KR20060012001A - 이. 콜라이 및 살모넬라에 대한 조류 배합 백신 - Google Patents

이. 콜라이 및 살모넬라에 대한 조류 배합 백신 Download PDF

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Abstract

가금류에 대량 적용하기에 적합한, 유전자 결실 돌연변이체 에스. 티피무리움 미생물과 유전자 결실 돌연변이체 이. 콜라이 미생물의 배합물을 포함하는 백신 조성물을 제공하고 있다. 또한, 이. 콜라이 및 살모넬라 감염 및 질환의 피해로부터 가금류를 보호하는 안전하고 효과적인 방법을 제공한다.
에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물, 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물, 조류 백신 조성물, 면역원성 유효량, 가금류

Description

이. 콜라이 및 살모넬라에 대한 조류 배합 백신{Avian combination-vaccine against E. coli and Salmonella}
본 발명은 살모넬라 및 이. 콜라이 감염에 대한 조류 배합 백신에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각각 살모넬라 및 이. 콜라이의 약독화된 균주인 생 돌연변이체를 함유하는 가금류에 대한 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 살모넬라와 이. 콜라이의 약독화된 미생물을 함유하는 백신을 투여함으로써 닭을 포함한 가금류에서 세균성 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다.
가금류 산업에서, 갓 부화한 병아리는 특히 살모넬라에 감염되기 쉽다. 이러한 세균은 대변 물질로부터 확산되고, 어린 동물들은 흙 또는 어쩌면 오염된 가공 식이로부터 감염되어 높은 사망률 및 이에 수반되는 심각한 경제적 결과를 야기할 수 있다. 살모넬라 이외에, 가금류 우리 환경은 또한 대변 오염을 통해 다수의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(이. 콜라이)를 보유하여 가금류에서 기도 및 장을 통한 전신성 감염을 야기할 수 있다. 이러한 이. 콜라이 감염을 대장균증이라고 한다. 상기 결과로 생기는 균혈증은 패혈증 및 사망으로 진행되거나, 상기 감염은 장막 표면, 심장막, 관절 및 다른 기관으로 확장된다. 따라서, 이. 콜라이 및 살모넬라 질환 둘다 계속적인 체계로 가금류 산업에 심각한 위협이 되고 있다.
살모넬라에 대한 치료 및 예방 전략은 미국 특허 제6,231,871 B1호에 기재된 것과 같이 살모넬라증에 대한 난 상태(in ovo)의 예방접종을 포함한다 . 그러나, 난 상태의 예방접종은 대규모 가금류 시설에서는 힘들 수 있다. 다수의 부화장은 필요한 복잡하고 전문화된 알을 예방접종하는 장치가 부족하다. 이. 콜라이 감염과 관련하여, 감염을 일으키는 소인 또는 환경적 인자의 제어 및 항생제의 조기 사용이 가금류 우리내 이. 콜라이 존재를 최소화하기 위한 허용되는 방안이다. 불행히도, 테트라사이클린, 카나마이신, 네오마이신, 세팔로틴, 스트렙토마이신 및 에리트로마이신에 대한 내성의 상당한 빈발이 관찰되었다.
칠면조의 대장균증에 대하여 사용가능한 이. 콜라이 생백신이 시판중이지만, 이는 닭에서 사용하기에는 완전히 적합한 백신인 것으로 보이지는 않는다. 또한, 닭을 포함한 가금류에 있어서 안전하고 효과적이며, 스프레이 또는 음료수를 통하여 부화후의 새에게 대량 적용하는 것과 같이 경제적 투여에 적합한, 살모넬라 및 이. 콜라이 감염 둘다로부터 보호하기 위해 사용가능한 어떠한 배합 백신 조성물도 존재하지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은, 닭을 포함한 가금류에서 에스케리키아 콜라이에 대한 것 뿐만 아니라 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)을 포함한 살모넬라 종으로 야기된 감염 및 질환에 대해 안전하고 효과적인 백신 조성물을 제공하 는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 가금류에서 살모넬라 종(예를 들어, 에스. 티피무리움 및 기타 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis) 및 에스. 하이델베르크(S. heidelberg)) 및 이. 콜라이에 의해 야기된 감염 또는 질환을 예방하거나 경감시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특징은, 백신 조성물이 음료수 또는 스프레이를 통해서와 같이 대량 적용에 적합하다는 것이다.
