PT1745123E - Estirpes de levedura que produzem colesterol e suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ESTIRPES DE LEVEDURA QUE PRODUZEM COLESTEROL E SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção refere-se à produção de colesterol nos organismos do reino dos Fungi. 0 colesterol (cf. figura 1) é o esterol animal mais importante. É um composto fundamental das membranas celulares, uma vez que controla a fluidez e está presente em todos os tecidos animais e, particularmente, no tecido nervoso. 0 colesterol é um produto de interesse industrial importante. Deste modo, é normalmente utilizado na indústria cosmética. É igualmente utilizado na indústria farmacêutica, por exemplo na administração de medicamento («Distribuição de fármaco») assim como na cultura celular. 0 colesterol é também utilizado na síntese industrial de vitamina D3. Esta vitamina é a seguir utilizada para suplementar a alimentação humana (nos produtos laticínios por exemplo) e animal. 0 colesterol é, igualmente, vantajosamente utilizado como aditivo na alimentação animal, nomeadamente na alimentação destinada à criação de camarão.

Actualmente, a imensa maioria do colesterol comercializado é extraído a partir de tecido animal (uma ínfima quantidade é produzida por síntese química). Duas grandes fontes de partida 1 sao utilizadas para a extracçao do colesterol: a medula espinal de bovinos e a lanolina que é a gordura natural da lã de ovelha. A utilização de tecido animal como produto de partida não é isenta de problemas. Deste modo, os recentes problemas ligados à transmissão do prião responsável pela doença das vacas loucas (doença denominada BSE (Encefalopatia Espongiforme Bovina) nos bovinos) lembraram a necessidade de prudência quando se utiliza tecido animal como matéria-prima. Contudo, apesar das medidas tomadas, o risco de transmissão do agente patogénico não pode ser totalmente excluido. Será, deste modo, extremamente vantajoso dispor de uma fonte de colesterol que não provenha de um tecido animal.

Xu et al. (1988) descrevem uma estirpe de levedura que apresenta uma mutação do gene erg6 e em que a enzima 24-C-metiltransferase é inactivada. Esta levedura expressa as enzimas naturais 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol Δ24-redutase. Ela produz vestígios de colesterol. A presente invenção tem por objectivo, fornecer uma fonte de colesterol abundante e segura do ponto de vista sanitário. A requerente mostrou de forma surpreendente que é possível desviar a produção natural de ergosterol em Fungi para produzir colesterol. 2

Descrição geral da invenção A invenção refere-se a uma estirpe de levedura que produz colesterol de modo autónomo a partir de uma fonte de carbono simples, caracterizada por expressar as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase e na qual a enzima esterol 24-C metiltransferase foi inactivada. Mais particularmente, a invenção refere-se a um organismo, tal como definido a seguir no qual a enzima C-22 esterol dessaturase foi inactivada.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma estirpe de levedura tal como definido a seguir caracterizada por a expressão das enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase ser obtida por transformação do organismo. A invenção refere-se, igualmente, a um organismo do reino dos Fungi, tal como definido a seguir, caracterizada por a inactivação da enzima esterol 24-C metiltransferase ser realizada por inactivação génica e/ou a inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase ser realizada por inactivação génica.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma estirpe de levedura tal como definido a seguir caracterizada por ser seleccionada no filo dos Ascomycete, mais particularmente, no subfilo dos Saccharomycotina, ainda mais particularmente, na classe dos Saccharomycetes ou dos Schizosaccharomycetes, ainda mais particularmente na ordem dos Saccharomycetales ou dos Schizosaccharomycetales, ainda mais particularmente, na família dos Saccharomycetaceae ou dos Schizosaccharomycetaceae, ainda 3 mais particularmente no género Saccharomyces ou Schizosaccharomyces.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe. A invenção refere-se, igualmente, a um método de produção de colesterol de origem não animal compreendendo a cultura de um organismo, tal como definido a seguir. Mais particularmente, o método é caracterizado por a etapa de cultura do organismo é seguido de uma etapa de extracção do colesterol. De um modo preferido, a extracção do colesterol é efectuada por um solvente não miscível em água.

Mais particularmente, o método, tal como definido a seguir, é caracterizado por se efectuar uma etapa de saponificação antes da extracção do colesterol. Ainda mais particularmente, o método, tal como definido a seguir, é caracterizado por se efectuar uma etapa de moagem mecânica das células antes da saponificação ou a extracçao do colesterol.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de uma estirpe de levedura como definido a seguir para a produção de colesterol, ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcados com 13C ou com 14C. A invenção refere-se igualmente a um método de produção de colesterol ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcados com 13C ou com 14C compreendendo as etapas seguintes: 4 - cultura de um organismo do reino dos Fungi, tal como definido a seguir num substrato marcado com 13C ou com 14C e, -extracção do referido colesterol ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou da mistura de esteróis. A invenção refere-se igualmente um método de preparação de uma mistura isotópica de colesterol, de intermediários ou de metabolitos do colesterol, marcados em diferentes posições com o auxílio de marcadores isotópicos, compreendendo a preparação de uma cultura de um organismos do reino dos Fungi, tal como definido a seguir num substrato marcado, depois num substrato não marcado, sendo as durações da cultura em cada um destes substratos selecionadas com a finalidade de obter um perfil isotópico definido.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se à produção de colesterol nos organismos do reino dos Fungi. Nos Fungi, não se encontra colesterol no seu estado natural, sendo este último um esterol animal. 0 esterol maioritário das membranas celulares destes organismos é o ergosterol. A presente invenção permite realizar a síntese de colesterol, pela multiplicação de leveduras, na presença de uma fonte de carbono simples. 0 método proposto pela presente invenção permite então obter uma grande quantidade de colesterol, de baixo custo, uma vez que o método prepara a cultura de organismos do reino dos Fungi e a adição de uma fonte de carbono simples, facilmente disponível no mercado. 5

Por fonte de carbono simples, de acordo com a presente invenção, entende-se as fontes de carbono utilizáveis pelo especialista da técnica para o crescimento normal de uma levedura. Pretende-se conceber, nomeadamente, os diferentes açúcares assimiláveis, tais como a glucose, a galactose ou a sacarose, ou os melaços, ou os subprodutos destes açúcares. Uma fonte de carbono simples completamente particularmente preferida é o etanol e o glicerol. 0 facto de a produção ser efectuada de modo autónomo significa que não é necessário adicionar substratos para obter o colesterol, mas que o organismo pode produzi-lo unicamente a partir da fonte de carbono simples de partida. É também claro que a estirpe pode produzir o colesterol, por utilização de um substrato situado a montante na via metabólica, na medida em que a estirpe do organismo de acordo com a presente invenção contém todos os genes necessários para completar a via metabólica da produção do colesterol. A invenção refere-se nomeadamente uma levedura geneticamente modificada que produz de modo autónomo do colesterol a partir de uma fonte de carbono simples.

Um determinado número de modificações genéticas da levedura pode ser efectuado com a finalidade de desviar a via metabólica natural de produção do ergosterol através da produção de colesterol. A presente invenção refere-se assim a uma levedura geneticamente modificada que expressa as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3p-hidroxiesterol A24-redutase. 0 estirpe de levedura assim modificada produziu colesterol. A requerente pode, com efeito, modular, graças aos resultados 6 obtidos (cf. a parte de exemplo do presente pedido), a via metabólica que conduz ao ergosterol e a alguns dos seus derivados (cf. figura 2) . A expressão das enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3p-hidroxiesterol A24-redutase no fungo S. cerevisiae pode permitir a produção de colesterol, desviando uma parte da via de biossintese do ergosterol. A enzima 7-desidrocolesterol redutase tem o número EC: 1.3.1.21 na classificação internacional das enzimas (Classificação de Enzima). Esta é igualmente denominada delta-5,7-esterol-delta-7-redutase, 7-DHC redutase ou Esterol delta-7-redutase e será igualmente denominada Delta-7 esterol redutase, Delta-7Red, Delta 7 Redutase ou A7-redutase na continuação deste documento. Esta enzima catalisa no estado natural nas plantas, por exemplo, a redução dependente de NADPH de delta 5, 7 colestadienol em delta 5 colestaenol ou a redução de intermediários esterólicos que possuem a ligação dupla em 7-8 (Taton e Rahier, 1991) . 0 gene que codifica a enzima 7-desidrocolesterol redutase foi isolado pela primeira vez na planta Arabidopsis thaliana, o isolamento do gene correspondente e a expressão desta enzima na levedura Saccharomyces cerevisiae é descrita na patente EP 727489. As sequências deste gene e da proteína sao acessíveis com c ) número de acesso do GenBank seguinte: U49398 (Lecain et al., 1996) . Um determinado número de homólogos deste gene foram descritos em outras espécies. Trata-se, por exemplo, do gene homólogo no homem (em que a sequência nucleotídica está acessível com o número GenBank AF 034544 , a sequência proteica com o número GenBank : AAC05086) (Moebius et ai., 1998) . 0 gene homólogo no rato Rattus norvegicus (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: AB016800, a 7 sequência proteica com o número GenBank: BAA34306). Os genes homólogos foram igualmente identificados na galinha Gallus gallus com a referência Genbank BM490402 ou no sapo Xenopus laevis com a referência Genbank BI315007 ou o peixe zebra Danio rerio com a referência Genbank BQ132664. Encontrou-se, igualmente, um gene que codifica para uma actividade delta7 esterol redutase nas plantas como o arroz Oryza sativa com a referência Genbank CA753545, a batata Solanum tuberosum com a referência Genbank BF342071. Este gene que codifica uma actividade delta7 esterol redutase pode ser igualmente encontrado no protista Mastigomoeba balamuthi com a referência Genbank BE636562. 0 especialista da técnica poderá isolar facilmente outros genes homólogos que codificam para a enzima 7-desidrocolesterol redutase em outros organismos. Poderá, nomeadamente, referir-se ao método de clonagem descrito no exemplo 1 da patente EP 727489, que descreve um método de clonagem que permite isolar um ADNc que codifica para uma proteína tendo uma actividade delta-5,7-esterol-delta-7-redutase. 0 especialista da técnica poderá igualmente facilmente determinar a actividade de 7-desidrocolesterol redutase das proteínas correspondentes, nomeadamente, utilizando o teste de actividade, igualmente descrito no exemplo 1 da patente EP 727489. A expressão da enzima 7-desidrocolesterol redutase num organismo do reino dos Fungi de acordo com a invenção pode ser obtida por todos os meios conhecidos do especialista da técnica. Pode tratar-se, em particular, da transformação do organismo por uma construção que comporta uma cassete de expressão constituída por um promotor de transcrição, de um modo preferido, homólogo, da grelha de leitura aberta que codifica para a enzima 7-desidrocolesterol redutase e de um terminador de transcrição adaptado de acordo com as regras habituais conhecidas do especialista da técnica. Como promotor homólogo, utilizar-se-á em geral um promotor adequado para permitir uma expressão suficiente e funcional da proteína heteróloga. 0 promotor pode ser, por exemplo, o promotor PGK, o promotor ADH, o promotor CYC1, o promotor GAL10/CYC1, o promotor TDH3 ou o promotor TPI. 0 terminador pode ser, por exemplo, o terminador do gene da fosfoglicerato cinase (PGK). A referida cassete de expressão pode ser integrada sob a forma de uma ou de várias cópias no genoma nuclear ou mitocondrial do hospedeiro, ou levada por uma estrutura artificial do tipo cromossoma artificial de levedura (YAC) ou ser levada por um elemento genético epissómico como um plasmídeo. Para realizar este tipo de expressão, as leveduras do tipo Yarrowia lipolitica, Kluyveromyces lactis ou Pichia pastoris podem, por exemplo, ser utilizadas.

