BRPI0517325B1 - método para a preparação de um substrato revestido adaptado para imobilização de uma amostra biológica - Google Patents

Abstract

REVESTIMENTOS DE POLIMERO POLICATIÔNICOS PARA IMOBILIZAÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS. A presente invenção é direcionada a um substrato pré-revestido, como uma lâmina, que é útil para imobilização de uma amostra. A invenção também fornece métodos de preparação de tais substratos pré-revestidos e métodos de análise de amostra biológicas imobilizadas em tal substrato pré-revestido. O substrato é revestido com um material de revestimento polimérico policatiônico especificamente selecionado de forma que o substrato revestido exiba melhor estabilidade e durabilidade prolongada. Materiais de revestimento polimérico preferidos incluem polímeros alílicos ou vinílicos tendo grupos catiônicos neles e que têm não mais que uma pequena percentagem de ligações monoméricas peptídicas, particularmente polidialildimetilamônio (PDDA).

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção é direcionada a um método para a preparação de um substrato revestido para imobilizar uma amostra biológica nele, preferivelmente para análise desta. A presente invenção é também direcionada a um substrato pré-revestido preparado de acordo com o método acima. O substrato é revestido com um polímero policatiônico que fornece uma camada de polímero estável capaz de interação iônica com componentes biológicos aniônicos.

Fundamento

[002] Várias técnicas preparatórias biológicas requerem a imobilização de materiais de amostra, como células, tecido, proteínas, ou ácidos nucléicos a um substrato antes do subseqüente processamento. Vários desses materiais biológicos de interesse são aniônicos na natureza, exibindo sítios de carga negativa. Um método de imobilização desses materiais é o revestimento do substrato alvo com uma solução química que contém ingredientes ativos que são catiônicos na natureza, exibindo uma carga positiva. Uma vez que os materiais biológicos de interesse a serem imobilizados exibem sítios de carga negativa, os materiais biológicos se ligam à superfície do substrato através de interação com os sítios de carga positiva da solução de revestimento. Essa propriedade de adesão da solução de revestimento permite a imobilização de material de amostra para subsequente processamento.

[003] O efeito de imobilização acima descrito pode ser criado pelo uso de revestimentos que contêm vários ingredientes ativos atualmente conhecidos na técnica. Por exemplo, é atualmente conhecido o uso de agentes de revestimento, como poli-l-lisina, 3-aminopropil trietoxissilano, gelatina alúmen cromo, e albumina de clara de ovo. Um dos mais usados desses agentes de imobilização conhecidos é poli-l-lisina (PLL).

[004] PLL é um homopolímero policatiônico grande que exibe uma forte carga positiva produzida pelos grupos amino terminais das cadeias laterais do resíduo de lisina ao longo do polímero. L-Lisina [ácido (S)-2,6- diaminohexanóico] é um aminoácido de estrutura química mostrada abaixo na fórmula (1).

[005] O polímero PLL é uma cadeia de unidades de monômero de 1-lisina ligadas através de ligações de peptídeo. A estrutura química para PLL é fornecida abaixo na fórmula (2), onde n é um número inteiro que representa o número de unidades de monômero na cadeia de polímero.

[006] Embora PLL seja amplamente usado como um revestimento de polímero policatiônico, substratos revestidos com PLL tendem a perder sua eficácia de imobilização por um período de tempo relativamente curto. Esse declínio na eficácia pelo tempo é geralmente atribuído à oxidação dos grupos amina da cadeia lateral de PLL. Os grupos oxidados não exibem a carga positiva necessária para adesão adequada aos materiais biológicos a serem imobilizados.

[007] A eficácia de PLL como um agente de imobilização é também limitada por sua inerente estrutura química mostrada acima na fórmula (2). Como previamente observado, os resíduos de aminoácido do polímero são conectados por ligações de peptídeo (ligações -CO-NH-). Essas ligações de peptídeo são altamente vulneráveis a clivagem por enzimas proteolíticas, como tripsina, e a clivagem hidrolítica geral, como através de ataque de uma substância nucleofílica. A clivagem das ligações de peptídeo resulta em moléculas PLL de comprimento de cadeia substancialmente menor, como medido pelo peso molecular médio do polímero. Uma vez que o peso molecular da molécula de PLL é reduzido através de clivagem proteolítica, a capacidade de imobilização da molécula (ou seja, sua propriedade adesiva) torna-se muito reduzida.

[008] Agentes de imobilização conhecidos, como PLL, exibem utilidade limitada como um resultado das instabilidades químicas acima descritas. Portanto, substratos revestidos com os agentes conhecidos também exibem utilidade limitada, particularmente para uso de longa duração ou uso depois de um tempo de estocagem significativo. Dada a estabilidade limitada dos substratos revestidos com os agentes de imobilização conhecidos, seria altamente útil ter um substrato pré-revestido que seja revestido com um agente de imobilização que exiba estabilidade aumentada, particularmente sendo útil para imobilizar uma amostra biológica para observação.

Sumário da invenção

[009] A presente invenção fornece um substrato revestido preferivelmente adaptado para imobilização de uma amostra biológica. O substrato é revestido com um polímero policatiônico que exibe estabilidade aumentada em comparação com os agentes de imobilização previamente conhecidos na técnica. Portanto, o substrato revestido com o polímero policatiônico estável é útil para imobilizar amostras biológicas que têm uma carga negativa, e o substrato revestido mantém tal utilidade por um período estendido de tempo.

[0010] Em uma modalidade da presente invenção, éfornecido um método para preparação de um substrato revestido. Preferivelmente, o substrato revestido é adaptado para imobilização de uma amostra biológica. De acordo com uma modalidade, o método compreende o fornecimento de um substrato que tem uma superfície quecompreende uma pluralidade de grupos aniônicos e o contato do substrato com uma composição que compreende uma soluçãode um material polimérico não peptídico para formar um revestimento do material polimérico não peptídico em pelo menos uma porção da superfície do substrato. A solução que compreende o material polimérico não peptídico pode ser uma solução aquosa ou uma solução orgânica, preferivelmente tendo um pH de pelo menos cerca de 6.

[0011] Em uma modalidade preferida da invenção, o método também compreende as etapas de secagem do substrato revestido com o material polimérico não peptídico. Preferivelmente, o substrato revestido com o material polimérico não peptídico seco é enxaguado.

[0012] Em uma outra modalidade preferida da invenção, o método é caracterizado pela ausência de limpeza do substrato. Em particular, o método exclui o processo de limpeza do substrato antes do contato do substrato com o material polimérico não peptídico.

[0013] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um substrato pré-revestido, como uma lâmina de microscópio, que é preferivelmente adaptado para imobilização de uma amostra biológica para análise. De acordo com uma modalidade, o substrato compreende uma superfície que tem uma pluralidade de grupos aniônicos para fornecer uma carga negativa, e o substrato é revestido com um material polimérico não peptídico que compreende uma pluralidade de grupos catiônicos.

[0014] O substrato pré-revestido, de acordo com esse aspecto da invenção, é caracterizado por sua capacidade de imobilizar um número médio de células por área de superfície do substrato. Em uma modalidade particular, o substrato pré-revestido é capaz de imobilizar um número médio de células por área de superfície de pelo menos cerca de 20.000 células /cm2 quando o substrato pré- revestido faz contato com 1 mL de uma suspensão de células da linha de células SiHa.

[0015] De acordo com uma outra modalidade da invenção, o material polimérico não peptídico usado para revestir o substrato pré-revestido compreende um polímero alílico, um polímero vinílico, ou uma combinação destes, preferivelmente que compreende grupos catiônicosselecionados do grupo que consiste em aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias e aminasquaternárias. Em uma modalidade preferida, o material polimérico não peptídico compreende polidialildimetilamônio (PDDA). Em uma outra modalidade preferida da invenção, o material polimérico não peptídico compreende polialilamina(PAH).

[0016] O substrato, de acordo com a presenteinvenção, pode ser qualquer item ou aparelho útil ou necessário para observar ou analisar um material biológico. Em uma modalidade preferida, o substrato é selecionado do grupo que consiste em lâminas, placas, glóbulos, tubos de teste, cuvetas, palitos, swabs e gaze. Em uma modalidade adicional, o substrato pode ser um dispositivo útil como um dispositivo que reúne contaminante. Por exemplo, o substrato pode ser uma luva, uma toalha ou uma compressa médica.

[0017] Os substratos revestidos de acordo com apresente invenção são adaptados para imobilizar materiais que são pelo menos parcialmente aniônicos em natureza. Preferivelmente, os materiais para imobilização têm uma carga negativa. Portanto, os substratos revestidos são úteis para imobilização de vários materiais, sendo adaptados particularmente para imobilização de material biológico, como células, tecido, fluidos, DNA, RNA, proteínas, e material biológico similar tendo grupos aniônicos disponíveis para interação com os grupos catiônicos do material polimérico não peptídico usado na preparação do substrato revestido da presente invenção.

