BRPI0407840B1 - Vírus do sarampo recombinante, composição farmacêutica, uso de uma composição farmacêutica, célula bacteriana, método para produzir um vírus recombinante e uso - Google Patents

Vírus do sarampo recombinante, composição farmacêutica, uso de uma composição farmacêutica, célula bacteriana, método para produzir um vírus recombinante e uso Download PDF

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Chantal Combredet
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Abstract

"polipeptídeo purificado, anticorpo policlonal ou monoclonal purificado, vetor de expressão, seqüência de polinucleotídeo purificada, uso de uma seqüência de polinucleotídeo, vetor viral recombinante, vírus do sarampo recombinante, composição farmacêutica, uso da mesma, célula hospedeira, método para produzir um vírus recombinante para a produção de um vírus recombinante, linhagem de células ensaio de neutralização de vírus do nilo ocidental, e, método para tratar e/ou prevenir uma infecção ou doença associada com wnv ou vírus do dengue em um animal". a presente invenção refere-se ao desenvolvimento de vetores virais expressando diferentes imunógenos do virus da encefalite do nilo ocidental (wnv, west nile encephalitis virus) ou do vírus do dengue que são capazes de induzir respostas celulares e humorais protetoras contra infecções com vírus wnv ou do dengue. mais especificamente, a presente invenção refere-se a três (3) antígenos do wnv (a glicoproteína (e) do envelope secretada, as glicoproteínas de heterodímero (pre-m-e) e a proteína nsi) e do vírus do dengue (a glicoproteína (e) do envelope secretada, as glicoproteínas de heterodímero (pre-m-e) e a proteína ns1) e seu uso em aplicações vacinais, terapêuticas e diagnósticas.

Description

“VÍRUS DO SARAMPO RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, CÉLULA BACTERIANA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRUS RECOMBINANTE E USO” Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se a peptídeos derivados do vírus do Nilo Ocidental (WNV) e/ou do vírus do Dengue, e more particularmente polipeptídeos ou polinucleotídeos derivados de polipeptídeos ou polinucleotídeos do WNV e/ou vírus do Dengue, e a seu uso na preparação de composições e vacinas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composições, vacinas e métodos de proporcionar uma resposta imune e/ou uma imunidade protetora para animais contra um vírus do Nilo Ocidental ou um vírus do Dengue, e a métodos para o diagnóstico de infecção com o vírus do vírus do Nilo Ocidental ou vírus do Dengue.
Fundamentos da invenção
[002] Flaviviridae são arbovírus (vírus portados por artrópodes) principalmente transportados por mosquitos e carrapatos sugadores de sangue. Eles são vírus encapsulados e seus genomas consistem de RNA infeccioso de filamento simples e linear com polaridade positiva. No Homem, flavivírus causam febre hemorrágica ou meningo-encefalite. Febre amarela, febre do dengue e encefalite japonesa são os flavivírus tropicais principais. Outros flavivírus humanos importantes são a encefalite de Saint Louis, encefalite Européia transmitida por carrapato e febre do Nilo Ocidental.
[003] Febre do Nilo Ocidental é uma zoonose associada com um flavivírus que foi isolada pela primeira vez em Uganda em 1937. Seu ciclo de transmissão requer pássaros como seu reservatório principal, e mosquitos sugadores de sangue do gênero Culex como vetores. Pássaros migratórios virêmicos transportam o vírus para regiões distantes onde eles o transmitem novamente para mosquitos ornitófilos do gênero Culex. Muitas espécies de
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2/64 mamíferos são permissivas para o vírus do Nilo Ocidental. Cavalos são particularmente sensíveis à doença, porém não participam do ciclo de transmissão. A febre do Nilo Ocidental é endêmica na África, Ásia, Europa e Austrália. Estudos filogênicos revelaram a existência de duas cepas principais de vírus: linha viral 1 apresenta uma distribuição mundial, e linha viral 2 é essencialmente africana. Linha viral 1 foi responsável por [doenças] enzoóticas na Romênia (1996), Rússia (1999), Israel (1998-2000) e, mais recentemente, na América do Norte onde o vírus nunca tinha sido detectado antes de 1999. As cepas virais isoladas durante as recentes epidemias em Israel e nos Estados Unidos apresentam mais de 99,7% de identidade. No Oriente Médio, e na América do Norte, onde o vírus fixou raízes, observou-se uma importante taxa de mortalidade entre pássaros infectados, principalmente em Corvidae. Na América do Norte, mais de 4000 sujeitos foram infectados com o vírus do Nilo Ocidental, sendo que 250 dos mesmos morreram entre os meses de Agosto e Dezembro 2002. No presente momento, a zoonose é observada em todas as regiões dos Estados Unidos. No momento, não existe qualquer vacina humana ou terapia específica contra a febre do Nilo Ocidental.
[004] Em regiões temperadas e sub-tropicais, infecções humanas podem ocorrer durante a estação do outono. Quando um sujeito é picado por um mosquito infectado, o período de incubação dura aproximadamente uma semana, porém menos de 20% das pessoas infectadas com o vírus do Nilo Ocidental prosseguem apresentando manifestações clínicas. Nesta forma benigna, a infecção viral manifesta-se por um estado febril não-diferenciado associado com fraqueza muscular, cefaléias e dor abdominal. Em menos de 1% de sujeitos infectados pode ocorrer meningite asséptica aguda. Observa-se também esplenomegalia, hepatite, pancreatite e miocardite. Reportou-se recentemente paralisias de Flask semelhantes a uma síndrome poliomielítica, porém casos fatais de encefalite viral (5% de pacientes apresentando distúrbios neurológicos graves) referem-se
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3/64 principalmente a sujeitos frágeis e aos idosos. Transmissão inter-humana do vírus também foi observada recentemente nos Estados Unidos em sujeitos que foram submetidos a transplantes de órgãos ou que foram submetidos a perfusão com produtos de sangue contaminado. Transmissão intra-uterina do vírus foi reportada nos Estados Unidos. O desenvolvimento de uma vacina humana contra a febre do Nilo Ocidental é uma prioridade em vista do fato de que a zoonose fixou raízes na América do Norte e que se espera venha a propagar-se, nos meses vindouros, à América Central, América do Sul, e o Caribe onde a febre do dengue e a febre amarela já grassam.
[005] Portanto, há uma necessidade de peptídeos derivados do vírus do Nilo Ocidental (WNV) e/ou vírus do Dengue, e mais particularmente de polipeptídeos ou polinucleotídeos derivados do WNV e/ou vírus do Dengue e seu uso na preparação de composições e vacinas.
[006] A presente invenção atende estas necessidades e também outras necessidades que serão perceptíveis por aqueles versados na técnica mediante a leitura da descrição a seguir.
Sumário da Invenção
[007] A presente invenção refere-se a polipeptídeos derivados do vírus do Nilo Ocidental e/ou vírus do Dengue.
[008] Mais especificamente, um objeto da invenção refere-se a um polipeptídeo purificado que se deriva de um antígeno do vírus do Nilo Ocidental ou um antígeno do vírus do Dengue.
[009] Outro objeto da invenção refere-se a anticorpo policlonal ou monoclonal purificado capaz de liga especificamente a um polipeptídeo da invenção.
[010] Outro objeto da invenção refere-se a uma seqüência de polinucleotídeo purificada codificando para o polipeptídeo da invenção e seu uso para detectar a presença ou ausência de um antígeno do vírus do Nilo
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Ocidental ou um antígeno do vírus do Dengue em uma amostra biológica.
[011] Um objeto adicional da invenção refere-se a vetor viral recombinante que é um vírus recombinante compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo da invenção.
[012] Outro objeto da invenção é um vírus do sarampo recombinante capaz de expressar um polipeptídeo da invenção ou compreendendo, em seu genoma, um polinucleotídeo da invenção.
[013] Outro objeto adicional da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo:
a) pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste de:
- um polipeptídeo da invenção ou um derivado funcional do mesmo;
- um anticorpo como definido acima;
- um vetor de expressão como definido acima;
- um polinucleotídeo da invenção ou um fragmento do mesmo,
- um vetor viral recombinante da invenção; e
- um vírus do sarampo recombinante da invenção;
e
b) um veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável.
[014] Outro objeto da invenção refere-se ao uso da composição farmacêutica da invenção, como um agente antivírus do Nilo Ocidental e/ou um agente antivírus do Dengue, ou para a preparação de uma vacina antivírus do Nilo Ocidental e/ou uma vacina antivírus do Dengue.
[015] Outro objeto da invenção refere-se a uma célula hospedeira incorporando um vetor de expressão como definido acima ou um vetor viral recombinante como definido acima.
[016] Além disso, outro objeto da invenção recombinante para a
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5/64 preparação de uma vacina antivírus do Nilo Ocidental ou uma vacina antivírus do Dengue, sendo que o método compreende as etapas de:
a) proporcionar uma célula hospedeira como definido acima;
b) colocar a célula hospedeira da etapa a) em condições que permitem a replicação de um vírus recombinante capaz de expressar um polipeptídeo da invenção; e
c) isolar o vírus recombinante produzido na etapa b).
[017] Outro objeto da invenção refere-se a um ensaio de neutralização do vírus do Nilo Ocidental, compreendendo as etapas de:
a) contactar células VERO com vírus do Nilo Ocidental e um anticorpo;
b) cultivar referidas células VERO em condições que permitem replicação do vírus do Nilo Ocidental; e
c) medir a redução de focos de replicação do vírus do Nilo Ocidental em referidas células VERO.
[018] Um objeto adicional da invenção consiste em proporcionar um método para tratar e/ou prevenir uma doença ou infecção associada com WNV ou vírus do Dengue em um animal, sendo que o método compreende a etapa de administrar ao animal uma quantidade efetiva de pelo menos um elemento selecionado do grupo que consiste de:
- um polipeptídeo ou um derivado funcional do mesmo como definido acima;
- um anticorpo como definido acima;
- um vetor de expressão como definido acima;
- um polinucleotídeo ou um fragmento do mesmo como definido acima;
- um vetor viral recombinante como definido acima; e
- um vírus do sarampo recombinante como definido acima.
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Breve Descrição dos desenhos
[019] Figura 1 mostra a seqüência de ácido nucleico que codifica a glicoproteína secretada E do WNV e identificada como SEQ ID NO. 1.
[020] Figura 2 mostra a seqüência de aminoácidos da glicoproteína E secretada do WNV e identificada como SEQ ID NO. 5.
[021] Figura 3 mostra a seqüência de ácido nucleico codificando as glicoproteínas preM mais E glicoproteínas do WNV e identificada como SEQ ID NO. 2.
[022] Figura 4 mostra a seqüência de aminoácidos das glicoproteínas preM mais E do WNV e identificada como SEQ ID NO. 6.
[023] Figura 5 mostra a seqüência de ácido nucleico codificando a proteína NS1 do WNV e identificada como SEQ ID NO. 3.
[024] Figura 6 mostra a seqüência de aminoácidos da proteína NS1 do WNV e identificada como SEQ ID NO. 7.
[025] Figura 7 mostra a seqüência de ácido nucleico codificando o gene preM-E do vírus do Dengue tipo 1 e identificada como SEQ ID NO. 4.
[026] Figura 8 mostra a seqüência de aminoácidos do gene preM-E do vírus do Dengue tipo 1 e identificada como SEQ ID NO 8.
[027] Figura 9 é um mapa esquemático dos plasmídeos recombinantes pTM-MVSchw de acordo com concretizações preferidas da invenção.
[028] Figura 10 mostra a expressão de sEWNV por MV recombinante de MVSchw sEWNV em células Vero. (A) Diagrama esquemático de MVschw-sEWNV e crescimento do vírus. O cDNA de IS-98-ST1 que codifica para sEWNV foi inserido no genoma de MV de Schwarz entre os sítios BsiW1 e BssHII de ATU na posição 2. Os genes de MV são indicados: N (nucleoproteína), PVC (fosfoproteína e V, C proteínas), M (matriz), F (fusão), H (hemaglutinina), L (polimerase). T7: promotor de RNA polimerase T7; hh:
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7/64 ribozima cabeça-de-martelo, T7t: terminador de RNA polimerase T7; δ: ribozima do vírus delta da hepatite (HDV, hepatitis delta vírus); ATU: unidade de transcrição adicional. (B) Curvas de crescimento da MV. células Vero infectadas com MVSchw.(caixa aberta) ou MVSchw-sEwnv (caixa preta) numa multiplicidade de infecção (m.o.i) de 0,01 TCID50/célula. Em vários momentos após a infecção, partículas de vírus infecciosas foram tituladas como descrito nos Métodos. (C) Manchamento de imunofluorescência de glicoproteína sEWNV em sincício de células Vero infectadas com MVSchw-sEWNV fixadas 36 h após a infecção. Células permeabilizadas (A, B) ou não (C, D) com Triton X100 e depois imunomanchadas utilizando-se HMAF anti-WNV. Amplificação: x 1000. Não se observou qualquer sinal positivo em células infectadas com MVSchw. (D) Ensaio de radio-imunoprecipitação (RIP,
Radioimmunoprecipitation) mostrando a liberação de sEwnv de células infectadas com MVSchw-sEWNV. Células Vero foram infectadas com WNV cepa IS-98-ST1 (m.o.i de 5) durante 24 h, MVSchw (m.o.i. de 0.1), MVSchw-sEwNV (m.o.i. de 0.1) durante 40 h, ou falsamente infectadas (MI, mock-infected). Lisados de células e sobrenadantes radio-marcados, foram imunoprecipitados com anticorpos policlonais específicos anti-MV (α-MV) ou anti-WNV (a-WNV). Mostra-se glicoproteína E de WNV (cabeça de seta aberta) e sEwnv (cabeça de seta preta).
[029] Figura 11 mostra anticorpos anti-MVSchw-sEwNv que reconhecem a glicoproteína E do WNV. Células Vero foram infectadas com WNV cepa IS-98-ST1 (WNV) ou falsamente infectadas (nenhum vírus). Lisados de células marcadas foram imunoprecipitados com soros imunes combinados (diluição de 1:100) de camundongos inoculados com WNV, MVSchw, MVSchwsEWNV como descrito na legenda da Fig. 10D. Utilizou-se anticorpos específicos antivírus da anti-linfocoriomeningite (LCMV) como um controle negativo. Glicoproteínas prM e E estruturais do WNV e proteínas não estruturais NS3,
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NS5, NS2A e NS2B são mostradas após a exposição [p.c., post-challenge].
Descrição detalhada da invenção
[030] A presente invenção refere-se a peptídeos derivados do vírus do Nilo Ocidental (WNV) e/ou vírus do Dengue, e mais particularmente a polipeptídeos ou polinucleotídeos derivados de polipeptídeos ou polinucleotídeos de WNV e/ou vírus do Dengue e seu uso na preparação de composições e vacinas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composições, vacinas e métodos de proporcionar uma resposta imune e/ou uma imunidade protetora a animais contra um vírus do Nilo Ocidental ou um vírus do Dengue e métodos para o diagnóstico de infecção com vírus do Nilo Ocidental ou vírus do Dengue.