De um modo preferido, a enzima 7-desidrocolesterol redutase expressa é a enzima da planta Arabidopsis thaliana (um exemplo do modo de expressão desta enzima na levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito na patente EP 727489). Pode contudo tratar-se de toda a enzima homóloga ou não, natural ou artificial que apresenta a mesma actividade enzimática. A enzima 3β-hidroxiesterol A24-redutase, igualmente denominada DHCR24 ou 24-desidrocolesterol redutase, catalisa no estado natural a redução do desmosterol (colesta 5,24 dienol) ou derivados do lanosterol que possuem uma ligação dupla em 24-25 na cadeia lateral (por exemplo, o 14 desmetil-lanosterol, o zimosterol ou o colesta 7, 24 dienol), redução necessária à biossíntese de colesterol no homem nomeadamente (Waterham HR. et ai., 2001). Esta enzima será igualmente denominada delta 9 24-(25) esterol redutase, delta 24 esterol Redutase ou A24-redutase na continuação deste documento. 0 gene que codifica para a enzima 3β-hidroxiesterol A24-redutase foi isolado pela primeira vez no homem, o isolamento do gene correspondente e a expressão desta enzima na levedura Saccharomyces cerevisiae é descrita na publicação Waterham HR. et al, 2001. As sequências deste gene e da proteína são acessíveis com os números de acesso do GenBank seguintes: NM_014762 e NP_055577.

Um determinado número de homólogos deste gene foi descrito noutras espécies. Trata-se, por exemplo, do gene homólogo no murganho (Mus musculus) (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: NM_053272, a sequência proteica com o número GenBank: NP_444502). Os homólogos foram descritos no verme Caenorhabditis elegans e, nomeadamente, um ADN complementar com a referência Genbank AF026214. As sequências homólogas foram igualmente descritas nas plantas como o algodão Gossypium hirsutum com a referência Genbank AAM 47602.1, o arroz Orysa sativa com a referência Genbank AAP53615, a ervilha Pisum satinum com a referência Genbank AAK15493. O especialista da técnica poderá isolar facilmente outros genes homólogos que codificam a enzima 3 β-hidroxiesterol A24-redutase em outros organismos. Poderá, nomeadamente, referir-se ao método de clonagem descrito na publicação Waterham HR. et al., 2001 . O especialista da técnica poderá, igualmente, facilmente determinar a actividade de 33-hidroxiesterol A24-redutase das proteínas correspondentes, nomeadamente, utilizando o teste de actividade igualmente descrito na publicação (Waterham et al., 2001). 10 A expressão da enzima 3β-hidroxiesterol A24-redutase numa levedura de acordo com a invenção pode ser obtida por todos os meios conhecidos de especialista da técnica. Pode tratar-se, em particular, de meios descritos a seguir no que se refere a expressão da enzima 7-desidrocolesterol redutase.

De um modo preferido, a enzima 3p-hidroxiesterol A24-redutase expressa é a enzima humana. Um exemplo de isolamento do gene correspondente e de expressão desta enzima na levedura Saccharomyces cerevisiae é descrito na publicação Waterham HR. et ai., 2001. Pode contudo tratar-se de todas as enzimas homólogas ou não, natural ou artificiais que apresentam a mesma actividade enzimática.

Vantajosamente, as leveduras de acordo com a presente invenção expressam as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase e apresentam, por outro lado, uma inactivação da enzima esterol 24-C-metiltransferase. A enzima esterol 24-C-metiltransferase comporta o número EC-2.1.1.41 na classificação internacional das enzimas (Classificação das Enzimas). Esta é igualmente denominada ERG6p, Delta(24)-metiltransferase, Delta(24)-esterol metiltransferase, Zimosterol-24-metiltransferase, S-adenosil-4-metionina:esterol delta(24)-metiltransferase, SMT1, 24-esterol C-metiltransferase, S-adenosil-L-metionina:delta(24(23))-esterol metiltransferase ou Fitosterol metiltransferase. Esta enzima catalisa no estado natural a metilação em C-24 do zimosterol, que conduz à formação de fecoesterol. 11 0 gene que codifica a enzima esterol 24-C-metiltransferase foi denominado Erg6 na levedura Saccharomyces cerevisiae. A sequência deste gene é acessível com o número de acesso do GenBank seguinte: NC_001145. A sequência da proteína correspondente é acessível com o número de acesso do GenBank seguinte: NP_013706 (Bowman et al, 1997), (Goffeau et al, 1996).

Um determinado número de homólogos deste gene foram descritos em outros Fungi. Trata-se, por exemplo, do gene homólogo em Schlzosaccharomyces pombe (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank Z99759, a sequência proteica com o número GenBank: CAB16897) (Wood et al., 2 002) . O gene homólogo em Neurospora crassa (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: NCB24P7, a sequência proteica com o número GenBank: CAB97289). O gene homólogo em Candida albicans (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: AF031941, a sequência proteica com o número GenBank: AAC26626) (Jensen-Pergakes et al., 1998). Os genes que codificam uma enzima homóloga à ERG6 foram igualmente descritos em Candida lusitaniae com a referência Genbank AA021936.1 e igualmente em Pneumocystis carinii (Kaneshiro et al., 2002) ou em Kluveromyces lactis (Ozier-Kalogeropoulos et al., 1998). O especialista da técnica poderá isolar facilmente outros genes homólogos do gene Erg6 nos organismos do reino dos Fungi. O especialista da técnica poderá, igualmente, facilmente determinar a actividade esterol 24-C-metiltransferase das proteínas correspondentes, nomeadamente utilizando como teste de actividade uma complementação funcional de uma estirpe de leveduras interrompida para estes genes. A complementação é depois atestada pela formação de esteróis ramificados na posição 12 24 em particular de esteróis de tipo ergosta- comportando um grupo metileno na posição 24-28. A presença de uma actividade biológica de esterol 24-C-metiltransferase de tipo ERG 6 será igualmente determinada in vitro graças às técnicas desenvolvidas por (McCammon et al., 1984) ou por Taylor e Parks (Taylor e Parks, 1978). Por outro lado, os esteróis produzidos e substrato da enzima ERG6 serão separados por cromatografia em fase gasosa de acordo com a técnica desenvolvida por Nés em (Methods in Enzimology Steroids and Isoprenoids Volume 111 parte B, 1985 « A comparison of Methods for the Identification of Sterols » pp3-37). A estirpe de levedura de acordo com a presente invenção, que expressa as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3p-hidroxiesterol A24-redutase e que apresentam por outro lado uma inactivação da enzima esterol 24-C-metiltransferase produz colesterol. A requerente pôde, com efeito, determinar que, de modo surpreendente, a inactivação da enzima esterol 24-C-metiltransferase bloqueia a via de biossintese do ergosterol a montante e permite uma produção aumentada em colesterol pela estirpe de levedura (cf. a parte do exemplo presente pedido). A expressão das enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase é realizada como descrito a seguir. A inactivação da enzima esterol 24-C-metiltransferase pode ser realizada por todos os meios conhecidos do especialista da técnica. Pode tratar-se, em particular, da introdução por mutagénese de uma mutação sem sentido, de uma inserção ou de uma 13 deleção que provoca uma alteração da grelha de leitura no gene que codifica a referida proteína.

Pode tratar-se, igualmente, da expressão de um ARN anti-sentido complementar ao ARN mensageiro que codifica a referida proteína ou do sistema de extinção génica conhecida do especialista da técnica sob o nome de RNAi (ARN pequeno de interferência) e dos sistemas enzimáticos associados se estes não existem naturalmente no hospedeiro. A mutagénese pode ser efectuada na sequência que codifica ou numa sequência não codificante de modo a tornar inactiva a proteína codificada ou a impedir a sua expressão ou a sua tradução. A mutagénese pode ser efectuada in vitro ou in situ, por supressão, substituição, deleção e/ou adição de uma ou várias bases no gene considerado ou por inactivação génica.

Pode tratar-se em particular, da introdução de um ADN exógeno na sequência que codifica ou promotora (por exemplo, uma cassete de expressão com promotor e/ou terminador homólogo e uma parte codificante heteróloga). A cassete de expressão permite vantajosamente a expressão de um marcador de selecção. É igualmente possível modificar o promotor do gene de modo a reduzir o nível de expressão. Para os Fungi, a inactivação faz-se, igualmente, por interrupção da sequência que codifica a sequência codificante de um gene marcador heterólogo- ou homólogo. As principais técnicas para interromper um gene de Fungi são descritas no artigo de Johnston et al. (2002) (Methods in Enzimology Volume 350 Editado por Christine Guthrie e Gerry Fink «Gène Disruption» ; M. Johnston, L. Riles, J. Hegemann pp290-315). 14

Vantajosamente, as leveduras de acordo com a presente invenção expressam as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3 β-hidroxiesterol A24-redutase e apresentam, por outro lado, uma inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase. A enzima C-22 esterol dessaturase é igualmente denominada ERG5p, Cyp61, citocromo p-45061, esterol delta22-dessaturase. Esta enzima catalisa, no estado natural, a conversão de ergosta-5,7,24(28)-trienol em ergosta-5,7,22,24(28)-tetraenol por adição de uma ligação dupla na posição C22 (cf. figura 2). 0 gene que codifica a enzima C-22 esterol dessaturase foi denominado Erg5 na levedura' Saccharomyces cerevisiae. A sequência deste gene é acessível com o número de acesso do GenBank seguinte: U34636. A sequência da proteína correspondente é acessível aos números de acesso do GenBank seguintes: AAB06217 (Skaggs et al., 1996) ou P54781 (Bowman et al., 1997).

Um determinado número de homólogos deste gene foram descritos em outros Fungi. Trata-se por exemplo do gene homólogo em Schizosaccharomyces pombe (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank Z98974, a sequência proteica com o número GenBank: CAB11640) (Wood et al., 2002). O gene homólogo em Symbiotaphrina buchneri (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: AB086896, a sequência proteica com o número GenBank: BAC01142) (Noda e Koizumi, 2003) . O gene homólogo em Symbioiaphrina kochii (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: AB086890, a sequência proteica com o número GenBank: BAC01139) (Noda e Koizumi, 2003) . O gene homólogo em Candida albicans (em que a sequência nucleotídica é acessível com o número GenBank: AL033396, a sequência proteica com o número GenBank: CAA21953) 15 (Tait et al., 1997). 0 gene ERG5 foi igualmente descrito em Candida lusitaniae com a referência Genbank AAO48601. 0 especialista da técnica poderá isolar facilmente outros genes homólogos do gene Erg5 nos organismos do reino dos Fungi. 0 especialista da técnica poderá, igualmente, facilmente determinar a actividade de C-22 esterol dessaturase das proteínas correspondentes, nomeadamente, utilizando o teste de actividade descrito por Skaggs, B. A., et al, 1996. Esta actividade poderá igualmente ser posta em evidência por complementação funcional de uma levedura S. cerevisiae com pré-lavagem interrompida ao nível do gene erg5. Esta complementação será atestada pela presença na estirpe complementar de ergosta 5,7,22 trienol. A actividade C-22 esterol dessaturase pode ser medida in vitro utilizando o método descrito por Kelly e Baldwin et al. JBC (1997) depois da lise das leveduras (Kelly et al., 1997). A estirpe de levedura de acordo com a presente invenção que expressa as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol Δ24- redutase e apresenta, por outro lado, uma inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase produzida do colesterol. A requerente pôde, com efeito, determinar que a inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase bloqueia vantajosamente a conversão do colesterol em colesta 5,22 dienol e permite uma estabilização da produção de colesterol (cf. a parte exemplo do presente pedido). Este bloqueio intervém também ao nível da conversão do colesta 5, 7 dienol, um precursor do colesterol em colesta 5,7,22 trienol, um precursor do colesta 5,22 dienol. De modo surpreendente, a enzima C-22 esterol dessaturase aceita, com efeito, como substrato o colesterol que esta converteu em colesta 5,22 dienol. Esta reacção parasita 16 pode ser eliminada pela inactivação da enzima 22 esterol-dessaturase, tal como pode ser determinado pelo requerente. A expressão das enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase é realizada como descrito a seguir. A inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase pode ser realizada por todos os meios conhecidos do especialista da técnica. Pode tratar-se, em particular, de métodos descritos a seguir referentes à inactivação da enzima esterol 24-C-metiltransferase.