[0018] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de análise de uma amostra biológica. Em uma modalidade de acordo com esse aspecto da invenção, o método compreende as seguintes etapas: o fornecimento de um substrato pré-revestido adaptado para imobilização de uma amostra biológica, o substrato compreendendo uma superfície que tem uma pluralidade de grupos aniônicos, onde o substrato é revestido com um material polimérico não peptídico que compreende uma pluralidade de grupos catiônicos; aplicação da amostra biológica ao substrato pré-revestido para imobilizar a amostra biológica no substrato; e análise da amostra biológica imobilizada no substrato pré-revestido. Em uma modalidade particular, o substrato pré-revestido é capaz de imobilizar um número médio de células por área de superfície de pelo menos cerca de 20.000 células/cm2quando o substrato pré-revestido faz contato com 1 mL de uma suspensão de células da linha de células SiHa.

Descrição detalhada da invenção

[0019] A presente invenção gora será descrita de maneira mais completa. Entretanto, essa invenção pode ser englobada em várias diferentes formas e não deve ser interpretada como limitada às modalidades aqui apresentadas; ao contrário, essas modalidades são fornecidas de modo que essa revelação satisfaça as necessidades legais aplicáveis. Como usado nessa especificação e nas reivindicações, as formas singulares “um” “uma” e “a/o” incluem referentes no plural a menos que o contexto dite claramente em contrário.

[0020] O substrato pré-revestido da presenteinvenção é caracterizado pelo uso de um material de revestimento polimérico preferivelmente que demonstre capacidade de imobilização pelo menos equivalente aos agentes de revestimento atualmente conhecidos, mas que também demonstre estabilidade estendida desse efeito de imobilização após o revestimento do substrato. Além disso, em uma modalidade preferida, o material de revestimento polimérico é de uma estrutura química que é menos vulnerável, ou invulnerável, à degradação proteolítica ou hidrolítica quando comparada aos agentes de revestimento convencionais, como PLL.

[0021] O material de revestimento polimérico deacordo com a presente invenção compreende uma pluralidade de grupos catiônicos que são disponíveis para interação comgrupos aniônicos, como em um substrato a ser revestido e emuma amostra biológica a ser imobilizada. Os grupos catiônicos podem ser um componente integral da estrutura polimérica do material de revestimento polimérico ou presente como grupos de cadeia lateral. Os grupos catiônicos podem ser qualquer grupo que tenha uma carga positiva e que seja capaz de interação iônica com partículas ou grupos de carga oposta. Grupos catiônicos particularmente preferidos incluem grupos amina e grupos amônio, que podem ser grupos amina primários, secundários, terciários ou quaternários ou grupos amônio. Grupos catiônicos, particularmente um grupo amônio, têmfreqüentemente um countérion negativamente carregado associado ao grupo, como cloro.

[0022] Grupos catiônicos que exibem maiores graus de substituição são particularmente preferidos. Como previamente observado, grupos amina simples, como aminas primárias, são altamente suscetíveis à oxidação. Aminas substituídas são menos suscetíveis a tal ataque oxidativo e, portanto, exibem estabilidade aumentada. Acredita-se que a substituição dos grupos hidrogênio na amina com mais grupos complexos, como grupos metil, forneça proteção contra oxidação, os grupos mais complexos sendo menos suscetíveis à substituição. Portanto, acredita-se que maiores graus de substituição geram aminas de estabilidade aumentada. Grupos amônio quaternários são particularmente preferidos por sua estabilidade aumentada.

[0023] O material de revestimento polimérico dapresente invenção é preferivelmente formado porpolimerização de um ou mais monômeros alílicos ou vinílicos. Polímeros alílicos são polímeros derivados de monômeros que compreendem pelo menos um grupo alílico, que é ilustrado abaixo na fórmula (3).

[0024] Polímeros vinílicos são polímeros derivadosde monômeros que compreendem pelo menos um grupo vinílico que é ilustrado abaixo na fórmula (4).

[0025] Ácido acrílico, ácido metacrílico, e váriosésteres destes são exemplos de monômeros vinílicos úteis na presente invenção. Monômeros alílicos e vinílicos resultam na formação de estruturas de polímero não peptídico e, como um resultado, exibem maior resistência à degradação proteolítica que PLL.

[0026] Em uma modalidade da presente invenção, um polímero particularmente preferido derivado de um monômero alílico para uso como o material de revestimento polimérico é polidialildimetilamônio (PDDA), que é geralmente disponível como o sal de cloreto do polímero. Assim como PLL, PDDA é um homopolímero policatiônico grande que exibe uma forte carga positiva. A forte carga positiva na molécula de PDDA é produzida por grupos amônio dimetilados de cadeia lateral nos resíduos junto do polímero. A estrutura química do polímero PDDA é fornecida abaixo na fórmula (5), onde n é um número inteiro que representa o número de unidades de monômero na cadeia do polímero.

[0027] PDDA é um agente de imobilização particularmente estável para uso como o material de revestimento polimérico da presente invenção. Os grupos catiônicos em PDDA são amônios quaternários, o que significa que eles são muito menos suscetíveis à oxidação, como acima descrito. A estrutura do polímero de PDDA é derivada de grupos alílicos e não contém ligações de peptídeo, como aquelas encontradas na molécula de PLL. Essa ausência de ligações de peptídeo torna o PDDA resistente ao ataque por agentes proteolíticos, como tripsina, que quebra a cadeia de polímero de PLL e reduz as capacidades de imobilização.

[0028] A estabilidade aumentada de substratos revestidos com um material de revestimento polimérico que compreende PDDA tem sido substanciada por testes de laboratório. Em um teste, um substrato foi revestido com um material de revestimento polimérico que compreende PDDA, deixado para secar, e enxaguado com água deionizada. Estudos de estabilidade acelerada que comparam substratos revestidos com PLL contra substratos revestidos com PDDA a 45°C previram estabilidade de performance excepcional em excesso de 15 meses. Essa comparação é também ilustrada no Exemplo 2.

[0029] Além disso, PDDA é vantajoso para uso no material de revestimento polimérico da presente invenção por causa de sua inerente hidrofilia. De modo surpreendente, substratos revestidos com PDDA exibem hidrofilia aumentada em comparação com substratos revestidos com os agentes de revestimento conhecidos, como PLL. Esse é um efeito vantajoso porque pequenas amostras analíticas aquosas se disseminarão mais uniformemente pelo substrato revestido com PDDA. Isso permite uma distribuição mais uniforme da amostra imobilizada, o que facilita a melhor observação da amostra imobilizada.

[0030] Em uma outra modalidade da presente invenção, o polímero usado no material de revestimento polimérico é polialilamina (PAH), que é geralmente disponível como o sal de cloridrato (cloridrato de polialilamina). Assim como o PDDA, PAH é um polímero alílico que não tem ligações de peptídeo. O grupo amina de PAH não é altamente substituído, como o PDDA; entretanto, o grupo PAH é ainda útil como um material de revestimento polimérico de acordo com a presente invenção. A estrutura química do polímero PAH é fornecida abaixo na fórmula (6), onde n é um número inteiro que representa o número de unidades de monômero na cadeia do polímero.

[0031]Além do PDDA e do PAH, o material de revestimento polimérico pode ser um polímero derivado dapolimerização de um ou mais diversos monômeros, particularmente monômeros alílicos ou vinílicos. Portanto, o material de revestimento polimérico pode ser um homopolímero, copolímero, ou terpolímero. Adicionalmente, o material de revestimento polimérico pode ser uma mistura física de um ou mais homopolímeros, copolímeros, ou terpolímeros. Quando o material de revestimento polimérico compreende um homopolímero, os monômeros são preferivelmente todos monômeros catiônicos; no entanto, quando o polímero é um copolímero, terpolímero ou mistura física de polímero, não é necessário que todos monômeros sejam catiônicos. Em uma modalidade preferida, o material de revestimento polimérico compreende uma percentagem molar de cerca de 5% a cerca de 100% de polímero catiônico ou de monômeros. Mais preferivelmente, o material de revestimento polimérico compreende uma percentagem molar de cerca de 30% a cerca de 100% de polímero catiônico ou de monômeros, mais preferivelmente cerca de 50% a cerca de 100% de polímero catiônico ou de monômeros.

[0032] O monômero catiônico usado no material de revestimento polimérico pode ser catiônico em seu estado normal ou pode ser derivado de um estado não catiônico para um estado catiônico. Tal derivatização pode ser por qualquer método geralmente conhecido na técnica, como por adição de uma funcionalidade iônica, como um grupo amina ou amônio. Ou seja, os monômeros usados para formar o material de revestimento polimérico podem conter grupos catiônicos nativos, como no caso dos monômeros usados para formar PDDA e PAH, ou podem conter grupos laterais que podem ser derivatizados para formar grupos laterais catiônicos.

[0033] Preferivelmente, o material de revestimento polimérico é derivado de pelo menos um monômero selecionado do grupo que consiste em dialildimetilamônio, alilamina, metilacrilamidopropiltrimetilamônio, acrilamida, ácido acrílico, metacriloiloxietiltrimetilamônio, 4-vinil- benziltrimetilamônio, ácido metacrílico, hidroxietilacrilato, metacrilato, metilmetacrilato, hidroxietilmetacrilato, 4-vinilpiridínio, 4-vinil-1- metilpiridínio, acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de butila, acrilato de 2-etil hexila, dimetilaminoetilacrilato, cloreto de dimetilaminoetilacrilato metila quaternário, dimetilaminopropilacrilamida, cloreto de dimetilaminopropilacrilamida metila quaternário, acriloxietildimetilbenzil amônio, acriloxietiltrimetil amônio, dimetilaminoetilmetacrilato, metacriloxietildimetil amônio, metacriloxietiltrimetil benzilamônio, eteno, etilenoimina, propeno, estireno, cloreto de vinila, isobutileno, trimetil-2-metacriloiletilamônio, trimetil-2- metacrilaminopropil amônio e misturas destes.

