BRPI0509598B1

BRPI0509598B1 - cepa de levedura que produz colesterol, processo de produção de colesterol, de sua mistura isotópica, de um de seus sais de intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcada no 13c ou no 14c e uso de um organismo para a produção do referido colesterol

Info

Publication number: BRPI0509598B1
Application number: BRPI0509598A
Authority: BR
Inventors: Bruno Dumas; Denis Pompon; Roberto Spagnoli
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2016-12-06
Also published as: LT2354218T; US8211676B2; WO2005121315A1; IL178741A; ES2662971T3; IL238365B; ES2390588T3; FR2869914B1; JP2007535960A; RU2006143060A; EP1745123B1; NO20065402L; MXPA06012840A; EP2354218B1; JP2012105651A; RS56952B1; BRPI0509598A; SI2354218T1; KR20070007902A; AR048938A1

Abstract

cepas de lêvedo que produzem colesterol e suas aplicações. a presente invenção refere-se à produção de colesterol em organismos do reino dos fungi. mas particularmente, a presente invenção refere-se a fungus geneticamente modificados que produzem, de maneira autônoma, colesterol a partir de uma fonte de carbono simples. a presente invenção refere-se igualmente à utilização de fungus de acordo com a invenção para a produção de colesterol não marcado e marcado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CEPA DE LEVEDURA QUE PRODUZ COLESTEROL, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE COLESTEROL, DE SUA MISTURA ISOTÓPICA, DE UM DE SEUS SAIS DE INTERMEDIÁRIOS METABÓLICOS, OU DE UMA MISTURA DE ESTERÓIS MARCADA NO 13C OU NO 14C E USO DE UM ORGANISMO PARA A PRODUÇÃO DO REFERIDO COLESTEROL". A presente invenção se refere à produção de colesterol nos organismos do reino dos Fungi. O colesterol (conforme figura 1) é o esterol animal o mais importante. Ele é um componente fundamental das membranas celulares, das quais ele controla a fluidez, e está presente em todos os tecidos animais e particularmente no tecido nervoso. O colesterol é um produto inerte industrial importante. Assim, ele é comumente utilizado na indústria cosmética. Ele é também utilizado na indústria farmacêutica, por exemplo na administração de medicamento ("Drug deliveiY), assim como na coluna celular. O colesterol é assim utilizado na síntese industrial da vitamina D3. Essa vitamina em seguida é utilizada para suplementar o alimento humano (nos produtos leiteiros, por exemplo) e animal. O colesterol é também vantajosamente utilizado como aditivo na alimentação animal, notadamente na alimentação destinada aos camarões de criações.

Atualmente, a imensa maioria do colesterol comercializado é extraída a partir do tecido animal (uma ínfima quantidade é produzida por síntese química). Duas grandes fontes de partida são utilizadas para a extração do colesterol: a medula espinhal de bovinos e a lanolina que é a gordura natural da lã de carneiro. A utilização do tecido animal como produto de partida não é feita sem apresentar problemas. Assim, os recentes problemas ligados à transmissão do microorganismo responsável pelo tremor do carneiro nos bovinos (doença denominada ESB (Encefalopatia Espongiforme Bovina) nos bovinos) lembraram a necessidade de prudência, quando da utilização de tecido animal como matéria-prima. Todavia, apesar das medidas tomadas, 0 risco de transmissão do agente patógeno não pode ser totalmente excluído. Seria, portanto, extremamente vantajoso dispor de uma fonte de colesterol não proveniente de um tecido animal. A presente invenção tem por finalidade fornecer uma fonte de colesterol abundante e segura de um ponto de vista sanitário. Os inventores mostraram, de maneira surpreendente, que é possível desviar a produção natural de ergoesterol nos Fungi para produzir colesterol.

Descrição geral da invenção Um primeiro aspecto da invenção refere-se. a um organismo do reino dos Fungi, produzindo, de maneira autônoma, colesterol.

Um segundo aspecto da invenção refere-se a um organismo do reino dos Fungi tal qual definido acima, caracterizado pelo fato de este último ser geneticamente modificado.

Um terceiro aspecto da invenção refere-se a um organismo do reino dos Fungi, tal como definido acima, caracterizado pelo fato de este último produzir colesterol, a partir de uma fonte de carbono simples. A invenção refere-se também a um organismo do reino dos Fungi, tal como definido acima, expressando as enzimas 7-deidrocolesterol re-ductase e 3p-hidroxiesterol A24-reductase. Mais particularmente, a invenção refere-se a um organismo tal como definido acima, no qual a enzima esterol 24-C-metiltransferase foi inativada e/ou a enzima C-22 esterol desaturase foi inativada.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um organismo do reino dos Fungi, tal como definido acima, caracterizado pelo fato de a expressão das enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3p-hidroxiesterol Δ24- re-ductase ser obtida por transformação do organismo. A invenção refere-se também a um organismo do reino dos Fungi, tal como definido acima, caracterizado pelo fato de a inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase ser realizada por inativação gênica e/ou inativação de enzima C-22 esterol desaturase ser realizada por inativação gênica.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um organismo do reino dos Fungi, tal como definido acima, caracterizado pelo fato de ser escolhido no divisão das Ascomycete, mais particularmente no sub-divisão das Saccharomycotina, ainda mais particularmente na classe das Saccharomy-cetes ou schizosaccharomycetes, ainda mais particularmente na ordem dos saccharomycetales ou dos schizosaccharomycetales, ainda mais particularmente na família dos Saccharomycetaceae ou dos schizosaccharomyceta-ceae, ainda mais particularmente no gênero Saccharomyces ou schizosac-charomyces.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um organismo do reino dos Fungi tal como definido acima, caracterizado pelo fato de se tratar de um lêvedo da espécie Saccharomyces cerevisiae ou schizosaccharomyces pombe. A invenção refere-se também a um processo de produção de colesterol de origem não animal, compreendendo a cultura de um organismo tal como definido acima. Mais particularmente, esse processo é caracterizado pelo fato de a etapa de cultura do organismo ser seguida de uma etapa de extração do colesterol. De maneira preferida, a extração do colesterol é feita por um solvente não miscível na água.

Mais particularmente, o processo, tal como acima, é caracterizado pelo fato de se efetuar uma etapa de saponificação, antes da extração do colesterol. Ainda mais particularmente, o processo tal como definido acima é caracterizado pelo fato de se efetuar uma etapa de moagem mecânica das células, antes da saponificação ou da extração do colesterol.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um organismo do reino dos Fungi, tal como definida acima para a produção de colesterol, ou de um de seus intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcada no 13C ou no 14C. A invenção é também relativa a um processo de produção de colesterol ou de um de seus intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcada no 13C ou no 14C, compreendendo as seguintes etapas: - cultura de um organismo de um dos Fungi, tal como definida acima sobre um substrato marcado no 13C ou no 14C; e - extração desse colesterol, ou de um de seus intermediários metabólicos, ou da mistura de esteróis. A invenção refere-se também a um processo de fabricação de uma mistura isotópica de colesterol, de intermediários ou de metabólitos do colesterol, marcados em diferentes posições com o auxílio de marcadores isotópicos, compreendendo a colocação em cultura de um organismo do reino dos Fungi, tal como definido acima sobre um substrato marcado, depois sobre um substrato não marcado, as durações de cultura de substrato sendo escolhidas a fim de se obter um perfil isotópíco definido. A invenção refere-se também a uma amostra de moléculas de colesterol, de intermediários ou de metabólitos do colesterol marcadas em diferentes posições com o auxílio de marcadores isotópicos apresentando um perfil isotópíco definido e capaz de ser obtido por esse processo de fabricação. A invenção refere-se também a uma composição contendo, a título do marcador de traçabilidade, uma mistura isotópica de colesterol, de intermediários ou de metabólitos do colesterol, marcadas em diferentes posições com o auxílio de marcadores isotópicos e apresentando um perfil iso-tópico definido. Mais partlcularmente, essa composição é destinada ao domínio da alimentação ou da terapia humana ou animal.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a produção de colesterol em organismos do reino dos Fungi. Nos Fungi, não se encontra colesterol no estado natural, este sendo um esterol animal. O esterol majoritário das membranas celulares desses organismos é o ergoesterol. A presente invenção permite realizar a síntese de colesterol, pela multiplicação de Fungi, em presença de uma fonte de carbono simples. O método proposto pela presente invenção permite, portanto, obter uma grande quantidade de colesterol, a baixo custo, já que o processo utiliza a cultura de organismos do reino dos Fungi e o acréscimo de uma fonte de carbono simples, facilmente disponível no comércio.

Por fonte de carbono simples, segundo a presente invenção, são entendidas fontes de carbono utilizáveis pelo técnico para o crescimento normal de um fungus e notadamente de um lêvedo. Entende-se designar notadamente os diferentes açúcares assimiláveis, tais como a glicose, a ga-lactose ou a sacarose, ou os melaços, ou subprodutos desses açúcares. Uma fonte de carbono simples particularmente preferida é o etanol e o glice- rol. O fato de a produção ser efetuada de maneira autônoma significa que não há necessidade de acrescentar substratos para se obter o coles-terol, mas que o organismo pode produzi-lo unicamente a partir da fonte de carbono simpies de partida. É também ciara que a cepa pode produzir o co-lesterol, pela utilização de um substrato situado a montante na via metabóli-ca, à medida que a cepa do organismo, segundo a presente invenção, contém todos os genes necessários à complexão da via metabólica de produção do colesterol. A invenção refere-se notadamente a um organismo do reino dos Fungi (um fungus) geneticamente modificado que produz, de maneira autônoma, colesteroi a partir de uma fonte de carbono simples.

Um certo número de modificações genéticas dos fungus pode ser feito, a fim de desviar a via metabólica natural de produção do ergoeste-rol para a produção de colesterol. A presente invenção refere-se assim a um organismo do reino dos Fungi geneticamente modificado, expressando as enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesteroI A24-reductase. A cepa do organismo do reino dos Fungi assim modificada produz colesterol. A requerente pôde com efeito modelar, graças aos resultados obtidos (conforme a parte exemplo do presente pedido), levando a via metabólica ao ergo-esterol e a determinados de seus derivados (conforme figura 2). A expressão das enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3p-hidroxiesterol A24-reductase no fungus S. cerevisiae pode permitir a produção de colesterol, desviando uma parte da via de biossíntese do ergoesterol. A enzima 7-deidrocolesterol reductase porta o número EC: 1.3.1.21 na classificação internacional das enzimas (Enzyme Classification). Ela é também denominada delta-5,7-esterol-delta-7-reductase, 7-DHC reductase ou Esterol delta-7- reductase e será também denominada Delta-7 esterol reductase, Delta-7Red, Delta 7 Reductase ou A7-reductase na se-qüência desse documento. Essa enzima catalisa no estado natural nas plantas, por exemplo, a redução NADPH dependente do delta 5,7-colestadieno em delta 5 colestaenol ou a redução de intermediários esterólicos que pos- suem a dupla ligação em 7-8 (Taton and Rahier, 1991). O gene codificando para a enzima 7-deidrocolesterol reductase foi isolado pela primeira vez na planta Arabidopsis thaliana, o isolamento do gene correspondente e a expressão dessa enzima no lêvedo Saccharomyces cerevisiae é descrita na patente EP 727 489. As seqüências desse gene e da proteína são acessíveis ao seguinte número de acesso: U49398 (Lecain et ai, 1996).