Vantajosamente, as leveduras de acordo com a presente invenção que expressam as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase e que apresentam, por outro lado uma inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase e uma inactivação da enzima esterol 24-C-metiltransferase. Estas estirpes apresentam efectivamente as vantagens acumuladas das duas inactivações e são estirpes produtoras de colesterol. A expressão as enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase e a inactivação das enzimas C-22 esterol dessaturase e esterol 24-C-metiltransferase são realizadas como descreve a seguir.

Numa forma de realização, o colesterol está presente na estirpe do organismo, de acordo com o presente invenção, numa proporção superior a 20%, de um modo preferido, 35%, de um modo mais preferido, 50% ou mais do total de esteróis produzidos pela estirpe de acordo com a invenção (nomeadamente os intermediários de síntese) . 17

De um modo preferido, as leveduras de acordo com a presente invenção são seleccionadas no filo dos Ascomycetes, de um modo mais preferido, estas são seleccionadas no subfilo dos

Saccharomycotina, de um modo ainda mais preferido, são seleccionadas na classe dos Saccharomycetes ou dos Schizosaccharomycetes, de um modo ainda mais preferido, são seleccionadas na ordem dos Sacchromycetales ou dos

Schizosaccharomycetales, de um modo ainda mais preferido, são seleccionadas na família dos Saccharomycetaceae ou dos Schizosaccharomycetaceae, de um modo ainda mais preferido, são seleccionadas no género Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, de um modo muito preferido os organismos do reino dos Fungi de acordo com a invenção pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe. A presente invenção refere-se, igualmente, a um método de produção de colesterol de origem não animal compreendendo as etapas seguintes: - cultura de uma levedura, tal como descrito a seguir, - extracção do colesterol produzido por este organismo. A extracção é baseada no tratamento da levedura por um solvente do colesterol, de um modo preferido, não miscível em água. Este tratamento pode ser, de um modo preferido, associado a um método qualquer de moagem mecânica das células. De um modo mais preferido, a levedura será tratada antes da extracção pelo solvente, por uma mistura de saponificação destinada a libertar o colesterol eventualmente ligado a outros compostos celulares como, em particular, os ácidos gordos. Esta mistura de saponificação poderá ser constituída por uma base, por exemplo, amoníaco, soda, potassa dissolvida em água ou, de um modo mais 18 preferido, num solvente orgânico miscivel em água como, por exemplo, o metanol ou o etanol, ou uma mistura solvente-água. A saponificação poderá ser efectuada sem, ou de um modo preferido, com aquecimento a uma temperatura de 60-120 °C, à pressão atmosférica ou subpressão. A extracção pelo solvente não miscivel em água poderá ser substituída por uma extracção em fase sólida numa resina hidrófoba. Um método de extracção dos esteróis é descrito por L. Parks e colaboradores (1985) (Methods in Enzimology 111 Editado por L Rilling, L. Parks, C. Bottema, R. Rodriguez e Thomas Lewis pp333-339). O colesterol bruto assim obtido poderá ser purificado por todos os métodos conhecidos do especialista da técnica, em particular, o descrito por Boselli E, Velazco V, Caboni Mf e Lercker G J Chromatogr A. 11 de Maio de 2001 ;917(1-2):239-44.

Outros métodos poderão igualmente ser utilizados como o descrito para a extracção do colesterol a partir de lã de ovelha. 0 especialista da técnica poderá, nomeadamente, referir-se aos métodos descritos nas patentes americanas US 2688623 ou US 2650929 ou nas patentes britânicas GB690879, GB646227 ou GB613778.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização das estirpes de acordo com a presente invenção d modo a obter o colesterol ou um dos seus intermediários metabólicos, ou uma mistura de esteróis marcados. Entende-se por intermediário metabólico do colesterol, nomeadamente, os esteróis especificados na figura 2. Pode tratar-se, nomeadamente, de colesta 8, 24(25) dienol, colesta 7, 24(25) dienol, colesta 5,7, 24(25) trienol, colesta 5,24(25) dienol, colesta 5,22 dienol. 19 0 princípio da obtenção de um colesterol marcado é descrito na figura 10. Esta manipulação consiste, em primeiro lugar, fazer crescer a levedura num substrato totalmente marcado. As células são a seguir colocadas em cultura num substrato não marcado. Existe, deste modo, a mudança de marcação isotópica da fonte de carbono, segue-se a síntese de novo de intermediários metabólicos depois do esterol, incluindo o colesterol e que comporta uma mudança progressiva de marcação. Trata-se então de um perfil complexo, mas perfeitamente determinável experimentalmente, que representa uma assinatura isotópica única que depende por sua vez: -1) do protocolo de marcação e, em particular, das durações e das condições de cultura em substrato marcado e não marcado. -2) da estrutura genética precisa da estirpe utilizada -3) do tempo preciso de interrupção das culturas.

Uma vez interrompida a cultura (por exemplo, por lise celular ou por interrupção da cultura na presença de concentração subletal de produtos antifúngicos citotóxicos ou citostáticos), o colesterol marcado ou um dos seus intermediários metabólicos, ou uma mistura de esteróis marcados, é extraído e purificado como descreve a seguir. O perfil isotópico do colesterol marcado ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou da mistura de esteróis marcados tem várias propriedades únicas: 20 -1) é modulável à vontade mantendo as condições de cultura, a estirpe utilizada e o esterol seleccionado. Um registo de marcadores único pode então ser produzido. -2) é «combinável» sabendo que várias assinaturas isotópicas correspondentes aos vários esteróis únicos marcados pelos perfis isotópicos, eles próprios moduláveis podem ser combinados para formar um «alfabeto molecular» -3) é reprodutível e fácil de determinar experimentalmente. -4) corresponde a uma mistura molecular vestigial fácil de isolar, estável, incolor e inodora, não volátil, não tóxica e incorporável nos alimentos, medicamentos, aditivos ou outros produtos assimiláveis pelo homem. -5) é não falsificável a menos que disponham de estirpes recombinantes específicas e de condições muito precisas de marcação, de cultura e de extracção. Além disso, o conhecimento da assinatura isotópica não permite voltar aos parâmetros que permitiram a sua produção.

Deste modo, um «alfabeto isotópico» infalsificável, de utilização geral e incorporável em todo o tipo de produtos, e compreendendo consumíveis pode ser obtido facilmente graças à presente invenção. As «palavras isotópicas» constituídas a partir de um tal alfabeto são em número quase ilimitado alavancando, por sua vez, os perfis de marcação e os diferentes tipos de esteróis. A incorporação destas assinaturas nos produtos mais variados constitui, então, um método único de marcação infalsificável, contrariamente, por exemplo, às assinaturas de ADN que podem ser reproduzidas uma vez 21 conhecidas. A assinatura pode ser lida, por outro lado, de modo não destrutivo, por exemplo, por ionização laser seguida por análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF ou assimilada). A utilização de substrato marcado no 13C no local e colocação das fontes de carbono não marcadas para a cultura de leveduras de acordo com a invenção, permite a síntese de esteróis e, em particular, de colesterol muito fortemente marcado (compreendendo pelo menos 95 % de carbono C) . A preparação de esteróis e de colesterol radioactivo 14C é igualmente possível pela mesma abordagem. 0 método pode também ser incorporado em estirpes de leveduras que produzem os esteróides e nomeadamente hidrocortisona (cf. Pedido de patente WO 02/061109) para produzir esteróides marcados com 13C ou com 14C, por exemplo para os testes RIA.

Legenda das figuras

Figura 1: Fórmula química do colesterol, assim como a nomenclatura geralmente utilizada para a numeração dos diferentes carbonos e o nome dos diferentes ciclos. Os quatro ciclos da molécula de colesterol são denominados, respectivamente, A, B, C e D e os carbonos são numerados de 1 a 27.

Figura 2: Esquema simplificado da parte tardia da via de biossíntese dos esteróis dos tipos ergosta- e colesta- nas leveduras naturais ou modificadas. O esquema não é exaustivo mas permite definir as etapas que fazem intervir as enzimas citadas neste documento. As proteínas ERG2p, ERG3p, ERG5p e ERG6p são proteínas de fungos ou de leveduras, enquanto as proteínas 22

Delta-7Red (Delta-7 esterol redutase), Delta 24-(25)Red (Delta 24-(25) esterol redutase) são proteínas heterólogas de origem em mamíferos ou plantas.

Figura 3. Perfil comparado em HPLC com detecção UV a 206 nm de esteróis livres de estirpes derivadas da estirpe BMA64 e identificação destes esteróis. As estirpes estudadas são as seguintes: WGIF01 (estirpe BMA64 interrompida no gene erg6 (cf. exemplo 1)), WGIF02 (estirpe BMA64 interrompida no gene erg6 e que expressa a A24-redutase, Exemplo 12), WGIF03 (estirpe BMA64 interrompida no gene erg6 e que expressa a Δ7 -redutase, Exemplo 13), WGIF04 (estirpe BMA64 interrompida no gene erg6 e que expressa a A7-redutase e a A24-redutase, Exemplo 14) . C5: colesta 5 enol (colesterol); C5,22: colesta 5,22 dienol; C5,24: colesta 5,24 dienol (desmosterol); C8,24: colesta 8,24 dienol (zimosterol); C5,7,22: colesta 5,7,22 trienol; C5.7,24: colesta 5,7,24 trienol; C5,22,24: colesta 5,22,24 trienol; C5,7,22,24: colesta 5,7,22,24 tetraenol ; lan: lanosterol.

Figura 4. Perfil comparado em HPLC com detecção UV a 206 nm dos esteróis livres da estirpe WGIF04 (estirpe BMA64 interrompida no gene erg6 e que expressa a A7-redutase e a A24-redutase, Exemplo 14) depois 0,2,4,8,24 horas de indução para a galactose. A:estirpe WGIF01 (Exemplo 1). Para a estirpe WGIF04, são retiradas amostras a 0, 2, 4, 8 e 24 h após a variação da fonte de carbono para galactose. O perfil da estirpe BMA64 comportando uma disrupção de erg6 (WGIF01) apresentada é a obtida imediatamente após a mudança para galactose. Este perfil fica praticamente inalterado durante a indução (0-24 h). O sinal de absorção a 206 nm corresponde aos coeficientes de absorção variáveis de um esterol para outro. C5: colesta 5enol (colesterol); C5,22: colesta 5,22 dienol; C5,24: colesta 5,24 23 dienol (desmosterol); C8,24: colesta 8,24 dienol (zimosterol); C5,7,22: colesta 5,7,22 trienol; C5.7,24: colesta 5,7,24 trienol; C5,22,24: colesta 5,22,24 trienol; C5, 7,22,24: colesta 5,7,22,24 tetraenol; lan: lanosterol.

Figura 5. Perfil comparado em HPLC com detecção em electrospray com ionização positiva (espectrometria de massa) dos esteróis livres da estirpe WGIF04 (Exemplo 14) após 0,2,4,8,24 horas de indução para a galactose. Δ: estirpe WGIF01. C5: colesta 5enol (colesterol); C5,22: colesta 5,22 dienol; C5, 24: colesta 5,24 dienol (desmosterol); C8,24: colesta 8,24 dienol (zimosterol). Os perfis de HPLC provêm do mesmo ensaio que os da figura 4.

Figura 5 A (esquerda): detecção a m/z =367, Figura 5B (direita) m/z = 369.

Ordenada: número de iões contados/segundo. Abscissa: duração da eluição em minutos.

Figura 6. Detalhe do perfil a m/z = 369 em HPLC para as três estirpes: WGIF01, CAIO comportando o plasmídeo de expressão para a delta 24 esterol Redutase e para WGIF04, o colesterol é injectado como padrão interno. As quantidades de esteróis totais injectadas para as três estirpes correspondentes às extracções feitas a partir das quantidades idênticas de cultura medidas pela absorvência a 600nm.

