro colorretal, cancro da próstata, cancro pulmonar de célula pequena e cancro pulmonar de célula não pequena, cancro de mama, cancro pancreático, cancro da bexiga, cancro renal, cancro gástrico, glioblastoma, cancro hepático primário e cancro do ovário.

Conforme usado no presente documento o termo "malignidades de célula B" inclui um grupo de distúrbios que incluem leucemia linfocítica crónica (CLL), mieloma múltiplo, e linfoma de não Hodgkin (NHL). Estas são doenças neoplásticas do sangue e órgãos que formam o sangue. Estes causam disfunção na medula óssea e no sistema imune, que tomam o hospedeiro altamente suscetível à infeção e hemorragia.

Conforme usado no presente documento, o termo "doença vascular" inclui, sem limitação: distúrbios vasculares hiperproliferativos (por exemplo, restenose e oclusão vascular), aterosclerose vascular de enxerto, doença cardiovascular, doença vascular cerebral e doença vascular periférica (por exemplo, doença da artéria coronária, arteriosclerose, aterosclerose, arteriosclerose não ateromatosa ou dano à parede vascular).

Conforme usado no presente documento o termo "regeneração neuronal" refere-se à estimulação do crescimento de célula neuronal e inclui crescimento de neurite e recuperação funcional de células neuronais. Doenças e distúrbios onde a regeneração neuronal pode ser de beneficio terapêutico significativo incluem, mas não se limitam a, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, coreia de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, neuralgia trigeminal, neuralgia glossofaringea, paralisia de Bell, distrofia muscular, acidente vascular cerebral, atrofia muscular progressiva, atrofia muscular herdada bulbar progressiva, espondilose cervical, sindrome de Gullain-Barre, demência, neuropatias periféricas e dano nervoso periférica, seja causada pelo dano físico (por exemplo, dano ou trauma da medula espinal, lesão ou dano do nervo ciático ou facial) ou um estado de doença (por exemplo, diabetes) .

Conforme usado no presente documento, o termo "doenças fibróticas" refere-se a doenças associadas à produção em excesso da matriz extracelular e inclui (sem limitação) sarcoidose, queloides, glomerulonefrite, doença renal em estágio final, fibrose hepática (incluindo mas não limitado a cirrose, doença hepática alcoólica e esteato-hepatite), nefropatia de enxerto crónica, adesões cirúrgicas, vasculopatia, fibrose cardíaca, fibrose pulmonar (incluindo, mas não limitado à fibrose pulmonar idiopática e alveolite fibrosante criptogénica), degeneração macular, retinopatia retinal e vítrea e fibrose induzida pela quimioterapia ou radiação.

Conforme usado no presente documento, o termo "doença do enxerto vs. hospedeiro" refere-se a uma complicação que é observada depois do transplante de célula estaminal alogénica / medula óssea. Esta ocorre quando as células que combatem a infeção do dador reconhecem o corpo do paciente como sendo diferente ou estranho. Estas células que combatem a infeção atacam então os tecidos no corpo do paciente exatamente como se elas estivessem atacando uma infeção. A doença do enxerto vs. hospedeiro é categorizada como aguda quando a mesma ocorre dentro dos primeiros 100 dias depois do transplante e crónica se a mesma ocorre a mais do que 100 dias depois do transplante. Os tecidos tipicamente envolvidos incluem o fígado, trato gastrointestinal e pele. A doença do enxerto vs. hospedeiro crónica ocorre aproximadamente em 10 a 40 por cento de pacientes depois do transplante de célula estaminal / medula óssea.

Conforme usado no presente documento, o termo "biodisponibilidade" refere-se ao grau ao qual ou à taxa na qual um medicamento ou outra substância é absorvida ou toma-se disponível no local de atividade biológica depois da administração, esta propriedade é dependente de vários fatores incluindo a solubilidade do composto, taxa de absorção no intestino, o grau de ligação e metabolismo de proteína, etc. Vários testes para a biodisponibilidade que podem ser familiares a uma pessoa de habilidade na técnica são descritos no presente documento (veja-se também Trepanier et al.f 1998, Gallant-Haidner et al.f 2000). O termo "solubilidade em água" como usado neste pedido refere-se à solubilidade em meios aquosos, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) no pH 7,4.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos da invenção tais como os compostos da fórmula (I) incluem sais convencionais formados a partir de ácidos ou bases inorgânicas ou orgânicas farmaceuticamente aceitáveis assim como sais de adição de ácido de amónio quaternário. Os exemplos mais específicos de sais de ácido adequados incluem clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiónico, succínico, glicólico, fórmico, láctico, maleico, tartárico, cítrico, palmóico, malónico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, fumárico, toluenossulfónico, metanossulfónico, naftaleno-2-sulfónico, benzeno-sulfónico hidroxinaftóico, iodídrico, málico, esteroico, tánico e outros. Outros ácidos tais como oxálico, embora não eles próprios farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicos adequados incluem os sais de sódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio, cálcio, zinco, N,Ν'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, N-metilglicamina e procaína. Referências a seguir a um composto de acordo com a invenção incluem tanto os compostos da fórmula (I) quanto seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Grupos alquilo, alcenilo e alcinilo podem ser de cadeia linear ou ramificada.

Os exemplos de grupos alquilo C1-C4 incluem metilo, etilo, n- propilo, i-propilo e n-butilo.

Os exemplos de grupos alcenilo C2-C4 incluem etenilo e 2-propenilo.

Os exemplos de grupos alcinilo C2-4 incluem etinilo.

Os grupos cicloalquilo C3-C6 referem-se a um anel de cicloalquilo incluindo 3 a 6 átomos de carbono que podem ser opcionalmente ramificados. Os exemplos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, metil-ciclobutilo, ciclopentilo e cicloexilo, os anéis heteroalquilo de 3 a 6 membros contendo um ou mais heteroátomos selecionados de N, 0 e S incluem anéis contendo um ou dois heteroátomos, especialmente um heteroátomo. Os exemplos incluem furano, pirano, oxetano, oxirano, piperidina, pirrolidina, azetidina, aziridina, tiirano, tietano, tiofeno, tiopirano e morfolina. 0 exemplo de substituintes opcionais para os anéis de heteroalquilo de 3 a 6 membros incluem -OH, - CH2OH, NH2, CH2NH2 e COOH. Tipicamente os anéis de heteroalquilo de 3 a 6 membros podem ser não substituídos ou substituídos por 1 ou 2, por exemplo, 1 substituinte.

Descrição da Invenção A presente invenção proporciona derivados de 39-desmetoxi-rapamicina, como apresentado acima, métodos para a preparação destes compostos, intermediários destes e estes compostos para a utilização na medicina.

Preferentemente R7 contém 7 ou menos especialmente 5 ou menos átomos de carbono. R7 preferentemente contém pelo menos um grupo funcional selecionado de -PO (OH)2, -OH, -COOH e -NH2, mais preferentemente -OH, - COOH ou -NH2, especialmente -COOH e OH, o mais especialmente OH. Preferentemente, R7 contém 2 ou mais substituintes, por exemplo, 2 grupos -OH.

Adequadamente X representa CH2;

Adequadamente a representa 0.

Adequadamente p representa 0 ou 1.

Adequadamente m representa 0 ou 1.

Adequadamente q representa 0, 1 ou 2.

Adequadamente Rn representa H. Adequadamente R12 representa H.

Adequadamente Rn representa H ou OH.

Quando p representa 1, adequadamente Rio representa Me, OH ou CH2OH.

Quando p representa 1, adequadamente Rn representa Me, H ou CH2OH.

Quando m e p ambos representam 0, adequadamente Rn e

Rn ambos representam H, R14 representa - (CRsR^g-OH onde q = 0 ou 1 e Re e R9 ambos representam H.

Quando p representa 1 e m representa 0, adequadamente Rio e Rn ambos representam H, Rn representa H, Rn representa H, OH ou NH2, Rn representa -(CRsR^g-OH onde q = 0 ou 1 e Re e R9 ambos representam H.

Quando representa -POR15R16 adequadamente Rn e Rn ambos representam CH3 ou ambos representam CH2CH3.

Adequadamente R6 representa o resíduo derivado de formar um éster com ácido hidroxil acético, ácido 3- hidroxi-2,2-dimetilpropiónico, ácido 2,3- diidroxipropiónico, ácido 3-hidroxi-2- hidroximetilpropiónico ou ácido 2,2- bis (hidroximetil)propiónico.

Num conjunto de exemplo de compostos, R6 representa: C(0)R7

Preferentemente, R7 é a fração formada pela condensação do álcool macrociclico com um ácido selecionado da lista que consiste de ácido hidroxiacético, ácido 3-hidroxi-2,2-dimetilpropiónico, ácido 2,3- diidroxipropiónico, ácido 3-hidroxi-2- hidroximetilpropiónico e ácido 2,2- bis(hidroximetil)propiónico, especialmente o ácido 2,2-bis-(hidroximetil)propiónico.

Quando Ris representa:

exemplos desta fração incluem a fração formada pela formação de um acetal com (i) glicose (isto é, Ris representa CH2OH e cada R76 e Ri7 representa OH) , por exemplo, D-glicose (ii) glicosamina (isto é, Ris representa CH2OH, cada Ri6 representa OH e Ri7 representa NH2) por exemplo, D-glicosamina, (iii) ácido glicurónico (isto é,

Ris representa COOH e cada R76 e Ri7 representa OH) por exemplo, ácido D-glicurónico e (iv) arabinose (isto é, Ris representa H e cada R76 e Ri7 representa OH) por exemplo, D-arabinose.

Quando R15 representa:

exemplos desta fração incluem a fração formada pela formação de um acetal com ffutose (isto é, cada Ri6 representa OH), por exemplo, o resíduo de D-frutose.

Quando R15 representa:

exemplos desta fração incluem a fração formada pela formação de um éster com ácido glicurónico (isto é, cada Ri6 representa OH) , por exemplo, o resíduo do ácido D-glicurónico.

No geral, os compostos da invenção são preparados pela derivação semissintética de um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina da fórmula (II).

Assim um processo para preparar um composto da fórmula (I) ou um sal f armaceuticamente aceitável do mesmo compreende: (a) fazer reagir um análogo de 39-desmetoxi- rapamicina da fórmula (II):

onde Ra representa H ou (CH2)2_OH ou um derivado protegido deste, com um composto da fórmula (III) : HO-R6 (III) ou um derivado ativado de R6; (b) converter um composto da fórmula (I) ou um sal deste a um outro composto da fórmula (I) ou um outro sal deste farmaceuticamente aceitáveis; ou (c) desproteger um composto protegido da fórmula (I). 0 termo "derivado ativado" como usado acima refere-se a (por exemplo, mas sem limitação) : no caso de ésteres - ácidos carboxilicos, haletos de acilo, anidridos mistos, anidridos simétricos ou éteres carboxilicos; no caso de éteres - haletos de alquilo, mesilatos de alquilo, triflatos de alquilo, tosilatos de alquilo ou outros derivados de alquilo adequadamente ativados; no caso de fosfatos e fosfonatos - clorofosfatos, cianofosfatos de dialquilo, dialquilfosforamidatos ou clorofosfitos de dialquilo; ou no caso de acetais derivados de grupos glicosilo - usando um dador de glicosilo por exemplo, haletos de glicosilo, tioglicósidos, 1-0-acil glicósidos, orto ésteres, carbonatos 1-0 ou 1-S, tricloroimidatos, 4- pentenil glicósidos, ésteres de fosfato de glicosilo, 1-0-sulfonilos ou glicósidos 1-0-sililados.

No processo (a) , análogos de 39-desmetoxi-rapamicina da fórmula (II) podem ser preparados como descrito no documento WO 2004/007709 e como ainda apresentado nos exemplos neste.

Além dos métodos e referências específicos no presente documento proporcionados um perito na especialidade também pode consultar referências em livro texto padrão quanto aos métodos sintéticos, incluindo, mas não limitados a Vogel's textbook of practical organic chemistry (Fumiss et al., 1989) e March's advanced organic chemistry (Smith e March, 2001).

