BR112016029201B1

BR112016029201B1 - Quimera de ácido nucleico, composição imunogênica, uso e método para inativar um vírus

Info

Publication number: BR112016029201B1
Application number: BR112016029201-4A
Authority: BR
Inventors: Claire Y. H. Kinney
Original assignee: The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2023-11-14
Also published as: BR112016029201B8; WO2015196094A1; EP3158061A1; AU2015276929A1; CN106574271A; US10428313B2; AU2015276929B2; EP3158061B1; US20170114330A1; CN106574271B; BR112016029201A2

Abstract

VÍRUS DO OESTE DO NILO/DENGUE QUIMÉRICOS E MÉTODOS DE USO. Estão descritos aqui flavivírus quiméricos que incluem regiões não codificadoras, proteínas não estruturais e pelo menos uma porção de uma proteína C do vírus Nilo (WNV) e uma proteína prM e uma proteína E do vírus da Dengue (DENV). O DENV pode ser do sorotipo DEN1, sorotipo DEN2, sorotipo DEN3 ou sorotipo DEN4. Também estão descritas aqui composições e métodos para desencadear uma resposta imune em um indivíduo tal como uma resposta imune a um ou mais sorotipos de DENV. Em modalidades particulares, as composições incluem um ou mais vírus inativados que incluem um ácido nucleico quimérico de WN/DENV (tal como uma vacina inativada tetravalente que inclui uma quimera de WN/DEN1, uma quimera de WN/DEN2, uma quimera de WN/DEN3 e uma quimera de WN/DEN4). As composições podem ser administradas a um indivíduo para desencadear uma resposta imune.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Esse reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No.62/015.265, depositado em 20 de junho de 2014, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] A descrição refere-se a flavivírus quiméricos, particularmente a construtos quiméricos do vírus do Oeste do Nilo/vírus da Dengue. Além disso, ela se refere aos métodos de uso dessas quimeras em métodos para desencadear uma resposta imune em um indivíduo.

ANTECEDENTES

[003] O vírus da Dengue (DENV) é a causa arboviral mais importante de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Existem atualmente 2,5 bilhões de pessoas vivendo em regiões endêmicas de dengue com, grosseiramente, 100 milhões de casos anuais de febre dengue e centenas de milhares de casos de febre hemorrágica por dengue e síndrome de choque por dengue (Gubler, Clin. Microbiol. Rev. 11:480-496, 1998). Atualmente, não existem vacinas comercialmente disponíveis contra qualquer um dos quatro sorotipos de DENV (DENV 1-4), embora várias vacinas estejam atualmente em desenvolvimento ou testes clínicos. A produção da vacina para DENV é dificultada pelo fato de que os anticorpos que neutralizam um sorotipo, não neutralizam efetivamente os sorotipos remanescentes de DENV (Halstead and O’Rourke, J. Exp. Med. 146:201-217, 1977). De fato, baixos níveis desses anticorpos podem realmente aumentar o risco de doença mais severa durante a infecção secundária, devido a um fenômeno conhecido como intensificação mediada pelo anticorpo, que ocorre quando os anticorpos contra um sorotipo de DENV se ligam de uma maneira não neutralizante às partículas de DENV de outro sorotipo. Essa ligação permite a infecção aumentada de células que abrigam o receptor Fc, tais como os macrófagos, que podem alterar o perfil infeccioso do vírus ou causar uma liberação que quimiocina que levam a febre hemorrágica por dengue e síndrome de choque por dengue (Halstead and O’Rourke, J. Exp. Med. 146:201-217, 1977).

SUMÁRIO

[004] Estão descritos aqui flavivírus quiméricos que incluem regiões não codificantes, proteínas não estruturais e pelo menos uma porção de uma proteína C de WNV e uma proteína prM e uma proteína E de DENV. O DENV pode ser o sorotipo DEN1, sorotipo DEN2, sorotipo DEN3 ou sorotipo DEN4. Em alguns exemplos, as proteínas prM e E são de DENVs diferentes (por exemplo, de sorotipos diferentes de DENV).

[005] Em algumas modalidades, a quimera inclui uma primeira molécula de ácido nucleico que inclui uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3’ não codificante de um vírus do Oeste do Nilo e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica pelo menos uma porção de uma proteína prM e proteína E de um DENV.

[006] Em modalidades adicionais, a quimera inclui uma primeira molécula de ácido nucleico que inclui uma região 5 ' não codificante, um ácido nucleico que codifica uma porção de uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3' não codificante de um vírus do Oeste do Nilo e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica pelo menos uma porção de uma proteína C, uma proteína prM e uma proteína E de um DENV.Em alguns exemplos, a porção da proteína C de WNV que codifica a sequência sinal de prM é substituída pela sequência sinal do DENV. Em outros exemplos, a sequência sinal de prM inclui uma porção 5’ da sequência sinal de WNV e uma porção 3’ da sequência sinal de DENV.

[007] Em alguns exemplos, o flavivírus quimérico inclui pelo menos um ácido nucleico ou uma substituição de aminoácido que melhore as características da quimera (tal como a replicação aumentada em cultura celular, capacidade infecciosa ou transmissibilidade em mosquitos diminuída ou reatividade cruzada do anticorpo diminuída). Em exemplos particulares, a substituição de aminoácido é no WNV ou na proteína C de DENV, proteína prM de DENV, proteína E de DENV ou proteína NS de WNV.

[008] Também estão descritas aqui composições e métodos para desencadear uma resposta imune em um indivíduo, tal como uma resposta imune a um ou mais dos sorotipos de DENV. Em modalidades particulares, as composições incluem um ou mais vírus inativados que incluem um ácido nucleico quimérico de WN/DENV (tal como uma vacina tetravalente inativada que inclui uma quimera de WN/DENV, uma quimera de WN/DEN1, uma quimera de WN/DEN2, uma quimera de WN/DEN3 e uma quimera de WN/DEN4). As composições são administradas a um indivíduo para desencadear uma resposta imune, tal como uma resposta imune protetora. Os métodos de inativação das quimeras de WN/DEN também estão descritos aqui.

[009] O precedente e outras características da descrição ficarão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, que continua com referência às figuras em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] As figuras 1A-1D são uma série de desenhos esquemáticos que mostram a organização genômica dos vírus de tipo selvagem ou quiméricos aqui descritos. A estrutura do genoma não é mostrada em escala. A figura 1A mostra um WNV de tipo selvagem, que inclui uma região 5’ não codificante (NCR), uma proteína do capsídeo (C) que inclui uma sequência sinal (C(ss)) para a proteína M, uma proteína pré- membrana (prM), uma proteína do envelope (E), proteínas 1 -5 não estruturais e um 3’NCR. A figura 1B mostra um WN/DENV quimérico com uma junção Tipo I, que inclui 5’ NCR, proteína C, proteínas NS 1-5 e 3’ NCR e WNV (caixas abertas) e C(ss), proteína prM e proteína E de um DENV (caixas sombreadas). A figura 1C mostra um WN/DENV com uma junção do tipo II, que inclui a 5’ NCR, proteína C, proteínas NS 1-5 e 3’ NCR de WNV (caixas abertas) e a proteína prM e a proteína E de um DENV (caixas sombreadas). Esse vírus inclui uma porção 5’ de C(ss) de WNV e uma porção 3’ de C(ss) de um DENV. A figura 1D mostra um WN/DENV quimérico com uma junção Tipo III, incluindo 5’ NCR, proteína C e C(ss), proteínas NS 1-5 e 3’ NCR de WNV (caixas abertas) e proteína prM e proteína E de um DENV (caixas sombreadas).

[0011] As figuras 2A e 2B são gráficos que mostram o crescimento das quimeras de WN/DENV e os vírus DEN correspondentes em células Vero no dia 2 pós-infecção (p.i.) (figura 2A) ou em células C6/36 nos dias 4 (barras da esquerda) e 6 (barras da direita) p.i. (figura 2B).

[0012] As figuras 3A-3D são uma série de gráficos que mostram as curvas de sobrevida de camundongos AG129 vacinados com uma candidata à vacina tetravalente para DENV e inoculados com a quimera WN/DENV-1 (figura 3A), WN/DENV-2 E203 (figura 3B), WN/DENV-3 CE345 (figura 3C) ou WN/DENV-14 C107 (figura 3D).

[0013] A figura 4 mostra a cronologia das placas visíveis produzidas pelo WNV, quimeras de WN/DENV e DENV1-4 (esquerda) e uma imagem digital das placas em placas de 6 poços no dia 3 p.i. em células Vero (direita).

[0014] As figuras 5A e 5B são uma série de imagens que mostram microfocos imunocorados de DENV1-4 48 h p.i. (figura 5A) e quimeras de WN/DENV 24 horas p.i. (figura 5B) em células Vero em placas de 96 poços. Os focos foram quantificados usando parâmetros de contagem otimizados para cada sorotipo em um iSpot Reader Spectrum (Autoimmun Diagnostika, GMBH).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0015] Qualquer uma das sequências de ácido nucleico e aminoácidos listadas aqui ou na Listagem de Sequências em anexo são mostradas usando as abreviações padronizadas com letra para as bases de nucleotídeo e aminoácidos, como definido em 37 C.F.R § 1.822. Em pelo menos alguns casos, apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a fita complementar é compreendida como incluída em qualquer referência à fita mostrada.

[0016] SEQ ID NOs: 1 e 2 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos do clone IC-P991 de WNV, respectivamente.

[0017] SEQ ID NOs: 3 e 4 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos de DEN1 16007, respectivamente.

[0018] SEQ ID NOs: 5 e 6 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos de DEN2 16681, respectivamente.

[0019] SEQ ID NOs: 7 e 8 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos de DEN3 16562, respectivamente.

[0020] SEQ ID NOs: 9 e 10 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos de DEN4 1036, respectivamente.

[0021] SEQ ID NOs: 11 e 12 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos da quimera de WN/DEN1 com uma junção tipo I, respectivamente.

[0022] SEQ ID NOs: 13 e 14 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos da quimera de WN/DEN2 E203-Asp com uma junção tipo I (BE3345), respectivamente.

[0023] SEQ ID NOs: 15 e 16 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos da quimera de WN/DEN3 E345-Leu (BE3345) com uma junção tipo II, respectivamente.

[0024] SEQ ID NOs: 17 e 18 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos da quimera de WN/DEN3 E345-Leu (CE345) com uma junção tipo III, respectivamente.

[0025] SEQ ID NOs: 19 e 20 são as sequências de ácido nucleico e aminoácidos da quimera de WN/DEN4 C107-Pro com uma junção tipo I, respectivamente.

[0026] SEQ ID NOs: 21 a 23 são as sequências de aminoácidos das junções tipo II exemplificadoras para as quimeras de WN/DEN1, WN/DEN2 e WN/DEN4, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0027] Embora ambos DENV e WNV sejam flavivírus, DENV replica muito mais lentamente e em títulos menores do que WNV em culturas celulares. Isso faz com que a produção de vírus ou de antígenos virais de DEN (por exemplo, para o desenvolvimento de vacinas para DENV) seja mais difícil do que para WNV. Os vírus WN/DEN quiméricos aqui descritos contêm estruturas antigênicas de DENV sobre a superfície das partículas de vírus, enquanto retêm certas características de WNV (tais como a replicação em altos títulos). As quimeras descritas podem assim ser usadas no desenvolvimento de composições imunogênicas, tais como vacinas de vírus inativados, para desencadear uma resposta imune aos vírus da DEN. Devido ao seu crescimento rápido e mais robusto do que wtDENVs em culturas celulares, essas quimeras podem ser produzidas em grande quantidade mais eficientemente do que DENVs de tipo selvagem para fazer vírus inativados.

[0028] Adicionalmente, nos protocolos de vacinação para DENV, é importante obter imunidade equilibrada contra todos os quatro sorotipos de DENV, para minimizar o risco potencial de surtos de doença severa associados com a intensificação do anticorpo da infecção por DENV. Portanto, as quimeras de WN/DENV inativadas e as composições imunogênicas que as contêm podem ser a melhor escolha para pessoas que adquiriram infeção prévia por DENV, mas que não têm imunidade para todos os quatro DENVs. Foi mostrado ser difícil obter a imunidade equilibrada usando uma vacina para DENV recombinante atenuada viva tetravalente (veja, Pat. U.S. No. 7.094.411) depois de uma dose única ou múltiplas doses, devido a interferência entre os vírus durante a replicação. Uma vacina inativada (sozinha ou como reforço) poderá resolver potencialmente esse problema, já que não haverá interferência do vírus (não requer replicação).

[0029] Os vírus quiméricos WN/DEN aqui descritos também podem ser virulentos e/ou gerar alta viremia em camundongos, portanto eles podem ser usados como dose de inoculação para avaliar a eficácia de candidatas a vacinas para DENV. Eles também são usados como um vírus substituto semelhante à DEN para testar a eficácia de uma vacina candidata para DENV e para diagnósticos mais rápidos e/ou mais eficazes de DENV.I. Abreviações

II. Expressões

[0030] A menos que observado de outra maneira, os termos técnicos são usados de acordo com a utilização convencional. As definições das expressões comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Lewin’s Genes X, ed. Krebs et al, Jones and Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 0763766321); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); e George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd Edition, Springer, 2008 (ISBN: 1402067534).

[0031] A menos que explicado de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem o mesmo significado como comumente compreendidos por aquele versado na técnica a qual essa descrição pertence. As expressões no singular "o", "a" e "um, "uma" incluem referencias no plural a menos que o contexto indique claramente o contrário. Deve ser compreendido que todos os tamanhos das bases (extensões) ou tamanhos de aminoácidos (extensões) e todos os valores dos pesos moleculares ou massas moleculares, dados para os ácidos nucleicos ou polipeptídeos, são aproximados e são fornecidos para descrição. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Todos os Nos. de Acesso do GenBank mencionados aqui estão incorporados por referência em sua totalidade. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aqueles descritos aqui possam ser usados para praticar ou para testar a presente descrição, métodos adequados e materiais estão descritos abaixo. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as explicações das expressões, controlará. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes.

[0032] A fim de facilitar a revisão das várias modalidades da invenção, as seguintes explicações das expressões específicas são fornecidas:

[0033] Anticorpo: Uma proteína (ou complexo de proteína) que inclui um ou mais polipeptídeos substancialmente codificada pelos genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e um, assim como a miríade de genes da região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, um, alfa, delta ou épsilon, o que por sua vez define as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[0034] A unidade estrutural básica da imunoglobulina (anticorpo) é geralmente um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par possuindo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa). A terminação de N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, primariamente responsável pelo reconhecimento do antígeno. As expressões "cadeia leve variável" (VL) e uma "cadeia pesada variável" (VH) se referem, respectivamente, a essas cadeias leve e pesada.

[0035] Como usada aqui, a expressão "anticorpos" inclui imunoglobulinas intactas assim como vários fragmentos bem caracterizados. Por exemplo, Fabs, Fvs e Fvs de cadeia simples (ScFv) que se ligam à proteína-alvo (ou epítopo dentro de uma proteína ou proteína de fusão) poderão ser agentes de ligação específicos para a essa proteína (ou epítopo). Esses fragmentos de anticorpo são definidos a seguir: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação ao antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo produzido pela digestão de um anticorpo completo com uma enzima papaína para fornecer uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; (2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo obtida pelo tratamento do anticorpo completo com pepsina, seguido pela redução, para fornecer uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab’ são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo obtido pelo tratamento do anticorpo completo com uma enzima pepsina sem a subsequente redução; (4) F(ab’)2, um dímero de dois fragmentos Fab’ mantidos juntos pelas duas ligações de dissulfeto; (5) Fv, um fragmento geneticamente manipulado que contém a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; e (6) anticorpo de cadeia simples, uma molécula geneticamente manipulada que contém a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas por um ligante peptídico adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida. Métodos para fazer esses fragmentos são rotineiros (veja, por exemplo, Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999).

[0036] Anticorpos para uso nos métodos e dispositivos dessa descrição podem ser monoclonais ou policlonais. Apenas como exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados a partir de hibridomas de murino de acordo com o método clássico de Kohler and Milstein (Nature 256:495-97, 1975) ou métodos derivados desse. Procedimentos detalhados para a produção de anticorpos monoclonais estão descritos em Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999.

[0037] Afinidade de ligação do anticorpo: A força da ligação entre o sítio de ligação de um anticorpo isolado e um ligante (por exemplo, um antígeno ou epítopo). A afinidade de um sítio de ligação X por um ligante Y é representada pela constante de dissociação (Kd), que é a concentração de Y que é necessária para ocupar metade dos sítios de ligação de X presente na solução. Um Kd menor representa uma interação mais forte ou de alta afinidade entre X e Y e uma concentração menor de ligante é necessária para ocupar os sítios. Em geral, a afinidade de ligação do anticorpo pode ser afetada pela alteração, modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos no epítopo reconhecido pelo parátopo do anticorpo. Em um exemplo, a afinidade de ligação do anticorpo é medida pela titulação no ponto final em um ensaio ELISA-Ag.