[0034] Em uma outra modalidade preferida da invenção, o material de revestimento polimérico compreende um copolímero de um monômero catiônico e pelo menos um monômero adicional. Preferivelmente, o material de revestimento polimérico compreende um copolímero de dialildimetilamônio e pelo menos um monômero adicional. Mais preferivelmente, o pelo menos um monômero adicional compreende um monômero vinílico. Em uma modalidade, o material de revestimento polimérico compreende um copolímero que compreende dialildimetilamônio e unidades de monômero de ácido acrílico. Em uma outra modalidade, o material de revestimento polimérico compreende um copolímero que compreende dialildimetilamônio e unidades de monômero de acrilamida. Em uma outra modalidade da invenção, o material de revestimento polimérico compreende um terpolímero que compreende dialildimetilamônio, ácido acrílico e unidades de monômero de hidroxietilmetacrilato.

[0035] Preferivelmente, o material de revestimento polimérico de acordo com a presente invenção é “não peptídico”, o que significa que as ligações entre as unidades de monômero são predominantemente e, preferivelmente, não peptídicas em natureza. Preferivelmente, o material de revestimento polimérico compreende não mais que cerca de 25% de ligações peptídicas monoméricas, o que significa que não mais que cerca de 25% das ligações entre as unidades de monômero compreendem ligações de peptídeo. Mais preferivelmente, não mais que cerca de 10% das ligações monoméricas são ligações peptídicas, e mais preferivelmente não mais que cerca de 5% das ligações monoméricas são ligações de peptídeo. Em certas modalidades preferidas, o material de revestimento de polímero é completamente livre de ligações peptídicas.

[0036] O polímero usado no material de revestimentopolimérico da presente invenção é preferivelmente de peso molecular relativamente alto. Polímeros de alto peso molecular são preferidos por sua alta densidade de carga associada com tal alto peso molecular. Portanto, embora altos pesos moleculares sejam preferidos, polímeros que têm menores pesos moleculares que os aqui descritos também seriam úteis de acordo com a presente invenção se os polímeros de menor pesos molecular exibissem uma densidade de carga suficientemente alta para ser considerada equivalente à densidade de carga dos polímeros de alto peso molecular aqui descritos.

[0037] O polímero usado no material de revestimentopolimérico preferivelmente tem um peso molecular maior que cerca de 75.000 Da, mais preferivelmente maior que cerca de 100.000 Da. Em modalidades particulares, o polímero tem um peso molecular na faixa de cerca de 250.000 Da a cerca de 750.000 Da, mais preferivelmente na faixa de cerca de 400.000 Da a cerca de 500.000 Da. A menos que observado em contrário, o peso molecular é aqui expresso como média de peso molecular (Mw), que é definido pela fórmula (7) abaixo yNiMi1

onde Ni é o número de moléculas de polímero (ou o número de moles daquelas moléculas) que tem peso molecular Mi.

[0038] Em uma modalidade preferida, o material de revestimento polimérico compreende PDDA, como acima mostrado na fórmula (5), onde n é um número inteiro entre cerca de 500 e 6.000, preferivelmente entre cerca de 2.000 e cerca de 5.000, mais preferivelmente entre cerca de 3.000 e cerca de 4.000. Em uma outra modalidade preferida, o material de revestimento polimérico compreende PAH, como mostrado acima na fórmula (6), onde n é um número inteiro entre cerca de 1.000 e cerca de 15.000, preferivelmente entre cerca de 5.000 e cerca de 12.000, mais preferivelmente entre cerca de 8.000 e cerca de 10.000.

[0039] Em um aspecto da invenção, é fornecido um método para a preparação de um substrato revestido que é preferivelmente adaptado para imobilização de uma amostra biológica. Geralmente, o método compreende o fornecimento de um substrato que tem uma superfície que compreende uma pluralidade de grupos aniônicos, o contato do substrato com uma composição que compreende uma solução de um material de revestimento polimérico não peptídico, como acima descrito, para formar um revestimento do material de revestimento polimérico em pelo menos uma porção da superfície do substrato, e secagem do material de revestimento polimérico revestido na superfície do substrato.

[0040] O substrato usado de acordo com o método da invenção pode ser qualquer substrato que compreende uma superfície que tem uma pluralidade de grupos aniônicos e que exibe uma carga negativa e que pode ser usado para imobilizar uma amostra nele. Preferivelmente, o substrato é um item útil como uma ferramenta diagnóstica, uma ferramenta de observação, uma ferramenta anti-contaminação, e outras ferramentas similares, cujo uso deve ser aparente para pessoa habilitada na técnica. Preferivelmente, o substrato usado no método da invenção compreende vidro, metais, cerâmicas, polímeros naturais ou sintéticos, materiais fibrosos naturais ou sintéticos e misturas destes. Exemplos específicos, não limitantes, de substratos úteis no método incluem lâminas, glóbulos, tubos de teste, cuvetas, palitos, swabs, gaze e outros.

[0041] Em uma modalidade da invenção, o substrato a ser revestido com o material de revestimento polimérico é uma placa ou lâmina, como uma lâmina de microscópio. A lâmina pode compreender qualquer material geralmente aceito na técnica como sendo útil como tal. Por exemplo, a lâmina pode ser construída de vidro, cerâmica, ou um material polimérico. Quando é usado vidro, o vidro pode ser qualquer tipo de vidro padrão que compreende primariamente dióxido de silício, como vidro padrão de cal sodada. Alternativamente, o vidro pode ser vidro especial, como vidro de borossilicato.

[0042] Quando a lâmina compreende um polímero, é preferível que o polímero, em seu estado normal, compreenda grupos aniônicos capazes de interação com os grupos catiônicos do material de revestimento polimérico. Na ausência de tais grupos, no entanto, o polímero pode ser derivatizado para melhorar a adesão celular. Exemplos de polímero útil como lâminas de acordo com essa modalidade da presente invenção incluem, sem limitação, poliestireno, polihidroxi metacrilato, polietileno tereftalato, politetrafluoroetileno, etileno fluorinado, e polidimetilsiloxano. O polímero pode ser um homopolímero, copolímero, terpolímero, ou misturas físicas de polímeros.

[0043] Em uma modalidade preferida do método dainvenção, o material de revestimento polimérico está em solução, que pode ser em uma solução aquosa ou uma soluçãoorgânica. Qualquer solvente adequado conhecido na técnica pode ser usado para solubilizar o material de revestimentopolimérico como água deionizada para fazer uma solução aquosa ou um álcool para fazer uma solução orgânica. A solução pode ter uma concentração do material de revestimento polimérico que varia de cerca de 0,001% (w/v)a cerca de 50% (w/v). Preferivelmente, a concentração domaterial de revestimento polimérico na solução é cerca de 0,01% a cerca de 10%, mais preferivelmente cerca de 0,05% a cerca de 2%, ainda mais preferivelmente cerca de 0,1% a cerca de 1%, e mais preferivelmente cerca de 0,15% a cerca de 0,75%.

[0044] Particularmente surpreendentemente de acordocom a presente invenção, em certas modalidades, soluções de menor concentração podem ser usadas para preparar um substrato revestido tendo uma capacidade de imobilização superior a um substrato revestido preparado usando uma solução de maior concentração. Por exemplo, em modalidades particulares, soluções que têm uma concentração de material de revestimento polimérico de cerca de 0,25% são especialmente vantajosas para a preparação de um substrato pré-revestido de acordo com a invenção.

[0045] Como acima observado, os polímerospolicatiônicos úteis na invenção podem existir em um estado neutro sendo ligado um countérion (por exemplo, cloreto no caso de PDDA e cloridrato no caso de PAH). Quando em solução, os íons tendem a se dissociar. Portanto, o polímero está em seu estado catiônico, pronto para uso como um agente de imobilização de acordo com a presente invenção.

[0046] A presente invenção também engloba a facilitação da ativação dos sítios de ligação no substrato, dessa forma aumentando o número de sítios aniônicos disponíveis para interação com os grupos catiônicos no material de revestimento polimérico. Qualquer método conhecido na técnica para ativação de sítios de ligação aniônicos em um substrato deve ser útil de acordo com a presente invenção.

[0047] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o pH do material de revestimento polimérico pode ser ajustado. Tal ajuste do pH do material de revestimento polimérico pode ser para elevar ou diminuir o pH e pode ocorrer antes ou após o revestimento do substrato com o material de revestimento polimérico. Essa capacidade de ajustar o pH do material de revestimento polimérico é particularmente vantajosa para aumento do número de sítios de ligação aniônicos no substrato por desprotonização do substrato quando em contato com o material de revestimento polimérico. Geralmente, o aumento do pH na superfície do substrato promoverá a desprotonização e o aumento do número de sítios de ligação aniônicos disponíveis

[0048] Preferivelmente, o pH da solução que compreende o material de revestimento polimérico é ajustado a um pH preferido. Em uma modalidade, o pH da solução é pelo menos cerca de 6. Em outras palavras, o pH da solução é cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, ou cerca de 14. Em uma modalidade preferida, o pH da solução que compreende o material de revestimento polimérico é cerca de 8 a cerca de 14, preferivelmente cerca de 8 a cerca de 10.