Um certo número de homólogos desse gene foi descrito em outras espécies. Trata-se, por exemplo, do gene homólogo no homem (cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número Gen Bank AF034544, a sequência protéica ao número GenBank: AAC05086) (Moebius ef ai, 1998). Do gene homólogo no rato Rattus norvegicus (cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número GenBank: AB016800, a seqüência protéica ao número GenBank: BAA34306). Genes homólogos foram também identificados na galinha Gallus gallus com a referência GenBank BM490402 ou no Sapo Xe-nopus laevis com a referência GenBank BI315007 ou o peixe zebra Danio rerío com a referência GenBank BQ132664. Encontra-se também um gene codificando para uma atividade delta 7 esterol reductase nas plantas como o arroz Oryza sativa com a referência GenBank CA753545, a batata Solanum tuberosum com a referência GenBank BF342071. Esse gene codificando para uma atividade delta7 esterol reductase pode ser também encontrado no protista Mastigomoeba balamuthi com a referência GenBank BE636562. O técnico poderá isolar facilmente outros genes homólogos codificando para a enzima 7-deidrocolesterol reductase em outros organismos. Ele poderá notãdamente se referir ao método de clonagem descrita no e-xemplo 1 da patente EP 727 489, que descreve um método de clonagem que permite isolar um ADNc codificando para uma proteína tendo uma atividade delta-5,7-esterol-delta-7-reductase. O técnico poderá também facilmente determinar a atividade 7-deidrocolesterol reductase das proteínas correspondentes notadamente utilizando-se o teste de atividade também descrito no exemplo 1 da patente EP 727 489. A expressão da enzima 7-deidrocolesterol reductase em um organismo do reino dos Fungi, segundo a invenção, pode ser obtida por qual- quer meio conhecido do técnico. Pode tratar-se, em particular, da transformação do organismo por uma construção, comportando uma cassette de expressão constituída de um promotor de transcrição, de preferência, homóloga, da fase aberta de leitura codificando para a enzima 7-deidrocolesterol reductase e de um terminador de transcrição adaptado segundo as regras habituais conhecidas do técnico. Como promotor homólogo; utilizar-se-á em geral um promotor adequado para permitir uma expressão suficiente e funcional da proteína heteróioga. O promotor pode ser, por exemplo, o promotor PGK, o promotor ADH, o promotor CYC1, o promotor GAL10/CYC1, o promotor TDH3 ou o promotor TPI. O terminador pode ser, por exemplo, o terminador do gene da fosfoglicerata quinase (PGK). Essa cassette de expressão pode ser integrada sob a forma de uma ou várias cópias no genoma nuclear ou mitocondrial do hospedeiro, ou portador por uma estrutura artificial do tipo cromossoma artificial de lêvedo (YAC) ou ser portada por um elemento genético epissomal como plasmídeo. Para realizar esse tipo de expressão dos lêvedos do tipo Yarrowia lipolitica, Kluyveromyces lactis ou Pi-chia pastoris podem, por exemplo, ser utilizadas.

Preferencialmente, a enzima 7-deidrocolesterol reductase expressa é a enzima da planta Arabidopsis thaliana (um exemplo de modo de expressão dessa enzima no lêvedo Saccharomyces cerevisiae é descrito na patente EP 727 489). Pode, todavia, tratar-se de qualquer enzima homóloga ou não, natural ou artificial que apresenta a mesma atividade enzimática. A enzima 3 β-hidroxiesterol A24-reductase, também denominada DHCR24 ou 24-de-hidrocolesterol reductase, catalisa no estado natural a redução do desmoesterol (colesta 5,24 dienol) ou dos derivados do lanoeste-rol que possui uma dupla ligação em 24-25 sobre a cadeia lateral (por e-xemplo o 14 desmetil-lanoesterol, o zimoesterol ou o colesta 7, 24 dienol), redução necessária à biossíntese de colesterol no homem notadamente (Waterham HR. et al., 2001). Essa enzima será também denominada delta 24-(25) esterol reductase, delta 24 esterol Reductase ou A24-reductase na seqüência desse documento. O gene codificando para a enzima e 3p-hidroxiesterol Δ24- reductase foi isolado pela primeira vez no homem, o isolamento do gene correspondente e a expressão dessa enzima no lêvedo Saccharomyces cerevi-siae é descrita na publicação Waterham HR. et a/., 2001. As seqüências desse gene e da proteína são acessíveis aos números de acesso GenBank seguinte: NM_014762 e NP_055577.

Um certo número de homólogos desse gene foram descritos em outras espécies. Trata-se, por exemplo, do gene homólogo no rato (Mus musculus) (cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número GenBank: NM_053272, a seqüência protéica ao número GenBank: NP_444502). Homólogos foram descritos no verme Caenorhabditis elegans e notadamente um ADN complementar com a referência GenBank AF026214. Seqüências homólogas foram também descritas nas plantas como o algodão Gossypium hirsutum com a referência GenBank AAM 47602.1, o arroz Orysa sativa com a referência GenBank AAP53615, a ervilha Pisum satinum com a referência GenBank AAK15493, O técnico poderá isolar facilmente outros genes homólogos codificando para a enzima 3β-hidroxiesterol delta 24-reductase em outros organismos. Poderá notadamente se referior ao método de clonagem descrito na publicação Waterham HR. et ai., 2001. O técnico poderá também facilmente determinar a atividade 3p-hidroxiesterol A24-reductase das proteínas correspondentes notadamente, utilizando-se o teste de atividade também descrito na publicação (Waterham et ai., 2001). A expressão da enzima 3p-hidroxiesterol A24-reductase em um organismo do reino dos Fungi, segundo a invenção, pode ser obtida por qualquer meio conhecido do técnico. Pode tratar-se, em particular, dos meios descritos acima no que se refere á expressão da enzima 7-deidrocolesterol reductase.

Preferencialmente, a enzima 3p-hidroxiesterol A24-reductase expressa é a enzima humana. Um exemplo de isolamento do gene correspondente e de expressão dessa enzima no lêvedo Saccharomyces cerevisi-ae é descrito na publicação Waterham HR. et a/., 2001. Pode, todavia, tratar-se de qualquer enzima homóloga ou não, natural ou artificial, apresentando a mesma atividade enzimática.

Vantajosamente, os organismos do reino dos Fungi, segundo a presente invenção expressam as enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase e apresentam, além disso, uma inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase. A enzima esterol 24-C-metiltransferase porta o número EC-2.1.1.41 na classificação internacional das enzimas (Enzima Classificação). Ela é também denominada ERG6p, Delta(24)-metiltransferase, Delta (24)-esterol metiltransferase, Zymosterol-24-metiltransferase, S-adenosil-4-metionina: esterol delta (24)-metiltransferase, SMT1, 24-esterol C-metiltransferase, S-adenosil-L-metionina: delta(24(23))-esterol metiltransferase ou Fitosterol metiltransferase. Essa enzima catalisa no estado natural de metilação em C-24 do zimoesterol, levando à formação de fecoesterol. O gene codificando para a enzima esterol 24-C-metiltransferase foi denominado Erg6 no lêvedo Saccharomyces cerevisiae. A seqüência desse gene é acessível ao seguinte número de acesso GenBank: NP_013706 (Bowman etal., 1997), (Goffeau et ai., 1996).

Um certo número de homólogos desse gene foi descrito em outros Fungi. Trata-se, por exempio, do gene homólogo em Schizosaccharomi-ces pomba (cuja seqüência nucieotidica é acessível ao número GenBank Z99759, a seqüência protéica ao número GenBank: CAB16897) (Wood et ai., 2002). O gene homólogo em Neurospora crassa (cuja seqüência nucleo-tídica é acessível ao número GenBank: NCB24P7, a seqüência protéica ao número GenBank: CAB97289). O gene homólogo em Candida albicans (cuja seqüência nucieotidica é acessível ao número GenBank: AF031941, a seqüência protéica ao número GenBank: AAC26626) (Jensen-Pergakes et ai, 1998). Genes codificando para uma enzima homóloga a ERG6 foram também descritas em Candida lusitaniae com a referência GenBank A-A0219365.1 e também em Pneumocystis carinii (Kaneshiro et ai, 2002) ou em Kluveromyces lactis (Ozier-Kalogeropoulos etal, 1998). O técnico poderá isolar facilmente outros genes homólogos do gene Erg6 nos organismos do reino Fungi O técnico poderá também facil- mente determinar a atividade esterol 24-C-metiltransferase das proteínas correspondentes notadamente, utilizando-se como teste de atividade a com-plementação funcional de uma cepa de lêvedo disruptada para esses genes. A complementação é então, atestada pela formação de esteróis ramificados em posição 24 em particular de esteróis de tipo ergosta- portando um grupamento metileno em posição 24-28. A presença de uma atividade biológica esterol 24-C-metiltransferase de tipo ERG6 será também determinada in vi-tro graças às técnicas desenvolvidas por (McCammon et ai, 1984) ou por Taylor et Parks (Taylor and Parks, 1978). Por outro lado, os esteróis produzidos e substrato da enzima ERG6 serão separados por cromatografia em fase gasosa, segundo a técnica desenvolvida por Nes in (Methods in Enzy-mology Steroids and Isoprenoids Volume 111 part B, 1985"A comparison of Methods for the Identification ofSteroIs" pp3-37). A cepa de organismo do reino dos Fungi, segundo a presente invenção expressando as enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase e apresentando, além disso, uma inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase produto do colesterol. A requerente pôde, com efeito, determinar que, de maneira surpreendente, a inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase bloqueia a via de biossíntese do ergo-esterol a montante e permite uma produção aumentada em colesterol pela cepa de fungus (conforme a parte exemplo do presente pedido). A expressão das enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase é realizada conforme descrito acima. A inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase pode ser realizada por qualquer meio conhecido do técnico, Pode tratar-se, em particular, da introdução por mutagênese de uma mutação sem sentido, de uma inserção ou de uma deleção, provocando uma mudança de quadro de leitura no gene codificando essa proteína.

Pode tratar-se também da expressão de um ARN anti-sentido complementar do ARN messager codificando essa proteína ou do sistema de extinção gênica conhecido do técnico sob o nome de RNAi (small interfe-ring RNA) e dos sistemas enzimáticos associados, caso estes não existam naturalmente no hospedeiro. A mutagênese pode ser feita na seqüência codificando ou em uma seqüência não codificante, de maneira a tomar inativa a proteína codificada ou a impedir sua expressão ou sua tradução. A mutagênese pode ser feita in vitro ou in situ, por supressão, substituição, deleção e/ou adição de uma ou várias bases no gene considerado ou por inativação gênica.

Pode tratar-se, em particular, da introdução de um ADN exógeno na seqüência codificante ou promotora (por exemplo uma cassette de expressão com promotor e/ou terminador homólogo e uma parte codificante heterólogo). A cassette de expressão permite vantajosamente a expressão de um marcador de seleção. Também é possível modificar o promotor do gene, a fim de reduzir o nível de expressão. Para os Fungi, a inativação é feita também por interrupção da seqüência codificante pela seqüência codificante de um gene marcador heterólogo ou homólogo. As principais técnicas para interromper um gene de Fungi são descritas no artigo de Johnston et al (2002) (Methods in Enzymology Volume 350 Edited by Christine Guthrie and Gerry Fink; "Gene disruption”; M. Johnston, L. Riles, J. Hegemann pp 290-315).

Vantajosamente, os organismos do reino dos Fungi, segundo a presente invenção expressam as enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase e apresentam, além disso, uma inativação da enzima C-22 esterol desaturase. A enzima C-22 esterol desaturase é também denominada ERG5p, Cyp61, cytochrome p-45061, esterol delta22-desaturase. Essa enzima catalisa no estado natural a conversão da ergosta~5,7,24(28)-trienol em ergosta-5,7,22,24(28)-tetraenol, acrescentando uma dupla ligação em posição C22 (conforme figura 2). O gene codificando para a enzima C-22 esterol desaturase foi denominado Erg5 no lêvedo Saccharomyces cerevisiae. A seqüência desse gene é acessível ao seguinte número de acesso GenBank: U34636. A seqüência da proteína correspondente é acessível aos números de acesso GenBank a seguir: AAB06217(Skaggs et al., 1996) ou P54781 (Bowman et al., 1997).