[031] Como usado aqui, o termo resposta imune refere-se à resposta de células T ou a níveis séricos incrementados de anticorpos para um antígeno, ou à presença de anticorpos neutralizadores para um antígeno, como um antígeno para WNV ou um antígeno para vírus do Dengue. O termo resposta imune deve ser compreendido como incluindo uma resposta humoral e/ou uma reposta humoral e/ou uma resposta inflamatória.
[032] Um antígeno refere-se a uma molécula, como uma proteína ou uma proteína ou um polipeptídeo, contendo um ou mais epíitopos que estimularão o sistema imunológico de um hospedeiro proporcionando uma resposta humoral e/ou celular específica para antígeno. O termo também é usado intercambiavelmente com imunógeno.
[033] O termo proteção ou imunidade protetora refere-se aqui à capacidade dos anticorpos no soro e da resposta celular induzida durante a imunização de proteger (parcialmente ou totalmente) contra um vírus do Nilo Ocidental ou um vírus do Dengue. Assim, um animal imunizado com as composições ou vacinas da invenção experimentará crescimento e espalhamento limitado de um WNV ou vírus do Dengue infeccioso.
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[034] Como usado aqui, o termo animal refere-se a qualquer animal que é suscetível de ser infectado por um vírus do Nilo Ocidental ou um vírus do Dengue. Entre os animais que são conhecidos por serem potencialmente infectados por estes vírus, conta-se, porém sem limitação, humanos, pássaros e cavalos.
1. Polinucleotídeos e polipeptídeos
[035] Em uma primeira concretização, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo purificado caracterizado pelo fato de que se deriva de um antígeno do vírus do Nilo Ocidental ou um antígeno do vírus do Dengue ou derivado funcional do mesmo. Como se pode perceber, diz-se que uma proteína/peptídeo deriva-se de uma proteína/peptídeo ou de um fragmento do mesmo quando referida proteína/peptídeo compreende pelo menos uma porção, com seqüência substancialmente similar, à proteína/peptídeo nativo ou a um fragmento do mesmo.
[036] O antígeno do vírus do Nilo Ocidental da presente invenção é selecionado, de preferência, do grupo que consiste de glicoproteína de envelope secretada (E), glicoproteínas de heterodímero (PreM-E) e proteína NS1. Mais especificamente, a glicoproteína de envelope secretada (E) compreende a seqüência de SEQ ID NO: 5 ou um derivado funcional do mesmo, as glicoproteínas de heterodímero (PreM-E) compreendem a seqüência de SEQ ID NO: 6 ou um derivado funcional do mesmo, e a proteína NS1 compreende a seqüência de SEQ ID NO: 7 ou um derivado funcional do mesmo.
[037] O antígeno do vírus do Dengue da invenção é selecionado, de preferência, do grupo que consiste de glicoproteína de envelope secretada (E), glicoproteínas de heterodímero (PreM-E) e proteína NS1. Mais especificamente, as glicoproteínas de heterodímero (PreM-E) compreende a seqüência de SEQ ID NO: 8 ou um derivado funcional do mesmo.
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[038] De acordo com uma concretização preferida, o polipeptídeo da presente invenção apresenta uma seqüência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de homologia, ou mais preferivelmente 85% de homologia com parte ou toda a SEQ ID NO:1, da SEQ ID NO:2, da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:4.
[039] Um derivado funcional, como é geralmente compreendido e usado aqui, refere-se a uma seqüência de proteína/peptídeo que apresenta uma atividade biológica funcional que é substancialmente similar à atividade biológica de toda a seqüência de proteína/peptídeo. Em outras palavras, isto refere-se a um polipeptídeo ou fragmento(s) do mesmo que conserva substancialmente a mesma funcionalidade biológica que o polipeptídeo das SEQ ID Nos: 5 a 8. Um derivado funcional de uma proteína/peptídeo pode ou não conter modificações pós-tradução, como carboidrato ligado covalentemente, se modificação do tipo referido não for necessária para o desempenho de uma função específica. O termo derivado funcional refere-se a fragmentos, segmentos', variantes, análogos ou derivados químicos de uma proteína/peptídeo. Como usado aqui, diz-se que uma proteína/peptídeo é um derivado químico de outra proteína/peptídeo quando contém porções químicas adicionais que normalmente não são parte da proteína/peptídeo, sendo que referidas porções são adicionadas com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica. Referidas porções podem aperfeiçoar a solubilidade, absorção, biodisponibilidade, meia-vida biológica, e análogos da proteína/peptídeo. Qualquer toxicidade e efeitos colaterais indesejáveis da proteína/peptídeo podem ser atenuados e até mesmo eliminados com o uso de referidas porções.
[040] De forma ainda mais preferível, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente igual ou apresentando 100% de identidade com SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID
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NO:4.
[041] É possível utilizar um programa, como o programa CLUSTAL para comparar seqüências de aminoácidos. Este programa compara seqüências de aminoácidos e encontra o alinhamento ótimo inserindo-se espaços em qualquer seqüência conforme apropriado. É possível calcular identidade ou homologia de aminoácidos para um alinhamento ótimo. Um programa como o BLASTx realizará a maior extensão de seqüências semelhantes e atribuirá um valor ao esquema. Assim, é possível obter uma comparação em que se encontra várias regiões de similaridade, cada uma apresentando uma classificação diferente. Ambos os tipos de análise de identidade são considerados na presente invenção.
[042] Como usado aqui, o termo polipeptídeo(s) refere-se a qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos, conjugados entre si por outras ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas. Polipeptídeo(s) refere-se tanto a cadeias longas, comumente referidas como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, como a cadeias mais longas geralmente referidas como proteínas. Polipeptídeos podem conter aminoácidos diferentes dos aminoácidos codificados com 20 genes. Polipeptídeo(s) incluem aqueles modificados, quer por processos naturais, como modificações de processamento e outras modificações pós-tradução, mas também por meio de técnicas de modificação química. Referidas modificações constam de textos básicos bem descritos e de monografias mais detalhadas, e também em volumosa literatura de pesquisa, e são bem conhecidos por aqueles com prática na técnica. Deve-se considerar que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em grau idêntico ou em grau variável em vários sítios de um dado polipeptídeo. Também, um dado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Modificações podem ocorrer alhures em um polipeptídeo, incluindo a espinha dorsal do peptídeo, as
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12/64 cadeias laterais de aminoácidos, e as pontas amino ou carboxila. Modificações incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfortilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodatação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, glicosilação, ligação lipídica, sulfatação, gama-carboxilação de radicais de ácido glutâmico, hidroxilação, selenoilação, sulfatação e adição mediada com RNA de transferência de aminoácidos a proteínas, como arginilação, e ubiquitinação. Ver, por exemplo: PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman e Company, New York (1993); Wold; F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); e Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:4862(1992). Polipeptídeos podem ser ramificados ou cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados e ramificados circulares de processos naturais pós-tradução e também podem ser preparados por meio de métodos inteiramente sintéticos.
[043] Com relação à proteína ou polipeptídeo, o termo polipeptídeo isolado ou polipeptídeo isolado e purificado é algumas vezes aqui utilizado. Este termo refere-se primariamente a uma proteína produzida por meio de expressão de uma molécula de polinucleotídeo isolada considerada pela invenção. Alternativamente, este termo pode referir-se a uma
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13/64 proteína que foi suficientemente separada de outras proteínas com as quais estaria normalmente associada, de forma a existir em forma substancialmente pura.
[044] O termo substancialmente pura refere-se a uma preparação compreendendo pelo menos 50-60% em peso do composto de interesse (p. ex., ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). Mais preferivelmente, a preparação compreende pelo menos 75% em peso, e, da forma mais preferível, 90-99% em peso, do composto de interesse.
[045] Pureza é medida por meio de métodos apropriados para o composto de interesse (p. ex. métodos cromatográficos, agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida, análise de HPLC, e análogos).
[046] Em uma segunda concretização, a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo purificado que codifica um polipeptídeo da invenção. Portanto, o polinucleotídeo da invenção apresenta uma seqüência de ácido nucleico que é pelo menos 65% idêntica, mais particularmente 80% idêntica e ainda mais particularmente 95% idêntica a parte ou toda de qualquer uma das SEQ ID NO de 5 a 8 ou seus fragmentos funcionais.
[047] Um fragmento funcional, como é geralmente compreendido e usado aqui, refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que codifica para uma atividade biológica funcional que é substancialmente similar à atividade biológica da seqüência de ácido nucleico integral. Em outras palavras, isto refere-se a um ácido nucleico ou fragmento(s) do mesmo que conserva substancialmente a capacidade de codificar para um polipeptídeo da invenção.
[048] O termo fragmento como usado aqui refere-se a uma seqüência de polinucleotídeo (p. ex., cDNA) que é uma porção isolada do ácido nucleico em pauta construído artificialmente (p. ex., por meio de síntese química) ou por meio de clivagem de um produto natural em múltiplas peças,
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14/64 utilizando-se endonucleases de restrição, ou cisalhamento mecânico, ou uma porção de um ácido nucleico sintetizado por meio de PCR, DNA polimerase ou qualquer outra técnica de polimerização bem conhecida na técnica, ou expressa em uma célula hospedeira por meio de tecnologia de ácido nucleico recombinante bem conhecida por alguém com prática na técnica.
[049] Com referência a polinucleotídeos da invenção, o termo polinucleotídeo isolado é utilizado por vezes. Este termo, quando aplicado a DNA, refere-se a uma molécula de DNA que é separada de seqüências com as quais é imediatamente contígua (nas direções 5' e 3') no genoma naturalmente ocorrente do organismo de que foi derivada. Por exemplo, o polinucleotídeo isolado pode compreender uma molécula de DNA inserida em um vetor, como um plasmídeo ou vetor de vírus, ou integrada no DNA genômico de um procarionte ou eucarionte. Uma molécula de polinucleotídeo isolado também pode compreender uma molécula de cDNA.
[050] Identidade e similaridade de seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos são determinadas a partir de um alinhamento global ótimo entre as duas seqüências que estão sendo comparadas. Obtémse um alinhamento global ótimo utilizando-se, por exemplo, o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453). Identidade significa que um aminoácido ou nucleotídeo numa posição particular em um primeiro polipeptídeo ou polinucleotídeo é idêntico a um aminoácido ou nucleotídeo correspondente em um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo que se encontra em um alinhamento global ótimo com o primeiro polipeptídeo ou polinucleotídeo. Em contraste com identidade, similaridade abrange aminoácidos que são substituições conservativas. Uma substituição conservativa é qualquer substituição que apresenta uma classificação positiva na matriz de substituição blosum62 (Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Por meio da
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15/64 indicação de que seqüência A é n% similar à seqüência B compreende-se que n% das posições de um alinhamento global ótimo entre seqüências A e B consiste de radicais ou nucleotídeos idênticos e substituições conservativas. Com a indicação seqüência A é n% idêntica à seqüência B compreende-se que n% das posições de um alinhamento global ótimo entre seqüências A e B consiste de radicais ou nucleotídeos idênticos.
[051] Como usado aqui, o termo polinucleotídeo(s) refere-se geralmente a qualquer polirribonucleotídeo ou poli-desoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNA modificado. Esta definição inclui, sem limitação, DNA de filamento simples ou de filamento duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento simples e de filamento duplo ou de regiões de filamento simples, duplo e triplo, cDNA, RNA de filamento simples e filamento duplo, e RNA que é uma mistura de regiões de filamento simples e de filamento duplo, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de filamento simples ou, mais tipicamente, de filamento duplo, ou de filamento triplo, ou uma mistura de regiões de filamento simples e de filamento duplo. Adicionalmente, polinucleotídeo como usado aqui refere-se a regiões de filamento triplo compreendendo RNA ou DNA ou ambos, RNA e DNA. Os filamentos em referidas regiões podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. As regiões podem incluir todas, de uma ou mais das moléculas, porém, mais tipicamente envolvem apenas uma região de algumas das moléculas. Uma das moléculas de uma região de tripla hélice freqüentemente é um oligonucleotídeo. Como usado aqui, o termo polinucleotídeo(s) também inclui DNAs ou RNAs como descrito acima que contêm uma ou mais bases modificadas. Assim, DNAs ou RNAs com espinhas dorsais modificadas quanto à estabilidade ou por outras razões são polinucleotídeo(s) da forma como esse termo é intencionado aqui. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, como inosina, ou bases modificadas, como bases tritiladas, apenas para indicar dois exemplos, são
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16/64 polinucleotídeos no sentido em que o termo é usado aqui. Deve-se considerar que se realizou uma grande variedade de modificações no DNA e RNA que servem para muitos fins úteis conhecidos por aqueles versados na técnica. Polinucleotídeo(s) abrange polinucleotídeos curtos ou fragmentos compreendendo pelo menos 6 nucleotídeos freqüentemente referidos como oligonucleotídeo(s). O termo polinucleotídeo(s) como é empregado aqui abrange, portanto, referidas formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, por exemplo, células simples e complexas que apresentam a mesma função biológica que o polipeptídeo codificado por qualquer uma das SEQ ID NOS. de 1 a 4. O termo polinucleotídeo(s) também abrange nucleotídeos curtos ou fragmentos, freqüentemente referidos como oligonucleotídeos que, devido à mutagênese, não são 100% idênticos, porém, ainda assim, codificam para a mesma seqüência de aminoácidos.
2. Vetores e células
[052] Em uma terceira concretização, a invenção também se refere a um hospedeiro, como uma célula geneticamente modificada, compreendendo qualquer seqüência de polinucleotídeos de acordo com a invenção e, mais preferivelmente, um hospedeiro capaz de expressar o polipeptídeo codificado por este polinucleotídeo. De forma ainda mais preferível, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que incorpora um vetor de expressão ou um vetor viral recombinante como definido aqui abaixo.
[053] A célula hospedeira pode ser qualquer tipo de célula (uma linhagem de células mamíferas transfectadas transientemente, uma célula primária isolada, ou célula de inseto, levedura (Saccharomyces cerevisiae, Ktuyveromyces lactis, Pichia pastoris), célula de planta, microorganismo, ou uma bactéria (como E. coli). O depósito biológico a seguir referente a MEF/3T3.
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Linhagem de células Tet Off/prME.WN # h2 compreendendo um vetor de expressão que codifica para pseudo-partículas de WNV cepa IS-98-ST1 constituído de glicoproteínas complexadas de prME foi registrada na Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM) sob números de acesso de 1-3018 em 2 de maio de 2003.
[054] Em uma quarta concretização, a invenção refere-se adicionalmente à clonagem ou vetor de expressão compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos como definido acima.
[055] Como usado aqui, o termo vetor refere-se a uma construção de polinucleotídeo projetada para transdução/transfecção de um ou mais tipos de células. Vetores podem ser, por exemplo, vetores de clonagem que são projetados para isolamento, propagação e replicação de nucleotídeos inseridos, vetores de expressão que são projetados para expressão de uma seqüência de nucleotídeos em uma célula hospedeira, ou um vetor viral que é projetado para resultar na produção de um vírus recombinante ou partícula semelhante a vírus recombinante, ou vetores de transporte, que compreendem os atributos de mais de um tipo de vetor.
[056] Diversos vetores vantajosos para transfecção estável de células e bactérias encontram-se disponíveis para o público (p. ex. plasmídeos, adenovírus, baculovírus, baculovírus da levedura, vírus de plantas, vírus adeno-associados, retrovírus, vírus do Herpes Simplex, Alfavírus, Lentivírus), são métodos de construir referidas linhagens de células. Deve-se compreender que a presente invenção abrange qualquer tipo de vetor compreendendo qualquer uma das moléculas de polinucleotídeo da invenção.