[0038] Antígeno: Um composto, composição ou substancia que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta da célula T em um animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas pelo animal. Um antígeno reage com os produtos específicos da imunidade humoral ou celular, incluindo aqueles induzidos pelos imunógenos heterólogo. Em uma modalidade, um antígeno é um antígeno viral, tal como uma proteína E de flavivírus.

[0039] Proteína do capsídeo (proteína C): Uma proteína estrutural do flavivírus que funciona para embalar o RNA viral no núcleo do nucleocapsídeo durante a montagem. A porção C terminal da proteína C inclui uma sequência sinal interna (referida aqui como C(ss), em alguns exemplos) para a translocação da proteína prM no retículo endoplasmático, onde a clivagem das proteínas C e prM ocorre. Essa sequência sinal varia em extensão entre os diferentes flavivírus. Por exemplo, a C(ss) dos vírus DEN tem 14 aminoácidos, enquanto que a C(ss) de WNV tem 18 aminoácidos.

[0040] Quimera: Uma molécula (por exemplo, de ácido nucleico ou proteína) composta por partes que têm origem diferente (tais como pelo menos dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos) que, embora tipicamente não ligados em seu estado nativo, são unidos ou ligados para formar uma única molécula contínua. Uma quimera pode incluir ácidos nucleicos ou polipeptídeos que são ligados extremidade com extremidade (por exemplo, a terminação amino de uma sequência é ligada à terminação carboxila de uma segunda sequência) ou pode incluir uma sequência de uma molécula que está incorporada dentro da outra molécula (por exemplo, a terminação amino e a terminação carboxila da quimera são de uma molécula, enquanto que a sequência interveniente vem de outra molécula).

[0041] Uma quimera pode incluir uma proteína quimérica, por exemplo, uma proteína que é composta por aminoácidos de mais do que uma proteína. Uma quimera também pode incluir um ácido nucleico quimérico composto por sequências de ácido nucleico de mais de uma fonte, tal como um ácido nucleico quimérico que codifique uma proteína quimérica. Em outros exemplos, uma quimera pode incluir um genoma quimérico, tal como um genoma de flavivírus, que é composto por sequências de dois ou mais flavivírus. Por exemplo, um genoma quimérico de flavivírus pode compreender sequências de ácido nucleico de mais de um genoma de flavivírus, tal como de um vírus do Oeste do Nilo e de um vírus da Dengue. Em alguns exemplos, um flavivírus quimérico inclui ácidos nucleicos que codificam uma ou mais proteínas de um primeiro flavivírus e ácidos nucleicos que codificam uma ou mais proteínas de um segundo flavivírus. Em exemplos particulares, um flavivírus quimérico é composto por um ácido nucleico que codifica as proteínas não estruturais e uma proteína C ou uma porção dessa de um genoma do vírus do Oeste do Nilo ligado a um ácido nucleico que codifica pelo menos uma porção de uma porção de uma proteína prM e proteína E (e opcionalmente uma porção de uma proteína C) do genoma de um vírus da Dengue (tal como DEN1, DEN2, DEN3 ou DEN4). Flavivírus quiméricos exemplificadores são mostrados esquematicamente nas figuras 1A-1D.

[0042] Substituição conservativa: Uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma sequência de proteína por um resíduo de aminoácido diferente que possui propriedades bioquímicas similares. Tipicamente, as substituições conservativas têm pouco ou nenhum impacto sobre a atividade de um polipeptídeo resultante. Por exemplo, idealmente, uma proteína de Flavivírus (tal como prM, E ou uma proteína não estrutural) que inclui uma ou mais substituições conservativas (por exemplo, 1-10, 2-5 ou 10-20 ou não mais do que 2, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 substituições) retém a estrutura e a função da proteína de tipo selvagem. Um polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservativas pela manipulação da sequência de nucleotídeos que codifica aquele polipeptídeo usando, por exemplo, procedimentos padronizados tais como a mutagênese direcionada ao sítio ou PCR. Em um exemplo, tais variantes podem ser facilmente selecionadas para o teste adicional pela infecção de células com um vírus que contém uma proteína variante e determinando sua habilidade de replicar, pela produção de vírus que contém uma proteína variante e determinando suas propriedades de virulência neural e invasão neural e/ou pelo teste da reatividade cruzada do anticorpo.

[0043] Glicoproteína do envelope (proteína E): Uma proteína estrutural do Flavivírus que medeia a ligação dos vírions do flavivírus aos receptores celulares sobre células hospedeiras. A proteína E do flavivírus é necessária para a fusão da membrana e o antígeno primário que induz imunidade protetora para a infecção por flavivírus. A proteína E do flavivírus afeta uma gama de hospedeiros, tropismo tecidual e a virulência viral. A proteína E do flavivírus contém três domínios estruturais e funcionais, DI-DIII. Nas partículas virais maduras, a proteína E forma homodímeros na conformação da cabeça para cauda sobre uma superfície plana e que formam uma densa malha sobre a superfície viral.

[0044] Anticorpo com reação cruzada com o flavivírus: Um anticorpo que reconhece (ou seja, se liga especificamente a) um epítopo encontrado sobre um peptídeo de mais do que uma espécie de flavivírus. Anticorpos com reação cruzada com o flavivírus são classificados anticorpos com reação cruzada com um complexo ou com reação cruzada com um grupo. Anticorpos com reação cruzada com um complexo reconhecem epítopos compartilhados por todos os vírus dentro de um complexo, tal como o complexo de vírus JE ou o complexo de DENV. Anticorpos com reação cruzada com um grupo reconhecem epítopos compartilhados por todos os membros do gênero Flavivirus.

[0045] A reatividade cruzada do anticorpo é refinada adicionalmente dentro das categorias de reatividade cruzada de subcomplexo e de subgrupo. Anticorpos com reatividade cruzada subcomplexa reconhecem anticorpos que compartilham a maioria, mas não todos os membros de um complexo de flavivírus em particular (por exemplo, DEN1, -2, -3, mas não DEN-4), enquanto que anticorpos com reatividade cruzada de subgrupo reconhecem epítopos compartilhados por flavivírus de vários complexos, mas não todos os membros do grupo dos flavivírus (por exemplo, todos os membros dos complexos de vírus DENV e JE, mas não todos os membros do complexo de vírus originados em carrapato).

[0046] Proteína não estrutural de flavivírus: Existem sete proteínas não estruturais (NS) de um flavivírus, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5, que são codificadas pela porção do genoma do flavivírus que está a 3’ das proteínas estruturais. NS1 foi implicada na replicação do RNA e foi mostrada ser secretada a partir de células de mamífero infectadas (Post et al., Virus Res. 18:291-302, 1991; Mackenzie et al., Virology 220:232-240, 1996; Muylaert et al., Virology 222:159-168, 1996). NS1 pode desencadear respostas imunes humorais acentuadas e é uma candidata à vacina em potencial (Shlesinger et al., J. Virol. 60:1153-1155, 1986; Qu et al., J. Gen. Virol. 74:89-97, 1993). NS2 é clivada em NS2A e NS2B. NS2A está envolvida na replicação do RNA e na montagem e secreção da partícula de vírus e NS2B forma um complexo com NS3 e funciona como um cofator para a protease NS3, que cliva porções da poliproteína de vírus. NS3 também funciona como uma RNA helicase e é usada para desenrolar o RNA viral durante a replicação (Li et al., J. Virol. 73:3108-3116, 1999). Embora as funções exatas de NS4A e NS4B permaneçam por serem elucidadas, elas são consideradas estarem envolvidas na replicação do RNA e no tráfego do RNA (Lindenbach and Rice, In: Fields Virology, Knipe and Howley, eds., Lippincott, Williams, and Wilkins, 991-1041, 2001). Finalmente, a proteína NS5 é uma RNA polimerase dependente de RNA envolvida na replicação do genoma (Rice et al., Science 229:726-733, 1985). NS5 também mostra atividade de metiltransferase comumente encontrada em enzimas que cobrem o RNA (Koonin, J. Gen. Virol. 74:733-740,1993).

[0047] Proteína estrutural do flavivírus: As proteínas do capsídeo (C), pré-membrana (prM) e do envelope (E) de um flavívirus são as proteínas estruturais do vírus. Os genomas do flavivírus consistem em RNAs de senso positivo que têm aproximadamente 11 kb de extensão. O genoma tem um cap 5’, mas carece de uma cauda poliadenilada a 3’ (Wengler et al., Virology 89:423-437, 1978) e é traduzido em uma poliproteína. As proteínas estruturais (C, prM e E) estão na extremidade amino terminal da poliproteína seguidas pelas proteínas não estruturais (NS1-5). A poliproteína é clivada pelas proteases derivadas do vírus e do hospedeiro em proteínas individuais. A proteína C forma o capsídeo viral, enquanto que as proteínas prM e E estão incorporadas no envelope circundante (Russell et al., The Togaviruses: Biology, Structure, and Replication, Schlesinger, ed., Academic Press, 1980). As funções da proteína E na ligação aos receptores da célula hospedeira que resultam na endocitose mediada pelo receptor. No pH baixo do endossoma, a proteína E sofre uma alteração conformacional que causa a fusão entre o envelope viral e as membranas do endossoma. A proteína prM é considerada estabilizar a proteína E até que o vírus saia da célula infectada, em cujo momento prM é clivada na proteína M madura (Revisto em Lindenbach and Rice, In: Fields Virology, Knipe and Howley, eds., Lippincott, Williams, and Wilkins, 991-1041, 2001).

[0048] Heterólogo: Originado de fontes genéticas ou espécies diferentes. Por exemplo, um ácido nucleico quimérico que inclui um ácido nucleico a partir de duas (ou mais) fontes genéticas diferentes ou de dois (ou mais) segmentos separados de outra maneira de uma sequência de uma fonte genética única é considerado um ácido nucleico heterólogo. Similarmente, um polipeptídeo que inclui peptídeos a partir de duas (ou mais) proteínas diferentes a partir de uma única fonte genética ou duas (ou mais) proteínas de fontes genéticas diferentes (tal como uma proteína de fusão) é considerado um polipeptídeo heterólogo. Por exemplo,, um ácido nucleico que compreende porções do genoma de um WNV operacionalmente ligadas a um ácido nucleico que compreende porções de um genoma de DENV é um ácido nucleico heterólogo. Similarmente, um polipeptídeo que inclui um polipeptídeo de WNV ou uma porção desse ligado a um polipeptídeo de DENV ou uma porção desse é um polipeptídeo heterólogo.

[0049] Em outro exemplo de uso da expressão heterólogo, um ácido nucleico que é heterólogo para uma célula se origina de um organismo ou espécie diferente da célula na qual ele é expresso. Em um exemplo específico,não limitante, um ácido nucleico heterólogo inclui um ácido nucleico de flavivírus que está presente ou expresso em uma célula bacteriana (tal como uma célula de E. coli) ou em uma célula de alga, planta, inseto (por exemplo, C6/C36) ou de mamífero (por exemplo, Vero).Métodos para introduzir um ácido nucleico heterólogo em células bacterianas, de algas, plantas, insetos e mamíferos são bem conhecidos na técnica, incluindo a infecção de uma célula com um ácido nucleico viral ou a transformação com um ácido nucleico, por exemplo, eletroporação, lipofecção e aceleração com arma de partícula.

[0050] Resposta imune: Uma resposta de uma célula do sistema imune, tal como uma célula B, célula T, macrófago ou polimorfonucleocito a um estimula tal como um antígeno. Uma resposta imune pode incluir qualquer célula do corpo envolvida na resposta de defesa do hospedeiro, por exemplo, uma célula epitelial que secrete um interferon ou uma citocina. Uma resposta imune inclui, mas não está limitada a uma resposta imune inata ou inflamação.

[0051] Vírus inativado: Um vírus (tal como uma vacina viral) que tenha sido tornado incapaz de replicação nas células hospedeiras) (e assim não é virulento), mas pode desencadear uma resposta imune. Métodos para inativar um vírus (tal como um vírus que inclui uma quimera de ácido nucleico aqui descrita) inclui o tratamento químico (por exemplo, formaldeído), tratamento físico (tal como calor), irradiação ou suas combinações.

[0052] Isolado: Um componente biológico "isolado" ou "purificado" (tal como um ácido nucleico, peptídeo, proteína, complexo de proteína ou partícula) substancialmente separado, produzido além de ou purificado separado de outros componentes em uma preparação ou outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre, ou seja, outro DNA e RNA cromossômico ou extracromossômico e proteínas. Ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas que tenham sido "isolados" ou "purificados" incluem, portanto, ácidos nucleicos e proteínas purificados pelos métodos de purificação padronizados. A expressão também abrange ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas preparados pela expressão recombinante em uma célula hospedeira assim como ácidos nucleicos e proteínas quimicamente sintetizadas. A expressão "isolado" ou "purificado" não requer pureza absoluta; preferencialmente é pretendida como uma expressão relativa. Assim, por exemplo, um componente biológico isolado é aquele em que o componente biológico é mais enriquecido do que o componente biológico é em seu ambiente natural dentro de uma célula ou outro vaso de produção. Preferivelmente, uma preparação é purificada tal que o componente biológico represente pelo menos 50%, tal como pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais do componente biológico total da preparação.

[0053] Molécula de ácido nucleico: Uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir ambas as fitas de senso e antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo se refere a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. A expressão "molécula de ácido nucleico" como usada aqui é sinônima de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico tem comumente pelo menos 10 bases de extensão, a menos que especificado de outra maneira. A expressão inclui formas de DNA de fita simples e de fita dupla. Um polinucleotídeo pode incluir qualquer um ou ambos nucleotídeos que ocorrem naturalmente ou modificados ligados pelas ligações de nucleotídeo que ocorrem naturalmente e/ou não ocorrem naturalmente.

[0054] Operacionalmente ligada: Um primeiro ácido nucleico está operacionalmente ligado a um segundo ácido nucleico quando o primeiro ácido nucleico é colocado em um relacionamento funcional com o segundo ácido nucleico. Geralmente, sequências de DNA operacionalmente ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões codificantes de proteína, na mesma fase de leitura aberta. Ácidos nucleicos operacionalmente ligados incluem um primeiro ácido nucleico contíguo com a extremidade 5’ ou 3’ de um segundo ácido nucleico. Em outros exemplos, um segundo ácido nucleico está operacionalmente ligado a um primeiro ácido nucleico quando ele está incorporado dentro do primeiro ácido nucleico, por exemplo, onde o construto de ácido nucleico (em ordem) inclui uma porção do primeiro ácido nucleico, o segundo ácido nucleico e o restante do primeiro ácido nucleico. Exemplos de um segundo ácido nucleico incorporado dentro de um primeiro ácido nucleico são mostrados esquematicamente nas figuras 1B-1D.

[0055] Veículo farmaceuticamente aceitável: Os veículos farmaceuticamente aceitáveis (transportadores) úteis nessa descrição são convencionais. Reminto: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21st Edition (2005), descreve composições e formulações adequadas para liberação farmacêutica de uma ou mais composições terapêuticas, tais como um ou mais polipeptídeos do capsídeo do poliomavírus ou seus fragmentos e agentes farmacêuticos adicionais.

[0056] Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo particular de administração a ser empregado. Por exemplo, formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis tais como água, salina fisiológica, soluções de sal balanceadas, dextrose aquosa, glicerol e semelhantes como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), veículos sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose ou estearato de magnésio. Em adição aos veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substancias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes e agentes de tamponamento do pH e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

[0057] Proteína pré-membrana (proteína prM): Uma proteína estrutural do flavivírus. A proteína prM é uma proteína com aproximadamente 25 kDa que é a precursora intracelular para a proteína da membrana (M). prM é considerada estabilizar a proteína E durante o transporte do vírion imaturo para a superfície celular. Quando o vírus sai da célula infectada, a proteína prM é clivada na proteína M madura, que é parte do envelope viral (Revisto em Lindenbach and Rice, In: Fields Virology, Knipe and Howley, eds., Lippincott, Williams, and Wilkins, 991-1041, 2001).