Um certo número de homólogos desse gene foi descrito em outros Fungi. Trata-se, por exemplo, do gene homólogo em Schizosaccha-romyces pombe ( cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número Gen-Bank Z98974, a seqüência protéica ao número GenBank: CAB11640) (Wood et al., 2002). O gene homólogo em Symbiotaphrína buchnerí (cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número GenBank: AB086896, a seqüência pro-téica no número GenBank; BAC01142) (Noda e Koizumi, 2003). O gene homólogo em Symbiotaphrína Kochii (cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número GenBank: AB086890, a seqüência protéica ao número GenBank: BAC01139) (Noda e Koizumi, 2003). O gene homólogo em Candida albicans (cuja seqüência nucleotídica é acessível ao número GenBank: AL033396, a seqüência protéica ao número GenBank: CAA21953) (Tait et al., 1997). O gene ERG5 foi também descrito em Candida lusitaniae com a referência GenBank AAO48601. O técnico poderá isolar facilmente outros genes homólogos do gene ErgS nos organismos do reino Fungi. O técnico poderá também facilmente determinar a atividade C-22 esterol desaturase das proteínas correspondentes notadamente utilizando-se o teste de atividade descrito por Skaggs, B.A., et al., 1996. Essa atividade poderá também ser colocadas em evidência por complementação funcional de um lêvedo S. cerevisiae previamente disruptada ao nível do gene erg5. Essa complementação será atestada pela presença na cepa complementada de ergosta 5, 7, 22 trienol. A atividade C-22 esterol desaturase pode ser medida in vitro, utilizando o método descrito por Kelly e Baldwin et ai JBC (1997) após lise dos lêvedos (Kelly et al., 1997). A cepa de organismo do reino dos Fungi segundo a presente invenção, expressando as enzimas 7-deidroco!esterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase e apresentando, além disso, uma inativação da enzima C-22 esterol desaturase produto do colesterol. A requerente pôde com efeito determinar que a inativação da enzima C-22 esterol desaturase bloqueia vantajosamente a conversão do colesterol em colesta 5, 22 dieneol e permite uma estabilização da produção em colesterol (conforme a parte exemplo do presente pedido) esse bloqueio intervém também ao nível da conversão do colesta 5,7 dienol, um precursor do colesterol em colesta 5, 7, 22 trienol, um precursor do colesta 5,22 dienol, De maneira surpreendente, a enzima C-22 esterol desatürase aceita, com efeito, como substrato o colesterol que ela converte em colesta 5, 22 dieneol. Essa reação parasita pode ser eliminada por inativação da enzima-22 esterol desatürase, tal que pôde ser determinado pela requerente. A expressão das enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase é feita conforme descrito acima. A inativação da enzima C-22 esterol desatürase pode ser realizada por qualquer meio conhecido do técnico. Pode tratar-se em particular dos métodos descritos acima referente à inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase.

Vantajosamente, os organismos do reino dos Fungi, segundo a presente invenção expressam as enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase e apresentam, além disso, uma inativação da enzima C-22 esterol desatürase e uma inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase. Essas cepas apresentam, com efeito, as vantagens acumuladas das duas inativações e são cepas produtoras de colesterol. A expressão das enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3β-hidroxiesterol A24-reductase e a inativação das enzimas C-22 esterol desa-turase e esterol 24-C-metiltransferase são realizadas conforme descrito acima.

Em um modo de realização, o colesterol está presente na cepa de organismo, segundo a presente invenção em uma proporção superior a 20%, de preferência 35%, de forma a mais preferida 50% ou mais do total dos esteróis produzidos pela cepa, segundo a invenção (notadamente os intermediários de síntese).

Preferencialmente, os organismos do reino dos Fungi, segundo a presente invenção, são escolhidos no divisão dos Ascomycetes, de maneira mais preferida, são escolhidos no sub-divisão dos Saccharomycotina, de maneira ainda mais preferida, são escolhidos na classe dos Saccharomyce- tes ou schizosaccharomycetes, de maneira ainda mais preferida são escolhidos na ordem das Saccharomycetales ou dos schizosaccharomycetates, de maneira ainda mais preferida são escolhidos na família dos Saccharomy-cetaceaa ou dos schizosaccharomycetaceae, de maneira ainda mais preferida são escolhidos no gênero Saccharomyces ou schizosaccharomycas, de maneira inteiramente preferida os organismos do reino dos Fungi, segundo a invenção, pertencem a espécie Saccharomyces cerevisiae ou schizosaccha-romyces pombe. A presente invenção refere-se também a um processo de produção de colesterol de origem não animal, compreendendo as seguintes etapas: - cultiva-se um organismo do reino dos Fungi, tal como descrito acima; - extraí-se o colesterol produzido por esse organismo. A extração é baseada no tratamento do fungus por um solvente do colesterol de preferência não miscível na água. Esse tratamento pode ser preferencialmente associado a um método qualquer de moagem mecânica das células. Mais preferenciaimente o fungus será tratado antes da extração pelo solvente por uma mistura de saponificação destinada a liberar o colesterol eventualmente ligado a outros componentes celulares como, particular, os ácidos graxos. Essa mistura de saponificação poderá ser constituída de uma base por exemplo amoníaca, soda, potassa dissolvida na água ou mais preferencialmente em um solvente orgânico miscível na água como, por e-xemplo, o metanol ou o etanol, ou uma mistura solvente-água. A saponificação poderá ser feita sem ou preferencialmente com aquecimento a uma temperatura de 60-120 °C, à pressão atmosférica ou sub-pressão. A extração pelo solvente não miscível na água poderá ser substituída por uma extração em fase sólida sobre uma resina hidrófoba. Um método de extração dos esteróis é descrito por L. Parks e colaboradores (1985) (Methods in Enzymology 111 Edited by L Rilling, L Parks, C. Bottema, R. Rodriguez and Thomas Lewis pp 333-339). O colesterol bruto assim obtido poderá ser purificado por quais- quer métodos conhecidos do técnico em particular aquela descrita por Bosel-li E, Velazco V, Caboni Mf et LerckerGJ Chromatogr A. 2001 May 11 ;917 (1-2): 239-44.

Outros métodos poderão também ser aplicados como aquele descrito para a extração do colesterol a partir de lã de carneiro. O técnico poderá notadamente se referir aos métodos descritos nas patentes americanas US 2,688,623 ou US 2,650,929 ou nas patentes britânicas GB690879, GB646227 ou GB613778.

Um outro aspecto da invenção se refere à utilização das cepas, segundo a presente invenção, a fim de se obter o colesterol ou um de seus intermediários metabólicos, ou uma mistura de esteróis marcada. Entende-se por intermediário metabólico do colesterol, notadamente os esteróis especificados na figura 2. Pode tratar-se notadamente de colesta 8,24 (25) di-eneol, colesta 7, 24(25) dieneol, colesta 5, 7,24(25) trieneol, colesta 5, 24(25) dieneol, colesta 5,22 dieneol. O princípio da obtenção de um colesterol marcado é descrito na figura 10. Essa manipulação consiste inicialmente fazer aumentar a cepa de fungus sobre um substrato totalmente marcada. As células são em seguida colocadas em cultura sobre um substrato não marcado. Há assim mudança de marcação isotópica da fonte de carbono, segue-se a síntese de novo de intermediários metabólicos, depois de esterol, incluindo o colesterol e comportando uma mudança progressiva de marcação. Trata-se, portanto, de um perfil complexo, mais perfeitamente determináve! experimentalmente, que representa uma assinatura isotópica única que depende ao mesmo tempo: - do protocolo de marcação e, em particular, das durações e das condições de cultura em substrato marcado e não marcado; - da estrutura genética precisa da cepa utilizada; - do tempo preciso de parada das culturas.

Uma vez a cultura parada (por exemplo por lise celular ou por parada da cultura em presença de concentração subletal de produtos anti-fúngicos citotóxicos ou citostáticos), o colesterol marcado ou um de seus intermediários metabólicos, ou uma mistura de esteróis marcado é extraída e purificada conforme descrito acima. O perfil isotópico do colesterol marcado ou de um de seus intermediários metabólicos, ou da mistura de esteróis marcada tem várias propriedades únicas: - é modulável à vontade, atuando sobre as condições de cultura, a cepa utilizada e o esterol é escolhido. Um registro de marcadores único pode, portanto, ser produzido; - é combinável, a saber que várias assinaturas isotópicas correspondentes a vários esteróis únicos marcados por perfis isotópicos, eles próprios moduláveis podem ser combinados para formar um "alfabeto molecular" - é reprodutível e fácil de determinar experimentalmente - ele corresponde a uma mistura molecular traçador fácil de isolar, estável, incolor e inodoro, não volátil, não tóxica e incorporável a alimentos, medicamento, aditivos ou outros produtos assimiláveis pelo homem - é infalsificável, salvo em dispor das cepas recombinantes específicos e das condições muito precisas de marcação, de cultura e de extração. Além disso, o conhecimento da assinatura isotópica não permite remontar aos parâmetros que permitiram produzi-lo.

Assim, um "alfabeto isotópico" infalsificável, de uso geral e incorporável em qualquer tipo de produtos, aí compreendidos consumiveis pode ser obtido facilmente graças à presente invenção. As "palavras isotópicas" constituíveis a partir desse alfabeto são em número quase ilimitado, aproveitando, ao mesmo tempo, os perfis de marcação e os diferentes tipos de esteróis. A incorporação dessas assinaturas no meio de produtos os mais variados constituem, portanto, um método único de marcação infalsificável, contrariamente, por exemplo, às assinaturas ADN que podem ser reproduzidas uma vez conhecidas. A assinatura pode ser lida, por outro lado, de maneira não destrutiva, por exemplo por ionização laser seguida de análise por espectrometria de massa (MALDITOF ou assimilado). A utilização de substrato marcado com 13C em lugar das fontes de carbono não marcada para a cultura das cepas de fungus, de acordo com a invenção, permite a síntese de esteróis e, em particular, de colesterol muito fortemente marcado (compreendendo pelo menos 95% de carbono 13C). O preparo de esteróis e de colesterol radioativo 14C é também possível pela mesma abordagem. O processo pode também ser incorporado a cepas de lêvedos, produzindo esteróides e notadamente da hidrocortisona (conforme pedido de patente WO 02/061109) para produzir esteróides marcados no 13C ou no 14C por exemplo para testes RIA.

Legenda das figuras Figura 1: fórmula química do colesterol, assim como a nomenclatura geralmente utilizada para a numeração dos diferentes carbonos e o nome dos diferentes ciclos. Os quatro ciclos da molécula de colesterol são denominados respectivamente A, B, C e D e os carbonos são numerados de 1a 27.

Figura 2: esquema simplificado da parte tardia da via de biossín-tese dos esteróis de tipos ergosta- e colesta- nos lêvedos naturais ou modificados. O esquema não é exaustivo, mas permite definir as etapas fazendo intervir as enzimas citadas nesse documento. As proteínas ERG2p, ERG3p, ERG5p e ERG6p são proteínas de fungus ou lêvedo, enquanto que as proteínas Delta-7Red (Delta-7 esterol reductase), Delta 24-(25)Red (Delta 24-(25) esterol reductase) são proteínas heterólogas de origem de mamíferos ou de plantas.

Figura 3. Perfil comparado em HPLC com detecção UV a 206 nm dos esteróis livres das cepas derivadas da cepa BMA64 e identificação desses esteróis. As cepas estudadas são as seguintes: WGIF01 (cepa BMA64 disruptada no gene erg6 (conforme exemplo 1)), WGIF02 (cepa BMA64 disruptada no gene erg6 e expressando a A24-reductase, Exemplo 12), WGIF03 (cepa BMA64 disruptada no gene erg6 e expressando a Δ7-reductase, Exemplo 13), WGIF04 (cepa BMG64 disruptada no gene erg6 e expressando a A7-reductase e a A24-reductase, Exemplo 14). C5: colesta 5 eneol (colesterol): C5,22: colesta 5,22 dieneol; C5,24: coleta 5,24 dieneol (desmoesterol); C8,24: colesta 8,24 dieneol (zimoesterol); G5,7,22: colesta 5,7,22 trienol; C5.7.24: colesta 5,7,24 trienol; C5,22,24: coleta 5,22,24 trie- no!; C5,7,22,24: colesta 5,7,22,24 tetraenol; lan: lanoesterol.

Figura 4. Perfil comparado em HPLC com detecção UV a 206 nm dos esteróis livres da cepa WGIF04 (cepa BMA64 disruptada no gene erg6 e expressando a Δ 7-reductase reductase e a A24-reductase, o exemplo 14) depois de 0,2,4,8,24 horas de indução pela galactose. Delta: cepa WGIF01 (Exemplo 1). Para a cepa WGIF04, as retiradas são feitas 0, 2,4,8 e 24 horas após a oscilação da fonte de carbono em galactose. O perfil da cepa BMA64 portando a disrupção erg6 (WGIF01) apresentado é aquele obtido imediatamente após oscilação em galactose. Esse perfil permanece praticamente inalterado durante a indução (0-24 horas). O sinal de absorção a 206 nm corresponde a coeficientes de absorção variáveis de um esterol ao outro. C5: colesta 5eneol (colesterol); C5,22: colesta 5,22 dieneol C5,24: colesta 5,24 dieneol (dismosterol); C8,24:colesta 8,24 dieneol (Zimosterol); C5,7,22: colesta 5,7,22 trienol; C5.7, 24: colesta 5,7,24 trienol; C5,22,24: colesta 5,22,24 trienol; C5,7,22,24: colesta 5,7,22,24 tetraenol; lanoesterol.