[057] De acordo com uma concretização preferida, o vetor é um vetor viral recombinante que é um vírus recombinante compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo como definido acima. De preferência, o vírus recombinante é um vírus atenuado ou um vírus deficiente, como um vírus
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18/64 recombinante selecionado do grupo que consiste de vírus do sarampo, vírus da hepatite B, papilomavírus humano, picomaviridae e lentivírus. De forma mais preferível, o vírus recombinante é um vírus do sarampo recombinante, por exemplo, a cepa de vírus do sarampo de Schwarz, que é capaz de expressar um polipeptídeo como definido acima ou que compreende, em seu genoma, um polinucleotídeo como definido acima.
3. Anticorpos
[058] Em uma quinta concretização, a invenção apresenta anticorpos purificados que se ligam especificamente ao polipeptídeo isolado ou purificado como definido acima ou a fragmentos dos mesmos. Os anticorpos da invenção podem ser preparados por meio de uma variedade de métodos utilizando os polipeptídeos descritos acima. Por exemplo, o antígeno do vírus do Nilo Ocidental ou vírus da Dengue, ou fragmentos antigênicos dos mesmos, podem ser administrados a um animal para induzir a produção de anticorpos policlonais. Alternativamente, anticorpos usados como descrito aqui podem ser anticorpos monoclonais, que são preparados utilizando-se tecnologia de hibridoma (ver, p. ex., Hammerling et al., em Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981).
[059] Como indicado acima, a presente invenção refere-se, de preferência, a anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno do Nilo Ocidental ou um antígeno do vírus do Dengue, ou seus fragmentos. Em particular, a invenção proporciona anticorpos neutralizadores'. Por anticorpos neutralizadores compreende-se anticorpos que interferem com qualquer uma das atividades biológicas de qualquer um dentre antígeno de WNV ou antígeno do vírus da Dengue. Qualquer ensaio convencional conhecido por alguém versado na técnica pode ser usado para avaliar anticorpos potencialmente neutralizadores. Uma vez produzidos, anticorpos monoclonais e policlonais são testados, de preferência, por meio de análise de imunoprecipitação, Western
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19/64 blot de reconhecimento de proteínas específicas para o WNV ou vírus do Dengue, ou qualquer outro método vantajoso.
[060] Anticorpos que reconhecem proteínas do WNV ou do vírus da Dengue expressando células e anticorpos que reconhecem especificamente proteínas do WNV ou do vírus da Dengue (ou seus fragmentos funcionais), como aqueles descritos acima, são considerados úteis para a invenção. Um anticorpo do tipo referido pode ser usado em qualquer método de imunodetecção convencional para a detecção, quantificação, e purificação das proteínas do WNV ou do vírus da Dengue. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal e pode ser modificado para fins diagnósticos. Os anticorpos da invenção podem ser usados, por exemplo, em um imunoensaio para monitorar níveis de expressão de proteínas do WNV ou vírus da Dengue, para determinar a quantidade de proteínas ou seus fragmentos do WNV ou vírus da Dengue em uma amostra biológica e para avaliar a presença ou não de um WNV ou vírus da Dengue. Adicionalmente, os anticorpos podem ser acoplados a compostos para usos diagnósticos e/ou terapêuticos, como partículas de ouro, fosfatase alcalina, peroxidase para diagnóstico por imagem e terapia. Os anticorpos também podem ser marcados (p. ex. imunofluorescência) para detecção mais fácil.
[061] Com relação a anticorpos da invenção, o termo liga-se especificamente a refere-se a anticorpos que se ligam com uma afinidade relativamente alta a um ou mais epitopos de uma proteína de interesse, mas que não reconhecem substancialmente e ligam moléculas diferentes daquela(s) de interesse. Como usado aqui, o termo afinidade relativamente alta significa uma afinidade de ligação entre o anticorpo e a proteína de interesse de pelo menos 106 M-1, e, de preferência, de pelo menos cerca de 107 M-1 e, de forma ainda mais preferível, de 108 M1- a 1010 M-1. Determinação de referida afinidade é conduzida, de preferência, em condições convencionais de imunoensaio de
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20/64 ligação competitiva que é conhecimento comum para alguém versado na técnica. Como usado aqui, anticorpo e anticorpos incluem todas as possibilidades mencionadas a seguir: anticorpos ou fragmentos dos mesmos obtidos por meio de purificação, tratamento proteolítico ou por meio de manipulação genética construções artificiais compreendendo anticorpos ou fragmentos dos mesmos e construções artificiais projetadas para emular as ligações de anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Referidos anticorpos são discutidos em Colcher et al. (Q J Nucl Med 1998; 42:225-241). Eles incluem anticorpos complexos, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos scFv, outros fragmentos, peptídeos de CDR e miméticos. Estes podem ser obtidos e preparados facilmente por aqueles com prática na técnica. Por exemplo, é possível utilizar digestão com enzimas para obter fragmentos F(ab')2 e Fab submetendo-se uma molécula de IgG a clivagem com pepsina ou papaína, respectivamente. Anticorpos recombinantes também podem ser cobertos pela presente invenção.
[062] Alternativamente, o anticorpo da invenção pode ser um derivado de anticorpo. Um anticorpo do tipo referido pode compreender uma região ligada a antígeno ligada ou não a uma região não-imunoglobulina. A região de ligação de antígeno é um domínio variável de cadeia leve de anticorpo ou domínio variável de cadeia pesada. Tipicamente, o anticorpo compreende domínios variáveis tanto de cadeia leve como de cadeia pesada, que podem ser inseridos em construções, como fragmentos Fv (scFv) de cadeia simples, fragmentos Fv (dsFv) estabilizados com dissulfeto, fragmentos de scFv multiméricos, dianticorpos, minianticorpos ou outras formas relacionadas (Colcher et al. Q J Nucl Med 1998; 42: 225-241). Algumas vezes, um anticorpo derivado pode ser preferível porque é isento da porção Fc do anticorpo natural que pode ligar-se a vários efetuadores do sistema imunológico e eliciar uma resposta imune quando administrado a um humano ou um animal.
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Efetivamente, anticorpo derivado normalmente não leva a doença imuno-complexo e ativação de complemento (reação de hipersensibilidade de tipo III).
[063] Alternativamente, uma região não-imunoglobulina é fusionada à região de ligação de antígeno do anticorpo da invenção. A região nãoimunoglobulina é tipicamente uma porção não-imunoglobulina e pode ser uma enzima, uma região derivada de uma proteína apresentando especificidade de ligação conhecida, uma região derivada de uma toxina de proteína ou, efetivamente, de qualquer proteína expressa por um gene, ou uma entidade química apresentando atividade(s) inibidor ou bloqueadora contra proteínas do WNV ou vírus do Dengue. As duas regiões daquele anticorpo modificado podem ser conectadas via uma seqüência clivável ou uma seqüência ligante permanente.
[064] De preferência, o anticorpo da invenção é uma imunoglobulina humana ou animal, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE ou IgD portando regiões variáveis de rato ou camundongo (quiméricas) ou CDRs (humanizados ou animalizados). Além disso, o anticorpo da invenção também pode ser conjugado a qualquer veículo vantajoso conhecido por alguém versado na técnica de forma a proporcionar, por exemplo, um fornecimento específico e retenção prolongada do anticorpo, quer em uma área local objetivada ou para uma aplicação sistêmica.
[065] O termo anticorpo humanizado refere-se a um anticorpo derivado de um anticorpo não-humano, tipicamente murino, que conserva ou que conserva substancialmente as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo parental, mas que é menos imunogênica em humanos. Isto pode ser obtido por meio de vários métodos incluindo (a) enxerto de apenas GDRs não-humanos numa matriz humana e regiões constantes com ou sem retenção de radicais de matriz críticos, ou (b) transplante dos domínios variáveis não-humanos inteiros, porém recobrimento dos mesmos com uma seção semelhante-a-humana por meio de substituição de radicais de superfície. Referidos métodos são bem conhecidos por alguém versado na técnica.
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[066] Como indicado acima, o anticorpo da invenção é imunologicamente específico ao polipeptídeo da presente invenção e seus derivados imunológicos. Como usado aqui, o termo derivado imunológico referese a um polipeptídeo que apresenta uma atividade biológica que é substancialmente semelhante à atividade imunológica do polipeptídeo inteiro, e referida atividade imunológica refere-se à capacidade de estimular a produção de anticorpos imunologicamente específicos para as proteínas ou seus derivados do WNV ou do vírus do Dengue. Portanto, o termo derivado imunológico abrange fragmentos, segmentos, variantes, ou análogos de um polipeptídeo.
4. Composições e vacinas
[067] Os polipeptídeos da presente invenção, os polinucleotídeos que codificam os mesmos, os anticorpos policlonais ou monoclonais, os vírus do sarampo recombinantes produzidos de acordo com a invenção, podem ser usados de várias maneiras para o diagnóstico, o tratamento ou a prevenção de infecção ou doença associada com WNV ou vírus do Dengue.
[068] Numa sexta concretização, a presente invenção refere-se a uma composição para eliciar uma resposta imune ou uma imunidade protetora contra um WNV ou um vírus do Dengue. De acordo com um aspecto relacionado, a presente invenção refere-se a uma vacina para prevenir e/ou tratar uma infecção ou doença associada com WNV ou vírus do Dengue. Como usado aqui, o termo tratar refere-se a um processo com o qual os sintomas de uma infecção ou doença associada com WNV ou vírus do Dengue são aliviados ou completamente eliminados. Como usado aqui, o termo prevenir refere-se a um processo com o qual uma infecção ou doença associada com WNV ou vírus do Dengue é obstruída ou retardada. A composição ou a vacina da invenção compreende um polinucleotídeo, um polipeptídeo, um vetor de expressão, um vetor viral recombinante, um vírus do sarampo recombinante
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23/64 e/ou um anticorpo como definido acima e um veículo aceitável.
[069] Como usado aqui, a expressão um veículo aceitável significa um veículo para conter o polinucleotídeo, o polipeptídeo, o vetor de expressão, o vetor viral recombinante, o vírus do sarampo recombinante e/ou o anticorpo da invenção que pode ser injetado em um hospedeiro animal sem efeitos adversos. Veículos vantajosos conhecidos na técnica incluem, embora sem limitação, partículas de ouro, água estéril, solução salina, glucose, dextrose, ou soluções tamponadas. Veículos podem incluir agentes auxiliares incluindo, embora sem limitação, diluentes, estabilizadores (i. e., açúcares e aminoácidos), conservantes, agentes umidificantes, agentes emulsificantes, agentes tamponadores de pH, aditivos acentuadores de viscosidade, cores e análogos.
[070] É possível adicionar agentes adicionais à composição e vacina da invenção. Por exemplo, a composição da invenção também podem compreender agentes, como drogas, imunoestimulantes (como α-interferon, βinterferon, γ-interferon, fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF, granulocyte macrophage colony stimulator factor), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF, macrophage colony stimulator factor), interleucina 2 (IL2), interleucina 12 (IL12), e CpG oligonucleotídeos), antioxidantes, tensoativos, agentes aromatizantes, óleos voláteis, agentes tamponadores, dispersantes, propelentes, e conservantes. Para a preparação dessas composições, é possível utilizar métodos bem conhecidos na técnica.
[071] A quantidade de polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor de expressão, vetor viral recombinante, vírus do sarampo recombinante e/ou anticorpo presente nas composições ou nas vacinas da presente invenção é, de preferência, uma quantidade terapeuticamente efetiva. Uma quantidade terapeuticamente efetiva do polinucleotídeo, do polipeptídeo, do vetor de expressão, do vetor viral recombinante, do vírus do sarampo
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24/64 recombinante e/ou do anticorpo da invenção é aquela quantidade necessária para permitir que o mesmo realize seu papel imunológico sem causar efeitos por demais negativos no hospedeiro a que se pretende administrar a composição. A quantidade exata de polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor de expressão, vetor viral recombinante, vírus do sarampo recombinante e/ou anticorpo a ser usada e a composição/vacina a ser administrada variará de acordo com fatores, como o tipo de condição sendo tratada, o modo de administração, e também os outros ingredientes da composição.
5. Métodos de utilização
[072] Em uma sétima concretização, proporciona-se a presente invenção refere-se a métodos de tratar e/ou prevenir uma infecção ou doença associada com WNV ou vírus do Dengue em um animal. O método compreende a etapa de administrar ao animal uma quantidade efetiva de pelo menos um elemento selecionado do grupo que consiste de:
- um polipeptídeo da invenção ou um derivado funcional do mesmo;
- um anticorpo como definido acima;
- um vetor de expressão como definido acima;
- um polinucleotídeo da invenção ou um fragmento do mesmo,
- um vetor viral recombinante da invenção; e
- um vírus do sarampo recombinante da invenção.
[073] A vacina, anticorpo e composição da invenção pode ser dada a um animal através de diversas vias de administração. Por exemplo, a composição pode ser administrada em forma de preparações injetáveis estéreis, como suspensões oleaginosas ou aquosas injetáveis estéreis. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na técnica utilizando-se agentes dispersantes ou umidificantes e agentes de
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25/64 suspensão vantajosos. As preparações injetáveis estéreis também podem ser suspensões ou soluções injetáveis estéreis em solventes ou diluentes nãotóxicos parenteralmente aceitáveis. Elas podem ser administradas parenteralmente, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente por meio de injeção, por meio de infusão ou per os. A vacina e a composição da invenção também podem ser formuladas como cremes, ungüentos, loções, géis, gotas, supositórios, pulverizadores, líquidos ou pós para administração tópica. Elas também podem ser administradas nas vias aéreas de um sujeito por meio de um dispensador de aerossol pressurizado, um pulverizador nasal, um inalador de dose medida, um inalador de pó seco, ou uma cápsula. Dosagens vantajosas variarão dependendo de fatores, como a quantidade de cada um dos componentes na composição, do efeito desejado (curto ou longo prazo), da via de administração, da idade e do peso do animal a ser tratado. É possível utilizar quaisquer outros métodos bem conhecidos na técnica para administrar a vacina, anticorpo e a composição da invenção.
[074] A presente invenção também se refere a um método para produzir um vírus recombinante para a preparação de uma vacina antivírus do Nilo Ocidental ou uma vacina antivírus do Dengue, sendo que o método compreende as etapas de:
a) proporcionar uma célula hospedeira como definido acima;
b) colocar a célula hospedeira da etapa a) em condições que permitem a replicação de um vírus recombinante capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção; e
c) isolar o vírus recombinante produzido na etapa b).
[075] Em uma concretização adicional proporciona-se um ensaio de neutralização do vírus do Nilo Ocidental. Assim, o ensaio compreende as etapas de:
a) contactar Células Vero com vírus do Nilo Ocidental e um
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26/64 anticorpo;
b) cultivar referidas Células Vero em condições que permitem replicação do vírus do Nilo Ocidental; e
c) medir a redução de focos de replicação do vírus do Nilo Ocidental em referidas Células Vero.