[0058] Purificado: A expressão "purificado" não requer pureza absoluta; pelo contrário, ela é pretendida ser uma expressão relativa. Assim, por exemplo, uma preparação de ácido nucleico purificado é aquela em que o ácido nucleico é mais enriquecido do que o ácido nucleico em seu ambiente natural (tal como dentro de uma célula) ou em uma preparação ou em um recipiente de produção. Em outros exemplos, uma preparação purificada de vírus é aquela na qual o vírus é mais enriquecido do que em uma célula ou organismo, uma preparação ou um recipiente de produção. Um ácido nucleico ou vírus purificados também incluem aqueles que são substancialmente livres de componentes indesejáveis, tais como um agente de inativação. Preferivelmente, uma preparação é purificada tal que o ácido nucleico ou o vírus representem pelo menos 50% do conteúdo total da preparação. Em algumas modalidades, uma preparação purificada contém pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de ácido nucleico ou vírus.

[0059] Ácido nucleico recombinante: Uma molécula de ácido nucleico que não ocorre naturalmente ou tem uma sequência que é feita pela combinação artificial de dois segmentos de sequência separados de outra maneira. Essa combinação artificial é obtida pela síntese química ou, mais comumente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, pelas técnicas de manipulação genética tais como aquelas descritas em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. A expressão recombinante inclui ácidos nucleicos que tenham sido apenas alterados pela adição, substituição ou deleção de uma porção da molécula de ácido nucleico natural. Ácidos nucleicos recombinantes exemplificadores são mostrados esquematicamente nas figuras 1B-1D.

[0060] Identidade de sequência: A similaridade entre duas sequências de ácido nucleico ou duas sequências de aminoácidos é expressa em termos de similaridade entre as sequências, referida de outra maneira como identidade de sequência. A identidade de sequência é frequentemente medida em termos de percentual de identidade (ou similaridade ou homologia); quanto maior o percentual, mais similares são as sequências.

[0061] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento estão descritos em: Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 2:482, 1981); Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443, 1970); Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444, 1988); Higgins and Sharp (Gene, 73:237-44, 1988); Higgins and Sharp (CABIOS, 5:151-53, 1989); Corpet et al. (Nuc. Acids Res., 16:10881-90, 1988); Huang et al. (Comp. Appls. Biosci., 8:155-65, 1992); and Pearson et al. (Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul et al. (Nature Genet., 6:119-29, 1994) apresentam uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia.

[0062] As ferramentas de alinhamento ALIGN (Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) ou LFASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448, 1988) podem ser usadas para realizar as comparações de sequência (Internet Program © 1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, "fasta20u63" version 2.0u63, data de liberação dezembro de 1996). ALIGN compara sequências inteiras uma contra a outra, enquanto LFASTA compara regiões de similaridade local. Essas ferramentas de alinhamento e seus respectivos tutoriais estão disponíveis na internet no website da NCSA. Alternativamente, para comparações de sequências de aminoácidos maiores do que cerca de 30 aminoácidos, a função "sequências Blast 2" pode ser empregada usando a matriz de padronização BLOSUM62 para ajustar os parâmetros padronizados (custo da existência de intervalo de 11 e um custo por intervalo de resíduo de 1). Quando peptídeos curtos são alinhados (menos do que cerca de 30 aminoácidos), o alinhamento deve ser realizado usando a função "sequências Blast 2", empregando a matriz PAM30 para ajustar os parâmetros padronizados (abertura de intervalo de 9, penalidades de extensão de intervalo de 1). O sistema de comparação BLAST está disponível, por exemplo, no website do NCBI; veja também, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-10, 1990; Gish and States, Nature Genet., 3:266-72, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol., 266:131-41, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402, 1997; e Zhang and Madden, Genome Res., 7:649-56, 1997.

[0063] Indivíduo: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui mamíferos humanos e não humanos (tais como camundongos, ratos, coelhos, ovelhas, cavalos, vacas e primatas não humanos).

[0064] Transformada: Uma célula "transformada" é uma célula na qual foi introduzida uma molécula de ácido nucleico (tal como um ácido nucleico heterólogo) pelas técnicas de biologia molecular. A expressão abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula, incluindo a transfecção com vetores virais, a transformação com vetores de plasmídeo e a introdução de DNA nu por eletroporação, lipofecção e aceleração com arma de partícula.

[0065] Vacina: Uma preparação de material imunogênico capaz de estimular uma resposta imune, administrada para a prevenção, inibição, melhora ou tratamento de uma doença infecciosa ou de outros tipos. O material imunogênico pode incluir microrganismos atenuados ou inativados (mortos) (tais como bactérias ou vírus) ou proteínas antigênicas, peptídeos ou DNA derivados deles. Um vírus atenuado é um organismo virulento que foi modificado para produzir uma forma menos virulenta, mas que apesar disso retém a habilidade de fazer surgir anticorpos e a imunidade mediada por célula contra a forma virulenta. Um vírus inativado (morto) é um organismo previamente virulento que foi inativado com químicos, calor ou outro tratamento, mas que faz surgir anticorpos contra o organismo. As vacinas podem desencadear ambas as respostas profilática (preventiva ou protetora) e terapêutica. Métodos de administração variam de acordo com a vacina, mas podem incluir a inoculação, ingestão, inalação ou outras formas de administração. As vacinas podem ser administradas com um adjuvante para reforçar a resposta imune.

III. Quimeras de Vírus do Oeste do Nilo/Dengue

[0066] São descritos aqui flavivírus quiméricos que incluem regiões não codificantes, proteínas não estruturais e pelo menos uma porção de uma proteína C de WNV e uma proteína prM e proteína E de DENV. As Tabelas 1 a 5 abaixo fornecem as posições inicial e final dos genes em particular e proteínas de vírus do Oeste do Nilo e da Dengue. Essas sequências podem servir como sequências de referência e podem ser usadas para identificar posições de nucleotídeos e aminoácidos particulares que correspondem às posições referidas nos ácidos nucleicos quiméricos aqui descritos ou proteínas codificadas pelos ácidos nucleicos quiméricos aqui descritos. Por exemplo, com base nessa informação, um especialista na técnica pode identificar a posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 347 da proteína E em um vírus DEN2, por exemplo, pela produção de um alinhamento de uma quimera e uma das sequências do vírus aqui fornecida. Tabela 1. Posições iniciais e finais de NCRs, proteínas estruturais e não estruturais no clone IC-P991 de WNV Tabela 2. Posições iniciais e finais de NCRs, proteínas estruturais e não estruturais em DEN1 16007 Continuação Tabela 3. Posições iniciais e finais de NCRs, proteínas estruturais e não estruturais em DEN2 16681 Tabela 4. Posições iniciais e finais de NCRs, proteínas estruturais e não estruturais em DEN3 16562 Tabela 5. Posições iniciais e finais de NCRs, proteínas estruturais e não estruturais em DEN4 1036

[0067] Em a guns exemplos aqui descritos, o genoma de WNV usado na quimera é derivado de uma cepa de WNV particular, tal como NY99 ou KEN-3829. Cepas adicionais de WNV são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Ebel et al. Emerg. Infect. Dis. 7:650-653, 2001; números de catálogo da American Type Culture Collection (ATCC) VR-82, VR-1267, VR-1507, VR-1510). Em exemplos particulares, o genoma de WNV é WN/IC-P991, por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou No. de acesso GenBank AF196835 (incorporado por referência como incluído no GenBank em 20 de junho de 2014, ou com mutações como descrito em Kinney et al., J. Gen. Virol. 87:3611-3622, 2006) e/ou Pat. U.S. No. 8.715.689, ambos incorporados por referência em sua totalidade. Em alguns exemplos, a sequência do genoma de WNV é modificada, por exemplo, para introduzir sítios de restrição com propósitos de clonagem. Essas modificações podem ser mutações silenciosas (por exemplo, alterações na sequência de nucleotídeos que não alteram a sequência de aminoácidos) ou elas podem alterar a sequência de aminoácidos.

[0068] As sequências do genoma de WNV estão publicamente disponíveis. Por exemplo, os Nos. de Acesso de GenBank AF196835, AY278441, AF202541, AF404754, AF260967, AY660002, AF481864, AY268133, AF404757, AY268132, AF260969, AF317203, AY262283, AY490240, AF260968, AY603654, D00246, M12294, EU068667, AY765264 e AY277251 descrevem sequências de ácido nucleico do genoma de WNV, todas as quais estão incorporadas pela referência como incluídas no GenBank em 20 de junho de 2014. Em exemplos adicionais, o genoma de WNV ou as regiões não codificantes, proteínas não estruturais e/ou a proteína C do genoma de WNV são pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas a uma sequência do genoma de WNV publicamente disponível.

[0069] Nas quimeras de ácido nucleico descritas, o genoma de DENV é de um vírus da Dengue 1 (DEN1), Dengue 2 (DEN2), Dengue 3 (DEN3) ou Dengue 4 (DEN4). Genomas de DENV exemplificadores estão descritos aqui como as SEQ ID NOs.: 3, 5, 7 e 9. Em alguns exemplos, a porção do genoma de das quimeras descritas de DENV inclui sequências de um único genoma de DENV, enquanto que outros exemplos, a porção de genoma de DENV inclui sequências de dois ou mais genomas de DENV. O genoma de DENV pode ser de uma cepa de tipo selvagem ou uma cepa atenuada (ou vacina). Em alguns exemplos, o genoma de DENV é DEN2 (por exemplo, cepa 16681 de DEN2 de tipo selvagem ou a cepa DEN-2 PDK-53 atenuada), DEN1 (por exemplo, cepa 16007 de DEN1 ou a cepa DEN1 PDK-13 atenuada), DEN3 (por exemplo, cepa DEN3 16562 de tipo selvagem ou DEN3 PGMK-30/FRhL-3 atenuada) ou DEN4 (por exemplo, cepa DEN4 1036 de tipo selvagem ou DEN4 PDK-48 atenuada). Cepas de DENV adicionais são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5.939.254 e 6.793.488). Em exemplos particulares, o genoma de DENV é uma cepa de tipo selvagem (não atenuada), por exemplo, DEN2 16681 (tal como o No. de acesso GenBank U87411, incorporado pela referência como incluído no GenBank em 20 de junho de 2014). Em alguns exemplos, a sequência do genoma de DENV é modificada, por exemplo, para introduzir sítios de restrição com propósitos de clonagem. Essas modificações podem ser silenciosas (por exemplo, alterações na sequência de nucleotídeos que não alteram a sequência de aminoácidos) ou elas podem alterar a sequência de aminoácidos.

[0070] As sequências de DENV estão publicamente disponíveis. Por exemplo, os Nos. de Acesso do GenBank NC_001477, AF180817, e U88536 descrevem as sequências de ácido nucleico de DEN1; NC_001474 e U87411 descrevem as sequências de ácido nucleico de DEN2; NC_001475, AY099336 e AF317645 descrevem as sequências de ácido nucleico de DEN3; e NC_002640 e AF326825 descrevem as sequências de ácido nucleico de DEN4, todas as quais estão incorporadas pela referência como incluídas no GenBank em 20 de junho de 2014. Em exemplos adicionais, o genoma de DENV (ou a sequência sinal da proteína C, prM e/ou E do genoma de DENV) têm pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de DENV publicamente disponível.

[0071] Os vírus que contêm as quimeras de ácido nucleico descritas podem ser facilmente produzidos pela replicação nas células hospedeiras em cultura. Métodos de produção de vírus são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Fields Virology, Knipe and Howley, eds., Lippincott, Williams, and Wilkins, 2001; Flint et al., Principles of Virology, ASM Press, 2000). As linhagens celulares hospedeiras são geralmente selecionadas por serem fáceis de infectar com vírus ou transfectar com RNA genômico viral, capazes de manter estavelmente o RNA estranho com uma sequência não arranjada e terem os componentes celulares necessários para a transcrição, tradução, modificação pós-traducional, montagem do vírus e secreção eficientes da proteína ou da partícula viral. Em adição, as células são tipicamente aquelas que possuem necessidades simples de componente do meio que podem ser adaptadas para o crescimento em cultura em suspensão. Em alguns exemplos, a linhagem celular hospedeira é uma linhagem celular de mamífero que é adaptada para crescer em meio com pouco soro ou sem soro. Linhagens celulares hospedeiras adequadas exemplificadoras incluem as células Vero (macaco), C6/36 (mosquito), BHK21 (hamster), LLC-MK2 (macaco) SK6 (suíno), L292 (camundongo), HeLa (humana), HEK (humana), 2fTGH (humana), HepG2 (humana) e PDK (cachorro). Linhagens celulares adequadas podem ser obtidas com a American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA.

[0072] Em alguns exemplos, os vírus WN/DEN quiméricos descritos replicam em cultura celular mais rapidamente do que os vírus DEN. Em alguns exemplos, as placas formadas pelos vírus quiméricos WN/DEN se formam em culturas celulares (tais como de células C6/36 ou Vero) mais cedo do que DENVs (tal como pelo menos um dia, dois dias, três dias, quatro dias ou cinco dias mais cedo depois da infecção). Em outros exemplos, os vírus quiméricos WN/DEN formam placas maiores do que DENVs, por exemplo, placas que são pelo menos 25% maiores a cerca de 10 vezes maiores do que os vírus DEN (tal como pelo menos 50% maior, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou até 10 vezes maior).

[0073] A descrição também fornece quimeras de WN/DEN que possuem uma ou mais substituições, inserções, deleções de ácido nucleico ou de aminoácidos ou combinações desses, tal que a quimera resultante tem características aperfeiçoadas. Em alguns exemplos, a característica aperfeiçoada da quimera inclui, mas não está limitada a título de vírus aumentado, taxa de replicação aumentada, tamanho da placa aumentado ou estabilidade aumentada em cultura celular comparada com o vírus de tipo selvagem. Em exemplos adicionais, a característica aperfeiçoada da quimera inclui capacidade de infecção ou virulência aumentada em um indivíduo (tal como camundongos ou primatas não humanos) ou capacidade de infecção ou transmissibilidade diminuída em mosquitos quando comparada com o vírus de tipo selvagem.

[0074] A manipulação da sequência de nucleotídeos dos flavivírus quiméricos descritos pelos procedimentos padronizados, incluindo, por exemplo, a mutagênese direcionada ao sítio ou PCR e mutagênese com o iniciador M13, podem ser usados para aperfeiçoar as características (tais como título de vírus aumentado ou estabilidade em cultura celular). Detalhes dessas técnicas são bem conhecidos. Por exemplo, são fornecidos protocolos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. As modificações mais simples envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos que possuem propriedades físico-químicas e/ou estruturais similares. Essas assim chamadas substituições conservativas provavelmente têm um impacto mínimo sobre a atividade e/ou a estrutura da proteína resultante. As substituições conservativas geralmente mantêm (a) a estrutura do arcabouço do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Exemplos de substituições conservativas são mostrados abaixo.

[0075] As substituições que em geral são esperadas produzir as maiores alterações nas propriedades da proteína serão não conservativas, por exemplo, alterações nas quais (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, seril ou treonil, é substituído por (ou pelo) resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil ou alanil (ou vice-versa); (b) uma cisteína ou prolina é substituída por qualquer outro resíduo; (c) um resíduo que tem uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisil, arginil ou histadil é substituído por ou pelo resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamil ou aspartil (ou vice- versa) ou (d) um resíduo que possui uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído por um que não tem uma cadeia lateral, por exemplo, glicina (ou vice-versa).

[0076] Em adição a mutagênese direcionada para a produção de variantes das quimeras de WN/DENV descritas, mutações podem se acumular depois da passagem na cultura que resulta nas variantes, algumas com as características desejadas. Substituições, inserções e/ou deleções que se acumulam em vírus quiméricos durante as passagens na cultura celular são prontamente determinadas pela análise de sequência do vírus amplificado de placas isoladas da semente de vírus e podem ser manipulados em clones infecciosos para gerar variantes da quimera de WN/DENV que possuem características aperfeiçoadas (tal como a replicação em altos títulos ou a produção de placas grandes uniformes nas células). Mutações consistentes identificadas a partir de múltiplas sementes ou placas isoladas são uma indicação de uma substituição desejável da quimera no tipo celular. Estudos prévios possuem substituições bem sucedidas identificadas que ocorreram em cultura celular e a manipulação dessas em diferentes construtos de vírus quiméricos para produzir vírus quiméricos com características aperfeiçoadas (por exemplo, Huang et al., J. Virol. 77:11436-11447, 2003; Huang et al., J. Virol. 12:7300-7310, 2005; Pat. U.S. No. 8.715.689).