Figura 7: Perfis comparados dos esteróis totais (livres e ésteres) em cromatografia de fase gás das estirpes WGIF01 (deleção de erg6), WGIF02 (deleção de erg6 com expressão da A24-redutase), WGIF03 (deleção de erg6 com expressão da A7-redutase), WGIF04 (deleção de ergô com expressão da Δ24- 24

redutase e da A7-redutase) e CAIO pYES_Delta24 (fundo genético FY1679, deleção de erg5 com expressão da A24-redutase, Δ-7 redutase, erg5). As escalas de resposta (correntes de ionização de chama) são arbitrárias. Os perfis não são para comparar para além do modo qualitativo de uma estirpe para a outra. A escala de tempo de retenção é, contudo, a mesma para todas as estirpes (os tempos de retenção são expressos em minutos). A identificação dos esteróis é efectuada de acordo com os critérios descritos no presente pedido.

Figura 8. Repartição quantitativa dos principais esteróis livres nas estirpes de leveduras (BMA64 (Figura 8 A) , WGIF01 (Figura 8B) , WGIF02 (Figura 8C) e WGIF03 (Figura 8D) ) avaliada na base dos espectros UV. A repartição é dada em % da totalidade das espécies apresentadas na figura e que são as únicas detectáveis em quantidades apreciáveis. Na ausência de padrão para vários dos esteróis intermediários a quantificação é efectuada na base dos espectros UV associados a cada um dos picos do cromatograma HPLC utilizando os coeficientes de absorção avaliados dados a seguir (cf. tabela 1, os coeficientes de absorção são expressas em mM por litro e por cm.) . Para o fazer, os coeficientes de absorção correspondente aos motivos estruturais insaturados presentes na estrutura de um dado esterol são pesquisados na tabela 1 e eventualmente adicionados (se vários motivos estão presentes numa mesma molécula) para fornecer uma avaliação do coeficiente de extinção de cada tipo de esterol. A avaliação é feita utilizando os valores a 280 nm se, pelo menos, um motivo absorvente a este comprimento de onda está presente, por defeito é utilizado um comprimento de onda de 235 nm, e por defeito a absorção desta última, é utilizado o comprimento de onda de 206 nm para avaliar as concentrações de 25 cada um dos esteróis a partir dos sinais de absorção respectivos em HPLC.

Figura 9. Repartição quantitativa dos principais esteróis livres na estirpe de leveduras WGIF4 avaliada na base de espectros UV. As quantificações são efectuadas da mesma forma da descrita na Figura 8.

Figura 10. Principio da marcação isotópica dos esteróis por substituição de fontes de carbono.

Figura 11. Avaliação dos perfis de marcação isotópica do colesterol produzido na estirpe WGIF04 após 4, 8 e 24 horas de indução. Os esteróis livres são extraídos e separados por HPLC como descrito. Um espectro de massa entre os valores de m/z 300 e m/z=450 é adquirido a todos os 0,2 segundos durante a eluição. Estes espectros são então médias de janelas de 1,8 segundos, depois, submetidos a uma regressão multi-linear, utilizando como base de regressão um conjunto de 24 vectores representando as distribuições teóricas de massa do colesterol marcadas por uma incorporação ao acaso por tiragens independentes do carbono 13 a cada uma das 27 posições da molécula, com uma probabilidade de marcação em cada carbono variável entre 0 e 1 de acordo com o vector considerado. As probabilidades de marcação dos diferentes vectores utilizados como base são seleccionadas de tal forma que o coeficiente de correlação cruzado das distribuições de dois vectores consecutivos da base seja de 0,92, a base começando com um vector correspondente a uma probabilidade de presença de 100% em todas as posições para o carbono 12. 0 ajustamento multilinear é efectuado sobre um critério estatístico de mínimos quadrados anulando os termos não diagonais da matriz dos produtos das derivadas parciais do método de Gauss (filtragem 26 numérica máxima). Após análise, os espectros de massa são depois reconstruídos sobre a base optimizada. As curvas representadas nas figuras representando, então, o resultado da reconstrução filtrado óptimo após normalização da amplitude máxima ao valor de 100.

Para cada tempo de indução as duas curvas representando dois perfis independentes correspondem aos tempos de eluição diferentes de 1,8 segundos e correspondem aos espectros situados na zona central do pico de eluição do colesterol. A figura demonstra a grande reprodutibilidade da análise.

Figura 12. Exemplo de diferentes assinaturas isotópicas ao nível de diferentes esteróis ou de diferentes tempos de indução. Mesmo cálculo e representação para a figura 11, mais para diferentes esteróis e diferentes tempos de indução. 0 valor de RT indica uma gama de tempos de retenção utilizada para o cálculo, (em minuto). Os valores desta gama são os seguintes:

Fig. 12 A: RT=12,25-12,42 Fig. 12 B: RT=12,2-12,7, Fig. 12 C: RT=12,25-12,35 Fig. 12 D: T=13,3-13,6,

Os tempos de indução sao de 8 ou 24 horas.

Os valores de m/z indicam o limite esquerdo e direito dos m/z. O valor mais fraco de m/z para cada quadro corresponde ao m/z para o esterol totalmente constituído por carbono 12. 27

Figura 13: Perfis comparados dos esteróis totais (livres e ésteres) em cromatografia de fase gás das estirpes YIM59/pIM303 (parte A da figura) e da estirpe YIM59/pIM331 (parte B da figura) (cf. exemplo 18). As escalas de resposta são arbitrárias. A escala de tempos de retenção é a mesma para as duas estirpes (os tempos de retenção são expressos em minutos). A identificação dos esteróis é efectuada de acordo com os critérios descritos no presente pedido. A presente invenção é ilustrada com o auxílio dos exemplos que se seguem, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos.

As técnicas de biologia molecular utilizadas são descritas por Ausubel et al.r certas manipulações das leveduras são descritas por Adams et al. (Adams e Holm, 1996). EXEMPLO 1: Construção de uma estirpe de leveduras S. cerevisiae interrompida no gene erg6 (estirpe WGIF01): A estirpe de leveduras de S. cerevisiae WGIF01 em que o gene ERG6 está interrompido pelo gene TRPl, foi obtida por transformação da estirpe BM64 com um produto de PCR portador de um gene funcional TRPl flanqueado por extremidades homólogas ao gene ERG6. A estirpe BM64 (de genótipo MATa; ura3-52; trplA2; leu2~ 3_112; his3-ll; ade2-l; canl-100) é um derivado da estirpe de leveduras S. cerevisiae W303 MATa por deleção completa do gene TRPl. A estirpe BMA64 e a estirpe W303 MATa são descritas na publicação de Baudin-Baillieu et. al. (Baudin-Baillieu et al., 28 1997) . Para isolar o gene TRPl, o gene TRPl do plasmídeo pFL44 (Bonneaud e al, 1991) foi amplificado utilizando a Z-Taql (uma polimerase de ADN dependente de ADN) fornecida pela Sociedade Takara (PanVera LLC 501 Charmany Drive Madison, W1 53719 EUA) . O par de iniciadores utilizado permite a amplificação por uma polimerase de ADN do gene TRPl flanqueado pelas sequências correspondentes ao gene ERG6. A sequência destes iniciadores é a seguinte: OERG6trpl: 5'(CCTAGCGACGAAAAGCATCATTGGAGTGAATAACTTGGACTTACCAttcttag cattttgacg) 3' (SEQ ID N° 1). OERG6trp2: 5' (GCATAAGAGTGAAACAGAATTGAGAAAAAGACAGGCCCAATTCAaattcggg tcgaaaaaagaaaagg) 3' (SEQ ID N° 2). O produto de PCR (Reacção em Cadeia de Polimerase) assim obtido é purificado por electroeluição do fragmento correspondente ao tamanho esperado e utilizado para transformar a estirpe BM64 pela técnica do cloreto de lítio como descrito por (Gietz et al., 1995).

Após transformação, as leveduras tratadas são espalhadas sobre um meio mínimo não contendo triptofano (Gietz et al., 1995). Obtém-se, assim, 41 colónias de BM64 transformadas prototróficas para o triptofano. Estas 41 colónias são a seguir testadas para três das suas propriedades: sensibilidade à nistatina, estrutura genómica da inserção do gene TRP1, perfil em cromatografia de fase gasosa dos esteróis totais que estas produzem. 29

Para isso, as 41 colónias são transferidas para um meio mínimo contendo, respectivamente, 10, 20 ou 50 pg/mL de nistatina, uma dezena de colónias é capaz de crescer em meios contendo uma dose de 50 pg/mL de nistatina. Estas colónias resistentes são seleccionadas para, verificar a sua estrutura génica assim como as suas composições em esteróis. A inserção do gene TRPl no gene ERG6 é verificada por PCR utilizando um par de oligonucleótidos que cobrem a junção entre o gene TRPl funcional e o ERG6 interrompido. Este par de oligonucleótidos é o seguinte: OERG6trp3: AGGGCCGAACAAAGCCCCGATCTTC (SEQ ID N° 3) e OERG6trp4: GGCAAACCGAGGAACTCTTGG (SEQ ID N° 4).

Algumas estirpes apresentam o perfil PCR esperado, quer dizer, um fragmento de 800 pares de bases correspondente ao tamanho esperado para uma inserção de TRPl em ERG6.

Com o objectivo de verificar que o gene ERG6 está bem inactivado nestas estirpes, uma análise das composições em esterol destas estirpes por cromatografia em fase gasosa e por cromatografia líquida de elevada pressão foi realizada (Duport et ai., 2003; Szczebara et al., 2003).

Estas análises confirmam a ausência de síntese de ergosterol e a acumulação de esteróis anormais compatíveis com as perturbações esperadas da via de biossíntese na estirpe interrompida.

Uma estirpe foi mais particularmente seleccionada e nomeada WGIF01. 30 EXEMPLO 2: Construção das estirpes CAIO, CA14 e CA23.

As estirpes CAI0 (de genótipo: MATa, rho+ , GAL2, ura3-52, trpl-A63, his3-A200, erg5::HYGROr , ade2: -.GAL10/CYC1: :A7Redutase: :PGK1, LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1), CA14 (de genótipo: MATa, rho+ , GAL2, ura3-52, trpl~ã63, hisJ-A200, erg5::HYGROr atf2:: G418R , ade2::GAL10/CYC1::A7Redutase::PGK1, LEU2::GAL10/CYC1::matADR::PGK1) , e CA23 (de genótipo: MATa, rho+, GAL2, ura3-52, trpl-A63, his3-A200, erg5:: HYGROR , arei: :G418R, are2::HIS3, ade2:: GAL10/CYC1::A7Redutase::PGKl, LEU2::GALl0/CYC1::matADR::PGKl) assim como as suas construções, são descritas na referência Duport et al., em que a técnica contida no que respeita à construção destas estirpes é incorporado por referência no presente pedido.

Estas estirpes produzem e contêm nas suas membranas esteróis não naturais (como descrito no pedido de patente europeia EP 0727489) e, em particular, do ergosta-5-enol (campesterol).

Estas três estirpes não expressam o produto do gene ERG5 que é não funcional por inserção na sequência codificante do gene de resistência à higromicina. Além disso, estas estirpes que expressam o ADNc que codifica para a Δ7 redutase da planta (o pedido de patente europeia EP 0727489 descreve nomeadamente a clonagem da Δ7 redutase da planta Arabidopsis thaliana, que é incorporado por referência ao presente pedido, o número de acesso do GenBank desta sequência é ATU49398). A estirpe CA14 é derivada da estirpe CAIO por disrupção do gene ATF2. O produto deste gene conduz a uma acetilação da 31 pregnenolona na posição 3 (como é descrito no pedido de patente W099/40203). A estirpe CA23 é uma estirpe derivada da estirpe CAIO por deleção dos genes AREI e ARE2, as duas proteínas Arelp e Are2p são responsáveis pela esterificação do ergosterol (Sturley, 2000) e, eventualmente, do colesterol, uma vez que são homólogos da enzima responsável pela esterificação do colesterol nos mamíferos (ACAT). EXEMPLO 3: Construção do plasmideo de expressão da Δ24-25 redutase de origem humana (plasmideo pYES_Delta24) A construção deste plasmideo foi descrita por Waterham et al. 2001. A construção consistiu em meter o ADNc que codifica a Delta 24 esterol redutase sob o controlo do promotor pGALl e do terminador tCYCl no vector pYES2 (Invitrogen SARL, Cergy Pontoise, França). Este plasmideo é um plasmideo navete E.coli/S cerevisiae e contém uma origem de replicação 2 micron e um gene URA3, o qual permite a sua replicação na levedura e facilita a selecção das leveduras transformadas por este plasmideo. O promotor GAL1 é além disso indutível para a galactose. EXEMPLO 4: Construção do plasmideo pAGl que expressa a A7-redutase de A. thaliana.