Exemplos
[076] A presente invenção será mais facilmente compreendida com referência aos exemplos a seguir. Estes exemplos são ilustrativos da grande faixa de aplicabilidade da presente invenção e não se destinam a limitar sua abrangência. É possível realizar modificações e variações na invenção sem afastar-se do espírito e da abrangência da mesma. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática para testar a presente invenção, os métodos e materiais são descritos aqui.
exemplo 1: CONSTRUÇÃO de antígenos de den1 e wnv expressando vírus do SARAMPO (MV)
[077] Para testar sua capacidade como candidatos de vacina contra infecção com WNV, construiu-se vírus do sarampo (MV) de Schwarz recombinantes expressando estes antígenos de WNV e DEN-1. Os diferentes genes foram introduzidos em uma unidade de transcrição adicional no cDNA de MV de Schwarz que os inventores clonaram previamente (pTM-MVSchw) (Pedido de Patente Européia N° 02291551.6 depositado em 20 de junho de 2002). Após recuperação dos diferentes vírus do sarampo de Schwarz recombinantes expressando os genes WNV e DEN-1, testar-se-á sua capacidade de proteger camundongos de uma exposição letal intraperitoneal a WNV, e macacos de infecção com vírus do Dengue.
Vetor de MV
[078] Vacinação em massa com vacinas atenuadas vivas
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27/64 reduziu drasticamente a incidência do sarampo e de suas complicações desde que foi introduzida na década de 1960. Até aqui, a vacina foi fornecida a bilhões de pessoas e é segura e eficaz. Ela induz uma imunidade humoral, CD4 e CD8 muito eficiente e para toda a vida após uma única injeção de 104 TCID50. Além disso, ela é muito fácil de produzir, econômica, e já existem os meios de fornecer a mesma a nível mundial. A segurança desta vacina deve-se a diversos fatores: i) A estabilidade do genoma do MV que explica aquela reversão à patogenicidade nunca foi observada. ii) A impossibilidade do genoma do MV integrar-se em cromossomos do hospedeiro porque a replicação viral é exclusivamente citoplásmica. iii) A produção da vacina em células fibroblásticas primárias de embrião de frango. Assim, MV atenuado vivo poderia proporcionar um vetor de vacinação pediátrica seguro e eficiente.
[079] MV pertence ao gênero Morbillivirus na família Paramyxoviridae. O MV de Edmonston foi isolado em 1954 (32), passado serialmente sobre células primárias de âmnio e de rim humano, depois adaptado a fibroblastos de embrião de frango (CEF, chick embryo fibroblasts) para produzir sementes A e B de Edmonston (ver (7, 8) para revisão). Edmonston B foi licenciada em 1963 como a primeira vacina de MV. Passagens adicionais de Edmonston A e B sobre CEF produziram vírus de Moraten e de Schwarz mais atenuados (33) cujas seqüências recentemente se demonstrou serem idênticas (34, 35). Sendo reatogênica a vacina de Edmonston B foi abandonada em 1975 e substituída pela vacina de Schwarz/Moraten. Atualmente, esta é a vacina do sarampo utilizada com mais freqüência (7, 8).
[080] Em um trabalho prévio, os inventores construíram um cDNA infeccioso a partir de uma batelada de vacina de Schwarz comercial, uma vacina de MV amplamente usadas (Pedido de Patente Européia N° 02291551.6 depositado em 20 de junho de 2002). As extremidades do cDNA
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28/64 foram manipuladas para maximizar o rendimento de vírus durante a recuperação. Um sistema de recuperação baseado em células auxiliares descrito previamente foi adaptado por meio de co-cultivo de células transfectadas em fibroblastos primários de embrião de frango, as células usadas para produzir a vacina de Schwarz. Após duas passagens a seqüência do vírus recuperado foi idêntica àquela do cDNA e da seqüência de Schwarz publicada. Introduziu-se duas unidades de transcrição adicionais (ATU, additional transcription units) no cDNA para clonagem de material genético estranho. A imunogenicidade de vírus recuperado foi estudada em camundongos transgênicos para o receptor CD46 do MV e em macacos. Titulações de anticorpos em animais inoculados com baixas doses do vírus recuperado foram idênticas àquelas obtidas com vacina de MV de Schwarz comercial. Em contraste, a imunogenicidade de um clone de MV derivado de cepa de Edmonston previamente indicado foi muito menor. Este novo clone molecular permite produzir vacina de MV sem necessidade de dependência de estoques de sementes. As ATUs permitem produzir vacinas recombinantes baseadas em uma cepa de vacina aprovada, eficiente e utilizada mundialmente.
Exemplo 2: construção de plasmídeos recombinantes de mv de schwarz WNV
1) Glicoproteína E secretada de WNV
[081] O gene de env de WNV que codifica a forma secretada da proteína foi gerado por meio de amplificação com RT-PCR de RNA viral purificado de partículas virais (WNV cepa IS-98-ST1). A seqüência específica foi amplificada utilizando-se DNA polimerase de PfuTurbo (Stratagene) e iniciadores específicos que contêm sítios únicos para clonagem subseqüente no vetor pTM-MVSchw: MV-WNEnv5 5'TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3' (SEQ ID NO: 9) (sítio
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BsiWI sublinhado) e MV-WNEnv3 5'ATAGCGCGCTTAGACAGCCTTCCCAACTGA-3' (SEQ ID NO: 10) (sítio BssHII sublinhado). Adicionou-se um códon de partida e um de interrupção em ambas as pontas do gene. Toda a seqüência gerada tem comprimento de 1380 nucleotídeos (ver Figura 1), incluindo os códons de partida e de interrupção respeita a regra de seis, estipulando que o número de nucleotídeos do genoma do MV precisa ser divisível por 6 (28, 29). A proteína Env assim gerada contém seu peptídeo-sinal na ponta N (18 aa) e nenhuma região de transmembrana. Assim, ela representa aminoácidos 275-732 na poliproteína do WNV e apresenta a seqüência mostrada na Figura 2.
2) Glicoproteínas E mais preM de WNV
[082] O gene de WNV que codifica as glicoproteínas E mais preM foi gerado por meio de amplificação com PCR do plasmídeo pVL prM-
E.55.1 (clone CNCM l-2732 depositado em 15 de outubro de 2001). Este plasmídeo de expressão codifica as proteínas pre-M e E de WNV (cepa IS-98ST1). A seqüência foi amplificada utilizando-se DNA polimerase de PfuTurbo (Stratagene) e iniciadores específicos que contêm sítios únicos para clonagem subseqüente no vetor pTM-MVSchw: MV-WNpreME5 5'-
TATCGTACGATGCAAAAGAAAAGAGGAGGAAAG-3' (SEQ ID NO: 11) (sítio BsiWI sublinhado) e MV-WNpreME3 5'ATAGCGCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGAG-3' (SEQ ID NO: 12) (sítio BssHII sublinhado). Adicionou-se um códon de partida e um de interrupção em ambas as pontas do gene. A seqüência integral gerada apresenta comprimento de 2076 nucleotídeos (ver Figura 3); incluindo os códons de partida e de interrupção e respeita a regra de seis do MV. Nesta construção, a parte da ponta C da proteína C serve como um sinal de translocação de prM. Ambas as glicoproteínas virais, preM e E, são glicoproteínas de transmembrana de tipo 1. Presume-se que preME env do WNV expressando MV produzirá e liberará
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30/64 formas multiméricas de heterodímeros de preM-E apresentando alto potencial imunogênico. A construção representa aminoácidos de 302-789 na glicoproteína do WNV e apresenta a seqüência mostrada na Figura 4.
3) Proteína NS1 de WNV
[083] O gene NS1 do WNV foi gerado por meio de amplificação com RT-PCR de RNA viral purificado de partículas virais (WNV cepa IS-98ST1). A seqüência específica foi amplificada utilizando-se DNA polimerase de PfuTurbo (Stratagene) e iniciadores específicos: MV-WNNS15 5'TATCGTACGATGAGGTCCATAGCTCTCACG-3' (SEQ ID NO: 13) (sítio BsWI sublinhado) e MV WNNS13 5'ATAGCGCGCTCATTAGGTCTTTTCATCATGTCTC-3' (SEQ ID NO: 14) (sítio BssHII sublinhado). Adicionou-se um códon de partida na ponta 5' e dois códons de interrupção na ponta 3' da seqüência. A seqüência integral tem comprimento de 1110 nucleotídeos (ver Figura 5), incluindo os códons de partida e os dois códons de interrupção, respeitando assim a regra de seis. A proteína NS1 gerada contém sua seqüência de peptídeo-sinal na ponta N (23 aa). Ela representa aminoácidos de 769-1136 na poliproteína do WNV e apresenta a seqüência mostrada na Figura 6.
4) Proteína preM-E do vírus do Dengue tipo 1
[084] O gene do vírus do Dengue que codifica as glicoproteínas preM mais E foi gerado por meio de amplificação com PCR do plasmídeo pVL pIND/[prM+E] (clone 2) (COURAGEOT, M.-P., et al. 2000, inibidores de Aglucosidase reduzem a produção de vírus do dengue ao afetarem as etapas iniciais da morfogênese do vírion no retículo endoplasmático. Journal of Virology 74: 564-572). Este plasmídeo codifica as glicoproteínas pre-M e E do vírus do DEN-1 (cepa FGA/89). A seqüência foi amplificada utilizando-se DNA polimerase de PfuTurbo (Stratagene) e iniciadores específicos que contêm sítios únicos para clonagem subseqüente no vetor pTM-MVSchw: MV DEN1
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31/64 preME5 5'-TATCGTACGATGAACAGGAGGAAAAGATCCGTG-3' (SEQ ID NO: 15) (sítio BsIWI sublinhado) e MV-DEN1preME3 5'ATAGCGCGCTTAAACCATGACTCCTAGGTACAG-3' (SEQ ID NO: 16) (sítio BssHII sublinhado). Adicionou-se um códon de partida e um de interrupção em ambas as pontas do gene. A seqüência integral gerada tem comprimento de 2040 nucleotídeos (ver Figura 7), incluindo os códons de partida e de interrupção e respeita a regra de seis do MV. Nesta construção, a parte da ponta C da proteína C serve como um sinal de translocação de preM. Ambas as glicoproteínas virais preM e E são glicoproteínas de transmembrana de tipo 1. Presume-se que DEN-1 env expressando MV produzirá e liberará formas multiméricas de heterodímeros preM-E apresentando elevado potencial imunogênico. A construção representa aminoácidos de 95-773 na glicoproteína do DEN-1 e apresenta a seqüência mostrada na Figura 8. É possível preparar os mesmos imunógenos a mesma maneira a partir dos sorotipos DEN-2, DEN3 e DEN-4.
5) Inserção no vetor MV Schwarz
[085] As diferentes sequências nucleotídicas de WNV e DEN-1 foram clonadas no plasmídeo pCR2.1-TOPO (Invitrogen) e seqüenciadas para verificar que não se introduziu mutações. Após digestão com BsiWI/BssHII dos plasmídeos pCR2.1-TOPO, os fragmentos de DNA foram clonados no vetor pTM-MVSchw na posição 2 do ATU dando plasmídeos: pTM-MVSchwEnvWNV, pTM-MVSchw-preMEwnv, pTM-MVSchw-NS1WNV e pTM-MVSchwpreMEDEN-1 de acordo com Figura 9.
Exemplo 3: RECUPERAÇÃO de vírus recombinantes mvschw-envwnv, mvschwPREMEWNV E MVSCHW-NSlWNV
[086] Para recuperar vírus de Schwarz recombinantes dos plasmídeos, nós utilizamos o sistema de recuperação à base de células auxiliares descrito por Radecke et al. (11) e modificado por Parks et al. (30).
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Células auxiliares humanas expressando de forma estável RNA polimerase T7e proteínas N e P do sarampo (células 293-3-46, um presente gentil de MA Billeter) foram transfectadas utilizando-se o procedimento do fosfato de cálcio com plasmídeos pTM-MVSchw-EnvWNV, pTM-MVSchw-preMEwnv ou pTMMVSchw-NS1WNV (5 μg) e um plasmídeo que expressa o gene L da MV polimerase (pEMC-La, 20 ng, um presente gentil de MA Billeter). Após incubação de um dia para o outro a 37° C, o meio de transfecção foi substituído por meio fresco e aplicou-se um choque com calor (43° C durante duas horas) (30). Após dois dias de incubação a 37° C, células transfectadas foram transferidas para uma camada de células CEF e incubadas a 32° C para evitar qualquer adaptação da vacina de Schwarz que foi selecionada originalmente em células CEF e é desenvolvida correntemente nestas células por considerações de segurança. Vírus infeccioso foi recuperado facilmente entre 3 e 7 dias após co-cultivo. Ocasionalmente apareceram sincícios em CEF, porém não sistematicamente. Os vírus recombinantes também foram recuperados por meio da mesma técnica após co-cultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37° C com Células Vero primatas (rim do macaco verde africano). Neste caso, sincícios ocorreram sistematicamente em todas as transfecções após 2 dias de co-cultura. Para aumentar o rendimento de recuperação e porque estes vírus recombinantes serão usados em experimentos envolvendo camundongos, utilizou-se células Vero como célulasalvo em lugar dos fibroblastos usuais de embrião de frango (CEF) (Pedido de Patente Européia N° 02291551.6 depositado em 20 de junho de 2002). Vírus recombinantes foram passados duas vezes em células Vero. Os inventores mostraram previamente que duas passagens do vírus de Schwarz em células Vero não altera suas capacidades imunogênicas em macacos (Pedido de Patente Européia N° 02291551.6 depositado em 20 de junho de 2002).
[087] Os vírus recombinantes foram preparados como descrito
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33/64 acima e verificou-se por meio de fluorescência a expressão do transgene em células infectadas. Para detectar a expressão de glicoproteínas de envelope do WNV, utilizou-se soros imunes de camundongos resistentes a infecção com WNV (Pedido de Patente Internacional WO 02/081741). Para detectar a expressão da proteína de NS1, os inventores usaram anticorpos monoclonais anti-NS1 (Pedido de Patente Internacional N° WO00/75665).
Exemplo 4: vacinação contra vírus do nilo ocidental
[088] A Doença do Nilo Ocidental emergiu como uma importante infecção com flavivírus transmitida por mosquito com numerosos casos fatais de encefalite humana, motivando assim a urgência de desenvolver uma vacina segura e eficiente. A vacina do vírus do sarampo (MV), um vírus de RNA vivo atenuado, é uma das vacinas humanas mais seguras e mais efetivas desenvolvidas até aqui. A vacina da cepa de Schwarz do MV pode ser usada como um vetor para imunizar contra vírus heterólogo, oferecendo assim uma estratégia de vacinação inédita e atraente contra vírus do Nilo Ocidental (WNV). Nós avaliamos a eficácia de um vetor derivado de vacina do sarampo de Schwarz expressando a forma secretada da glicoproteína E de envelope do WNV em um modelo de camundongo. Vacinação induziu altas titulações de anticorpos neutralizadores específicos anti-WNV e proteção de uma exposição letal a WNV. Administração passiva com anti-soros de camundongos imunizados também proporcionou proteção, mesmo após exposição a altas doses de WNV. Exemplo 4 é o primeiro relato de que um vírus recombinante do sarampo vivo atenuado proporciona imunidade protetora eficiente contra uma doença viral heteróloga. A indução de imunidade protetora mostra que MV vivo atenuado expressando a forma secretada da glicoproteína E é uma vacina efetiva contra a doença do Nilo Ocidental.