Os grupos hidroxilo adicionalmente presentes podem ser protegidos por uma de muitas estratégias de proteção de hidroxi padrão disponíveis a um perito na especialidade. Os grupos hidroxilo podem ser protegidos pela formação de éteres, incluindo, mas não limitado a, éteres alquílicos substituídos, éteres benzílicos substituídos e éteres silílicos. Preferentemente um éter silílico, incluindo, mas não limitado a, trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo e t-butildifenil-sililo, o éter é formado reagindo-se uma forma ativada do silano (incluindo, mas não limitado a, cloreto de sililo ou triflato de sililo) com 39-desmetoxi-rapamicina na presença de uma base adequada. 0 grupo de proteção pode ser depois removido pela hidrólise ácida ou clivagem auxiliada por fluoreto. 1,2-Dióis podem ser protegidos como acetonidas, com base na condensação de um derivado de acetona. Estas podem ser removidas pela catálise ácida.

Os análogos de 39-desmetoxi-rapamicina da fórmula (II) podem ser usados como padrões para outra semi-síntese (isto é, o processo (a)). 0 grupo hidroxilo pendente em C-40 pode ser funcionalizado por exemplo, pela acilação, alquilação, glicosilação ou fosforilação via várias transformações sintéticas conhecidas a um perito na especialidade.

No processo (a) , quando R6 representa uma fração da fórmula - C(0)R7 ou Y-Ris onde Ris representa

e Y = ligação, a formação de um hidroxi éster, ou 0-acilação, pode ser mediada pela reação do grupo hidroxilo dos compostos da fórmula (II) com um ácido carboxílico correspondente preferentemente na forma ativada, por exemplo um composto da fórmula (IIIAi) ou (IIIAii):

ou com um composto da fórmula (IIIB):

onde W é um grupo que ativa um ácido carboxilico para o ataque nucleofilico. Os ácidos carboxilicos podem ser ativados pela formação por exemplo mas sem limitação, de haletos de acilo (por exemplo, W = Cl), anidridos mistos (isto é, W = OC(O)R'), anidridos simétricos (W = 0C(0)R7) ou ésteres carboxilicos (isto é, W = OR').

Os compostos da fórmula (IIIAi), (IIIAii) ou (IIIB) podem ser preparados a partir dos seus ácidos carboxilicos comercialmente disponíveis usando métodos padrão conhecidos por um perito na especialidade, e num aspeto específico, os compostos de acordo com a Fórmula (IIIAi) em que R7 é -(CR8R9) m (CR10R11) PCR12R13R14 podem ser preparados usando métodos como descritos no documento US 5.362.718, US 5.665.772 ou EP 0 663 916.

Preferentemente, um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina é feito reagir em meios orgânicos com um cloreto ácido ou anidrido misturado na presença de uma base. As bases que podem ser usadas incluem, mas não são limitadas a, piridina, 4,4-dimetilaminopiridina (DMAP), 2,6-lutidina, 2,6-di- terc-butilpiridina, trietilamina, diisopropiletilamina, outras trialquilaminas, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) ou 1,5-diaza-biciclo[4.3.0]non-5- eno (DBN). Em exemplos específicos descritos no presente documento, a 39-desmetoxi- rapamicina é feita reagir com um anidrido misturado na presença de DMAP.

No processo (a) , quando Rõ representa uma fração da fórmula -C(0)R7 ou Y-R15 onde R15 representa

e Y = -C(0)0- ou -(CH2) 2-OC(0)0- a formação destes hidroxi ésteres, requer a reação do grupo hidroxilo dos compostos da fórmula (II) ou um composto que é 40-0-(hidroxietil) -fórmula II com um reagente que formará um carbonato ativado tal como um composto da fórmula IV

(IV), onde T = ligação ou -0(CH2)2- e R24 é um grupo alquilo ou arilo, preferentemente um grupo arilo, especialmente grupo para-nitrofenilo. 0 composto da fórmula IV pode depois reagir com um composto da fórmula III, para gerar compostos com ligado ao grupo 40-hidroxilo, ou grupo 40-0-(hidroxietil) via um ligante de carbonato (documento WO 2004/101583).

Do mesmo modo, um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina pode ser derivado com hidroxi éteres diferentes em C-40, pela reação do análogo de 39-desmetoxi-rapamicina com um derivado de alquilo adequadamente ativado de escolha, para formar um derivado de 40-O-alquil- 39-desmetoxi-rapamicina. Os grupos alquilo ativados referem-se a um grupo alquilo que foi ativado por um de muitos métodos, incluindo, mas não limitado à formação de haletos de alquilo (RC1, Rl, RBr), mesilatos de alquilo (ROS(0) 2CH3), triflatos de alquilo (ROS (O)2CF3) , tosilatos de alquilo (ROS (0)2PhMe) . 0 grupo alquilo ativado pode ser depois feito reagir com um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina em meios orgânicos na presença de uma base adequada. Os métodos padrão para otimizar as condições de reação podem ser utilizados por um perito na especialidade para evitar a alquilação em outras posições reativas.

Do mesmo modo, um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina pode ser fosforilado, e depois da desproteção dos ésteres de fosfato o mesmo pode produzir um derivado de 40-O-fosfo-39-desmetoxi-rapamicina ou um derivado de 40-0-dialquilfosf0-39-desmetoxi-rapamicina, e sais destes derivados fabricados pelos métodos conhecidos por um perito na especialidade. Os ésteres de fosfato podem ser formados direta ou indiretamente via um 0-fosfito (isto é, (R'0)2P0R) em que o fosfito trivalente é oxidado (preferentemente pela ação de um perácido, tal como mas não limitado a mCPBA) ao fosfato pentavalente. Os métodos de fosforilação direta incluem, mas não se limitam à reação de um análogo de 39- desmetoxi-rapamicina com um clorofosfato protegido (por exemplo, (BnO)2P(0)Cl, (AlquilO)2P(0)Cl), preferentemente na presença de DMAP em meios orgânicos, ou a reação de um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina com oxicloreto de fósforo (POCI3) , na presença de uma base tal como trietilamina, seguida pela hidrólise ácida do 0-diclorofosfato resultante (isto é, R0P(0)CÍ2), ou ligação a um cianofosfato de dialquilo (documento WO 01/81355). 0 clorofosfato de dialquilo ou diarilo pode ser gerado in situ pela reação de um fosfito de dialquilo ou diarilo (isto é, (R0)2P(0)H) com tetracloreto de carbono na presença de base. Os métodos de formar o 0-fosfito (para a oxidação ao 0-fosfato) incluem, mas não se limitam à ligação de um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina com um dialquil-fosforamidato de dialquilo (preferentemente

diisopropilfosforilamidato de dialquilo), na presença de base (preferentemente tetrazol), ou ligação usando um clorofosfito na presença de base (Evans et al., 1992) . A escolha do grupo de proteção é importante, os ésteres de etilo e metilo de fosfatos não são facilmente hidrolisáveis sob condições ácidas ou básicas. Preferentemente os grupos de proteção incluem, mas não se limitam a, ésteres benzílicos (clivados por intermédio da hidrólise promovida pelo iodeto de sódio / clorotrimetilsilano, (documento WO 01/81355)) ou ésteres 2-cianoetílicos (clivados por intermédio da clivagem catalisada por base branda). De maneira similar 40-O-dialquilfosfono-39- desmetoxi-rapamicina podem ser gerados pela reação de um análogo de 39- desmetoxi-rapamicina com um dialquilfosfonato ou dialquilfosfito ativados adequados (como descrito acima).

No processo (a), quando Ris representa uma fração da fórmula ou a formação de uma ligação glicosídica, ou O-glicosilação, pode ser mediada pela reação do grupo hidroxilo com um dador de glicosilo correspondente, preferentemente na forma ativada, (veja-se Toshima e Tatsuta (1993)) por exemplo um composto da fórmula (IIIC):

ou um composto da fórmula (IIID):

Usando um 'dador de glicosilo', incluindo, mas não limitado a, haletos de glicosilo (Z = F, Cl, Br) , tioglicósidos (Z = SMe, Set, SPh, SPy, SCN) , 1-0-acil glicósidos (Z = OC(O)R), orto ésteres (Z = OC(Me) (R) (0-C2 da fórmula (IIIC/IIID)), carbonatos 1-0 ou 1-S (Z = 0C(S)SMe, Z = OC(0)imidazol, Z = OC(S)imidazol, Z = SC(S)OEt), tricloroimidatos (Z = OC(=NH)CCI3) , 4-pentenil glicósidos (Z = OCH2CH2CH2CH=CH2) , ésteres de fosfato (por exemplo, Z = OP(0)(0Ph)2), 1-0-sulfonilos (Z = tosilo), ou glicósidos 1-0-sililados (Z = OTMS ou OTBS), o análogo de 39-desmetoxi- rapamicina pode ser glicosilado em meios orgânicos, preferencialmente na presença de um ativador (tal como um ácido de Lewis ou sal de metal pesado, veja-se Toshima e Tatsuta, 1993)). 0 dador de glicosilo específico usado e as condições de reação determinarão se um alfa ou beta glicósido é formado. Como antes para a acilação, quaisquer grupos hidroxilo presentes no composto precursor podem ser protegidos ou mascarados tal que usando um equivalente de dador de glicosilo resultará na 40-0-acilação. Os hidroxilos remanescentes no dador de glicosilo devem ser protegidos, como por exemplo, 0-acetatos, 0-benzoatos, 1,2-acetonidas, de modo que uma desproteção será necessária. Além disso, os dadores de 2-desoxiglicosilos tais como glicais podem ser usados (uma etapa redutiva também é requerida) para preparar glicósidos de 2'-desoxi-39-desmetoxi-rapamicina e dadores de 2,6-didesoxiglicosilo tais como 2,6-anidro-2-tioaçúcares podem ser usados para preparar glicósidos de 2',6'-didesoxi-39-desmetoxi-rapamicina.

No processo (b), a formação de sal e a troca podem ser realizadas por métodos convencionais conhecidos por um perito na especialidade. As interconversões de compostos da fórmula (I) podem ser realizadas pelos processos conhecidos por exemplo grupos hidroxi e ceto podem ser interconvertidos pela oxidação/redução como no presente documento descrito em outro lugar. Os compostos da fórmula (I) em que R6 representa -PO(OH)2 podem ser preparados pela fosforilação de um composto correspondente da fórmula (I) em que R6 representa OH. As condições adequadas são no presente documento proporcionadas em outro lugar.

Nos processos (a) e (c) , os exemplos de grupos de proteção e o meio para a sua remoção podem ser encontrados em T W Greene "Protective Groups in Organic Synthesis" (J Wiley and Sons, 1991) . Os grupos de proteção de hidroxilo adequados incluem alquilo (por exemplo, metilo), acetal (por exemplo, acetonida) e acilo (por exemplo, acetilo ou benzoila) que podem ser removidos pela hidrólise, e arilalquilo (por exemplo, benzilo) que podem ser removido pela hidrólise catalítica, ou éter sililico, que pode ser removido pela hidrólise ácida ou clivagem auxiliada pelo ião fluoreto.

Além do processo (a) , os análogos de 39-desmetoxi-rapamicina da fórmula (I) onde R6 representa R7 podem ser sintetizados pela transesterificação catalisada por Lipase. Por exemplo, mas sem limitação, um análogo de 39-desmetoxi-rapamicina da fórmula (II) pode ser feito reagir com um éster vinilico da fórmula (V) na presença de lipase PS-C "Amano" II sob as condições de reação descritas por Gu et al (2005) e como ainda no presente documento apresentado nos exemplos. Esta metodologia não é limitada à utilização de ésteres vinilicos e a transesterificação pode ser catalisada por outras lipases ou esterases.

Outros compostos da invenção podem ser preparados pelos métodos conhecidos por si mesmos ou pelos métodos análogos a aqueles descritos acima.