Figura 5: perfil comparado em HPLC com detecção em eletros-pray com ionização positiva (espectrometria de massa) dos esteróis livres da cepa WGIF04 (Exemplo 14), após 0,2,4,8,24 horas de indução pela galactose. Δ: cepa WGIF01. C5: colesta 5eneol (colesterol): C5,22: colesta 5,22 dieneol; C5, 24: colesta 5,24 dieneol (desmoesterol): C8,24: colesta 8,24 dieneol (zymosterol). Os perfis HPLC provêm da mesma forma testes que a-queles da figura 4.

Figura 5A (esquerda): detecção de m/z = 367, Figura 5B (direita) m/z = 369.

Ordenado: número de íons computados/segundo. Abscissa: duração de purificação em minutos.

Figura 6: detalhe do perfil de m/z = 369 em HPLC para as três cepas: WGIF01, CA10 portando o plasmídeo de expressão para a delta 24 esterol Reductase e para WGIF04, o colesterol é injetado como padrão interno. As quantidades de esteróis totais injetadas para as três cepas correspondem a extrações feitas a partir das quantidades idênticas de cultura medidas pela absorbância a 600 nm.

Figura 7: perfis comparados dos esteróis totais (livres e ésteres) em cromatografia fase gás das cepas WGIF01 (deleção de erg6), WGIF02 (deleição de erg6 com expressão da A24-reductase), WGIF03 (deleição de erg6 com expressão da A7-reductase), WGIF04 (deleição de erg6 com expressão da A24-reductase e da A7-reductase) e CA10 pYESJMa24 (fundo genético FY1679, deleção de ergõ com expressão da A24-reductase, Δ-7 reductase, ergõ). As escalas de resposta (correntes de ionização de chama) são arbitrárias. Os perfis só devem ser comparados de maneira qualitativa de uma cepa à outra. A escala de tempo de retenção é, todavia, a mesma para todas as cepas (os tempos de retenção são expressos em minutos). A identificação dos esteróis é feita, segundo os critérios descritos no presente pedido.

Figura 8. Repartição quantitativa dos principais esteróis livres nas cepas de lêvedo (BMA64 (Figura 8A), WGIF01 (figura 8B), WGIF02 (figura 8C) e WGIF03 (Figura 8D) avaliada sobre a base dos espectros UV. A repartição é dada em % da totalidade das espécies apresentadas na figura e que são as únicas detectáveis em quantidades apreciáveis. Na ausência de padrão para vários dos esteróis intermediários a quantificação é feita sobre a base dos espectros UV associados a cada um dos picos do cromatograma HPLC, utilizando os coeficientes de absorção avaliados dados abaixo (conforme mesa 1, os coeficientes de absorção são expressos em mM por litro e por cm). Para fazer isto, os coeficientes de absorção correspondentes aos motivos estruturais insaturados presentes na estrutura de um esterol determinado são buscados na tabela 1 e eventualmente adicionados (caso vários motivos estão presentes em uma mesma molécula) para fornecer uma avaliação do coeficiente de extinção de cada tipo de esterol. A avaliação é feita, utilizando-se os valores de 280 nm, se pelo menos um motivo absorvente nesse comprimento de onda está presente, na falta de absorção nesta, o comprimento de onda 206 nm é utilizado para avaliar as concentrações de cada um dos esteróis a partir dos sinais de absorção respectivos em HPLC.

Figura 9. Repartição quantitativa dos principais esterójs livres na cepa de lêvedo WGIF4 avaliada sobre a base dos espectros UV. As quantifi- cações são feitas da mesma forma que descrita na figura 8.

Figura 10. Princípio da marcação isotópica dos esteróis por substituição de fontes de carbono.

Figura 11. Avaliação dos perfis de marcação isotópica do coles-terol produzido na cepa WGIF04, após 4,8 e 24 horas de indução. Os esteróis iivres são extraídos e separados por HPLC conforme descrito. Um espectro de massa entre os valores de m/z 300 e m/z = 450 é adquirido a cada 0,2 segundos durante a purificação. Esses espectros são então mediana-mente colocados em janelas de 1,8 segundos, depois submetidos a uma regressão multilinear, utilizando como base de regressão um conjunto de 24 vetores que representam as distribuições teóricas de massa de colesterol marcado para uma incorporação ao acaso por tiragens independentes do carbono 13 em cada uma das 27 posições da molécula com uma probabilidade de marcação sobre cada carbono variável entre 0 e 1 segundo o vetor considerado. As probabilidades de marcação dos diferentes vetores utilizados como base são escolhidas de tal forma que o coeficiente de cross-correlação dos distribuidores de dois vetores consecutivos da base seja de 0,92, a base acionando com um vetor correspondente a uma probabilidade de presença de 100 % a todas as posições para o carbono 12.0 ajuste mul-tilinear é feito com base em um critério estatístico de menor quadrado, anulando os termos não diagonais da matriz dos produtos dos derivados parciais do método de Gauss (filtragem numérica máxima). Após análise, os espectros de massa são então reconstruídos sobre a base otimizada. As curvas representadas nas figuras representam, portanto, o resultado da reconstrução filtrada ótima, após normalização da amplitude máxima ao valor 100.

Para cada tempo de indução as duas curvas representam dois perfis independentes correspondentes a tempos de purificação diferentes de 1.8 segundos e correspondentes a espectros situados na zona central do pico de purificação do colesterol. A figura demonstra a grande reprodutibili-dade da análise.

Figura 12. Exemplo de diferentes assinaturas isotópicas ao nível de diferentes esteróis ou diferentes tempos de indução. Mesmo cálculo e representação que para a figura 11, mas para diferentes esteróis e diferente tempo de indução. O valor de RT indica a gama de tempo de retenção gasta para o cálculo (em minuto). Os valores dessa gama são os seguintes: Figura 12A: RT = 12,25 -12,42 Figura 12B: RT = 12,2 -12,7 Figura 12C: RT = 12,25 -12,35 Figura 12D: RT = 13,3 -13,6 Os tempos de indução são de 8 ou 24 horas.

Os valores de m/z indicam o limite esquerdo e direito dos m/z. O valor o mais baixo de m/z para cada quadro corresponde ao m/z para o este-rol totalmente constituído de carbono 12.

Figura 13: perfis comparados dos esteróis totais (livres e éste-res) em cromatografia fase gás das cepas YIM59/plM303 (parte A da figura) e da cepa YIM59/plM331 (parte B da figura) (conforme exemplo 18). As escalas de resposta são arbitrárias. A escala de tempo de retenção é a mesma para as duas cepas (os tempos de retenção são expressos em minutos). A identificação dos esteróis é feita segundo os critérios descritos no presente pedido. A presente invenção é ilustrada com o auxílio dos exemplos que se seguem, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos.

As técnicas de biologia molecular utilizada são descritos por Au-subel et al., certas manipulações dos lêvedos são descritas por Adams et al (Adamsand Holm, 1996).

Exemplo 1: Produção de uma cepa de lêvedo S. cerevisiae interrompida no gene erg6 (cepa WGIF01): A cepa de lêvedo S. cerevisae WGIF01, cujo gene ERG6 é interrompido pelo gene TRP1 foi obtida por transformação da cepa BM64 por um produto PCR portando um gene funcional TRP1 contornado por extremidades homólogas um gene ERG6. A cepa BM64 (de genótipo MATa\ ura3-52; írp 1Δ2; /eu2-3_112; /ws3-11; acfe2-1; can1-100) é um derivado da cepa de lêvedo S. cerevisiae W303 ΜΑΤα pordeleição completa do gene 7RP1. A cepa BMA64 e a cepa W303 ΜΑΤα são descritas na publicação de Baudin-Baillieu et al (Baudin-Baillieu etal., 1997).

Para isolar o gene 7ÍRP1, o gene TÍRP1 do plasmídeo pFL44 (Bonneaud et al., 1991) foi amplificado, utilizando a Z-Taql (uma DNA poli-merase DNA dependente) fornecida pela sociedade Takara (Pan Vera LLC 501 Charmany Drive Madison, W1 53179 USA). O binário de atração utilizado permite amplificação pelo DNA polimerase do gene TRP1 contornado de seqüências correspondentes ao gene ERG6. A seqüência dessas atrações é a seguinte: OERG6trp1 (CCTAGCGACGAAAAGCATCATTGGAGTGAATAACTTGGACTTACCAttctt agcattttgacg) 3’(SEQ ID N° 1). OERG6trp2: (GCATAAGAGTGAAACAGAATTGAGAAAAAGACAGGCCCAATTCAaattcgg gtcgaaaaaagaaaagg)3’(SEQ ID N° 2). O produto de PCR {polymerase Chain Reaction) assim obtido é purificado por eletropurificação do fragmento correspondente ao tamanho esperado e utilizado para transformar a cepa BM64 pela técnica do cloreto de lítio conforme descrito por (Gietz etal., 1995).

Após transformação, os lêvedos tratados são aferidos em um meio mínimo que não contém triptofano (Gietzetal., 1995). Obtêm-se assim 41 colônias BM64 transformadas prototrófico para o triptofano. Essas 41 colônias são em seguida testadas para três de suas propriedades: sensibilidade à nistatina, estrutura genômica da inserção do gene TRP1, perfil em cro-matografia fase gasosa dos esteróis totais que elas produzem.

Para isto, as 41 colônias são transferidas sobre um meio mínimo contendo respectivamente 10, 20 ou 50 pg/ml de nistatina, uma dezena de colônias é capaz de crescer sobre o meio contendo uma dose de 50 μΓη/ιηΙ de nistatina. Essas soluções resistentes são selecionadas para verificar sua estrutura génica, assim como suas composições em esteróis. A inserção do gene 7RP1 no gene EPG6 é verificado por PCR, utilizando um par de oligonucleotídeos abrangendo a junção entre o gene TRPt funcional e o ERG6 disruptado. Esse par de oligonucleotídeos é o seguinte: OERG6trp3: AGGGCCGAACAAAGCCCCGATCTTC (SEQID n° 3) E OERG6trp4: GGCAAACCGAGGAACTCTTGG (SEQ ID n° 4).

Algumas cepas apresentam o perfil PCR esperado, isto é, um fragmento de 800 pares de base correspondendo ao tamanho esperado para uma inserção de TRP1 em ERG6.

Com a finalidade de verificar que o gene ERG6 é bem inativado nessas cepas, uma análise das composições em esterol dessas cepas pela cromatografia em fase gasosa e por cromatografia líquida alta pressão foi realizada (Duport etal., 2003; Szczebara et ai., 2003).

Essas análises confirmam a ausência de síntese de ergoesterol e o acúmulo de esteróis anormais compatíveis com as perturbações esperadas da via de biossíntese na cepa disruptada.

Uma cepa foi mais particularmente selecionada e nomeada WGIF01.

Exemplo 2: produção das cepas CA10, CA14 e CA23.

As cepas CA10 (de genotipo: MATa, rho+, GAL2, ura3-52, trpl-Δ63, his3-A200, erg5:: HYGROr, ade2:: GAL10/CYC1:: A7Reductase:: PGK1, LEU2::GAL 10/CYC1 ::matADR::PGK1), QA14 (de genotipo: MATa, rho*, GAL2, ura3-52, trp1-A63, his3-A200, erg5::HYGR<f atf2:: G4lf, a-de2::GAL10/G YC1::A 7redutase:: PGK1, LEU2:: GAL10/CYC1::matADR:: PGK1) et CA23 (de genotipo: MATa, rho+, GAL2, ura3-52, trpi-A63, his3-Δ200, erg5:: HYGR<f, arei:: G418R, are2:: HIS3, ade:: GAL10/CYC1:: A7Reductase:: PGK1, LEU2:: GAL10/CYC1:: matADR::PGK1), assim como suas produções, são descritas na referência Duport et ai, cujo conteúdo técnico no que se refere à produção dessas cepas é incorporado por referência ao presente pedido.

As cepas produzem e contêm em suas membranas esteróis não naturais (conforme descrito no pedido de patente européia EP 0727 489) e, em particular da ergosta-5-enol (campesterol).