Materiais e métodos
[089] Células e vírus. Células Vero-NK (rim do macaco verde
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34/64 africano) foram mantidas em DMEM Glutamax (Invitrogen) suplementado com 5% de soro bovino fetal (FBS, fetal bovine serum) inativado com calor. Utilizouse células auxiliares 293-3-46 para recuperação viral (11) (um presente gentil de M. Billeter, Universidade de Zurique) que foram desenvolvidas em DMEM/10% de FBS e suplementadas com 1,2 mg de G 418 por ml. Cepa IS98-ST1 do WNV (número de acesso GenBank AF 481864) foi propagada em monocamadas de células de no mosquito Aedes pseudoscutellaris AP61 (13). Purificação sobre gradientes de sacarose, e titulação de vírus sobre células AP61 por meio de ensaio de imunodetecção de foco (FIA, focus immunodetection assay) foram realizadas como descrito previamente (13, 27).
[090] Anti-soros de camundongo para WNV. Fluido ascítico de camundongo hiperimune anti-WNV (HMAF, hyperimmune mouse ascitic fluid) foi obtido por meio de imunização repetida de camundongos adultos com a cepa IS-98-ST1 do WNV seguido da inoculação de sarcoma 180. Anticorpos anti-MNV policlonais de camundongo foram obtidos por meio de imunização de camundongos congênicos BALB/c-MBT adultos com 103 FFU de IS-98-STI como descrito previamente (13). O soro imunológico foi coletado uma vez por mês após a preparação.
[091] Construção do plasmídeo pTM-MVSchw-sEWNV. O plasmídeo pTM-MVSchw que contém um cDNA de MV infeccioso correspondente ao anti-genoma da cepa de vacina de MV Schwarz/Moraten amplamente usada foi reportado alhures (10). Unidades de transcrição adicional foram introduzidas no genoma viral para torná-lo um vetor que expressa proteínas estranhas. Para construir pTM-MVSchw-sEWNV, RNA genômico do WNV foi extraído de vírions IS-98-ST1 altamente purificados e transcritos de forma invertida utilizando-se o kit de RT-PCR de uma etapa Titan One-Step RT-PCR kit (Roche Molecular Biochemicals) de acordo com as instruções do fabricante. Um fragmento de RT-PCR codificando o sinal de
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35/64 translocação de E interno (prM-151 a prM-166) seguido do ectodomínio e da região de haste da proteína E (E-1 a E-441) foi gerado utilizando-se o iniciador a 5' MV-WNEnv5 5'-TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3' (SEQ ID NO: 9) contendo um sítio de restrição BsiWI (sublinhado) e o iniciador a 3' MV-WNEnv3 5'-ATAGCGCGCTTAGACAGCCTTCCCAACTGA-3' (SEQ ID NO: 10) contendo um sítio de restrição BssHII (sublinhado). Adicionou-se um códon de partida e um de interrupção em ambas as pontas do gene. A seqüência respeita a regra de seis, estipulando que o número de nucleotídeos do genoma do MV precisa ser um múltiplo de 6 (28, 29). O produto de PCR foi inserido diretamente no plasmídeo pCR2.1-TOPO (kit de clonagem TOPO TA, Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante dando TOPO-sEWNV. Um fragmento de 1,4 kb contendo proteína E truncada com seqüência-sinal de translocação foi excisada de TOPO-sEWNV utilizando-se BsiWI e BssHII e depois inserido em pTM-MVSchw-ATU2 digerido com BsiWI/BssHII que contém a unidade de transcrição adicional (ATU, additional transcription unit) entre os genes P e M do genoma do MV de Schwarz (10, 11). O plasmídeo resultante foi denominado pTM-MVSchw-sEWNV (denominado pTM-MVSchw EnvWVN nos Exemplos precedentes). Todas as construções foram verificadas por meio de seqüenciamento automatizado.
[092] Recuperação de vírus recombinante MVSchw-sEWNV do cDNA clonado. Recuperação de MV de Schwarz recombinante do plasmídeo pTM-MVSchw-sEWNV foi realizada utilizando-se o sistema de recuperação baseado em células auxiliares descrito por Radecke et al. (11) e modificado por Parks et al. (30). Resumidamente, células auxiliares humanas expressando de forma estável RNA polimerase T7 e proteínas N e P do sarampo (células 2933-46, um presente gentil de MA Billeter, Universidade de Zurique) foram transfectadas com 5 μg de pTM-MVSchw-sEWNV e 0,02 μg de pEMC-La expressando o gene L de MV polimerase (um presente gentil de MA Billeter)
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36/64 utilizando-se o procedimento do fosfato de cálcio. Após incubação de um dia para o outro a 37° C, aplicou-se um choque com calor aplicado durante 2 h a 43° C. Após dois dias de incubação a 37° C, células transfectadas foram transferidas para uma monocamada de células Vero. Utilizou-se células Vero como células-alvo em lugar dos fibroblastos usuais de embrião de frango (CEF) para incrementar o rendimento de vírus recuperado. Os inventores mostraram previamente que duas passagens do vírus de Schwarz em células Vero não alteram sua imunogenicidade em primatas (10). Sincícios que apareceram após 2-3 dias de co-cultura foram transferidos para poços de 35 mm de células Vero, depois expandidos em frascos de 75 e, depois, de 150 cm2 em DMEM/5% de FBS. Quando sincícios atingiram 80-90% de confluência (usualmente 36-48 h após a infecção), as células foram raspadas em um pequeno volume de OptiMEM (Invitrogen) e congeladas e orvalhadas uma vez. Após centrifugação a baixa velocidade para pelotizar fragmentos celulares, o sobrenadante que continha vírus foi armazenado a 80°C. As titulações de MVSchw sEwnv foi determinada por um ensaio de diluição limite de ponto terminal sobre células Vero. As doses infecciosas em cultura de tecidos a 50% (TCID50, 50% tissue culture infectious doses) foram calculadas utilizando-se o método de Karber.
[093] Ensaios de radio-imunoprecipitação. Células Vero foram mantidas sem nutriente durante 1 h com DMEM sem metionina e cisteína (ICN Biomedicals) e marcadas [lacuna] 3 h com 250 iiCi/ml de marcador Tran35S (ICN Biomedicals). Células foram lisadas com tamponador RIPA (20 mM de TrisCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato, 1% de Triton X-100) suplementado com um coquetel de inibidores de protease. Ensaio RIP foi realizado como descrito previamente (31). Amostras foram analisadas por meio de SDS-15% de PAGE em condições de redução.
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[094] Experimentos com camundongos. Camundongos CD46IFNAR foram produzidos como descrito previamente (10). Camundongos BALB/c adultos foram adquiridos da Janvier Laboratories (Le Genest St Isle, França). Camundongos foram alojados em condições isentas de patógeno específico no Instituto Pasteur. Camundongos CD46-IFNAR com 5 a 6 semanas de vida foram inoculados i.p. com 104 ou 106 TCID50 de MV. Exposição aguda a WNV foi realizada por meio de inoculação i.p. da cepa IS98-ST1 de WNV neurovirulenta (i.p. LD50 = 10) em tamponador de solução salina de fosfato modificada Dulbecco (DPBS) suplementada com 0,2% de albumina de soro bovino (BSA, bovine serum albumin) pH 7,5 (Sigma Chemical Co.). Os animais foram monitorados diariamente quanto a sinais de morbidez e mortalidade. Todos os experimentos são aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes do Office Laboratory Animal Care no Pasteur Institute.
[095] Teste de vacinação anti-WN com reforço antigênico. Camundongos CD46+/- IFN-a/pR-/- adultos foram vacinados durante um período de quatro semanas com o vírus MV-WN sE a uma dose de 104 DCIP50 (que é uma dose recomendada para humanos) e proporcionou-se um reforço antigênico com pseudo-partículas de WNV purificadas que foram secretadas por células MEF/3T3.Tet-Off/WN prME # h2.
[096] Resposta humoral. Para avaliar a resposta específica do anticorpo no soro, camundongos foram sangrados pela via periorbital em momentos diferentes após inoculação. Detecção de anticorpos anti-MV foi realizada por meio de ELISA (Trinity Biotech, E.U.A.) como descrito previamente (10). Utilizou-se um conjugado HRP-anticorpo anti-camundongo (Amersham) como o anticorpo secundário. A titulação de ponto terminal foi calculada como a recíproca da última diluição, dando um valor positivo de densidade óptica. A presença de anticorpos anti-WNV foi avaliada por meio de ELISA como descrito previamente (13). Resumidamente, placas de
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38/64 microtitulação foram revestidas com 106 FFU de cepa IS-98-ST1 de WNV altamente purificada e, depois, incubadas com diluições de soros de camundongo. Um soro de teste foi considerado positivo quando sua densidade óptica foi de duas vezes a densidade óptica de soros de camundongos de controle imunizados.
[097] Ensaio de neutralização. Anticorpos neutralizadores antiWNV foram detectados com um teste FRNT. Soros de cada grupo de camundongos foram combinados e inativados com calor a 56°C durante 30 min. Células Vero foram semeadas em placas de 12 poços (1,5 x 105 células/poço) durante 24 h. Amostras de soro de camundongo foram diluídas serialmente em MEM Glutamax/2% de FBS. Diluições (0,1 ml) foram incubadas a 37°C durante 2 h e sob agitação delicada com um volume igual da cepa IS98-ST1 do WNV contendo 100 FFU. Em seguida avaliou-se a infetividade remanescente em monocamada de células Vero recoberta com MEM Glutamax/2% de FBS contendo 0,8% (W/v) de carboximetil celulose (BDH). Após 2 dias de incubação a 37°C com 5% de CO2, realizou-se FIA com HMAF anti-WNV como descrito previamente (27). A maior diluição de soro testada que reduziu o número de FFU em pelo menos 90% (FRNT90) foi considerada a titulação de ponto terminal.
[098] Transferência passiva de soros imunonólogicos. Soros imunológicos combinados foram transferidos para camundongos BALB/c fêmeas com 6 semanas de vida por via intraperitoneal. Camundongos receberam injeção de 0,1 ml de diluições seriais de amostras de soro combinadas em DPBS/0,2% de BSA um dia antes da inoculação do WNV. Os camundongos expostos foram observados durante mais de 3 semanas.
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
[099] Desde sua introdução nos Estados Unidos em 1999, a infecção por vírus do Nilo Ocidental (WNV) foi reconhecida como uma das
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39/64 doenças transmitidas por mosquito mais sérias no Hemisfério Ocidental, causando grave doença neurológica (meningoencefalite e síndrome semelhante a poliomielite) em humanos. (3). Nos últimos 4 anos, o WNV disseminou-se por toda a América do Norte, América Central e o Caribe (1, 2). Presume-se que ela atingirá a América do Sul nos anos vindouros. Desde 2002, os surtos nos E.U.A. foram caracterizados por um incremento aparente da gravidade da doença humana com 13.000 casos e 500 mortes. Embora a transmissão do WNV por mosquito seja predominante, o WNV também é transmitido por meio de transfusão de sangue, doação de órgãos e transplacentarmente para o feto (3). A prevenção da encefalite do Nilo Ocidental é uma prioridade de saúde pública e é imperativo que se desenvolva uma vacina (3, 4, 5). Até aqui nenhuma vacina foi aprovada para uso humano.
[0100] Porque o WNV pode ser transmitido através de espécies, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias preventivas para humanos. Uma abordagem racional poderia ser a de conferir uma imunidade de longo prazo em grandes grupos de indivíduos, e para reforçar esta imunidade em caso de surtos de WNV. Agora é possível usar vacina do vírus do sarampo (MV) como um vetor para imunizar contra doenças virais heterólogas, oferecendo com isso uma estratégia de vacinação inédita e atraente contra o WNV. Nós testamos recentemente este vetor contra infecção por HIV (6). A vacina do MV, um vírus de RNA vivo atenuado, é uma das vacinas humanas mais segura e efetiva desenvolvida até aqui. Ela induz uma imunidade vitalícia muito eficiente após uma única injeção ou após duas injeções (7, 8). O genoma do MV é muito estável e a reversão de cepas de vacina à patogenicidade jamais foi observada. A cepa de Schwarz do MV é usada em duas vacinas de sarampo mais amplamente usadas, Attenuavax (Merck e Co. Inc., West Point, E.U.A.) e Rouvax (Aventis Pasteur, Marcy I'Etoile, França), e na vacina combinada contra sarampo, caxumba e rubéola
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40/64 (MMR, measles, mumps, rubella) (9). Recentemente, nós geramos um cDNA infeccioso para esta cepa (10) e introduzimos unidades de transcrição adicionais (ATU) no mesmo para a clonagem de genes estranhos, baseado no trabalho de Radecke et al. (11). A vacina recuperada do clone molecular foi tão imunogênica quanto a vacina parental em primatas, e camundongos suscetíveis a infecção por MV. Assim, esta vacina de MV aprovada e amplamente usada pode ser usada como um vetor para imunizar indivíduos simultaneamente contra sarampo e outras doenças infecciosas.
[0101] O WNV é um vírus de RNA de filamento simples da família Flaviviridae, gênero flavivírus, dentro do complexo antigênico da encefalite Japonesa (2, 3). O vírion é constituído de três proteínas estruturais, denominadas C (proteína de núcleo [Core]), M (proteína de Membrana) e E (proteína de envelope). Proteína E, que é exposta sobre a superfície do vírion, é responsável pela fixação do vírus e fusão de membrana específica para vírus. Como a glicoproteína E pode servir potencialmente como um imunógeno protetor importante para uma vacina de WNV (12), os inventores introduziram o cDNA de WNV que codifica a glicoproteína E truncada na ponta carboxila que carece da região de ancoragem de transmembrana (radicais de E-1 a E-441, denominada sEwnv a seguir) da cepa IS-98-ST1 (13) no cDNA infeccioso para a vacina da [cepa] Schwarz do MV (10) (Fig. 10A). A cepa do WNV IS-98-ST1 precisa apresentar as mesmas propriedades neurológicas que a nova variante denominada Isr98/NY99 que foi responsável pelos recentes surtos de WNV na América do Norte e Oriente Médio (13). A seqüência do WNV foi introduzida em uma ATU localizada entre os genes de fosfoproteína (P) e matriz (M) no genoma do MV. O vírus recombinante MVSchw-sEwNV foi produzido após transfecção do plasmídeo correspondente para células auxiliares humanas, permitindo a recuperação de RNA de paramixovírus de filamento simples (11), depois propagação em culturas de células Vero. O crescimento de MVSchw
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41/64 sEwnv em células Vero só se mostrou ligeiramente retardado em comparação com aquele da cepa convencional Schwarz do MV (MVSchw) (Fig. 10B). Após 60 h de infecção, o rendimento de MVSchw-sEwNV mostrou ser comparável àquele de MVSchw. A expressão de sEwnv em células Vero infectadas com MVSchw-sEwNV foi demonstrada por meio de ensaios de imunofluorescência e radio-imunoprecipitação (RIP, radioimmunoprecipitation) (Fig. 10C, D). Após 40 h da infecção, a superfície celular de sincícios induzidos com MVSchw-sEwNV foi claramente visualizada com soro imune anti-WNV, indicando que sEwnv é transportado ao longo dos compartimentos da via secretora (Fig. 10C). Análise RIP revelou que anticorpos anti-WNV reconheceram sEwnv que migrou mais rapidamente do que glicoproteína E autêntica (Fig. 10D). É interessante observar que sEwnv foi detectado nos sobrenadantes de células Vero infectadas com MVSchw-sEwNV após 40 h da infecção (Fig. 10D, quadro Sobrenadantes / MVSchw-sEwNV, faixa α WNV). Assim, MVSchw-sEwNV expressa uma glicoproteína E recombinante que é secretada de maneira eficiente. Imunotransferências confirmaram que sEwnv acumulados no meio de cultura de células Vero infectadas com MVSchw-sEwNV (dados não mostrados).
