BRPI0410355B1 - composição de vacina aviária para a proteção de aves contra doença e infecção causadas por e. coli e samonella - Google Patents

Abstract

"composição de vacina aviária para a proteção de aves contra doença e infecção causadas por e. coli e salmonella". a presente invenção refere-se a uma composição de vacina compreendendo uma combinação de um microorganismo s. typhimurium mutante de deleção genética e um microorganismo e. coli mutante de deleção genética adequada para aplicação em massa a aves. é também provido um método seguro e eficaz para proteger aves contra as destruições de infecção e doença por e. coli e salmonella.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE VACINA AVIÁRIA PARA A PROTEÇÃO DE AVES CONTRA DOENÇA E INFECÇÃO CAUSADAS POR E. COLIE SALMONELLA".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a vacinas aviárias de combinação contra infecções por Salmonelia e E. coli. Em particular, a invenção refere-se a uma composição de vacina para aves contendo uma cepa mutante viva, atenuada, respectivamente, de Salmonelia e E. coli. A invenção refere-se também a um método de prevenção de doença bacteriana em aves, incluindo galinhas, através da administração de uma vacina contendo microorganismos atenuados de Salmonelia e E. coli.

Antecedentes da Invenção Na indústria de aves, pintinhos recém-chocados são particular-mente suscetíveis à infecção por Salmonelia. Esta bactéria é espalhada a partir de material fecal, e os animais jovens podem se infectar a partir do solo ou talvez de alimento processado contaminado, levando a uma taxa de mortalidade alta e conseqüências econômicas sérias concomitantes. Em adição à Salmonelia, o ambiente de vida de aves também mantém grandes números de Escheríchia coli (£. coli) através de contaminação fecal, levando à infecção sistêmica nas aves através do trato respiratório e intestinos. Esta infecção por E. coli é referida como colibacilose. A bacteremia resultante progride para septicemia e morte, ou a infecção se estende para superfícies de serosa, pericárdio, juntas e outros órgãos. Ambas as doenças por £. coli e Salmonelia então apresentam um risco sério à indústria de aves em uma base contínua.

Estratégias de tratamento e prevenção contra Salmonelia incluem vacinação in ovo contra Salmonelose, tal como aquela descrita na US 6.231.871 B1. No entanto, vacinação in ovo pode ser difícil em instalações grandes de aves. Muitas chocadeiras não têm o equipamento sofisticado e especializado de vacinação no ovo que é necessário. Com relação à infecção por E. coli, o controle de infecções pré-dispostas ou fatores ambientais e o uso precoce de antibióticos são práticas aceitáveis para minimizar a pre- sença de E. coli em alojamentos de ave. Infelizmente, uma alta freqüência de resistência à tetraciclina, canamicina, neomicina, cefalotina, estreptomici-na e eritromicina foi observada.

Embora haja uma vacina para E. coli viva comercial disponível para uso contra colibacilose em perus, ela não parece ser uma vacina completamente adequada para uso em galinhas. Além disso, não parece haver qualquer composição de vacina de combinação disponível para proteção contra ambas as infecções por Salmonella e E, coli que seja segura e eficaz para aves, incluindo galinhas, e que seja adequada para administração econômica tal como aplicação em massa a aves pós-chocadas através de pulverização ou água de beber.

Desse modo, é um objetivo da presente invenção prover uma composição de vacina segura e eficaz contra infecção e doença causadas por espécies de Salmonella, incluindo Salmonella typhimurium, bem como contra Escherichia coli, em aves, incluindo galinhas, É um outro objetivo da presente invenção prover um método para a prevenção ou melhora da infecção ou doença causada por espécies de Salmonella (incluindo S. typhimurium, bem como outras tal como S. enteriti-dis e S. heidelberg) e por E. coli em aves. É uma característica da presente invenção que a composição de vacina seja adequada para aplicação em massa, tal como através da água de beber ou pulverização. É uma vantagem da presente invenção que uma composição de vacina viva proveja ambas as respostas de imunidade celular e humoral no hospedeiro.