[0049] Após o contato do substrato com o materialde revestimento polimérico, o material de revestimento polimérico revestido no substrato é preferivelmente seco antes do processamento ou uso. A secagem do material de revestimento polimérico pode ser avaliada por qualquer método geralmente conhecido na técnica. Em uma modalidade da invenção, o revestimento polimérico é pelo menos seco a um ponto de secagem visual. A diferença visual entre um material polimérico úmido e um material polimérico seco deve ser facilmente reconhecível por pessoa habilitada na técnica.

[0050] A secagem do material de revestimentopolimérico pode ser realizada por qualquer método geralmente aceito na técnica e pode compreender secagem passiva ou secagem ativa (por exemplo, ar forçado como um ventilador). O material de revestimento polimérico revestido no substrato pode ser seco em temperatura ambiente ou em uma temperatura elevada. Temperatura ambiente, como aqui usado, deve referir-se à temperatura do ambiente circundante. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é uma temperatura ambiente média, geralmente considerada como estando na faixa de cerca de 20°C a cerca de 25°C (cerca de 68°F a cerca de 77°F). De fato, temperaturas abaixo de cerca de 20°C não devem ser excluídas pela presente invenção. De fato, a secagem pode ser realizada em temperaturas tão baixas quanto a temperatura de congelamento do material de revestimento polimérico.

[0051] A secagem do material de revestimento polimérico revestido no substrato também pode ser realizada em uma temperatura elevada. A temperatura pode ser elevada em até uma temperatura próxima daquela em que o aumento adicional causaria a degradação do material de revestimento polimérico. Portanto, o material de revestimento polimérico revestido no substrato pode ser pelo menos parcialmente seco em uma temperatura elevada de cerca de 35°C a cerca de 120°C (cerca de 95°F a cerca de 248°F), mais preferivelmente cerca de 45°C a cerca de 80°C (cerca de 113°F a cerca de 176°F), mais preferivelmente cerca de 50°C a cerca de 60°C (122°F a cerca de 140°F).

[0052] O período de tempo pelo qual o material de revestimento polimérico revestido no substrato é seco pode variar dependendo da temperatura e do método de secagem. Geralmente, o período de tempo para secagem pode variar de cerca de 1 minuto a cerca de 1 hora, ou mais. Por exemplo, quando a secagem do material de revestimento polimérico revestido no substrato é realizada em temperatura ambiente, tal secagem é preferivelmente realizada por um período de tempo de até cerca de 1 hora, mais preferivelmente por um período de tempo de cerca de 5 minutos a cerca de 1 hora, e ainda mais preferivelmente por um período de tempo de cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos. Secagem em temperatura ambiente pode ser continuada em excesso de 1 hora sem prejudicar o material de revestimento polimérico.

[0053] Quando a secagem do material de revestimento polimérico revestido no substrato é realizada em uma temperatura elevada, tal secagem é preferivelmente realizada por um período de tempo de cerca de 1 minuto a cerca de 20 minutos, mais preferivelmente por um período de tempo de cerca de 2 minutos a cerca de 10 minutos. Secagem em temperaturas elevadas pode ocorrer por um período de tempo em excesso de cerca de 20 minutos contanto que a combinação de tempo e temperatura não leve à degradação do polímero.

[0054] O substrato com o material de revestimento polimérico seco aplicado a ele é preferivelmente enxaguado, com água deionizada, antes do uso para imobilizar uma amostra. Tal enxágüe é útil para remover countérions desassociados bem como excesso de material de revestimento polimérico que não interagiu ionicamente com o substrato. A secagem do material polimérico revestido no substrato antes do enxágüe é preferida porque a falha em realizar a etapa de secagem antes da etapa de enxágüe pode resultar em um substrato revestido onde o revestimento é incompleto (ou seja, “remendado”). O enxágüe imediatamente depois do revestimento leva a uma lavagem de quantidades excessivas do material de revestimento polimérico que deixam um substrato revestido com capacidade limitada para posterior imobilização da amostra. Secagem do material de revestimento polimérico revestido no substrato antes do enxágüe (como acima descrito), no entanto, facilita a máxima interação iônica entre o material de revestimento polimérico e o substrato, o que fornece um substrato revestido que tem uma quantidade máxima de material de revestimento polimérico aplicada a ele (ou seja, máxima densidade de carga) e, portanto, tem uma capacidade maximizada para posterior imobilização da amostra.

[0055] A maximização da capacidade de imobilização é também possível de acordo com a presente invenção já que é fornecido um método para aplicação do material de revestimento polimérico ao substrato em uma maneira controlada de modo que a etapa de enxágüe é completamente eliminada. O enxágüe é geralmente incluído no método de revestimento para remover excesso de material polimérico que não foi imobilizado no substrato através de interações iônicas. Isso é economicamente indesejável. Primeiramente, a etapa de enxágüe aumenta o tempo necessário para preparar o substrato revestido, particularmente em produção em massa, como com lâminas de microscópio. Segundo, o enxágüe representa uma perda de material. Excesso de material polimérico aplicado ao substrato (ou seja, material polimérico que não adere ao substrato) é perdido no enxágüe. Novamente, em produção em massa, a quantidade de material polimérico perdida no enxágüe pode adicionar um custo substancial.

[0056] A presente invenção resolve esses problemas. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para aplicação controlada de um material polimérico a um substrato. Nesse método, o volume de material polimérico necessário para máxima interação iônica com os grupos iônicos na superfície do substrato é calculado, e apenas a quantidade de material polimérico necessária é aplicada ao substrato.

[0057] Portanto, o substrato é revestido com o material polimérico, e não há excesso de volume presente para requerer a etapa de enxágüe. Preferivelmente, o material polimérico é ainda seco antes do uso do substrato revestido para imobilização da amostra.

[0058] Um outro aspecto surpreendente da presente invenção até agora não reconhecido na técnica é que, quando o método da invenção exclui especificamente a submissão da superfície do substrato a um processo de limpeza antes do contato do substrato com o material de revestimento polimérico, o substrato revestido resultante exibe melhores propriedades de imobilização. É geralmente aceito na técnica que substratos usados para imobilizar amostras neles passam por uma vigorosa limpeza antes da etapa de imobilização. Por exemplo, quando o substrato é uma lâmina de microscópio, a prática comum é de tomar a lâmina, como recebida do fabricante, e lavar a lâmina antes do procedimento com quaisquer etapas de imobilização. Múltiplos exemplos de processos de limpeza, ou de lavagem, são fornecidos por Cras, J.J., e cols., Biosensors & Bioelectronics, 14 (1999) 683-688.

[0059] Processos de limpeza a serem evitados de acordo com a presente invenção são processos que compreendem o uso de agentes químicos reconhecidos como úteis para a remoção de compostos orgânicos das superfícies do substrato. Exemplos de processos de limpeza a serem evitados são processos que incluem o uso de ácidos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido crômico e ácido cromossulfúrico), bases (por exemplo, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio) e solventes orgânicos (por exemplo, álcool metílico, álcool etílico, álcool propílico, tolueno, acetona, cloreto de metileno e destilados minerais). Processos de limpeza adicionais a serem evitados incluem processos de silanização projetados para expor grupos silano em substratos, como vidro. Processos como acima descritos (e também descritos por Cras, J.J., e cols.) incluem um mecanismo de ação além do simples enxágüe ou secagem de uma superfície do substrato. Portanto, as etapas do processo, como enxágüe de um substrato com água deionizada ou secagem da superfície de um substrato com um tecido, não são excluídas de acordo com a invenção. Em outras palavras, a presente invenção engloba processos onde um substrato é seco, livre de poeira ou enxaguado com água antes de cobrir com o material polimérico não peptídico.

[0060] Processos de limpeza, como os acimadescritos, são demorados e podem incluir o uso de agentes químicos tóxicos. O método da presente invenção, portanto, é particularmente útil pelo fato de tais etapas de limpeza serem completamente excluídas em modalidades preferidas. Portanto, uma lâmina de microscópio, por exemplo, pode ser usada como recebida do fabricante sem incluir quaisquer etapas de limpeza. Em outras palavras, no método da invenção, o método exclui o processo de limpeza do substrato antes do contato do substrato com o material de revestimento polimérico não peptídico.

[0061] Em um outro aspecto da invenção, é fornecidoum substrato pré-revestido particularmente útil para imobilizar uma amostra biológica nele. Em uma modalidade, o substrato pré-revestido é preparado de acordo com o método acima descrito.

[0062] Um substrato pré-revestido de acordo com a invenção que utiliza o material de revestimento polimérico aqui descrito é vantajoso pois, mesmo quando a camada de revestimento do material de revestimento polimérico não peptídico é relativamente fina, o substrato pré-revestido é ainda útil e eficaz para imobilizar uma amostra biológica. De fato, a eficácia do revestimento não é limitada a tais revestimentos relativamente finos, e o material de revestimento polimérico é também eficaz com revestimentos relativamente finos. A capacidade de preparar um substrato pré-revestido de acordo com a invenção, no entanto, é particularmente vantajosa em termos de custo de preparação de tais lâminas. Em outras palavras, a capacidade de preparar substratos para imobilizar uma amostra neles usando apenas um fino revestimento do material de revestimento polimérico é econômica pelo fato de uma quantidade reduzida do material polimérico ser usada.