Os novos derivados de 39-desmetoxi-rapamicina são úteis diretamente, e como padrões para outra semi-síntese ou bioconversão, para produzir compostos úteis como imunossupressores, agentes antifúngicos, agentes anticancro, agentes anti-inflamatórios, agentes neuro-regenerativos ou agentes para o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doença vascular e/ou doenças fibróticas. Métodos para a derivação semissintética de rapamicina e análogos desta são bem conhecidos na técnica e incluem (mas não se limitam a) aquelas modificações descritas por exemplo, no documento US 5.665.772; documento US 5.362.718. WO 96/41807; documento US 5.728.710, documento US 5.378.836; documento US 5.138.051; documento US 5.665.772, documento US 5.391.730; documento US 5.023.262, documento US 5.563.145, documento US 5.446.048, documento US 5.912.253, documento US 5.221.670; documento US 5.955.457; documento WO 98/04279, documento US 6.015.815 e documento US 5.432.183.

As estruturas acima de intermediários (por exemplo, compostos da fórmula (II) podem ser submetidas à tautomerização e onde um tautómero representativo é ilustrado será entendido que todos os tautómeros por exemplo compostos ceto onde compostos enol são ilustrados e vice versa são intencionados a serem aludidos também.

Num outro aspeto, a presente invenção proporciona a utilização dos derivados de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção na medicina. Num outro aspeto a presente invenção proporciona a utilização de derivados de 39- desmetoxi-rapamicina da invenção na preparação de um medicamento para a indução ou manutenção da imunossupressão, na estimulação da regeneração neuronal ou no tratamento de cancro, malignidades de célula B, infeções fúngicas, rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas ou agentes para a utilização na regulação da cicatrização de ferimento. A Resistência a Multi-Medicamento (MDR) é um problema significativo no tratamento de cancro e malignidades de célula B. Esta é a razão fundamental por detrás do desenvolvimento da resistência a medicamento em muitos cancros (Persidis A, 1999) . A MDR está associada a os níveis aumentados de transportadores do cassete de ligação de trifosfato de adenosina (transportadores ABC), em particular um aumento na expressão do gene da MDRl que codifica a glicoproteína P (P-gp) ou o gene de MRPl que codifica a MRPl. 0 nível de expressão do gene MDRl varia amplamente através de linhas de célula derivadas de cancro diferentes, em algumas linhas de célula é indetetável, ao passo que em outras podem mostrar até uma expressão 10 ou 100 vezes aumentada em relação aos controlos padrão.

Portanto, um outro aspeto da invenção proporciona a utilização de um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção no tratamento de cancros de MDR ou malignidades de célula B. Num aspeto específico a presente invenção proporciona a utilização de derivados de 39-desmetoxi-rapamicina no tratamento de cancros que expressam P-gp ou malignidades de célula B. Numa forma de realização ainda mais preferida a presente invenção proporciona a utilização de um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção no tratamento de cancros que expressam P-gp alta ou malignidades de célula B. Particularmente, os cancros que expressam P-gp alta ou malignidades de célula B podem ter a expressão 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes aumentada em relação aos níveis de controlo. Os controlos adequados são células que não expressam P-gp, que tenham um nível de expressão baixo de P-gp ou que tenham função de MDR baixa, um perito na especialidade está ciente de ou pode identificar tais linhas de célula; por meio de exemplo (mas sem limitação) as linhas de célula adequadas incluem: MDA435/LCC6, SBC-3/CDDP, MCF7, NCI-H23, NCI-H522, A549/ATCC, EKVX, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, HOP- 18, HOP-92, LXFL 529, DMS 114, DMS 273, HT29, HCC-2998, HCT-116, COLO 205, KM12, KM20L2, MDA-MB-2 31/ATCC, MDA-MB-435, MDA- N, BT-549, T-47D, OVCAR- 3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, IGROVI, SK-OV-3, K-562, MOLT- 4, HL-6 0 (TB) , RPMI-8226, SR, SN12C, RXF-631, 786-0, TK-10, LOX IMVI, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, M14, UACC-62, UACC-257, PC-3, DU-145, SNB-19, SNB-75, SNB-78, 0251, SF-268, SF-539, XF 498.

Num aspeto alternativo a presente invenção proporciona a utilização de um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção na preparação de um medicamento para a utilização no tratamento de cancros de MDR ou malignidades de célula B. Num aspeto específico a presente invenção proporciona a utilização de um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção na preparação de um medicamento para a utilização no tratamento de cancros que expressam P-gp ou malignidades de célula B. Num forma de realização ainda mis preferida a presente invenção proporciona a utilização de um derivado de 39- desmetoxi-rapamicina na preparação de um medicamento para a utilização no tratamento de cancros que expressam P-gp alto ou malignidades de célula B. Particularmente, os cancros que expressam P-gp alto ou malignidades de célula B podem ter a expressão 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes aumentada em relação aos níveis de controlo. Os controlos adequados são descritos acima.

Os métodos para determinar o nível de expressão de P-gp numa amostra são debatidos adicionalmente no presente documento.

Portanto, descreve-se no presente documento um método para o tratamento de cancros que expressam P-gp ou malignidades de célula B que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção. 0 nível de expressão de glicoproteína P (P-gp) num tipo de cancro particular pode ser determinado por um perito na especialidade usando técnicas incluindo mas não limitadas à RT-PCR em tempo real (Szakács et al., 2004; Stein et ai., 2002; Langmann et al.; 2003, Alvarez et al., 1995, Boyd et al., 1995), pela imunoistoquímica (Stein et al., 2002) ou usando microsséries (Lee et al. , 2003), estes métodos são proporcionados apenas como exemplos, outros métodos adequados ocorrerão a um perito na especialidade.

Um perito na especialidade pode ser capaz pela experimentação de rotina determinar a capacidade destes compostos para inibir o crescimento fúngico (por exemplo, Baker, H., et al., 1978; NCCLS Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts: Approved standard M27-A, 17(9), 1997). Adicionalmente, urn perito na especialidade pode ser capaz pela experimentação de rotina determinar a capacidade destes compostos para inibir o crescimento de célula de tumor, (veja-se Dudkin, L., et al. , 2001; Yu et al. , 2001). Num outro aspeto os compostos desta invenção são úteis para induzir a imunossupressão, os ensaios para determinar uma eficácia do composto nestas áreas são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica, por exemplo mas sem limitação: Imunossupressor activity - Warner, L. M., et al., 1992, Kahan et al., (1991) & Kahan & Camardo, 2001); Allografts -Fishbein, T. M., et al. , 2002, Kirchner et al. . 2000; Autoimmune / Inflammatory / Asthma - Carlson, R. P. et al., 1993, Powell, N. et al., 2001; Diabetes I - Rabinovitch, A. et al. , 2002; Psoriasis - Reitamo, S. et al., 2001; Rheumatoid Artritis - Foey, A., et al. , 2002; Fibrosis -Zhu, J. et al. , 1999, Jain, S., et al. , 2001, Gregory et al.. 1993. A capacidade dos derivados de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção para induzir a imunossupressão pode ser demonstrada em testes padrão usados para este propósito. Num outro aspeto os derivados de 39- desmetoxi-rapamicina desta invenção são úteis em relação aos mecanismos antifibróticos, neuro-regenerativos e anti-angiogénicos, um perito na especialidade pode ser capaz pela experimentação de rotina determinar a capacidade destes compostos para prevenir a angiogénese (por exemplo, Guba, M., et al., 2002) . Um perito na especialidade pode ser capaz pela experimentação de rotina determinar a utilidade destes compostos para tratar doença hiperproliferativa vascular, por exemplo em sondas de eluição de medicamento (por exemplo, Morice, M. C., et al. , 2002) . Adicionalmente, um perito na especialidade pode ser capaz pela experimentação de rotina determinar a capacidade neurorregenerativa destes compostos (por exemplo, Myckatyn, T. M., et al. , 2002, Steiner et al. , 1997). A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção, juntamente com um portador farmaceuticamente aceitável. A rapamicina e os compostos relacionados que estão ou estavam em testes clínicos, tais como CCI-779 e RAD001 têm perfis farmacológicos deficientes, solubilidade deficiente em água e biodisponibilidade deficiente. A presente invenção proporciona derivados de 39- desmetoxi-rapamicina que têm propriedades melhoradas tais como estabilidade melhorada e/ou permeabilidade de membrana celular aumentada. Um perito na especialidade será capaz de determinar facilmente a solubilidade de um dado composto da invenção usando métodos padrão. Um método representativo é mostrado nos exemplos no presente documento.

Adicionalmente, um perito na especialidade será capaz de determinar as farmacocinéticas e biodisponibilidade de um composto da invenção usando métodos in vivo e in vitro conhecidos por um perito na especialidade, incluindo mas não limitado àqueles descritos a seguir e nos exemplos, os ensaios alternativos são bem conhecidos por um perito na especialidade incluindo, mas não limitado àqueles descritos a seguir e em Gallant-Haidner et al. , 2000 e Trepanier et ai., 1998 e referências nestes. A biodisponibilidade de um composto é determinada por vários fatores, (por exemplo, solubilidade em água, taxa de absorção no intestino, o grau de ligação e metabolismo de proteína) cada um dos quais pode ser determinado pelos testes in vitro como descritos a seguir, será avaliado por um perito na especialidade que uma melhora num ou mais destes fatores levará a uma melhora na biodisponibilidade de um composto. Alternativamente, a biodisponibilidade de um composto pode ser medida usando métodos in vivo como descritos em mais pormenores a seguir. Ensaio de permeacão de Caco-2

As células Caco-2 confluentes (Li, A. P., 1992; Grass, G. M., et al. , 1992, Volpe, D. A., et al. , 2001) num formato Corning Costar Transwell de 24 poços podem ser usadas, por exemplo, como proporcionadas pela In Vitro Technologies Inc. (IVT Inc., Baltimore, Mariland, EUA) . A câmara apical contém 0,15 ml de solução tampão balanceada de Hank (HBBS) pH 7,4, 1 % de DMSO, 0,1 mM de Amarelo Lúcifer. A câmara basal contém 0,6 ml de HBBS pH 7,4, 1 % de DMSO. Os controlos e testes são depois incubados a 37 °C num incubador umidificado e agitado a 130 rpm por 1 hora. O Amarelo de Lúcifer permeia apenas por intermédio da via paracelular (entre as junções firmes), uma Permeabilidade Aparente (Papp) alta para o Amarelo de Lúcifer indica dano celular durante o ensaio e todos de tais poços foram rejeitados. Propranolol (boa permeação passiva sem nenhum efeito transportador conhecido) & acebutalol (permeação passiva deficiente atenuado pelo efluxo ativo pela P-glicoproteína) são usados como compostos de referência. Os compostos podem ser testados num formato uni e bidirecional pela aplicação de composto às câmaras apical ou basal (a 0,01 mM) . Os compostos nas câmaras apical ou basal são analisados pela HPLC-MS. Os resultados são expressados como Permeabilidade Aparente, Papp, (nm/s) e como a Razão de Fluxo (A para B versus B para A).

Volume de Aceitador: 0,6 ml (A > B) e 0,15 ml (B > A) Área da monocamada: 0,33 cm

Atempo: 60 min

Um valor positivo para a Razão de Fluxo indica efluxo ativo a partir da superfície apical das células.

Ensaio de estabilidade de Microssoma Hepático Humano I (HLM)

Homogenados hepáticos fornecem uma medida de uma vulnerabilidade inerente dos compostos às enzimas de Fase I (oxidativa), incluindo CYP450s (por exemplo, CYP2C8, CYP2D6, CYPlA, CYP3A4, CYP2E1), esterases, amidases e monooxigenases de flavina (FMOs). A meia vida (Tl/2) de compostos de teste podem ser determinadas, na exposição aos Microssomas hepáticos humanos, pela monitoração do seu desaparecimento com o tempo pela LC-MS. Os compostos a 0,001 mM são incubados por 40 min a 37 °C, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4 com fração sub-celular microssómica humana de fígado a 0,25 mg/ml de proteína e níveis de saturação de NADPH como co-fator. Em intervalos de tempo, acetonitrilo é adicionada às amostras de teste para precipitar a proteína e deter o metabolismo. As amostras são centrifugadas e analisadas quanto ao composto precursor pela HPLC-MS.