본 발명의 이점은, 생백신 조성물이 숙주에서 세포 및 체액 면역 반응 둘다를 제공한다는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 면역원성 유효량의 배합물 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안전하고 효과적인 조류 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 이. 콜라이 및 살모넬라 감염 또는 질환인 가금류에게 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 면역원성 유효량의 배합물을 투여함을 포함하여, 상기 가금류에서 이. 콜라이 및 살모넬라 감염 또는 질환을 예방하거나 경감시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 특징은 본원 하기 제시된 상세한 기재로부터 보다 명백하게 될 것이다.
가축 가금류에서의 조류 대장균증은 혈청형 O78, O1, O2 및 몇몇 특히 독성의 형이 없는 균주를 포함한 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이)와 빈번하게 관련되어 있다. 통상적으로 감염은 다른 가금류 집단 질환에 노출된 후, 또는 감염된 후 기도를 통해 발생한다. 닭에서, 대장균증은 일반적으로 3 내지 10주령의 브로일러에 영향을 미치고, 높은 이환율 및 사망률과 관련있다. 조류 대장균증의 가장 심각한 징후는 심막염, 간주위염 및 기낭염을 특징으로 하는 패혈증이다. 다른 문제점으로는 관절염 및 봉소염이 포함된다. 가금류로부터의 이. 콜라이 분리주는 종종 암피실린, 클로르암페니콜, 옥시테트라사이클린, 네오마이신, 젠타마이신, 니트로푸란, 날리딕산, 폴리믹신 B 또는 설폰아미드 등과 같은 약물에 내성이다. 그러나, 2003년 3월 27일 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)ATCC)에 기탁되고 ATCC 수탁번호가 PTA-5094인 균주의 확인된 특징을 갖는, 이. 콜라이 aroA 유전자 결실 돌연변이체 미생물인 이. 콜라이 aroA-는 닭을 포함한 가금류에서 조류 대장균증에 대한 백신으로 사용하기에 안전하고 효과적이다. 이. 콜라이 aroA- PTA-5094 백신 면역원을 닭에게 투여하는 경우, 이는 우수한 세포 및 체액 면역 반응을 제공한다. 또한, 상기 백신은 용이하게 제조되고, 대량 적용, 즉, 스프레이 또는 음료수를 통하여 투여될 수 있다. 또한, 이. 콜라이 aroA- PTA-5094 백신 및 이의 작제물은 이와함께 동시에 출원되고, 본원에 참조로 인용된 공계류중인 특허원 제___호에 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 배합 백신의 부분으로서의 면역원으로서 결실 돌연변이체, 특히 aroA 결실 돌연변이체를 포함한 다른 약독화된 이. 콜라이 유전자 생 돌연변이체를 추가로 고려하고 있다.
가축 가금류에서의 또다른 중요한 감염원은 살모넬라 티피무리움(에스. 티피무리움)을 포함한 살모넬라 세균이다. 갓 부화된 새는 특히 살모넬라에 감염되기 쉽고, 그 결과 부화 직후 상당한 사망률이 야기되어 심각한 경제적 결과를 가질 수 있다. 또한, 다수종의 살모넬라는 사람 및 다른 동물에서 감염을 야기하므로, 가금류에서 살모넬라 감염을 제어하는 것이 특히 중요하다. 약독화된 살모넬라 생백신은 닭을 보호하는 것으로 나타났다[참조: Cooper, et al., Microb. Pathog., 9:255-265, 1990; Hassan and Curtis III, Res. Microbial., 141:839-950, 1990]. 중요하게는, 수탁번호 N93/43266하에 오스트랄리안 거번먼트 아날리티컬 래보러터리즈(Australian Government Analytical Laboratories)에 기탁된 에스. 티피무리움STM-1의 확인된 특징을 갖는 무독성 에스.　티피무리움 aroA 결실 돌연변이체 미생물은 살모넬라 감염 및 질환으로부터 가금류를 보호하는데 특히 효과적인 것으로 발견되었다. 상기 에스. 티피무리움 STM-1 미생물 및 이의 작제물은 미국 특허 제6,231,871호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로서 인용된다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 배합 백신의 부분으로서의 면역원으로서 결실 돌연변이체, 특히 aroA 결실 돌연변이체를 포함하는 기타 약독화된 살모넬라 유전자 생 돌연변이체를 추가로 고려한다.