Essas três cepas não expressam o produto do gene ERG5 que é não funcional por inserção em sua sequência codificante do gene de resistência à higromicina. Além disso, essas cepas expressam o cDNA codificando para a Δ7 reductase de planta (o pedido de patente européia EP 0727 489 descrito notadamente a clonagem da Δ7 reductase da planta Arabidop-$i$ thaliana, que é incorporado por referência ao presente pedido, o número de acesso GenBank dessa seqüência é ATU49398). A cepa CA14 é derivada da cepa CA10 por disrupção do gene ATF2.0 produto desse gene leva a uma acetilação da pregnenolona na posição 3 (conforme descrito no pedido de patente W099/40203). A cepa CA23 é uma cepa derivada da cepa CA10 por deleção dos genes AREI e ARE2, as duas proteínas Arelp et Are2p são responsáveis pela esterificação do ergoesterol (Sturley, 2000) e eventualmente o coleste-rol, pois são homólogos à enzima responsável pela esterificação do coleste-rol nos mamíferos (ACAT).

Exemplo 3: produção do plasmídeo de expressão da Δ24-25 reductase de origem humana (plasmídeo pYES_Delta24). A produção desse plasmídeo foi descrita por Waterham et al. 2001. A produção consistiu em colocar cDNA codificando para o Delta 24 esterol reductase sob o controle do promotor pGAL1 e do terminador tCYC1 no vetor pYES2 (Invitrogen SARL, Cergy Pontoise, France). Esse plasmídeo "navette" E.coli / S cerevisiae e contém uma origem de replicação 2 mícrons e um gene URA3, isto permitindo sua replicação no lêvedo e das facilidades de seleção dos lêvedos transformadas por esse plasmídeo. O promotor GAL1 é, além disso, inductível pela galactose.

Exemplo 4: produção do plasmídeo pAG1 expressando a Δ7-reductase de A.thaliana Um plasmídeo foi produzido especificamente para a expressão da Delta 7 Reductase ae A. thaliana sobre um vetor monocópia. O plasmídeo pAM1 foi utilizado para essa construção. Esse plasmídeo cuja construção é descrita no pedido PCT W002/061109 (conforme exemplo 9.b desse pedido, que é incorporado por referência ao presente pedido) é um plasmídeo "navette" e.coli/S. cerevisiae baseado em uma seqüência de replicação autônoma e um centromãe (ARS CEN). O marcador de seleção é o gene ADE2. Esse plasmídeo é compatível, e pode, portanto, se replicar ao mesmo tempo que um plasmídeo baseado em uma origem de replicação 2 mícrons. Esse plasmídeo possuí, em particular, um site único Notl, permitindo clonar cassettes de expressão, tal como descrito no pedido PCT acima.

Esse site foi utilizado para clonar uma cassette de expressão da delta7-reductase de A.Thaliana proveniente da cepa CA10. Com efeito, essa cassette de expressão é muito eficaz e permite à cepa CA10 que é, além disso, disruptada para ERG5, produzir campestrol (ergosta-5-enol) como esterol majoritário (Duport et a/., 1998). O fragmento de ADN genômico da cepa CA10 contendo o gene da delta7-reductase é amplificado como auxilio das seguintes atrações: OSA 72 5’ (TATATAGCGGCCGCTTTCGCTGATTAATTACCCCAG)3' (SEQ ID N° 5) OSA 77 5' (TATATAGCGGCCGCGAGAAGTGACGCAAGCATCA) 3' {SEQ ID N° 6} A amplificação é realizada sobre o ADN genômico da cepa CA10 preparado pela técnica rápida de extração ao fenol/clorofórmio, conforme descrito por Adams et al (Adams and Holm, 1996).

Cinquenta nanogramas de ADN genômico de CA10 são utilizados como matriz para amplificação com o auxílio das atrações OSA72 e OSA77. A Taq DNA polimerase e as condições enzimáticas provinham da sociedade Stratagene. As condições de amplificação eram as seguintes. Desnaturação inicial de 5 minutos a 95 °C, depois, em seguida, trinta ciclos são realizados consistindo em uma desnaturação de 30s a 95 °C, uma hibri-dação de 30s a 50 °C, depois uma elongação de um minuto a 72 °C. A reação é concluída por uma extensão de 10 minutos a 72 °C. O fragmento de PCR é em seguida digerido pela enzima Notl e purificado sobre gel de agarose, depois cionado classicamente ao nível do site único Notl do plasmídeo pAM1. O plasmídeo assim obtido foi nomeado pAG1.

Trata-se de um vetor monocópia permitindo a expressão da Del- ta7 Reductase de A. thaliana no lêvedo, o gene da delta7 Reductase sendo colocado sob o controle do promotor GAL10/CYC1 (Lecain et ai, 1996).

Exemplo 5: extração dos esteróis livres e esterificados no lêvedo para as análises: 1) condições de extrações dos esteróis livres e esterificados no lêvedo (procedimento 1) a) condições de extração dos esteróis livres: O resíduo celular é lavado duas vezes com 500 μΙ de água desi-onizada e filtrada, em um tubo em vidro.

As células são em seguida suspensas novamente em 500 μΙ de água contendo esferas de vidro de 0,5 mm correspondente a 150 μΙ de líquido no tubo.

Uma extração é realizada duas vezes com 2 ml de 1,2 dicloroe-tano com uma agitação forte sobre um vortex durante dez minutos. Após a primeira extração, a mistura células, esferas de vidro, solvente é centrifugado durante 5 minutos a 1500 g com a finalidade de separar as duas fases.

As duas frações orgânicas oriundas das duas extrações sucessivas são reunidas e secadas sob uma corrente de nitrogênio durante algumas horas. O extrato esterólico é suspenso em 100 μΙ de acetonitrila para sua análise por cromatografia líquida elevado desempenho (HPLC) (Szcze-bara et ai, 2003) ou em 100 μΙ de hexano para as análises por cromatografia em fase gasosa (GC) (Duport et ai, 2003). b) condições de extração dos esteróis totais: saponificação e extração dos esteróis esterificados, análise qualitativa procedimento 1: O resíduo celular é suspenso de novo em 500 μΙ de água purificada. A essa suspensão São acrescentados 2 ml de hidróxido de potássio KOH a 10% no metanol. A mistura é aquecida durante uma hora a 60 °C em tubos fechados. Após a incubação e uma vez que os tubos voltam à temperatura ambiente, a mistura extraída três vezes com 2 ml de hexano. Entre cada extração, as duas fases são separadas por uma centrifugação de 5 minutos a 1500 g. Após cada extração, a fase orgânica é transferida em um novo tubo, depois as três fases orgânicas são reunidas, depois secadas sob um fluxo de nitrogênio. O resíduo esterólico é suspenso de novo em 100 μΙ de acetonitri-la 100% para sua análise por cromatografia líquida elevado desempenho (HPLC) (Szczebara et ai, 2003) ou em 100 μΙ de hexano para as análises por cromatografia em fase gasosa (GC) (Duport et ai, 2003). 2) condições de extração de estereóis livres e esterificados na levedura para análise qualitativa (procedimento 2).

As cepas são cultivadas em meio rico (10 g de bactopeptona por litro e 10 g de extratos de lêvedo por litro) com 2% de glicose como fonte de carbono, a fim de se obterem 500 mg de células liofilizadas. Essas células secadas são retomadas em três ml de metanol (100%) contendo 1 g de KOH e um traço de pirogalol, depois a mistura é incubada durante 45 minutos a 90 °C. Após retomo è temperatura ambiente, os esteróis são extraídos com 5 ml de hexano. A fase orgânica é separada em três amostras de mesmo volume e secada sob uma corrente de ar. Duas das amostras dos esteróis extraídos são retomados em 100 μΙ de hexano para as análises por cromatografia em fase gasosa (GC) e cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa GC/MS e a terceira amostra é retomada em 150 μΙ de metanol para os estudos por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC).

Exemplo 6: análises dos esteróis livres e esterificados no lêvedo por cromatografia em fase gasosa (GC). 1) cromatografia em fase gasosa (GC) com detecção FID (ioni-zação de chama) O extrato esterólico (livre ou total) suspenso no hexano é preparado segundo o procedimento 1 (conforme exemplo 5 1) a) e b)). Uma prova de injeção é acrescentada à mistura de esterol, em geral ou colesterol a uma concentração de 10 a 50 ng/μΙ.

Injeta-se em seguida de 1 a 3 μΙ de amostras sobre um aparelho de cromatografia em fase gasosa nas condições a seguir. 1 a 3 μΙ foram injetados sobre uma coluna Alltech de tipo SE3Q (referência da coluna: 30mX0.32 mm IDX 0,25 pm). O gás vetor é o hélio. A relação de Split está entre 50 e 80. A pressão na cabeça da coluna é de 207 kPa (30 psi). O inje-tor está regulado a 280 °C. A temperatura inicial da coluna é de 130 °C durante 0,5 minuto. Ela sobe a 230 °C à razão de 40 °C/min, depois de 230 °C a 280 °C, à razão de 3 °C/min. A coluna é em seguida mantida a 290 °C. A temperatura do detector é de 310 °C. 2) cromatografia em fase gasosa (GC) com detecção FID (ioni-zação de chama) acoplada à espectrometria de massa (GC/MS). O extrato esterólico suspenso no hexano é preparado segundo o procedimento 2. A GC utilizada é equipada com um injetor clássico "split split less" com uma coluna clássica DB5 com um comprimento de 30 metros e com um diâmetro de 0,25 mm. A injeção é realizada a 230 °C com, como gás vetor, o hélio à vazão de 2ml/min. A coluna passa de 130 a 290 °C em 4 etapas. A coluna é mantida à 130 °C antes da injeção, depois sobe a 230 °C com uma rampa de 40 °C/min, depois de 230 °C a 280 °C com uma rampa de 3 °C /min, depois de 280 °C a 290 °C com uma rampa de 30 °C/min. A coluna permanece durante 5 minutos a 290 °C.

Na saida da coluna de cromatografia em fase gasosa, as moléculas são em seguida analisadas por espectrometria de massa por vaporiza-ção em uma câmara de ionização, tal qual aquela de um aparelho de tipo turbo de Perkin Elmer. As moléculas são fragmentadas por um feixe de elétrons de energia. Os diferentes fragmentos são separados sobre um filtro quadripolar, depois detectados sobre um detector de íons. A cada massa localizada sobre o gráfico de corrente iônica corresponde um espectro de massa que agrupa as massas de todos os produtos de fragmentação do íon M+. Esse espectro de massa obtido em um tempo de retenção determinado sobre a coluna é comparado a bibliotecas de produtos fragmentados assim como àquelas descritas pelos esteróis por Quail e Kelly. (Methods in Molecular Biology Vol53 Yeast Protocols Edited by Evans; M. Quail e S, Kelly 'The Extraction and Analysis of Sterols from Yeast" pp 123-131 (1996)).

Dessa forma, pode ser colocado em evidência o efeito da dele- ção do gene ERG6 na cepa WGIF01 e notadamente a ausência de ergosta 8,24(28) dienol e a presença de esterol do tipo colesta que tem a dupia ligação em 24(25).

Exemplo 7: análise dos esteróis livres e esterificados no lêvedo por cromatografia líquida de elevado desempenho (HLPC) com detecção UV ou detecção por espectrometria de massa. 1) análise por HLPC detecção UV: 10 a 30 μΙ de extrato esterólico (suspenso na acetonitrila ou no metanol e preparado segundo o procedimento um ou dois (conforme exemplo 5)) são injetados sobre uma coluna de tipo X terra RP18, 4,6X1 OOmm (Waters, Milford, MA01757 USA). A separação é feita sobre um gradiente composto de água contendo 0,02% de TFA (ácido trifluoroacético) (tampão A) e de acetonitrila puro (tampão B), A coluna é mantida a 60 °C durante a análise. O aparelho HPLC utilizado é do tipo "Waters 600 E System Con-troller"(Waters, Milford, MA01757 USA). A detecção UV com barra de diodos abrangendo os comprimentos de onda de 206 a 350 nm. A coluna foi equilibrada com um tampão a 20% (v/v) de tampão A (acetonitrila) e 80% de tam- ' pão B (água contendo 0,02% de TFA (ácido trifluoroacético)). Um gradiente linear é feito a partir de uma solução contendo 50% de tampão A e 50% de tampão B. Ao cabo de 10 minutos, a composição do tampão de purificação é de 25% de tampão A para 75% de tampão B. um novo gradiente é aplicado, de forma que a 30 minutos o gradiente atinge o valor de 100% em tampão B. Esse valor é mantido durante 5 minutos para limpar a coluna. 2) análise por HPLC detecção por espectrometria de massa (H- PLC/MS): No caso de uma análise por espectrometria de massa, a amostra é mantida em 30°C, e a coluna é mantida a 60 °C durante a análise. O aparelho HPLC utilizado é do tipo "Alliance HT Waters 2790", acoplado a um detector de massa "Waters MicroMass ZQ". Dlferentemente do método de detecção precedente, o tampão de purificação A não contém TFA, mas os dois tampões A e B contêm 0.01% (v/v) de ácido fórmico. A coluna foi equilibrada com um tampão contendo 80% de tampão A’(água contendo 0,01% (v/v) de ácido fórmico) e 20% de tampão B’(acetonitrila contendo 0,01% (v/v) de ácido fórmico). A injeção é acionada com um tampão contendo 50% desses dois tampões. Um gradiente linear com duas rampas é efetuado a partir de uma solução contendo 50% de tampão A’ e 50% de tampão B’.