Sumário da Invenção A presente invenção provê uma composição de vacina aviária segura e eficaz que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma combinação de um microorganismo mutante de deleção genética Escherichia coli e um microorganismo mutante de deleção genética Salmonella typhimurium e um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também provê um método para a preven- ção ou melhora de infecção ou doença por E. coli e Salmonella em aves que compreende administração às ditas aves de uma quantidade imunogenica-mente eficaz de uma combinação de um microorganismo mutante de dele-ção genética Escheríchia coli e um microorganismo mutante de deJeção genética Salmonella typhimurium.

Outros objetivos e características da invenção se tornarão mais aparentes a partir da descrição detalhada descrita abaixo.

Descrição Detaíhada da Invenção Colibacilose aviária em aves domésticas é freqüentemente associada com Escheríchia coli (E. coli) incluindo os sorotipos 078, 01, 02, bem como algumas cepas não-tipificadas especialmente virulentas. A infecção geralmente acontece através do trato respiratório, muitas vezes seguindo exposição a, ou infecção por, outras doenças da comunidade de aves. Em galinhas, a colibacilose geralmente afeta frangos criados para grelhar entre 3 a 10 semanas de vida e está associada com alta morbidade e mortalidade. A manifestação mais severa de colibacilose aviária é septicemia que é caracterizada por pericardite, periepatite e saculite aérea. Outros problemas incluem artrite e celulite. Isolatos de E. coli de aves são freqüentemente resistentes a drogas tal como ampicilina, cloranfenicol, oxitetraciclina, neo-micina, gentamicina, nitrofuranos, ácido nalidíxico, polimixina B, sulfonami-das ou similares. No entanto, o microorganismo mutante de deleção genética aroA de £ coli, £ coli aroA, tendo as características de identificação da cepa depositada com o American Type Culture Collection (ATCC) em 27 de março de 2003 e tendo o número ATCC PTA-5094, é seguro e eficaz para uso em uma vacina contra colibacilose em aves, incluindo galinhas. O imu-nógeno da vacina E. coli aroA- PTA-5094, quando administrado a galinhas, provê boas respostas imunes celular e humoral. Ainda, as ditas vacinas podem ser facilmente produzidas e podem ser administradas através de aplicação em massa, isto é, pulverização ou água de beber. A vacina E. coli a-roA PTA-5094 e a sua construção são também descritas no pedido de patente co-pendente Número de Série________________ depositado concomitante- mente com o presente e incorporado aqui a título de referência. Ainda, a in- venção compreende ainda outros mutantes de gene de E. coli viva, atenuada, incluindo mutantes de deleção, em particular mutantes de deleção de aroA particulares, como imunógenos como parte de uma vacina de combinação aqui descrita.

Uma outra fonte significante de infecção em aves domésticas é da bactéria Salmonella, incluindo Safmonella typhimuríum (S. typhimurium). Aves recém-chocadas são particuíarmente suscetíveis à infecção por Salmonella, e uma taxa de mortalidade alta como um resultado da mesma imediatamente após o choco pode ter conseqüências econômicas sérias. Muitas espécies de Salmonella também causam infecção em seres humanos e outros animais, tomando o controle de infecção por Salmonella em aves de importância particular. Vacinas de Salmonella atenuada viva mostraram proteger galinhas (Cooper e outros, Microb. Pathog., 9:255-265, 1990; Hassan e Curtis III, Res. Microbial., 141:839-950,1990). Importante, o microorganismo mutante de deleção de aroA S. typhimurium avirulenta tendo as características de identificação de S. typhimuríum STM-1 depositado no Australian Government Analytical Laboratories sob o Número de Acesso N93/43266 foi verificado ser particularmente eficaz na proteção das aves contra infecção e doença por Salmonella. O dito microorganismo STM-1 S. Typhimuríum e o seu construto são descritos na US 6.231.871, que é incorporada aqui a título de referência. Ainda, a invenção compreende outros mutantes de gene de Salmonella viva, atenuada, incluindo mutantes de deleção, em particular mutantes de deleção de aroA, como imunógenos como parte de uma vacina de combinação conforme aqui descrito.