난 상태 및 급식과 같은 경구 예방접종 경로가 힘들고 불편할 수 있기 때문에, 스프레이 또는 음료수를 통한 대량 적용에 적합한 백신 조성물이 상당히 바람직하다. 유사하게는, 가금류에서 이. 콜라이와 살모넬라 감염 둘다에 대해 안전하고 효과적인 단일 배합 백신 조성물이 특히 바람직하다. 그러나, 하나 이상의 유기체가 단일 백신 조성물로 어셈블리되는 과정에서, 간섭이 발생하여 면역 반응이 각각의 유기체를 개별적으로 투여한 경우에서 보다 크지 않을 수 있다. 따라서, 하나 이상의 미생물의 배합을 포함하는 백신 조성물은 이를 적용할 경우 목적하는 효과를 야기할 것으로 예측할 수 없고, 각각의 미생물을 개별적으로 투여하는 경우보다 실제로 덜 효과적일 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 면역원성 유효량의 배합물 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물이 살모넬라 및 이. 콜라이에 의해 야기된 질환 및 감염으로부터 가금류를 보호하는데 안전하고 효과적인 것으로 발견되었다. 유리하게는, 본 발명의 조성물은 숙주에서 세포 및 체액의 면역 반응을 둘다 유도할 수 있는 면역원으로서 무독성 약독화된 생 미생물을 포함하고, 호흡기를 통해 투여되는 경우에서 조차 안전한 것으로 증명되었다. 이러한 타고난 안전성으로 인하여 상당히 어린 월령기에서 조차 스프레이(예를 들어, 조악한 스프레이) 또는 음료수, 또는 둘다와 같은 경제적이고 효과적인 대량 적용을 가능하게 한다. 이러한 특성은, 그렇지 않은 경우 어린 새의 호흡기 점막을 통한 2개의 세균성 면역원의 투여가 상기 동물들에게 상당한 해로운 효과를 가질 것으로 예상되기 때문에 중요하다.
배합 백신에서 각각의 미생물의 면역원성 유효량은 숙주의 월령 및 크기, 감염의 중증도, 병원체의 생식력 또는 투여 방법에 따라서 달라질 수 있다. 일반적으로, 용량 단위당 적합한 유효량은 약 102 내지 104콜로니 형성 단위(cfu), 바람직하게는, 약 5.0 x 102cfu 내지 5.0 x 1010cfu, 보다 바람직하게는 약 3.0 x 106cfu 내지 6.0 x 106cfu의 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물일 수 있고, 약 102 내지 1014cfu, 바람직하게는 약 5.0 x 102 내지 5.0 x 1010cfu, 보다 바람직하게는 약 2.0 x 106 내지 6.0 x 106cfu의 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물일 수 있다.
1 또는 2회의 용량 단위가 숙련가에 의해 고려될 수 있다. 2회의 용량 단위가 선택되는 경우, 예방접종은 전형적으로는 약 부화 1일 후와 다시 약 1 내지 2주령에서 이루어진다. 용량 단위는 바람직하게는 새 1마리당 약 0.5 내지 1mL이지만, 상기 용량은 상기 기재된 각각의 미생물의 면역원성 유효량을 전달하도록 최적화될 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물은, 아미노산 또는 비타민 또는 기타 필수 분자의 생합성 경로에서 돌연변이를 유도함으로써; 바람직하게는, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 생합성에 영향을 미치는 돌연변이에 의해; 보다 바람직하게는, 방향족 비타민 생합성 경로에 돌연변이를 야기함으로써; 특히 바람직하게는 aro 경로, 보다 특히 aroA 유전자에서 돌연변이를 유도함으로써 변형된 이. 콜라이 또는 에스. 티피무리움 미생물일 수 있다. 바람직한 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 구체적 예로는 각각 2003년 3월 27일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되고, 수탁번호 PTA-5094번이며, 하기 이. 콜라이 aroA- PTA-5094로서 명명된, 에스케리키아 콜라이 aroA- 미생물 및 수탁번호 N93/43266하에 오스트랄리안 거번먼트 아날리티컬 래보러터리즈에 기탁되고, 하기 에스. 티피무리움 STM-1로서 명명된, 살모넬라 티피무리움 균주 STM-1이 있다.