[0063] O material de revestimento polimérico, quando revestido em um substrato, pode ter uma espessura de cerca de 0, 005 μm a cerca de 500 μm. Preferivelmente, o material de revestimento polimérico tem uma espessura de revestimento de cerca de 0,5 μm a cerca de 100 μm, mais preferivelmente cerca de 1 μm a cerca de 50 μm. Preferivelmente, o material de revestimento polimérico é revestido no substrato como uma camada única, significando que não há camadas entrepostas de um diferente material entre duas ou mais camadas do material de revestimento polimérico da invenção. No entanto, revestimentos de várias camadas são também previstos pela presente invenção.

[0064] O substrato pré-revestido da presente invenção é particularmente útil não apenas em termos de vida de prateleira aumentada, mas também em termos de capacidade de imobilizar uma quantidade aumentada de uma amostra biológica. Por exemplo, em uma modalidade, o substrato pré-revestido da invenção pode ser caracterizado como sendo capaz de imobilizar um número médio aumentado de células por área de superfície sobre outros substratos pré- revestidos previamente conhecidos.

[0065] Em uma modalidade particular, o número médio de células por área de superfície imobilizada no substrato pré-revestido da presente invenção é pelo menos cerca de 10% maior que o número médio de células por área de superfície pela mesma área de um substrato não revestido de acordo com os métodos da presente invenção que foram contatados com a mesma amostra de células. Preferivelmente, o número médio de células por área de superfície imobilizada no substrato pré-revestido da presente invenção é pelo menos cerca de 15% maior que o número médio de células por área de superfície na mesma área de um substrato não revestido de acordo com os métodos da presente invenção, mais preferivelmente pelo menos cerca de 20% maior.

[0066] A contagem aumentada de células de material biológico associada a um substrato pré-revestido de acordo com a presente invenção pode ser determinada com o uso de vários equipamentos e métodos que devem ser reconhecidos por pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que um hemacitômetro pode ser usado para contar células manualmente sobre um número representativo de campos de visão e depois extrapolar um número total de células por área.

[0067] As contagens de células também podem ser obtidas pelo uso de um equipamento automatizado controlado por computador, como o sistema de leitura de lâmina automatizado FOCALPOINTTMCell Profiler (disponível por TriPath Imaging, Inc.). O FOCALPOINTTMCell Profiler usa algoritmos específicos para limitar o número de células incluídas na contagem de células para uma população de valor diagnosticamente significativo (ou seja, contagens apenas de células reais, e não leva artefatos em consideração). Essa contagem de células é acumulada de aproximadamente 950 a 1.000 imagens tiradas em alta resolução em campos de células avaliadas como de mais alto potencial.

[0068] Preferivelmente, métodos usados para obter contagens de células, como acima descrito, são capazes de fornecer resultados reprodutíveis e são capazes de fornecer resultados que podem ser avaliados em uma maneira estatisticamente significativa. Portanto, uma amostra biológica aplicada a um substrato pode ser processada usando equipamento padronizado de modo que aquelas amostras processadas com o uso do equipamento podem ser comparativamente avaliadas. Um exemplo de tal equipamento de processamento é um PrepStain Slide Processor (disponível por TriPath Imaging, Inc.). O PrepStain Slide Processor permite a preparação de uma lâmina com um volume consistentemente aplicado de uma amostra biológica, de modo que a área da lâmina à qual a amostra será aplicada é consistente e reprodutível. Tal processamento é particularmente útil para avaliar uma amostra biológica aplicada a um substrato baseado em uma contagem de células média por área de superfície do substrato.

[0069] Uma modalidade particular da invenção fornece um substrato pré-revestido adaptado para imobilização de uma amostra biológica para análise. O substrato pode ser qualquer substrato como aqui descrito que seja revestido com um material de revestimento polimérico não peptídico, como acima descrito. O substrato pré-revestido nessa modalidade da invenção é caracterizado por ser capaz de imobilizar um número médio de células por área de superfície. Tal capacidade de imobilização pode ser avaliada baseado na imobilização de uma linha de células padrão. Por exemplo, a capacidade de um substrato pré- revestido de imobilizar células pode ser avaliada com o uso de células de carcinoma cervical humano, comumente conhecidas como linha de células SiHa. Células SiHa são facilmente disponíveis, como por “American Type Culture Collection” (ATCC), identificadas pelo “ATCC Number” HTB- 35.

[0070] De acordo com uma modalidade da invenção, um substrato pré-revestido é fornecido em que a superfície do substrato pré-revestido é capaz de imobilizar um número médio de células por área de superfície de pelo menos cerca de 20.000 células/cm2quando o substrato pré-revestido faz contato com 1 mL de uma suspensão de células da linha de células SiHa. Preferivelmente, a superfície do substrato pré-revestido é capaz de imobilizar uma média de pelo menos cerca de 21.000 células/cm2quando o substrato pré- revestido faz contato com 1 mL de uma suspensão de células da linha de células SiHa, mais preferivelmente pelo menos cerca de 22.000 células/cm2, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 23.000 células/cm2.

[0071] A capacidade de imobilização melhorada do substrato pré-revestido de acordo com a presente invenção pode ser observada através de métodos analíticos adicionais também. Um método adequado para uso na quantificação de densidade de carga do substrato revestido pode medir diretamente a densidade da carga em termos de densidade de carga por área de substrato revestido. Um outro método mede indiretamente a densidade da carga por correlação a uma outra propriedade mensurável. Por exemplo, a densidade de carga do material de revestimento polimérico revestido no substrato pode ser quantificada através de medida espectrográfica de um corante associado ao substrato revestido (por exemplo, adsorvido nele).

[0072] Como previamente observado, a capacidade de um substrato revestido para aderir uma amostra biológica (geralmente sendo negativamente carregada) é diretamente relacionada à quantidade de carga positiva em excesso na superfície da lâmina. Quando um corante negativamente carregado é associado com a superfície da lâmina, o excesso de carga positiva na superfície da lâmina pode ser quantificado por análise espectrográfica do corante. É bem conhecido na técnica que a absorção de radiação eletromagnética em um dado comprimento de onda por um corante é diretamente proporcional à concentração do corante. Portanto, dada uma relação proporcional entre o corante aniônico e o material de revestimento catiônico, uma medida da absorvência do corante associado ao material de revestimento é um indicador confiável da quantidade de excesso de carga positiva na superfície do substrato revestido. Em outras palavras, quanto maior a densidade da carga, maior a concentração do corante absorvido no substrato revestido, e maior a absorção pelo corante da radiação eletromagnética em um comprimento de onda dado.Tal técnica de medição é descrita por Tadao Sakai e Akihiko Hirose (Talanta 59 (2003) 167-175), que está aqui incorporado por referência.

[0073] Múltiplos corantes conhecidos na técnica são úteis em uma técnica analítica para quantificar a densidade de carga de um material de revestimento polimérico revestido em um substrato de acordo com a presente invenção. Uma classe de corantes particularmente úteis para quantificação de densidade de carga de um substrato revestido na presente invenção são corantes de xanteno, como eosina e tetraiodofluoresceína. Um corante particularmente útil de acordo com a presente invenção é Eosina Y (mostrado abaixo na fórmula 8) que é, em uma solução neutra aquosa, di-aniônico. Como uma espécie di- aniônica, o corante se liga a uma espécie mono-catiônica em uma relação de 1:2.

[0074] Eosina Y adsorvida em um polímero catiônico, como PDDA, tem um comprimento de onda máximo de absorção (Xmax) de cerca de 542 nm. Portanto, medidas de absorção nesse comprimento de onda são eficazes para quantificação de excesso de carga positiva na superfície de um substrato revestido. Tais medidas podem ser tomadas em qualquer dispositivo analítico conhecido na técnica como útil para tais medições, como um espectrofotômetro UV-Vis. Um exemplo da medição da densidade de carga de um substrato revestido com um material de revestimento polimérico de acordo com a presente invenção é fornecido no Exemplo 4.

[0075] Um substrato revestido de acordo com a presente invenção revestido com um material de revestimento polimérico tem um excesso de locais de carga positiva, tal excesso sendo de uma quantidade para ligar de modo eficaz a amostra biológica. O material de revestimento polimérico no substrato revestido é eficaz para ligar a amostra biológica de acordo com a presente invenção quando o material de revestimento polimérico exibe pelo menos uma densidade de carga minimamente aceitável. A densidade de carga de um substrato pré-revestido preparado de acordo com a presente invenção, através de medição quantitativa, pode ser facilmente muito maior que a densidade de carga de um substrato pré-revestido que não é preparado de acordo com a presente invenção. Quando corante Eosina Y é usado no método de quantificação como acima descrito, um substrato pré-revestido de acordo com a presente invenção deve exibir uma absorvência que é pelo menos duas vezes maior que a absorvência em um substrato não preparado de acordo com a presente invenção. Mais preferivelmente, a absorvência exibida por um substrato de acordo com a presente invenção é pelo menos cerca de três vezes maior que a absorvência em um substrato não preparado de acordo com a presente invenção. Ainda mais preferivelmente, a absorvência exibida por um substrato de acordo com a presente invenção é pelo menos cerca de quatro vezes maior que a absorvência em um substrato não preparado de acordo com a presente invenção.