Uma vez que as vias de vacinação in ovo e oral, tal como gavagem, podem ser difíceis e inconvenientes, uma composição de vacina adequada para aplicação em massa através de pulverização ou água de beber seria altamente preferida. Similarmente, uma composição dc vacina de combinação simples que fosse segura e eficaz contra ambas infecção e doença por E. colie Salmonella em aves seria particularmente preferida. No entanto, a qualquer momento que mais de um organismo é reunido em uma composição de vacina simples, a interferência pode ocorrer, de modo que tal res- posta imune não seja tão grande como quando o organismo individual foi administrado separadamente. Desse modo, uma composição de vacina compreendendo uma combinação de mais de um microorganismo não pode, em face disso, ser prevista elicitar o efeito desejado e pode na verdade ser menos eficaz do que a administração de cada microorganismo individualmente.

Surpreendentemente, foi verificado que uma composição do vacina que compreende: uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma combinação de um microorganismo mutante de deleção genética E. coli e um microorganismo mutante de deleção genética S. typhimurium; e um veículo farmacologicamente aceitável é seguro e eficaz para a proteção de a-ves contra doença e infecção causadas por Salmonella e E. coli. Vantajosamente, a composição da invenção compreende microorganismos avirulentos vivos atenuados como imunógenos capazes de indução de ambas as respostas de imunidade celular e humoral no hospedeiro, enquanto demonstrando segurança mesmo quando administrada através do sistema respiratório. Esta segurança inerente permite vias de aplicação em massa econômicas e eficientes tais como pulverização (por exemplo, pulverização grossa) ou água de beber, ou ambos, até mesmo em idades muito jovens. Esta característica é importante uma vez que a administração de dois imunógenos bacterianos através das mucosas respiratórias de aves jovens seria de outro modo esperada ter um efeito prejudicial considerável em animais.

As quantidades imunogenicamente eficazes dos respectivos microorganismos na vacina de combinação podem variar de acordo com a idade e o tamanho do hospedeiro, a gravidade da infecção, a virilidade do pató-geno, o modo de administração ou similares. Em gerai, quantidades eficazes adequadas por unidade de dosagem podem ser cerca de 102 a 104 unidades de formação de colônia (cfu), de preferência cerca de 5,0x102 cfu a 5,0x1010 cfu, com mais preferência cerca de 3,0x106 cfu a 6,0x10e cfu do microorganismo mutante de deleção genética de E. coli e cerca de 102 a 1014 cfu, de preferência cerca de 5,0x102a 5,0x101° cfu, com mais preferência cerca de 2,0x106 a 6,0x105 cfu do microorganismo mutante de deleção genética S. typhimurium.

Uma ou duas unidades de dosagem podem ser contempladas pelo versado na técnica. Se duas unidades de dosagem forem selecionadas, então a vacinação é tipicamente realizada por volta do 1 dia pós-choco e novamente por volta de uma a duas semanas de vida. Uma unidade de dosagem é desejavelmente cerca de 0,5 a 1 mL de vacina por ave, mas esta quantidade pode ser otimizada para liberar uma quantidade imunogenica-mente eficaz do respectivo microorganismo acima descrito.

Os microorganismos mutantes de deleção genética E. coli e S. typhimurium adequados para uso na composição da invenção podem ser um microorganismo de E. coli ou S. typhimurium que foi modificado através de indução de uma mutação em um curso biossintético de um aminoácido ou vitamina ou outra molécula essencial; de preferência, a mutação afeta a bi-ossíntese de um ou mais dos aminoácidos selecionados de alanina, argini-na, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; com mais preferência através de indução de uma mutação em uma via biossintética de vitamina aromática; particularmente de preferência através de indução de uma mutação na via aro, mais particularmente no gene aroA. Exemplos específicos dos microorganismos mutantes de deleção genética E. coli e S. typhimurium são, respectivamente, o microorganismo aroA de Escherichia coli depositado no American Type Culture Collection em 27 de março de 2003 e concedido o número PTA-5094, daqui em diante designado como E. coli aroA- PTA-5094 e cepa STM-1 de Salmonelia typhimurium, depositada no Australian Government Analytical Laboratories sob o Número de Acesso N93/43266, daqui em diante designada como S. typhimurium STM-1.