본 발명의 백신의 부분으로서의 유전자 결실 돌연변이체 미생물을 숙련가가 이용가능한 배지 및 기술을 사용하여 일련으로 계대시킬 수 있다. 일련의 계대는 균주를 더욱 약독화하여 백신 면역원으로서 보다 적합하게 만들 수 있다. 약 10회 이하의 일련의 계대가 고려되고, 바람직하게는 약 3 내지 5회이다.
본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적합한 약리학적으로 허용되는 담체는 수의학적 약제학적 조성물에 적합한 임의의 통상적인 액체 담체, 바람직하게는 멸균 인산염 완충 식염수와 같은 조직 또는 세포 배양 배지에 사용하기에 적합한 평형 염 용액, 보다 바람직하게는 증류수일 수 있다. 다른 적합한 배지로는 에멀젼이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 숙련가에 의해 아쥬반트화될 수 있다. 백신을 음료수를 통해 적용하는 경우, 무-지방 분유가 담체로서 사용될 수 있다. 무-지방 분유는 백신을 안정화시키고, 아마도 생존에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 미량 미네랄의 작용을 중성화하는 것으로 보인다.
실질적으로 수행하는데 있어서, 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물을 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 배합하고, 배합된 미생물을 액체 담체와 혼합하여 스프레이 또는 음료수 첨가제로서 투여할 수 있다. 대안으로, 각각의 개별적 미생물을 액체 담체와 혼합한 후, 스프레이 또는 음료수 첨가제로서 투여하기 위해 함께 배합하거나, 동시에 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 면역원성 유효량의 배합물을 이. 콜라이 및 살모넬라 감염 또는 질환인 가금류에게 투여함으로 포함하여, 상기 가금류에서 이. 콜라이 및 살모넬라 감염 또는 질환을 예방하거나 경감시키기 위한 방법을 제공한다 .
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 가금류는 닭, 오리, 칠면조, 거위, 밴텀닭, 메추라기, 꿩 또는 비둘기 등, 바람직하게는 통상적으로 중요한 가금류, 예를 들어 닭, 오리, 거위 및 칠면조, 보다 바람직하게는 닭 및 칠면조, 특히 바람직하게는 닭이 포함된다.
이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물 및 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물은 임의의 통상적인 방법, 바람직하게는 가금류 산업에 있어서 경제적으로 실행가능한 방법, 예를 들어 스프레이 또는 음료수를 통한 대량 투여에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물은 아미노산 또는 비타민 또는 기타 필수 분자의 생합성 경로에서 돌연변이를 유도함으로써; 바람직하게는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 생합성에 영향을 미치는 돌연변이에 의해; 보다 바람직하게는 방향족 비타민 생합성 경로에서 돌연변이를 유도함으로써; 특히 바람직하게는 aro 경로, 보다 특히 aroA 유전자에서 돌연변이를 유도함으로써 변형된 이. 콜라이 또는 에스. 티피무리움 미생물일 수 있다. 바람직한 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 구체적 예로는 각각 이. 콜라이 aroA- PTA-5094 및 에스. 티피무리움 STM-1의 확인된 특성을 갖는 미생물이다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 면역원성 유효량은 숙주의 월령 및 크기, 감염의 중증도, 병원체의 생식력 또는 투여 방법 등에 따라서 달라질 수 있다. 일반적으로, 적합한 유효량은 단위 용량당 약 102 내지 1014cfu, 바람직하게는 약 5.0 x 102 내지 5.0 x 1010cfu, 보다 바람직하게는 약 3.0 x 106cfu 내지 6.0 x 106cfu를 제공하기에 충분한 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 양 및 단위 용량당 약 102 내지 1014cfu, 바람직하게는 약 5.0 x 102 내지 5.0 x 1010cfu, 보다 바람직하게는 약 2.0 x 106cfu 내지 6.0 x 106cfu를 제공하기에 충분한 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 양일 수 있다.