A. Quimeras de WN/DEN com Sequência de Sinal de prM Quimérica

[0077] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos quiméricos de WN/DEN descritos aqui incluem uma primeira molécula de ácido nucleico que inclui uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3’ não codificante do genoma do vírus do Oeste do Nilo, onde a proteína C inclui uma porção de uma sequência sinal de prM (também referida como "C(ss)") de WNV e uma porção de uma sequência sinal de prM do genoma de DENV. A quimera também inclui uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, codificando pelo menos uma porção de uma proteína prM e uma proteína E do genoma de DENV. Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico que codificam a proteína prM e a proteína E do genoma de WNV são substituídas com moléculas que possuem as sequências correspondentes do genoma de DENV. Adicionalmente, uma porção da sequência sinal de prM de WNV da proteína C é substituída por uma porção da sequência sinal de prM da proteína C de um DENV, produzindo uma sequência sinal quimérica ou "misturada". Uma ilustração esquemática de uma quimera exemplificadora dessa construção é mostrada na figura 1C (e é referida aqui em alguns exemplos como quimera de ácido nucleico que possui uma junção "Tipo II" ou uma "quimera Tipo II"). Portanto, em alguns exemplos, o segundo ácido nucleico está incorporado dentro do primeiro ácido nucleico, tal que a quimera inclui (em ordem) 5’ NCR de WNV, proteína C de WNV que inclui pelo menos uma porção N terminal de C(ss) de WNV, porção C terminal de C(ss) de DENV, proteína prM de DENV, proteína E de DENV, proteínas não estruturais (NS1-NS5) de WNV e 3’ NCR de WNV.

[0078] As quimeras de ácido nucleico com uma junção do Tipo II possuem uma C(ss) que tem o mesmo comprimento como a C(ss) da C(ss) de WNV nativo, que tem 18 aminoácidos, Uma porção 5’ de C(ss) é do genoma de WNV e uma porção 3’ de C(ss) é do genoma de DENV. Em exemplos particulares de quimeras de ácido nucleico com uma junção Tipo II, a C(ss) inclui os seis primeiros aminoácidos da C(ss) de WNV (por exemplo, aminoácidos 106 a 111 de SEQ ID NO:2) e os últimos 12 aminoácidos de uma c(ss) de DENV (por exemplo, aminoácidos 103 a 114 da SEQ ID NOs: 4, 6 ou 8 ou os aminoácidos 102 a 113 da SEQ ID NO: 10). Por exemplo, a C(ss) de uma quimera de WN/DEN1 Tipo II tem a sequência GGKTGITMLLMLLPTALA (SEQ ID NO: 21), a C(ss) de uma quimera de WN/DEN2 Tipo II tem a sequência GGKTGIGMIIMLIPTVMA (SEQ ID NO: 22), a C(ss) de uma quimera de WN/DEN3 Tipo II tem a sequência GGKTGILCLMMMLPATLA (aminoácidos 106-123 de SEQ ID NO: 16), e a C(ss) de uma quimera de WN/DEN4 Tipo II tem a sequência GGKTGIITLLCLIPTVMA (SEQ ID NO: 23). Uma quimera exemplificadora de WN/DEN3 com uma junção tipo II é fornecida aqui como as SEQ ID NOs: 15 e 16.

[0079] Em exemplos adicionais, uma C(ss) híbrida da junção Tipo II (que fornece uma C(ss) de 18 aminoácidos, mas com ambos aminoácidos quiméricos de WNV e DENV) pode incluir os primeiros aminoácidos 11-17 da C(ss) de WNV e os últimos 1 a 7 aminoácidos de uma C(ss) de DENV. Portanto, junções Tipo II adicionais podem incluir os primeiros 11 aminoácidos da C(ss) de WNV e os últimos 7 aminoácidos da C(ss) de um DENV, os primeiros 12 aminoácidos da C(ss) de WNV e os últimos 6 aminoácidos da C(ss) de um DENV e assim por diante.

[0080] Em alguns exemplos, as quimeras de WN/DEN descritas incluem uma ou mais substituições de ácido nucleico que resultam em uma substituição de aminoácido que fornece uma característica desejável, por exemplo, estabilidade, replicação ou título viral em cultura celular (tal como células Vero e/ou C6/36) aumentados, comparadas como o vírus ou quimera não substituídos. Substituições de aminoácidos exemplificadoras incluem uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde a aminoácido 345 da proteína E de DEN3 ou o aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4. Em alguns exemplos, a substituição de aminoácido resulta na presença de um resíduo de leucina na posição de aminoácido 345 de DEN3 (substituição de His-Leu) ou 347 de DEN1, DEN2 ou DEN4 (substituição de Glu-Leu). Substituições de ácido nucleico exemplificadoras que resultam nessas substituições são fornecidas na Tabela 7, abaixo. Uma quimera tipo II exemplificadora que inclui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 345 da proteína E de DEN3 ou aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4 é fornecida aqui como a quimera de WN/DEN3 de SEQ ID NOs.: 15 e 16.

B. Quimeras de WN/DEN com a Sequência de Sinal de prM de Dengue

[0081] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos quiméricos de WN/DEN descritos aqui incluem uma primeira molécula de ácido nucleico que inclui uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3’ não codificante do genoma do vírus do Oeste do Nilo, onde a proteína C não inclui uma porção de uma sequência sinal de prM de WNV (por exemplo, a quimera inclui uma sequência sinal de prM de um genoma de DENV). A quimera também inclui uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, codificando uma sequência sinal de prM e pelo menos uma porção de uma proteína prM e da proteína E do genoma de DENV. Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência sinal de prM, a proteína prM e a proteína E do genoma de WNV são substituídas com moléculas que possuem as sequências correspondentes do genoma de DENV. Uma ilustração esquemática de uma quimera exemplificadora dessa construção é mostrada na figura 1B (e é referida aqui em alguns exemplos como quimera de ácido nucleico que possui uma junção "Tipo I" ou uma "quimera Tipo I"). Portanto, em alguns exemplos, o segundo ácido nucleico está incorporado dentro do primeiro ácido nucleico, tal que a quimera inclui (em ordem) 5’ NCR de WNV, proteína C de WNV excluindo a C(ss), C(ss) de DENV, proteína prM de DENV, proteína E de DENV, NS1-NS5 de WNV e 3’ NCR de WNV.

[0082] As quimeras de ácido nucleico com uma junção Tipo I possuem uma sequência sinal de prM (também referida como "C(ss)") de m DENV, que tem 14 aminoácidos (ao invés dos 18 aminoácidos da sequência de C(ss) de WNV). Quimeras de WN/DEN exemplificadoras com uma junção tipo I incluem as SEQ ID NOs.: 11-14, 19 e 20.

[0083] Em alguns exemplos, as quimeras de WN/DEN descritas incluem uma ou mais substituições de ácido nucleico que resultam em uma substituição de aminoácido que fornece uma característica desejável, por exemplo, estabilidade, replicação ou título viral em cultura celular (tal como células Vero e/ou C6/36) aumentados, comparadas como o vírus ou quimera não substituídos. Substituições exemplificadoras de ácido nucleico e aminoácidos incluem aquelas mostradas na Tabela 7, abaixo. Por exemplo, a quimera WN/DEN pode incluir uma ou mais substituições que incluem uma substituição de aminoácido em um ou mais aminoácidos que correspondem ao posição de aminoácido 92 da proteína C de WNV; posição 101 da proteína C de DEN1, DEN2 ou DEN3; posição 100 da proteína C de DEN4; posição 102 da proteína C de DEN1, DEN2 ou DEN3; posição 101 da proteína C de DEN4; uma substituição de aminoácido em um ou mais aminoácidos que correspondem as posições 22, 135, 154 ou 155 da proteína prM de DEN1, DEN2, DEN3 ou DEN4; uma substituição de aminoácido em um ou mais aminoácidos que correspondem a posição de aminoácido 171 da proteína E de DEN1, DEN2, DEN3 ou DEN4; posição de aminoácido 311 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 309 da proteína E de DEN3; posição de aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 345 da proteína E de DEN3; posição de aminoácido 397 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 395 da proteína E de DEN3; posição de aminoácido 417 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 415 da proteína E de DEN3; uma substituição na posição de aminoácido 71 de NS3 de WNV; e/ou uma substituição na posição de aminoácido 18 da proteína NS4A de WNV.

[0084] Em alguns exemplos, duas ou mais substituições estão presentes na quimera aqui descrita. Em um exemplo, a quimera de WN/DEN inclui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 201 da proteína E de DEN3 ou ao aminoácido 203 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4 e uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido na posição 100 da proteína C de DEN4 ou 101 de DEN1, DEN2 ou DEN3. Em outro exemplo, a quimera de WN/DEN inclui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 135 da proteína prM de DEN1, DEN2, DEN3 ou DEN4 e uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 154 da proteína prM de DEN4 ou 101 de DEN1, DEN2 ou DEN3.

[0085] Em um exemplo particular, uma quimera de WN/DEN com uma junção tipo I inclui uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 201 da proteína E de DEN3 ou ao aminoácido 203 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4. Em alguns exemplos, a substituição de aminoácido resulta na presença de um resíduo de ácido aspártico na posição de aminoácido 201 da proteína E de DEN3 (substituição de Asn-Asp) ou 203 de DEN1 (substituição de Glu-Asp), DEN2 (substituição de Asn-Asp), ou DEN4 (substituição de Lys-Asp). Uma quimera tipo I exemplificadora incluindo uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de 201 da proteína E de DEN3 ou 203 de DEN1, DEN2, ou DEN4 é fornecida aqui como as SEQ ID NOs: 13 e14 (previamente descritas na Pat. U.S. No. 8.715.689). Em outros exemplos, a substituição de aminoácido resulta na presença de uma serina ou prolina em uma posição que corresponde ao aminoácido 101 da proteína C de DEN4 (substituição de Thr-Pro) ou 102 de DEN1 (substituição de Val-Pro), DEN2 (substituição de Ala-Pro), ou DEN3 (substituição de Ser-Pro). Uma quimera tipo I exemplificadora incluindo uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 101 da proteína C de DEN4 ou 102 de DEN1, DEN2, ou DEN3 é fornecida aqui como a quimera WN/DEN4 das SEQ ID NOs: 19 e 20.

C. Quimeras de WN/DEN com a Sequência de Sinal de prM de Oeste do Nilo

[0086] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos de WN/DEN quimérico aqui descritos incluem uma primeira molécula de ácido nucleico que inclui uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3’ não codificante do genoma do vírus do Oeste do Nilo. A quimera também inclui uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, codificando pelo menos uma porção de uma proteína prM e da proteína E do genoma de DENV. Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico que codificam a proteína prM e a proteína E do genoma de WNV são substituídas com moléculas que possuem as sequências correspondentes do genoma de DENV. Uma ilustração esquemática de uma quimera exemplificadora dessa construção é mostrada na figura 1D (e é referida aqui em alguns exemplos como quimera de ácido nucleico que possui uma junção "Tipo III" ou uma "quimera Tipo III"). Portanto, em alguns exemplos, o segundo ácido nucleico está incorporado dentro do primeiro ácido nucleico, tal que a quimera inclui (em ordem) 5’ NCR de WNV, proteína C de WNV, proteína prM de DENV, proteína E de DENV, NS1-NS5 de WNV e 3’ NCR de WNV.

[0087] As quimeras de ácido nucleico com uma junção Tipo III possuem uma sequência sinal de prM (também referida como "C(ss)") de WNV, que tem 18 aminoácidos (ao invés dos 14 aminoácidos da sequência de C(ss) de DENV). Quimeras de WN/DEN exemplificadoras com uma junção tipo III incluem as SEQ ID NOs.: 17 e 18.

[0088] Em alguns exemplos, as quimeras de WN/DEN descritas incluem uma ou mais substituições de ácido nucleico que resultam em uma substituição de aminoácido que fornece uma característica desejável, por exemplo, estabilidade, replicação ou título viral em cultura celular (tal como células Vero e/ou C6/36) aumentados, comparadas como o vírus ou quimera não substituídos. Substituições exemplificadoras de aminoácidos incluem uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 345 da proteína E de DEN3 ou ao aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4. Em alguns exemplos, a substituição de aminoácido resulta na presença de um resíduo de leucina na posição de aminoácido 345 de DEN3 (substituição de His-Leu) ou 347 de DEN1 (substituição de Gln- Leu), DEN2 (substituição de Val-Leu), ou DEN4 (substituição de Gln- Leu). Substituições de ácido nucleico exemplificadoras que resultam nessas substituições são fornecidas na Tabela 7, abaixo. Uma quimera tipo III exemplificadora incluindo uma substituição em uma posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 345 da proteína E de DEN3 ou aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4 é fornecida aqui como a quimera WN/DEN3 das SEQ ID NOs: 17 e 18.

IV. Composições e Métodos para Desencadear uma resposta Imune

[0089] São fornecidos aqui métodos de desencadear uma resposta imune em um indivíduo pela administração de um ou mais vírus inativados que incluem um ácido nucleico quimérico de WN/DEN (tal como uma ou mais das quimeras de ácido nucleico descritas) ao indivíduo. Em um exemplo particular, o indivíduo é um humano. O vírus inativado que compreende a quimera de ácido nucleico de WN/DENV é usado para produzir uma resposta imune que previne ou inibe a infecção por um DENV (tal como DENV1, DENV2, DENV3 ou DENV4) e pode também ser usado para tratar ou inibir a infecção por DENV.

[0090] Em alguns exemplos, o método inclui ainda selecionar um indivíduo que precisa de imunidade intensificada contra DENV. Indivíduos que precisam de imunidade intensificada contra DENV incluem indivíduos que estão em risco de ter a infecção por DENV, indivíduos que foram expostos a um ou mais DENV e indivíduos que estão infectados por DENV. Residentes ou viajantes por países ou regiões onde DENV é endêmico estão em risco de contrair o DENV. Fatores adicionais que contribuem para o risco de infecção por DENV incluem as características da área, a presença de DENV na área, exposição aos mosquitos e ausência de medidas preventivas (tais como repelente de inseto).

[0091] Em alguns exemplos, um, dois, três, quatro ou mais vírus quiméricos WN/DEN inativados são administrados ao indivíduo. Se dois ou mais vírus inativados são administrados, eles podem ser administrados separadamente (por exemplo, em composições imunogênicas separadas que são administradas ao indivíduo dentro de um curto período de tempo) ou elas podem ser administradas substancialmente simultaneamente (por exemplo, em uma única composição imunogênica que inclui dois ou mais vírus quiméricos inativados). Em alguns exemplos, os vírus WN/DEN1, WN/DEN2, WN/DEN3 e WN/DEN4 são administrados a um indivíduo separadamente (por exemplo, sequencialmente, em qualquer ordem) ou simultaneamente (em uma única composição imunogênica (multivalente)). As quimeras de WN/DEN inativadas podem incluir qualquer combinação daquelas aqui descritas e/ou aquelas descritas na Pat. U.S. No. 8.715.689 (incorporada aqui por referência em sua totalidade). Em um exemplo particular, quatro vírus quiméricos inativados de WN/DEN são administrados a um indivíduo (sequencialmente ou simultaneamente), por exemplo, um vírus quimérico inativado de WN/DEN1 com uma junção tipo I (tal como a quimera de WN/DEN1 fornecida aqui como as SEQ ID Nos. 11 e 12), um vírus quimérico inativado de WN/DEN2 com uma junção tipo II e uma substituição Ans-Asp na posição de aminoácido 203 da proteína E (tal como a quimera de WN/DEN2 fornecida aqui nas SEQ ID NOs: 13 e 14), um vírus quimérico de WN/DEN3 inativado com uma junção tipo II ou tipo III e uma substituição de His-Leu na posição de aminoácido 345 da proteína E (tal como a quimera de WN/DEN3 fornecida aqui nas SEQ ID NOs: 15 - 18) e um vírus quimérico inativado de WN/DEN4 com uma junção tipo I e uma substituição de Thr-Pro na posição de aminoácido da proteína C que corresponde ao aminoácido 101 da proteína C (tal como a quimera de WN/DEN4 fornecida aqui nas SEQ ID NOs: 19 e 20). Em outros exemplos, dois ou três vírus quiméricos inativados de WN/DENV são administrados a um indivíduo (sequencialmente ou simultaneamente), por exemplo, um vírus quimérico inativado de WN/DEN3 com uma junção tipo II ou tipo III e uma substituição de His-Leu na posição de aminoácido 345 da proteína E (tal como as quimeras de WN/DEN3 fornecidas aqui como as SEQ ID Nos. 15-18) e um vírus quimérico inativado de WN/DEN4 com uma junção tipo I e uma substituição Thr-Pro na posição de aminoácido que corresponde ao aminoácido 101 da proteína C (tal como a quimera de WN/DEN4 fornecida aqui nas SEQ ID NOs: 19 e 20). A administração de um, dois ou três vírus quiméricos inativados pode ser particularmente útil quando os vírus inativados são usados como reforço para uma vacina de DENV vivo atenuado, por exemplo, para obter uma imunidade mais equilibrada para todos os quatro sorotipos de DENV (veja o Exemplo 7).