[0076] De acordo com uma modalidade da presente invenção, é fornecida uma lâmina de vidro pré-revestida adaptada para imobilização de uma amostra biológica para análise. A lâmina de vidro tem uma pluralidade de grupos aniônicos, e a lâmina é revestida com um material de revestimento polimérico não peptídico que compreende uma pluralidade de grupos catiônicos. A lâmina de vidro pré- revestida tem uma densidade de carga de modo que quando o corante Eosina Y é adsorvido na lâmina revestida e é depois submetida a radiação eletromagnética em um comprimento de onda de 542 nm, o corante exibe uma absorvência de pelo menos cerca de 0,05, que é indicativa de uma densidade de carga minimamente aceitável (ou seja, excesso de carga positiva) no material de revestimento polimérico que cobre a lâmina de vidro. Preferivelmente, a absorvência é de pelo menos cerca de 0,1. Mais preferivelmente, a absorvência é pelo menos cerca de 0,15.

[0077] Como deve ser do conhecimento de pessoa habilitada na técnica, a escolha do substrato pode afetar a absorvência medida do corante adsorvido no material de revestimento usado para revestir o substrato. Portanto, se um substrato diferente de uma lâmina de vidro for usado de acordo com a presente invenção, os valores de absorvência podem variar da faixa acima fornecida. Não obstante, como previamente observado, um substrato revestido de acordo com a presente invenção deve exibir uma absorvência que é pelo menos cerca de duas vezes maior que a absorvência exibida quando o mesmo substrato é revestido por um método que não está de acordo com a presente invenção, preferivelmente pelo menos cerca de três vezes maior, mais preferivelmente pelo menos cerca de quatro vezes maior.

[0078] A amostra para imobilização no substrato revestido com o material de revestimento polimérico pode ser qualquer amostra que tenha grupos aniônicos capazes de interação com os grupos catiônicos do material de revestimento polimérico e dessa forma sendo imobilizados nele. Preferivelmente, a amostra compreende um componente biológico. Exemplos de amostras biológicas para imobilização no substrato revestido de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação, células, tecido, fluidos, ácidos nucleicos, incluindo polinucleotídeos e oligonucleotídeos (por exemplo, DNA, RNA e fragmentos desses), polipeptídeos e proteínas.

[0079] Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, uma única camada da amostra biológica é imobilizada no substrato revestido com o material de revestimento polimérico. A frase “camada única” deve significar que apenas uma camada de material é depositada nele, e imobilizada no substrato revestido. Conseqüentemente, além da amostra biológica, nenhuma camada adicional é imobilizada, particularmente sobre ela, uma vez que isso obstruiria a visualização e impediria a análise da amostra biológica imobilizada diretamente no material de revestimento polimérico no substrato.

[0080] A amostra biológica pode ser imobilizada no substrato revestido para uma variedade de usos. Preferivelmente, o uso é um uso diagnóstico. Por exemplo, a amostra biológica pode ser imobilizada para os objetivos de extração de uma amostra maior, para processamento ou teste adicional, e para vários métodos analíticos. Exemplos não limitantes, específicos de usos para o substrato revestido incluem, microarranjos de tecido (TMA), microarranjos citológicos (CMA), microarranjos de ácido nucleico e outros diagnósticos citológicos ou histológicos. Em adição a tais usos específicos, o substrato pré-revestidos da presente invenção também pode ser usado para imobilização de várias amostras biológicas para kits de ensaio diagnóstico manuais ou automáticos.

[0081] O substrato pré-revestido da invenção pode ser usado em uma variedade de métodos diagnósticos. Por exemplo, o substrato pré-revestido pode ser usado para imobilizar um anticorpo que é seletivo para uma proteína particular. Em um outro exemplo, o substrato pré-revestido pode ser usado para imobilizar um substrato reativo, que pode ser particularmente útil para isolação de uma proteína particular que é uma enzima capaz de agir no substrato reativo. Outros usos diagnósticos similares são também englobados pela presente invenção.

[0082] Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um glóbulo pré-revestido. Preferivelmente, o glóbulo pré-revestido é adaptado para extração de um componente biológico da amostra. O glóbulo nessa modalidade tem uma superfície que compreende uma pluralidade de grupos aniônicos capazes de interação com os grupos catiônicos de um material de revestimento polimérico não peptídico, como acima descrito. Portanto, o glóbulo tem um material de revestimento polimérico não peptídico sobreposto e ionicamente anexado à superfície do glóbulo. O glóbulo revestido tem portanto, uma pluralidade de grupos catiônicos expostos para interação com os grupos aniônicos do componente biológico de interesse na amostra. O componente biológico pode ser então imobilizado na superfície do glóbulo e extraído da amostra.

[0083] O glóbulo pré-revestido preferivelmente compreende um material selecionado do grupo que consiste em vidro, polímeros, sílicas, metais, óxidos de metal e cerâmicos. Em uma modalidade particularmente preferida, o glóbulo compreende um polímero selecionado do grupo que consiste em poliestireno, poliacrilato, polimetacrilato, polietileno, polipropileno, poliéster, poliuretano, poliamida, policarbonato, polidimetilsiloxano, polidialquilsiloxano, celulose, derivados desses, co- polímeros desses e combinações desses.

[0084] Os glóbulos pré-revestidos de acordo com a presente invenção podem ser usados em uma variedade de métodos de extração e separação, como previamente descrito, e como deve ser facilmente percebido por pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, os glóbulos pré-revestidos podem ser usados em vários métodos cromatográficos separatórios. Adicionalmente, os glóbulos pré-revestidos podem ser inseridos em uma amostra e seletivamente removidos para extrair um componente biológico desses.

[0085] De fato, a presente invenção também engloba múltiplas outras modalidades onde um substrato pré- revestido como aqui descrito pode ser usado em um método diagnóstico, e a invenção não é limitada pela presente revelação. Por exemplo, modalidades onde o substrato pré- revestido é uma lâmina de microscópio foram aqui previamente descritas.

[0086] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de análise de uma amostra biológica. O método geralmente compreende o fornecimento de um substrato pré-revestido adaptado para imobilização de uma amostra biológica, onde o substrato é revestido com um material de revestimento polimérico como aqui descrito, imobilização da amostra biológica no substrato pré- revestido, e análise da amostra biológica imobilizada no substrato pré-revestido.

[0087] Em uma modalidade particular, a etapa de análise da amostra biológica imobilizada à lâmina pré- revestida é realizada pelo uso de um instrumento diagnóstico; no entanto, a presente invençãotambém contempla a análise da amostra imobilizada por um indivíduo sem o auxílio de instrumentação adicional (ou seja, pelo uso dos sentidos isoladamente). Exemplos de instrumentos diagnósticos úteis na análise da amostra imobilizada de acordo com o presente método incluem, sem limitação, microscópios (como microscópios a luz ou microscópios eletrônicos), cromatógrafos, espectrômetros, e dispositivos de imagem (como câmeras digitais, câmeras de vídeo e câmeras de dispositivos ligados a carga (CCD)).

[0088] A presente invenção também engloba várias modalidades onde o substrato pré-revestido da invenção tem usos diferentes de usos diagnósticos, como previamente descrito. Por exemplo, em uma modalidade, é fornecido um dispositivo útil para reunir um ou mais contaminantes biológicos. Nessa modalidade, como anteriormente, o substrato compreende um material que tem uma pluralidade de grupos aniônicos e é revestido com um material de revestimento polimérico não peptídico. Modalidade particularmente preferida nessa modalidade, o substrato compreende um material fibroso. O material fibroso pode ser natural ou sintético e pode ser trançado ou não trançado. Exemplos não limitantes de materiais fibrosos úteis como o dispositivo que reúne o contaminante biológico incluem algodão, celulose e polietileno.

[0089] Em uma modalidade preferida, o dispositivo que reúne o contaminante biológico é selecionado do grupo que consiste em gaze, toalhas e ataduras médicas. Conseqüentemente, o dispositivo que reúne o contaminante biológico pode ser usado em amostras de transferência, em procedimentos médicos, e em outras situações onde ele é útil para coletar ou reunir materiais biológicos possíveis ou conhecidos para evitar que o material biológico contamine um material ou área. Por exemplo, o dispositivo que reúne o contaminante biológico pode ser usado para conter a lâmina com uma amostra de DNA nela. Conseqüentemente, evita-se que DNA estranho, como da pessoa que manuseia a lâmina, contamine a amostra de DNA na lâmina. De modo similar, o dispositivo que reúne o contaminante pode ser usado ao redor do campo cirúrgico para coletar material biológico para evitar que o material contamine o campo cirúrgico.

[0090] Em uma modalidade da invenção particularmente preferida, o dispositivo que reúne o contaminante biológico é uma luva, como uma luva cirúrgica. A luva deve compreender um material fibroso revestido com um material de revestimento polimérico como acima descrito. Alternativamente, a luva pode compreender um polímero natural ou sintético (por exemplo, uma luva de “borracha”).

[0091] Modalidades adicionais da presente invenção são mais completamente descritas de acordo com os seguintes exemplos experimentais.

EXPERIMENTAL

[0092] A presente invenção é mais completamente ilustrada pelos exemplos a seguir, que são apresentados para ilustrar a presente invenção e não devem ser interpretados como limitantes dessa.