본 발명의 보다 명확한 이해를 위해서, 다음 실시예가 하기 제시되어 있다. 이들 실시예는 단지 예시하고자 함이고, 본 발명의 취지 또는 근원적인 본질을 어떠한 방법으로도 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형은 하기 제시된 실시예 및 상기 기재로부터 당해 기술분야 숙련가에게 명백할 것이다. 또한, 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 포함되어야 한다.
실시예 1
aroA 유전자 결실된 이. 콜라이 돌연변이체의 작제
I) 수용체
모 유기체는 수의학 실험청(VLA)(Addlestone, Surrey, UK)에 기탁되고, 1995년 VLA에서 혈청형으로 분류된 임상적 경우의 조류 대장균증으로부터 분리된 이. 콜라이의 조류 분리주이다. 모 균주를 1일령의 SPF 병아리에서 이의 콜로니화, 침습성, 지속성 및 병원성에 대하여 선택하고, 이의 항생제 민감성 패턴에 대하여 시 험관내 특성화한다. 수용체 균주는 형질전환된 공여체(aroA를 함유하는 100bp가 결실된, 이. 콜라이 K12 S17 λ pir을 함유하는 PNG101)와 야생형 모 균주(야생형 이. 콜라이 분리주 EC34195) 사이의 접합에 의해 생성시켰다.
II) 결실의 특성화
통상적인 방향족 생합성 경로의 효소인 3-포스포에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신세타제를 암호화하는 aroA 유전자를 serC-aroA 오페론내 serC에 대한 프로모터 말단에 인접하게 위치시킨다. 수용체에서 aroA 유전자의 작용 손실이 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, p-아미노벤조에이트(PABA) 및 2,3-디하이드록시벤조에이트를 포함하는 방향족 대사산물에 대한 소요를 야기한다. 척추동물 조직에서 발견되지 않는 대사산물인 PABA에 대한 소요는 생체내 증식의 약독화를 야기한다.
III) aroA 결실된 이. 콜라이 돌연변이체의 작제
a) SrfI 및 BglII 제한 부위 및 정지 코돈을 혼입시켜 상기 기재된 가금류 이. 콜라이 O78 분리주로부터의 aroA 유전자의 5' 및 3' 말단에 대하여 대략 650bp의 2개의 개별적 PCR 산물을 증폭시키도록 PCR 프라이머를 디자인한다.
b) 두개의 모든 PCR 산물을 2시간 동안 BglII로 분해하고, 100볼트에서 1시간 동안 전기영동시킨 후, 밴드를 절제하고, 각각의 밴드를 SephaGlas bandprep 키트를 사용하여 정제한다.
c) 동일 용적의 각각의 정제된 PCR 산물을 혼합하고 pCR2.1내로 연결한다.
d) aroA를 함유하는 연결된 플라스미드를 DH5α 최대 수용적격 세포로 형질 전환시키고, 제한 효소 맵핑 및 PCR에 의해 클로닝을 확인한다.
e) pCR2.1로부터 결실된 완전한 aroA 유전자를 EcorV 및 SpeI로 절제한 후, 정제하고, 미리 분해된(SpeI) 자살 벡터(SacB, pKNG101)와 연결한 후, 수용적격 이. 콜라이 K12 S17 λ pir로 형질전환시키며, 제한 효소 맵핑 및 PCR에 의해 클로닝을 확인한다.
f) 공여체(aroA를 함유하는 100bp가 결실된 이. 콜라이 S17 λ pir를 함유하는 pKNG101)와 야생형 이. 콜라이 분리주 사이에 접합을 수행한다.