[0092] Em alguns exemplos, o vírus quimérico é inativado, por exemplo, usando a inativação química, inativação em alta pressão, irradiação ultravioleta ou gama ou qualquer combinação dessas. Por exemplo, a inativação química inclui expor o vírus a um ou mais de formaldeído (por exemplo, formalina), β-propionolactona, aziridinas, peróxido de hidrogênio, solventes orgânicos, tensoativos (por exemplo, sarkosyl) ou detergentes não iônicos (por exemplo, Triton®-X100) ou ácido ascórbico por um tempo suficiente para inativar o vírus. Em um exemplo, o vírus é inativado usando um agente oxidante tal como o peróxido de nitrogênio, por exemplo, o tratamento com cerca de 0,05 a 5% de peróxido de hidrogênio (tal como cerca de 0,1 a 1%, cerca de 0,5 a 3%, cerca de 1 a 5%) em temperatura ambiente por cerca de 1 a 24 horas (tal como cerca de 1 a 16 horas, cerca de 2 a 12 horas, cerca de 4 a 8 horas, cerca de 1 a 6 horas, por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 16 horas ou cerca de 24 horas). Veja, por exemplo, WO 2008/039171; Amanna et al., Nat. Med. 18:974979, 2012; Pinto et al., J. Virol. 87:1926-1936, 2013. Aquele versado na técnica pode determinar as concentrações ótimas de peróxido de hidrogênio e as condições para a inativação de diferentes títulos ou volumes virais de partida.

[0093] Em um exemplo particular, não limitante, o vírus (tal como uma ou mais quimeras de WN/DENV descritas aqui) é tratado com cerca de 0,001 a 0,5% de sarkosyl (tal como cerca de 0,005-0,4%, cerca de 0,025-0,2% ou cerca de 0,01-0,4% de sarkosyl, por exemplo, cerca de 0,005%, cerca de 0,01%, cerca de 0,025%, cerca de 0,05%, cerca de 0,1%, cerca de 0,2%, cerca de 0,3%, cerca de 0,4% ou cerca de 0,5% de sarkosyl) em cerca de 20-37°C (por exemplo, cerca de 2037°C, cerca de 22-30°C, cerca de 30-37°C, ou cerca da temperatura ambiente) por um tempo suficiente para inativar o vírus (tal como cerca de 15 minutos a 3 horas, cerca de 30 minutos a 2 horas, cerca de 1-2 horas ou cerca de 30 minutos a 90 minutos). Aquele versado na técnica pode determinar as concentrações de detergente ótimas e as condições para a inativação de outros detergentes e/ou títulos ou volumes virais de partida diferentes, por exemplo, usando os métodos descritos no Exemplo 5. Em alguns exemplos, tempos de inativação mais longos são usados em temperaturas menores (tal como a temperatura ambiente) do que as temperaturas mais elevadas (tal como 37°C). Aquele versado na técnica pode determinar os tempos de inativação com base na temperatura de tratamento e na experimentação de rotina.

[0094] Em outros exemplos, o vírus é exposto a uma fonte de luz ultravioleta (tal como uma fonte de luz UV-C de 254 nm) ou a uma fonte radioativa (tal como cobalto 60) por um tempo suficiente para inativar o vírus. Em alguns exemplos, o vírus (tal como uma ou mais quimeras de WN/DENV aqui descritas) é exposto a cerca de 350-700 μW/cm2 (tal como cerca de 350-680 μW/cm2, cerca de 400-670 μW/cm2, cerca de 670-685 μW/cm2 ou cerca de 350 μW/cm2, cerca de 670 μW/cm2 ou cerca de 680 μW/cm2) de UV-254 nm por cerca de 10 minutos a 2 horas (tal como cerca de 15 minutos a 1 hora, cerca de 15-45 minutos, cerca de 1-2 horas, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora ou mais). Em outros exemplos, o vírus (tal como uma ou mais quimeras de WN/DENV aqui descritas) é exposto a cerca de 0,1-200 mW/cm2 (tal como cerca de 0,5-5 mW/cm2, cerca de 1-10 mW/cm2, cerca de 10-50 mW/cm2, cerca de 25-100 mW/cm2, cerca de 100-200 mW/cm2, por exemplo, cerca de 2 mW/cm2, cerca de 5 mW/cm2, cerca de 10 mW/cm2, cerca de 50 mW/cm2, cerca de 100 mW/cm2, cerca de 150 mW/cm2, ou cerca de 200 mW/cm2) for cerca de 10 minutos a 8 horas (tal como cerca de 30 minutos a 1 hora, cerca de 1-6 horas, cerca de 2-4 horas, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas). Em alguns exemplos, o vírus é mantido resfriado (por exemplo a 4°C ou sobre gelo) durante o tratamento com UV. Em exemplos particulares, volumes pequenos (tal como menos do que cerca de 1 ml) são tratados a 670 μW/cm2 por 15 minutos ou 350 μW/cm2 por 45 minutos e volumes maiores (tal como cerca de 1 ml ou mais, por exemplo, cerca de 2-5 ml, cerca de 1-3 ml, ou mais) são tratados a 680 μW/cm2 por 45 minutos ou mais. Aquele versado na técnica pode determinar a potência de UV ótima e as condições para a inativação de outros volumes ou de títulos virais de partida diferentes, por exemplo, usando os métodos descritos no Exemplo 5.

[0095] Em exemplos adicionais, o vírus é inativado pela inativação fotoquímica. Os métodos incluem a exposição do vírus à radiação UV (365 nm) na presença de químicos fotoativáveis, tais como 1,5- indonaftilazida (INA), 4’-aminometil-trioxsalen (AMT), 8-metoxipsoralen (MOP), 4,5’,8-trimetilpsoralen (TMP), ou psoralen. Veja, por exemplo, Raviprakash et al., Hum Vaccines Immunother. 9:2336-2341, 2013; Raviv et al., J. Virol. 82:4612-4619, 2008; Sharma et al., Vaccine 29:953959, 2011; Hanson et al., J. Gen. Virol. 40:345-358, 1978. Em exemplos particulares, o vírus (tal como uma ou mais quimeras de WN/DENV aqui descritas) é exposto a cerca de 0.1-200 mW/cm2 (tal como cerca de 0,11 mW/cm2, cerca de 0,5-5 mW/cm2, cerca de 1-100 mW/cm2, cerca de 100-200 mW/cm2, por exemplo, cerca de 2 mW/cm2, cerca de 100 mW/cm2, cerca de 145 mW/cm2, cerca de 180 mW/cm2, ou cerca de 200 mW/cm2) de UV-365 nm por cerca de 1 minuto a cerca de 6 horas (tal como cerca de 2-15 minutos, cerca de 5-30 minutos, cerca de 15 minutos a 1 hora, cerca de 15-45 minutos, cerca de 1-2 horas, cerca de 90 minutos a 4 horas, cerca de 2-6 horas, cerca de 2 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, ou mais) na presença de INA, ANT, MOP, TMP, ou psoralen. Aquele versado na técnica pode determinar a potência de UV ótima e as condições para a inativação usando compostos em particular, volumes de vírus ou títulos virais de partida descritos no Exemplo 5.

[0096] Depois que o vírus quimérico foi inativado, o vírus inativado pode ser purificado. Os métodos de purificação incluem a filtração ou diafiltração, cromatografia (por exemplo, cromatografia por exclusão de tamanho, troca de íon ou imunoafinidade), centrifugação com gradiente de densidade, centrifugação com coxim de glicerol ou com meio sulfato Cellufine®. Em outros exemplos, o vírus quimérico é purificado antes da inativação. Se o vírus purificado está inativado, uma etapa adicional de purificação pode ser incluída depois da inativação, por exemplo, para remover o agente de inativação química (tal como um detergente), por exemplo, usando a filtração ou troca de tampão. As preparações de quimeras de WN/DENV inativadas purificadas pode incluir o vírus completo inativado ou partículas inativadas semelhantes ao vírus.

[0097] Em alguns exemplos, as quimeras são purificadas (por exemplo, através da precipitação com polietileno glicol 8000 (PEG8000) e centrifugação com gradiente de densidade, centrifugação com coxim de glicerol ou com meio sulfato Cellufine®) antes da inativação. Os vírus inativados podem ser adicionalmente purificados pela filtração para remover o reagente de inativação, por exemplo, se necessário. Em exemplos particulares, o detergente (tal como sarkosyl) é removido depois da inativação pela filtração, colunas rotatórias de remoção de detergente (tais como os kits Millipore Detergent-OUT™), diálise ou cromatografia de troca de íon. O produto final pode ser testado quanto a capacidade infecciosa em culturas celulares (por exemplo, como descrito nos Exemplos 1 e 2), antigenicidade (por exemplo, por ELISA, como discutido na Seção VI abaixo) e/ou concentração de proteína (por exemplo, pelo ensaio de proteína de Bradford ou do ácido bicinchonínico).

[0098] Um ou mais vírus inativados purificados que compreendem quimeras de ácido nucleico de WN/DEN (por exemplo, na forma de uma composição farmacêutica ou imunogênica) são administrados a um indivíduo por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma composição em um indivíduo. Métodos de administração incluem, mas não são limitados a intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, parenteral, intravenoso, subcutâneo, vaginal, retal, intranasal, por inalação ou oral. A administração parenteral, tal como a administração subcutânea, intravenosa ou intramuscular, é geralmente obtida pela injeção. Injetáveis podem ser preparados de formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão líquida antes da injeção ou como emulsões. As soluções e suspensões injetáveis podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito. A administração pode ser sistêmica ou local.

[0099] As composições imunogênicas são administradas de qualquer maneira adequada, tal como com veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composição. Veja, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21st Edition (2005). Consequentemente, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente descrição.

[00100] As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas e não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo salina e meio tamponado. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes.

[00101] Em alguns exemplos, a composição aqui descrita inclui um ou mais adjuvantes. Em outros exemplos, um adjuvante não está incluído na composição, mas é separadamente administrado ao indivíduo (por exemplo, em combinação com uma composição aqui descrita) antes, depois ou substancialmente simultaneamente com a administração de uma ou mais das composições aqui descritas. Os adjuvantes são agentes que aumentam ou intensificam a resposta imune em um indivíduo tratado com um antígeno, comparada com a administração do antígeno na ausência do adjuvante. Um exemplo, de um adjuvante é um sal de alumínio, tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e potássio ou hidroxifosfato de alumínio. Outros adjuvantes incluem adjuvantes biológicos tais como as citocinas (por exemplo, IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α ou IFN-Y), fatores do crescimento (por exemplo, GM-CSF ou G-CSF), uma ou mais moléculas tais como OX-40L ou 4-1 BBL, oligonucleotídeos imunoestimuladores (por exemplo, oligonucleotídeos de CpG). agonistas do receptor semelhante a Toll (por exemplo, agonistas de TLR2, TLR4, TLR7/8 ou TLR9) e lipopolissacarídeos bacterianos ou seus derivados (tais como 3D-MPL). Adjuvantes adicionais incluem emulsões em óleo e água, esqualeno ou outros agentes. Em um exemplo, o adjuvante é uma mistura de detergentes estabilizadores, agente que forma micela e um óleo disponível sob o nome de PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA). Aquele versado na técnica pode selecionar um adjuvante adequado ou combinação de adjuvantes a serem incluídos nas composições aqui descritas ou administradas a um indivíduo em combinação com as composições aqui descritas.

[00102] A administração é obtida com doses únicas ou múltiplas. A dose administrada a um indivíduo no contexto da presente descrição deve ser suficiente para induzir uma resposta terapêutica benéfica em um indivíduo ao longo do tempo ou para inibir ou prevenir a infecção por DENV. A dose necessária variará de indivíduo para indivíduo dependendo da espécie, idade, peso e condição geral do indivíduo, severidade da infecção a ser tratada, a composição imunogênica particular a ser usada e seu modo de administração. Uma dose apropriada pode ser determinada por aquele versado na técnica usando apenas a experimentação de rotina. Em alguns exemplos, a dose de cada vírus inativado (tal como uma composição imunogênica) administrada ao indivíduo é de cerca de 0,1 μg a cerca de 100 μg. Por exemplo, a dose da composição imunogênica pode conter pelo menos 0,1 μg, pelo menos 0,2 μg, pelo menos 0,25 μg, pelo menos 0,3 μg, pelo menos 0,33 μg, pelo menos 0,4 μg, pelo menos 0,5 μg, pelo menos 1,0 μg, pelo menos 2,0 μg, pelo menos 3,0 μg, pelo menos 5,0 μg ou pelo menos 10,0 μg, (ou qualquer quantidade entre 0,1 and 10,0 μg) de cada sorotipo do vírus. Em outros exemplos, a dose da composição imunogênica contém não mais do que 100 μg de cada sorotipo do vírus, por exemplo, não mais do que 90 μg, 80 μg, 75 μg, 70 μg, 60 μg, ou 50 μg, 40 μg, 30 μg, 20 μg, 10 μg (ou qualquer quantidade entre 10 e 100 μg) de cada sorotipo do vírus.

[00103] Imunizações repetidas podem ser necessárias para produzir uma resposta imune em um indivíduo. Quando administradas em múltiplas doses, as doses de reforço são administradas em vários intervalos de tempo, tais como semanas ou meses a anos. Em outros exemplos, os vírus quiméricos de WN/DEN quiméricos são usados como um reforço depois da administração de uma ou mais vacinas de DEN (por exemplo, vacinas recombinantes atenuadas vivas descritas na Pat. U.S. No. 7.094.411). Em um exemplo, um indivíduo é inoculado com uma dose inicial da vacina de DENV (tal como uma composição de DENV tetravalente atenuada) seguida por pelo menos uma dose de reforço de um ou mais (tais como 1, 2, 3 ou 4) vírus quiméricos de WN/DENV inativados aqui descritas. Em alguns exemplos, a dose de reforço é administrada cerca de 14, 30, 60, 90 ou mais dias depois da administração da dose inicial. Reforços adicionais (de quimeras de DENV atenuados vivos ou de WN/DENV inativado) podem ser administrados em pontos de tempo subsequentes, se determinado ser necessário ou benéfico. Os protocolos de imunização (tais como a quantidade de imunógeno, número de doses e intervalo de administração) podem ser determinados experimentalmente, por exemplo, pelo uso de modelos animais (tais como camundongos ou primatas não humanos), seguidos pelo teste clínico em humanos.

V. Preparação de Vírus

[00104] Métodos de cultura celular, replicação viral, titulação e placa e purificação de vírus ou de partícula de vírus são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Obijeski et al., J. Gen. Virol. 22:21-33, 1974; Beaty et al., Diagnostic Procedures for Viral, Ricksettial, and Chlamydial Infections, pp. 189-212, Lennette et al. (eds.), 7th Edition, American Public Health Association, 1995; Virology Methods Manual, Mahy and Kangro (eds.), Academic Press, 1996.

[00105] Os vírus quiméricos da presente invenção podem ser feitos usando métodos padronizados conhecidos e reconhecidos na técnica. Por exemplo, as moléculas de RNA que correspondem ao genoma de um vírus ou um vírus quimérico podem ser introduzidas em células primárias, embriões de galinha ou linhagens celulares diploides, a partir das quais (ou dos sobrenadantes das quais) a progênie de vírus pode ser purificada. Outro método que pode ser usado para produzir os vírus emprega células heteroploides tais como as células Vero (Yasumura et al., Nihon Rinsho 21:1201-1215, 1963) ou células C6/36. Nesse método, uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de RNA) que corresponde ao genoma de um vírus ou vírus quimérico é introduzida nas células heteroploides e o vírus é coletado do meio no qual as células foram cultivadas. O vírus coletado pode então ser concentrado (por exemplo, pela precipitação com PEG 8000, uso de ultrafiltração usando um filtro que possui um ponto de corte de peso molecular de, por exemplo 50 a 500 kDa (por exemplo, filtro de ultracentrifugação Amicon, cassete de filtração de fluxo tangencial ou cassete de ultrafiltração Pellicon-2 Mini), diafiltrado contra MEME com fenol red ou FBSm formulado pela adição de lactose e filtrado em um recipiente estéril. Detalhes de um método de produção de vírus são fornecidos no WO 03/060088. Os vírus são opcionalmente purificados mais tarde, por exemplo, pela centrifugação com gradiente de densidade, centrifugação em coxim de glicerol e/ou cromatografia com meio de sulfato Cellufine® (veja, por exemplo, Exemplo 5).