Ao cabo de 10 minutos, a composição do tampão de purificação é de 25% de tampão A’ para 75% do tampão B’. A rampa do gradiente é em seguida modificada para atingir 12,5% de tampão A’ e 87,5% de tampão B’ após 25 minutos de análise, depois 100% de tampão B com 30 minutos. Esse valor é mantido durante 5 minutos para regenerar a coluna. O detector de massa "Waters MicroMass ZQ" é regulado para varrer em ionização positiva eletrospray ao valores de m/z compreendidos entre 295 a 450. Um modo de aquisição contínuo é escolhido para a varredura. Por outro lado, uma extração de sinal em modo "SIR" é feita em paralelo a todas as massas esperadas em abundância isotópico natural para os esteróis a analisar. O detector é regulado de maneira a resolver totalmente sem interferência das moléculas diferindo de 1 unidade de m/z. A totalidade das aquisições é parametrada, de forma que a duração total de aquisição correspondente à varredura e ao tempo total de aquisição do conjunto dos SIR continua inferior a 2 segundos.

Exemplo 8: cultura das cepas de lêvedos para análise de seu conteúdo em esterol com ou sem marcação 13C: As cepas a analisar foram cultivadas em um volume de 50 ml de meio Kappeli (Kappeli et a/., 1985) contendo 2% de D-glicose normal ou de D-glicose-U-13C6(para as experiências de marcação, conforme figura 10). A densidade ótica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Essa cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos. O resíduo celular é em seguida analisado diretamente pelas técnicas de análise apresentadas no exemplo 5 (para os estudos que não necessitam de indução à galactose).

Todavia, para os estudos de cinética de indução da expressão da delta 7- reductase e A24-reductase (cepas transformadas pelo plasmídeo pYESjMa24 e/ou pAG1), o resíduo é suspenso de novo em 50 ml do meio Kappeli fresco, contendo 2% galactose (não marcado ao carbono 13C).

Essa cultura é incubada a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm. 10 ml de cultura são recuperados após 0 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas e 24 horas de culturas.

Essas amostras de cultura são centrifugadas a 800 g durante 10 minutos, o resíduo celular é congelado e conservado a -20 °C, antes da extração esterólica pelos métodos descritos no exemplo 5.

Exemplo 9: identificação dos esteróis presentes nas cepas analisadas: A identificação dos esteróis é baseada na combinação dos seguintes princípios: - comparação do comportamento em GC, HPLC, GC/MS e H-PLC/MS com padrões autênticos no caso do campesterol (ergosta 5, eneol), do ergoesterol (ergosta 5,7,22 trienol), do colestrol; (colesta 5-eneol), do desmoesterol (colesta 5,24 dieneol), do colesta 5,22 dieneol e do zimoeste-rol (colesta 8,24 dieneol): - análise do espectro de absorção em HPLC e detecção UV com barra de diodos (conforme exemplo 7-1)): Esse método permite identificar sem ambigüidade sobre a base espectral 5 classes de esteróis: 1) classe SA1: sem sistema diênico conjugado, 2) classe SA2: presença de um sistema 5,7-diênico; 3) classe SA3: presença de um sistema 22,24(25) diênico; 4) classe SA4: presença de um sistema 8,14 diênico; 5) classe SA5: presença de um sistema 22,24(28) diênico. As classes SA3 e SA5 não podem coexistir por razões estruturais. As classes SA2 e SA4 não podem coexistir por razões de biossíntese, a classe SA2 pode ser associada a motivos estruturais de classes SA1, SA3, SA5 para formar os espectros compósitos aditivos. - análise dos tempos de retenção em GC e em HPLC sobre a base de uma aditividade aproximativa dos deslocamentos de tempo de retenção associados a cada tipo de insaturação e à presença de uma estrutura de tipo ergosta e colesta. Esse critério não sendo absoluto, ele é utilizado como auxiliar da identificação e para levantar as ambigüidades, mas apresenta um risco de erro se for utilizado sozinho. Portanto ele só é utilizado em combinação com os outros critérios; - análise em GC/MS (conforme exemplo 6-2) que fornece a massa molecular e um perfil de fragmentação que pode ser comparado a bibliotecas de espectros; - análise em HPLC/MS (conforme exemplo 7-2) em eletrospray que fornece, no caso dos 3-hidroxiesteróís, um sinal principal à massa molecular -17 (protonação (+1) e perda de uma molécula de água (-18)); - análise com o conjunto dos sistemas acima da composição em esteróis de diferentes cepas de lêvedos de referência desruptadas em diferentes pontos da bíossíntese; - análise das variações da composição em esterol da comple-mentação por diferentes enzimas de bíossíntese e da cinética dessa com-plementação, quando da indução dessa complementação; - análise do perfil de marcação dos diferentes esteróis pelo isó-topo 13 do carbono; - análise do espectro UV dos esteróis separados por HPLC a um tempo de retenção determinado.

As duas duplas ligações 5, 7 conjugadas apresentam um espectro típico com dois picos de absorção entre 265 e 280 nm, enquanto que as duas duplas ligações 22, 24 conjugadas apresentam um pico de absorção em 235 nm. A última dupla ligação conjugada em 8,14 é identificável por um pico de absorção em 245 nm.

Exemplo 10: Identificação dos esteróis presentes na cepa BMA64: A cepa BMA64 é cultivada em um volume de 50 ml de meio Kappeli contendo 2% de D-glicose para a análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Essa cultura é incubada 72 horas a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o resíduo celular é analisado pelas técnicas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por essa cepa.

Determinou-se assim que essa cepa acumula mais de 80% de seus esteróis livres sob a forma de ergoesterol (ergosta 5,7,22 trienol) (conforme figura 8). Dois outros esteróis minoritários detectáveis são produzidos por essa cepa, trata-se da ergosta 5,7 dieneol (substrato do produto do gene ERG5) (12%) e o zlmoesterol (ergosta 8,24 dieneol) (5%). Nenhum traço de colesterol é detectável (o limite de detecção do método é de aproximadamente 0,5% dos esteróis observáveis). Pequenas quantidades de lanoeste-rol são também detectáveis (unicamente ao nível das análises dos esteróis totais).

Exemplo 11: identificação dos esteróis presentes na cepa WGIF01: - a cepa WGIFQ1 (conforme exemplo 1) foi cultivada em um volume de 50 ml de meio Kappeli (Kappeli et ai, 1985) contendo 2% de D-glicose para a análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Essa cultura é incubada 72 horas a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o resíduo celular é analisado pelas técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por essa cepa. A pesquisa no cromatograma de ergosta 5,7,22 trienol (ergoesterol) ou de ergosta 5,7 dieneol é negativa (menos de 0,5 % do valor obtido em BMA64) em HPLC acoplada à espectrometria de massa. Ao nível dos esteróis livres, a cepa acumula para 50 % do total do zimoesterol (colesta 8,24 dieneol), substrato do produto do gene ERG6, e para 30 e 20 % respectivamente, do colesta 5,7,24 trienol e do colesta 5,7,22, 24 tetraenol resultante provavelmente de um mecanismo de síntese idêntico àquele que leva á ergosta 5,7 dienol e à ergosta 5,7,22 trienol na cepa parenteral (conforme figura 3 e 8). Isto mostra bem que a via de biossíntese é bloqueada ao nível de erg6, já que a enzima ERG6p (S-adenosilmetionina delta24 esterol C-metil transferase) transforma a colesta 8,24 (25) dieneol em ergosta 8, 24(28) dieneol (conforme figura 2). Esse acúmulo indica claramente que a cepa WGIF01 não possui cópia funcional do gene erg6. Os resultados indicam também que a via de biossíntese normal do ergoesterol no lêvedo e em particular a esterol 8,7-isomerase, a esterol 5-desaturase e a esterol delta 22-desaturase, são capazes converter os substratos de tipo colesta- com uma atividade que permanece importante.

Exemplo 12: produção da cepa WGIF02 e identificação dos es-teróis presentes nessa cepa: A cepa WGIF02 foi obtida por transformação da cepa WGIF01 pelo plasmídeo pYES2 portando a cassete de expressão da Δ24 reductase (pYES_delta24, conforme exemplo 3). Os clones foram selecionados sobre um meio desprovido em uracila e a presença e a expressão do cDNA de Δ24 reductase é verificada, analisando os esteróis desses transformadores pelo procedimento 1 (conforme exemplo 5-1).

Um clone nomeado WGIF02 foi selecionado, pois possuía um perfil esterólico diferente da cepa WGIF01, além disso, o esterol suplementar tinha um tempo de retenção próximo daquele do colesterol (conforme figura 7). A cepa WGIF02 é cultivada em um volume de 50 ml de meio Kappeli (Kappeli etal., 1985) contendo 2 % de D-glicose para a análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Essa cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o resíduo celular é analisado pelas técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por essa cepa.

Os dois perfis de extratos esteróiicos da cepa WGIF01 e da cepa WGIF02 são semelhantes, salvo ao aparecimento de um novo pico identificado por sua massa, seu tempo de retenção e suas duplas ligações conjugadas como o colesta 5,7,22 trieneol (Figuras 2, 3 e 7). A presença desse composto indica a presença esperada de uma atividade 24-25 esterol reduc-tase sobre a dupla ligação em 24(25) do colesta 5,7,22,24 (25) tetraenol. Além disso, a quantidade de colesta 5, 7, 24 trienol é diminuída com o aparecimento do colesta 5, 7,22 trienol na cepa WGIF02 (figuras 7 e 8). A atividade da enzima é colocada em evidência pela conversão do colesta 5,7,24 trienol representando 30 % na cepa WGIF01 e somente 12 % em WGIF02, a diferença, seja 18 % achando-se integralmente sob a forma de colesta 5,7,22 trienol na cepa WGIF02. Trata-se de um resultado inesperado à medida que o produto de conversão do colesta 5,7, 24 pelo delta 24-reductase é o colesta 5,7, que está ausente em WGIF02, portanto quantitativamente convertido em colesta 5, 7, 22. Isto coloca em evidência um outro resultado inesperado, a saber que o colesta 5,7 é um substrato da esterol 22-desaturase, enquanto que o colesta 5,7,24 é, a partir do perfil esterólico da cepa WGIF01 um mau substrato.

Exemplo 13: Produção da cepa WGIF03 e identificação dos esteróis presentes nessa cepa A cepa WGIF03 foi obtida por transformação da cepa WGIF01 pelo plasmídeo pAG1. Esse plasmídeo "navette" entre E.coli e S.cerevisiae porta uma cassette de expressão para a Δ7 reductase, cujo cDNA correspondente se acha sob controle do promotor GAL10/CYC1. A cepa WGIF01 foi transformada pela técnica do cloreto de litio e os transformantes foram selecionados sobre meio que não contém adenina. A expressão da Delta7 reductase foi verificada pelo aparecimento no perfil esterólico dos bons clones de colesta 5,24(25) dienol. Um clone correspondente a esses critérios foi mais particularmente selecionado e nomeado WGIF03. A cepa WGIF03 foi cultivada em um volume de 50 m! de meio Kappeli (Kappeli et ai, 1985) contendo 2 % de D-glicose para a análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Es-sa cultura é incubada 72 horas a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o resíduo celular é analisado pelas técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por essa cepa. A expressão da delta7 esterol reductase na cepa WGIF01 (para dar a cepa WGIF03), contrariamente à expressão da delta24 esterol reductase, leva a uma profunda mudança do perfil esterólico da cepa com desaparecimento quase total dos coleta 5,7,22,24 tetraenol, dos coleta 7,24 dieneol e dos colesta 8,24 dienol.