Ensaios de biodisponibilidade in vivo

Os ensaios in vivo também podem ser usados para medir a biodisponibilidade de um composto (veja-se, por exemplo, Crowe et al., 1999) . No geral, um composto é administrado a um animal de teste (por exemplo, camundongo ou rato) tanto intraperitonealmente (i.p.) ou intravenosamente (i.v.) quanto oralmente (p.o.) e amostras de sangue são tomadas em intervalos regulares para examinar como a concentração de plasma do medicamento varia com o tempo. 0 curso de tempo da concentração plasmática com o tempo pode ser usado para calcular a biodisponibilidade absoluta do composto como uma percentagem usando modelos padrão. Um exemplo de um protocolo típico é descrito a seguir.

Os camundongos são dosados com 3 mg/kg do composto da invenção ou do composto precursor i.v. ou 10 mg/kg de um composto da invenção do composto precursor p.o. As amostras de sangue são tiradas em intervalos de 5 minutos, 15 minutos, 1 h, 4he24hea concentração do composto da invenção ou composto precursor na amostra é determinada por intermédio da HPLC. O curso de tempo de concentrações plasmáticas pode ser depois usado para derivar parâmetros chave tais como a área sob a curva concentração plasmática-tempo (AUC - que é diretamente proporcional à quantidade total de medicamento não mudado que atinge a circulação sistémica), a concentração de medicamento plasmática máxima (pico), o tempo no qual a concentração de medicamento plasmática máxima ocorre (tempo de pico), fatores adicionais que são usados na determinação exata da biodisponibilidade incluem: a meia vida terminal do composto, a depuração do corpo total, volume de estado constante de distribuição e F %. Estes parâmetros são depois analisados pelos métodos não compartimentais ou compartimentais para dar uma biodisponibilidade percentual calculada, para um exemplo deste tipo de método veja-se

Gallant-Haidner et al. , 2000 e Trepanier et al., 1998 e referências nestes.

Os derivados de 39-desmetoxi-rapamicina anteriormente mencionados da invenção ou uma formulação destes podem ser administrados por qualquer método convencional por exemplo mas sem limitação eles podem ser administrados parentérica, oral, topicamente (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica), via um dispositivo médico (por exemplo, uma sonda), pela inalação ou via injeção (subcutânea ou intramuscular). O tratamento pode consistir de uma dose única ou uma pluralidade de doses num período de tempo.

Embora seja possível para um composto da invenção ser administrado em separado, é preferível apresentá-lo como uma formulação farmacêutica, juntamente com um ou mais portadores aceitáveis. 0(s) portador(es) deve(m) ser "aceitável(is)" no sentido de ser(em) compatível(is) com o composto da invenção e não deletério aos seus recetores. Os exemplos de portadores adequados são descritos em mais pormenores a seguir.

Os derivados de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos, a coadministração de dois (ou mais) agentes possibilitam que doses significativamente mais baixa de cada um sejam usadas, reduzindo deste modo os efeitos secundários observados.

Numa forma de realização, um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina é coadministrado com um outro agente terapêutico para a indução ou manutenção da imunossupressão, para o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes ou doenças de inflamação, os agentes preferidos incluem, mas não se limitam a, agentes imunorreguladores por exemplo, azatioprina, corticosteroides, ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, Micofenolato Mofetilo, OKT-3 e ATG.

Numa forma de realização alternativa, um derivado de 39- desmetoxi-rapamicina é coadministrado com um outro agente terapêutico para o tratamento de cancro ou malignidades de célula B, os agentes preferidos incluem, mas não se limitam a, metotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorrelbina, doxorubicina, tamoxifen, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (por exemplo, Herceptin™), capecitabina, cloridreto de raloxifeno, inibidores de EGFR (por exemplo, Iressa®, Tarceva™, Erbitux™), inibidores de VEGF (por exemplo, Avastin™), inibidores de proteassoma (por exemplo, Velcade™), Glivec® ou inibidores de hsp90 (por exemplo, 17-AAG). Adicionalmente, um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina pode ser administrado em combinação com outras terapias incluindo, mas não limitado a, radioterapia ou cirurgia.

Numa forma de realização, um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina é coadministrado com um outro agente terapêutico para o tratamento de doença vascular, os agentes preferidos incluem, mas não se limitam a, inibidores de ACE, antagonistas do recetor de angiotensina II, derivados do ácido fibrico, inibidores da HMGCoA redutase, agentes bloqueadores beta adrenérgicos, bloqueadores do canal de cálcio, antioxidantes, anticoagulantes e inibidores de plaqueta (por exemplo, Plavix™).

Numa forma de realização, um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina é coadministrado com um outro agente terapêutico para a estimulação da regeneração neuronal, os agentes preferidos incluem, mas não se limitam a, fatores neurotróficos por exemplo, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de glial, fator de crescimento derivado de cérebro, fator neurotrófico ciliar e neurotrofina-3.

Numa forma de realização, um derivado de 39-desmetoxi- rapamicina é coadministrado com um outro agente terapêutico para o tratamento de infeções fúngicas; os agentes preferidos incluem, mas não se limitam a, anfotericina B, flucitosina, equinocandinas (por exemplo, caspofungina, anidulafimgina ou micafungina), griseofulvina, um agente antifúngico de imidazol ou um de triazol (por exemplo, clotrimazol, miconazol, cetoconazol, econazol, butoconazol, oxiconazol, terconazol, itraconazol, fluconazol ou voriconazol).

Pela coadministração é incluído qualquer meio de liberar dois ou mais agentes terapêuticos ao paciente como parte do mesmo regime de tratamento, como estará evidente à pessoa habilitada. Embora os dois ou mais agentes possam ser administrados simultaneamente numa única formulação isto não é essencial. Os agentes podem ser administrados em formulações diferentes e em tempos diferentes.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma farmacêutica unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Tais métodos incluem a etapa de levar em associação o ingrediente ativo (composto da invenção) com o portador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. No geral as formulações são preparadas levando-se uniforme e intimamente em associação o ingrediente ativo com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, dar forma ao produto.

Os derivados de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção normalmente serão administrados oralmente ou por qualquer via parentérica, na forma de uma formulação farmacêutica que compreende o ingrediente ativo, opcionalmente na forma de um sal de adição de ácido ou base, orgânico ou inorgânico, não tóxico, numa forma farmacêutica farmaceuticamente aceitável. Dependendo do distúrbio e do paciente a ser tratado, assim como da via de administração, as composições podem ser administradas em doses variáveis.

Por exemplo, os compostos da invenção podem ser administrados oral, bucal ou sublingualmente na forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conter agentes aromatizantes ou corantes, para aplicações de libertação imediata, demorada ou controlada.

As soluções ou suspensões de derivados de 39-desmetoxi- rapamicina adequadas para a administração oral também podem conter excipientes por exemplo, N,N-dimetilacetamida, dispersantes por exemplo, polissorbato 80, tensioativos, e solubilisadores, por exemplo, polietileno glicol, Phosal 50 PG (que consiste de fosfatidilcolina, ácidos graxos de soja, etanol, mono/diglicéridos, propileno glicol e palmitato de ascorbilo) .

Tais comprimidos podem conter excipientes tais como celulose microcristalina, lactose (por exemplo, lactose monoidratada ou lactose anidra), citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantes tais como amido (preferentemente amido de milho, batata ou tapioca), amido glicolato de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos, e aglutinantes de granulação tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxi-propilcelulose (HPC), macrogol 8000, sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, behenato de glicerilo e talco podem ser incluídos.

As composições sólidas de um tipo similar também podem ser utilizadas como cargas em cápsulas de gelatina. Os excipientes preferidos a este respeito incluem lactose, amido, uma celulose, lactose ou polietileno glicóis de peso molecular alto. Para as suspensões aquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem ser combinados com vários agentes adoçantes ou aromatizantes, matéria corante ou pigmentos, com agentes de emulsificação e/ou suspensão e com diluentes tais como água, etanol, propileno glicol e glicerina, e combinações destes.

Um comprimido pode ser fabricado por meio da compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos comprimidos podem ser preparados pela compressão numa máquina adequada do ingrediente ativo numa forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante (por exemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte, conservante, desintegrante (por exemplo, amido glicolato de sódio, povidona reticulada, carboximetil celulose sódica reticulada), agente ativo na superfície ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser fabricados por meio da moldagem numa máquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou marcados e podem ser formulados de modo a proporcionar libertação lenta ou controlada do ingrediente ativo neles usando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para proporcionar o perfil de libertação desejado.

As formulações de acordo com a presente invenção adequadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades separadas tais como cápsulas, comprimidos ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade pré determinada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão num líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsão líquida de água em óleo. 0 ingrediente ativo também pode ser apresentado como um bolo, electuário ou pasta.

As formulações adequadas para a administração tópica na boca incluem comprimidos que compreende o ingrediente ativo numa base aromatizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas que compreende o ingrediente ativo numa base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e enxagúes bucais que compreendem o ingrediente ativo num portador liquido adequado.

Deve ser entendido que além dos ingredientes particularmente mencionados acima as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica considerando-se o tipo da formulação em questão, por exemplo aqueles adequados para a administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

As composições farmacêuticas adaptadas para a administração tópica podem ser formuladas como pomadas, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, géis, curativos impregnados, pulverizações, aerossóis ou óleos, dispositivos transdérmicos, pós de empoamento, e outros. Estas composições podem ser preparadas via métodos convencionais contendo o agente ativo. Assim, estes também podem compreender portadores e aditivos convencionais compatíveis, tais como conservantes, solventes para ajudar na penetração de medicamento, emoliente em cremes ou pomadas e etanol ou álcool oleílico para loções. Tais portadores podem estar presentes como de cerca de 1 % até cerca de 98 % da composição. Mais usualmente estes formarão até cerca de 80 % da composição. Apenas como uma ilustração, um creme ou pomada é preparado misturando-se quantidades suficientes de material hidrofílico e água, contendo de cerca de 5 a 10 % em peso do composto, em quantidades suficientes para produzir um creme ou pomada tendo a consistência desejada.

As composições farmacêuticas adaptadas para a administração transdérmica podem ser apresentadas como sistemas transdérmicos separados intencionados para permanecer em contato íntimo com a epiderme do recetor por um período prolongado de tempo. Por exemplo, o agente ativo pode ser libertado do sistema transdérmico pela iontoforese.

Para aplicações aos tecidos externos, por exemplo à boca e pele, as composições são preferentemente aplicadas como uma pomada ou creme tópicos. Quando formulado numa pomada, o agente ativo podem ser utilizado com uma base de pomada parafínica ou uma miscível em água.

Alternativamente, o agente ativo pode ser formulado num creme com uma base de creme de óleo em água ou uma base de água em óleo.

Para a administração parentérica, as formas farmacêuticas unitária fluida são preparadas utilizando o ingrediente ativo e um veículo estéril, por exemplo mas sem limitação água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, a água sendo preferida. 0 ingrediente ativo, dependendo do veículo e concentração usados, pode ser colocado em suspensão ou dissolvido no veículo. Na preparação de soluções, o ingrediente ativo pode ser dissolvido em água para injeção e esterilizada em filtro antes do enchimento num frasco ou ampola adequados e selagem.

Vantajosamente, agentes tais como anestésicos locais, conservantes e agentes de tamponização podem ser dissolvidos no veículo. Para realçar a estabilidade, a composição pode ser congelada depois de encher no frasco e a água removida sob vácuo. 0 pó liofilizado seco é depois selado no frasco e um frasco associado de água para injeção pode ser proporcionado para reconstituir o líquido antes da utilização.