VI. Detecção de Anticorpos para Flavivírus

[00106] A presente descrição fornece adicionalmente um método de detecção de um anticorpo reativo para flavivírus em uma amostra (tal como uma amostra de um indivíduo, por exemplo, uma amostra de sangue), incluindo contatar a amostra com um vírus quimérico dessa descrição sob condições através das quais um complexo de anticorpo/polipeptídeo pode se formar; e detectar a formação do complexo, detectando dessa maneira o anticorpo para o flavivírus em uma amostra. Uma vantagem das quimeras de WN/DEN descritas é que elas se desenvolvem rápido e em títulos mais altos e produzem placas maiores e mais bem definidas do que o DENV de tipo selvagem. Portanto, a descrição fornece métodos de detecção de um anticorpo reativo para DENV em uma amostra que são mais rápidos e mais específicos do que os métodos que usam DENV do tipo selvagem (veja, por exemplo, as figuras 4, 5A e 5B). Por exemplo, a especificidade do ensaio (por exemplo, para distinguir entre os sorotipos de DENV) pode ser aperfeiçoada pelo uso das quimeras descritas que incluem substituições de aminoácido na proteína E o que reduz a reatividade cruzada do anticorpo.

[00107] Os métodos de detecção de anticorpos reativos para flavivírus em uma amostra são realizados, por exemplo, pelo contato de um fluido ou amostra de tecido de um indivíduo com um vírus quimérico dessa descrição e detectar a ligação de pelo menos um polipeptídeo codificado pelo vírus para o anticorpo. Uma amostra de fluido desse método inclui qualquer fluido biológico que possa conter o anticorpo, tal como um fluido cérebro-espinhal, sangue, bile, plasma, soro, saliva e urina. Outros exemplos possíveis de fluidos corporais incluem esputo, muco e semelhantes.

[00108] Em um exemplo, a presença de um anticorpo para DENV é detectada a partir de um indivíduo utilizando um flavivírus quimérico descrito em um teste de neutralização com redução de placa (PRNT) ou teste de neutralização com redução de microfoco (mFRNT). No ensaio PRNT ou mFRNT, uma amostra é contatada com um vírus codificado por flavivírus quimérico aqui descrito. Uma cultura celular adequada (tal como de células Vero, C6/36 ou BHK) é inoculada com uma mistura de vírus-amostra para infectar as células. A cultura celular é incubada sob condições suficientes para permitir a formação da placa ou microfoco e o número de placas ou microfocos formados em uma cultura inoculada com a mistura de vírus quimérico-amostra é comparado com o número de placas ou microfocos formados em uma cultura de controle (tais como células inoculadas apenas com vírus). Uma redução no número de placas ou de microfocos na cultura celular inoculada com a mistura de vírus quimérico-amostra quando comparada com uma cultura de controle (por exemplo, uma diminuição de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% comparada com a amostra de controle) indica a presença de um anticorpo neutralizante para DENV na amostra.

[00109] Imunoensaios enzimáticos tais como ensaio de imunofluorescência, ELISA e immunoblotting podem ser facilmente adaptados para obter a detecção de anticorpos contra o flavivírus em uma amostra de acordo com os métodos dessa descrição. Um método ELISA eficaz para a detecção dos anticorpos inclui, por exemplo: 1) ligar o vírus quimérico ou as partículas de vírus a um substrato; 2) contatar o vírus quimérico ligado com um fluido ou amostra de tecido que contém o anticorpo; 3) contatar o acima com um anticorpo secundário que seja reativo com o anticorpo ligado, ligado a uma porção detectável (por exemplo, enzima peroxidase de rábano ou enzima fosfatase alcalina); 4) contatar o acima com o substrato para a enzima; 5) contatar o acima com um reagente de cor; e 6) observar/medir a alteração ou o desenvolvimento de cor.

[00110] A porção detectável permite a detecção visual de um precipitado ou uma alteração de cor, detecção visual por microscopia (tal como um depósito cromogênico ou fluorescência) ou detecção automatizada pela espectrometria, medição radiométrica e semelhantes. Exemplos de porções detectáveis incluem a fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, Cy5 e Cy3 (para microscopia de fluorescência e/ou imunoensaio baseado em microesfera), peroxidase de rábano (para detecção por microscopia óptica ou eletrônica e bioquímica), botina-estreptavidina (para microscopia óptica e eletrônica) e fosfatase alcalina (para detecção bioquímica pela mudança de cor).

[00111] Outra técnica imunológica que pode ser útil na detecção de anticorpos para flavivírus usa mAbs para a detecção de anticorpos especificamente reativos com polipeptídeos de flavivírus em um ensaio de inibição competitiva. Resumidamente, uma amostra é contatada com um flavivírus quimérico ou partícula de vírus dessa invenção que está ligada a um substrato (por exemplo, uma placa de 96 poços). O excesso da amostra é exaustivamente removido por lavagem. Um mAb marcado (por exemplo, ligado a enzima, fluorescente, radioativo, etc.) é então contatado com quaisquer complexos de polipeptídeo-anticorpo previamente formados e a quantidade de mAb que se liga é medida. A quantidade de inibição da ligação do mAb é medida em relação a um controle (sem anticorpo), permitindo a detecção e a medida do anticorpo na amostra. O grau de inibição da ligação do mAb pode ser um ensaio muito específico para detectar a variedade ou cepa de flavivírus em particular, quando baseada na especificidade de ligação do mAb para uma variedade ou cepa particular de flavivírus. mAbs também podem ser usados para a detecção direta de flavivírus em células, por exemplo, por ensaios de imunofluorescência de acordo com métodos padronizados.

[00112] Como um exemplo adicional, um teste de microaglutinação pode ser usado para detectar a presença de anticorpos para o flavivírus em uma amostra. Resumidamente, esferas de látex, células vermelhas sanguíneas ou outras partículas aglutináveis são revestidas com um flavivírus quimérico ou partículas de vírus dessa descrição e misturadas com uma amostra, tal que os anticorpos na amostra que são especificamente reativos com o antígeno reticulam com o antígeno, causando a aglutinação. Os complexos de antígeno-anticorpo aglutinados formam um precipitado, visível a olho nu ou mensurável pelo espectrofotômetro.

[00113] Em ainda outro exemplo, um imunoensaio baseado em microesfera pode ser usado para detectar a presença de anticorpos para o flavivírus em uma amostra. Resumidamente, microesferas são revestidas com um flavivírus quimérico ou partículas de vírus dessa descrição e misturadas com uma amostra, tal que os anticorpos na amostra que são especificamente reativos com o antígeno codificado pelo vírus se ligam ao antígeno. Os complexos de esfera ligada ao vírus- anticorpo são deixados reagir com um anticorpo antiespécie marcado com um corante fluorescente (tal como IgM de cabra anti-humano marcada com FITC) e são medidos usando um leitor de microesfera (tal como um instrumento Luminex®).

VII. Avaliação da Eficácia da Candidata à Vacina

[00114] Os flavivírus quiméricos aqui descritos podem ser usados nos métodos para avaliar a eficácia de candidatas à vacina, tais como candidatas à vacina contra DENV. Várias candidatas à vacina contra DENV foram desenvolvidas previamente, tais como cepas atenuadas para vacina, por exemplo, DEN2 PDK-53, DEN1 PDK-13, DEN3 PGMK- 30/FRhL-3 e DEN4 PDK-48) e construtos quiméricos de DENV (veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 7.094.411). Entretanto, atualmente não um modelo de camundongo ideal para a avaliação de candidatas a vacina contra DENV, por que camundongos imunocompetentes mestiços não sucumbem com a inoculação de DENV do tipo selvagem e não geram viremia suficiente para medir um efeito protetor de uma candidata à vacina.

[00115] Em alguns exemplos, a eficácia de candidatas à vacina contra DENV é testada pela inoculação de indivíduos (por exemplo, camundongos ou primatas não humanos (tal como macacos rhesus)) com uma candidata à vacina, seguida pela inoculação com uma cepa de DENV virulenta. As quimeras de WN/DENV descritas são virulentas e/ou geram viremia significativa em camundongos não imunizados, portanto elas podem ser usadas como a dose de ataque em indivíduos previamente inoculados.

[00116] Em uma modalidade particular, um grupo de indivíduos (tais como camundongos) é inoculado com uma candidata à vacina contra DENV (por exemplo, cepa PDK-53 de DENV). A administração da cepa do vírus da candidata à vacina pode ser realizada por qualquer meio adequado, incluindo a injeção parenteral (tal como a injeção intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular), pela injeção em ovo nas aves, oralmente e pela aplicação tópica do vírus (tipicamente realizada na formulação farmacêutica) a superfície da vi aérea. A aplicação tópica do vírus a uma superfície das vias aéreas pode ser realizada pela administração intranasal (por exemplo, pelo uso de um conta-gotas, cotonete ou inalador que deposita uma formulação farmacêutica por via intranasal) ou pala administração por inalação, tal como pela criação de partículas respiráveis de uma formulação farmacêutica (incluindo partículas sólidas e partículas líquidas) que contenham o vírus como uma suspensão em aerossol e fazendo com que o indivíduo inale as partículas respiráveis. Em um exemplo particular, os indivíduos são inoculados por via intraperitoneal com o vírus da candidata à vacina em um veículo tal como salina tamponada com fosfato. Inoculações múltiplas (tais como reforços) podem ser realizadas, separadas por um período de tempo adequado, tal como pelo menos duas semanas, quatro semanas, oito semanas, doze semanas ou mais.

[00117] Os indivíduos que foram vacinados com a candidata à vacina são inoculados com uma dose letal ou virulenta de uma quimera de WN/DEN aqui descrita depois de um período de tempo adequado para permitir que a imunidade baseada na vacinação se desenvolva (tal como pelo menos duas semanas, quatro semanas, oito semanas, doze semanas ou mais). A dose de ataque é administrada por qualquer via adequada incluindo aquelas acima e, opcionalmente, é administrada pela mesma ou por uma via diferente como a dose de vacinação. Depois da dose de ataque, os indivíduos são monitorados quanto ao desenvolvimento de morbidade (tal como febre, erupção cutânea, vomito, perda de apetite, pele áspera, encurvamento, letargia, movimento irritável ou desequilibrado, desidratação, perda de peso ou sinais de paralisia) ou mortalidade. Adicionalmente, o sangue é coletado dos indivíduos depois da inoculação para medir os níveis de viremia. Uma diminuição nos níveis de viremia, sinais de morbidade e/ou mortalidade comparados com um grupo de indivíduos de controle que não são inoculados com a candidata à vacina (por exemplo, uma diminuição de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% em uma população de teste vacinada comparada com uma população de controle) indica a eficácia da candidata à vacina.

[00118] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certas características particulares e/ou modalidades. Esses exemplos não devem ser considerados limitar a descrição às características ou modalidades particulares descritas.

Exemplo 1 Construção de Vírus Quimérico

[00119] Esse exemplo descreve a construção de vírus do Oeste do Nilo/Dengue quiméricos que incluem os genes de prM e E de DENV em um arcabouço de WNV. O vírus WN/DENV2 foi previamente descrito na Pat. U.S. No. 8.715.689 que está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Métodos

[00120] Usando a genética reversa, um sistema de clone infeccioso com dois plasmídeos foi desenvolvido para construir o WN/DENV quimérico para todos os 4 sorotipos de vírus da dengue (DENV-1 a 4). Essas quimeras contêm um vetor de replicação do vírus do Oeste do Nilo (WNV) que expressa os genes pré-membrana (prM) e do envelope (E) de DENV. A proteína prM é uma proteína chaperona importante para o processamento da proteína E e a montagem do envelope viral nas células e um peptídeo localizado entre os genes do capsídeo (C) e de prM é a sequência sinal (ss) para o processamento correto da proteína prM. A C(ss) é muito diferente entre WNV e DENV. A extensão da C(ss) de WNV é de 18 aminoácidos, mas ela é de 14 aminoácidos para DENV. Devido as diferenças da C(ss) entre WNV e DENV, estratégias múltiplas de junção foram investigadas para obter quimeras com crescimento aceitável e estabilidade em células de mamífero.

[00121] A estratégia inicial para os construtos de quimera foi incorporar a SS de DENV (14 aminoácidos) para otimizar o processamento da proteína para a prM de DENV nas quimeras (figura 1B e Tabela 6, junção tipo I). Essa estratégia foi previamente descrita na Pat. U.S. No. 8.715.689, incorporada aqui por referência. Usando essa abordagem, vírus quiméricos viáveis para todos os quatro sorotipos foram transfectados para células C6/36 foram produzidos, mas a quimera WN/DENV-3 replicou significativamente menos eficientemente (<104 pfu/ml no dia 8 p.i.) do que os outros três sorotipos das quimeras em cultura celular (geralmente >106-107 pfu/ml no dia 6-8 p.i.) ou em camundongos.

[00122] Para otimizar adicionalmente as quimeras de WN/DENV, estratégias de junção quimérica adicionais forma testadas. Quatro sítios de junção adicionais em C(ss) na quimera WN/DENV-3 foram testadas e quimeras infecciosas foram recuperadas a partir de três das quatro novas estratégias de junção. Duas dessas estratégias (junção tipo II e III; figuras 1C e 1D, respectivamente e Tabela 6) resultaram em quimeras que replicaram significativamente melhor do que a quimera WN/DENV-3 tipo I e similar aos outros três sorotipos de quimeras tipo I em culturas celulares e camundongos. Quimeras da estratégia de junção tipo II continham os 6 aminoácidos da C(ss) N terminal de WNV seguida pelos 12 aminoácidos da C(ss) C terminal de DENV-3. A C(ss) da estratégia tipo III continha todos os 18 AA da C(ss) de WNV.

[00123] Os clones de cDNA quiméricos manipulados em 5’ (contendo 5’NCR-C-prM-E) de cada quimera foi ligado in vitro com o clone de cDNA 3’ de WNV (contendo NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5-3’NCR) para gerar o cDNA genômico de extensão completa do vírus quimérico. O RNA genômico quimérico viral foi gerado pela transcrição in vitro do cDNA de extensão completa e transfectado para células C6/36 ou Vero pela eletroporação como descrito previamente. Vírus quiméricos derivados das células transfectada foram coletados no dia 3-7 pós- transfecção e amplificados peça passagem uma vez em células C6/36 para gerar sementes dominantes do vírus para a caracterização do vírus. Essas sementes tiveram o genoma sequenciado para verificar a exatidão do genoma do RNA. A cinética de crescimento dos vírus nas células C6/36 e Vero também foram analisados para avaliar sua eficiência de replicação. Essas quimeras replicaram muito bem e significativamente mais rápido do que os DENV de tipo selvagem nas células C6/36, mas alguns desses vírus quiméricos replicaram muito pouco e/ou eram instáveis nas células Vero de mamíferos.

[00124] Para aperfeiçoar o crescimento viral nas células Vero, as quimeras foram passadas com crescimento subótimo em células Vero até 10 vezes para obter as mutações adaptadas a célula que melhoraram o crescimento e a estabilidade genética das quimeras em células de mamífero. As titulações de vírus e o sequenciamento genômico das quimeras depois de passagens seriadas nas células Vero foram conduzidos para identificar mutações potenciais que intensifiquem a capacidade das quimeras e a estabilidade nas células de mamíferos. Substituições de aminoácidos específicos determinadas serem eficazes na adaptação em célula Vero foram então manipuladas nos construtos quiméricos pela clonagem por mutagênese e os vírus quiméricos modificados eram derivados das células C6/36 como descrito acima. Esses vírus quiméricos modificados foram analisados quanto a cinética do crescimento em células Vero e capacidade de infecção em camundongos, para confirmar seu crescimento aperfeiçoado em células de mamífero e capacidade de infecção em camundongos. Sequências do genoma das quimeras modificadas também foram analisadas para confirmar sua estabilidade genética em células Vero.Tabela 6. Organização de quimeras de WN/DEN com diferentes tipos de juncosContinuaçãoBlocos sombreados indicam a sequência de WNV; blocos não sombreados indicam a sequência de DEN

Resultados

[00125] WN/DENV-1: Nenhuma substituição de aminoácido foi necessária para a quimera de WN/DENV com uma junção do tipo I (denominada WN/DENV-1; SEQ ID NOs: 11 e 12) para replicar bem em ambos os tipos celulares e ela teve estabilidade genética aceitável em ambos os tipos celulares. Portanto, WN/DENV-1 com sítios de junção do tipo I usada diretamente sem modificação genética posterior. Entretanto, a mutação no resíduo 347 da proteína E (de Gln para Leu) aperfeiçoou a capacidade de WN/DENV-1 (Tabela 8). Essa mutação evoluiu em uma semente de vírus específica para WN/DENV-1 amplificada em células Vero, que tinha uma substituição no aminoácido 106 da proteína E (quimera manipulada com substituição Gly-E106- Leu). A mutação Gly-E106-Leu manipulada nas quimeras tipicamente faz com que elas repliquem menos eficientemente em células Vero, tal que a mutação E347 parece mais importante para a habilidade do mutante G106L de WN/DENV-1 do que WN/DENV-1 sem a mutação G106.