[0102] Camundongos modificados geneticamente expressando o receptor CD46 de MV e não apresentando o receptor do interferon α/β (6, 14) (CD46+/- IFN-α/β R-/-, abreviado CD46-IFNAR) que são suscetíveis a o MV (14) foram usados para avaliar a resposta imune induzida por MVSchw-sEwNV. Estes camundongos com deficiência de resposta a IFN-α/β apresentam respostas imunológicas celulares e humorais semelhantes àquelas de camundongos competentes (6, 10, 15, 16). Dois grupos de seis camundongos CD46-IFNAR foram inoculados intraperitonealmente (i.p.) com 104 ou com 106 doses infectivas de culturas de tecidos (TCID50) de MVSchw-sEwNV. Cada grupo recebeu reforço utilizando-se a mesma dose 1 mês após a primeira imunização. Como um controle, camundongos CD46-IFNAR foram imunizados
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42/64 com 106 TCID50 de MVSchw vazio. Um mês após a primeira imunização, detectou-se anticorpos específicos anti-MV em soros imunes de camundongos inoculados com MVSchw ou com MVSchw-sEWNV (Tabela 1). Camundongos que receberam qualquer dose de MVSchw-sEWNV apresentaram anticorpos específicos anti-WNV a uma diluição de 1:3.000. Um mês após o reforço, as titulações de anticorpos anti-WNV atingiram de 1:30.000 a 1:200.000 (Tabela 1) e mostraram-se altamente reativas com a glicoproteína E do WNV (Fig. 11). Não se detectou anticorpos anti-WNV nos soros de quaisquer camundongos de controle (Tabela 1 e Fig. 11). Estes resultados mostram que uma injeção de MVSchw-sEWNV, induz anticorpos anti-WNV, e que o reforço um mês após a dose inicial aumenta suas titulações de 10 a 60 vezes.
[0103] Atividade neutralizadora anti-WNV foi medida em soros imunes para MVSchw-sEWNV utilizando-se um teste de redução de foco (FRNT90) (Tabela 1). Como um controle positivo, o soro imune para WNV de camundongos congênitos BALB/c-MBT imunizados (13) deu uma titulação de 50 de acordo com FRNT90. O soro imune de camundongos CD46-IFNAR inoculados com MVSchw vazio não apresentou atividade neutralizadora detectável. Camundongos CD46-IFNAR imunizados que receberam 104 ou 106 TCID50 de MVSchw-sEWNV desenvolveram anticorpos neutralizadores com titulações semelhantes de acordo com FRNT90, e o reforço incrementou suas titulações de 10 para 200-300. Estes dados mostram que camundongos inoculados duas vezes com o MV recombinante vivo atenuado que codifica a forma secretada da glicoproteína E de IS-98-ST1 apresentaram altos níveis de anticorpo anti-WNV com atividade neutralizadora, independentemente da dose injetada.
[0104] Porque a imunidade mediada com anticorpo pode ser crítica para proteger contra infecção por WNV (17, 18), os inventores examinaram se a transferência passiva de soro de camundongos imunizados
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43/64 com MVSchw-sEwNv pode proteger camundongos BALB/c adultos contra infecção por WNV (Tabela 2). Grupos de seis camundongos BALB/c com seis semanas de vida receberam por via i.p. diversas quantidades de soros imunes combinados de camundongos CD46-IFNAR imunizados com MVSchw-sEWNV coletados um mês após a dose inicial ou o reforço. Um dia mais tarde, os camundongos foram expostos a 10 vezes a dose letal de 50% (LD50) de WNV da cepa IS-98-ST1 (13, 19). Como um controle positivo, camundongos BALB/c que receberam apenas 2 gl do soro imune para WNV foram protegidas contra a exposição (Tabela 2). Em contraste, todos os camundongos que receberam 2 gl do soro de camundongo não-imune ou soro de camundongos imunizados com MVSchw vazio morreram dentro de 11-12 dias. Observou-se imunidade passiva protetora em todos os camundongos BALB/c após transferência de 2 gl de soros combinados de camundongos CD46-IFNAR imunizados uma vez com 106 TCID50 de MVSchw-sEWNV. Apenas 1 gl destes anti-soros induziu 66% de proteção. Transferência passiva de soros coletados um mês após uma única imunização com 104 TCID50 induziu uma taxa de sobrevida de 50%.
[0105] É digno de nota que a administração de 1 gl de soros imunes para MVSchw-sEWNV coletados 1 mês após reforço induziu 100% de proteção. Estes resultados indicam que uma única injeção de 106 TCID50 ou duas injeções de 104 TCID50 de MVSchw-sEWNV eliciaram resposta humoral protetora. Porque a quantidade de flavivírus inoculada durante a alimentação do mosquito é provavelmente da ordem de 102 a 104 partículas virais infecciosas (1), nós avaliamos a capacidade de soros imunes para MVschwsEWN de proteger contra uma faixa de 102 a 105 unidades formadoras de foco (FFU, focus forming units) de WNV da cepa IS-98-ST1. Grupos de seis camundongos BALB/c foram imunizados passivamente com 2 gl de soros imunes combinados coletados de camundongos CD46-IFNAR inoculados duas vezes com 104 TCID50 de MVSchw-sEWNV (Tabela 2). Observou-se taxas de
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44/64 sobrevida de 85-100% em camundongos que receberam o soro imune para MVSchw-sEwNv, independentemente das doses letais de IS-98-ST1 (de 10 a 10.000 i.p. LD50). Estes dados são consistentes com a verificação de que a resposta humoral desempenha um papel crítico na proteção contra infecção por WNV.
[0106] Camundongos que são completamente não-responsivos para IFN-α/β são altamente suscetíveis ao flavivírus encefalítico (19, 20). Efetivamente, os inventores mostraram previamente que infecção de camundongos CD46-IFNAR por WNV foi letal dentro de 3 dias em lugar dos 11 dias no caso de camundongos competentes (19). Para avaliar se a imunidade induzida por MVSchw-sEWNV poderia proteger estes animais contra infecção por WNV, três camundongos CD46-IFNAR do grupo que havia recebido duas injeções de MVSchw-sEWNV (106 TCID50), foram inoculados i.p. com 100 FFU de IS-98-ST1 um mês após o reforço. Camundongos inoculados com MVSchw vazio foram usados como controles. Os camundongos que haviam recebido MVSchw-sEWNV sobreviveram à exposição por WNV enquanto que ratos de controle morreram dentro de 3 dias. Camundongos imunizados com MVSchwsEWNV foram sangrados 3 semanas após a exposição. A resposta do anticorpo de acordo com FRNT90 (titulação - 100) foi comparável à resposta préexposição. Principalmente, soros imunes pós-exposição não reagiram com proteínas não-estruturais de WNV, como NS3 e NS5 como mostrado por meio de ensaio RIP (Fig. 11, quadro MVSchw-sEWNV, faixa 106 TCID50, dia 20, p.c.), sugerindo que não ocorreu replicação viral após exposição com WNV. Estes dados mostram que imunização com MVSchw-sEWNV preveniu infecção por WNV em animais altamente suscetíveis.
[0107] O presente Exemplo mostra pela primeira vez que um vetor de sarampo vivo atenuado derivado da vacina Schwarz MV pode induzir uma imunidade protetora contra um patógeno letal heterólogo. Estes dados
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45/64 também constituem a prova de conceito de que uma vacina de sarampo de Schwartz viva atenuada manipulada para expressar a forma secretada da glicoproteína E de WNV pode ser usada como uma vacina para prevenir doença do Nilo Ocidental em humanos. O vetor de vacina do MV proporciona várias vantagens sobre outros vetores virais existentes. A vacina de Schwarz MV foi usada em bilhões de pessoas desde a década de 1960 e mostrou ser segura e eficaz. Ela é produzida com facilidade em grande escala na maior parte dos países e pode ser distribuída com baixo custo. O genoma do MV é muito estável, e nunca se observou reversão à patogenicidade (8). Além disso, MV replica exclusivamente no citoplasma, excluindo a possibilidade de integração no DNA hospedeiro. Mostrou-se que o vetor de MV expressa uma variedade de genes, ou combinações de genes, em grande escala em mais de doze passagens (6, 16, 21, 22, 23, 24). Esta estabilidade deve-se provavelmente ao fato de que há pouca restrição sobre o tamanho do genoma para vírus pleomórfico com um nucleocapsídeo helicoidal. Diferentemente de vetores virais quiméricos, o vetor de MV recombinante é um MV autentico expressando um gene adicional. Isto reduz em grande parte o risco de alterar o tropismo e a patogenicidade da vacina original. Isto também reduz o risco de recombinação.
[0108] A vacina de MV-WNV recombinante de acordo com uma concretização preferida da presente invenção é um vetor vivo atenuado promissor para imunizar-em-massa crianças e adolescentes tanto contra o sarampo como também contra doenças do Nilo Ocidental. Embora a existência de uma imunidade anti-MV em quase toda a população de adultos humanos pareça restringir seu uso em crianças, um objetivo que já é proveitoso, estudos recentes demonstraram que revacinando-se crianças já imunizadas obtém-se um reforço de anticorpos anti-MV (25, 26). Estes e outros estudos (Ann Arvin) demonstraram que a presença de pré-imunidade de MV passiva (anticorpos
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46/64 maternais) não evita a replicação de MV atenuado após uma segunda injeção. Isto abre a possibilidade de utilizar o vetor derivado de MV vivo atenuado para imunizar adultos. Efetivamente, os inventores reportaram que um vírus recombinante de MV-HIV induziu anticorpos neutralizadores anti-HIV em camundongos e macacos mesmo na presença de imunidade anti-MV préexistente (6). Devido à transmissão entre espécies, receia-se que o WNV tornase uma zoonose recorrente com surtos sazonais repetidos em humanos. Os inventores propõem que MVSchw-sEWNV pode ser usado para induzir memória de imunidade de longo prazo em grandes grupos de crianças e adultos, e para reforçar esta imunidade no caso de surto de doença do Nilo Ocidental.
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Tabela 1. Resposta de anticorpo de camundongos CD46-IFNAR para
INOCULAÇÃO INTRAPERITONEAL DE MVSCHW-SEwNV
Vírus imunizante Titulação de Ab específica para MV4 Titulação de Ab específica para WN4 FRNT90 específico para WN5
WNV1 (103 FFU) NT 10.000 50
MVSchw2 (106 TCID50) 30.000 <10 <10
MVSchw-sEwnv2 (104 TCID50) 15.000 3.000 10
MVSchw-sEwnv2 (106 TCID50) 25.000 3.000 10
2xMVSchw-sEwnv3 (104 TCID50) 90.000 30.000 200
2xMVSchw-sEwnv3 (106 TCID50) 140.000 200.000 300
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49/64 1 Camundongos congênitos BALB/c-MBT foram inoculados i.p. com WNV cepa IS-98-ST1 2 Vírus foi dado i.p. a camundongos CD46-IFNAR.
3 Vírus foi dado i.p. duas vezes com intervalos de 1 mês.
4 Determinado por meio de ELISA em soros combinados inativados com calor.
5 A diluição sérica mais alta que reduziu o número de FFU de WNV em pelo menos 90%.
NT: não testado
Tabela 2. Capacidade protetora do soro imune para MVSchw-sEwnv
Material usado para imunização Volume de soro transferido1 (μΐ) wnv2 (FFU) proteção (n° de sobreviventes/ n° testado) m.d.o.d3 (dia ± desvio padrão)
Controles 10 100 0/6 11,5+1,5
DPBS
WNV4 10 100 6/6 -
2 100 5/6 20
MVSchw5 2 100 0/6 12,0+1,5
MVSchw-sEWNV6
106 TCID50 (dia 30) 2 100 6/6 -
1 100 4/6 11,0+1,5
104 TCID50 (dia 30) 10 100 3/6 10,5+2,0
104 TCID50 (dia 60) 1 100 6/6 -
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Material usado para imunização Volume de soro transferido1 (μΙ) WNV2 (FFU) Proteção (n° de sobreviventes/ n° testado) m.d.o.d3 (dia ± desvio padrão)