g) 37℃에서 배양한 48시간 후 나타나는 콜로니를 젠타마이신 및 스트렙토마이신 및 방향족 아미노산(각각 20mg/l의 DL 트립토판, DL 페닐알라닌 및 DL 티로신)으로 보충된 최소 배지상에서 2차 배양한다. 각각의 콜로니를 PCR에 의해 시험한다. 야생형 PCR 산물 및 몇몇 100bp의 보다 작은 돌연변이된 PCR 산물이 수득된 콜로니를 추가의 연구를 위해 보유한다.
h) 단일 교차물을 10% 슈크로스로 보충된 LB-G 브로쓰에서 37℃에서 16시간 동안 부드럽게 교반하면서 배양한다. 밤새 배양물의 일련의 희석물을 10% 슈크로스로 보충된 LB-G 플레이트상에 플레이팅하고, 37℃에서 16시간 동안 배양한다.
i) 10% 슈크로스 LB-G 플레이트상에 증식한 콜로니를 LB-G, LB-G + 젠타마이신 및 스트렙토마이신 및 최소 배지에서 각각 2차 배양하고, 37℃에서 16시간 동안 배양한다. LB-G 플레이트상에서만 증식한 콜로니(이중 교차물)를 5% 양 혈액 한천상에서 2차 배양하고, 4℃에서 유지시킨다.
IV) 중간체 클로닝 벡터
자살 벡터(SacB, PNG101)는 중간체 클로닝 벡터였다. 공여체(aroA를 함유하는 100bp가 결실된, S17을 함유하는 PNG101) 및 야생형 이. 콜라이 분리주 사이의 접합을 수행하였다.
실시예 2
마스터 시드 제조
이. 콜라이 aroA- 균주(실시예 1에서 작제됨)를 먼저 트립신의 대두 한천 플레이트에서 증식시키고, 트립신의 대두 브로쓰중에 3회 계대시킨다. 배양물을 유리 바이얼에 분배하여 밀봉하고 동결건조한다.
실시예 3
이. 콜라이 및 살모넬라 감염에 대하여 닭에서 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 배합물의 효능 평가
이러한 평가에서, 사용된 이. 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물은 상기 실시예 1 및 2에서 제조된 이. 콜라이 aroA- 균주이고, 사용된 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물은 미국 특허 제6,231,871 B1호에 기재된 바와 같이 제조된 에스. 티피무리움 STM-1이다.
이러한 평가를 위해서, 성이 혼합된 103 SPF 백색 레그혼종 닭을 각각 25마리씩 2개 그룹, 각각 24마리씩 2개 그룹 및 5마리의 하나의 대조군 그룹(예방접종되지 않고, 챌리지되지 않은 그룹)의 5개 그룹으로 나눈다. 새들을 손으로 골라, 임의대로 배분된 격리기에 위치시킨다. 각각의 시험 그룹을 2개의 격리기에서 사육하고, 각각은 12 내지 13마리의 새들을 함유하고 있다.
시험 그룹 A 및 B(예방접종된 그룹)를 휴대형 스프레이기를 사용하여 조악한 스프레이에 의해 1일령째에 예방접종한다. 1일령째에, 각각의 시험 그룹 A 및 B에서의 새들을 작은 컨테이너에 함께 그룹짓고, 배합된 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물 백신을 목표로 하는 용량이 제공될 때까지(새 1마리당 0.5mL의 용량당 5.0 x 106cfu의 이. 콜라이 aroA- PTA-5094를 표적으로 하고, 5.0 x 106cfu의 에스. 티피무리움 STM-1를 표적으로 함), 새의 머리에 스프레이한다. 각각의 백신인 이. 콜라이 aroA- PTA-5094 및 에스. 티피무리움 STM-1을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석한 후, 예방접종전 함께 혼합한다. 2주령째에, 시험 그룹 A 및 B를 음료수 경로로 다시 예방접종한다. 새에게 음료수 경로를 통한 예방접종 3시간 전부터 음료수를 제공하지 않는다. 스프레이 적용을 위해 상기 제조된 2개의 백신을 찬 증류수의 측정된 양에 각각의 백신에 있어서 (새 1마리당 0.5mL의) 용량당 5.0 x 106cfu의 최종 역가로 첨가한다. 백신을 함유하는 물이 유일한 음료수이다. 백신을 함유하는 물이 일단 소비하면, 마신 새를 단위로부터 제거하고, 통상의 음료수 공급원을 재공급한다.