EXEMPLO 1 Pré-revestimento de lâmina de microscópio de vidro com PDDA

[0093] Na preparação de uma lâmina de microscópio de vidro pré-revestida, uma solução de PDDA em água deionizada foi preparada de modo que a concentração final da solução foi de 1% PDDA (+/- 0,05%) w/v. O pH da solução foi então ajustado para 9,0 (+/- 0,2) pela adição de 1N NaOH.

[0094] A solução de PDDA de pH ajustado foi colocada em um banho de coloração manual de lâmina. Uma bandeja de coloração de lâmina manual foi carregada com lâminas de microscópio de vidro, e a bandeja com as lâminas de microscópio de vidro foi adicionada à solução de PDDA no banho, com a solução cobrindo a lâminas até o lado áspero das lâminas. As lâminas foram deixadas em repouso na solução de PDDA por aproximadamente 10 segundos. A bandeja foi removida do banho, as lâminas foram removidas da bandeja, e a lâminas foram colocadas em uma posição vertical levemente angulada e deixadas para secar em temperatura ambiente. As lâminas com a solução de PDDA aplicada a elas foram secas até a secagem visual então enxaguadas com água deionizada. As lâminas enxaguadas foram deixadas novamente para secar fornecendo lâminas revestidas com PDDA prontas para uso na análise de amostras aniônicas.

EXEMPLO 2 Comparação de lâmina de microscópio revestida com PDDA com lâmina de microscópio revestidas com PLL

[0095] Uma solução de PDDA foi preparada e múltiplas lâminas de microscópio de vidro foram revestidas usando a solução de acordo com o Exemplo 1. Múltiplas lâminas de microscópio adicionais foram revestidas de modo similar usando reagente de revestimento de Lâmina PREPSTAINTM(PLL) (disponível por TriPath Imaging, Inc.).

[0096] As lâminas revestidas com PDDA e as lâminas revestidas com PLL foram separadas em dois grupos. Um grupo de lâminas revestidas com PDDA foi estocado por 16 semanasem temperatura ambiente. Do mesmo modo, um grupo de lâminasrevestidas com PLL foi estocado por 16 semanas emtemperatura ambiente. Um segundo grupo de lâminasrevestidas com PDDA e um segundo grupo de lâminasrevestidas com PLL foi estocado por 5 semanas emtemperatura ambiente e foi estocado por mais 9 semanas a45°C, por um total de 16 semanas de estocagem. Ao final das16 semanas, todos os quatro grupos de lâminas foramremovidos do estoque para teste posterior, como abaixodescrito. Como uma comparação no experimento, um conjunto livre de lâminas revestidas com PLLfoi preparado de acordo com o mesmo método previamente descrito para comparação com os grupos de estabilidade.

[0097] Lâminas de cada um dos cinco grupos acima descritos foram submetidas a um único conjunto de material citológico e subseqüentemente coradas usando o método PREPSTAINTM. As lâminas de todos os cinco grupos foram então comparadas com base na quantidade de material citológico que aderiu à superfície revestida.

[0098] As lâminas revestidas com PLL foram observadas como tendo estabilidade reduzida, que diminui com o tempo e temperatura. Essa estabilidade reduzida foi visivelmente reconhecível da quantidade diminuída de material citológico aderido e corado presente nas lâminas revestidas com PLL. Lâmina 1, a lâmina de controle, foi revestida com PLL no momento da avaliação e não foi submetida ao teste da semana 16. Lâmina 2, revestido com PLL, foi deixada em repouso em temperatura ambiente por 16 semanas. Uma comparação da lâmina 2 com a lâmina 1 indicou menos material citológico corado aderido à lâmina 2, o que indicou uma degradação do polímero que reveste pelo período de 16 semanas. Lâmina 4, também revestida com PLL, permaneceu por 5 semanas em temperatura ambiente e 9 semanas a 45°C. A degradação do polímero nessa lâmina foi ainda mais aparente. A inspeção visual da lâmina 4 indicou apenas mínimo material citológico aderida à superfície da lâmina (ou seja, praticamente nenhum material citológico corado visível).

[0099] A lâmina 3 foi revestida com PDDA e estocada em temperatura ambiente por 16 semanas. A lâmina 5 foi revestida com PDDA, estocada em temperatura ambiente por 5 semanas, e então estocada a 45°C por 9 semanas. As lâminas 3 e 5 indicaram pouca à nenhuma degradação do revestimento. Isso foi aparente pela distribuição completa e uniforme do material citológico corado aderido às lâminas revestidas. Além disso, em comparação com a lâmina de controle recém revestida com PLL (lâmina 1), as lâminas de PDDA, mesmo depois de repousar por 16 semanas, exibiram uma coloração mais intensa do revestimento, indicando uma concentração aumentada do polímero (e assim sítios de ligação catiônica) nas lâminas revestidas com PDDA em comparação com as lâminas revestidas com PLL.

EXEMPLO 3 Comparação de Lâminas de microscópio revestidas usando várias metodologias de revestimento

[00100] Dois conjuntos de lâminas de microscópio foram revestidos com PDDA de acordo com o método da presente invenção e um método previamente descrito. Uma comparação das capacidades de imobilização de uma lâmina é fornecido abaixo.

[00101] Doze lâminas de microscópio de vidro foram revestidas com PDDA de acordo com a presente invenção. Particularmente, uma solução de PDDA 0,25% (w/v) em água deionizada foi preparada e o pH ajustado usando NaOH a um pH final de 9,2. As 12 lâminas de microscópio foram removidas da embalagem como recebido do fabricante e foram especificamente não submetidas a qualquer processo de limpeza antes do revestimento com a solução de PDDA. A seguir, as lâminas não limpas foram manualmente mergulhadas na solução de PDDA, removidas, deixadas para secar em condição ambiente até a secagem visual, e então enxaguadas com água deionizada para remover qualquer PDDA residual. As lâminas enxaguadas foram deixadas para secar antes do uso.

[00102] Doze lâminas de microscópio adicionais forampreparadas de acordo com métodos de preparação conhecidos para comparação com as lâminas revestidas com PDDA da invenção. Primeiro, as 12 lâminas, novas da mesma embalagem e fabricante, foram limpas de acordo com Método 2 revelado por Cras, J.J., e cols., Biosensors & Bioelectronics, 14 (1999) 683-688. As lâminas limpas foram então revestidascom uma solução aquosa de PDDA a 1,0% de acordo com o método fornecido por Seyfert, S., e cols., Biomaterials, 16 (1995) 201-207. Particularmente, as lâminas limpas forammanualmente mergulhadas na solução de PDDA a 1%, removidas da solução, e imediatamente enxaguadas para remover qualquer solução de PDDA residual (ou seja, não foi realizada secagem do revestimento antes do enxágüe). As lâminas enxaguadas foram deixadas para secar antes do uso.

[00103] Para preparar a amostra de células paraimobilização das lâminas de microscópio, três frascos de células controle SiHa (de TriPath Imaging, Inc.) foram obtidos. As células SiHa usadas no experimento foram de uma única linha de células primeiramente descrita em Friedl, F., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 135 (1970) 543-545. osconteúdos dos três frascos foram centrifugados (800g por 10 minutos) para compactar as células em um pélete. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em água deionizada. As células foram então recompactadas em um pélete por centrifugação (800g por 10 minutos). O sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas em aproximadamente 30 mL de água deionizada. Um mL da suspensão de células foi transferido em cada um dos 24 tubos cônicos e as amostras foram processadas de acordo com o protocolo padrão usando um instrumento processador de Lâmina TriPath Imaging PREPSTAINTM(as amostras foram aplicadas às lâminas e coradas).

[00104] Depois das lâminas serem coradas e cobertas,as lâminas foram avaliadas com um “TriPath Imaging FOCALPOINTTMSlide Profiler”. O número de células em cada lâmina foi contado pelo instrumento, e a contagem de células para cada lâmina de microscópio foi extraída da base de dados do instrumento (contagem de células sendo diretamente proporcional ao número de objetos registrado pelo “Slide Profiler”.

[00105] A amostra de células em cada lâmina demicroscópio foi preparada como um círculo uniforme tendo um diâmetro conhecido de 1,3 cm (13 mm). Conseqüentemente, a área de amostra de cada lâmina foi de 1,33 cm2 (132,7 mm2). O número de células imobilizadas em cada lâmina é mostradoabaixo. A Tabela 1 fornece o número de células imobilizadas nas lâminas preparadas de acordo com o método da presenteinvenção, e a Tabela 2 fornece o número de células imobilizadas nas lâminas preparadas de acordo com os métodos previamente descritos. Tabela 1

Tabela 2

[00106] A comparação das contagens de célulasfornecida acima na Tabela 1 e Tabela 2 que usam a distribuição t de Student revela um nível de significância de menos que 0,005. Portanto, as contagens de células ilustram com significância estatística que as lâminas revestidas com PDDA preparadas de acordo com a presente invenção imobilizam um maior número médio de células que as lâminas revestidas com PDDA preparadas de acordo com métodos previamente conhecidos. Em particular, as lâminas revestidas com PDDA da invenção imobilizaram um número médio de células 22,97% maior que o número médio de células imobilizadas nas lâminas revestidas com PDDA preparadas de acordo com os métodos previamente conhecidos.