Um plasmideo foi construído especificamente para a expressão da Delta 7 Redutase de A. thaliana num vector monocópia. O plasmideo pAMl foi utilizado para esta construção. Este 32 plasmídeo em que a construção é descrita no pedido PCT W002/061109 (cf. exemplo 9.b do referido pedido, que é incorporado por referência no presente pedido) é um plasmídeo navete E.coli/S. cerevisiae baseado numa sequência de replicação autónoma e um centrómero (ARS CEN) . 0 marcador de selecção é o gene ADE2. Este plasmídeo é compatível e pode, deste modo replicar-se ao mesmo tempo que um plasmídeo baseado numa origem de replicação 2 micron. Este plasmídeo possui, em particular, um sítio único iVotl que permite clonar as cassetes de expressão tal como descrito no pedido PCT a seguir.

Este sítio foi utilizado para clonar uma cassete de expressão da Delta7-redutase de A. thaliana proveniente da estirpe CAIO. Com efeito, esta cassete de expressão é muito eficaz e permite à estirpe CAIO, que é além disso interrompido por ERG5, produzir campesterol (ergosta-5-enol) como esterol maioritário (Duport et ai., 1998). 0 fragmento de ADN genómica da estirpe CAIO contendo o gene da delta7-redutase é amplificado com o auxílio dos iniciadores seguintes: OSA72 5' (TATATAGCGGCCGCTTTCGCTGATTAATTACCCCAG) 3' (SEQ ID N° 5) OSA 77 5' (TATATAGCGGCCGCGAGAAGTGACGCAAGCATCA) 3' (SEQ ID N° 6). A amplificação é realizada em ADN genómico da estirpe CAIO preparado pela técnica rápida de extracção com fenol/clorofórmio como descrito por Adams et al. (Adams e Holm, 1996).

Cinquenta nanogramas de ADN genómico de CAIO são utilizados como matriz para amplificação com o auxílio dos iniciadores OSA72 e OSA77. A Taq DNA polimerase e as condições enzimáticas 33 provêm da sociedade Stratagene. As condições de amplificação foram as seguintes. Desnaturação inicial de 5 min a 95 °C,

depois a seguir, são realizados trinta ciclos consistindo numa desnaturação de 30 s a 95 °C, uma hibridação de 30 s a 50 °C depois um alongamento de 1 min a 72 °C. A reacção é terminada por uma extensão final de 10 min a 72 °C. 0 fragmento de PCR é, a seguir, digerido pela enzima Notl e purificado em gel de agarose, depois clonado classicamente ao nível do sítio único Notl do plasmídeo pAMl. O plasmídeo assim obtido foi nomeado pAGl.

Trata-se de um vector monocópia gue permite a expressão da Delta7 Redutase de A. thaliana na levedura, sendo o gene da Delta7 Redutase colocado sob o controlo do promotor GAL10/CYC1 (Lecain et al., 1996). EXEMPLO 5: Extração dos esteróis livres e esterifiçados na levedura para as análises: 1) Condições de extracção dos esteróis livres e esterifiçados na levedura, (procedimento 1) a) Condições de extracção dos esteróis livres: 0 precipitado celular é lavado duas vezes com 500 pL de água desionizada e filtrada, num tubo em vidro.

As células são a seguir ressuspensas em 500 pL de água contendo esferas de vidro de 0,5 mm correspondente a 150 pL de líquido no tubo. 34

Uma extracção é realizada duas vezes com 2 mL de 1,2 dicloroetano com uma agitação forte num vórtice durante 10 minutos. Após a primeira extracção, a mistura de células, esferas de vidro, o solvente é centrifugado durante 5 minutos a 1500 g com a finalidade de separar as duas fases.

As duas fracções orgânicas provenientes das duas extrações sucessivas são recolhidos e secos sob uma corrente de azoto durante algumas horas. O extracto esterólico é suspenso em 100 pL de acetonitrilo para a sua análise por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) (Szczebara et ai., 2003) ou em 100 pL de hexano para as análises por cromatografia em fase gasosa (GC) (Duport et al., 2003). b) Condições de extracção dos esteróis totais: Saponificação e extracção dos esteróis esterificados, análise qualitativa procedimento 1: O precipitado celular é ressuspenso em 500 pL de água purificada. A esta suspensão adiciona-se 2 mL de hidróxido de potássio KOH a 10% em metanol. A mistura é aquecida durante uma hora a 60 °C em tubos fechados. Após incubação e uma vez que os tubos retornaram à temperatura ambiente, a mistura é extraída três vez com 2 mL de hexano. Entre cada extracção, as duas fases são separadas por uma centrifugação de 5 min a 1500 g. Após cada extracção, a fase orgânica é transferida para um novo tubo, depois as três fases orgânicas são recolhidas, depois secas sob um fluxo de azoto. 35 0 resíduo esterólico é ressuspenso em 100 pL de acetonitrilo 100% para a sua análise por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) (Szczebara et al., 2003) ou em 100 pL de hexano para as análises por cromatografia em fase gasosa (GC) (Duport et al, 2003), 2) Condições de extracção dos esteróis livres e esterificados na levedura para análise qualitativa (procedimento 2).

As estirpes são cultivadas em meio rico (10 g de bactopeptona por litro e 10 g de extratos de leveduras por litro) com 2% de glucose como fonte de carbono com a finalidade de obter 500 mg de células liofilizadas. Estas células secas são recuperadas em 3 mL de metanol (100%) contendo 1 g de KOH e um vestígio de pirogalol, depois, a mistura é incubada durante 45 minutos a 90 °C. Após voltar à temperatura ambiente, os esteróis são extraídos com 5 mL de hexano. A fase orgânica é separada em três fracções com o mesmo volume e seca sob uma corrente de ar. Duas das fracções dos esteróis extraídos são recuperados em 100 pL de hexano para as análises por cromatografia em fase gasosa (GC) e cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massa GC/MS e a terceira fracção é recuperada em 150 pL de metanol para os estudos por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC). 36 EXEMPLO 6: Análise dos esteróis livres e esterifiçados na levedura por cromatografia em fase gasosa (GC) 1) Cromatografia em fase gasosa (GC) com detecção FID (ionização de chama) 0 extracto esterólico (livre ou total), suspenso em hexano é preparado de acordo com o procedimento 1 (cf. exemplo 5 1) a) e b)). Uma testemunha da injecção é adicionada à mistura de esterol, em geral, o colesterol a uma concentração de 10 a 50 ng/pL.

Injecta-se, a seguir, de 1 a 3 pL de fracções num equipamento de cromatografia em fase gasosa nas condições seguintes. 1 a 3 pl foram injectados numa coluna Alltech de tipo SE30 (Referência da coluna: 30 m X 0,32 mm IDX 0,25 pm).0 gás vector é o hélio. O reportado por Split está entre 50 e 80. A pressão no topo da coluna é de 30 psi. O injector é regulado a 280 °C. A temperatura inicial da coluna é de 130 °C durante 0,5 minutos. Esta sobe a 230 °C a uma taxa de 40 °C/min, depois de 230 °C a 280 °C a uma taxa de 3°C/min. A coluna é, a seguir, mantida a 290 °C. A temperatura do detector é de 310 °C. 2) Cromatografia em fase gasosa (GC) com detecção FID (ionização de chama) acoplada a espectrometria de massa (GC/MS). 0 extracto esterólico total suspenso em hexano é preparado de acordo com o procedimento 2. A GC utilizada é equipada com um injector clássico «split split less» com uma coluna clássica DB5 com um comprimento de 30 metros e de um diâmetro de 0,25 mm. 37 A injecção é realizada a 230 °C com gás vector, o hélio com o débito de 2 mL/min. A coluna passa de 130 a 290 °C em 4 etapas. A coluna é mantida a 130 °C antes da injecção, depois, sobe a 230 °C com uma rampa de 40 °C/min, depois, de 230 °C a 280 °C com uma rampa de 3 °C/min, depois, de 280 °C a 290 °C com uma rampa de 30 °C/min. A coluna fica durante 5 minutos a 290 °C. À saída da coluna de cromatografia em fase gasosa, as moléculas são, a seguir, analisadas por espectrometria de massa por vaporização numa câmara de ionização, tal como a de um equipamento do tipo Turbo Mass da Perkin Elmer. As moléculas são fragmentadas por uma viga de electrões de elevada energia. Os diferentes fragmentos são, a seguir, separados num filtro quadrupolar, depois, detectados num detector de iões. A cada massa localizada no gráfico de corrente iónica corresponde um espectro de massa que reagrupa as massas de todos os produtos de fragmentação do ião M+. Este espectro de massa obtido a um tempo de retenção dado na coluna é comparado ao das bibliotecas de produtos fragmentados assim como as descritas para os esteróis por Quail e Kelly. (Methods in Molecular Biology N° 153 Yeast Protocols Editado por Evans; M, Quail e S, Kelly "The Extraction and Analysis of Sterols from Yeast" pp 123-131 (1996)).

Desta forma, pôde ser posto em evidência o efeito da deleção do gene ERG6 na estirpe WGIF01 e nomeadamente a ausência de ergosta 8,24(28) dienol e a presença de esterol de tipo colesta tendo a ligação dupla em 24(25). 38 EXEMPLO 7: Análise dos esteróis livres e esterifiçados na levedura por cromatografia liquida de elevado desempenho (HPLC) com detecção UV ou detecção por espectrometria de massa. 1) Análise por HPLC com detecção UV:

Dez a 30 pL de extracto esterólico (suspenso em acetonitrilo ou metanol e preparado de acordo com o procedimento 1 ou 2 (cf. exemplo 5) ) são injectados numa coluna de tipo X terra RP18, 4,6 X 100 mm (Waters, Milford, MA01757 EUA). A separação efectua-se num gradiente composto por água contendo 0,02% de TFA (ácido trifluoroacético) (tampão A) e acetonitrilo puro (tampão B). A coluna é mantida a 60° C durante a análise. 0 equipamento HPLC utilizado é do tipo «Waters 600 E System Controller» (Waters, Milford, MA01757 EUA) . A detecção UV foi realizada num detector de matriz de díodos cobrindo os comprimentos de onda de 206 a 350 nm. A coluna foi equilibrada com um tampão a 20% (v/v) de tampão A (acetonitrilo) e 80% de tampão B (água contendo 0,02% de TFA (ácido trifluoroacético)). Um gradiente linear é efectuado a partir de uma solução contendo 50% de tampão A e 50% de tampão B. Ao fim de 10 min, a composição do tampão de eluição é de 25% de tampão A para 75 % de tampão B. Um novo gradiente linear é, depois, aplicado para que aos 30 min o gradiente atinja um valor de 100% em tampão B. Este valor é mantido durante 5 minutos para limpar a coluna. 39 2) Análise por HPLC com detecção por espectrometria de massa (HPLC/MS) :

No caso de uma análise por espectrometria de massa, a amostra é mantida a 30 °C, e a coluna é mantida a 60 °C durante a análise. 0 equipamento HPLC utilizado é do tipo «Alliance HT Waters 2790», acoplado a um detector de massa «Waters MicroMass ZQ». A diferença do método de detecção anterior, o tampão de eluição A não contém TFA mas os dois tampões A e B contêm 0,01% (v/v) de ácido fórmico. A coluna foi equilibrada com um tampão contendo 80% de tampão A' (água contendo 0,01 % (v/v) de ácido fórmico) e 20% de tampão B' (acetonitrilo contendo 0,01% (v/v) de ácido fórmico). A injecção inicia-se com um tampão contendo 50% destes dois tampões. Um gradiente linear com duas rampas é efectuado a partir de uma solução contendo 50% de tampão A' e 50% de tampão B'.