Essa atividade é também marcada pelo aparecimento de um pico majoritário identificado conforme descrito anteriormente como o colesta 5, 24 dieneol ou desmoesterol. As quantidade de colesta 8,24 dieneol passam de 12 a 48 %. O colesta 5,7,24 trieneol detectado passa de 30 a 3 % e o colesta 5,7,22,24 tetraeneol detectado de 23 a 4 %, respectivamente para as cepas WGIF01 e WGIF03. Essas observações indicam, de maneira inesperada, que a esterol delta 7-reductase reduz os colesta 5,7 dienol de maneira quase independente da natureza das insaturações portadas pela cadeia lateral dos esteróis. Esse resultado é oposto àquele observado com a esterol delta 24-reductase. De maneira inesperada, a expressão da esterol delta 7-reductase leva também ao acúmulo (12 %) de uma molécula co-migrante com o colesta 5,7 dieneol. Parece, todavia, pouco provável, embora não excluído que essa molécula seja do colesta 5,7 dieneol, cujo nível teórico deveria diminuir e não aumentar nessas condições. O aparecimento de pequena quantidade de colesta 5,22,24 trienol (8 %) é também de interesse. Este último esterol é o produto esperado da ação da esterol 22-desaturase sobre o colesta 5,24 dienol esterol majoritário (60 %) na cepa WGIF03 (resultante da redução do colesta 5,7,24 trienol pela esterol delta 7-reductase). O pequeno acúmulo de colesta 5,22,24 trienol indica de maneira inesperada que o colesta 5,24 dieno! não é um bom substrato da esterol 22-desaturase. Graças aos resultados obtidos na cepa WGIF02 (conforme e-xemplo 12), pode ser deduzido que a presença de uma insaturação em 24 (colesta 5, 24 dienol ou colesta 5,7,24 trienol) torna os esteróis dificilmente metabolizável pela esterol 22-desaturase. A ação da enzima ERG6p, transformando os colesta insaturados em 24 em ergosta, leva, portanto, a transformar de mau substratos do gene ERG5 (22-desaturase) em bons substratos.

Exemplo 14: produção da cepa WGIF04 e identificação dos esteróis presentes nessa cepa A cepa WGIF04 foi obtida por transformação da cepa WGIF02 pelo plasmídeo pAG1 pela técnica do cloreto de lítio e os transformantes foram selecionados sobre meio não contendo de adenina, nem de uracila. Os bons transformantes foram então confirmados sobre a base da detecção do acúmulo de colesterol. Um clone correspondente a esses critérios foi mais particularmente selecionado e nomeado WGIF04. Uma amostra da cepa foi depositado junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganis-mes (CNCM) Institut pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 22 de abril de 2004 sob o número de registro I-3203.

Cepas indistinguíveis de WGIF04 podem ser também obtidas, transformando a cepa WGIF03 por pYES_Delta24 e aplicando a mesma seleção. A cepa WGIF04 foi cultivada em um volume de 50 ml de meio Kappeli, contendo 2 % de D-glicose para a análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Essa cultura é incubada 72 horas a uma temperatura de 30 °C sob agitação a 200 rpm.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o resíduo celular é analisado pelas técni- cas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por essa cepa. O colesterol representa 25 % dos esteróis livres da cepa WGIF04 (conforme figura 9). A formação de colesterol nessa cepa é independentemente demonstrada em GC e em HPLC pela co-migração com um padrão autêntico e por confirmação, ao mesmo tempo, em GC/MS e em H-PLC/MS. O colesterol é não detectável (< 0,5 % dos esteróis totais) em todas as cepas que não expressam simultaneamente a delta 7-reductase e a delta 24-reductase.

As cepas que não são disruptadas para o gene erg6 podem produzir do colesterol, todavia, este representa menos de 5 % dos esteróis livres totais. Assim, pôde ser construída a cepa BMA64-pYES_Delta24-pAG1 obtida a partir de BMA64 co-transformada por pYES_Delta24 e pAG1. Essa cepa produz colesterol, este representando alguns % dos esteróis totais. A cepa CA10 foi transformada pelo plasmídeo pYES_Delta24. Essa cepa produz também colesterol, este representando alguns % dos esteróis totais. Pôde ser demonstrado, por outro lado, que a formação do colesterol; necessita muito da indução dos promotores da delta 7-reductase e A24-reductase (conforme figuras 4 e 5). As cepas contendo esses genes não produzem colesterol na ausência de indução, a figura 5 indica que o nível máximo de colesterol é atingido após aproximadamente 24 horas de indução. Paralelamente à formação de colesterol (colesta 5-eneol) observa-se também a formação de colesta 5,22 dieneol. A análise da figura 4 e da figura 5 indica que a formação deste composto se produz mais rapidamente, após a indução que a formação de colesterol e começa mesma antes da indução (conforme figura 5A: m/z = 367). Todavia, esse composto está totalmente ausente, caso a cepa não porte os dois plasmídeos pAG1 e pYES_Delta24. A formação de 22-de-hidrocolesterol é, portanto, um processo mais rápido do que aquele de formação do colesterol, mas esse processo implica um precursor que desaparece rapidamente após indução deixando lugar à formação de colesterol. O colesterol pode ser formado a partir de colesta 5,24 através da Δ 24-reductase ou a partir de colesta 5,7 através da Δ7-reductase. Ora, foi mostrado que o colesta 5,7 dienol não pode se acumular devido à sua conversão imediata em colesta 5,7,22 trienol. A fonte do coles-terol é, portanto, o colesta 5,24 dienol que está ausente no momento da indução e se acumula para 4 a 8 horas de indução antes de diminuir para 24 horas (figura 5). Isto explica o aparecimento tardio do colesterol, já que a síntese prévia de colesta 5,24 dieneol é requerida. Em oposição, os dois precursores possíveis do colesta 5,22 dieneol são o colesta 5,7,22 trienol e o colesta 5,22,24 trienol. Este está ausente no começo da indução (figura 4), enquanto que o primeiro está presente, depois diminui rapidamente em paralelo com a estabilização da formação de colesta 5,22 dienol. Pode ser daí concluído que a fonte de colesterol é a redução do 5,24 dieneol pela Δ 24-reductase, enquanto que a formação do colesta 5,22 dienol resulta da redução do 5,7,22 trienol pela A7reductase. A formação de colesta 5,22 dienol por ação da A22-desaturase sobre o colesterol não é totalmente excluída, mas parece um processo minoritário sobre a base do acúmulo preferencial de colesterol em relação ao colesta 5,22 dieneol ao tempo longo (24h) da cinética (figura 4 e 5).

Exemplo 15: otimização da via de biossíntese do colesterol papel da A22-desaturase: Para durações de indução da ordem de 24 horas da cepa WGIF04 o acúmulo de colesta 5,22 dieneol representa aproximadamente 50 % daquela do coiesterol ao nível dos esteróis livres (figura 4). A disrupção do gene da A22-desaturase é uma opção para otimizar a produção de colesterol. A produção de uma cepa duplamente disruptada ao nível da Δ22-desaturase é uma opção para otimizar a produção de colestrol. A produção de uma cepa duplamente disruptada ao nível da delta 22-desaturase (gene erg5) e do gene erg6 e expressando a A7-reductase e a A24-reductase é perfeitamente considerável. Uma cepa portando o subconjunto: disrupção da Δ 22-desaturase, expressão da A7-reductase e expressão da A24-reductase foi realizada.

Essa cepa foi obtida por transformação da cepa CA10 pelo plasmídeo pYES_Delta24 pela técnica do cloreto de lítio e por seleção para a prototrofia para a uracila. A cepa obtida foi nomeada CA10/ Δ24. A cepa CA10 expressando a Δ24 esterol reductase produz uma quantidade relativamente pequena de colesterol (conforme figura 6 e 7) e acumula de maneira maior ergosta 5-eneol e, de maneira intermediária, er-gosta 5,7 dieneol. O acúmulo de colesta 5,7 dienol é muito pequeno nessa cepa, indicando que a disrupção do gene erg6 é indispensável ao acúmulo importante de derivados da série colesta. A atividade da A24-reductase é, portanto, de maneira inesperada, pouco competitiva com aquela do produto gene erg6. Pode, portanto, ser concluído desses resultados que a disrupção simultânea dos genes erg5 e erg6 é importante com a finalidade de otimizar a produção de colesterol. A disrupção do gene erg5 na cepa WGIF04 permitiría ao técnico aumentar de maneira considerável a produção em colesterol. A maneira de conseguir essa cepa é estabelecida pela produção das cepas WGIF04 e CA10/ Δ24 e o fato de essa cepa ser apenas uma combinação genética evidente de produzir duas cepas precedentes. Os dados oriundos de WGIF04 indicam o desaparecimento rápido do colesta 5,24, quando da expressão da Δ 24-reductase (comparando os resultados obtidos com WGIF03 e aqueles obtidos com WGIF04). Isto permite predizer uma síntese muito eficaz de colesterol em uma cepa disruptada simultaneamente pelos genes erg5 e erg6, e co-expressando a A7-redutase e a A24-redutase, o colesterol sendo então o único esterol terminal.

Concluindo, o mínimo requerido para a produção de colesterol em um limite superior ou igual a 20 % dos esteróis totais é a disrupção do gene erg6, a expressão da A7-redutase e da A24-redutase. A disrupção complementar da Δ 22-desaturase permitiria melhorar a produtividade em colesterol e eliminar a formação parasita de colesta 5, 22 dieneol como esterol terminal.

Exemplo 16: Marcação isotópica do colesterol e definição de assinaturas isotópicas O princípio da obtenção de um colesterol marcado é descrito na figura 10. Essa manipulação consiste inicialmente em fazer crescer o lêvedo sobre glicose totalmente marcada ao 13C durante 72 horas de cultura a 30 °C.

As células são em seguida recuperadas por centrifugação do meio a 600 g, durante 10 minutos. O resíduo de células é em seguida suspenso em 50 ml de meio Kappeli fresco, contendo 2 % de galactose não marcada ao carbono 13C. As culturas são paradas 2 horas, 4 horas, 8 horas ou 24 horas após a passagem em galactose, os esteróis são extraídos, depois analisados (conforme exemplo 7). A passagem de glicose em galactose provoca a indução dos promotores GAL10/CYC1, controlando, ao mesmo tempo, o gene da A7-reductase e aquele da A24-reductase. Simultaneamente, há mudança de marcação isotópica da fonte de carbono. Segue-se a síntese de novo de intermediários metabólicos, depois de esterol, incluindo o colesterol e comportando uma mudança progressiva de marcação. Essa mudança de marcação pode ser caracterizada pelo perfil de massa de cada esterol intermediário. Com efeito, a incorporação de cada átomo de 13C in-duz uma defasagem de massa de uma unidade de massa atômica (UMA). Assim, por exemplo, o colesterol aparece com uma massa molar que varia de 386 a 413 dáltons, segundo o nível de marcação. Em análise por HPLC-massa, utilizando-se a ionização eletrospray positiva, isto corresponde a m/z (massa/carga) que variam de 369 a 396 (íon M+H+ -H2O, seja M+1-18 = 385-17= 369). O tempo de retenção dos esteróis em HPLC não dependendo de maneira detectável do nível de marcação, 0 espectro de massa de um pico HPLC correspondente a um esterol "X" único, corresponde a uma distribuição de massa que é, portanto, a superposição (a soma) das distribuições de massa do esterol "X" sintetizado em diferentes tempos após a marcação. Trata-se, portanto, de um perfil complexo (figura 11), mas perfeitamente de-terminável experimentalmente, que representa uma assinatura isotópica única que depende, ao mesmo tempo: 1) do protocolo de marcação e em particular durações e condições de cultura em 12C e em 13C galactose; 2) da estrutura genética precisa da cepa utilizada; 3) do tempo preciso de parada das culturas.

Esse perfil isotópico tem várias propriedades únicas: - ele é modulável à vontade, agindo-se sobre as condições de cultura, a cepa utilizada e o esterol escolhido. Um registro de marcadores único pode, portanto, ser produzido; - ele é combinável a saber que várias assinaturas isotópicas correspondentes a vários esteróis únicos marcados por perfis ísotópicos eles próprios moduláveis podem ser combinados para formar um "alfabeto molecular"; - ele é reprodutível e fácil de determinar experimentalmente (cf figura 11 e 12) o dobro ou o triplo de traços que indicam a reprodutíbilidade dos perfis; - ele corresponde a uma mistura molecular traçadora fácil de isolar, estável, incolor e inodora, não volátil, não tóxica e incorporável a alimentos, medicamentos, aditivos ou outros produtos assimiláveis peto técnico; - ele é infalsificável, salvo a dispor de cepas recombinantes específicas e condições muito precisas de marcação, de cultura e de extração. Além disso, o conhecimento da assinatura isotópica não permite subir aos parâmetros que permitiram produzi-lo.