2 100 5/6 11
2 1.000 6/6 -
2 10.000 5/6 10
2 100.000 5/6 11
1 Camundongos BALB/c receberam 0,1 ml de DPBS contando a quantidade indicada de soros combinados.
2 Camundongos foram expostos a WNV cepa IS-98-ST1 um dia após transferência passiva.
3 Dia médio de morte ± desvio padrão.
4 Soros imunes de camundongos congênitos BALB/c-MBT resistentes (13) inoculados com 103 FFU de IS-98-ST1 WNV.
5 Soros imunes de camundongos CD46-IFNAR coletados 30 dias após inoculação de MVSchw (106 TCID50).
6 Soros imunes de camundongos CD46-IFNAR foram coletados dias após 1 injeção ou 60 dias após 2 injeções de MVSchw-sEWNV.
Listagem De Seqüências <110> Institut Pasteur CNRS <120> PROTEÍNAS INÉDITAS DE VÍRUS DA DENGUE E DO
NILO OCIDENTAL E GENES
QUE CODIFICAM OS MESMOS, E SEU USO EM APLICAÇÕES VACINAIS,
TERAPÊUTICAS E DIAGNÓSTICAS] <130> 000466-0053
Petição 870200025757, de 21/02/2020, pág. 58/142
51/64 <140>
<141>
<150> CA 2.432.738 <151 >20.06.2003 <150> CA 2.420.092 <151 >26.02.2003 <160> 16 <170> Patentin Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Virus do Nilo Ocidental <400> 1 atgagagttg tgtttgtcgt gctattgcfct ttggtggecd eagdttacag cttdàactgc60 cttggaatga gcaacagaga cttcttggaa ggagtgtatg gagcaacatg ggtggatttg120 gttctcgaag gcgacagctg cgtgactatc atgtctaagg acaagcctac catcgatgtg15 0 aagatgatga atatggaggc ggtcaacctg gcagaggtcc gcagttattg ctatntggct240 accgtcagcg atctctccac aaaagctgcg tgoccgacaa tgggagaagc tcacaatgau300 aaacgtgctg acccagcttt tgtgtgcaga caaggagtgg tggacagggg ctggggcaac360 ggctgcggat tatttggcaa aggaagcatt gacacatgcg ccaaatttgc ctgctctacc420 aaggtaatag gaagaaccat cttgaaagag aatatcaagt acgaagtggc catttttgtc46 0
Citggaceaa etactgtgga gttrgcacgga aactadtCca cacaggttgg agCCaçtcíg540 gcagggagat tcagtahCac tcctgcggcg CCttcataca cactaaagCt tggagaatat600 ggagaggtga eagtggactg tgaactacgg tcagggattg acaccaatgc atactacgtg660 atgactgttg gaaeaaagae gttcttggtc catdgtgagt ggttdatgga cctcaacetc720 ccttggagca gtgctggaag tactgtgtgg aggaacagag agaagttaat ggagtttgag760 gaaccacacg caacgaagaa gbctgtgata gcattgggct cacaagaggg agctctgcat940 caagctttgg ctggagccat tcctgtggaa ttttcaagca acactgtcaa gttgacgtcg300 ggtcatttga agtgtagagt gaagatggaa aaattgcagt tgaagggaàC aaddtatggc960 gtctgttcaa aggctttcaa gtttcfctggg actcccgcag acacaggtea cggcactgtg102o gtgttggaat tgcagtacac tggcacggat ggaccttgca aagttcctat ctcgtcagtg10B0 gcttcattga acgacctaac gccagtgggc agattggtca ctgtcaaccc ttttgtttca1140 gtggccacgg ccaacgctaa ggtcctgatt gaattggaac csccctttgg agactcatacιξοο atagtggtgg gcagaggaga adaacagatc aatcàdeath gefcajdaagtc tggaagcaga1260 attggcaaag cctttacaac cadcdtcaaa ggagdgcaga gadtigc-cge tctaggagac1320 acagdttggg actttggatc agttggaggg gtgttcacct eagttgggaa ggctgtctaa1350 <210>2 <211 >2076 c212> DNA <213> Virus do Nilo Ocidental <400> 2
Petição 870200025757, de 21/02/2020, pág. 59/142
52/64 atgcaaaaga aaagaggagg aaagacdgga atugeagtda tgaútggcct gatcgccagcGO gtanaacrcacr ttaccctctc taaettecaa agoaaaatcia taatrsaccrcrt aaatcrctact1Ξ0 gacgtdâdag atgtcatcAC gattccaaca gctgctggaa agaacctatg cattgtcagaISO gcaatggatg tgggatacat gtgegatgat actatcaett atgaabgccc agtgctgtcg240 gctggtaatg Btccagaaga categaetgt tggtgcacaa agteageegt etaegteagg300 tfltggaagat gcaccaagaú AÈgccactça agicgdagtc ggaggLcact gacagtgeag360 acacaeggag aaagcacEct agegaacaag aagggggctt ggatggacag caecaaggee420 acaaggtatt tggtaaaaac agaatcatgg atettgagga accetggata tgcactggtg480 gcagccgtca ttggtfcggat gcttgggagc aacaccatgc agagagttgt gtctgtcgtg540 etattgettt tggtggcvcc agcttacagc ttcaactgca ttggaatgag caacagagaerGOO ttattggaag gagtgtctgg agcaacatgg gtggatttgg ttetegaagg cgacagctgc650 gtgactatca tgtetaagga caagcctadc atcgatgtga agatgatgaa tatggaggcg720 gtcaacctgg cajaggteeg cagútattgc tatttggcta ccgtCàgcga tctctccacc7BQ aaagetgegt gaccgaccat gggagaaget cacaatgaca aacgtgctga cccagctttt840 gtgtgcagac aaggagtggt ggacaggggc tggggcaacg getgeggatt atttggcaaa900 ggaagcattg acacatgdge ciaatttgcc tgctctacca aggcaa.ta.gg aagaaceatc860 ttgaaagaga atatcaagta egaagtggee atttttgtcc atggaccaaü tactgtggag1020 tcgcacggaa actactccac aaaggttgga gccactcagg cagggagatt cagcatcact1080 cctgcggcgcr cttcatacad aetaaagett ggagaatatg gagaggtgac agtggactgfc1140 gaaccaeggt cagggattga. cancaatgea fcactaegfcga tgactgttgg aacaaagacg1200 ttcttggtcc ategtgagtg gttcatggad ctcàacctcc cttggagcsg tgctggaagt1250 actgtgtgga ggaacagaga gacgttaatg gagtttgagg aaccacacgc cacgaagcag1320 tctgligatag cattgggctc acaagaggga getetgaate aagctttggç tggagccatt1380 cctgtggaat tttcaagcaa cactgtcaag tbgaegtegg gtcatttgaa gtgtagagtg1440 aagatggaaa aattgcagtt gaagggaaca acctatggcg tctgttcaaa ggetttcaag150Q tttcttggga ctdecgdaga cacaggtcac ggcactgtgg tgttggaatt gcagtacact1560 ggcacggatg gaccttgcaa agttacrtatc tegteagtgg cttcattgaa cgacctaacg1G20 ccagtgggca gattggtcac tgtcaaccct tttgtttcag tggecaaggc eaaegetaag1580 gtcctgattg aattggaacc accctttgga gactcataca tagtggtggg eagaggagaa1740 caaeragabca atcaceattg gcacaagt-ct ggaagcagea ttggcaaagc ctttacaatü1B0O accctcaaag gagegcagag actagccgct ctaggagaca cagettjjgga ctttggateai860 gttggagggg tgtteacetc agttgggaag gctgtccatc aagtgttcgg aggagcattc1920 cgctcactgt tcggaggcat gtcctggata acgcaaggat Cgctgggggc tctactgfctg1980 tggatgggca teaatgeteg tgataggtcc atagetetea cgtttctcgc agttggagga2D40 gttctgctcli tcctctccgt gaaegtgeac gettaa2 075 <210>3 <211> 1110 <212> DNA <213> Virus do Nilo Ocidental <400> 3 atgaggtcca tagetataaa gtttcriicgca gttggaggag ttctgctctt cctctccgtgGO aacgtgeacg ctgacactgg gtgbgccata gacatcagcc ggcaagaget gagatgtgga120 agtggagtgt tcatacacaa tgatgtggag gettggatgg accggtacaa gtattaccct1B0 gaaacgccac aaggcctagc caagatcatt cagaaagclic ataaggaagg agtgtgcggtΞ40 ctacgatcag tttccagact ggagcatcaa atgLgggaag cagtgaagga cgagctgaac300 aetçttttga aggagaatgg tgtggacctt agtgtcgtgg ttgagaaaca ggagggaatg360 tacaagtcag cacctaaacg cctcaccgcc accacggaaa aattggaaat tggctggaag4Ξ0 gcctggggaa agagtatttt atttgcacca gaactcgcca acaacacctt tgtggttgat400 ggteeggaga ccaaggaatg tccgactcag aategegett ggaatagett agaagtggag540 gattttggat ttggtctcac cagcacbcgg atgttcctga aggteagaga gagcaacaca600 actgaatgtg aetegaagat cattggaacg gatgteaaga acaacttggc gatacacagt660 gacctgtcct attggattga aagcaggctc aatgataegt ggaagcttga aagggcagtt720 □tgggtgaag tcaaataatg tacgtggcct gagaegcata cettgtgggg egatggaata7H0 ettgagagtg aettgataat accagtcaca otggegggac cacgaagcaa tcacaatcgg840 agacctgggt aeaagaeaca aaaccagggc ccatgggacg aaggccgggt agagattgac800 ttegattaert gcccaggaac Cacggtcacc etgagtgaga gatgcggaca ccgtggacct960 gccactcgca ccaccacaga gageggaaag ttgataacag attggtgctg caggagctgc1020 accttaccac cactgcgcta ccaaactgac agcggctgtt ggtatggtat ggagatcaga10HO ecacagagac atgatgaaaa gacctaatga1110
Petição 870200025757, de 21/02/2020, pág. 60/142
53/64 <210>4 <211 >2040 <212> DNA <213> Virus do Dengue de tipo 1 <400> 4 atgaacagga ggaaaagatc cgtgaccatg ctcetcatgc tgctgcccac agteetggct60
Etccatttga ccacacgagg gggagagatra cacibgatag ttagtaagca ggaaagagga124} aagtcaotcb tgttdaagac ctctgcaggt gtcaatatgt gcactctcat tgcgatggat180 ttgggagagt tatgtgagga cacaatgatrt tacaaatgce cccggatcac tgaggeggaa.340 ccagatgacg ttgactgctg gtgcaatgpc acagacacat gggtgaccta tgggacgtgt300 tctcaaaccg gtgaacaccg acgagacaaa cgttCCgtgg cactggccce acaegtggga360 cttggtctag aaaoaagaac cgaaacatgg atgtcctqtg aaggcgcctg gaaacaaata420 caaaaagtgg agscttgggc ttlgagaaac ccaggattca egglgatagc tcitttttta480 gcacatgMa taggaacatc catcactcag aaagggakca ttttdattct gctgatgctg540 gtaaeaccat caatggccat gcgatgcgtg ggaataggca acagagaett cgttgaagga¢00 atgtcaggag caacgtgggt ggacgtggta ttggagcatg gaagdtgcgt caccaccatg6Ê0 gcaaaaaata aaccaacatt ggacattgaa ctcttgaaga cggaggtcac gaaccctgcc720 gtcttgcgca aattgtgcat tgaagctaaa atstcaaaca ccaCCaccga ttcaagatgt780 ccaacacõag gagaggctac acLggtggaa gaacaagacg cgaactttgt gtgtcgacgaÍ40 acggttgtgg acagaggctg gggcaatggt tgcggaetat ttggaaaagg aagcctactg300 acgtgtgcta agttcaagtg tgtgacaaaa ctggaaggaa agatagttca atatgaaaac360 ttaaaatatt cagtgatagt cactgtacac aqaggggacr agcaccaggt gggaaacgag1020 actacagaac atggaacaat tgcaaccata acaccbcaag CtCdtacgtc ggaaatapag10BO ttgacagact acggaaccct tacactggac tgctcaccca gaacagggct ggactttaat1140 gaggtggtgc taktgacaat gaaagaiaaa tqatggcttg tccacaaaca atggtttcta1200 gacttaccac tgccttggac ttcgggggct teaaeateçç aagagacttg gaacagacaa1260 gatttgctgg tcacattcaa gacagctcat gcaaagaagc aggaagtagt cgtactggga1320 tcacaggaag gagcaatgca cactgcgttg accggggcga cagaaatcca gaagtcagga13BO acgacaaaaa tctttgcagg sqacctgaaa tgcagattaa aaatggataa actgacttta1440 aaagggatgt cakatgtcjat gtgcacaggc tcatttaagc tagagaagga agtggctgag1500 acccagcatg gaactgtcct agtgcaggtt aaatacgasg gaacagatgc gccatgcaag1560 atcccctttt cgacccaaga tgatjaaagga. gtqacccaga atgggagatt gataacagcc1620 aatcccatag ttactgacaa agaaaaacca akcaacattg agacagaacc accttttggtis80 gagagctaca tcatagtagtf ggcaggtgaa a^gctttga aactàagCtg gttcaagaaa1740 ggaagcagca tagggaaaat gttcgaagca atcgecügag gagcacgaag gatggctatc1880 ctgggagada ccgcatggga cttcggctct ataggaggag tgtttacgtc tgtgggaaaa1960 ttggtacacc aggtttttgg aaccgcatac ggggtcatgt tcagcggcgt ttcttggacc1920 atgaaaatag gaatsgggat qttgctgaea tggttgggat taaattcaag gagcgcgtcg1980 ctttcgatga cgt^cattgc agttggqatg gttacactgt acctaggagt catggtttaa2040 <210>5 <211 >459 <212> PRT <213> Virus do Nilo Ocidental <400> 5
Petição 870200025757, de 21/02/2020, pág. 61/142
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Met Arç Vai vai Phe Vàl val Leu L-eu Leu Lett Vai Ala Pro Ala
1015
Tyr Ser Phe Άβπ Cye Leu Gly Met Ser Aeh Arg Αερ Phe Leu Glu
2530
Gly Vai Ser Gly Ala Tin Τϊρ Vai Asp Leu Vai Leu olu Gly Asp
4045
Ser Cys Vai Thr lie Met Ser Lys Asp Lye Pro Thr He Asp Vai
5550
Lye Met Met flm Met Gin Ala Vai Αβπ Leu Ala Glu Vai Arg Ser
7075
Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr Vai Ser Asp Lèu ger Thr Lye Ala Ala 80 n 8590
Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala Hig ftan Asp Lya Arg Ala Aap Pro
Ala Phe val Cys Arg Gin 110 Gly Val Val Aap 115 Arg Gly Trp Gly Αβπ 120
Gly Cyfl Gly Leu Phe Gly Lye Gly Ser He Asp Thr Cys Ala Lya
125 130 135
Phe Ala cys ser Thr Lys Ala He Gly Arg Thr He Leu LyS Glu
140 145 ISO
Αβπ lie Lye Tyr Glu Val Ala Ho Phe Val His Gly Pio Thr Thr
155 ISO 165
Vai Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gin Val Gly Ala Thr Gin
170 175 180
Ala Gly Arg Phe Ser He Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr Leu
ias 190 195
Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cye Glu Pro Arg
200 205 210
Ger Gly He Asp Thr Aen Ala Tyr Tyr Val Net Thr Val Gly Thr
215 220 225
Lys Thr Phe LblI val Hie Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Ann Leu
230 235 240
Pro Trp Ser Ser Ala Gly Eer Thr Val Trp Arg Asn Arg G1U Thr
245 250 255
Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro Hl a Ala Thr Lye Glh Ser Val lie
2ÊÕ 265 270
Ala Leu Gly Eer Gin Glu Gly Ala Leu His Gin Ala LeU Ala Gly
275 250 285
Ala Ils Pro Vai Glu Phi 3ai* Str Aflfi Thr val Lye Leu Thr Ser
290 295 300
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55/64
Gly His Leu Lye Cys Arg Vai Lya Met Siu Lys Leu Gin Leu l»ys
305 310315
Gly Thr Thr Tyr Gly Vai Cys Ser ty? Ala Phe Lys Pile leu Gly
320 325330
Thr Pro Ma Asp Thr Gly Hie Gly Thr Vai Vai Leu Glu Leu Qin
335 340345
Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lya Vai Pro lie Ser Ser Vai
350 355360
Ala Sit Leu Asn Asp Leu Thr Pro Vai Gly Arg Leu Vai Thr Vai
365 370375
Asn Pro Phe Vai Ser Vai Ma Thr Ala Aeu Ala Lye Vai Leu He
330 3B5390
Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr He Vai Vai Gly Arg
335 4Q0405
Gly Glu Gin Gin lie Asn His Hie Tip His Lys Ser Gly Ser Ser
410 4154Ξ0
He Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gin Arg Leu
425 430435
Ala Ala Leu Gly Aep Thr Ala Τηι Asp Phfl Gly Ser Vai Gly Gly
440 445450
Vai Phe Thr Ser Vai Gly Lys Ala Vai
455 <210>6 <211 >691 <212> PRT <213> Virus do Nilo Ocidental <400> 6
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Met Gin Lye Lys Arg Gly Gly Lya Thr Gly He Ala Vai Met He
515
Gly LSQ He Ma Ser Vai Gly Ala Vai Thr Leu Ser Aan Phe 61n
2530
Gly Lys Vai Met Met Thr Vai Mn Ala Thr Asp Vai Thr Asp Vai
4045
He Thr lie Pro Thr Ala Ala Gly Lye Aen Leu Cye He Vai Arg
55GO
Ala Met Aep Vai Gly Tyr Met Cya Asp Aep Thr IL· flit Tyr Glu
7075
Cys Pro Val Leu Ser Ala Gly Ab π Asp Pro Glu Asp He Asp Cy?