Ao fim de 10 min, a composição do tampão de eluição é de 25% de tampão A' para 75% de tampão B'. A rampa do gradiente é a seguir modificada para conseguir 12,5% de tampão A' e 87,5% de tampão B' após 25 minutos de análise, depois 100% de tampão B aos 30 minutos. Este valor é mantido durante 5 minutos para regenerar a coluna. 0 detector de massa «Waters MicroMass ZQ» é regulado por varrimento em ionização positiva por electrospray. Os valores de m/z compreendidos entre 295 a 450. Um modo de aquisição «continum» é escolhido para o varrimento. Por exemplo uma extracção de sinal em modo «SIR» é efectuada em paralelo com 40 todas as massas esperadas em abundância isotópica natural para os esteróis a analisar. 0 detector é regulado de modo a resolver totalmente sem interferência das moléculas que diferem de 1 unidade de m/z. A totalidade das aquisições é parametrada para que a duração total da aquisição correspondente ao varrimento e o tempo total de aquisição do conjunto dos SIR seja inferior a 2 segundos. EXEMPLO 8: Cultura de estirpes de leveduras para a análise do seu conteúdo em esterol com ou sem marcação 13C:

As estirpes a analisar foram cultivadas num volume de 50 mL de meio Kappeli (Kappeli et al., 1985) contendo 2% de D-glucose normal ou de D-glucose-U-13C6 (para as experiências de marcação, cf. figura 10). A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Esta cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C, sob agitação, a 200 rotações/min.

As células são a seguir recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos. O precipitado celular é a seguir analisado directamente através das técnicas de análise apresentadas no exemplo 5 (para os estudos não é necessária indução com galactose).

Contudo, para os estudos de cinética da indução da expressão da delta 7-redutase e da delta 24-redutase (estirpes transformadas pelo plasmídeo pYES_Delta24 e/ou pAGl), o precipitado é ressuspenso em 50 mL de meio Kappeli fresco contendo 2% de galactose (não marcado com carbono 13C) . 41

Esta cultura é incubada a uma temperatura de 30 °C sob agitação, a 200 rotações/min. São recuperados dez mL de cultura após 0 horas, 2 horas, 4 horas, 8 horas e 24 horas de culturas.

Essas amostras de cultura são centrifugadas a 800 g durante 10 minutos, o precipitado celular é congelado e conservado a -20 °C antes da extracção esterólica através dos métodos descritos no exemplo 5. EXEMPLO 9: Identificação dos esteróis presentes nas estirpes analisadas: A identificação dos esteróis é baseada na combinação dos seguintes princípios: - Comparação do comportamento em GC, HPLC, GC/MS e HPLC/MS com os padrões autênticos, no caso do campesterol (ergosta 5-enol), do ergosterol (ergosta 5,7,22 trienol), do colesterol (colesta 5-enol), do desmosterol (colesta 5, 24 dienol), do colesta 5,22 dienol e do zimosterol (colesta 8,24 dienol). - Análise do espectro de absorção em HPLC e detecçao em UV num arranjo de diodos (cf. exemplo 7-1)):

Este método permite identificar, sem ambiguidade sobre a base espectral, cinco classes de esteróis: 1) classe SAI: sem sistema diénico conjugado, 2) classe SA2: presença de um sistema 42 5,7-diénico; 3) classe SA3: presença de um sistema 22,24 (25) diénico; 4) classe SA4: presença de um sistema 8,14 diénico; 5) classe SA5: presença de um sistema 22, 24(28) diénico. As classes SA3 e SA5 não podem coexistir por razões estruturais. As classes SA2 e SA4 não podem coexistir por razões de biossintese, a classe SA2 pode estar associada aos motivos estruturais das classes SAI, SA3, SA5 para formar os espectros de compósitos aditivos. - Análise dos tempos de retenção em GC e em HPLC sobre uma base de uma aditividade aproximada de deslocamentos dos tempos de retenção associados a cada tipo de insaturação e à presença de um esqueleto de tipo ergosta ou colesta. Este critério, não sendo absoluto, é utilizado como auxiliar na identificação e para resolver as ambiguidades, mas apresenta um risco de erro se for utilizado isoladamente. Não é por isso utilizado se não em combinação com os outros critérios. - Análise em GC/MS (cf. exemplo 6-2)) que fornece uma massa molecular e um perfil de fragmentação que pode ser comparado com os de bibliotecas de espectros. - Análise em HPLC/MS (cf exemplo 7-2)) em electroaspersão que produz, no caso dos 3-hidroxiesteróis, um sinal principal de massa molecular -17 (protonação ( + 1) e perda de uma molécula de água (-18)) - Análise com o conjunto dos sistemas acima da composição em esteróis de diferentes estirpes de leveduras de referência interrompidas em diferentes pontos da biossintese. 43 - Análise das variações da composição em esterol depois da complementação por diferentes enzimas de biossintese e da cinética desta complementação depois da indução desta complementação. - Análise do perfil de marcação dos diferentes esteróis pelo isótopo 13 do carbono. - Análise do espectro de UV dos esteróis separados por HPLC a um dado tempo de retenção. As duas ligações duplas 5,7 conjugadas que apresentam um espectro típico com dois picos de absorção entre 265 e 280 nm enquanto as duas ligações duplas 22, 24 conjugadas que apresentam um pico de absorção a 235 nm. A última ligação dupla conjugada em 8, 14 é identificável por um pico de absorção a 245 nm. EXEMPLO 10: Identificação dos esteróis presentes na estirpe BMA64: A estirpe BMA64 é cultivada num volume de 50 mL de meio Kappeli contendo 2% de D-glucose para análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica de uma cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Esta cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C, sob agitação, a 200 rotações/min.

As células são a seguir recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o precipitado celular é analisado através das técnicas apresentadas no exemplo 5. As 44 diferentes análises descritas permitem identificar os produtos de esteróis por esta estirpe.

Foi assim determinado que esta estirpe acumula mais de 80% dos seus esteróis livres sob a forma de ergosterol (ergosta 5,7,22 trienol) (cf. Figura 8). Dois outros esteróis minoritários detectáveis são produzidos por esta estirpe, trata-se do ergosta 5,7 dienol (substrato do produto do gene ERG5) (12%) e o zimosterol (ergosta 8,24 dienol) (5%) . Não é detectável nenhum vestígio de colesterol (o limite de detecção do método é por volta dos 0,5% dos esteróis observáveis). São igualmente detectáveis quantidades baixas de lanosterol (unicamente ao nível das análises dos esteróis totais). EXEMPLO 11: Identificação dos esteróis presentes na estirpe WGIF01: A estirpe WGIF01 (cf. exemplo 1) foi cultivada num volume de 50 mL de meio Kappeli (Kappeli et al, 1985) contendo 2% de D-glucose para análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Esta cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C, sob agitação, a 200 rotações/min.

As células são a seguir recuperadas para centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o precipitado celular é analisado através das técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os produtos dos esteróis por esta estirpe. 45 A investigação no cromatograma de ergosta 5,7,22 trienol (ergosterol) ou de ergosta 5,7 dienol é negativa (menos os 0,5% do valor obtido em BMA64) em HPLC acoplada a uma espectrometria de massa. Ao nivel dos esteróis livres, a estirpe acumula para 50% do total do zimosterol (colesta 8,24 dienol), substrato do produto do gene ERG6 e para 30 e 20%, respectivamente, do colesta 5,7,24 trienol e do colesta 5,7,22,24 tetraenol resultando provavelmente de um mecanismo de síntese idêntico ao que conduz a ergosta 5,7 dienol e a ergosta 5,7,22 trienol numa estirpe parental (cf. figura 3 e 8). Isto mostra bem que uma via de biossíntese é bloqueada ao nível de erg6 pois a enzima ERGôp (S-adenosilmetionina delta24 esterol C-metiltransferase) transformar o colesta 8,24 (25) dienol em ergosta 8, 24(28) dienol (cf. figura 2) . Esta acumulação indica claramente que a estirpe WGIF01 não possui a cópia funcional do gene erg6. Os resultados indicam igualmente que uma via de biossíntese normal de ergosterol na levedura e, em particular, um esterol 8,7-isomerase, um esterol 5-dessaturase e um esterol delta 22-dessaturase, são capazes de converter os substratos de tipo colesta- com uma actividade que permanece importante. 46 EXEMPLO 12: Construção da estirpe WGIF02 e identificação dos esteróis presentes nesta estirpe: A estirpe WGIF02 foi obtida por transformação da estirpe WGIF01 através do plasmideo pYES2 contendo a cassete de expressão da Δ24 Redutase (pYES_Delta24, cf. exemplo 3). Os clones foram seleccionados através de um meio desprovido de uracilo e a presença e a expressão do ADNc de Δ24 redutase são verificadas analisando os esteróis destes transformantes através do procedimento 1 (cf. exemplo 5-1)).

Um clone denominado WGIF02 foi seleccionado porque possuía um perfil esterólico diferente da estirpe WGIF01, além disso o esterol suplementar possuía um tempo de retenção próximo do tempo de retenção do colesterol (cf. figura 7). A estirpe WGIF02 é cultivada num volume de 50 mL de meio Kappeli (Kappeli et al., 1985) contendo 2% de D-glucose para análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Esta cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C, sob agitação, a 200 rotações/min.

As células são a seguir recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o precipitado celular é analisado através das técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por esta estirpe.

Os dois perfis dos extractos esterólicos da estirpe WGIF01 e da estirpe WGIF02 são semelhantes salvo o aparecimento de um novo pico identificado pela sua massa, seu tempo de retenção e 47 suas ligações duplas conjugadas como o colesta 5,7,22 trienol (Figuras 2, 3 e 7). A presença deste composto indica a presença esperada de uma actividade de 24-25 esterol redutase numa ligação dupla em 24(25) do colesta 5, 7, 22, 24 (25) tetraenol. Além disso, a quantidade de colesta 5, 7 24 trienol é diminuída com o surgimento do colesta 5, 7, 22 trienol na estirpe WGIF02 (figuras 7 e 8) . A actividade da enzima é posta em evidência através da conversão do colesta 5,7,24 trienol representando 30% na estirpe WGIF01 e apenas 12% em WGIF02, a diferença de 18% que se encontra integralmente soba a forma de colesta 5,7,22 trienol na estirpe WGIF02. Trata-se de um resultado inesperado na medida em que o produto de conversão do colesta 5,7,24 por uma delta 24-redutase é o colesta 5,7, que está ausente em WGIF02, portanto, quantitativamente convertido em colesta 5,7,22. Isto coloca em evidência um outro resultado inesperado, a saber que o colesta 5,7 é um substrato da esterol 22-dessaturase e que o colesta 5,7,24 é de acordo com o perfil esterólico da estirpe WGIF01 um mau substrato. EXEMPLO 13: Construção da estirpe WGIF03 e identificação dos esteróis presentes nesta estirpe: A estirpe WGIF03 foi obtida por transformação da estirpe WGIF01 através do plasmídeo pAGl. Este plasmídeo navete entre E. coli e S.cerevisiae possui uma cassete de expressão para uma Δ7 redutase, portanto, o ADNc correspondente encontra-se sob o controlo do promotor GAL10/CYC1. A estirpe WGIF01 foi transformada pela técnica do cloreto de lítio e os transformantes foram seleccionados em meio que não continha adenina. A expressão da Delta7 redutase foi verificada através do surgimento no perfil esterólico de bons clones de colesta 48 5,24(25) dienol. Um clone que respondia a estes critérios foi depois particularmente seleccionado e denominado WGIF03. A estirpe WGIF03 foi cultivada num volume de 50 mL de meio Kappeli (Kappeli et al., 1985) contendo 2% de D-glucose para análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Esta cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C, sob agitação, a 200 rotações/min.

As células são a seguir recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o precipitado celular é analisado através das técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por esta estirpe. A expressão da delta7 esterol redutase na estirpe WGIF01 (para dar a estirpe WGIF03), contrariamente à expressão da delta24 esterol redutase, conduz a uma profunda alteração do perfil esterólico da estirpe com o desaparecimento quase total de colesta 5, 7, 22, 24 tetraenol, de colesta 7, 24 dienol e de colesta 8,24 dienol.