As suspensões parenterais são preparadas substancialmente da mesma maneira como as soluções, exceto que o ingrediente ativo é colocado em suspensão no veículo ao invés de ser dissolvido e a esterilização não pode ser realizada pela filtração. 0 ingrediente ativo pode ser esterilizado pela exposição ao óxido de etileno antes de colocar em suspensão no veículo estéril. Vantajosamente, um tensioativo ou agente de umectação são incluídos na composição para facilitar a distribuição uniforme do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção também podem ser administrados usando dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa forma de realização, uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica isento de agulha, tal como os dispositivos divulgados no documento US 5.399.163; documento US 5.383.851; documento US 5.312.335; documento US 5.064.413; documento US 4.941.880; documento US 4.790.824; ou documento US 4.596.556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: o documento US 4.487.603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação a uma taxa controlada; o documento US 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; o documento US 4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para liberar medicação a uma taxa de infusão precisa; o documento US 4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a libertação de medicamento contínua; o documento US 4.439.196, que divulga um sistema de libertação de medicamento osmótico tendo compartimentos de câmara múltipla; e o documento US 4.475.196, que divulga um sistema de libertação de medicamento osmótico. Numa forma de realização específica o derivado de 39-desmetoxi-rapamicina pode ser administrado usando uma sonda de eluição de medicamento, por exemplo que corresponda àquela descrita no documento WO 01/87263 e publicações relacionadas ou aquela descrita por Perin (Perin, EC, 2005). Muitos outros de tais implantes, sistemas de libertação, e módulos são conhecidos pelos peritos na especialidade. A dosagem a ser administrada de um derivado de 39-desmetoxi-rapamicina da invenção variará de acordo com o composto particular, as doenças envolvidas, o paciente, e a natureza e severidade da doença e a condição física do paciente, e a via selecionada de administração. A dosagem apropriada pode ser facilmente determinada por um perito na especialidade.

As composições podem conter de 0,1 % em peso, preferentemente de 5 a 60 %, mais preferentemente de 10 a 30 % em peso, de um composto da invenção, dependendo do método de administração.

Será reconhecido por um perito na especialidade que a quantidade ótima e o espaçamento de dosagens individuais de um composto da invenção serão determinados pela natureza e extensão da condição que é tratada, da forma, via e local de administração, e da idade e condição do paciente particular que é tratado, e que um médico por fim determinará as dosagens apropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida tão frequentemente quanto for apropriado. Se efeitos secundários se desenvolvem a quantidade e/ou frequência da dosagem podem ser alteradas ou reduzidas, de acordo com a prática clínica normal.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: mostra a estrutura da rapamicina

Figura 2: mostra a via da fragmentação para a 39- desmetoxi-rapamicina

Figura 3: mostra a via da fragmentação para a 39- desmetoxi-40-O-[2,2— bis(hidroximetil)propionil]rapamicina.

Figura 4: mostra a via da fragmentação para 39-desmetoxi- 40-0-[2-hidroxietil 3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato] rapamicina

Figura 5: mostra a via da fragmentação para 27-O-desmetil- 39-desmetoxi-40-0-[2,2— bis(hidroximetil)propionil] rapamicina

Figura 6: mostra a atividade inibidora de mTOR da 39- desmetoxi-40-O-[2,2-

bis(hidroximetil)propionil]rapamicina (A triângulos cheios) e 39-desmetoxi-40-0-(2-hidroxi)etil rapamicina (B - triângulos cheios) comparadas com a rapamicina (quadrados cheios).

EXEMPLOS Métodos Gerais e Materiais

Materiais

Todos os reagentes foram obtidos a partir de fontes comerciais, e usados sem outra purificação a não ser que de outro modo estabelecido.

Cultura S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] (documento WO 04/007709; Gregory et al. , 2004) foi mantido em placas de ágar com meio 1 (veja-se a seguir) a 28 °C. Os estoques de esporo foram preparados depois do cultivo em meio 1, preservados em 20 % p/v de glicerol: 10 % p/v de lactose em água destilada e armazenados a -80 °C. As culturas vegetativas foram preparadas pela inoculação de 0,1 ml de estoque congelado em 50 ml de meio 2 (veja-se a seguir) em frasco de 250 ml. A cultura foi incubada por 36 a 48 horas a 28 °C, 300 rpm. Método de Produção:

As culturas vegetativas foram inoculadas de 2,5 a 5 % v/v em meio 3. O cultivo foi realizado por 6 a 7 dias, 26 °C, 300 rpm.

Procedimento de alimentação: A alimentação/adição do ácido carboxilico selecionado foi realizada 24 a 48 horas depois da inoculação e foi alimentado de 1 a 2 mM a não ser que de outro modo estabelecido.

Os meios foram depois esterilizados por meio da autoclavagem a 121 °C, 20 min.

Os meios foram depois esterilizados por meio da autoclavagem a 121 °C, 20 min.

Depois da esterilização 0,16 ml de glicose a 40 % é adicionado a cada 7 ml de meios.

0 pH é corrigido para 6,0 com NaOH 1 M

Antes da esterilização 0,4 ml de α-amilase Sigma (BAN 250) foi adicionada a 1 L de meio. O meio foi esterilizado durante 20 min a 121 °C.

Depois da esterilização 0,35 ml de frutose a 40 % estéril e 0,10 ml de L-lisina (140 mg/ml em água, esterilizada em filtro) foi adicionada a cada 7 ml.

Os meios foram depois esterilizados por meio da autoclavagem a 121 °C, 20 min.

0 meio foi esterilizado por 30 min a 121 °C.

Depois da esterilização 15 g de Frutose por L foram adicionados. Depois de 48 h 0,5 g/L de L-lisina foi adicionado.

Métodos Analíticos Método A

Volume de injeção: 0,005 a 0,1 ml (como requerido dependendo da sensibilidade). A HPLC foi realizada em cartuchos "Spherisorb" "Resolução Rápida" SB C8 da Agilent, 3 micrones, 30 mm x 2,1 mm, conduzindo uma fase móvel de: Fase móvel A: 0,01 % de Ácido fórmico em água pura

Fase móvel B: 0,01 % de Ácido fórmico em Acetonitrilo

Vazão: 1 ml/minuto. O gradiente linear foi usado, de 5 % de B a 0 min a 95 % de B a 2,5 min mantendo a 95 % de B até 4 min retomando a 5 % de B até o ciclo seguinte. A deteção foi pela absorvância em UV a 254 nm e/ou por meio da ionização de

eletropulverização da espetrometria de massa (positivo ou negativo) usando um instrumento Micromass Quattro- Micro. Método B

Volume de injeção: 0,02 ml. A HPLC foi realizada em coluna BDS C18 Hypersil de 3 micrones (ThermoHypersil-Keystone Ltd), 150 x 4,6 mm, mantida a 50 °C, conduzindo uma fase móvel de:

Um gradiente linear de 55 % de B a 95 % de B foi usado em 10 minutos, seguido por 2 minutos a 95 % de B, 0,5 minuto a 55 % de B e um adicional de 2,5 minutos a 55 % de B. A deteção de composto foi por meio da absorvância em UV a 280 nm.

Método C O sistema de HPLC compreendeu um Agilent HP1100 e foi realizado em coluna BDS C18 Hypersil de 3 micrones (ThermoHypersil- Keystone Ltd), 150 x 4,6 mm, mantido a 40 °C, conduzindo uma fase móvel de:

O sistema foi ligado a um espetrómetro de massa de eletropulverização Bruker Daltonics Esquire3000. A mudança de positive negativo foi usada numa série de varrimento de 500 a 1000 Dalton. Um gradiente linear de 55 % de B a 95 % de B foi usado em 10 minutos, seguido por 2 minutos a 95 % de B, 0,5 minutos a 55 % de B e um adicional de 2,5 minutos a 55 % de B. Métodos Sintéticos

Todas as reações foram realizadas sob condições anidras a não ser que de outro modo estabelecido usando solventes secos comercialmente disponíveis. As reações foram monitorizadas pela LC-UV-MS, numa HPLC Agilent 1100 ligada a um espetrómetro de massa Bruker Dattonics Esquire3000+ equipado com uma fonte de eletropulverização. A separação foi obtida numa coluna Phenomenex Hyperclone, BDS Qg 3 p (150 x 4,6 mm) a 1 ml/min, com um gradiente linear de água: acetonitrilo v:v 30:70 a 100 % de acetonitrilo em 10 min seguida por um período isocrático de 5 min a 100 % de acetonitrilo.

Os espetros de RMN foram registrados em CDCI3 e as mudanças químicas δΗ e õc são aludidas ao solvente (7,26 ppm e 77,0 ppm respetivamente) . Visto que a 39-desmetoxi-rapamicina e seus derivados existem como urna mistura de confórmeros todas as designações correspondem apenas ao confórmero principal.

Bioensaio in vitro quanto a atividade anticancro A avaliação in vitro de compostos quanto a atividade anticancro num painel de 12 linhas de células de tumor humano num ensaio de proliferação de monocamada foi realizado na Oncotest Testing Facility, Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg. As caraterísticas das 12 linhas de células selecionadas estão resumidas no Quadro 1.

As linhas de células da Oncotest foram estabelecidas a partir de xenoenxertos de tumor humano como descrito por Roth et al. 1999. A origem dos xenoenxertos de dador foi descrita por Fiebig et al. 1999. Outras linhas de célula foram obtidas da NCI (H460, SF-268, OVCAR-3, DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-468) ou adquiridas da DSMZ, Braunschweig,

Alemanha (LNCAP).

Todas as linhas de células, a não ser que de outro modo especificado, são cultivadas a 37 °C num atmosfera umidifiçada (95 % de ar, 5 % de CO2) num meio de 'mistura pronta' contendo meio RPMI 1640, 10 % de soro de bezerro fetal, e 0,1 mg/ml de gentamicina (PAA, Coibe, Alemanha). Ensaio de Monocamada - descrição resumida do protocolo 1:

Um ensaio de iodeto de propídio modificado foi usado para avaliar os efeitos do(s) composto(s) de teste sobre o crescimento de doze linhas de célula de tumor humano (Dengler et al., (1995)).

Em resumo, as células foram colhidas a partir de culturas de fase exponenciais pela tripsinização, contadas e plaqueadas em placas de microtítulo de fundo chato de 96 poços a uma densidade de célula dependente da linha de célula (5 a 10.000 células viáveis/poço). Depois de 24 h de recuperação para permitir que as células reassumam o crescimento exponencial, 0,01 ml de meio de cultura (6 poços de controlo por placa) ou meio de cultura contendo macbecin são adicionados aos poços. Cada concentração é plaqueada em triplicata. Os compostos são aplicados em duas concentrações (0,001 μΜ e 0,01 μΜ) . A seguir de 4 dias de exposição continua, o meio de cultura de célula com ou sem composto de teste é substituído por 0,2 ml de uma solução de iodeto de propídio aquosa (PI) (7 mg/L). Para medir a proporção de células vivas, as células são permeabilizadas pelo congelamento das placas. Depois de descongelar as placas, a fluorescência é medida usando a leitora de placa Cytofluor 4000 (excitação 530 nm, emissão 620 nm) , dando uma relação direta ao número total de células viáveis. A inibição do crescimento é expressada como tratado/controlo x 100 (% T/C). Para os compostos ativos, os valores de IC5o & IC7o foram estimados pela representação gráfica da concentração de composto versus a viabilidade da célula.

Exemplo 1. Fermentação e isolação de 39-desmetoxi-rapamlclna A 39-desmetoxi-rapamicina foi produzida pelo cultivo de culturas de S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] e alimentando com ácido cicloexanocarboxílico (CHCA) como descrito a seguir.