Os microorganismos mutantes de deleção genética como parte da vacina da invenção podem ser serialmente passados usando meios e técnicas disponíveis ao versado na técnica. A passagem serial pode servir ainda para atenuar a cepa para torná-la mais adequada como um imunóge-no de vacina. Até cerca de 10 passagens seriais são contempladas, com cerca de 3 a 5 sendo preferidas.

Os veículos farmacologicamente aceitáveis para uso na composição de vacina da invenção podem ser qualquer veículo líquido convencional adequado para composições farmacêuticas veterinárias, de preferência uma solução de sal equilibrada adequada para uso em meio de tecido ou meio de cultura de célula tal como solução salina tamponada de fosfato estéril, com mais preferência água destilada. Outros meios adequados podem incluir emulsões. A vacina da invenção pode também ser um adjuvante escolhido pelo versado na técnica. Quando a aplicação da vacina é através de água de beber, leite em pó desnatado pode ser utilizado como veículo. O leite em pó desnatado parece estabilizar a vacina, e talvez neutraliza a ação de alguns minerais traço que podem afetar a viabilidade.

Na prática atual, o microorganismo mutante de deleção genética E. coli pode ser combinado com o microorganismo mutante de deleção genética S. typhimuríum e os microorganismos combinados podem ser misturados com um veículo líquido e administrados como um aditivo em pulverização ou água de beber. Alternativamente, cada microorganismo individual pode ser misturado como um veículo líquido e então combinado junto para administração com um aditivo em pulverização ou água de beber, ou pode ser administrado simultaneamente.

Desse modo, a presente invenção também provê um método para a prevenção ou melhora de infecção ou doença por E. coli e Salmonella em aves que compreende administração à dita ave de uma quantidade imu-nogenicamente eficaz de uma combinação de um microorganismo mutante de deleção genética E. coli e um microorganismo mutante de deleção genética S. typhimuríum.

Aves adequadas para uso no método da invenção incluem galinhas, patos, perus, gansos, bantans, codorna, pombos ou similar, de preferência aves comercialmente importantes tal como galinhas, patos, gansos e perus, com mais preferência galinhas e perus, particularmente de preferência galinhas. O microorganismo mutante de deleção genética E. coli e o mi- croorganismo mutante de deleção genética S. typhimurium podem ser administrados através de qualquer meio convencional, de preferência um meio economicamente viável para a indústria de ave tal como administração em massa através de pulverização ou água de beber.

Os microorganismos mutantes de deleção genética S. typhimurium e E-cof\ adequados para uso no método da invenção podem ser um microorganismo de £ co// ou S. typhimurium que foi modificado através da indução de uma mutação em uma via biossintética de um aminoácida ou vitamina ou outra molécula essencial; de preferência, a mutação afeta a biossín-tese de um ou mais aminoácidos selecionados de alanina, arginina, aspara-gina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, gfutamina, glicína, bistidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; com mais preferência através de indução de uma mutação em uma via biossintética de vitamina aromática; particularmente de preferência através de indução de uma mutação na via aro, mais particular- f mente iio gene aroA. Exemplos específicos dos microorganismos mutantes de deleção genética E. coli e S. typhimurium são aqueles tendo as características de identificação, respectivamente, E. coli aroA- PTA-5094 e S. typhimurium STM-1.

Quantidades imunogenicamente eficazes adequadas para uso no método da invenção podem variar de acordo com a idade e tamanho do hospedeiro, a gravidade da infecção, a virulência do patógeno, o modo de administração ou similares. Em geral, quantidades eficazes adequadas podem ser aquelas quantidades de um microorganismo mutante de deleção genética E. coli suficientes para prover cerca de 102 a 1014 cfu, de preferência cerca de 5,0x102 a 5,0x1010 cfu, com mais preferência cerca de 3,0x106 cfu a 6,0x106 dfu por unidade de dosagem e aquela quantidade de um microorganismo mutante de deieção genética S. typhimurium suficiente para prover cerca de 102 a 1014 cfu, de preferência cerca de 5,0x102 a 5,0x1010 cfu, com mais preferência cerca de 2,0x106 a 6,0x106 cfu por unidade de dosagem.