Esta actividade é igualmente marcada pelo surgimento de um pico maioritário identificado como descrito anteriormente como o colesta 5, 24 dienol ou desmosterol. As quantidades de colesta 8, 24 dienol passam de 12 para 48%. O colesta 5, 7, 24 trienol detectado passa de 30 para 3% e o colesta 5, 7, 22, 24 tetraenol detectado de 23 a 4%, respectivamente para as estirpes WGIF01 e WGIF03. Estas observações indicam, de modo inesperado, que o esterol delta 7-redutase reduz os colesta 5, 7 dienol de modo 49 quase independente da natureza das insaturações transportadas pela cadeia lateral dos esteróis. Este resultado é oposto àquele observado com o esterol delta 24-redutase. De modo inesperado, a expressão da esterol delta 7-redutase conduz, igualmente, à acumulação (12%) de uma molécula co-migrante com o colesta 5,7 dienol. No entanto, parece pouco provável que não esteja excluído que esta molécula seja do colesta 5,7 dienol portanto o nível teórico deve diminuir e não aumentar nestas condições. 0 surgimento de uma fraca quantidade de colesta 5,22,24 trienol (8%) é também de interesse. Este último esterol é o produto esperado da acção da esterol 22-dessaturase sobre o colesta 5,24 dienol esterol maioritário (60%) na estirpe WGLF03 (resultante da redução do colesta 5,7,24 trienol por uma esterol delta 7-redutase). A acumulação fraca de colesta 5,22,24 trienol indica de maneira inesperada que o colesta 5,24 dienol não é um bom substrato da esterol 22-dessaturase. Graças aos resultados obtidos na estirpe WGIF02 (cf exemplo 12), pode ser deduzido que a presença de uma insaturação em 24 (colesta 5, 24 dienol ou colesta 5,7,24 trienol) torna os esteróis dificilmente metabolizáveis pela esterol 22-dessaturase. A acção da enzima ERG6p na transformação dos colesta insaturados em 24 em ergosta conduz portanto à transformação de maus substratos do gene ERG5 (22-dessaturase) em bons substratos. EXEMPLO 14: Construção da estirpe WGIF04 e identificação dos esteróis presentes nesta estirpe: A estirpe WGIF04 foi obtida por transformação da estirpe WGIF02 pelo plasmídeo pAGl através da técnica do cloreto de lítio e os transformantes foram seleccionados em meio que não continha adenina nem uracilo. Os bons transformantes foram 50 depois confirmados numa base da detecção da acumulação de colesterol. Um clone que respondia a estes critérios foi mais particularmente seleccionado e denominado WGTF04. Uma amostra da estirpe WGIF04 foi depositada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue do Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, França, no dia 22 de Abril de 2004 com o número de registro 1-3203.

As estirpes indistinguíveis de WGIF04 podem ser também obtidas através da transformação da estirpe WGIF03 por pYES_Delta24 e aplicando a mesma selecção. A estirpe WGIF04 foi cultivada num volume de 50 mL de meio Kappeli contendo 2% de D-glucose para a análise quantitativa e comparativa dos esteróis. A densidade óptica da cultura de partida é de 0,1 a 600 nm. Esta cultura é incubada durante 72 horas a uma temperatura de 30 °C, sob agitação, a 200 rotações/min.

As células são, a seguir, recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos, o precipitado celular é analisado através das técnicas apresentadas no exemplo 5. As diferentes análises descritas permitiram identificar os esteróis produzidos por esta estirpe. O colesterol representa 25% dos esteróis livres da estirpe WGIF04 (cf. figura 9) . A formação de colesterol nesta estirpe é independentemente demonstrada em GC e em HPLC pela co-migração com um padrão autêntico e por confirmação por sua vez em GC/MS e em HPLC/MS. O colesterol é não-detectável (< 0,5% dos esteróis 51 totais) em todas as estirpes que não expressam simultaneamente a delta 7-redutase e a delta 24-redutase.

As estirpes que não são interrompidas pelo gene erg6 podem produzir colesterol, contudo, aquela representa menos de 5% dos esteróis livres totais. Deste modo, foi possível construir a estirpe BMA64-pYES_Delta24-pAGl obtida a partir de BMA64 co-transformada por pYES_Delta24 e pAGl. Esta estirpe produziu colesterol, representando, este último, alguns % dos esteróis totais. A estirpe CAIO foi transformada pelo plasmídeo pYES_Delta24. Esta estirpe produziu igualmente colesterol, representando este último alguns % dos esteróis totais.

Foi demonstrado por outros que a formação do colesterol necessita da indução dos promotores da delta 7-redutase e da delta 24-redutase (cf. figuras 4 e 5). As estirpes que contêm este genes não produzem colesterol na ausência da indução, a figura 5 indica que o nível máximo de colesterol é obtido após cerca de 24 h de indução. Paralelamente à formação de colesterol (colesta 5-enol) observa-se igualmente a formação de colesta 5,22 dienol. A análise da figura 4 e da figura 5 indicam que a formação deste último composto foi produzida mais rapidamente após a indução que a formação de colesterol e começa mesmo antes da indução (cf. figura 5A: m/z = 367). Contudo, este composto é totalmente ausente se a estirpe não possuir os dois plasmídeos pAGl e pYES_Delta24. A formação de 22-desidrocolesterol é, portanto, um processo mais rápido do que o da formação do colesterol mas este processo implica um precursor que desaparece rapidamente após a indução dar lugar à formação de colesterol. 0 colesterol pode ser formado a partir de colesta 5,24 através de 52 uma Δ 24-redutase ou a partir de colesta 5,7 através da A7-redutase. Ou foi demonstrado que o colesta 5,7 dienol não se pode acumular devido à sua conversão imediata em colesta 5,7,22 trienol. A fonte do colesterol é, portanto, o colesta 5,24 dienol que está ausente no momento da indução e acumula-se em 4 a 8 horas de indução antes de diminuir para 24 h (figura 5) . Isto explica o surgimento tardio do colesterol após a síntese prévia de colesta 5,24 dienol ser exigida. Contrariamente, os dois precursores possíveis do colesta 5,22 dienol são o colesta 5,7,22 trienol e o colesta 5,22, 24 trienol. Este último está ausente no início da indução (figura 4) depois do primeiro estar presente depois diminuir rapidamente em paralelo com a estabilização da formação de colesta 5,22 dienol. Pode concluir-se que a fonte de colesterol é a redução do 5,24 dienol pela Δ 24-redutase após a formação do colesta 5,22 dienol resultar da redução do 5,7,22 trienol pela Δ 7redutase. A formação de colesta 5,22 dienol pela acção da A22-dessaturase sobre o colesterol não está totalmente excluída mais parece um processo minoritário na base da acumulação preferencial de colesterol em relação ao colesta 5,22 dienol a longo termo (24 h) da cinética (figura 4 e 5) . EXEMPLO 15: Optimização da via de biossintese do colesterol, papel da A22-dessaturase:

Para as durações da indução da ordem das 24 h da estirpe WGIF04, a acumulação de colesta 5,22 dienol representa cerca de 50% daquela do colesterol ao nível dos esteróis livres (figura 4). A interrupção do gene da A22-dessaturase é uma opção para optimizar a produção de colesterol. A construção de uma estirpe duplamente interrompida ao nível da Δ 22-dessaturase 53 (gene erg5) e do gene erg6 e que expressa a A7-redutase e a Δ24-redutase é perfeitamente possível. Foi preparada uma estirpe contendo o subconjunto: interrupção da Δ 22-dessaturase, expressão da A7-redutase e expressão da á24-redutase.

Esta estirpe foi obtida por transformação da estirpe CAIO pelo plasmídeo pYES_Delta24 através da técnica do cloreto de lítio e por selecção para a prototrofia em volta do uracilo. A estirpe obtida foi designada CA10M24. A estirpe CAIO que expressa a Δ24 esterol redutase produziu uma quantidade relativamente baixa de colesterol (cf. figura 6 e 7) e acumula principalmente ergosta 5-enol e de forma intermédia ergosta 5,7 dienol. A acumulação de colesta 5,7 dienol é muito baixa numa tal estirpe indicando que a interrupção do gene erg6 é indispensável à acumulação importante de derivados da série colesta. A actividade da Δ 24-redutase é portanto, de uma forma inesperada, pouco competitiva com aquela do produto do gene erg6. Pode, por isso, concluir-se a partir destes resultados que uma interrupção simultânea dos genes erg5 e erg6 é importante de modo a optimizar a produção de colesterol. A interrupção do gene erg5 na estirpe WGIF04 permite a um especialista da técnica aumentar de modo importante a produção em colesterol. A viabilidade de uma tal estirpe é estabelecida pela construção das estirpes WGTF04 e CA10/A24 e pelo facto de esta estirpe não ser mais do que uma combinação genética evidente a realizar das duas estirpes anteriores. Os dados a partir de WGIF04 indicam um desaparecimento rápido do colesta 5,24 depois da expressão da Δ 24-redutase (em comparação com os resultados obtidos com WGIF03 e os obtidos com WGIF04). Isto permite prever uma síntese muito eficaz de colesterol numa 54 estirpe interrompida simultaneamente para os genes erg5 e erg6, e co-expressar a A7-redutase e a A24-redutase, sendo depois o colesterol o único esterol terminal.

Em conclusão, o requisito mínimo para a produção de colesterol num limiar superior ou igual a 20% dos esteróis totais é a interrupção do gene erg6, a expressão da A7-redutase e da A24-redutase. A interrupção complementar da Δ 22-dessaturase permite melhorar uma produtividade em colesterol e eliminar a formação parasita de colesta 5, 22 dienol como esterol terminal. EXEMPLO 16: Marcação isotópica do colesterol e definição de assinaturas isotópicas: O princípio da obtenção de um colesterol marcado é descrito na figura 10. Esta manipulação consiste, em primeiro lugar, em fazer crescer a levedura em glucose totalmente marcada em 13C durante as 72 horas de cultura a 30 °C.

As células são a seguir recuperadas por centrifugação do meio a 600 g durante 10 minutos. O precipitado de células é a seguir suspenso em 50 mL de meio Kappeli fresco contendo 2% de galactose não marcada no carbono 13C. As culturas são paradas 2 horas, 4 horas, 8 horas ou 24 horas após a passagem em galactose, os esteróis são extraídos depois analisados (cf. exemplo 7). A passagem de glucose para galactose provoca a indução dos promotores GAL10/CYC1 controlando por sua vez o gene da A7-redutase e o da Δ 24-redutase. Simultaneamente, há uma alteração da marcação-isotópica da fonte de carbono. Daí resulta a síntese de novo de intermediários metabólicos depois de 55 esterol, incluindo o colesterol e que comporta uma alteração progressiva da marcação. Esta alteração de marcação pode ser caracterizada pelo perfil de massa de cada esterol intermediário. De facto, a incorporação de cada átomo de 13C induz uma deslocação de massa de uma unidade de massa atómica (UMA). Deste modo, por exemplo, o colesterol surge com uma massa molar que varia de 386 para 413 daltons de acordo com o nível de marcação. Em análise por HPLC-massa, utilizando electroaspersão de ionização positiva, esse corresponde às variantes m/z (massa/carga) de 369 a 396 (ião M+ H+ - H20, seja M+l-18 = 385-17 = 369) . Os tempos de retenção dos esteróis em HPLC não dependem de maneira detectável do nível de marcação, o espectro de massa de um pico de HPLC correspondente a um esterol «X» único, corresponde a uma distribuição de massa que é, portanto, a superposição (a soma) das distribuições de massa do esterol «X» sintetizada em tempos diferentes após a marcação. Trata-se, portanto, de um perfil complexo (figura 11), mas perfeitamente determinável experimentalmente, que representa uma assinatura isotópica única que depende de cada vez: -1) do protocolo de marcação e, em particular das durações e das condições de cultura em 12C glucose e em 13C galactose. -2) da estrutura genética precisa da estirpe utilizada -3) do tempo preciso de paragem das culturas

Esse perfil isotópico possui várias propriedades únicas: -1) é modulável à vontade jogando com as condições de cultura, a estirpe utilizada e o esterol escolhido. Um registo de marcadores único pode ser, portanto, produzido. 56 -2) é «combinável» a saber que várias assinaturas isotópicas correspondentes a vários esteróis únicos marcados pelos perfis isotópicos eles próprios moduláveis podem ser combinados para formar um «alfabeto molecular» -3) é reprodutível e fácil de determinar experimentalmente (cf. figura 11 e 12) os traços duplos ou triplos que indicam a reprodutibilidade dos perfis. -4) corresponde a uma mistura molecular traçadora fácil de isolar, estável, incolor e inodora, não volátil, não tóxica e incorporável nos alimentos, medicamentos, aditivos ou outros produtos assimiláveis pelo homem. -5) é infalsificável salvo se existirem estirpes recombinantes específicas e as condições muito precisas de marcação, de cultura e de extracção. Além disso, o conhecimento da assinatura isotópica não permite voltar aos parâmetros que permitiram a sua produção.