Cultura Líquida

Uma cultura vegetativa de S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] foi cultivada como descrito em Materiais & Métodos. As culturas de produção foram inoculadas com a cultura vegetativa a 0,5 ml em 7 ml de meio 3 em tubos de 50 ml. O cultivo foi realizado por 7 dias, 26 °C, 300 rpm. Amostras de um mililitro foram extraídas em acetonitrilo 1:1 com agitação por 30 min, centrifugadas 10 min, 13.000 rpm e analisadas e quantificadas de acordo com o método de análise B (veja-se Materiais & Métodos). A confirmação do produto foi determinada pela espetrometria de massa usando o Método de análise C (veja-se Materiais & Métodos). 0 análogo de rapamicina observado foi proposto ser a 39-desmetoxi-rapamicina desejada com base nos dados analíticos debatido sob a caraterização a seguir. Fermentação

Uma cultura vegetativa primária em Meio 4 de S. hygroscopicus MG2-10 [IJMNOQLhis] foi cultivada essencialmente como descrito em Materiais & Métodos. Uma cultura vegetativa secundária em Meio 4 foi inoculada a 10 % v/v, 28 °C, 250 rpm, por 24 horas. As culturas vegetativas foram inoculadas a 5 % v/v em meio 5 (veja-se Materiais & Métodos) num fermentador de 20 L. O cultivo foi realizado por 6 dias a 26 °C, 0,5 vvm. > 30 % de oxigénio dissolvido foram mantidos pela alteração da velocidade da ponta giratória, velocidade da ponta mínima de 1,18 ms"1 velocidade da ponta máxima de 2,75 ms-1. A alimentação do ácido cicloexanocarboxílico foi realizada em 24 e 48 horas depois da inoculação para dar uma concentração final de 2 mM.

Extração e Purificação O caldo de fermentação (30 L) foi agitado com um volume igual de metanol por 2 horas e depois centrifugado para formar um pellet a partir das células (10 min, 3500 rpm) . O sobrenadante foi agitado com resina Diaion® HP20 (43 g/L) por 1 hora e depois filtrados. A resina foi lavada por batelada com acetona para retirar o análogo de rapamicina e o solvente foi removido a vácuo. O concentrado aquoso foi depois diluído a 2 L com água e extraído com acetato de etilo (3 x 2 L). O solvente foi removido a vácuo para dar um óleo castanho (20,5 g). O extrato foi dissolvido em acetona, seco em sílica, aplicado a uma coluna de sílica (6 x 6,5 cm de diâmetro) e eluído com um gradiente escalonado de acetona/hexano (20 % a 40 %). As frações contendo o análogo de rapamicina foram reunidas e o solvente removido a vácuo. 0 resíduo (2,6 g) foi ainda submetido à cromatografia (em três lotes) em Sephadex LH2O, eluindo com 10:10:1 clorofórmio/heptano/ etanol. O análogo de rapamicina semipurifiçado (1,7 g) foi purificado pela HPLC preparativa de fase reversa (C18) usando um Gilson HPLC, eluindo numa coluna Phenomenex 21,2 x 250 mm Luna 5 ym Cig BDS com 21 ml/min de 65 % de acetonitrilo/água. As frações mais puras (identificadas pela HPLC analítica, Método B) foram combinadas e o solvente removido a vácuo para dar a 39-desmetoxi-rapamicina (563 mg).

Caraterização O espetro de *H RMN da 39-desmetoxi-rapamicina foi equivalente àquele de um padrão (P. Lowden, Ph. D. Dissertation, University of Cambridge, 1997). 13C-RMN (125 MHz), 5C (ppm): 215,75, 208,27, 169,19, 166,71, 140,13, 135,94, 133,61, 130,10, 129,62, 126,80, 126,33, 98,42, 84,77, 84,37, 75,85, 70,91, 67,10, 59,44, 55,82, 51,21, 46,50, 44,17, 41,39, 40,70, 40,16, 38,74, 38,37, 35,44, 35,26, 35,08, 33,78, 33,64, 33,04, 32,37, 31,22, 30,41, 27,24, 27,02, 25,27, 21,48, 20,58, 16,24, 15,95, 15,78, 13,74, 13,00, 10,12.

As análises de LCMS e LCMSn de extratos de cultura mostraram que a razão m/z para o novo análogo de rapamicina é 30 unidades de massa atómica mais baixo do que para a rapamicina, compatível com a ausência de um grupo metoxi. Iões observados: [M-H]“ 882,3, [M+NH4]+ 901,4, [M+Na]+ 906,2, [M+K]+ 922,2. A fragmentação do aduto de sódio deu os iões prognosticados para 39desmetoxi-rapamicina seguindo um via de fragmentação anteriormente identificado (Figura 2) (J. A. Reather, Ph. D. Dissertation, University of

Cambridge, 2000). Estes dados de fragmentação pela espetrometria de massa estreita a região dos novos análogos de rapamicina onde a perda de um metoxi ocorreu para o fragmento C28-C42 que contém a fração cicloexilo. Estes dados de fragmentação da espetroscopia de massa são totalmente compatíveis com a 39-desmetoxi- rapamicina. Exemplo 2: 39-desmetoxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)propionil]-rapamicina 39-Desmetoxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil] rapamicina foi sintetizada a partir da 39-desmetoxi-rapamicina de acordo com o seguinte procedimento. 2.1 Síntese de 39-desmetoxi-28-0-trimetilasilil rapamicina 39-Desmetoxi-rapamicina (170 mg, 0,17 mmol) e imidazol (51 mg, 0,75 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de acetato de etilo a 0 °C. A esta solução fria clorotrimetilsilano (77 mg, 0,09 ml, 0,71 mmol) foi adicionado gota a gota num período de 10 min. A agitação foi continuada por mais 60 minutos para completar a formação do éter 28,39-bis-O-trimetilsilílico. Depois deste período 0,4 ml de ácido sulfúrico 0,5 N aquoso foi adicionado e a mistura foi agitada durante 2,5 h a 0 °C. 20 ml de acetato de etilo foram adicionados e a camada orgânica foi lavada com salmoura, solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio e água. A secagem em sulfato de sódio e a concentração sob pressão reduzida produziu o éter 28-O-trimetilsililo como um sólido incolor que foi usado sem outra purificação para a reação subsequente. 1H-RMN (400 MHz, CDC13) , δ (ppm): 4,07 (d, 1H, J = 6,5 Hz, C (28)-H), 0,00 (s, 9H, 28-O-TMS) . MS (ESI) m/z 978 [M+Na] + 2.2. Síntese de anidrido 2,4,6-triclorobenzoico 2',2',5'-trimetil-1',3'-dioxano- 5' carboxilico 2,2-Dimetoxipropano (13,5 g, 130 mmol) e ácido p-toluenossulfónico monoidratado (100 mg, 0,53 mmol, 0,4 % em mol) foram adicionados a uma solução de ácido 2,2-bis (hidroximetil)-propiónico (13,5 g, 100 mmol) em acetona (100 ml) . A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 2 h. Depois deste período hidrogeno carbonato de sódio húmido foi adicionado e a mistura foi agitada por mais 5 minutos. O sobrenadante foi separado por decantação e concentrado sob pressão reduzida. 0 sólido resultante foi tratado com éter dietilico (3 x 50 ml) e os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida para produzir um sólido branco, 16,2 g (93 %) 1H-RMN (400 MHz, CDC13) , δ (ppm): 4,19 (d, 1H, J = 12,0

Hz) 3,68 (d, 1H, J = 12,0 Hz) 1,45 (s, 1H) 1,41 (s, 1H) 1,20 (s, 1H).

Este material foi depois convertido num anidrido misturado ativado pelo método do documento US 5.362.718. Assim, a acetonida (1,04 g, 5,98 mmol) foi dissolvida em THF (20 ml) arrefecida a 0 °C e tratada com a adição gota a gota de trietilamina (0,83 ml, 5,98 mmol) e cloreto de 2,4,6- triclorobenzoilo (0,93 ml, 5,98 mmol). A reação foi depois agitada na temperatura ambiente durante 5 horas. O precipitado resultante foi filtrado e lavado com THF (10 ml) . O filtrado combinado foi reduzido a vácuo até um sólido amorfo branco que foi usado (como a seguir) sem outra purificação. 2.3. Sintese do éter 28-O-trimetilasililico de 39-desmetoxi-rapamicina, 40- éster com o ácido 2,2,5- trimetil[1,3-dioxano]-5-carboxilico A 28-0-trimetilasilil-39-desmetoxi-rapamicina bruta (200 mg, a partir de 0,17 mmol de 39-desmetoxi-rapamicina) do exemplo 2.1 foi dissolvida em 2 ml de diclorometano. A solução foi arrefecida a 0 °C e DMAP (102 mg, 0,84 mmol) foi adicionado. Depois, uma solução de anidrido 2,4,6-triclorobenzoico 2', 2',5'-trimetil-1',3'-dioxano-5' carboxilico (159 mg, 0,42 mmol) em 1 ml de diclorometano foi adicionada num período de 10 min. A mistura de reação foi agitada a 0 °C durante 5 h e a conversão foi monitorizada pela LC/MS. A mistura de reação foi diluída com 7 ml de diclorometano e extinta pela adição de 5 ml de água. A camada orgânica foi separada e lavada sucessivamente com ácido sulfúrico 0,5 N, solução de hidrogeno carbonato de sódio e água. A secagem em sulfato de sódio e a concentração sob pressão reduzida deram o composto do titulo como espuma incolor, que foi usada imediatamente sem outra purificação. MS (ESI) m/z 1111 [M- ΗΓ 2.4. 39-desmetoxi-40-O-[2,2- bis (hidroximetil)propionil]rapamicina 0 éter 39-desmetoxi-rapamicina-28-0-trimetilasilílico 40-éster com o ácido 2,2,5-trimetil[1,3-dioxano]-5-carboxílico bruto do exemplo 2.3 foi dissolvido em 2 ml de acetona e 0,5 ml de ácido sulfúrico 0,5 N foi adicionado. A mistura de reação foi agitada durante 5 h na temperatura ambiente e subsequentemente neutralizada pela adição de 5 ml de solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio e 5 ml de água. A mistura aquosa foi extraida com acetato de etilo e os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio. A concentração sob pressão reduzida deu um sólido incolor que foi purificado pela cromatografia de exclusão molecular em Sephadex LH20 usando clorofórmio/heptano/etanol (v:v:v 10:10:1) como eluentes. 1H-RMN (500 MHz, CDC13) , δ (ppm): 4,72 (m, 1H, C(40)-H), 3,87 (m, 2H) , 3,69 (m, 2H) , 1,03 (s, 3H) ; 13C-RMN (125 MHz, CDCI3) , δ (ppm): 175,52, 74, 04 (C(40) ) , 68,73 (2C) , 48, 90, 17,09. MS (ESI) m/z 1023 [M+Na]+

Exemplo 3: 39-desmetoxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina 3.1. Triflato de 2-(terc-butildimetilsilil)oxietilo

Uma solução de 2-(terc-butildimetilsilil)-etileno glicol (125 mg, 0,71 mmol) e 2,6-lutideno (0,08 ml, 0,69 mmol) em 6 ml de diclorometano foi arrefecida a -78 °C.