Para uma compreensão mais clara da invenção, os exemplos são descritos abaixo. Esses exemplos são meramente ilustrativos e não pretendem limitar o escopo ou princípios de base da invenção de modo algum. Na verdade, várias modificações da invenção, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir dos exemplos descritos abaixo e a descrição precedente. Tais modificações pretendem também se encaixar no escopo das reivindicações apensas. EXEMPLO 1 CONSTRUTO DE MUTANTE DE E. COLI COM GENE AROA DELETADO I) Recipiente O organismo de origem é um isoíato de ave de £. coli isolada de um caso clínico de colibacilose aviária submetido ao Veterinary Laboratories Agency (VLA), Addlestone, Surrey, UK e sorotipado no VLA em 1995. A cepa de origem foi selecionada quanto à sua colonização, invasão, persistência e pato-genicidade em pintinhos SPF de um dia de vida e através de caracterização in vitro quanto ao seu padrão de sensibilidade a antibiótico. A cepa recipiente foi gerada através de conjugação entre o doador transformado (K12 S17 λ pir de E. coli carregando PNG101 com aroA carregando a deleção de 100 pb) e a cepa de origem do tipo selvagem (isolato EC34195 de E. coíi do tipo selvagem). II) Caracterização da Deleção O gene aroA, que codifica 3-fosfoenolpiruvilchiquimato-5-fo$fato sintetase, uma enzima do curso biossíntético aromático comum, está localizado adjacente e promoterdistal a serC no operon serC-aroA. A perda de função para o gene aroA no recipiente resulta na necessidade de metaboli-tos aromáticos, incluindo tirosina, fenilalanina, triptofano, p-aminobenzoato (PABA) e 2,3-dihidroxibenzoato. A necessidade de PABA, um metabolito não encontrado em tecidos vertebrados, resulta na atenuação de crescimento in vivo. (II) Construção do Mutante de E. coli com aroA Deletado a) Primers de PCR são esboçados incorporando locais de restrição Srfl e BglU e códons de parada para amplificar dois produtos de PCR sepa- rados de aproximadamente 650 bp para as extremidades 5' e 3' do gene a-roA do isolato 078 de E. coli de ave descrito acima. b) Ambos os produtos de PCR são digeridos com Sg/ll por 2 horas, a eletroforese é realizada por 1 hora a 100 volts, as faixas são excisadas e as respectivas faixas são purificadas usando o kit de preparação de faixa Se-phaGlas. c) Volumes iguais de cada produto de PCR purificado são misturados e ligados em pCR2.1. d) Plasmídeos ligados carregando aroA são transformados em células maxicompetentes DH5a e a clonagem é confirmada através de mapeamento de enzima de restrição e PCR. e) 0 gene aroA completo com deleção de pCR2,1 é excisado com E-coN e Spel, então purificado e ligado em um vetor pré-digerido (Spel) suicida (SacB, pKNB101), transformado em K12 S17 λ pir de E coli competente e clonagem é confirmada através de mapeamento de enzima de restrição e PCR. f) Uma conjugação é realizada entre o doador (S17 λ pir de E. coli carregando pKNG101 com aroA carregando deleção de 100 bp) e isolato de £. coli do tipo selvagem. g) Colônias que aparecem após incubação de 48 horas a 37° C são subculturadas em meio mínimo suplementado com gentamicina e estrepto-micina e aminoácidos aromáticos (20 mg/l de cada DL triptofano, DL fenila-lanina e DL tirosina). Colônias individuais são testadas através de PCR. As colônias que deram um produto de PCR do tipo selvagem e produtos de PCR mutados de um pouco menos de 100 pb são retidas para mais estudos. h) Cruzamentos únicos são culturados em caldo LB-G suplementado com sacarose a 10% a 37° C com agitação suave por 16 horas. Diluições seriais das culturas de um dia para o outro são postas em placa em placas de LB-G suplementadas com sacarose a 10% e incubadas a 37° C por 16 horas. i) Colônias que crescem em placas LB-G de sacarose a 10% são sub- culturadas em cada uma de LB-G, LB-G + gentamicina e estreptomicina e mínima e incubadas a 37° C por 16 horas. As colônias que crescem apenas nas placas LB-G (cruzamentos duplos} são subculturadas em ágar de sangue de ovelha a 5% e mantidas a 4o C. II) Vetor de Clonagem Intermediário O vetor suicida (SacB, PNG101) era o vetor de clonagem intermediário. A conjugação foi realizada entre o doador (S17 carregando PNG101 com arok carregando deleção de 100 bp) e isolato de E. coli do tipo selvagem. EXEMPLO 2 PREPARACAO DE SEMENTE PRINCIPAL A cepa de E. coli arok (construída no exemplo 1) é cultivada em placa de agar de soja tríptica uma vez e passada 3 vezes em caldo de soja tríptico. A cultura é distribuída em frascos de vidro, vedada e Itofilizada. EXEMPLO 3 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE UMA COMBINAÇÃO DE UM MICROORGANISMO MUTANTE DE DELEÇÃO GENÉTICA DE E. COLI MAIS UM MICROORGANISMO MUTANTE DE DELEÇÃO GENÉTICA DE S. TRYPHI-MURIUM EM GALINHAS CONTRA INFECÇÕES POR SALMONELLA E E. COLI