Em resumo, é inventado um «alfabeto isotópico» infalsificável, de utilização geral e incorporável em todo o tipo de produtos, e compreendendo consumiveis. As «palavras isotópicas» constituídas a partir de um tal alfabeto são em número quase ilimitado alavancando por sua vez os perfis de marcação e os diferentes tipos de esteróis. A incorporação dessas assinaturas no meio dos produtos mais variados constitui, portanto, um método único de marcação infalsificável, contrariamente por exemplo às assinaturas de ADN que podem ser reproduzidas uma vez conhecidas. A assinatura pode ser lida de, por exemplo, de modo não destrutivo, por exemplo, por ionização 57 laser seguida de análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF ou semelhante). EXEMPLO 17: Produção de colesterol não animal amplamente marcado com 13C: A utilização de galactose 13C ou de glucose e de etanol 13C em vez e no lugar das fontes de carbono não marcadas para a cultura da estirpe WGIF04 nas condições descritas anteriormente para as análises de esteróis permite a síntese de esteróis e, em particular, de colesterol fortemente marcado (compreendendo, pelo menos, 95% de carbono 13C) . A preparação de esteróis e de colesterol radioactivo 14C é igualmente possível pela mesma abordagem. 0 método pode também ser incorporado em estirpes de leveduras que produzem esteróides e nomeadamente hidrocortisona (cf. pedido de patente W002/061109) para produzir esteróides marcados com 13C ou com 14C, por exemplo, para testes RIA. EXEMPLO 18: Construção de uma estirpe que produz maioritariamente colesterol: A estirpe CDR07 Mata é descrita no pedido de patente publicado sob o número W002061109 e foi depositado na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue do Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste na CNCM a 24 de Janeiro de 2001 sob o número de ordem 1-2616. A estirpe CDR07 MATa (marcadores pertinentes: ade2: GAL10/CYC1P: : Δ7 ; erg5: : PGK1P: : hygroR; ERG6) foi cruzada 58 com a estirpe WGIF01 descrita no exemplo 1 (marcadores pertinentes: ERG5; erg6::TRPl).

Após esporulação do diplóide, a composição em esterol dos esporos é determinada por encontrar esporos que produzem desmosterol que é o precursor do colesterol como descrito no exemplo 6. Identificou-se assim um esporo que produz desmosterol e que possui um gene TRPl funcional e comportando o ADNc da Δ7 redutase de Arabidopsis thaliana, tal como indicado por análise por PCR. Além disso, esta estirpe, denominada YLM59, é sensível à higromicina indicando que o gene ERG5 é funcional.

Uma preparação esterólica, preparada como descrito nos exemplos 6 e 9, mostrou que esta estirpe YLM59 produzia esteróis tendo o mesmo tempo de retenção que o zimosterol e o desmosterol. A estirpe YFM59 mostrou, igualmente, auxotrofias para a adenina, a leucina, uracilo e histidina. A presença de desmosterol demonstra que esta estirpe expressa a esterol Δ7 redutase e que comporta um alelo não funcional erg6.

Com a finalidade de melhorar o nível de expressão da DHCR24 humana, a sequência nucleotídica do ADNc da DHCR24 foi modificada; com a finalidade de melhorar a tradução ao nível de do ATG iniciador, o promotor que controla a expressão do DHCR24 foi igualmente modificado. 0 novo promotor seleccionado é o promotor CYCl do citocromo cl em substituição do promotor indutível GALl do plasmídeo pYES_Delta24 (cf. exemplo 3). A sequência correspondente ao terminal NH2 da DHCR24 redutase em fusão com o promotor CYCl foi modificada como se segue: 59 tagcgtggatggccaggcaactttagtgctgacacatacaggcatatatatatgtgtgcgacga cacatgatcatatggcatgcatgtgctctgtatgtatataaaactcttgttttcttcttttctc taaatattctttccttatacattaggtcctttgtagcataaattactatacttctatagacacg caaacacaaaggaattgacaagtttgtacaaaaaagcaggctaaaaaATGGAACCTGCC GTGTCGCTGGCCGTGTGCG (SEQ ID N° 7) .

Em caracteres pequenos, encontra-se a sequência nucleotídica parcial do promotor CYC1, depois as sequências de recombinação AttBl, a seguir uma sequência AAAA que precede o ATG iniciador. A sequência dos dois primeiros codões foi igualmente modificada (sequência GAA-CCT após o codão iniciador ATG). 0 plasmideo final comporta o ADNc da DHCR24 sob controlo do promotor CYC1 assim como a origem de replicação 2 μ de S. cerevisiae e o marcador de selecção URA3-d foi nomeado pIM331. 0 seu equivalente sem o ADNc da DHCR24 foi denominado ΡΙΜ303. A estirpe YLM59 é transformada independentemente pelos plasmideos pIM303 e pIM331 e dois transformantes são portadores do pLM303 (estirpe YIM59/pIM303) ou pIM331 (estirpe YLM59/pLM331) são mais particularmente seleccionados.

Estas estirpes são cultivadas num meio rico reconstituído de tipo Kappeli durante 72 horas a 28 °C para obter uma absorvência de 40 à 600 nm. Os extractos esterólicos totais (esteróis esterifiçados e esteróis livres) da estirpe YLM59/pIM303 (não são portadores do ADNc da DHCR24) e da estirpe YrM59/pIM331 (portadores de ADNc da DHCR24) são realizados na presença de potassa metanólica (cf. Exemplos 5 e 6). Estas duas estirpes são testadas quanto à sua capacidade para produzir colesterol. Uma parte dos resultados (GC) é apresentada na figura 13. Os tempos 60 de retenção apresentados são dados em minutos nos dois cromatogramas. Pôde, deste modo, ser mostrado que a estirpe que não comporta o vector de expressão da DHCR24 (estirpe YIM59/pLM303) não produziu colesterol (parte A) mas, principalmente, desmosterol (parte A) . Ao inverso, a estirpe que comporta o ADNc da DHCR24 (estirpe YIM59/pIM33) produziu um esterol tendo o tempo de retenção do colesterol (parte B) . Pôde ser demonstrado por técnicas de cromatografia em fase gasosa acoplada a um espectrómetro de massa por impacto electrónico (como descrito no exemplo 6) que o esterol é mesmo do colesterol. Utilizando as superfícies de cada um dos picos de esterol, pôde estimar-se em 57% dos esteróis, a quantidade de colesterol produzido pela estirpe YIM59/pIM331.

Depósito de material biológico

Os organismos seguintes foram depositados a 22 de Abril de 2004 na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue do Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste. - Estirpe WGIF04 depositada sob o número de registo 1-3203.

Todas as publicações e patentes citadas são incorporadas no presente pedido por referência. 61

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Tabela 1: Avaliação das contribuições espectrais das insaturações dos esteróis (coeficientes de extinção mM^cirT1) ; Insaturação Comprimento de onda (nm) 206 j 23 S ' 280 ....................5 ............. ............P............ 1..........M......... .............w~....... j .....P “ ....................4Ϊ3................... _ ..................ÍL5................... 4β 1,7 Π-5 4S4 0,0 ' 0,0 ..... ; ) 63 Qfi 0,0 V 273) 0,0 W*. yS 1,7 j Π.5 , 29,8 !1,5 8,14 ...........................________) 0 0,6 0,0 64

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Aventis Pharma S.A.

SUAS

<120> ESTIRPES DE LEVEDURA QUE PRODUZEM COLESTEROL E UTILIZAÇÕES <130> PRJ02025 <160> 7 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 63 <212> ADN <213> Artificial <400> 1 60 63 cctagcgacg aaaagcatca ttggagtgaa taacttggac ttaccattct tagcattttg acg <210> 2 <211> 68 <212> ADN <213> Artificial <400> 2 60 gcataagagt gaaacagaat tgagaaaaag acaggcccaa ttcaaattcg ggtcgaaaaa agaaaagg 65 68 <210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <400> 3 agggccgaac aaagccccga tcttc 25 <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <40 0> 4 ggcaaaccga ggaactcttg g 21 <210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <400> 5 tatatagcgg ccgctttcgc tgattaatta ccccag 36

<210> 6 <211> 34 <212> ADN 66 <213> Artificial <400> 6 tatatagcgg ccgcgàgaag tgacgcaagc atca 34 <210> 7 <211> 270 <212> ADN <213> Artificial <400> 7 tagcgtggat ggccaggcaa ctttagtgct gacacataca ggcatatata tatgtgtgcg 60 acgacacatg atcatatggc atgcatgtgc tctgtatgta tataaaactc ttgttttctt 120 cttttctcta aatattcttt ccttatacat taggtccttt gtagcataaa ttactatact 180 tctatagaca cgcaaacaca aaggaattga caagtttgta caaaaaagca ggctaaaaaa 240 tggaacctgc cgtgtcgctg gccgtgtgcg 270

Lisboa, 26 de Setembro de 2012 67

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe de levedura que produz colesterol de modo autónomo, caracterizada por expressar as enzimas heterólogas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase, e em que a enzima esterol 24-C-metiltransferase foi inactivada.
2. 2. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima C-22 esterol dessaturase foi inactivada.
3. 3. Estirpe de levedura de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por a expressão das enzimas 7-desidrocolesterol redutase e 3β-hidroxiesterol A24-redutase ser obtida por transformação do organismo.
4. 4. Estirpe de levedura de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a inactivação da enzima esterol 24-C-metilfransferase ser realizada por inactivação génica.
5. 5. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a inactivação da enzima C-22 esterol dessaturase ser realizada por inactivação génica.
6. 6. Estirpe de levedura de acordo com uma das reivindicações anteriores caracterizada por ser selecionada no género Saccharomyces ou Schizosaccharomyces.
7. 7. Estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae caracterizada por se tratar da estirpe WGIF04 depositado na Collection 1 Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) a 22 de Abril de 2004 sob o número de registo 1-3203.
8. 8. Método de produção de colesterol de origem não animal compreendendo a cultura de um organismo de acordo com uma das reivindicações anteriores.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a etapa de cultura do organismo ser seguida de uma etapa de extracção do colesterol.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizada por a extracção do colesterol ser efectuada por um solvente não miscivel em água.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por se efectuar uma etapa de saponificação antes da extracção do colesterol.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 9, 10 ou 11, caracterizada por se efectuar uma etapa de moagem mecânica das células antes da saponificação ou extracção do colesterol.
13. 13. Utilização de um organismo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 para a produção de colesterol, ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis marcados com 13C ou com 14C.
14. 14. Método de produção de colesterol, ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou de uma mistura de esteróis 2 marcados com 13C ou com 14C compreendendo as etapas seguintes: - cultura de um organismo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 num substrato marcado com 13C ou com 14C e, - extracção do referido colesterol, ou de um dos seus intermediários metabólicos, ou da mistura de esteróis.
15. 15. Método de preparação de uma mistura isotópica de colesterol, de intermediários ou de metabolitos do colesterol, marcados em diferentes posições com o auxilio de marcadores isotópicos, compreendendo a colocação em cultura de um organismo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 num substrato marcado, depois num substrato não marcado, sendo as durações de cultura em cada um destes substratos seleccionadas com a finalidade de obter um perfil isotópico definido. Lisboa, 26 de Setembro de 2012 3