[00126] WN/DENV-2: Dados prévios mostraram que WN/DENV-2 sem a estratégia da junção tipo I replicou bem em células C6/36, mas não em células Vero, embora múltiplas substituições de aminoácido tenham sido observadas em WN/DENV-2 durante a adaptação da célula Vero. O estudo da mutagênese adicional mostrou que a substituição Asn-E203-Asp sozinha é suficiente para intensificar a habilidade do vírus quimérico (denominado WN/DENV-2 E203; SEQ ID NOs: 13 e 14). Essa quimera está descrita em detalhes na Pat. U.S. No. 8.715.689. Outras mutações não pareceram ter efeito significativo sobre a habilidade da quimera, mas combinações de algumas dessas mutações também aumentam a habilidade da quimera em células Vero.

[00127] WN/DENV-3: Como discutido acima, o uso da estratégia da junção tipo I não produziu quimeras de WN/DENV-3 robustas em qualquer tipo de célula. WN/DENV-3 original sem qualquer modificação atingiu o menor pico de título (<7 log10 pfu/ml) do que os outros três sorotipos (geralmente 8 ou 9 log10 pfu/ml) de quimera em células C6/36. Essa quimera WN/DENV-3 também teve o menor crescimento nas células Vero quando comparada com os outros sorotipos de quimera. Múltiplas mutações de aminoácidos evoluíram durante as tentativas para adaptar o vírus em células Vero (Tabela 7). Múltiplas versões de WN/DENV-3 com várias combinações dessas mutações (por exemplo, C106/prM22/E395, C106/prM22/prM154, C106/prM154/E395 e C106/prM22/prM154/E395) também foram manipuladas para aperfeiçoar a habilidade das quimeras. Embora alguns efeitos benéficos dessas mutações fossem observados em cultura celular (títulos de vírus aumentaram significativamente em culturas de célula C6/36, mas apenas discretamente nas células Vero), essas substituições não foram suficientes para estabilizar as quimeras nas células Vero (mutações adicionais continuaram a evoluir a partir da cultura de célula Vero das quimeras). Adicionalmente, nenhuma dessas modificações resultou em quimeras satisfatórias que efetivamente infectaram os camundongos AG129 (um modelo de camundongo amplamente usado para a pesquisa de DENV). Camundongos AG129 foram encontrados ser altamente suscetíveis a todos os outros sorotipos de quimeras de WN/DENV que foram produzidas.

[00128] Devido a menor replicação/estabilidade em culturas celulares e falta de capacidade infecciosa de WN/DENV-3 que usa a estratégia de junção tipo I, quatro construtos adicionais com diferentes estratégias de junção em C(ss) foram designados e produzidos. Duas dessas estratégias resultaram em vírus quiméricos aperfeiçoados, WN/DENV-3 B (junção tipo II) e WN/DENV-3 C (junção tipo III). Quimeras de ambas as estratégias replicaram bem em células C6/36 e Vero, mas elas não eram geneticamente estáveis em células Vero. Apenas uma passagem de célula Vero dessas quimeras resultou em mutação (His para Leu) na posição E345 (Tabela 7) em ambas as quimeras WN/DENV-3 B (denominada WN/DENV-3 BE345; SEQ ID NOs: 15 e 16) e WN/DENV-3 C (denominada WN/DENV-3 CE345;SEQ ID NOs: 17 e 18). Interessantemente, a mesma mutação E345 foi previamente identificada ser crítica para a adaptação na célula V de quimeras de DENV-2/DENV-3 (veja a Pat. U.S. No. 7.094.411). Em adição, a mutação E347 que evoluiu na proteína E G106L de WN/DENV-1 que replicou nas células Vero (descrito acima), corresponde à mutação E345 de DENV-3 de acordo com o alinhamento de aminoácidos de todos os DENV. Como a mutação E345 pareceu ser muito eficaz na intensificação da habilidade de vários DENV quiméricos (especialmente com o gene prM-E de DENV-3), essa substituição foi incorporada em versões finais dos construtos de WN/DENV-3 com todas as três estratégias de junção (I, II, III). Para o construto com junção tipo I (WN/DENV-3 E345), essa mutação intensificou apenas levemente a habilidade global da quimera, mas a quimera continuou a evoluir com mutações adicionais nas células Vero. Por outro lado, a incorporação da mutação His-E345-Leu nos construtos de WN/DENV-3 B e C estabilizou com sucesso os vírus quiméricos replicados em células Vero.

[00129] WN/DENV-4: Uma única substituição (Thr para Pro) no resíduo C-107 (Tabela 7) foi identificada como sendo importante para a estabilidade genética de WN/DENV-4 em células Vero. Essa substituição não foi crítica para a replicação viral ou a estabilidade genética em células C6/36. A substituição Thr-C107-Pro foi manipulada na quimera WN/DENV-4, denominada WN/DENV-4 C107 (SEQ ID NOs: 19 e 20). C107 (posição baseada no vírus quimérico) é em C101 da cepa 1036 de DENV-4 parental e é o primeiro aminoácido de DENV-4 da C(ss) na quimera que usa a estratégia da junção tipo I. A proteína C de DENV-4 é um aminoácido mais curto do que os outros três sorotipos de DENV e C101 de DENV-4 está alinhado com C102 dos outros três sorotipos no alinhamento da sequência de aminoácidos entre todos os DENVs. Em adição à mutação C107, uma mutação de Gly para Arg em NS4A-18 (na parte WN da quimera) também foi observada e pode aperfeiçoar adicionalmente a habilidade viral em células Vero. Essa mutação também é uma das múltiplas mutações observada em WN/DENV-3 depois de múltiplas passagens nas células Vero (Tabela 7). Tabela 7. Mutações de vírus quiméricosTabela 8. Efeito das mutações sobre a habilidade do vírus quimérico a Evidência de adaptação celular inclui a eficiência de replicação aumentada (crescimento cinético ou tamanho da placa), rendimento global do vírus e estabilidade genética da quimera replicada a partir das culturas celulares. "+" indica que a mutação demonstrou pelo um dos critérios. "-" indica que a mutação não é necessária para adaptação celular. "Nd" significa não determinado; essas mutações codesenvolvidas com outras mutações e suas contribuições para a habilidade não foram determinadas

Exemplo 2 Características do Crescimento de Quimeras de WN/DEN em Cultura Celular

[00130] Esse exemplo descreve as características do crescimento das quimeras de WN/DEN em culturas de célula Vero e C6/36.

[00131] As quimeras descritas no Exemplo 1 (WN/DENV-1, WN/DENV-2 E203, WN/DENV-3 CE345 e WN/DENV-4 C107) foram testadas quanto a sua habilidade de replicar em células Vero e C6/26. Essas quimeras replicaram mais eficientemente do que os DENV do tipo selvagem em ambas as células C6/36 e Vero, como mostrado nos dias iniciais de crescimento viral em células (Figuras 2A e 2B). No segundo dia pós-infecção (d.p.i) das células Vero, os títulos das quimeras de WN/DENV eram cerca de 2-3 log10 maiores (p<0,05) do que de DENVs (figura 2A). Nos pontos de tempo precoces das culturas celulares de C6/36, as quimeras também mostraram títulos significativamente maiores (p<0,05) do que os de DENVs (figura 2B). As curvas de crescimento das quimeras atingiram o platô cerca de 4 a 5 dias mais cedo do que aquelas de DENVs em células Vero e 2 a 3 dias mais precocemente nas células C6/36 (Tabela 9). Adicionalmente, as quimeras produziram um rendimento maior do que os DENVs nas células C6/36 (Tabela 9).Tabela 9. Crescimento das quimeras e de DENV em células C6/36 e Vero

Exemplo 3 Determinação da Virulência da Quimera de WN/DENV em Camundongos e seu Uso como Vírus Letal de Inoculação para Avaliar a Vacina para DENV

[00132] Esse exemplo descreve a virulência das quimeras de WN/DENV em camundongos e o uso das quimeras como a inoculação letal para avaliar a eficácia das candidatas à vacina para DENV.

[00133] A virulência das quimeras foi caracterizada em camundongos CD-1 com 3 semanas de idade e camundongos AG129 com 12 semanas de idade (Tabela 10). 50% da dose letal (LD50) foi determinada para WNV, quimeras de WN/DENV e uma mistura de DENV1-4 pela administração intracerebral (i.c.) ou intraperitoneal (i.p.). Globalmente, as quimeras de WN/DEN foram mais infecciosas e virulentas do os DENV de tipo selvagem nos camundongos.Tabela 10. Virulência da quimera em camundongos

[00134] As quimeras foram avaliadas para uso como vírus letais para a inoculação em camundongos AG129 em um estudo da eficácia de vacina para DENV. Grupos de camundongos AG129 com 3 a 4 semanas de idade (n=32/grupo) foram vacinados com uma dose única (inoculação apenas no dia 0) ou dupla (inoculação no dia 0 e reforço no dia 30) de tetraDENVax (vacina recombinante viva atenuada tetravalente para DEN descrita na Pat. U.S. No. 7.094.411). O grupo de placebo recebeu apenas PBS em ambos os dias. Cada grupo de camundongos foi então separado em 4 subgrupos (n=8/subgrupo) e cada subgrupo foi inoculado com 107 pfu de um único sorotipo da quimera de WN/DENV no dia 120 (3 meses depois da 2a. dose). Os camundongos foram monitorados quanto à morbidade depois da inoculação e camundongos com sinais de morbidade, tais como pelo áspero, encurvamento, letargia, movimentação desequilibrada ou irritável, desidratação, mais do que 10% de perda de peso ou paralisia foram sacrificados. A eficácia protetora da vacina foi avaliada pela comparação das taxas de sobrevivência dos grupos vacinados com os grupos de placebo. Os soros dos camundongos foram coletados nos dias 28, 60, 90, 118 e 148. Os soros de cada subgrupo de camundongos foram testados quanto aos anticorpos neutralizantes contra sues sorotipos respectivos pelo teste de neutralização de redução de microfoco (mFRNT; Tabela 11).

[00135] Os resultados mostraram que todos os quatro sorotipos das quimeras de WN/DEN foram letais para camundongos naives (grupos placebo) e os camundongos vacinados com 1 ou 2 doses da vacina viva tetravalente atenuada estavam completamente protegidos contra cada sorotipo do inóculo de vírus de WN/DEN (figuras 3A-3D). As quimeras também foram avaliadas em uma inoculação de camundongos AG129 mais velhos (até 27 semanas de idade) e 107 pfu de cada quimera de WN/DEN foram suficientes para causar 100% de morbidade em 3 a 7 dias nesse grupo etário. Como as quimeras foram uniformemente letais para uma ampla faixa de idade de camundongos AG129 (3 a 27 semanas de idade) pela injeção intraperitoneal mais conveniente, causando morbidade/mortalidade em uma semana, elas podem ser o instrumento para o estabelecimento fácil, flexível e de longo prazo de modelos de eficácia em AG129 para vacina ou desenvolvimento terapêutico contra todos os sorotipos de DENV. Tabela 11. Títulos de anticorpo neutralizantes do estudo de eficácia de TetraDENVax aDose da vacina: 0 = PBS no dia 0 e dia 30; 1 =TetraDENVax no dia 0 apenas; 2 = TetraDENVax no dia 0 e dia 30 b Média Geométrica do Título representa 70% do ponto de corte de mFRNT cNA: Não Aplicável. Nenhum camundongo sobreviveu para a coleta de soro.

Exemplo 4 Ensaios de Neutralização

[00136] Esse exemplo descreve a avaliação da resposta do anticorpo neutralizante à infecção por DENV usando quimeras de WN/DENV.

[00137] Ensaios de neutralização de um painel de soros clínicos humanos de pacientes expostos a um único ou a múltiplos sorotipos de DENV foram conduzidos contra as quimeras de WN/DEN e DENVs wt. Um painel de referência de soros humanos caracterizados (n=18) foi obtido do Walter Reed Army Institute of Research. Amostras clínicas de soro humano (n=12) foram obtidas do Dengue Branch/DVBD/ CDC, San Juan, Porto Rico. Amostras de soro naives para Dengue (n=4) foram coletadas de indivíduos que vivem em regiões não endêmicas.

[00138] Amostras de soro humano diluídas em série duas vezes foram pré-incubadas com uma quantidade específica de vírus por 60 min a 37°C ou por uma noite a 4°C. A mistura de soro/vírus foi inoculada em monocamadas de Vero por 90 minutos de adsorção e as células foram sobrepostas com meio contendo agarose 0,8% (para o teste de neutralização com redução da placa (PRNT)) ou carboximetilcelulose 1% (para o teste de neutralização com redução de microfoco (mFRNT)). As placas foram incubadas a 37°C por 1 a 7 dias, dependendo do tempo necessário para a formação de placa ou microfocos. Para PRNT, as placas foram superpostas com outra cobertura de agarose contendo vermelho neutro 1,5% para visualizar as placas e as placas foram contadas nos 1 a 3 dias seguintes. As placas puderam ser contadas nos dias 3-4 para as quimeras e no dia 7 para os DENVs wt. No mFRNT, as placas foram lavadas com PBS para remover a cobertura e fixadas com acetona por 1 h a -20°C. Os microfocos foram imunocorados com o Ab primário específico para o sorotipo seguido pelo Ab secundário conjugado com HRP e precipitando o substrato.Os micropontos puderam ser corados pela contagem em 24 h depois da infecção das quimeras e em 48 h depois da infecção dos DENVs wt.

[00139] Como as quimeras de WN/DEN replicaram mais rápido, elas produziram placas virais e microfocos muito mais rápido do que os DENVs wt. Em adição, as placas e os focos imunes produzidos pelas quimeras foram mais uniformes e melhor definidos o que aqueles dos DENVs wt (figuras 4, 5A e 5B). Portanto, o uso das quimeras no ensaio de neutralização pode intensificar potencialmente a eficiência (duração mais curta) e exatidão (medida mais exata do número de placas e microfocos) do ensaio.

[00140] Uma redução no número de placas ou microfocos nas células inoculadas com a mistura de vírus-soro quando comparadas com as células infectadas apenas com o vírus, indica a presença de um anticorpo neutralizante no soro. O título do anticorpo neutralizante é identificado como a diluição mais elevada do soro que reduz o número de placas de vírus no teste em 50%, 70% ou 90% (Tabelas 12 e 13). Os resultados do teste mostraram que os títulos de neutralização contra as quimeras de WN/DENV geralmente concordaram com os títulos contra DENVs wt (dentro de uma variação de 4 vezes) na maioria das amostras testadas (Tabela 12). Nenhuma reatividade cruzada foi vista com os soros positivos para o vírus da encefalite japonesa (JEV). Soros monossorotípicos não mostraram reatividade com os três outros sorotipos de DENV.Tabela 12. Avaliação de WN/DENVs em mFRNT com painel de referência humano aPotência da neutralização: H=alta; M= média; L=baixa bTítulos são de 90% de neutralização da infecção pelo vírus Tabela 13. Avaliação de WN/DENVs em mFRNT usando amostras clínicas de soro humano a bTítulos são de 90% de neutralização da infecção pelo vírus. Exceto para amostras naives para DENV, a maioria das amostras clínicas foram coletadas de pacientes expostos a múltiplos sorotipos de DENV.

Exemplo 5 Inativação de Quimeras de WN/DENV

[00141] Esse exemplo descreve a concentração/purificação de quimeras de WN/DENV e métodos de avaliação e otimização para a inativação das quimeras de WN/DENV.

Concentração/Purificação

[00142] Vários métodos de concentração e purificação das quimeras de WN/DENV descritas foram testados. Os vírus foram cultivados em células C6/36 com meio de cultura sem soro a 28°C por 10 dias ou mais. No dia 5, o meio de cultura foi removido e substituído com meio fresco. A partir do dia 6 até 10 (ou mais), a cada dia o sobrenadante da cultura era coletado para coletar o vírus e as células realimentadas com meio fresco para a coleta do dia seguinte. O sobrenadante da cultura foi clarificado com remoção de restos celulares por centrifugação em cerca de 15.000 xg por 20 minutos a 4°C antes da purificação.