Nesta avaliação, o microorganismo mutante de deleção genética E. coli usado é a cepa E. coli arok preparada nos exemplos 1 e 2 acima e o microorganismo mutante de deleção genética S. typhimuri-um usado é o S. typhimurium STM-1 preparado conforme descrito na US 6.231.871 B1.

Para esta avaliação, galinhas brancas que põem ovos com fre-qüência 103 SPF de gênero misto são divididas em 5 grupos, 2 grupos de 25 cada, 2 grupos de 24 cada e um grupo de controle de 5 (não-vacinada, não-provocada). As aves são pegas com a mão e postas em um isolador arbitrariamente designado. Cada grupo de teste é alojado em 2 isoladores, cada um contendo 12 a 13 aves.

Os grupos de teste A e B (vacinados) são vacinados em um dia de vida com pulverização grossa usando um pulverizador portátil. Em um dia de via, as aves em cada um dos grupos de Teste A e B são agrupadas em um recipiente pequeno e a vacina de microorganismo mutante de deleçâo genética E. colie S. typhimurium combinada é pulverizada sobre as cabeças das aves até que a dosagem calibrada seja dada (um alvo de 5,0x106 cfu de E. coli arok- PTA-5094 e um alvo de 5,0x106 cfu de S. typhimurium STM-1 por dose de 0,5 mL por ave). Cada vacina, E. coli arok- PTA-5094 e S. typhimurium STM-1, é diluída com solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) e então misturada antes da vacinação. Com duas semanas de vida, os grupos de teste A e B são vacinados novamente através da via de água de beber. As aves são privadas de água de beber por 3 horas antes da vacinação através da via de água de beber. As duas vacinas preparadas acima para a aplicação através de pulverização são adicionadas a uma quantidade medida de água destilada fria para um título final de 5,0x106 dfu por dose (0,5 mL por ave) para cada vacina. A água contendo vacina é então a única fonte de água de beber. Uma vez que a água contendo vacina consumida, o bebedouro é removido da unidade e a fonte de água de beber regular é retomada.

Com seis semanas de vida, cada ave no grupo de teste A (vacinado) e grupo de teste C (não-vacinado) é provocada através de via intrate-cal (IT) com uma cepa virulenta de £ coli 078 em um título de 5,89x108 cfu por dose. Também, com seis semanas de vida, cada ave no grupo de teste B (vacinado) e grupo de teste D (não-vacinado) é provocada através de ga-vagem oral com uma cepa resistente a ácido nalidíxico de S. typhimurium em um título de 4,0x106 cfu por dose. O grupo de teste E é não-vacinado e não-provocado (grupo de controle negativo). Aves vacinadas e de controle são criadas em ísoladores separados até o término do estudo.