6주령째에, 시험 그룹 A(예방접종된 그룹) 및 시험 그룹C(예방접종되지 않은 그룹)의 각각의 새들을 독성 균주 이. 콜라이 078로 용량당 5.89 x 108cfu의 역가로 기관내(IT) 경로를 통해 챌린지시킨다. 또한, 6주령째에, 시험 그룹 B(예방접종된 그룹) 및 시험 그룹 D(예방접종되지 않은 그룹)의 각각의 새를 날리딕산 내성 균주인 에스. 티피무리움으로 용량당 4.01 x 106cfu의 최종 역가로 경구 급식에 의해 챌린지시킨다.
시험 그룹 E는 예방접종되지 않고, 챌린지되지 않은 (네가티브 대조군 그룹)이다. 예방접종된 새 및 대조군 새를 연구가 완료될 때까지 개별적 격리물에서 사육한다.
모든 새들은 마음대로 이용가능한 급식 및 물이 제공되는 수의학적 관리하에 있다. 새를 챌린지후 7일동안 매일 관찰한다. 챌린지 기간후 마지막 7일째에, 모든 생존 새를 부검하고, 그룹 A 및 C를 조류 대장균증의 전형적인 병변의 존재에 대하여 조사한다. 비생존 새, 및 간주위염, 심막염, 기낭염, 봉소염 또는 관절염과 같은 육안으로 보이는 임의의 병변이 확인된 새들은 대장균증에 대하여 포지티브인 것으로 간주한다. 데이터를 표 I에 제시하고 있다.
그룹 B 및 D를 기관에서 에스. 티피무리움에 의한 콜로니화에 대해 조사한다. 데이터를 표 II에 제시하고 있다.
이. 콜라이 078 감염 및 질환*에 대하여 닭에서 이. 콜라이와 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 배합물의 효능 평가
시험 그룹 예방접종 경로 챌린지 경로 사망율 (%) 육안 병변을 갖는 새의 생존율(%) 대장균증에 대한 포지티브율(%)
Hepa Cardb Airc Celld Arthe
A 조악한 스프레이 IT 33.3 43.8 50.0 43.8 12.5 12.5 66.7
C 없음 IT 29.2 64.7 82.4 82.4 35.3 0 87.5
E 없음 없음 0 0 0 0 0 0 0
a간주위염 b심막염 c기낭염 d봉소염 e관절염 *백신을 이. 콜라이에 의한 감염과 관련된 대장균증을 예방하기 위한 보조제로서 닭에게 투여한다.
살모넬라 감염 및 질환*에 대하여 닭에서 이. 콜라이와 에스. 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 배합물의 효능 평가
시험 그룹 예방접종 경로 챌린지 경로 에스. 티피무리움 포지티브율(%)
기관 풀(Pool) 장 풀 맹장 풀
B 조악한 스프레이/ 음료수 OGa 32 80 68
D 없음 OGa 68 100 92
E 없음 없음 0 0 0
a경구 급식 *백신을 장 및 맹장을 포함하는 내부 기관의 살모넬라 콜로니화를 감소시키기 위한 보조제로서 닭에게 투여한다.
표 I 및 II의 결과에서 제시되는 바와 같이, 본 발명의 배합 백신의 결과로 이. 콜라이 감염 및 살모넬라 감염 발생과 관련된 두가지 모든 대장균증에서 상당한 감소가 있다. 표 II에서, 살모넬라 콜로니화에서 상당한 감소가 있고, 이는 보다 적은 수의 새가 감염되고, 따라서 보다 적게 만연한 사망으로 진행되며, 질환이 이들의 알로 보다 적게 전이된다는 것을 의미한다.