Anidrido trifluorometanossulfónico (0,11 ml, 0,65 mmol) foi adicionado num período de 5 min e a agitação foi continuada durante mais 15 min a -78 °C para completar a formação do triflato. O triflato foi usado in situ para a reação como descrito em 3.2 a seguir. 3.2. 40-0- (2- (terc-butildimetilsilil)]etil-39-desmetoxi-rapamicina 39-Desmetoxi-rapamicina (300 mg, 0,34 mmol) e 2,6-di-terc- butilpiridina (1,5 ml, 6,68 mmol) foram tratados com triflato de 2-(terc- butildimetilsilil)oxietilo (0,65 mmol em 6 ml de diclorometano) na temperatura ambiente. Esta solução foi concentrada até um terço do seu volume original com uma corrente suave de nitrogénio e a suspensão resultante foi agitada por mais 72 h na temperatura ambiente. Depois deste período, solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio (5 ml) e água (5 ml) foram adicionados e a mistura foi agitada durante 30 min. A camada orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída com acetato de etilo (2x5 ml). Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida para dar um óleo incolor. A purificação pela cromatografia de coluna em sílica usando um gradiente de hexano para hexano/acetona (v:v 1:1) deu o produto como um sólido incolor. 1H-RMN (500 MHz, CDC13) , δ (ppm): 4,16 (d, 1H, J = 6,5 Hz, C (2 8) -H) , 3,73 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 3,52 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 0,89 (s, 9H) , 0,06 (s, 6H) ; 13C-RMN (125 MHz, CDC13) , δ (ppm): 76,61 (C-40), 69,31 (CH2) , 63,03 (CH2) , 25, 92 (3C), 18,36, -5,23 (2C) . MS (ESI) m/z 1065 [M+Na]+ 3.3. 39-Desmetoxi-40~O-(2-hidroxi)etil rapamicina

Uma solução de 40-0-[2-(terc-butildimetilsilil)]etil-39- desmetoxi rapamicina (160 mg, 0,15 mmol) em 2 ml de acetona foi tratada com 0,3 ml de ácido sulfúrico 0,5 N na temperatura ambiente. A solução foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 3 h e foi subsequentemente extinta pela adição de 5 ml de solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio e 10 ml de água. A mistura aquosa foi extraída com acetato de etilo (3 x 10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio. A concentração sob pressão reduzida deu um sólido incolor que foi ainda purificado pela HPLC (água/acetonitrilo v:v 20/80). 1H-RMN (500 MHz, CDC13) , δ (ppm): 4,16 (d, 1H, J = 6 Hz),

3,70 (m, 2H) , 3,57 (m, 2H) , 3,20 (m, 1H, C(40)-H); 13C-RMN (125 MHz, CDCI3) , δ (ppm): 78, 65 (C-40), 77,20 (C-28), 68, 93 (CH20) , 62,10 (CH20) . MS (ESI) m/z 951 [M+Na]+

Exemplo 4 39-desmetoxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)propionil]- rapamlclna através da esterificação catalisada pela lipase de 39- desmetoxi-rapamicina

Uma mistura de 39-desmetoxi-rapamicina (720 mg, 0,82 mmol), 2,2,5-trimetil[1,3-dioxano]-5-carboxilato de vinilo

(244 mg, 1,22 mmol), lipase PS-C "Amano" II (720 mg) e peneiras moleculares 0,5 nm (250 mg) em éter terc-Butil metilico anidro (3,5 ml) foi aquecido a 43 °C sob uma atmosfera de árgon. Depois de 48 h, o monitoramento pela LC/MS mostrou a conversão completa do material de partida. THF (10 ml) foi adicionado e a mistura foi filtrada através de uma almofada de celite. A enzima foi lavada com THF (2x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em THF (50 ml) e H2S04 (15 ml, 0,5 N) foi adicionado. A solução foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 5 h e a reação foi subsequentemente extinta pela adição de NaHCCq (50 ml, 5 %) e salmoura (50 ml). A mistura aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 100 ml) e os extratos orgânicos combinados foram secos em MgSCq. A remoção dos solventes deu o produto como semissólido. A purificação pela cromatografia cintilante (hexano/acetona 1:1) deu o produto como um sólido incolor.

Os dados de RMN são idênticos como aqueles do exemplo 2.4 MS (ESI) m/z 1022 [M+Na]+ A fragmentação do aduto de sódio deu iões a m/z 850, 728, 693, 614, 560, 545, 441 e 431 de acordo com o padrão de fragmentação mostrado na Figura 3. Exemplo 5 39-Desmetoxi-40-O-[2-hidroxietil 3-hidroxi-2- (hidroximetil) - 2-metilpropanoato] rapamicina

Uma mistura de 39-Desmetoxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina (40 mg, 0,04 mmol), 2,2,5-trimetil[1,3-dioxano]-5-carboxilato de vinilo (25 mg, 0,13 mmol), lipase PS-C "Amano" II (40 mg) e peneira molecular 0,5 nm (40 mg) em éter terc-Butil metilico anidro (2 ml) foi aquecida a 43 °C sob uma atmosfera de árgon. Depois de 72 h o monitoramento pela LC/MS mostrou a conversão completa do material de partida. THF (10 ml) foi adicionado e a mistura foi filtrada através de uma almofada de celite. A enzima foi lavada com THF (2x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em acetona (7,5 ml) e H2SO4 (2,5 ml, 0,5 N) foi adicionado. A solução foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 2 h e a reação subsequentemente extinta pela adição de NaHCCb sat. (10 ml) e água (10 ml) . A mistura aquosa foi extraída com EtOAc (3x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram secos em MgSCq. A remoção dos solventes deu o produto como sólido amarelado. A purificação pela HPLC preparativa numa coluna Phenomenex 21,2 x 50 mm Luna 5 ym C18 BDS usando um gradiente de 70:30 MeCN/água a 100 % de MeCN em 15 min deu o produto como um sólido incolor. MS (ESI) m/z 1067 [M+Na]+ A fragmentação do aduto de sódio deu iões a m/z 894, 772, 738, 614, 604, 589, 475 e 441 de acordo com o padrão de fragmentação mostrado na Figura 4. Exemplo 6 27-O-desmetil-39-desmetoxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)- propionil] rapamicina 6.1. 27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 40-éster com ácido 2,2,5- trimetil [1,3-dioxano]-5-carboxilico

Uma mistura de 27-Odesmetil-39-desmetoxi rapamicina (30 mg, 0,034 mmol), 2,2,5- trimetil[1,3-dioxano]-5-

carboxilato de vinilo (34 mg, 0,17 mmol), lipase PS-C "Amano" II (30 mg) e peneira molecular 0,5 nm (30 mg) em éter terc-Butil metílico anidro (2 ml) foi aquecido a 43 °C sob uma atmosfera de árgon durante 72 h. THF (10 ml) foi adicionado e a mistura foi filtrada através de uma almofada de celite. A enzima foi lavada com THF (2 x 10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida para dar um semissólido amarelado. A purificação pela cromatografia cintilante usando hexano: acetona (v:v 2:1) deu o produto como um sólido amarelo claro. MS (ESI) m/z 1049 [M+Na]+ 6.2 27-O-desmetil-39-desmetoxi-40-O-[2,2-bis (hidroximetil)propionil]- rapamicina O material de 6.1 foi dissolvido em acetona (6 ml) e H2S04 (2 ml, 0,5 N) foi adicionado. A solução foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 2 h e a reação subsequentemente extinta pela adição de NaHCCp sat. (10 ml) e água (10 ml) . A mistura aquosa foi extraída com EtOAc (3x10 ml) e os extratos orgânicos combinados foram secos em MgSCq. A remoção de solventes deu o produto como sólido amarelado. A purificação pela HPLC preparativa numa coluna Phenomenex 21,2 x 50 mm Lima 5 ym C18 BDS usando um gradiente de 70:30 MeCN/água a 100 % de MeCN em 15 min deu o produto como um sólido incolor. MS (ESI) m/z 1009 [M+Na]+ A fragmentação do aduto de sódio deu iões a m/z 836, 679, 600, 560, 531, 431, 427 de acordo com o padrão de fragmentação mostrado na Figura 5 ΧΗ RMN (500 MHz, CDC13) δ ppm 4,73 (m, 1 H, C(40)-H), 4,32 (d, J = 4,5 Hz, 1C (27) -H) , 4,19 (d, J = 4,5 Hz, 1 H, C(28)-H), 3,89 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H) 1,03 (s, 3 H) .

Exemplo 7. Avaliação in vitro da atividade anticancro de 39-desmetoxi- 40-0-(2-hidroxi)etil rapamicina e 39-desmetoxi-40-O-[2,2-bis(hidroxi- metil)propionil] rapamicina A avaliação in vitro de 39-desmetoxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina e 39-desmetoxi-40-O-[2,2-bis (hidroximetil)propionil]-rapamicina quanto a atividade anticâncer num painel de 12 linhas de célula de tumor humanas num ensaio de proliferação em monocamada foi realizado como descrito como Protocolo 1 nos métodos gerais acima usando um ensaio de iodeto de propídio modificado.

Os resultados são demonstrados no Quadro 3 a seguir; cada resultado representa a média de experiências em duplicata. 0 Quadro 4 mostra a IC50 e IC70 médias para os compostos através das linhas de célula testadas, com rapamicina mostrada como uma referência.

Exemplo 8. Ensaios de ligação in vitro FKBP12 FKBP12 reversivelmente desdobra no desnaturante químico de cloridrato de guanidínio (GdnHCl) e a desdobra pode ser monitorizada pela mudança na fluorescência intrínseca da proteína (Main et al., 1998). Ligandos que especificamente ligam e estabilizam o estado nativo de FKBP12 mudam a curva de desnaturação tal que a proteína desdobra nas concentrações mais altas e desnaturante químico (Main et al. , 1999) . A partir da diferença na estabilidade, a constante de ligando-ligação pode ser determinada usando a equação 1.

(1) onde Δ Gapp é a diferença aparente na energia livre da desdobra entre as formas livre e ligada a ligando, é a energia livre de desdobra em água da proteína livre, [L] a concentração de ligando e Kd a constante de dissociação para o complexo de proteína-ligando (Meiering et al., 1992) . A energia livre da desdobra pode estar relacionada com o ponto intermediário da transição de desdobra usando a seguinte equação:

(2) onde mD-N é uma constante para uma dada proteína e dado desnaturante e que é proporcional à mudança no grau de exposição de resíduos ma desdobra (Tanford 1968 e Tanford 1970), e [D] 50% é a concentração de desnaturante que corresponde ao ponto central de desdobra. Foi definido a diferença na estabilidade de FKBP12 com rapamicina e ligando desconhecido (na mesma concentração de ligando), como:

(3) onde < mD-N > é o valor m médio da transição de desdobra e Δ[D] 50% a diferença nos pontos centrais para a transição de desdobra de rapamicina-FKBPl2 e transição de desdobra do complexo de ligando desconhecido-FKBPl2. Sob condições onde [L] > Kd, então, AAGd-w, pode ser relacionado com Kd s relativos dos dois compostos através da equação 4:

(4) onde à é a constante de dissociação para a rapamicina e “v é a constante de dissociação para o ligando desconhecido X. Portanto,

(5)

Ajustando cada curva de desnaturação gera valores para mD_N e [D] 50 %, que podem ser usados para calcular um valor m medio, < mD-N >, e A[D]50%, e por este motivo . O valor

Ky? de literatura de « de 0,2 nM é usado.

Em alguns casos, devido à solubilidade baixa do composto de teste, concentrações mais baixas do composto de teste foram usadas do que na experiência de controlo da rapamicina. Nestes casos, as diferenças entre a concentração do composto de teste e a concentração de controlo de rapamicina foram levados em conta usando a equação 6 a seguir:

{6}

Quadro 5 - Resultados de ensaio de ligação in vitro de FKBP-12

itiTOR A inibição de mTOR foi estabelecida indiretamente por intermédio da medição do nivel de fosforilação dos marcadores substitutos da via mTOR e p70S6 quinase e S6 (Brunn et al. , 1997; Mothe-Satney et al. , 2000; Tee e

Proud, 2002; Huang e Houghton, 2002).