[00107] Como acima notado, a área de amostra de células em cada lâmina foi de 1,33 cm2(132,7 mm2). Conseqüentemente, é possível calcular o número médio de células imobilizadas em uma dada área de superfície. Com as lâminas preparadas de acordo com a presente invenção, o número médio de células por área de superfície imobilizada foi de 23.475 células/cm2(235,2 células/mm2). Em contraste, as lâminas preparadas de acordo com métodos previamente conhecidos tinham um número médio de células por área de superfície imobilizadas de apenas 19.090 células/cm2(191,3 células/mm2).

EXEMPLO 4 Análise de Lâminas Revestido com PDDA por Absorção de UV de corante Eosina Y adsorvido

[00108] Quinze lâminas de microscópio ESCO (número de catálogo 2951) foram obtidas. Três lâminas foram deixadas como lâminas de controle. As doze lâminas restantes foram divididas em quatro grupos de três lâminas cada. As lâminas do grupo 1 foram revestidas com uma solução de PDDA a 1% em um pH de aproximadamente 9,2. As lâminas revestidas foram deixadas para secar por 1 hora, foram enxaguadas com água deionizada, e deixadas para secar por mais 1 hora. As lâminas do grupo 2 foram revestidas com uma solução de PDDA a 1% em um pH de aproximadamente 9,2. As lâminas revestidas foram imediatamente enxaguadas com água deionizada (sem secagem do revestimento de PDDA), e as lâminas enxaguadas foram deixadas para secar por 1 hora. As lâminas do grupo 3 foram revestidas com uma solução de PDDA a 1% em um pH de aproximadamente 5,3. As lâminas revestidas foram deixadas para secar por 1 hora, foram enxaguadas com água deionizada, e deixadas para secar por mais 1 hora. As lâminas do grupo 4 foram revestidas com uma solução de PDDA a 1% em um pH de aproximadamente 5,3. As lâminas revestidas foram imediatamente enxaguadas com água deionizada (sem secagem do revestimento de PDDA), e as lâminas enxaguadas foram deixadas para secar por 1 hora. As lâminas do grupo 5 (as lâminas de controle) não foram revestidas.

[00109] Todas as lâminas nos 5 grupos acima foram preparadas para tratamento por colocação de cada lâmina em uma base de colocação de lâmina de microscópio Hettich e posicionando uma câmara de ajuste Hettich nas lâminas para isolar uma porção da lâmina. A porção isolada da superfície de cada lâmina foi tratada com 200 μL de uma solução 5% w/v de Eosina Y em água deionizada por 1 minuto. A solução corante foi removida com sucção a vácuo, e cada lâmina foi tratada duas vezes com 2,5 mL de água deionizada, com cada enxágüe durando 1 minuto antes da remoção com sucção a vácuo. Cada lâmina foi então tratada duas vezes com 2,5 mL isopropanol, com cada enxágüe durando 1 minuto antes da remoção com sucção a vácuo. Cada lâmina foi então removida de uma base de lâmina e deixada para secar por pelo menos 10 minutos. Cada lâmina tratada com o corante tinha uma porção corada circular tendo uma área de cerca de 240 mm2, o centro da porção corada circular sendo de aproximadamente 17,5 mm da extremidade curta áspera da lâmina.

[00110] Análise espectrográfica foi realizada com o uso um espectrofotômetro UV-Vis como 542 mn. O instrumento foi zerado usando uma lâmina de vidro plana, não tratada, não revestida. A absorvência medida para cada lâmina (fornecida abaixo na Tabela 6) indicou uma significante diferença entre lâminas revestidas com nenhuma secagem do revestimento polimérico antes do enxágüe e aquelas revestidas pelo método da presente invenção. a adsorção de Eosina Y nas superfícies positivamente carregadas das lâminas revestidas com PDDA foi muito maior nas lâminas que foram deixadas para secar em temperatura ambiente por cerca de 1 hora antes de serem enxaguadas com água deionizada. Tabela 3

[00111] Uma comparação direta de lâminas revestidas sem secagem (Grupo 2) e as lâminas revestidas de acordo com os métodos da presente invenção (Grupo 1), ambas em pH 9,2, indica que o excesso de carga positiva foi cerca de 4,3 (+/- 0,8) vezes maior nas lâminas preparadas de acordo com a presente invenção. De modo similar, uma comparação direta de lâminas revestidas sem secagem (Grupo 4) e a lâminas revestidas de acordo com os métodos da presente invenção (Grupo 3), ambas em pH 5,3, indica que o excesso de carga positiva foi cerca de 4,7 (+/- 3,0) vezes nas lâminas preparadas de acordo com a presente invenção. A contribuição do vidro em si para a absorção de corante Eosina Y é desprezível, como indicado pelos valores de absorção próximos a zero para as lâminas não revestidas (lâminas de controle). A adsorção de corante Eosina Y pode ser, portanto, atribuída apenas às cargas positivas carregadas pelo revestimento de PDDA nas lâminas.

[00112] Várias modificações e outras modalidades da invenção aqui apresentadas virão ao pensamento de pessoa habilitada na técnica à qual essa invenção pertence tendo o benefício dos ensinamentos apresentados na descrição antecedente. Portanto, deve-se compreender que a invenção não deve ser limitada às modalidades específicas reveladas e que modificações e outras modalidades devem estar incluídas dentro do escopo das reivindicações em apêndice. Embora termos específicos sejam aqui empregados, eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não com objetivos de limitação.

Claims (18)

1. Método para a preparação de um substrato revestido adaptado para imobilização de uma amostra biológica, caracterizadopelo fato de que compreende: o fornecimento de um substrato que tem uma superfície que compreende uma pluralidade de grupos aniônicos; o contato do substrato com uma composição que compreende uma solução de um material polimérico de amônio quaternário não peptídico compreendendo pelo menos um monômero selecionado do grupo que consiste de dialildimetilamônio, metilacrilamidopropiltrimetilamônio, metacriloiloxietiltrimetilamônio, 4-vinil- benziltrimetilamônio, acriloxietildimetilbenzil amônio, acriloxietiltrimetil amônio, metacriloxietil dimetilamônio, metacriloxietiltrimetilbenzilamônio, trimetil-2- metacriloiletilamônio, trimetil-2-metacrilaminopropilamônio e misturas desses, o dito material polimérico de amônio quaternário presente em uma concentração de 0,01% (v/v) a 10% (v/v) em solução, a solução tendo um pH de 8 a 14, para formar um revestimento de uma camada única do material polimérico de amônio quaternário não peptídico em pelo menos uma porção da superfície do substrato sem camadas intermediárias de um material de revestimento diferente entrepostas entre duas ou mais camadas de material de revestimento polimérico de amônio quaternário não peptídico e sem camadas adicionais de qualquer material revestido sobre a referida camada do material polimérico de amônio quaternário não peptídico; em que o material de revestimento polimérico de amônio quaternário não peptídico tem um peso molecular médio de 400.000 Da a 500.000 Da; a secagem do revestimento do material polimérico de amônio quaternário não peptídico; e o enxágue do substrato que tem o revestimento do material polimérico não peptídico seco nele, em que o revestimento do material polimérico não peptídico é posicionado para imobilização da amostra biológica e em que o revestimento de material polimérico não peptídico é uma camada única.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa de secagem do substrato revestido é realizada em temperatura ambiente.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que a etapa de secagem do substrato revestido é realizada por um período de tempo de 5 minutos a 1 hora.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a etapa de secagem do substrato revestido é realizada em uma temperatura de 35°C a 120°C.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que a etapa de secagem do substrato revestido é realizada por um período de tempo de 1 minuto a 20 minutos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o substrato é selecionado a partir do grupo que consiste em lâminas, placas, glóbulos, tubos de teste, cadinho, bastões, swabs e gaze.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o substrato é uma lâmina de microscópio.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material polimérico de amônio quaternário não peptídico compreende um copolímero de dialildimetilamônio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material polimérico de amônio quaternário não peptídico compreende um copolímero de dialildimetilamônio e pelo menos um monômero adicional.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material de revestimento polimérico de amônio quaternário não peptídico está presente em solução em uma concentração de 0,15% (v/v) a 0,75% (v/v).

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a superfície do substrato não foi submetida a um processo de limpeza antes do contato do substrato com a solução do material polimérico não peptídico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a superfície do substrato não foi submetida a um processo de limpeza que incorpora um ácido, uma base, ou um solvente orgânico antes do contato do substrato com a solução do material polimérico de amônio quaternário não peptídico.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a superfície do substrato não foi submetida a um processo de sinalização antes do contato do substrato com a solução do material polimérico de amônio quaternário não peptídico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a lâmina de microscópio é uma lâmina de microscópio fabricada previamente em que a lâmina compreende um material selecionado do grupo que consiste em vidro, cerâmica, e materiais poliméricos.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a lâmina compreende um polímero selecionado do grupo que consiste em poliestireno, polihidroxi metacrilato, polietileno tereftalato, politetrafluoroetileno, etileno fluorinado, polidimetilsiloxano, co-polímeros ou terpolímeros desses, e combinações desses.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material polimérico de amônio quaternário não peptídico compreende um polímero selecionado do grupo de polímeros alílicos.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material polimérico de amônio quaternário não peptídico compreende polidialildimetilamônio.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a referida concentração é 0,25% (v/v).