Em, resumo, um "alfabeto isotópico" in falsificável, de uso geral e incorporável em qualquer tipo de produtos, aí incluídos consumíveis, foi inventado. As "palavras isotópicas" constituíveis a partir desse alfabeto são em número quase ilimitado, aproveitando-se ao mesmo tempo os perfis de marcação e os diferentes tipos de esteróis. A incorporação dessas assinaturas no meio de produtos os mais variados constitui portanto um método único de marcação infalsificável, contrariamente, por exemplo, às assinaturas ADN que podem ser reproduzidas uma vez conhecidas. A assinatura pode ser lida, por outro lado, de maneira não destrutiva, por exemplo por ioniza-ção laser seguida de análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF ou assimilado).

Exemplo 17: produção de colesterol não animal altamente mar- cado no 13C. A utilização de galactose 13C ou de glicose ou de etanol 13C em lugar das fontes de carbono não marcado para a cultura da cepa WGIF04 nas condições descritas anteriormente para as análises de esteróis permite a síntese de esteróis e em particular de colesterol muito acentuadamente marcado (compreendendo pelo menos 95% de carbono 13C). A preparação de esteróis e de colesterol radioativo 14C é também pela mesma abordagem. O processo pode também ser incorporado a cepas de lêvedos, produzindo esteróides e notadamente a hidrocortisona (conforme pedido de patente WO 02/061109) para produzir esteróides marcados no 13C ou no 14C, por exemplo, para testes RIA.

Exemplo 18: produção de uma cepa produzindo majoritariamen-te colesterol. A cepa CDR07 mata é descrita no pedido de patente publicado sob um número W002061109 e foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, segundo as disposições do tratado de Budapest na CNCM em 24 de janeiro de 2001, com número de ordem 1-2616. A cepa CDR07 MATa (marcadores pertinentes: a- de2::GAL10/CYC1p::A7; erg5::PGK1p::hygroR; ERG6) foi cruzada com a cepa WGIF01 descrita no exemplo 1 (marcadores pertinentes: ERG5; erg6::TRP1).

Após esporulação do diplóide, a composição em esterol das esporas é determinada para encontrar esporas que produzem desmoesterol que é o precursor do colesterol conforme descrito no exemplo 6. Identificou-se assim uma espora produzindo desmoesterol e possuindo um gene TRP1 funcional e portando o cDNA, da Δ7 reductase de Arabidopsis thaliana, assim como indicado pela análise por PCR. Além disso, essa cepa, denominada YIM59, é sensível à higromicina, indicando que o gene ERG5 é funcional.

Uma preparação esterólica, preparada conforme descrita nos exemplos 6 e 9, mostrou que essa cepa YIM59 produz esteróis tendo o mesmo tempo de retenção que o zimoesterol e o desmoesterol. A cepa YIM59 foi também mostrado auxotrofias pela adenina, leucina, uracila e histidina. A presença de demosterol demonstra que essa cepa expressa a esterol Δ7 reductase e que ela porta um alelo não funcional ERG6.

Com a finalidade de melhorar o nível da DHCR24 humana, a seqüência nucleotídica do cDNA da DHCR24 e foi modificada; a fim de melhorar a tradução ao nível do ATG iniciador, o promotor controlando a expressão do DHCR24 foi também modificado. O novo promotor escolhido é o promotor CYC1 do citocromo C1 em substituição ao promotor indutível GAL1 do plasmídeo pYES_delta24 (conforme exemplo 3). A seqüência correspondente ao NH2 termina! da DHCR24 reductase em fusão com o promotor CYC1 foi modificada conforme a seguir: Em caráter inferior, encontra-se a seqüência nucleotídica do promotor CYC1, depois as seqüências da recombinação AttB1, em seguida uma seqüência AAAA que precede o ATG iniciador. A seqüência dos dois primeiros códons foi também modificada (seqüência GAA-CCT após o códon iniciador ATG). O plasmídeo final portando o cDNA da DHCR24 sob controle do promotor CYC1, assim como a origem de replicação 2μ de S. cerevisiae e o marcador de seleção URA-3-d foi nomeado plM331. Seu equivalente sem o cDNA da DHCR24 foi denominado plM303. A cepa YIM59 foi transformada independentemente pelos plas-mídeos plM303 e plM331 e dois transformadores portando o plasmídeo plM303 (cepa YIM59/plM303) ou plM331 (cepa YIM59/plM331) são mais particularmente selecionados.

Essas cepas são cultivadas em um meio rico reconstituído de tipo Kappeli durante 72 horas a 28 °C para atingir uma absorbância de 40 a 600 nm. Extratos esterólicos totais (esteróis esterificados e esteróis livres) da cepa YIM59/plM303 (não portando o cDNA da DHCR24) e da cepa YIM59/plM331 (portando ο cDNA da DHCR24) são realizados em presença de potassa metanólica (conforme exemplos 5 e 6). Essas duas cepas são testadas por sua capacidade de produzir colesterol. Uma parte dos resultados (GC) é apresentada na figura 13. Os tempos de retenção apresentados são dados em minutos nos dois cromatogramas. Pôde assim ser mostrado que a cepa que não porta o vetor de expressão da DHCR24 (cepa YIM59/plM303) não produz colesterol (parte A), mas principalmente desmoesterol (parte A). Ao contrário, a cepa que porta o cDNA da DHCR24 (cepaYIM59/plM331) produz um esterol tendo o tempo de retenção do colesterol (parte B). Pôde ser demonstrado por técnicas de cromatografia em fase gasosa acoplada a um espectrômetro de massa por impacto eletrônico (como descrito no exemplo 6) que esse esterol é bem colesterol. Utilizando-se as superfícies da cada um dos picos de esterol, pôde ser estimado em 57 % dos esteróis a quantidade de colesterol produzida pela cepa YIM59/plM331.

Depósito de material biológico Os seguintes organismos foram depositados em 22 de abril de 2004 junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, segundo as disposições do tratado de Budapest, - cepa WGIF04 depositada sob o número de registra I-3203. Todas as publicações e patentes citadas são incorporadas ao presente pedido por referência.

Listagem de Referências - Adams, A.K., and C. Holm. 1996. Mol CelIBiol. 16:4614-20. - Ausubel Fred M., Brent Roger, Kingston Robert E., Moore David D., Seid-man J.G., Smith John A., Struhl Kevín (Editeurs). Current Protocols in Molecular Biology, publié par Jobn Wiley & Sons Inc. Current Protocols Cus-tomer Service, 605 Third Avenue, 9th Floor New York, NY10158 USA (é-dition mise à jour de Mars 2002). - Baudin-Baillieu, A., E. Guillernet, C. Cullin, and F. Lacroute. 1997. Yeast 13:353-6. - Bonneaud, N., 0. Ozier-Kalogeropoulos, G.Y. Li, M. Labouesse, L. Min-vielle-Sebastia, and F. Lacroute. 1991, Yeast. 7:609-15. - Bowman, S. et al. 1997. Nature. 387:90-3. - Duport, C., B. Schoepp, E. Chatelain, R Spagnoli, B. Dumas, and D. Pompon, 2003. Eur J Biochem. 270:1502-14. - Gietz, R.D., R.H. Sochiestl, A.R. Willems, and R.A. Woods. 1995. Yeast. 11:355-60. - Goffeau, A., et al.. 1996. Science. 274:546,563-7. - Jensen-Pergakes, K.L., M.A. Kennedy, N.D. Lees, R. Barbuch, C. Koegel, and M. Bard. 1998. Antimicrob Agents Chemother. 42:1160-7. - Kaneshiro, E.S., J.A. Rosenfeld, M. Basselin-Eiweida, J.R. Stringer, S.P. Keely, A.G. Smulian, and J.L. Giner. 2002. Moi Microbio! 44:989-99. - Kappeli, O., M. Arreguin, and M. Rieger. 1985. JGen Microbiol. 131:1411- 6. - Kelly, S.L., D.C. Lamb, B.C. Saldwin, A.J. Corran, and D.E. Kelly. 1997. J BiolChem. 272:9986-8. - Lecain, E,, X. Chenivesse, R. Spagnoli, and D. Pompon. 1996. J Biol Chem. 271:10866-73. - McCammon, M.T., M.A. Hartmann, C.D. Bottema, and L.W. Parks. 1984. J Baderíol. 157:475-83. - Moebius, F.F., B.U. Fitzky, J.N. Lee, Y.K. Paik, and H. Glossmann. 1998. Proc NatlAcad Sei USA. 95:1899-902. - Noda, H., and Y. Koizumi. 2003. Insect Biochem Mol Biol. 33:649-58. - Ozier-Kalogeropoulos, O., A. Malpertuy, J. Boyer, F. Tekaia, and B. Dujon. 1998. Nucieic Acids Res. 26:5511-24. - Skaggs, B.A., J.F. Alexander, C.A. Pierson, K.S. Schweitzer, K.T. Chun, C. Koegel, R. Barbuch, and M. Bard. 1996. Gene. 169:105-9. - Sturley, S.L. 2000. Biochim BiophysActa. 1529:155-63. - Szczebara, F.M., et al.. 2003. NatBiotechnol. 21:143-9. - Tait, E., M.C. Simon, S. King, A:J. Brown, N.A. Gow, and D.J. Shaw. 1997. Fungai GenetBiol. 21:308-14. - Taton, M., and A. Rahier. 1991. Biochem Biophys Res Comrnun. 181:465- 73. - Taylor, FR., and L.W. Parks. 1978.JBacteriol. 136:531-7. - Waterham, H.R., J. Koster, G.J. Romeijn, R.C. Hennekam, P. Vreken, H.C. Andersson, D.R. FitzPatrick, R.I. Kelley, and R.J. Wanders. 2001. Am Hum Genet. 69:685-94, - Wood, V., etal. 2002. Nature. 415:871-80.

Tabela I: Avaliação das contribuições espectrais das insaturações dos este-róis (coeficientes de extinção nM-1cm-1) REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Cepa de levedura, caracterizada pelo fato de que produz co-lesterol de maneira autônoma a partir de uma fonte de carbono simples e que expressa as enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3p-hidroxiesterol A24-reductase, em que a enzima esterol 24-C-metiltransferase foi inativada.

2. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima C-22 esterol desaturase foi inativada.

3. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a expressão das enzimas 7-deidrocolesterol reductase e 3p-hidroxiesterol A24-reductase é obtida por transformação do organismo.

4. Cepa de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a inativação da enzima esterol 24-C-metiltransferase é realizada por inativação gênica.

5. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a inativação da enzima C-22 esterol desaturase é realizada por inativação gênica.

6. Cepa de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de ser escolhida a partir do gênero Saccharomyces ou Schizosaccharomyces.

7. Cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae, caracterizada pelo fato de que é a cepa WGIF04 depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) em 22 de abril de 2004 sob o número de registro I-3203.

8. Processo de produção de colesterol de origem não animal, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de um organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivo do organismo é seguida de uma etapa de extração do colesterol.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a extração do colesterol é efetuada por um solvente não miscível em água.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que uma etapa de saponificação é efetuada antes da extração do colesterol.

12. Processo de acordo com a reivindicação 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que uma etapa compreendendo moagem mecânica das células é efetuada antes da saponificação ou da extração do colesterol.

13. Uso de um organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a produção de colesterol, ou de um de seus sais intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcada no 13C ou no 14C.

14. Processo de produção de colesterol, ou de um de seus sais de intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcada no 13C ou no 14C, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: - cultura de um organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 sobre um substrato marcado no 13C ou no 14C; e - extração do dito colesterol, ou de um de seus intermediários metabólicos, ou da mistura de esteróis.

15. Processo de fabricação de uma mistura isotópica de colesterol, de intermediários ou de metabólitos do colesterol, marcados em diferentes posições com o auxílio de marcadores isotópicos, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de um organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 sobre um substrato marcado, depois sobre um substrato não marcado, os tempos de cultivo sobre cada um desses substratos sendo escolhidos a fim de se obter um perfil isotópico definido.