As células HEK293 foram co-transfectadas com mTOR marcado com FLAG e Raptor marcado com myc, cultivado durante 24 h depois de privadas de soro durante a noite. As células foram estimuladas com 100 nM de insulina depois colhidas e lisadas durante 3 ciclos de congelamento/ descongelamento. Os lisados foram reunidos e quantidades iguais foram imunoprecipitadas com anticorpo FLAG no lugar do complexo mTOR/Raptor. Os imunoprecipitados foram processados: as amostras tratadas com composto (0,00001 a 0,003 mM) foram pré-incubadas durante 30 min a 30 °C com FKBP12/rapamicina, FKBP12/derivado de 39-desmetoxi- rapamicina ou veiculo (DMSO), as amostras não tratadas foram incubadas em tampão de quinase. Os imunoprecipitados foram depois submetidos ao ensaio de quinase in vitro na presença de 3 mM de ATP, 10 mM de Mn2+ e GST4E-BP1 como substrato. As reações foram interrompidas com tampão de amostra 4x depois submetidas a 15 % de SDS-PAGE, transferidas úmidas para membrana de PVDF depois sondadas quanto a fosfo-4E-BPl (T37/46) . As bandas de Western blot foram quantificadas pela análise de imagem usando Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/). A Figura 6A mostra curvas de dose-resposta para a rapamicina (quadrados cheios) e 39-desmetoxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)propionil]rapamicina (triângulos cheios). A Figura 6B mostra curvas de dose-resposta para a rapamicina (quadrados cheios) e 39-desmetoxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina (triângulos cheios).

Alternativamente, as células HEK293 foram semeadas em placas de 6 poços e pré incubadas durante 24 h e depois privadas de soro durante a noite. As células foram pré-tratadas com veiculo ou composto durante 30 min a 30 °C,

depois estimuladas com 100 nM de insulina durante 30 min a 30 °C e lisadas durante 3 ciclos de congelamento/descongelamento e ensaiadas quanto a concentração de proteína. Quantidades iguais de proteína foram carregadas e separadas nos géis de SDS-PAGE. A proteína foi transferida húmida para membrana de PVDF depois sondada quanto a fosfo-S6 (S235/36) ou fosfo-p70 S6K (T389). As bandas de Western blot foram quantificadas pela análise de imagem usando Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/).

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

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Claims (52)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de acordo com a Fórmula (I) a seguir apresentada:

   em que: X representa uma ligação ou CH2; Ri representa um grupo ceto ou (H,H); R2 representa OH ou OMe; R3 representa H, OH ou OMe; R4 e R5 representam, cada um, independentemente H ou OH; Re representa -R7, -C(0)R7, - (CH2) 2-0- [CR21R22-O] a-C (0) -R23; -CR21R22-0-C (0) -R23; -POR19R20, -PO (OR19) (OR20) ou Y-R15; R7 representa - (CR8R9) m (CRioRn) pCRi2Ri3Ri4; Rg e R9 representam, cada um, independentemente C1-C4 alquilo, C2-C4 alcenilo ou C2-C4 alcinilo, podendo qualquer um desses grupos ser opcionalmente substituído com -PO (OH) 2, -CF2PO(OH)2, -OH, -C00H ou -NH2; ou Rg e Rg representam, cada um, independentemente H, trifluorometilo ou F; Rio, Rn, R12, R13 e R14 representam, cada um, independentemente C1-C4 alquilo, C2-C4 alcenilo ou C2-C4 alcinilo, podendo qualquer um desses grupos ser opcionalmente substituído com -P0(0H)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -C00H ou -NH2; ou Rio, R11, R12, R13 e R14 podem ser independentemente selecionados a partir de H, (CR8R9) qNH2, - (CR8R9) qOH, CF3, F, COOH; ou Rio e Rn ou R12 e R13 ou R13 e R14 podem ser tomados juntamente com o carbono ao qual são unidos para formar um C3-C6 cicloalquilo ou um anel heteroalquilo de 3 a 6 membros que contém um ou mais heteroátomos selecionados a partir de N, 0 e S e que é, opcionalmente, substituído com até 5 grupos (CR8R9) q0H, - (CR8R9) qNH2 ou COOH; Y = ligação, -C(0)-0-; - (CH2) 2-0-C (0)-0-; Ris representa

   Ri6 são, cada um, independentemente H ou OH; R17 é independentemente selecionado a partir de H, OH e NH2; Ri8 é independentemente selecionado a partir de H, -CH3, -CH20H e -COOH; contanto que, no entanto, não mais de 2 grupos selecionados a partir de R16, R17 e R18 representem H ou CH3; Ri9 e R2o representam, cada um, independentemente H ou Cl-C4 alquilo ou R19 e R2o juntos representam =CH2; R2i é independentemente selecionado a partir de H, CH3; R22 é independentemente selecionado a partir de H, -CH3, - CH=CH2, -CH2C1, -CHC12, -CCI3, - CH (OH) Me, -CH20H, -CH2CH3, -CH(Cl)Me; R23 é independentemente R7, Y-R15 ou um anel arilo ou heteroarilo de 5 ou 6 membros opcionalmente substituído com entre um e três grupos selecionados a partir de OH, F, Cl, Br, N02 e NH2; a representa 0 ou 1; m, p e q representam, cada um, independentemente um número inteiro entre 0-4; contanto que, no entanto, a fração R7 não contenha mais de 12 átomos de carbono e contenha pelo menos um grupo funcional selecionado a partir de -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, COOH, OH ou NH2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. 2. Um composto de acordo com a reivindicação 1 onde R6 representa -R7.
3. 3. Um composto de acordo com a reivindicação 1, onde R6 representa -C(0)R7.
4. 4. Um composto de acordo com a reivindicação 1, onde R6 representa - (CH2) 2-0- [CR21R22-O] a-C (O) -R23 .
5. 5. Um composto de acordo com a reivindicação 4, onde R23 representa R7.
6. 6. Um composto de acordo com a reivindicação 4, onde R23 representa Y-R15.
7. 7. Um composto de acordo com a reivindicação 1-5, onde R7 contém 7 ou menos átomos de carbono.
8. 8. Um composto de acordo com a reivindicação 7, onde R7 contém 5 ou menos átomos de carbono.
9. 9. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 7 ou 8, em que R7 contém dois grupos selecionados a partir de -PO(OH)2, -CF2PO(OH)2, -OH, -COOH e -nh2.
10. 10. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 9 em que R7 contém pelo menos um grupo funcional selecionado a partir de -COOH, OH e NH2.
11. 11. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 10, em que p representa 0 ou 1.
12. 12. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 11, em que m representa 0 ou 1.
13. 13. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 12, em que q representa 0, 1 ou 2 .
14. 14. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 13, em que Rn representa H.
15. 15. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 14, em que R12 representa H.
16. 16. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 15, em que R13 representa H ou OH.
17. 17. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 16, onde p representa 1, e Rio representa Me, OH ou CH2OH.
18. 18. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 16, onde p representa 1 e Rn representa Me, H ou CH2OH.
19. 19. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 10, onde m e p ambos representam 0, Rn e Rn ambos representam H e Rn representa - (CR8R9) q-OH onde q = 0 ou 1 e Rg e R9 ambos representam H.
20. 20. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 10, onde p representa 1 e m representa 0, Rio e Rn ambos representam H, Rn representa H, R13 representa H, OH ou NH2 e R14 representa -(CRsR^q-OH onde q = 0 ou 1 e Re e R9 ambos representam H.
21. 21. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 10 em que R6 representa o resíduo derivado da formação de um éster com ácido hidroxiacético, ácido 3-hidroxi-2,2-dimetilpropiónico, ácido 2,3-dihidroxipropiónico, ácido 3-hidroxi-2- hidroximetilpropiónico ou ácido 2,2- bis (hidroximetil)propiónico .
22. 22. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7 a 10, em que Rõ representa o resíduo derivado da formação de um éter com ácido hidroxiacético, ácido 3-hidroxi-2,2-dimetilpropiónico, ácido 2,3-dihidroxipropiónico, ácido 3-hidroxi-2- hidroximetilpropiónico ou ácido 2,2- bis(hidroximetil)propiónico.
23. 23. Um composto de acordo com a reivindicação 1 que é 39-desmetoxi-40-O-[2,2-bis(hidroximetil)propionil]rapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
24. 24. Um composto de acordo com a reivindicação 1 que é 39-desmetoxi-40-O-(2-hidroxi)etil rapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
25. 25. Um composto de acordo com a reivindicação 1 que é 39-desmetoxi-40-O-[2-hidroxietil 3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato] rapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
26. 26. Um composto de acordo com a reivindicação 1 que é 27-O-desmetil-39-desmetoxi-40-O-[2,2- bis(hidroximetil)propionil] rapamicina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
27. 27. Um composto de acordo com a reivindicação 1, onde R6 representa -POR19R20·
28. 28. Um composto de acordo com a reivindicação 1, onde R6 representa -PO(ORig) (OR20) ·
29. 29. Um composto de acordo com a reivindicação 27 ou 28, onde R19 e R20 ambos representam CH3 ou ambos representam CH2CH3.
30. 30. Um composto de acordo com a reivindicação 1, onde R6 representa Y-R15.
31. 31. Um composto de acordo com a reivindicação 30, em que o qrupo R15 representa
32. 32. Um composto de acordo com a reivindicação 31, em que Ris é uma fração formada por meio da formação de um acetal com glucose, glucosamina, ácido glucurónico ou arabinose.
33. 33. Um composto de acordo com a reivindicação 31, em que Ris é uma fração formada por meio da formação de um acetal com D-glucose.
34. 34. Um composto de acordo com a reivindicação 31, em que Ris é uma fração formada por meio da formação de um acetal com D-glucosamina.
35. 35. Um composto de acordo com a reivindicação 31, em que Ris é uma fração formada por meio da formação de um acetal com D-ácido glucurónico.
36. 36. Um composto de acordo com a reivindicação 30, em que Ris representa:
37. 37. Um composto de acordo com a reivindicação 36, em que Ris é uma fração formada por meio da formação de um acetal com frutose.
38. 38. Um composto de acordo com a reivindicação 30, em que Ris representa:
39. 39. Um composto de acordo com a reivindicação 38, em que Ris é uma fração formada por meio da formação de um éster com ácido glucurónico.
40. 40. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39 em que Y representa uma ligação.
41. 41. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, em que Y representa - (CH2)2-0-C (O)-O-.
42. 42. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 39, em que Y representa - C(0)-0-.
43. 43. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 para utilização como um aqente farmacêutico.
44. 44. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 para utilização no tratamento de cancro e/ou malignidades de células B, a indução ou manutenção da imunossupressão, o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, a estimulação da regeneração neuronal ou o tratamento de infeções fúngicas.
45. 45. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 para utilização como um agente farmacêutico no tratamento de cancro ou malignidades de células B.
46. 46. Uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 juntamente com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
47. 47. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de cancro ou malignidades de células B.
48. 48. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro e/ou malignidades de células B, a indução ou manutenção da imunossupressão, o tratamento de rejeição a transplante, doença do enxerto vs. hospedeiro, distúrbios autoimunes, doenças de inflamação, doença vascular e doenças fibróticas, a estimulação da regeneração neuronal ou o tratamento de infeções fúngicas.
49. 49. A utilização de acordo com a reivindicação 48, em que o medicamento é para o tratamento de cancro ou malignidades de células B.
50. 50. Um processo para preparação de um composto de fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 que compreende: (a) fazer reagir um composto de fórmula (II):

    onde Ra representa H ou (CH2)2_OH ou um derivado protegido do mesmo com um composto de fórmula (III) : HO-R6 (III) ou um derivado ativado do mesmo em que o grupo R6 é como definido acima para os compostos de fórmula (I) ou um derivado protegido do mesmo; ou (b) converter um composto de fórmula (I) ou urn sal do mesmo em outro composto de fórmula (I) ou outro sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ou (c) desproteger um composto protegido de fórmula (I).
51. 51. Uma composição ou kit de partes que compreende (i) um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42 e (ii) um ou mais outros agentes terapeuticamente eficazes.
52. 52. A composição ou kit de partes de acordo com a reivindicação 51, em que o um ou mais outros agentes terapeuticamente eficazes são selecionados a partir do grupo de metotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorrelbina, doxorrubicina, tamoxifen, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (por exemplo, Herceptin™), capecitabina, cloridreto de raloxifeno, inibidores de EGFR, inibidores de VEGF, inibidores de proteassoma, inibidores de hsp90, azatioprina, corticosteroides, ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, Micofenolato de Mofetil, OKT-3, ATG, anfotericina B, flucitosina, equinocandinas, griseofulvina, um imidazol e um agente antifúngico de triazol.