[00143] O primeiro método foi a centrifugação com gradiente de densidade, que é baseado em um método clássico bem estabelecido para purificar os flavivírus. Usando esse método, os produtos finais são partículas de vírus altamente purificadas, mas o rendimento dos vírus é tipicamente muito baixo (tipicamente <5%) para WT DENVs. O método é demorado, difícil e não idealmente adequado para a preparação de vírus em grande escala. Os vírus foram concentrados primeiro através de um sistema de filtração (Amicon Ultra Centrifugal Filter Unit, Centricon-70 ou Sistema de Filtração de Fluxo Tangencial, com membrana MWCO=50-100 kDa) ou precipitação com PEG8000 e depois ultracentrifugados através de um gradiente de glicerol 30%- tartarato de potássio 45% em 260.000 xg durante 12 horas uma ou duas vezes (primeiro por 3 a 4 h, coleta da banda e durante o segundo gradiente por 12 h). Com o crescimento rápido das quimeras de WN/DENV aqui descritas, que atingiram títulos mais elevados do que os DENVs de tipo selvagem, foram obtidas quantidades das quimeras 50 a 100 vezes maiores do que aquelas de DENVs de tipo selvagem em um único lote de purificação em escala laboratorial usando a centrifugação com gradiente de densidade.

[00144] A centrifugação em coxim de glicerol também foi testada. Os vírus concentrados foram ultracentrifugados através de um coxim de glicerol 30% a 260.000 xg por 2 a 3 h. A pureza do produto final foi menor do que aquela produzida pela centrifugação com gradiente de densidade, mas o método foi mais rápido, fácil e o rendimento final foi muito maior (25 a 60%).

[00145] Finalmente, o meio de cromatografia com sulfato Cellufine® foi usado para purificar as quimeras de WN/DENV. O sulfato Cellufine® tem alta afinidade por uma ampla gama de vírus, incluindo os flavivírus. As amostras de vírus foram ajustadas para 1-20 mg/ml em tampão fosfato de sódio 0,01M pH 7,5 ou Tris-HCl 0,5 M pH 8,5 com NaCl 0-0,1 M (tampão de adsorção) antes de serem adsorvidas na coluna de sulfato Cellufine®. A coluna foi lavada com 5 a 10 volumes de coluna do tampão de adsorção e a amostra foi eluída com tampão de eluição (por exemplo, Tris-HCl 0,5 M com NaCl 0,2-10 M). Esse método foi fácil e mais adequado para a preparação em grande escala, mas os resultados mostraram que o produto final ainda continha significativamente mais proteínas celulares do que a preparação obtida com a centrifugação em coxim de glicerol. A otimização adicional pela eluição da amostra com vários gradientes de sal iônico melhorou a pureza do produto. Esse método também pode ser incorporado como parte do procedimento em outros métodos para purificar o vírus. Por exemplo, para obter uma pureza maior, esse procedimento pode ser adicionado antes ou depois da centrifugação em coxim de glicerol.

Inativação do Vírus

[00146] Vários métodos foram testados para inativação das quimeras de WN/DENV quimérico. O vírus quimérico purificado (tipicamente purificado pela centrifugação em coxim de glicerol) foi inativado pela radiação UV 254 nm em diferentes níveis de potência por várias durações em uma embalagem fria. As amostras inativadas foram tituladas quanto ao título infeccioso e atividade antigênica para dengue. As condições de UV que resultaram na inativação total do vírus e retenção da mais alta atividade antigênica para a dengue foram posteriormente otimizadas (Tabela 14). As condições que funcionaram bem com amostra de tamanho pequeno (0,2 ml) em altos títulos foram identificadas (670 μW/cm2 por 15 min ou 350 μW/cm2 por 45 min). Para tamanhos de amostra maiores (2,4-3,7 ml), tratamentos mais prolongados (> 45 min) a 680 μW/cm2 foram necessários para a inativação total.Tabela 14. Inativação com UV 254 nm de WN/DEN4 C107

[00147] Também foi determinado que WN/DENVs (até 4 x 109 pfu/ml) foram eficientemente inativados com Sarkosyl 0,005% a 37°C por 1 hora, ainda com retenção da atividade viral antigênica medida por ELISA (Tabela 15). A maior concentração mínima (>0,1%) de Sarkosyl foi requerida para inativar as amostras com maior concentração de vírus. Em concentrações de 0,1% ou maiores, Sarkosyl é tóxico para as células. Tanto filtros de ultracentrifugação (por exemplo, Amicon) quanto kits para remoção de detergente (por exemplo, Millipore) podem ser usados para remover o Sarkosyl extra dos vírus inativados para reduzir a toxicidades da amostra para as células.Tabela 15. Inativação com Sarkosyl de WN/DEN2 a 37°C por 1 hora* A concentração de Sarkosyl na amostra é tóxica para as células durante a titulação.

[00148] Os resultados preliminares mostraram que a β-propio- nolactona (BPL) e o peróxido de hidrogênio também inativaram efetivamente os vírus quiméricos, mas eles também diminuíram efetivamente a atividade antigênica viral. Nenhuma capacidade infecciosa foi medida depois do tratamento com BPL 3% por 48 horas ou com H2O2 0,1% em temperatura ambiente por 2 horas. Entretanto, a inativação resultou em mais do que 95% de diminuição da atividade antigênica viral medida por ELISA.

Exemplo 6 Avaliação das Quimeras de WN/DENV inativadas em camundongos

[00149] Esse exemplo descreve os métodos para a avaliação da virulência e da imunogenicidade de quimeras de WN/DENV em camundongos. Métodos similares podem ser usados em outros indivíduos, tais como primatas não humanos ou humanos.

[00150] As quimeras de WN/DENV descritas no Exemplo1 são purificadas e inativadas pelos métodos descritos no Exemplo 5. Grupos de camundongos AG 129 com 3 a 4 semanas de idade são tratados como 1 a 50 μg de um único sorotipo da quimera de WN/DENV no dia 0 e no dia 30. Os camundongos são monitorados quanto a morbidade e camundongos com sinais de morbidade, tais como pelo áspero, encurvamento, letargia, movimentação desequilibrada ou irritável, desidratação, mais do que 10% de perda de peso ou paralisia foram sacrificados.. A inativação eficaz da quimera de WN/DENV é avaliada pela titulação do vírus em cultura celular e pela sobrevida dos camundongos imunizados. Os soros dos camundongos são coletados periodicamente (por exemplo, nos dias 28, 60, 90, 118 e/ou 148 ou outros dias adequados com base no protocolo particular usado). Os soros de cada subgrupo de camundongos são testados quanto a atividade antigênica por ELISA ou pelos anticorpos neutralizantes contra seus respectivos sorotipos por um teste de neutralização com redução de microfoco. As condições de inativação que carecem de morbidade e induzem os mais altos níveis de anticorpos neutralizantes anti-DENV são selecionadas para uso como uma vacina inativada. Camundongos imunizados são opcionalmente inoculados com uma dose letal de WN/DENV vivo no dia 60 para determinar a eficácia protetora das duas doses de cada sorotipo de vacina inativada.

Exemplo 7 Uso das Quimeras de WN/DENV como uma Vacina para DENV Inativada

[00151] Esse exemplo descreve métodos para a avaliação da eficácia de uma estratégia de vacinação combinada para DENV no modelo de camundongo AG129. Essa estratégia de vacinação combinada utiliza duas doses da vacina. Uma dose contém a vacina para DENV recombinante viva atenuada (LA) tetravalente (veja a Pat. US No. 7.094.411) e a outra contém a vacina inativada (IA) feita com as quimeras de WN/DENV aqui descritas. As condições de inativação são como descritas nos Exemplos 5 e 6. Métodos similares podem ser usados em outros indivíduos, tais como primatas não humanos e humanos.

[00152] Para avaliar completamente o potencial das quimeras IA candidatas a vacina, as seguintes combinações são testadas: 1) primeira dose e reforço da vacina LA (2 doses da vacina LA de controle ; LA/LA); 2) primeira dose e reforço da vacina IA (2 doses da vacina IA de controle ; IA/IA); 3) primeira dose com a vacina La e reforço com IA (LA/IA); 4) primeira dose com a vacina IA e reforço com LA (IA/LA). Grupos de camundongos com 3 a 4 semanas de idade são inoculados por via intraperitoneal com 100 μL de PBS contendo a vacina tetravalente LA (103 a 105 pfu para cada sorotipo) ou quimeras de IA WN/DEN variando entre 0,1 a 100 μg de cada vírus inativado no dia 0. A segunda dose, de LA ou de IA como descrito acima, é injetada no dia 30 ou 60. Um grupo de camundongos é inoculado com PBS apenas em ambos os dias como o grupo de controle naive.

[00153] No dia 90 ou 120, os camundongos são inoculados com uma dose letal de quimeras vivas de WN/DENV. Essas quimeras vivas de WN/DENV foram estabelecidas como os vírus inoculados letais (em 107 pfu cada) para os camundongos AG129 em um modelo de eficácia de vacina (veja o Exemplo 3). Os camundongos inoculados são monitorados diariamente por 3 a 4 semanas e camundongos que mostram sinais de doença são sacrificados. O sangue é coletado nos dias 28, 58, 88 e 118 dos animais para a análise de imunogenicidade. Os camundongos que sobrevivem à inoculação letal serão sangrados no final do experimento. Amostras de soro do sangue coletado serão inativadas pelo calor a 56°C por 30 minutos e os anticorpos no soro são determinados por ELISA e/ou teste de neutralização (por exemplo, como descrito no Exemplo 4). As quatro estratégias de vacinação (LA/LA, IA/IA, LA/IA e IA/LA) são comparadas para desenvolver uma estratégia de vacinação otimizada que forneça 100% de proteção contra a inoculação letal e forneça as respostas de anticorpo mais equilibradas para todos os quatro sorotipos de DENV.

[00154] Estudos adicionais com camundongo são conduzidos para determinar se um único sorotipo de quimera IA ou combinações de 2 a 3 sorotipos de quimera IA são mais eficazes como a vacina de reforço para obter imunidade equilibrada contra todos os 4 sorotipos de DENV. Por exemplo, a vacina viva atenuada tetravalente pode resultar em maiores respostas do anticorpo para DEN1 e DEN2 e respostas menores para DEN3 e DEN4. Uma dose de reforço com IA contendo apenas os sorotipos DEN3 e DEN4 da quimera de WN/DEN pode ser eficaz para reforçar as respostas do anticorpo a esses dois sorotipos e resulta em respostas de anticorpo mais equilibradas a todos os quatro sorotipos do que a dose de reforço de IA contendo todos os quatro sorotipos de quimeras.

[00155] Em vista de várias modalidades possíveis as quais os princípios da descrição podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos e não devem ser tomadas como limitantes do escopo da invenção. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações em anexo. Portanto, eu reivindico como minha invenção tudo que estiver dentro do escopo e do espírito dessas reivindicações.

Claims

1. Quimera de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: uma primeira molécula de ácido nucleico que compreende uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica proteínas não estruturais e uma proteína C, e uma região 3’ não codificante de um genoma do vírus do Oeste do Nilo, em que a proteína C compreende uma sequência sinal de 18 aminoácidos compreendendo os primeiros seis aminoácidos de uma sequência sinal prM do genoma do vírus do Oeste do Nilo compreendendo GGKTGI (aminoácidos 106-111 da SEQ ID NO: 2) e os últimos doze aminoácidos de uma sequência sinal prM de um genoma do vírus da dengue compreendendo os aminoácidos 103-114 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6 ou 8, ou os aminoácidos 102-113 da SEQ ID NO: 10; e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína prM e proteína E de um genoma do vírus da Dengue.

2. Quimera de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína E compreende uma substituição de aminoácido em um aminoácido que corresponde ao aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4 ou aminoácido 345 da proteína E de DEN3.

3. Quimera de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácido compreende uma leucina.

4. Quimera de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:15.

5. Quimera de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a quimera de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

6. Quimera de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: uma primeira molécula de ácido nucleico que compreende uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica proteínas não estruturais e uma proteína C e uma região 3’ não codificante de um genoma do vírus do Oeste do Nilo; e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína prM e proteína E de um genoma do vírus da Dengue, em que a proteína E compreende uma substituição de aminoácido em um aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 347 da proteína E de DEN1, DEN2 ou DEN4 ou à posição de aminoácido 345 da proteína E de DEN3.

7. Quimera de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:17.

8. Quimera de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a quimera de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:18.

9. Quimera de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: uma primeira molécula de ácido nucleico que compreende uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica proteínas não estruturais e uma proteína C, e uma região 3’ não codificante de um genoma do vírus do Oeste do Nilo, em que a proteína C compreende uma sequência sinal de prM de um genoma do vírus da Dengue; e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína prM e uma proteína E do genoma do vírus da Dengue, em que: a proteína C compreende uma substituição de aminoácido em um ou mais de um aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 92 de WNV; posição de aminoácido 101 de DEN1, DEN2 ou DEN3; posição de aminoácido 100 de DEN4; posição de aminoácido 102 de DEN1, DEN2 ou DEN3; ou posição de aminoácido 101 de DEN4; a proteína prM compreende uma substituição de aminoácido em um ou mais de um aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 22, 135, 154 ou 155 de DEN1, DEN2, DEN3 ou DEN4; a proteína E compreende uma substituição de aminoácido em um ou mais de um aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 171 de DEN1, DEN2, DEN3 ou DEN4; posição de aminoácido 311 de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 309 de DEN3; posição de aminoácido 347 de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 345 de DEN3; posição de aminoácido 397 de DEN1, DEN2 ou DEN4; posição de aminoácido 395 de DEN3; posição de aminoácido 417 de DEN1, DEN2 ou DEN4; ou posição de aminoácido 415 de DEN3; a proteína NS3 compreende uma substituição na posição de aminoácido 71 de WNV; e/ou a proteína NS4A compreende uma substituição na posição de aminoácido 18 de WNV.

10. Quimera de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:19.

11. Quimera de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo de que a quimera de ácido nucleico codifica a sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:20.

12. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vírus inativados compreendendo a quimera de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende ainda: (i) um vírus inativado compreendendo uma quimera de ácido nucleico de WN/DEN2 que compreende: uma primeira molécula de ácido nucleico que compreende uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3’ não codificante de um genoma do vírus do Oeste do Nilo, em que a proteína C compreende uma sequência sinal de prM de um genoma do vírus da Dengue-2; e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína prM e uma proteína E do genoma do vírus da Dengue-2, em que a proteína E compreende uma substituição de aminoácido na posição 203; e/ou (ii) um vírus inativado compreendendo uma quimera de ácido nucleico de WN/DEN1 que compreende: uma primeira molécula de ácido nucleico que compreende uma região 5’ não codificante, um ácido nucleico que codifica uma proteína C e proteínas não estruturais e uma região 3’ não codificante de um genoma do vírus do Oeste do Nilo, em que a proteína C compreende uma sequência sinal de prM de um genoma do vírus da Dengue-1; e uma segunda molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada à primeira molécula de ácido nucleico, que codifica uma proteína prM e uma proteína E do genoma do vírus da Dengue-1.

14. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a substituição de aminoácido na posição 203 da proteína E da quimera WN/DEN2 compreende um ácido aspártico.

15. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a quimera de WN/DEN2 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:13.

16. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que a quimera de WN/DEN2 codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO:14.

17. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a quimera de WN/DEN1 compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11.

18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a quimera de WN/DEN1 codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:12.

19. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um vírus que compreende uma quimera de ácido nucleico de WN/DEN1, um vírus que compreende uma quimera de ácido nucleico de WN/DEN2, um vírus que compreende uma quimera de ácido nucleico de WN/DEN3 e um vírus que compreende uma quimera de ácido nucleico de WN/DEN4.

20. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vírus quiméricos inativados de WN/DENV que compreende a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 11, 13, 15, 17 ou 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais adjuvantes.

22. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, caracterizada pelo fato de que o um ou mais vírus inativados são purificados e/ou em que o um ou mais vírus inativados são inativados por um ou mais de tratamento químico, tratamento físico e irradiação.

23. Uso de um ou mais vírus inativados compreendendo a quimera de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e/ou um ou mais vírus quiméricos inativados de WN/DENV que compreende a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 11, 13, 15, 17 ou 19, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição imunogênica, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 22 para desencadear uma resposta imune contra um ou mais vírus da Dengue em um indivíduo.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende uma resposta imune a cada um de DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica é formulada para ser usada de uma a cinco doses e/ou com um ou mais adjuvantes.

26. Método, caracterizado pelo fato de que compreende inativar um vírus que compreende uma ou mais quimeras de ácido nucleico, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a inativação do vírus compreende tratar o vírus com um agente de inativação química, alta pressão, irradiação ultravioleta, irradiação gama ou uma combinação dessas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende ainda purificar o vírus inativado.