fiQ. 8530
Tip Cys Thr Lys Ser Ala val Tyr val Arg Tyr Gly Arg Cya Thr
100105
Lys Thi Arg Hi? Her Arg Arg Ser Arg Arg Set Ltu Thr Val Gin
110 115120
Thr Hi? Gly Glu Ber Thr Leu Ala Aen Lys Ly? Gly Ala Tip Met
125 130135
Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp
140 145150
Tie Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ale Leu Val Ala Ala Val Hi Gly
155 1ÊÜ165
Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gin Arg Val Val Phe Val Val
170 L75130
Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly
185 ISO155
Met Set Asn Arg Asp Fhe Leu Glu Gly Val Ser Gly Ala Thr Tip
300 205' 210
Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Aep Ser Cye Val Thr He Met Ser
215 320225
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Vai Asn Lâu Ala Qlu Vai Arg Ser Tyr Cya Tyr Leu Ala Thr Val 355
245 350
Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cye Pro Thr Met Gly Glu Ala
2S0 255 270
Hie Asn Asp Lye Arg Ala A6p Pro Ala Phe Val Cys Arg Gin Gly
275 280 285
Vai Vai Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly cys Gly Leu Phe Gly Lys
290 295 300
(31y ser Ile Asp Thr cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala
305 310 315
Ile Gly Arg Thr he Leu Lys Glu Asn lie Lys Tyr G1U Val Ala
3Ξ0 325 330
11® Phe Vai Eia Gly Pro Thr Thr val Glu Ser His sly Asn Tyr
335 340 345
Ser Thr Gin Vai Gly Ala Thr Gin Ala Gly Arg Phe Ser lie Thr
350 355 360
Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glil Tyr Gly □In
3 65 370 375
Vai Thr Vai Asp Cys Glu Pre Arg Ser Gly He Asp Thr Asn Ala
380 385 390
Tyr Tyr Vai Met Thr Vai Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg
395 400 405
Glu Trp Phe Met Aap Leu Aen Leu Pro Trp Ser ser Ala Gly Ear
410 415 420
Thr Vai Trp Arg Aen Arg Glu Thr LeU Met Glu Phe G1U Glu pro
425 430 435
HÍS Ala Thr Lya □Ln Ser Val Ile Ala Leu Gly Ser Gin Glu Gly
440 445 450
Ala Leu híb Gin Ala Litt Ala Gly Ala lie Pro val Glu the Ser
455 460 465
Ser Asn Thr Vai Lye Leu Thr Ser Gly His Leu Lys cys Arg Val
470 475 480
Lys Met 01u Lya Leu Gin Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly val cya
485 490 495
3®r Lye Ala Phe Lya Phe Leu. Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His
500 505 510
Gly Thr vai Vai Leu Glu Leu Gin Tyr Thr 01y Thr Asp Gly Pro
515 520 525
Cys Lys Vai Pro He Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr
530 535 540
Pro Vai Gly Arg Leu Vai Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala
545 550 555
Thr Ala Asn Ala Lys val Leu lie Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly
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570
560 £¢5
Αθρ Ser Tyr lie Vai 575 Vai Sly Arg Gly Glu Gin Gin saí lie Asn His sas
His Trp His Lys Ser □Ly str Ser lie Gly Lys Ala Phe Thr Thr
sso 535 600
Thr Leu Lye Gly Ala Gin Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala
605 610 615
Trp Asp Phe Gly Ser Vai Gly Gly Vai Phe Thr Ser Val Gly Lytí
6Ξ0 625 63D
Ala Vai Hie Gin Vai Phe Gly Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly
635 640 645
Gly Met Ser Trp He Thr Gin Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu
650 655 660
Ιΐρ Met Gly lie A£ii Ala Arg Afip Arg Ser lie Ala Leu Thr Phe
665 67U 67 Ξ
LSU Ala Vai Gly Gly Vai Leu Leu Phe Leu Ser Vai Aan Vai Hie
660 685 650
Ala <210>7 <211 >368 <212> PRT <213> Virus do Nilo Ocidental
<400> 7 Thr Phe Leu Ala Val ID Gly Gly val Leu IS
Met Arg ser He Ala Leu 5
Leu Phe Leu Ser Val 20 ΑεΠ val Hie Ala Asp 25 Thr □ly Cys Ala He 30
Asp He Ser Arg □In 35 Glu Leu Arg Cye Gly 40 Ser Gly Val Phe He 45
Είθ Ash Asp val Glu 50 Ala Trp Met Asp Arg 55 Tyr Lya Tyr Tyr Pro 60
Glu Thr Pro Gin Gly 65 Leu Ala Lye lie lie 70 Gin Lys Ala HÍE Lys 75
Glu Gly Vai Cys Gly 80 Leu Arg Ser Val Ser 05 Arg Leu Glu Hie Gin 90
Met Trp Glu Ala Val 35 Lys Asp Glu Leu Asn 100 Thr LEU Leu Lys Glu 105
AGil Gly val Asp Leu 110 Ser Val Val Val G1U 115 Lya Gin Glu Gly Met 120
Tyr Lys Ser Ala Pro 135 Lys Arg Leu Thr Ala 130 Thr Thr Glu Lye Leu 135
Glu He Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lye ser He LBV Phe Ala Pro
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140 145 . 150
Glu Leu Ala Aén Asn 155 Thr Phe Val Val Asp 160 Gly Pro Glu Thr Lye 165
Glu Cys Pro Ί/hr Gin 170 Asn Arg Ala Trp Asn 175 Ser Leu Glu val Glu 180
Asp Phe Gly Phe Gly IflS Leu Thr Ser Thr Arg iso Met Phe Leu Lys Val 15 5
Arg Glu Ser Asu Thr 300 Thr Gin Cys Asp Ger 205 Lys He lie Gly Thr 210
Ala val Lys Asn Asn 315 Leu Ala He HiS ser 220 Asp Leu Ser Tyr Trp 225
I1& Glu Ssr Arg Leu 330 Asn Asp Thr Trp Lys 235 Leu Glu Arg Ala Val 240
Leu Gly Glu Val Lya 245 Sei- Cys Thr Tip Pro 350 Glu Thr His Thr Leu 355
Trp Gly Asp Gly lie 360 Leu Glu Ser Asp Leu 265 Tie lie Pro Val Thr 270
Leu Ala Gly Pro Arg 275 Ser Aân Hi a Asn Arg 2B0 Arg Pro Oly T^r Lys 295
Thr Gin Asn Gin Gly 290 Pro Trp Aep Glu Gly 295 Arg Val Glu Tie Asp 300
Phe Asp Tyr Cye Pro 305 Gly Thr Thr val Thr 3 LG Leu. Her Glu Ser Cys 315
Gly His Arg Gly Pro 320 Ala Thr Arg rhr Thr 325 Thr G1U Ser Gly Lye 330
Leu He Thr Aap Trp 335 Cys Cys Arg Ser Cys 340 Thr Leu Pro Pro LEU 345
Arg Tyr Gin Thr Asp 350 Ser Gly Cys Trp Tyr Gly 355 Het Glu lie Arg 360
<210>8 <211 >679 <212> PRT <213> Virus do Dengue de tipo 1 <400> 8
Hit A$a Arg Arg Lya Arg Ser Vai Thr Wet Leu Leu Met Leu Leu
IQ15
Pro Thr Vai Leu Ala Phe Hi a Leu Thr Tht Arg Gly fily Glu Pro
2530
Hifl Met lie Vai Ser Lys Gin Gin Arg Gly Lye Ser Leu Leu Phe
4045
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60/64
Lys Thr Ser Ala Gly Val Abu Wet Cys Thr Leu He Ala Mat Asp 60
50 55
Leu Sly Glu Leu cyo Glu Aep Thr Het Thr Tyr Lye Cye Pro Arg
65 70 75
lie Thr Glu Ala Glu Pro Asp Agp Val Aep Cys Ttp Cys Abb Ala
80 85 so
Thr Asp Thr Trp val Thr Tyr Gly Thr Cys Ser Gin Thr Gly Glu
95 100 105
His Arg Arg Asp Lys Arg Éer val Ala Lau Ala Pro Hie Val Gly
110 115 120
Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met 3er Ser Glu Gly
125 130 13S
Ala Trp Lys Gin He Glu Lye Val Glu Thr Trp Ala Leu Arg RiS
140 145 150
Pro Gly Phe Thr Val He Ala Leu Phe Leu Ala Hig Ala He Gly
155 160 165
Thr Str He Thr Gin Lye Gly He lie Phe lie Leu Leu Met Leu
170 175 180
Vai Thr Pro Ser Met Ala wet Arg Cye Val Gly He Gly Aen Arg
185 190 195
Asp phe Vai Glu Gly Leu sau Gly Ala Thr Trp val Aep Val Val
200 205 210
Leu 31U Rib GlySer cys Val Thr Thr Het Ala Lya ASu Lye Pro
215 220 225
Thr Leu Asp He Glu Leu Leu Lya Thr Glu Val Thr Ann Pre Ala
230 235 240
Val Leu Arg Lye Leu cys lie Glu Ala Lye He Set* Asn Thr Thr
345 250 255
Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gin Gly Glu Ala Thr Leu val Glu
260 265 270
Glu Gin Asp Ala Asn Phe Val eye Arg Arg Thr Val val A ep Arg
37S 280 285
Gly Tip Gly Asn Gly eye Gly Leu Phe Gly Lye Gly Ser Leu Leu
230 Ξ95 300
Ώ1Γ cys Ala Lys Phe Lys eye val Thr Lys Leu Glu Gly Lys He
305 310 315
Vai Gin Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser val He Val Thr Val Hig
320 325 330
Thr Gly Asp □ In Hia Gin Val Gly Asn Glu rhr Thr Glu HÍB Gly
335 340 345
Thr He Ala Thr lie Thr Pro Gin Ala Pro Thr Ser Glu lie Glh
350 355 360
Lau Thr Asp Tyr Gly Thr Leu Thr Leu Asp Cys 5 er Pro Arg Thr
365 370 375
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61/64
Gly Leu Asp Phe Asn 3 EID Glu Vai Val Leu Leu 3B5 Thr wet Lye Glu Lys 330
Sei Tip Lea Vai His Lyg Gin Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pre
395 4Ü0 405
Trp Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gin G1U Thr Trp Aan Arg Gin
410 415 420
Asp Leu Leu Vai Thr Phe Lye Thr Ala His Ala Lys Lye Gin Glu
425 430 435
Vai Vai Vai Leu Gly 3er Gin Glu Gly Ala Met Hie Thr Ala Leu
440 445 450
Thr Gly Ala Thr □lu Tie Gin Thr Ser Gly Thr Thr Thr lie Phe
455 460 465
Ala Gly His Leu Lye Cys Arg Leu Lye Met Asp Lys Leu Thr Leu
470 475 4B0
Lye Gly Met Ser Tyr Vai Wet Qye Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu
435 490 495
Lye Glu Vai Ala Glu Thr Glu His Gly Thr val Leu Val Gin Val
500 505 510
Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lye He Pre Phe Ser Thr
515 520 525
Gin Asp Glu Lye Gly Vai Thr Gin Asn Gly Arg Leu He Thr Ala
530 535 540
Asn Pro lie Vai Thr Asp Lys Glu Lye Pre He Aan He Glu. Thr
545 550 555
Glu Pre Pro Phe Gly Glu Ser Tyr He He val Gly Ale Gly □111·
560 565 570
Lye Ala Leu Lys Leu ser Trp Phe Lya Lys Gly Ser Ser He Gly
Ξ75 530 505
Lya Met Pile □lu Ala He Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala He
590 535 600
Leu Gly Asp Thr Ala Trp Aap Phe Gly Ser lie Gly Gly Val Phe
605 SID 615
Thr Ger Vai Gly Lya Leu Vai Hie Gin val Phe Gly Thr Ala Tyr
620 62.5 630
Gly Val Leu. Phe Ger Gly Vai Ser TSp Thr wet Lya He Gly Tie
635 640 645
Sly Tie Leu Leu Thr T*P Leu Gly Leu Asn Ger Arg Ser Ala Ser
650 655 650
Leu. Ser Met Thr Çys Tie Ala Vai Gly Wet Val Thr Leu Tyr Leu
665 670 675
Gly Vai Met Vai <210>9 <211 >33 <212> DNA
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62/64 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da seqüência artificial: DNA sintético <400> 9 tatcgtacga tgagagttgt gtttgtcgtg cta 33 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 10 atagcgcgct tagacagcct tcccaactga 30 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 11 tatcgtacga tgcaaaagaa aagaggagga aag 33 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 12
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63/64 atagcgcgct taagcgtgca cgttcacgga g 31 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 13 tatcgtacga tgaggtccat agctctcacg 30 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 14 atagcgcgct cattaggtct tttcatcatg tctc 34 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 15 tatcgtacga tgaacaggag gaaaagatcc gtg 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA
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64/64 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: DNA sintético <400> 16

Claims (9)

  1. Reivindicações
    1. VÍRUS DO SARAMPO RECOMBINANTE, que é um vírus de sarampo vivo ou atenuado, caracterizado por compreender um polinucleotídeo selecionado a partir da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, dito vírus recombinante sendo capaz de expressar dito polipeptídeo e dito polipeptídeo sendo capaz de induzir uma resposta imune protetiva contra vírus do Nilo Ocidental em um animal ou respectivamente contra vírus da Dengue em um animal.
  2. 2. VÍRUS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, em seu genoma, dito polinucleotídeo.
  3. 3. VÍRUS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado_por ser derivado da cepa Schwarz do vírus do sarampo.
  4. 4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender:
    a) pelo menos um vírus do sarampo recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e
    b) um veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável.
  5. 5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser capaz de induzir uma imunidade protetora contra um vírus do Nilo Ocidental ou um vírus da Dengue em um animal.
  6. 6. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 5, caracterizado por ser para a preparação de uma vacina antivírus do vírus do Nilo Ocidental ou uma vacina antivírus do vírus da Dengue.
  7. 7. CÉLULA BACTERIANA, caracterizada por ser a linhagem de células depositada na C.N.C.M., sob número de acesso I-3018 compreendendo um vírus recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações
    Petição 870200025757, de 21/02/2020, pág. 73/142
    2/2
    1 a 3.
  8. 8. MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRUS RECOMBINANTE, para a produção de uma vacina antivírus do Nilo Ocidental, caracterizado pelo método compreender as etapas de:
    a) proporcionar uma célula bacteriana, conforme definida na reivindicação 7;
    b) colocar a célula bacteriana da etapa a) em condições que permitem a replicação de um vírus recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o qual é capaz de expressar referido polipeptídeo; e
    c) isolar o vírus recombinante produzido na etapa b).
  9. 9. USO, de pelo menos um vírus do sarampo recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para preparação de um medicamento para tratar e/ou prevenir uma infecção do vírus do Nilo Ocidental ou respectivamente uma infecção do vírus da Dengue, em um animal.
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