Claims (20)

  1. 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 면역원성 유효량의 배합물 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조류 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 담체가 조직 또는 세포 배양 배지에서 사용하기에 적합한 평형 염 용액인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 담체가 증류수인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 면역원성 유효량이 약 5.0 x 102cfu 내지 5.0 x 1010cfu의 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물 및 약 5.0 x 102cfu 내지 5.0 x 1010cfu의 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물을 제공하기에 충분한 양인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물이 이. 콜라이 aroA- 미생물인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 미생물이 ATCC PTA-5094의 확인된 특성을 갖는 이. 콜라이 aroA-인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물이 에스. 티피무리움 aroA- 미생물인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 미생물이 에스. 티피무리움 STM-1의 확인된 특성을 갖는 미생물인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물이 이. 콜라이 aroA- PTA-5094의 확인된 특성을 갖는 미생물인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 면역원성 유효량이 약 3.0 x 106 내지 6.0 x 106cfu의 이. 콜라이 aroA- PTA-5094 및 약 2.0 x 106 내지 6.0 x 106cfu의 에스.　티피무리움 STM-1을 제공하기에 충분한 양인 조성물.
  11. 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물과 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물의 면역원성 유효량의 배합물을 이. 콜라이 및 살모넬라 감염 또는 질환인 가금류에게 투여함을 포함하여, 상기 가금류에서 이. 콜라 이 및 살모넬라 감염 또는 질환을 예방하거나 경감시키기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서, 가금류가 닭, 오리, 거위, 칠면조, 밴텀닭, 메추라기, 꿩 및 비둘기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 배합물을 대량 적용을 통해 투여하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물이 이. 콜라이 aroA- 미생물인 배합물을 갖는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 미생물이 이. 콜라이 aroA- PTA-5094의 확인된 특성을 갖는 균주인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 살모넬라 티피무리움 유전자 결실 돌연변이체 미생물이 에스. 티피무리움 aroA- 미생물인 배합물을 갖는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 미생물이 에스.　티피무리움 STM-1의 확인된 특성을 갖는 균주인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 유전자 결실 돌연변이체 미생물이 이 . 콜라이 aroA- 미생물인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 이. 콜라이 미생물이 이. 콜라이 aroA- PTA-5094의 확인된 특성을 갖는 미생물인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 면역원성 유효량이 약 3.0 x 106 내지 6.0 x 106cfu의 이. 콜라이 aroA- PTA-5094 및 약 2.0 x 106 내지 6.0 x 106cfu의 에스. 티피무리움 STM-1을 제공하기에 충분한 양인 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7357935B2 (en) * 2003-05-14 2008-04-15 Wyeth Avian E. coli vaccine for protection against colibacillosis
US7935355B2 (en) * 2007-04-19 2011-05-03 Nutritional Health Institute Laboratories, Llc Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms
US20080260777A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-23 Sotomayor Konky Composition and method for controlling intestinal pathogenic organisms
TR201802361T4 (tr) 2008-09-26 2018-03-21 Ambrx Inc Doğal olmayan amino asit replikasyonuna bağımlı mikroorganizmalar ve aşılar.
CN102140430B (zh) * 2011-01-13 2013-10-23 河南科技大学 一种不含抗性标记的鼠伤寒沙门氏菌基因缺失突变菌株、疫苗及应用
KR101518872B1 (ko) * 2013-05-14 2015-05-22 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트
CN104711365B (zh) * 2015-04-02 2018-06-12 青岛康伦生物科技有限公司 沙门菌和大肠杆菌o78多重pcr快速检测的试剂盒
CN112618706B (zh) * 2020-11-21 2021-09-14 青岛博霖生物科技有限公司 沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US400958A (en) * 1889-04-09 Leading-in apparatus for conduits
US650733A (en) * 1899-06-23 1900-05-29 William A Shaw Fire-escape.
GB8912330D0 (en) 1989-05-30 1989-07-12 Wellcome Found Live vaccines
JPH07206705A (ja) 1993-11-03 1995-08-08 American Cyanamid Co 生インオボ（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン
GB9806449D0 (en) * 1998-03-25 1998-05-27 Peptide Therapeutics Ltd Attenuated bacteria useful in vaccines
US7357935B2 (en) * 2003-05-14 2008-04-15 Wyeth Avian E. coli vaccine for protection against colibacillosis

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