Todas as aves estão sob cuidado veterinário com alimento e á-gua disponíveis ad libitum. As aves são observadas diariamente por 7 dias pós-provocação. No final do período de 7 dias pós-provocação, todas as a-ves sobreviventes são necropsiadas e os grupos A e C são examinados quanto à presença de lesões típicas de colibacilose aviária. Aves não- sobreviventes e aves que demonstraram qualquer uma das lesões grosseiramente visíveis tais como periepatite, pericardíte, saculite aérea, celulite ou artrite, são consideradas positivas para colibacilose. Os dados são mostrados na tabela 1.

Os grupos B e D são examinados quanto à colonização por S. typhimurium nos órgãos. Os dados são mostrados na tabela II. TABELA 1 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE UMA COMBINAÇÃO DE MICROORGANISMOS MUTANTES DE DELEÇÃO GENÉTICA E. COLI E S. TYPHIMURIUM EM GALINHAS CONTRA INFECÇÃO E DOENÇA CAUSADAS POR E. CO-U 078* aPeriepatite bPericardite cSaculite aérea dCelulite eArtrite *A vacina é administrada a galinhas como um auxílio na prevenção de colibacilose associada com infecção por E. coli.

TABELA II AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE UMA COMBINAÇÃO DE MICROORGANISMOS MUTANTES DE DELEÇÃO GENÉTICA E. COLI E S. TYPHIMURIUM EM GALINHAS CONTRA INFECÇÃO E DOENÇA CAUSADAS POR SAL-MONELLA* aGavagem oral *A vacina é administrada a galinhas como um auxílio na redução de colonização dos órgãos internos por Salmone/la, incluindo os intestinos e ceco.

Como os resultados das tabelas I e II indicam, há uma redução significante em ambas colibacilose associada com infecção por E. coli e incidência de infecção por Salmonella, como um resultado da vacina de combinação da invenção. Na tabela II, há uma grande redução na colonização de Saimonelia, significando que menos aves foram infectadas e são então menos prováveis de desenvolver doença completa ("full-blown"), e são menos prováveis de transmitir a doença aos seus ovos.

Claims (10)

1. Composição de vacina aviária, caracterizada pelo fato de que compreende: uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma combinação de um micro-organismo mutante de deleção genética Escherichia coli e um microorganismo mutante de deleção genética Salmonella typhimurium, em que o mutante de deleção genética compreende um construto de mutante de deleção aroA, que causa uma atenuação do crescimento in vivo de E. coli e S. typhimu-riumin na ausência de p-aminobenzoato (PABA) e um veículo farmacologica-mente aceitável.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito veículo é uma solução de sal equilibrada adequada para o uso em tecido ou meio de cultura celular.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito veículo é água destilada.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a quantidade imunogenicamente eficaz é suficiente para prover cerca de 5,0x102 cfu a 5,0x1010 cfu do dito micro-organismo mutante de deleção genética Escherichia coli e cerca de 5,0x102 cfu a 5,0x1010 cfu do dito micro-organismo mutante de deleção genética Salmonella typhimurium.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o micro-organismo mutante de deleção genética Escherichia coli é um micro-organismo E. coli aroA.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito micro-organismo é E. coli aroA com número de acesso ATCC PTA-5094.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito micro-organismo mutante de deleção genética Salmonella typhimurium é um micro-organismo S. typhimurium aroA.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dito micro-organismo é S. typhimurium STM-1 depositado no Austra-lian Government Analytical Laboratories com número de acesso N93/43266.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o dito micro-organismo mutante de deleção genética é Es-cherichia coli aroA- PTA-5094.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a quantidade imunogeneticamente eficaz é uma quantidade suficiente para prover cerca de 3,0x106 a 6,0x10® cfu de E. coli aroA- PTA-5094 e cerca de 2,0x10® a 6,0x10® cfu de S. typhimurium STM-1.